JPS6091995A - サツカロミセス属酵母によるインターロイキン‐2の製造方法 - Google Patents
サツカロミセス属酵母によるインターロイキン‐2の製造方法Info
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- JPS6091995A JPS6091995A JP59200595A JP20059584A JPS6091995A JP S6091995 A JPS6091995 A JP S6091995A JP 59200595 A JP59200595 A JP 59200595A JP 20059584 A JP20059584 A JP 20059584A JP S6091995 A JPS6091995 A JP S6091995A
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- dna
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- cell
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明はインターロイキン−2(以下、IL−2と略記
する。)活性を有するポリペプチド−を」−ドする遺伝
子を有するサツカロミセス属酵母を用いてI L−2を
製造する方法に関する。
する。)活性を有するポリペプチド−を」−ドする遺伝
子を有するサツカロミセス属酵母を用いてI L−2を
製造する方法に関する。
(従来の技術)
I L −2は以前、1゛細胞増殖因子と呼ばれ−ζい
たものであり、レクチンあるいは抗原で活性化された゛
「細胞より産生される可溶性蛋白(一般には「リンホカ
イン」として知られている。)である(モーガンら、
5cience 、 j 93. ] 007〜106
8 (1076)、ギリスら+ J、Immunol、
。
たものであり、レクチンあるいは抗原で活性化された゛
「細胞より産生される可溶性蛋白(一般には「リンホカ
イン」として知られている。)である(モーガンら、
5cience 、 j 93. ] 007〜106
8 (1076)、ギリスら+ J、Immunol、
。
120.2027〜2033 (197B))。このI
L−2はリンパ球の反応性を調節でき、抗原特異的な
エフーLクター′■゛−リンパ球のin vitro4
こおりる長期培養を可能ならしめることができる(キリ
スら、NaLure、−268,154〜15Ei(1
977))。また、IL−2は胸腺細胞の分裂の促進(
チェ7ら、 Ce1l Immunol、、 2η、2
11〜224(1(177)、ショーら、 J、Imm
unol、1120.19fi7〜1973 (1!1
78))、ヌードマウスの肝細胞の培養系での細胞障害
性T細胞活性の誘導(ソグナーら、 Nature、2
−町ん。
L−2はリンパ球の反応性を調節でき、抗原特異的な
エフーLクター′■゛−リンパ球のin vitro4
こおりる長期培養を可能ならしめることができる(キリ
スら、NaLure、−268,154〜15Ei(1
977))。また、IL−2は胸腺細胞の分裂の促進(
チェ7ら、 Ce1l Immunol、、 2η、2
11〜224(1(177)、ショーら、 J、Imm
unol、1120.19fi7〜1973 (1!1
78))、ヌードマウスの肝細胞の培養系での細胞障害
性T細胞活性の誘導(ソグナーら、 Nature、2
−町ん。
278〜280(+980))や抗S R13Cプラー
ク形成細胞反j、シの誘導(ギリスら、 J、 nxp
、 Med。
ク形成細胞反j、シの誘導(ギリスら、 J、 nxp
、 Med。
−L(9,1!360〜1968 N 979)) 等
0)関連する他の生物活性をもっことが明らかにされて
いる。したがゲ乙このリンパf;17 JJAI fi
f小J74:I、液体免疫や細胞性免疫反応を増強した
り、免疫不全状態を正常な液体や細胞性免疫の4Je態
に回復させるのに゛有用である。これらの明らかにされ
ノこ11、=2の免疫学的活性はIL−2が悪性腫瘍、
細菌またはウィルス感染、免疫不全、自己免疫疾患等(
バジャーマスターら、八dv、 Immunophar
m、、 5 [17。
0)関連する他の生物活性をもっことが明らかにされて
いる。したがゲ乙このリンパf;17 JJAI fi
f小J74:I、液体免疫や細胞性免疫反応を増強した
り、免疫不全状態を正常な液体や細胞性免疫の4Je態
に回復させるのに゛有用である。これらの明らかにされ
ノこ11、=2の免疫学的活性はIL−2が悪性腫瘍、
細菌またはウィルス感染、免疫不全、自己免疫疾患等(
バジャーマスターら、八dv、 Immunophar
m、、 5 [17。
(1980))に対する医科免疫療法にイj用であるこ
とを示している。
とを示している。
本願出願人に係るヨーロッパ特許出願
第8310io35.0*″(米国特許出願第4634
96号)には、I L−2ポリペプチドをコードする遺
伝子、該遺伝子を担持する組換えDNA、該組換えDN
Aを有する細胞および該細胞を用いてI L、−2を製
造する方法が開示されている。このヨーロッパ11′1
出願はIL 2ポリペブチFをコーMl’る遺伝子がザ
ソヵL1ミセス・モレ5シエ(Sgc、c、harom
ycqs cereviBiae)の細胞内で増殖可L
’14 ”<フタ−IっNAと結合した後では、該遺
伝子をリノヵ1、!ミセス・セレビシェの細胞内に取込
むことが出来るごとおよび該取込J:れノこ遺伝子の遺
伝情報を表現してI i、 −2を生産しうるごとが示
唆されている。
96号)には、I L−2ポリペプチドをコードする遺
伝子、該遺伝子を担持する組換えDNA、該組換えDN
Aを有する細胞および該細胞を用いてI L、−2を製
造する方法が開示されている。このヨーロッパ11′1
出願はIL 2ポリペブチFをコーMl’る遺伝子がザ
ソヵL1ミセス・モレ5シエ(Sgc、c、harom
ycqs cereviBiae)の細胞内で増殖可L
’14 ”<フタ−IっNAと結合した後では、該遺
伝子をリノヵ1、!ミセス・セレビシェの細胞内に取込
むことが出来るごとおよび該取込J:れノこ遺伝子の遺
伝情報を表現してI i、 −2を生産しうるごとが示
唆されている。
(発明が解決しようとする問題点)
本発明者らは、l +、、−2ポリペプチドをτ1−ト
する遺伝子とり゛ソカロミセス・セレビシェの細胞内で
増殖可能な・\フタ−1) NAよりなり、かつ該遺伝
子のコード配列がプlコモーター配列の下流位置に存在
する3、]1換えl) NAにより形質転換さレタサノ
力ロミセス・セレビシェの細胞を取得するごとに成功し
た。この形質転換されたり一カi:1ミセス・セレヒシ
ュ番、1該細胞に取込まれた遺伝子の遺伝情報を表現す
るIL−2を製造することがごきる。
する遺伝子とり゛ソカロミセス・セレビシェの細胞内で
増殖可能な・\フタ−1) NAよりなり、かつ該遺伝
子のコード配列がプlコモーター配列の下流位置に存在
する3、]1換えl) NAにより形質転換さレタサノ
力ロミセス・セレビシェの細胞を取得するごとに成功し
た。この形質転換されたり一カi:1ミセス・セレヒシ
ュ番、1該細胞に取込まれた遺伝子の遺伝情報を表現す
るIL−2を製造することがごきる。
(問題点を解決するだめの手段)
本発明はlL2活性を有するポリペブチ1.をコードす
る遺伝子が挿入されており、ザソヵにIミセス属酵母菌
体内で増殖可能なブラスミ!−・\フタ−を有するす°
ノカロミセス属酵母を培養し、生産されたインターロイ
キン−2を採取することを特徴とする112の製造方法
である。
る遺伝子が挿入されており、ザソヵにIミセス属酵母菌
体内で増殖可能なブラスミ!−・\フタ−を有するす°
ノカロミセス属酵母を培養し、生産されたインターロイ
キン−2を採取することを特徴とする112の製造方法
である。
] 1..−2ポリペブチ1を−+−)したりじj−ン
化逍伝子は、l 1.、−2活性を自するポリペブチI
・を産生ずる能力をもつご出番、二よって特徴づりられ
る哺乳動物細胞に由来する11、−2に相当するメソセ
ンシャー RN A (m RN A ; l−1?
NA−jはリボ核酸の略、以下rlL−2mRNΔ1と
略記する。)を相補的1)NA(cl)NA)に転写す
ることによって得ることができる。得られたー」′fI
’ic I) NA(ss−cDN八)は2重9真c
I) NA(ds−cDN八)に変換させることができ
る。
化逍伝子は、l 1.、−2活性を自するポリペブチI
・を産生ずる能力をもつご出番、二よって特徴づりられ
る哺乳動物細胞に由来する11、−2に相当するメソセ
ンシャー RN A (m RN A ; l−1?
NA−jはリボ核酸の略、以下rlL−2mRNΔ1と
略記する。)を相補的1)NA(cl)NA)に転写す
ることによって得ることができる。得られたー」′fI
’ic I) NA(ss−cDN八)は2重9真c
I) NA(ds−cDN八)に変換させることができ
る。
cl)NAを調製するための鋳型とU7て用いるm R
N Aは、l L −2ポリペブチ1−を産生ずること
ができる咄″′IL動物細胞から−t1. iXI[す
るごとができる。単離さ巳:RNΔはポリアデニル化さ
れ(キリスら、 ImmunoloI!1cal 1l
ev、、6−3. 167−209 (1982) )
、ポリアデニル化された1’?NAは、例えばソヨ!J
3密度勾配遠心法によって11〜12Sil!lI分に
分画することが一ζきる。+3sのm RN A Lこ
IL−2mRNA活性が現われることがあるか、この場
合は11〜12S 汀+ RNAの凝集物であることが
考えられる。
N Aは、l L −2ポリペブチ1−を産生ずること
ができる咄″′IL動物細胞から−t1. iXI[す
るごとができる。単離さ巳:RNΔはポリアデニル化さ
れ(キリスら、 ImmunoloI!1cal 1l
ev、、6−3. 167−209 (1982) )
、ポリアデニル化された1’?NAは、例えばソヨ!J
3密度勾配遠心法によって11〜12Sil!lI分に
分画することが一ζきる。+3sのm RN A Lこ
IL−2mRNA活性が現われることがあるか、この場
合は11〜12S 汀+ RNAの凝集物であることが
考えられる。
本発明の汀11’? NAの供給源となる+ +、−2
を産生ずることができる哺乳動物細胞は、抽圧動物より
摘出できる末梢III巨ij、核■ニド、扁lヒ腺9.
111胞、胛)藏5111胞のようなT−リンパ球で良
い。細胞に11、−2産4L能を与えたり、またはI+
、−2活1ノ1を増強するためGこ、ナイしIンカラム
処理、抗血清と補体処理、密度勾配分画、ノイラミニダ
ーセとカラク1−スオキシダーセの組合−μ処理、X綿
++<? ’41. l・リプシン処理のよ・)な様々
な酵素処理など1JL来知りれだ方法で前処理しても良
い。上記哺乳動物細胞をT細胞増91fj因子存在下で
培養後得られるり1−1−ン化′[゛−リンパ球も+n
RNAの供給源として用いることができ、これはより
好ましい′1゛−リンパ球である。白血病やリンパ腫細
胞株に由来するr −リンパ球それ自体または上記の方
法で前処理または変異したそれらの跣導体などの形質転
換されたリンパ球細胞株またはクローニングされた形質
転換細胞株もmRNへの供給源として好ましい。明らか
に、クローン化した細胞株は通常クローン化前の親株に
比較して多量のIL−2mRN八を含んでいる。上記し
たリンパ球由来細胞とCI’CM 。
を産生ずることができる哺乳動物細胞は、抽圧動物より
摘出できる末梢III巨ij、核■ニド、扁lヒ腺9.
111胞、胛)藏5111胞のようなT−リンパ球で良
い。細胞に11、−2産4L能を与えたり、またはI+
、−2活1ノ1を増強するためGこ、ナイしIンカラム
処理、抗血清と補体処理、密度勾配分画、ノイラミニダ
ーセとカラク1−スオキシダーセの組合−μ処理、X綿
++<? ’41. l・リプシン処理のよ・)な様々
な酵素処理など1JL来知りれだ方法で前処理しても良
い。上記哺乳動物細胞をT細胞増91fj因子存在下で
培養後得られるり1−1−ン化′[゛−リンパ球も+n
RNAの供給源として用いることができ、これはより
好ましい′1゛−リンパ球である。白血病やリンパ腫細
胞株に由来するr −リンパ球それ自体または上記の方
法で前処理または変異したそれらの跣導体などの形質転
換されたリンパ球細胞株またはクローニングされた形質
転換細胞株もmRNへの供給源として好ましい。明らか
に、クローン化した細胞株は通常クローン化前の親株に
比較して多量のIL−2mRN八を含んでいる。上記し
たリンパ球由来細胞とCI’CM 。
Mo1t 4F、 BW 5147のごとき腫瘍細胞株
を融合するごとによって得られたT細胞ハイブリドーマ
もまた本発明に使用するのに好ましい哺乳動物細胞株で
ある。この場合のリンパ球由来細胞株は、+111 L
−2の自発産生細胞および+2) I +−−2産生
を補助する他の細胞の存在下または非存在士に培養液中
に導入されたマイトジェンが存在している時のみI L
−2を再生する細胞株を含む。
を融合するごとによって得られたT細胞ハイブリドーマ
もまた本発明に使用するのに好ましい哺乳動物細胞株で
ある。この場合のリンパ球由来細胞株は、+111 L
−2の自発産生細胞および+2) I +−−2産生
を補助する他の細胞の存在下または非存在士に培養液中
に導入されたマイトジェンが存在している時のみI L
−2を再生する細胞株を含む。
I L、−2自発産生細胞においてIL、−2mRN八
を誘導するために、IL−2自発産生細胞は、細胞培養
のうj野でよく知られた条件下で培養される。
を誘導するために、IL−2自発産生細胞は、細胞培養
のうj野でよく知られた条件下で培養される。
マイ(・ジエン存在下のみで11.−2を産/、l=−
するし1(胞においてm RN八を産生ずるには、培養
した細胞は培地で良く洗った後血清を含むがまたは含ま
ないローズウェルパークメモリアルインスティテュー1
−1640(以下、l−RPMI 1640Jと略記す
る。)、ダルヘノコラ変法イーグル培地(以下r D
M ICM Jと略記する。)またはクリック培地のご
とき培地に再び懸濁する。これらの培地には、ペニシリ
ン、ストレブ1−マイシンまたは他の抗生物質、フレノ
シプーL−グルタミン、へペス緩衝液および炭酸水素す
1−リウムのような種々の添加物を細胞培養の分野で一
般にI使われる濃度で加えても良い。好ましい細胞濃度
は0.5〜4×106細胞/ rn j!である。m
RN Aの活性化と11、、−2の産シ1−を誘導する
ために適当な刺激剤が加えられる。このj内当な刺激剤
の中には、マイトジェン5 ノイラミニダーゼ、カラク
l−−スオキソダーゼ、塩イい111鉛の如き亜鉛化合
物またはプ1コテインΔ、スルプトリソンー〇の如き細
菌由来のリンパ球活性化因子が含まれる。刺激された細
胞は回収され、洗浄される。マイ1〜ジエン刺激の1際
、マクロファージまたはプントリティック細胞を共存さ
せるとやむ、lすmRNAを活性化し、あるいは活性化
m RNΔの収量を増大さ(!得る。同様にラ一)(1
ンaji>、夕゛ウジ(Ilaudi ) 、 K 5
62 。
するし1(胞においてm RN八を産生ずるには、培養
した細胞は培地で良く洗った後血清を含むがまたは含ま
ないローズウェルパークメモリアルインスティテュー1
−1640(以下、l−RPMI 1640Jと略記す
る。)、ダルヘノコラ変法イーグル培地(以下r D
M ICM Jと略記する。)またはクリック培地のご
とき培地に再び懸濁する。これらの培地には、ペニシリ
ン、ストレブ1−マイシンまたは他の抗生物質、フレノ
シプーL−グルタミン、へペス緩衝液および炭酸水素す
1−リウムのような種々の添加物を細胞培養の分野で一
般にI使われる濃度で加えても良い。好ましい細胞濃度
は0.5〜4×106細胞/ rn j!である。m
RN Aの活性化と11、、−2の産シ1−を誘導する
ために適当な刺激剤が加えられる。このj内当な刺激剤
の中には、マイトジェン5 ノイラミニダーゼ、カラク
l−−スオキソダーゼ、塩イい111鉛の如き亜鉛化合
物またはプ1コテインΔ、スルプトリソンー〇の如き細
菌由来のリンパ球活性化因子が含まれる。刺激された細
胞は回収され、洗浄される。マイ1〜ジエン刺激の1際
、マクロファージまたはプントリティック細胞を共存さ
せるとやむ、lすmRNAを活性化し、あるいは活性化
m RNΔの収量を増大さ(!得る。同様にラ一)(1
ンaji>、夕゛ウジ(Ilaudi ) 、 K 5
62 。
Y3八L1、−1の如き13リンパ球またはI33リン
パ細胞株に由来する細胞株を共存させてもrn RN
Aは活性化され、または活性化mRN△の収F計を増大
さ−I!ljる。
パ細胞株に由来する細胞株を共存させてもrn RN
Aは活性化され、または活性化mRN△の収F計を増大
さ−I!ljる。
哺乳動物細胞を増殖さ−Uるために、細胞は通常の条件
下でin vitroで細胞培養により、または3.1
1′4%適合fJj物の体内で維持される。m RNへ
の供給源を調製するためにin viLro培養による
811°代を行なう場合には、従来’r itn胞の生
育を促進することが知られている培地であればどのよう
な培地乙こ4)これら細胞は生育する。これらの培地に
は削孔動物のllu ’/il; 、 部端成分または
血清アルジミンを話力11しCも良い。m RNΔの活
性化のための培養期間は、m RN八を生成するだめの
細胞の活11ト化に必要な時間に対応する。この時間は
、通常I L−2の培地中への産生か開始されるまでに
必要な時間と対応している。好ましい時間は、マーイト
ジエン等の刺激剤を添加してから3〜12肋間ごある。
下でin vitroで細胞培養により、または3.1
1′4%適合fJj物の体内で維持される。m RNへ
の供給源を調製するためにin viLro培養による
811°代を行なう場合には、従来’r itn胞の生
育を促進することが知られている培地であればどのよう
な培地乙こ4)これら細胞は生育する。これらの培地に
は削孔動物のllu ’/il; 、 部端成分または
血清アルジミンを話力11しCも良い。m RNΔの活
性化のための培養期間は、m RN八を生成するだめの
細胞の活11ト化に必要な時間に対応する。この時間は
、通常I L−2の培地中への産生か開始されるまでに
必要な時間と対応している。好ましい時間は、マーイト
ジエン等の刺激剤を添加してから3〜12肋間ごある。
培養時間が長ずぎる場合、生成したl L−2m RN
Δが分解されることかある。I L−2産生細胞の活性
化に1際し、PMΔまたは′「PΔの如きホルボールエ
ステル類をlO〜500g/mρ添加して活性化レー・
、ルを上昇さ−Uることもできる。
Δが分解されることかある。I L−2産生細胞の活性
化に1際し、PMΔまたは′「PΔの如きホルボールエ
ステル類をlO〜500g/mρ添加して活性化レー・
、ルを上昇さ−Uることもできる。
l L −2m RN A活性化のための1−記工程は
pH7,0〜7. /l−15!4度範囲32〜;38
“Cの飽和水蒸気の環境下で11なわれる。
pH7,0〜7. /l−15!4度範囲32〜;38
“Cの飽和水蒸気の環境下で11なわれる。
I L−2を産生ずることかできる哺乳動物細胞を取得
し、培j7する方法を以下ロ、二述べる。
し、培j7する方法を以下ロ、二述べる。
(]) I L−21’1発産生株の取ij?ヒl−1
’−リンパL17由来白血病細胞であるツブ、ルカソI
〜細胞()し・ノ1ハノチンソンl;<’i (ilF
突所、レア1−ル、アメリカ;ソーク研究所、す゛ン
ジエー2゜アメリカ;西Iイツ国立癌センター、ハイう
一ル・\ルク、西)・イツ等で自由に手に入る。)をI
X I F+ 61111 / m p、のキ111
胞富度でクリック培地中6.二)¥:!濁さU、150
レン1ケン/分の照射率で合At 80 (10レント
ケンの×♀:j)照射を11なう。この後 木イ111
胞を0、1111111fi/ 2 (1(l p (
<培地の細胞重度で9(j穴の平1民マ・イタ1:Iブ
レーI・([−ファルーlン3(1721’)に接種し
、5%牛脂児血清を含むクリック培地中で3週間37°
(:にて5%CO2インキョ、−1−ター中にて培養す
る(限界希釈法に、■、るり17−ニング)細胞の住育
が認められた培養ウェル中の細胞は、細胞が底面全体を
おおう密度に到達する前に24穴の培養プレート(ヌン
ク礼製)に移し、さらに5日間培養する。さらに、本細
胞を初期細胞密度1・〜2 x I O” 111i1
/川pにで」I11清も血′清アルソミンも含まない合
成培地にて約2日間thg養し、本培養−上清を遠心分
離操作して集め、次いで(1,2277のミリポアフィ
ルタ−にてテブリス除去と無菌化を行なった。このよう
にして得た培養」−清のI L−2活性を4111定す
るごとによってl L −2を自発産生ずるX線処理変
異株か選択、かつり11−ニングされた。
’−リンパL17由来白血病細胞であるツブ、ルカソI
〜細胞()し・ノ1ハノチンソンl;<’i (ilF
突所、レア1−ル、アメリカ;ソーク研究所、す゛ン
ジエー2゜アメリカ;西Iイツ国立癌センター、ハイう
一ル・\ルク、西)・イツ等で自由に手に入る。)をI
X I F+ 61111 / m p、のキ111
胞富度でクリック培地中6.二)¥:!濁さU、150
レン1ケン/分の照射率で合At 80 (10レント
ケンの×♀:j)照射を11なう。この後 木イ111
胞を0、1111111fi/ 2 (1(l p (
<培地の細胞重度で9(j穴の平1民マ・イタ1:Iブ
レーI・([−ファルーlン3(1721’)に接種し
、5%牛脂児血清を含むクリック培地中で3週間37°
(:にて5%CO2インキョ、−1−ター中にて培養す
る(限界希釈法に、■、るり17−ニング)細胞の住育
が認められた培養ウェル中の細胞は、細胞が底面全体を
おおう密度に到達する前に24穴の培養プレート(ヌン
ク礼製)に移し、さらに5日間培養する。さらに、本細
胞を初期細胞密度1・〜2 x I O” 111i1
/川pにで」I11清も血′清アルソミンも含まない合
成培地にて約2日間thg養し、本培養−上清を遠心分
離操作して集め、次いで(1,2277のミリポアフィ
ルタ−にてテブリス除去と無菌化を行なった。このよう
にして得た培養」−清のI L−2活性を4111定す
るごとによってl L −2を自発産生ずるX線処理変
異株か選択、かつり11−ニングされた。
(2)ヒト末梢血単核細胞よりIL−2産生1111胞
の取得 ヒ1−の末梢血を採+1+1 L、フィコール−ハイバ
ークの密度勾配遠心法により末梢血リンパfニド(以下
、P B Lと略記する。)を採取する。木PBI、を
1XIO’個/ rn 1.の細胞密度で5%I? C
S”を含むクリック培地に懸濁し、各2mp宛24六の
ヌンクの培養プレー1に接種する。ごこにソイ1−ヘー
lグルチニン−M(−トラフ1社製)(1’lt△)を
577 g/ ITI 7!の終末濃度Gごなるように
I00μp添加し、1−記の条件[・に4)3時間培養
し、た。次いC1細胞を培養液で洗浄し、再ひIXI(
15個/ m Pの細胞密度でクリックl韻l!!l
m 7!L::接種−dる。さらに、コンカナバリンΔ
(以下、Con △と略記する。)2.5μg / m
/!’(48時間刺激したヒト胛細胞から調製したコ
ンディソヨニンクした培地] rn 1を加え、該コン
ディショニンクした培地50%を含む培地を3日句G、
二取換えてl’) B l−、からのヒじ1゛−リンパ
球を長期1a+ (すJS養する。、二のよ・うに長1
す1組代培養して得たヒl′I”−リンパL17を、」
、記の限界希釈法でコンう゛−イショiニングした培地
に由来するヒト牌細胞の存liド、りl:I−ニンクを
行ない、かつ同様に細胞増殖を行なう。こうしてi)t
られたクローン化ヒトT リンパ球をl X I O”
個/ rn eの細胞密度に10 μg / m 1.
のP HΔ存在ド、24穴のタンク培養プレート中のR
PM I l (i 4 (]培地1 mlに接種し、
24時間、37°Cで7.5%CO2インキュヘーター
中にて培養した。本培養液の−上清を集め、遠心分離し
、次いで0.22.+1のミリポアフィルタ−で濾過し
、l L −2産牛ヒト正常′I゛−リンパ球クローン
を同定するために、l L−2活性検定を行なった。
の取得 ヒ1−の末梢血を採+1+1 L、フィコール−ハイバ
ークの密度勾配遠心法により末梢血リンパfニド(以下
、P B Lと略記する。)を採取する。木PBI、を
1XIO’個/ rn 1.の細胞密度で5%I? C
S”を含むクリック培地に懸濁し、各2mp宛24六の
ヌンクの培養プレー1に接種する。ごこにソイ1−ヘー
lグルチニン−M(−トラフ1社製)(1’lt△)を
577 g/ ITI 7!の終末濃度Gごなるように
I00μp添加し、1−記の条件[・に4)3時間培養
し、た。次いC1細胞を培養液で洗浄し、再ひIXI(
15個/ m Pの細胞密度でクリックl韻l!!l
m 7!L::接種−dる。さらに、コンカナバリンΔ
(以下、Con △と略記する。)2.5μg / m
/!’(48時間刺激したヒト胛細胞から調製したコ
ンディソヨニンクした培地] rn 1を加え、該コン
ディショニンクした培地50%を含む培地を3日句G、
二取換えてl’) B l−、からのヒじ1゛−リンパ
球を長期1a+ (すJS養する。、二のよ・うに長1
す1組代培養して得たヒl′I”−リンパL17を、」
、記の限界希釈法でコンう゛−イショiニングした培地
に由来するヒト牌細胞の存liド、りl:I−ニンクを
行ない、かつ同様に細胞増殖を行なう。こうしてi)t
られたクローン化ヒトT リンパ球をl X I O”
個/ rn eの細胞密度に10 μg / m 1.
のP HΔ存在ド、24穴のタンク培養プレート中のR
PM I l (i 4 (]培地1 mlに接種し、
24時間、37°Cで7.5%CO2インキュヘーター
中にて培養した。本培養液の−上清を集め、遠心分離し
、次いで0.22.+1のミリポアフィルタ−で濾過し
、l L −2産牛ヒト正常′I゛−リンパ球クローン
を同定するために、l L−2活性検定を行なった。
(3)マイi・ジエン存在下でI L −2を生産゛4
るヒ1〜リンパ球由来悪性化細1把株の取得ジュルカノ
ト細胞や上記した限界赤釈法Gこより得たジュルカノL
111のようなり1、】−ン化した細胞株は、前記の
無血清合成培地や削孔動物血゛清l〜2%を含むRPM
l 1640’f;Ilj!中に゛(ConΔl O
Is g / 1n QやI) HΔ2.5メIFX/
l11p等のマイトツエンの存在下に24時間培養する
と、J O〜4000jij位/ m 1.のI +−
,−2を産41.することができる。また、これらヒト
悪性化i+11胞株ム、IIM化曲釦、プI−1ティン
A、ピシハニール存在[ζに培養しても、I L−2を
産生ずる。
るヒ1〜リンパ球由来悪性化細1把株の取得ジュルカノ
ト細胞や上記した限界赤釈法Gこより得たジュルカノL
111のようなり1、】−ン化した細胞株は、前記の
無血清合成培地や削孔動物血゛清l〜2%を含むRPM
l 1640’f;Ilj!中に゛(ConΔl O
Is g / 1n QやI) HΔ2.5メIFX/
l11p等のマイトツエンの存在下に24時間培養する
と、J O〜4000jij位/ m 1.のI +−
,−2を産41.することができる。また、これらヒト
悪性化i+11胞株ム、IIM化曲釦、プI−1ティン
A、ピシハニール存在[ζに培養しても、I L−2を
産生ずる。
(4)マイj−シー1−ンの存在ド、他の細胞もしくは
iiJ熔外回外因子刺激することにより11.−2を産
生ずる細胞の取得 ヒト悪性化細胞株hlolL4Fや1(la界霜釈法゛
(得たクローン化された細胞株の・うlう例えば、ソコ
ールカノI・、199株G、1、レクチンやマイトジ:
1−ンか如何なる深度で存杓し、24〜72時間培11
(シても、。
iiJ熔外回外因子刺激することにより11.−2を産
生ずる細胞の取得 ヒト悪性化細胞株hlolL4Fや1(la界霜釈法゛
(得たクローン化された細胞株の・うlう例えば、ソコ
ールカノI・、199株G、1、レクチンやマイトジ:
1−ンか如何なる深度で存杓し、24〜72時間培11
(シても、。
I L −2を産41.シない。ところが、この間モノ
力・インの目iJjであるインターロイキン−1を5〜
10ツノ/ m 1または50%のに562やラージ細
胞と共に37°C、24It;’11fl培養すると、
これらの1.111胞はかなり(7)”El (I O
〜100μ/m+2) +7)l L −2を産生でき
るよ・うになる。
力・インの目iJjであるインターロイキン−1を5〜
10ツノ/ m 1または50%のに562やラージ細
胞と共に37°C、24It;’11fl培養すると、
これらの1.111胞はかなり(7)”El (I O
〜100μ/m+2) +7)l L −2を産生でき
るよ・うになる。
このようにし’(/lIi性化された細胞よりl 1.
、−2m RN八を抽出するには、細胞源の種類を問わ
ず常法によっ′(行41′えばよい。たとえば、NP−
10゜SDS、1〜すイン−X I 00.チオキシ、
TI−ル酸などの界面活性剤を添加することにより、:
Fだし、1機械的に均一化したり、凍結融解なとをii
な・うごとによりj111胞を部分的あるいは完全に破
壊する。
、−2m RN八を抽出するには、細胞源の種類を問わ
ず常法によっ′(行41′えばよい。たとえば、NP−
10゜SDS、1〜すイン−X I 00.チオキシ、
TI−ル酸などの界面活性剤を添加することにより、:
Fだし、1機械的に均一化したり、凍結融解なとをii
な・うごとによりj111胞を部分的あるいは完全に破
壊する。
m RN A抽出の際にリボヌクレアーゼ心、二よるR
Nへの分解を防くために、抽出液中にRNaseインヒ
ビター、たとえはヘパリン、ポリビニル硫酸、ヘントナ
イト、マカロイド、ジエチルピ1コカーボ不一1・、バ
ナジウム複合体なとを添加しておくのが望ましい。また
、場合に応じては、抗I L−2抗体を用いてI L
−2合成途−にのポリゾームを沈降−ヒしぬ、これより
m RNAを界面活性剤などで抽出する方法も行ない得
る。
Nへの分解を防くために、抽出液中にRNaseインヒ
ビター、たとえはヘパリン、ポリビニル硫酸、ヘントナ
イト、マカロイド、ジエチルピ1コカーボ不一1・、バ
ナジウム複合体なとを添加しておくのが望ましい。また
、場合に応じては、抗I L−2抗体を用いてI L
−2合成途−にのポリゾームを沈降−ヒしぬ、これより
m RNAを界面活性剤などで抽出する方法も行ない得
る。
また、poli八を含むm RNAはオリゴ(ビ1゛−
セルロース、セファロース2Bを担体とするポリ(J−
セファ(:]−スなどのアフィニティ・カラ去クロマI
・グラフィあるいはハツチ法、シ:l $1ii密度勾
配遠心法、アガ11−スケルミ気泳動法等の常法によっ
て分画や濃縮を行なうことができる。
セルロース、セファロース2Bを担体とするポリ(J−
セファ(:]−スなどのアフィニティ・カラ去クロマI
・グラフィあるいはハツチ法、シ:l $1ii密度勾
配遠心法、アガ11−スケルミ気泳動法等の常法によっ
て分画や濃縮を行なうことができる。
−1−記の如くして得られたm RNΔ画分がl +−
−2mRNA活性を有するものであることを確認するた
めには、m RNへ画分を催白に翻訳さ−H、その生理
活性を調べるか、抗IL−2ペプチド車りローン性抗体
を用い該翻訳蛋白を同定する等の方法を行なえは、(、
い。たとえばm RNAもま通゛、Iζ、アフリカ゛ン
メ力コニル(及9−的pus↓−acvis−)の卵G
こマイクロインシγ、クションすることにより(=+’
−1−ンら、 Nature、 −2,、−、fi−3
−、177= 182(1972))、あるいは網状赤
血球またしよ小麦胚無細胞翻訳システムを使用すること
に3t/)対1、する蛋白に翻訳される。
−2mRNA活性を有するものであることを確認するた
めには、m RNへ画分を催白に翻訳さ−H、その生理
活性を調べるか、抗IL−2ペプチド車りローン性抗体
を用い該翻訳蛋白を同定する等の方法を行なえは、(、
い。たとえばm RNAもま通゛、Iζ、アフリカ゛ン
メ力コニル(及9−的pus↓−acvis−)の卵G
こマイクロインシγ、クションすることにより(=+’
−1−ンら、 Nature、 −2,、−、fi−3
−、177= 182(1972))、あるいは網状赤
血球またしよ小麦胚無細胞翻訳システムを使用すること
に3t/)対1、する蛋白に翻訳される。
l L、 −2活性は、先Cントリスら(−1−リスら
9.1゜l mmuy+o l 、 +−上−2Q−,
2(+27−2F+33 (1978)’)によって基
本的には述へられているミクI−1検定l)二によって
確認できる。この検定法−ご番よ、4・IJスqlによ
ゲζTi(1;立され)こ参藝表方法も1″’、 ii
[ツ”C作)戊しブこイ、111胞障實性′1゛−リン
パ球8.+11胞株(以下、CT i I。
9.1゜l mmuy+o l 、 +−上−2Q−,
2(+27−2F+33 (1978)’)によって基
本的には述へられているミクI−1検定l)二によって
確認できる。この検定法−ご番よ、4・IJスqlによ
ゲζTi(1;立され)こ参藝表方法も1″’、 ii
[ツ”C作)戊しブこイ、111胞障實性′1゛−リン
パ球8.+11胞株(以下、CT i I。
と略記する。)のI L、−2に依存細胞0) l)
NΔ合成」Jを指標としている。1211ら、4xl(
1’イ1古1(7)CTL L細胞を2%のF CSを
含も[ン1)M+1640培地100μβに懸濁し、l
(] (] It 7!0)連続希釈した翻訳産物と
共に96穴の甲j戊マイクロプレートに接第1Iiする
。、37°C,5%002インキユヘーター中で20時
間培養した後、inl 11包を0.5/7 Ciの月
(−′I−d Rで4時間う・\ルし、自動II+胞バ
ーヘスターを用いて帯状ガラス繊維にに細胞を回収し、
♀111胞が取り込んだ放射能を液体シンチレーション
法で測定する。この検定法により、11゜−2存在下に
培養されたC TL L、細胞か投す法に応じて11I
−TdRを取り込むことが判明し7、このことから液体
中に含まれるl 1.−2のh)を明itに計算づる、
二とができる。
NΔ合成」Jを指標としている。1211ら、4xl(
1’イ1古1(7)CTL L細胞を2%のF CSを
含も[ン1)M+1640培地100μβに懸濁し、l
(] (] It 7!0)連続希釈した翻訳産物と
共に96穴の甲j戊マイクロプレートに接第1Iiする
。、37°C,5%002インキユヘーター中で20時
間培養した後、inl 11包を0.5/7 Ciの月
(−′I−d Rで4時間う・\ルし、自動II+胞バ
ーヘスターを用いて帯状ガラス繊維にに細胞を回収し、
♀111胞が取り込んだ放射能を液体シンチレーション
法で測定する。この検定法により、11゜−2存在下に
培養されたC TL L、細胞か投す法に応じて11I
−TdRを取り込むことが判明し7、このことから液体
中に含まれるl 1.−2のh)を明itに計算づる、
二とができる。
l L−2はT−リンパ球の増殖を促す/iζ性を有す
るので、IL−2活性をT細胞の増夕(((71!:竹
を指標として測定することができる。即ら5個のCi’
L L細胞を2%のFe2を含むDMEM 1 (1
0tt (!に移し、100μpの連続希釈した翻訳産
物とノ(に96穴の平底マイクロプレートに接種する。
るので、IL−2活性をT細胞の増夕(((71!:竹
を指標として測定することができる。即ら5個のCi’
L L細胞を2%のFe2を含むDMEM 1 (1
0tt (!に移し、100μpの連続希釈した翻訳産
物とノ(に96穴の平底マイクロプレートに接種する。
72文・l照li丁として100中イ立/mj!、10
中1)ン/ m 7!のII、−2を用い、この対照群
の増殖した/、L#llI胞数と比較して検体のIL−
2活性をめる。
中1)ン/ m 7!のII、−2を用い、この対照群
の増殖した/、L#llI胞数と比較して検体のIL−
2活性をめる。
このようにして最も高活性の両分から得られた1m−2
1丁112N△はd s−c I) NAを合1戊する
だめの鋳型として用い、d s −c I) I%IΔ
はヘクターDNAと結合ざ−1る。(: l) NAの
合成は1〕L来の方法によって114(う。
1丁112N△はd s−c I) NAを合1戊する
だめの鋳型として用い、d s −c I) I%IΔ
はヘクターDNAと結合ざ−1る。(: l) NAの
合成は1〕L来の方法によって114(う。
まず、m RNAを9寿型とし、オリコ゛(Jゴをゾラ
イマーとして用イd A−1” P、(] (ン1’
P、d C”r’ F’。
イマーとして用イd A−1” P、(] (ン1’
P、d C”r’ F’。
(I T i” Pのイrイ11・で逆転写酵素により
m RNAと相捕的なs s −c、 l)NAを合成
し、−フルカリ処理で鋳型m 12 NAを除去した後
、逆qj7;写酵素あるいはD NAポリメラーゼを用
いて上記の合成SSc D NAを鋳型にしてds−c
l)NAを合成する。
m RNAと相捕的なs s −c、 l)NAを合成
し、−フルカリ処理で鋳型m 12 NAを除去した後
、逆qj7;写酵素あるいはD NAポリメラーゼを用
いて上記の合成SSc D NAを鋳型にしてds−c
l)NAを合成する。
このようにし、て得られたds−cDNΔとり゛ツカ1
1ミセス・セレビシェの細胞中に71製できるレプリコ
ンを含む・〜フタ−1) NAから組換えl−) NA
が作られる。1−2かる後、この組換えl) NAはl
宿主細胞に3,11の込まれる。
1ミセス・セレビシェの細胞中に71製できるレプリコ
ンを含む・〜フタ−1) NAから組換えl−) NA
が作られる。1−2かる後、この組換えl) NAはl
宿主細胞に3,11の込まれる。
このd s −(: I) NA及びリンカ1:1ミ〜
セス・−1!レヒシエの細胞11じ(増殖し得るヘクタ
ー1つNAは、これらを結合さ−Uる前にエギソヌクレ
アーゼ処理。
セス・−1!レヒシエの細胞11じ(増殖し得るヘクタ
ー1つNAは、これらを結合さ−Uる前にエギソヌクレ
アーゼ処理。
化学合成1)NAltJi片の追加、ds−cl)NA
や・\ククー1)Nへの末端に連結可能な端末をつりる
ためにG、0〜鎖を伸ばすなど各種処理によって修飾さ
れる。これらの連結可能なI) N Aは、例えばΔ′
[゛P共存ドに′■゛4ファージのDNANカリゼによ
って−)ぎ合せることが出来る。
や・\ククー1)Nへの末端に連結可能な端末をつりる
ためにG、0〜鎖を伸ばすなど各種処理によって修飾さ
れる。これらの連結可能なI) N Aは、例えばΔ′
[゛P共存ドに′■゛4ファージのDNANカリゼによ
って−)ぎ合せることが出来る。
このようにして得られた組換えDNAによってクローン
化されたcDNΔを増巾させろため、またはI L−2
ポリペプチドを製造するために生細胞を形質転換する。
化されたcDNΔを増巾させろため、またはI L−2
ポリペプチドを製造するために生細胞を形質転換する。
ds−cl)NAはエシェリヒア・二1りまノこはエシ
ェリヒア・:Iりおよびザソカロミセス・セレビシェの
双方で増り16することができるヘクターと結びつける
ごとができる。これによりI L−2ポリペプチドをニ
2−ドする填伝子をエシェリヒア・コリを用いてJバ択
することができる。選択に使用するヘクターカくエシェ
リヒア・二Jすにおいてのみ]曽殖ごきるものごある場
合は、選択した逍伝rはその後ザノカロミセス・セレビ
シェにおい゛C増殖できるヘクターに挿入される。
ェリヒア・:Iりおよびザソカロミセス・セレビシェの
双方で増り16することができるヘクターと結びつける
ごとができる。これによりI L−2ポリペプチドをニ
2−ドする填伝子をエシェリヒア・コリを用いてJバ択
することができる。選択に使用するヘクターカくエシェ
リヒア・二Jすにおいてのみ]曽殖ごきるものごある場
合は、選択した逍伝rはその後ザノカロミセス・セレビ
シェにおい゛C増殖できるヘクターに挿入される。
エシェリヒア・コリで増殖できる・\フタ−としては、
p 、+ 1) P 219 、p 、+ 1’) P
2 ] 8 、 Y Rp3、y+=p ] 3.Y
I P l、p YC’l pYC2゜YF、p21
3.YI?I)17.YIp203およびp PGKが
ある。
p 、+ 1) P 219 、p 、+ 1’) P
2 ] 8 、 Y Rp3、y+=p ] 3.Y
I P l、p YC’l pYC2゜YF、p21
3.YI?I)17.YIp203およびp PGKが
ある。
組換えD NAを用いた宿主細胞の形質転換は宿主細胞
のプし叫・プラストを形成後能率よく行われる。
のプし叫・プラストを形成後能率よく行われる。
l L −2iff伝r−を保有する細胞は、次の2つ
の方法の何れかの方法により形質転換後付iXl[’I
IJ能である。
の方法の何れかの方法により形質転換後付iXl[’I
IJ能である。
(1)プラス−マイナス法;マイトジェンで活性化した
哺乳動物i+11胞より抽出したrn RNAを蔗糖密
度勾配遠心分離Gこ−(I l−12S画分とし′(部
分tri !W し7〕こ I L −2mRN 八
を調製 し2、、二 の;用質)精製rn RNAを鋳
型としζ用い121) 放1・1性ss−c、 I)
NAを合成−づる。アルカリ処理6ごてtlf型+n
RN Aを除去後、 ’!’−fPillされたC1N
△は、マイトジェン刺激しない削孔動物細胞から抽出さ
れた部分精製11−123mRNAでハイブリクイズす
る。引続いてハイブリダイズしなかったcl)NAとハ
イブリクイズしたc I) NA番、1ハイ1−1コニ
トシアパタイトカラムク1コマ1〜グラフィーで分画す
る。
哺乳動物i+11胞より抽出したrn RNAを蔗糖密
度勾配遠心分離Gこ−(I l−12S画分とし′(部
分tri !W し7〕こ I L −2mRN 八
を調製 し2、、二 の;用質)精製rn RNAを鋳
型としζ用い121) 放1・1性ss−c、 I)
NAを合成−づる。アルカリ処理6ごてtlf型+n
RN Aを除去後、 ’!’−fPillされたC1N
△は、マイトジェン刺激しない削孔動物細胞から抽出さ
れた部分精製11−123mRNAでハイブリクイズす
る。引続いてハイブリダイズしなかったcl)NAとハ
イブリクイズしたc I) NA番、1ハイ1−1コニ
トシアパタイトカラムク1コマ1〜グラフィーで分画す
る。
ハイブリクイズしなかったc’l)NAとハイブリダイ
ズしたc、 I) NAをそれぞれブ1−7−ブΔおよ
びプローブ1うと仮に呼ぶ。何れのトランスフォーマン
ト・も全く同一の方法によりそれぞれ二1・11セルロ
一刈月1(上で生育させる。ずなわら、キ1(1胞のI
) NAをアルカリ処理にて濾紙上に固定する。プロー
ブAおよび13をそれぞれ二つの異った濾紙1−でDN
Aとハイブリダイズさ一ロる。その後、オーi・ラジオ
グラフィーを行なってブにl−ブΔと反応する1ランス
フメーマント(シラス)、プ1コー713と僅かにまた
は全熱反応しないトランスフォーマント(マイナス)を
選別する(谷L1ら;Proc、 、Iap。
ズしたc、 I) NAをそれぞれブ1−7−ブΔおよ
びプローブ1うと仮に呼ぶ。何れのトランスフォーマン
ト・も全く同一の方法によりそれぞれ二1・11セルロ
一刈月1(上で生育させる。ずなわら、キ1(1胞のI
) NAをアルカリ処理にて濾紙上に固定する。プロー
ブAおよび13をそれぞれ二つの異った濾紙1−でDN
Aとハイブリダイズさ一ロる。その後、オーi・ラジオ
グラフィーを行なってブにl−ブΔと反応する1ランス
フメーマント(シラス)、プ1コー713と僅かにまた
は全熱反応しないトランスフォーマント(マイナス)を
選別する(谷L1ら;Proc、 、Iap。
八cad、、V 上5−5B 464 〜469(19
79)) 。
79)) 。
(2)第2の方法は、例えはI 00 (1〜1 (1
000のトランスフォーマント 百りじ1−ン宛のグループに大別し、それぞれのり「7
−ングループを常法によって培養し−ζプラスミド’
D NA3を調製する。次いで、これらプラスミドI)
NA3を例えは熱変性して5scDN八に変換し、この
・BS−cl)NAを二1・1」セルlコース1紙−に
に固定し、活性化11.−2 m lマNへを含有する
削孔動物細胞から調製されたm 12 NAと相補的に
ハイソリタ・イセーソ3Iンを11なう。ある0はまた
、111.−’l mRNAを含有−づる「Y11ンN
ΔSを熱変性したプラスト11〕NΔSとノ゛・・イフ
′リタイスさせるとD NA 1丁11?NΔノ\・イ
ソ゛リノ1〜力)J−1・l:1セ月ルース炉8氏日こ
踵1定さ旧7る。このシ戸翁(を1m MのHIF、
P IE S、あるいはlomMの食塩水0)ような低
塩類緩衝71にで洗浄し、炉祇−日、二吸着さ41゜た
m RNAを(1,5m M E l) i”Δおよび
0.1%S l) S熔液含イi液で例えば95℃、1
う(間処理し7て抽出する。精製m RNAはこれをオ
リ:f d l’ −セルロースカラJ、り11マドグ
ラフイーにてン容11日ii1収する。次いご、m R
NAをアフリカ゛ンメカニ11)Lノの卯にマイクしコ
インジエクシシ1ンして蛋白質Gこδ11訳してlI、
2 ’/1!!性をモイ「認する。ある(、sはm
IンNΔに依存性のN1tl状赤血球系または小麦胚の
in\+itr。
000のトランスフォーマント 百りじ1−ン宛のグループに大別し、それぞれのり「7
−ングループを常法によって培養し−ζプラスミド’
D NA3を調製する。次いで、これらプラスミドI)
NA3を例えは熱変性して5scDN八に変換し、この
・BS−cl)NAを二1・1」セルlコース1紙−に
に固定し、活性化11.−2 m lマNへを含有する
削孔動物細胞から調製されたm 12 NAと相補的に
ハイソリタ・イセーソ3Iンを11なう。ある0はまた
、111.−’l mRNAを含有−づる「Y11ンN
ΔSを熱変性したプラスト11〕NΔSとノ゛・・イフ
′リタイスさせるとD NA 1丁11?NΔノ\・イ
ソ゛リノ1〜力)J−1・l:1セ月ルース炉8氏日こ
踵1定さ旧7る。このシ戸翁(を1m MのHIF、
P IE S、あるいはlomMの食塩水0)ような低
塩類緩衝71にで洗浄し、炉祇−日、二吸着さ41゜た
m RNAを(1,5m M E l) i”Δおよび
0.1%S l) S熔液含イi液で例えば95℃、1
う(間処理し7て抽出する。精製m RNAはこれをオ
リ:f d l’ −セルロースカラJ、り11マドグ
ラフイーにてン容11日ii1収する。次いご、m R
NAをアフリカ゛ンメカニ11)Lノの卯にマイクしコ
インジエクシシ1ンして蛋白質Gこδ11訳してlI、
2 ’/1!!性をモイ「認する。ある(、sはm
IンNΔに依存性のN1tl状赤血球系または小麦胚の
in\+itr。
無細胞合成系を用いてこのmRNAを蛋白に翻訳さ−け
、抗I L −2抗体を用いてIL−27/活性を分析
する。これらの処理によってr L−2’4!i性が検
出されたグループをさらに小数のトランスフォーマント
りし1−ンを含有するnYに類別し、Hk%的にはI
1.−2 1)NAをイjする単一りし1−ンが特定さ
れるまで繰返し実施する。
、抗I L −2抗体を用いてIL−27/活性を分析
する。これらの処理によってr L−2’4!i性が検
出されたグループをさらに小数のトランスフォーマント
りし1−ンを含有するnYに類別し、Hk%的にはI
1.−2 1)NAをイjする単一りし1−ンが特定さ
れるまで繰返し実施する。
11−7−2産生能のある1−ランスフォーマントより
I 1.、−2ポリペプチドをフードするC19N八を
1!するには、先ずトランスフォーマント中のII I
MえDNA体を分離し、これを制限酵素エンドヌクレア
ーゼで切断する。切断によって形成されるl) NA1
す11゛、より&、II込まれたcDNA画分を分離す
る。
I 1.、−2ポリペプチドをフードするC19N八を
1!するには、先ずトランスフォーマント中のII I
MえDNA体を分離し、これを制限酵素エンドヌクレア
ーゼで切断する。切断によって形成されるl) NA1
す11゛、より&、II込まれたcDNA画分を分離す
る。
p I +−2−50Aの組換えDNA体より]I、=
2ポリペプチドをコードするI’5LIDNΔインリ−
−1〜全ヌクレオヂド配列はマキサム−ギルバー1−法
(Meth、 Enzym、65.499〜560゜(
1980))ならびにシデオキシヌクレチド鎖末端法(
スミス、八、 、1. M、 Metb、 lir+z
ym、 −(i 5−。
2ポリペプチドをコードするI’5LIDNΔインリ−
−1〜全ヌクレオヂド配列はマキサム−ギルバー1−法
(Meth、 Enzym、65.499〜560゜(
1980))ならびにシデオキシヌクレチド鎖末端法(
スミス、八、 、1. M、 Metb、 lir+z
ym、 −(i 5−。
560・〜□ 580 (1980) )にて決定され
た。
た。
cl)NΔバインートの1h11限酵素:iエンドヌク
レアーゼによるリノ断図および塩基配列を第1図および
第2図(al !、こ小づ。第2図(al 4こ示ずご
と(、ごのcDNA4土そ、11.ぞれll5L N
l 、Xba I 、BsLN lなる制限I’ll素
エノ1ヌクレアーゼでLJJ断される部位を有する。
レアーゼによるリノ断図および塩基配列を第1図および
第2図(al !、こ小づ。第2図(al 4こ示ずご
と(、ごのcDNA4土そ、11.ぞれll5L N
l 、Xba I 、BsLN lなる制限I’ll素
エノ1ヌクレアーゼでLJJ断される部位を有する。
木cDNAイン・す−1・のDNA配列ば一つの大きな
オーブンリーディングフレームを保イjする。
オーブンリーディングフレームを保イjする。
真核生物の読め取り開始配列として通常役立つ第一のA
Tc配列(二Iザック、 M、 Ce11. j−5
。
Tc配列(二Iザック、 M、 Ce11. j−5
。
1109〜1123 (+ 978))は、5′一端か
ら48.50ヌクレオチF位に見出され、読め柊りトリ
プレソb ’I” GΔが存在するヌクレオチド位50
7−509迄152の二J−トンがこのΔ′1゛GGこ
つな力くっている。rn RNへの3 ’−poly(
八)末q:Mに相当するA残恭のつながりかc、 I)
NΔ末端に見出され、通常真核生物m RNへのほと
んどに見出される6個からなるヌクレオヂトAへ′「Δ
Δ△(771−77fi位)が先に位置する(プラウ1
フッ1−、ブラ1”ノンリー、 Nature 2 足
夫、211−214 (1976))。
ら48.50ヌクレオチF位に見出され、読め柊りトリ
プレソb ’I” GΔが存在するヌクレオチド位50
7−509迄152の二J−トンがこのΔ′1゛GGこ
つな力くっている。rn RNへの3 ’−poly(
八)末q:Mに相当するA残恭のつながりかc、 I)
NΔ末端に見出され、通常真核生物m RNへのほと
んどに見出される6個からなるヌクレオヂトAへ′「Δ
Δ△(771−77fi位)が先に位置する(プラウ1
フッ1−、ブラ1”ノンリー、 Nature 2 足
夫、211−214 (1976))。
cDNAによってコードされるアミノ酸配列は第2図(
bl (アミノ酸配列])のどと<611えきでき、し
かもアミノ酸配列■のポリペプチドは153個のアミノ
酸からなり、その分子量は17G3]、7ダルトンと旧
算される。今日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見ら
れると報告されているように(ゾロウヘルら、 Sym
、 Soc、 exp、 Med、4.’i−,9〜3
6 (1979)) 、上記演えきIL−2ポリペブチ
lのN末端領域はやはり疎水性である。本領域は成FJ
I I L −2の分泌時に切断されるシグナルベブチ
トの役割を果しているであろう。このような切14Ji
4;l: 2 (1−21位のセリンとアラニン間て
起るか、2122位間のアシーンとプロリン間で起こり
、アミノ酸配列11およびIIIをイji’ するポリ
ペプチドを形成する。(iiJ故ならば同様なLJJ
1iJi部(\ンは今)2知られたその他の分7必蛋白
にもしばし7ば見出されているからである(ブロウヘル
ら、 Symp。
bl (アミノ酸配列])のどと<611えきでき、し
かもアミノ酸配列■のポリペプチドは153個のアミノ
酸からなり、その分子量は17G3]、7ダルトンと旧
算される。今日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見ら
れると報告されているように(ゾロウヘルら、 Sym
、 Soc、 exp、 Med、4.’i−,9〜3
6 (1979)) 、上記演えきIL−2ポリペブチ
lのN末端領域はやはり疎水性である。本領域は成FJ
I I L −2の分泌時に切断されるシグナルベブチ
トの役割を果しているであろう。このような切14Ji
4;l: 2 (1−21位のセリンとアラニン間て
起るか、2122位間のアシーンとプロリン間で起こり
、アミノ酸配列11およびIIIをイji’ するポリ
ペプチドを形成する。(iiJ故ならば同様なLJJ
1iJi部(\ンは今)2知られたその他の分7必蛋白
にもしばし7ば見出されているからである(ブロウヘル
ら、 Symp。
So(:、 exp、 Mcd、33. 9〜36 (
197つ))。
197つ))。
従って、成熟IL2ポリペプチドは133あるいは13
2個のアミノ酸を含有し、分子量1ま15420.5ま
人二は+5349.、iダルトンされる。本分子)d値
はジj〜ルカノト細胞から得られたヒl− 1 1.、
2蛋白の分子量(15000ダルトン)として報告され
たものに対比される(ギリスら. Immuno lB
ical llev.+ 6 1, 6 7〜209(
1 9 8 2) )。また、塩基配列111〜113
位にあるC C T::1−ト′ンから始まるL) N
△断JV、ずなわち22位に位置するプじ1リンから始
まるポリペプチドに幻するコード(第2 1PI ib
l中のアミノ酸配列III )は実施例5に示すように
、11.− 2活性を有するポリペブチ1を表現してい
ることが6′C1認された。塩基配列107〜I l
O (j>にあるGC△配列から始まるI) NA1υ
i片、ずなわ621位(第2図fblのアミノ酸配列I
+)に位置するアラニンから始まるポリペプチドをコー
トする1)Nへ断片は、実施例8に示ずごとく、z.、
−z/占j’lをイ1するポリペブチ1を表現している
ことが(r(+°認された。
2個のアミノ酸を含有し、分子量1ま15420.5ま
人二は+5349.、iダルトンされる。本分子)d値
はジj〜ルカノト細胞から得られたヒl− 1 1.、
2蛋白の分子量(15000ダルトン)として報告され
たものに対比される(ギリスら. Immuno lB
ical llev.+ 6 1, 6 7〜209(
1 9 8 2) )。また、塩基配列111〜113
位にあるC C T::1−ト′ンから始まるL) N
△断JV、ずなわち22位に位置するプじ1リンから始
まるポリペプチドに幻するコード(第2 1PI ib
l中のアミノ酸配列III )は実施例5に示すように
、11.− 2活性を有するポリペブチ1を表現してい
ることが6′C1認された。塩基配列107〜I l
O (j>にあるGC△配列から始まるI) NA1υ
i片、ずなわ621位(第2図fblのアミノ酸配列I
+)に位置するアラニンから始まるポリペプチドをコー
トする1)Nへ断片は、実施例8に示ずごとく、z.、
−z/占j’lをイ1するポリペブチ1を表現している
ことが(r(+°認された。
真核生物の遺伝7− ti+:例えはヒ1−インターフ
エし1ン遺伝子においてしばしは多形現象をボすことが
知られている(谷L1ら, Gpne.lj) 、!
1 〜l 5(1980)、大野、合口、、Proc、
Na1.1.八c、ad。
エし1ン遺伝子においてしばしは多形現象をボすことが
知られている(谷L1ら, Gpne.lj) 、!
1 〜l 5(1980)、大野、合口、、Proc、
Na1.1.八c、ad。
Sci、USA、 7二−7、5305〜 5309
(1981);グレイIら、 Nature 2.95
. 50 j〜508(1981))。この多形現象に
よって、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換される
場合もあれば、蛋白生産物の構造が変わらない場合もあ
る。
(1981);グレイIら、 Nature 2.95
. 50 j〜508(1981))。この多形現象に
よって、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換される
場合もあれば、蛋白生産物の構造が変わらない場合もあ
る。
ヒト+1.−2 cDNAの場合、plL 2−50Δ
cDNAの503位のA残基(第2図)がG残基て置
き換えられた他のcDNAりL+−ン(pH,,2−5
0Δ)も検出できる。l) I l−2−50A cD
NAとは塩基配列が異なるその他のcDNAクローンの
存在jも期待できる。
cDNAの503位のA残基(第2図)がG残基て置
き換えられた他のcDNAりL+−ン(pH,,2−5
0Δ)も検出できる。l) I l−2−50A cD
NAとは塩基配列が異なるその他のcDNAクローンの
存在jも期待できる。
上記説明からも明らかなごとく、本発明の遺伝子は、第
2図ta+に示された塩基配列を有する1つNA。
2図ta+に示された塩基配列を有する1つNA。
/l 8−50位のへ1゛G配列から始まり、504〜
506位にある少くともA T C配列に至る連続塩基
配列を有するDN’、A、108−110位0) OC
A配列から始まり、OCA配列から少くともAT Cロ
ートンに至る連続塩基配列を有するDNA、また!11
−113位のOCT配列から始まり、少くともΔ′1゛
C配列に至る連続塩基配列を有するDNAを包含する。
506位にある少くともA T C配列に至る連続塩基
配列を有するDN’、A、108−110位0) OC
A配列から始まり、OCA配列から少くともAT Cロ
ートンに至る連続塩基配列を有するDNA、また!11
−113位のOCT配列から始まり、少くともΔ′1゛
C配列に至る連続塩基配列を有するDNAを包含する。
本発明の遺伝子はまた、504〜50 [i I7の△
CT配列に終り、1イ1ンの八に始まるDNA、411
−50位のΔ]゛(:配列で始まるDNA、lolli
lo位のG CΔ配列で始まる1) NAまたはl i
I−113位のにCT配列で始まるDNAを包含゛j
る。さらに、本発明の遺伝子は507−5 (1!1位
の′I″GΔ配列に終り、1位の八に始まるI)NA、
dll−50位のΔ′1゛G配列に始まるDNA、I(
18−110位の(ンCΔ配列に始まるDNA)(二た
はl l 1−113位のCC′F配列に始まる1つN
Aを包含する。本発明の遺伝子は、さらに801位のC
で終り、1位の八で始まるDNA、48−50位のA
TGC配列始まるD NA。
CT配列に終り、1イ1ンの八に始まるDNA、411
−50位のΔ]゛(:配列で始まるDNA、lolli
lo位のG CΔ配列で始まる1) NAまたはl i
I−113位のにCT配列で始まるDNAを包含゛j
る。さらに、本発明の遺伝子は507−5 (1!1位
の′I″GΔ配列に終り、1位の八に始まるI)NA、
dll−50位のΔ′1゛G配列に始まるDNA、I(
18−110位の(ンCΔ配列に始まるDNA)(二た
はl l 1−113位のCC′F配列に始まる1つN
Aを包含する。本発明の遺伝子は、さらに801位のC
で終り、1位の八で始まるDNA、48−50位のA
TGC配列始まるD NA。
108−11 +1位のOCA配列で始まるI) N
Aまたは111−113位のCCT配列で始まるI)N
Aを包含する。本発明の遺伝子はまたpoly(A)で
終り、48−50位のATGコーローンから始まるDN
A、10B−110位のGCA配列で始まるDNAまた
ば1jl−113位のOCT配列で始まるI) N A
を含む。
Aまたは111−113位のCCT配列で始まるI)N
Aを包含する。本発明の遺伝子はまたpoly(A)で
終り、48−50位のATGコーローンから始まるDN
A、10B−110位のGCA配列で始まるDNAまた
ば1jl−113位のOCT配列で始まるI) N A
を含む。
また、本発明はアミノ酸配列1.n、Illに相当する
塩基配列を有する遺伝子を含む。アミノ酸配列Iの中で
14IPi+ないしそれ以」−のアミノ酸を欠くポリペ
ブチl1、あるいはアミノ酸配列Iの中の1個ないしそ
れ以−にのアミノ酸が1個ないしそれ以上のアミノ酸で
置換されたポリペブチF4;l: l L −2活性を
有することもある。従って、この様なポリペプチドをロ
ー1する遺伝子は本発明の遺伝子として好適である。同
様にアミノ酸配列1.11またはlIIに対して1個な
いしそれ以」―の−j′ミノ酸を表現し得る1個ないし
それ以上の塩基配列を全労に結合し7た遺伝子であって
も追加されたアミノ酸が、ポリペプチドのI L−2活
性発現に邪魔しない限り本発明の中に包含される。I
L−2とL/(のポリペプチド機能を1(11害する追
加アミノ酸領域を有する修飾領域であっても遣方11さ
れた領域が容易に除去出来るものならば本発明の遺伝子
とU7て利用出来る。同じことはアミノ酸配列1,11
およびnlをそれぞれ有するアミノ酸配列!、1.tお
よび■のC−末◇:i;に追加アミノ酸をロー1するア
ミノ酸配列1.II;l:;よひIIIに対する遺伝子
の3′−末端へのD N Aの追加結合の場合にも蕗え
る。従って、この4娘なポリペプチドを二]−トするj
貞(云了の利用は、本発明に包含される。
塩基配列を有する遺伝子を含む。アミノ酸配列Iの中で
14IPi+ないしそれ以」−のアミノ酸を欠くポリペ
ブチl1、あるいはアミノ酸配列Iの中の1個ないしそ
れ以−にのアミノ酸が1個ないしそれ以上のアミノ酸で
置換されたポリペブチF4;l: l L −2活性を
有することもある。従って、この様なポリペプチドをロ
ー1する遺伝子は本発明の遺伝子として好適である。同
様にアミノ酸配列1.11またはlIIに対して1個な
いしそれ以」―の−j′ミノ酸を表現し得る1個ないし
それ以上の塩基配列を全労に結合し7た遺伝子であって
も追加されたアミノ酸が、ポリペプチドのI L−2活
性発現に邪魔しない限り本発明の中に包含される。I
L−2とL/(のポリペプチド機能を1(11害する追
加アミノ酸領域を有する修飾領域であっても遣方11さ
れた領域が容易に除去出来るものならば本発明の遺伝子
とU7て利用出来る。同じことはアミノ酸配列1,11
およびnlをそれぞれ有するアミノ酸配列!、1.tお
よび■のC−末◇:i;に追加アミノ酸をロー1するア
ミノ酸配列1.II;l:;よひIIIに対する遺伝子
の3′−末端へのD N Aの追加結合の場合にも蕗え
る。従って、この4娘なポリペプチドを二]−トするj
貞(云了の利用は、本発明に包含される。
生Ill胞中でI L−2産生を指示する組換えI)N
A体は種々の方法で作ることができる。例えば、I L
−2CI)NAをコードする配列を発現ヒークルのプロ
モーター配列下流にλ[i込むことができる。あるいは
プI」モーター配列を持つcl)NAJ)を発現ヒーク
ルのcl)NΔ挿入の前あるいは後Gこ11、、−2を
′:1−1ずろ配列の」−流に糺込むことが出来る。
A体は種々の方法で作ることができる。例えば、I L
−2CI)NAをコードする配列を発現ヒークルのプロ
モーター配列下流にλ[i込むことができる。あるいは
プI」モーター配列を持つcl)NAJ)を発現ヒーク
ルのcl)NΔ挿入の前あるいは後Gこ11、、−2を
′:1−1ずろ配列の」−流に糺込むことが出来る。
11− 2 (1)NAを発現し、l L、−2ポリペ
プチドを産生ずるナソカロミセス・セレヒシエの造成法
の例を1・−記に訂述する。
プチドを産生ずるナソカロミセス・セレヒシエの造成法
の例を1・−記に訂述する。
西¥員−−−コニシェリヒア・コリ ツヤ1ル・ベクタ
ーp A T77おcl゛ひpΔM82が宮[・ら(l
’rocNaL1. 八c、ad、Sci、 U S
Δ B 実、 I 5(19B3))によって報告され
−ζいる。ヘクタ−p八M82はpΔ′F77の誘導体
であり、両者とも見上(ステインチコームら、 Ni]
Lure −鼾影I。
ーp A T77おcl゛ひpΔM82が宮[・ら(l
’rocNaL1. 八c、ad、Sci、 U S
Δ B 実、 I 5(19B3))によって報告され
−ζいる。ヘクタ−p八M82はpΔ′F77の誘導体
であり、両者とも見上(ステインチコームら、 Ni]
Lure −鼾影I。
39−43 (1979)、2μm 部1 (ブローチ
ら、 Gene、8゜、121−133 (1979)
。
ら、 Gene、8゜、121−133 (1979)
。
leu 2 (ジノ−1−ンら、 Proc、 Nat
l、八cad、 Sci。
l、八cad、 Sci。
USA 74.474−491 (1979))のマー
カーおよび酵母、の酸1生フオスフブターセ(AP ;
3 S e )遺伝子に対するプロモーターを持ってい
る。両ヘククーともアンピシリン耐性マーカー(八p’
)を持つpBR322の3700塩基からなるI) N
A画分と増111オリジンを持っている (第5図)
。APaSeブ1:Jモーターは培養液中で高dz度リ
ン酸を低fHInにソフトするごとにより始めて誘導さ
れる。ヒトl L −2(: I) NAを発現さ見上
るために、p I L I 2−5 (lΔをエシェリ
ヒア・コリのフレノウ断片またはi’4DNΔポリメラ
ーゼで処理した後、Pstlで切断し、このcl)NA
と予めXholで切断したpAM82をつなぎ合わせ、
エシェリヒア・コリのフレノウ断片と共にインキュへ−
1・し゛ζ末端をうめる。
カーおよび酵母、の酸1生フオスフブターセ(AP ;
3 S e )遺伝子に対するプロモーターを持ってい
る。両ヘククーともアンピシリン耐性マーカー(八p’
)を持つpBR322の3700塩基からなるI) N
A画分と増111オリジンを持っている (第5図)
。APaSeブ1:Jモーターは培養液中で高dz度リ
ン酸を低fHInにソフトするごとにより始めて誘導さ
れる。ヒトl L −2(: I) NAを発現さ見上
るために、p I L I 2−5 (lΔをエシェリ
ヒア・コリのフレノウ断片またはi’4DNΔポリメラ
ーゼで処理した後、Pstlで切断し、このcl)NA
と予めXholで切断したpAM82をつなぎ合わせ、
エシェリヒア・コリのフレノウ断片と共にインキュへ−
1・し゛ζ末端をうめる。
cDNAをローl゛する配列を酵母ΔP a Saプロ
モーター配列のド流に持つハイブリットプラスミドはエ
シェリヒア・コリにてりl−1−ニングし選択する。得
られたp Y I L−2aプフスミトを酵母に組み込
み、AP a s Cプト1モーターの誘導を行なった
のら酵1り抽出液中にIL−2店性が検出される。プラ
スミF’pYll−2aは酵+++ブしJモーターと1
1、−2 c I) Nへの間に〔;0残貼の伸びてい
る部分を持っている。この様な配列釣用L−2cl)N
Aの発現を阻害づ−る可能性もある。この問題を克服す
るにはプラスミド構造を次の様にすることができる。ず
なわら、p l 1..2−50AプラスミI41−工
。j p−1で切断し、(: l) NΔ挿入部分を屯
離する。次いで、このcl)NAをdΔi’ P。
モーター配列のド流に持つハイブリットプラスミドはエ
シェリヒア・コリにてりl−1−ニングし選択する。得
られたp Y I L−2aプフスミトを酵母に組み込
み、AP a s Cプト1モーターの誘導を行なった
のら酵1り抽出液中にIL−2店性が検出される。プラ
スミF’pYll−2aは酵+++ブしJモーターと1
1、−2 c I) Nへの間に〔;0残貼の伸びてい
る部分を持っている。この様な配列釣用L−2cl)N
Aの発現を阻害づ−る可能性もある。この問題を克服す
るにはプラスミド構造を次の様にすることができる。ず
なわら、p l 1..2−50AプラスミI41−工
。j p−1で切断し、(: l) NΔ挿入部分を屯
離する。次いで、このcl)NAをdΔi’ P。
d G ’FI) 、d i” i’ I)共存下、−
1’ 41.) N△ポリメラーゼで処理してcDNA
の両端にあるC−残基の伸びている部分を切りすて、次
にヌクレアーゼ−ジ±で処理し、G残基の伸びている部
分を除去する。
1’ 41.) N△ポリメラーゼで処理してcDNA
の両端にあるC−残基の伸びている部分を切りすて、次
にヌクレアーゼ−ジ±で処理し、G残基の伸びている部
分を除去する。
このDNAは%−1tol DNAリンカ−およびE
c o R1部位が切断され、Ec oRIとフレノウ
断片でフラノツユされたプラスミドp B l? 32
2とを−)なき合ね−d、、 4j)られたプラスミド
p11゜2− xl+ oをXholで切断してcDN
ΔDNA分を単面1する。このcl)NAを次にpΔM
82の一一一つの及I−1部位に導入し、酵母AI−’
a s eプロモーターに関しては正しく配置された
l L −2をロー1する配列を有するプラスミドをエ
シェリヒア・:1りにクローンする。得られたプラスミ
ドpYI+、−2bを酵母に導入し、Δpaseプし1
モーターを誘入りしたのぢ酵母抽出液中にI +、、
−2活性を検出する。
c o R1部位が切断され、Ec oRIとフレノウ
断片でフラノツユされたプラスミドp B l? 32
2とを−)なき合ね−d、、 4j)られたプラスミド
p11゜2− xl+ oをXholで切断してcDN
ΔDNA分を単面1する。このcl)NAを次にpΔM
82の一一一つの及I−1部位に導入し、酵母AI−’
a s eプロモーターに関しては正しく配置された
l L −2をロー1する配列を有するプラスミドをエ
シェリヒア・:1りにクローンする。得られたプラスミ
ドpYI+、−2bを酵母に導入し、Δpaseプし1
モーターを誘入りしたのぢ酵母抽出液中にI +、、
−2活性を検出する。
組換えD N A体を取込んだ細胞を培養してi11換
えL)NA体を増11]シあるいはIL−2ポリペプチ
ドを生産する。この培養は通常の方法で行なわれる。例
えばi・ランスツメ−J、した酵母を炭素源。
えL)NA体を増11]シあるいはIL−2ポリペプチ
ドを生産する。この培養は通常の方法で行なわれる。例
えばi・ランスツメ−J、した酵母を炭素源。
窒素源、 jjjE機塩類、必要あれば、ビタミン、ア
ミノ酸の9oき有機栄養源を含有する培地で20°0な
いし37°Cの範囲、pl−14〜7にて好気的条件ト
で行なう。細胞内または細胞外に生産されたl t。
ミノ酸の9oき有機栄養源を含有する培地で20°0な
いし37°Cの範囲、pl−14〜7にて好気的条件ト
で行なう。細胞内または細胞外に生産されたl t。
−2は硫安沈′A殿、塩類除去のための透+Ji′(常
圧または減圧ト)、ゲル濾過、クロマ1〜グラフイー。
圧または減圧ト)、ゲル濾過、クロマ1〜グラフイー。
等電点平板」1濃1’l!i 、リール電気泳動、高速
71シ体り1コマlグラフイー(以「IT P L C
と略記)、(イオン交換、す゛ル濾過並びに逆相クロマ
トグラフィー)および色素結僑担体、(L−21こ対す
るモノクl:1−ナル抗体を結合した活11化セファロ
ース4 Bまたはレクチン結合セファロース4B等によ
るアフィニティクロマ1グラフィー等、公知の方法によ
って回収することができる。I L−2のり1月1精製
法はワトソンら、1.1jxp、 Med、 、上旦準
、 849−861 (1979)、キリスらJ、 I
mmunol、。
71シ体り1コマlグラフイー(以「IT P L C
と略記)、(イオン交換、す゛ル濾過並びに逆相クロマ
トグラフィー)および色素結僑担体、(L−21こ対す
るモノクl:1−ナル抗体を結合した活11化セファロ
ース4 Bまたはレクチン結合セファロース4B等によ
るアフィニティクロマ1グラフィー等、公知の方法によ
って回収することができる。I L−2のり1月1精製
法はワトソンら、1.1jxp、 Med、 、上旦準
、 849−861 (1979)、キリスらJ、 I
mmunol、。
」1本、+951−1962 (1980)、重列ら、
J、Immunol、門cLhods 39. 18
5 201(1980)、1ンエルテら、 、1.1i
xp、 1lad、。
J、Immunol、門cLhods 39. 18
5 201(1980)、1ンエルテら、 、1.1i
xp、 1lad、。
156、 7154−464 (1982))によって
報告されている。
報告されている。
かくしてl)られノこポリペプチド′はマーfトジ]ニ
ン刺激によって哺乳動物細胞から作られるI L −2
について知られているものと同一・の生化学的並びに生
物学的挙動を示し、かつI L −2活性を有する。分
−r量は約15000ダルl−7テアリI I−−2活
性は、I(Hsorb (Enzyme Center
)の様な免疫吸着剤の有無にかかわらず完全に中和さ
れ、抗モノクローナル抗IL−2抗体で沈澱した。免疫
電気泳動においてIL−2ポリペプヂトは対応する抗I
L −2抗体に対して唯1個の沈降線を示す。
ン刺激によって哺乳動物細胞から作られるI L −2
について知られているものと同一・の生化学的並びに生
物学的挙動を示し、かつI L −2活性を有する。分
−r量は約15000ダルl−7テアリI I−−2活
性は、I(Hsorb (Enzyme Center
)の様な免疫吸着剤の有無にかかわらず完全に中和さ
れ、抗モノクローナル抗IL−2抗体で沈澱した。免疫
電気泳動においてIL−2ポリペプヂトは対応する抗I
L −2抗体に対して唯1個の沈降線を示す。
IL−2活性は2−メルカプトエタノールで還元後も安
定であり、DNA5eおよびRNA5e処理してもある
いは56’C,30分熱処理しζも安定である。活性は
p H2〜9で安定である。この様にして生産されたI
L −2はモノクローナルな機能を有する′■゛細胞
(細胞障害性Tリンパ球)の増殖を促進し、胸腺細胞の
分裂を強め、さらに抗原非存在ド、メモリー状態から抗
癌持戒的細胞障害性’l’ リンパ球への分化を惹き起
ごず。また、YAC−1左111胞やl’? L♂工細
胞に対するナチュラルキラー細胞の活性化の増強に役)
′1つ。
定であり、DNA5eおよびRNA5e処理してもある
いは56’C,30分熱処理しζも安定である。活性は
p H2〜9で安定である。この様にして生産されたI
L −2はモノクローナルな機能を有する′■゛細胞
(細胞障害性Tリンパ球)の増殖を促進し、胸腺細胞の
分裂を強め、さらに抗原非存在ド、メモリー状態から抗
癌持戒的細胞障害性’l’ リンパ球への分化を惹き起
ごず。また、YAC−1左111胞やl’? L♂工細
胞に対するナチュラルキラー細胞の活性化の増強に役)
′1つ。
以上本発明を説明したが、以下に示す実施例により一層
理解されるだろう。しかしながら1.Lれらの実施例1
まip、なる例示にずぎす、本発明を限定実施例 A、1L−2ポリベプ千Fをコートする遺伝子の製造(
11 (1) ヒトT細胞系白血病細胞株であるジ1.ルヵノ
ト細胞(1ヨ1本、西独およ、び米国で自由に入手可能
である)を10容量%ト’ CSを含む[ン1)M11
640培地にりん濁し、X線照射装置E x 5150
/3001(東芝製)を用いて50秒間、室温で10
(10(lレントゲンに達するまでX!!fAを照射し
た。その後、照射された細胞を一1xiホの培地中、初
期細胞密j度lXIO3個/mIで5%炭酸ガス、37
’(:のイア 4’ −:+、 ベーター中で!i
l−1間培j7し ]こ。
理解されるだろう。しかしながら1.Lれらの実施例1
まip、なる例示にずぎす、本発明を限定実施例 A、1L−2ポリベプ千Fをコートする遺伝子の製造(
11 (1) ヒトT細胞系白血病細胞株であるジ1.ルヵノ
ト細胞(1ヨ1本、西独およ、び米国で自由に入手可能
である)を10容量%ト’ CSを含む[ン1)M11
640培地にりん濁し、X線照射装置E x 5150
/3001(東芝製)を用いて50秒間、室温で10
(10(lレントゲンに達するまでX!!fAを照射し
た。その後、照射された細胞を一1xiホの培地中、初
期細胞密j度lXIO3個/mIで5%炭酸ガス、37
’(:のイア 4’ −:+、 ベーター中で!i
l−1間培j7し ]こ。
この変異細胞((1,2個/穴)を96穴の平底の一フ
ィクロプレーIθ月0穴にまき、5%炭酸カス、37°
Cのインキ7.ベーター中で21E1間培養した。
ィクロプレーIθ月0穴にまき、5%炭酸カス、37°
Cのインキ7.ベーター中で21E1間培養した。
住育を示す穴から得られるり1−J−ンはりI′t−ン
リイスを増大させるため繰り返し新たな培地−1移した
。その増大したクローンはCo n△ 50 p t:
/mρ存在下で初期細胞密度I X l O’″個/m
7!で24時間培養した。そしてI L、−2?1!i
性を前述の方法に従って1lll定した。
リイスを増大させるため繰り返し新たな培地−1移した
。その増大したクローンはCo n△ 50 p t:
/mρ存在下で初期細胞密度I X l O’″個/m
7!で24時間培養した。そしてI L、−2?1!i
性を前述の方法に従って1lll定した。
ごの結果、親株のジュルカソトからクローン化されたジ
ュルカソト−111(以後” 、J−111”と1略6
己する。) (ΔT”CCCRL 8129)と命名さ
れたヒI−1’細胞が選択され、そのI 1.、−2産
生能は親株の40倍に増加し゛(いた。
ュルカソト−111(以後” 、J−111”と1略6
己する。) (ΔT”CCCRL 8129)と命名さ
れたヒI−1’細胞が選択され、そのI 1.、−2産
生能は親株の40倍に増加し゛(いた。
このクローン化した。J −111細胞株は通常の条件
下で増殖し、その増殖速度は通常のシェルカット細胞と
ほとんど同じであった。
下で増殖し、その増殖速度は通常のシェルカット細胞と
ほとんど同じであった。
(2)J−111細胞(I X 10’ /rn/りを
)11(血清合成培地 RITC55−9(佐藤ら、
Exp。
)11(血清合成培地 RITC55−9(佐藤ら、
Exp。
Ce1l IrO2,,138,127−134,(1
982) )1000 +n +2に接種し、ローラー
培養ボ1〜ル(ファルコン3027)内で37℃、4日
間培養し、増殖した細胞を遠心分離により取得した。こ
の細胞を再び4X106個/ m +2となるよう−1
−逮のConΔ 25.+Ig/mg含有培地に接種し
た。ローラー’ff 養ボトル(ファルコン)4ハツチ
の各々に細胞を接種した培養71シ10100(1を入
れ、6時間回転給養し1人:。
982) )1000 +n +2に接種し、ローラー
培養ボ1〜ル(ファルコン3027)内で37℃、4日
間培養し、増殖した細胞を遠心分離により取得した。こ
の細胞を再び4X106個/ m +2となるよう−1
−逮のConΔ 25.+Ig/mg含有培地に接種し
た。ローラー’ff 養ボトル(ファルコン)4ハツチ
の各々に細胞を接種した培養71シ10100(1を入
れ、6時間回転給養し1人:。
(3)このよう&、:、 C(l IIΔ 251!f
z/r■1ρて6時間!Il/l!りしlこジ、Iルソ
ノ、1・NII目1包(1,2XIf16)は仕理食塩
リン酸緩衝液(以後I用!S稈略記する。)8 (1
0(l m Rに懸濁した。この細胞は遠心操作心こよ
り2回洗浄し、ヌクレアーゼ((11害剤であるリポス
フレオシ[ハナディルル合体(10mM)を含イ1する
R S I−う溶液(10m 7!lリス−塩酸、r、
H7,5、I Om M N a Ci1!、1.5
mM MgC7!2)800 m (!に再五口濁した
。その後、界面活性剤N I)−40を最終濃度0.0
5%となるよ・うに加え、ゆるやかに混合し7、K11
1胞核を300 Orpm 、5i’)、4℃で遠心分
1テ)1(シて除去した。S l) S ((]、 5
5%およびEI〕i’Δ(5mM)を上清液・\加え、
同量のフェノールを加えて細胞質RN八を抽出した。
z/r■1ρて6時間!Il/l!りしlこジ、Iルソ
ノ、1・NII目1包(1,2XIf16)は仕理食塩
リン酸緩衝液(以後I用!S稈略記する。)8 (1
0(l m Rに懸濁した。この細胞は遠心操作心こよ
り2回洗浄し、ヌクレアーゼ((11害剤であるリポス
フレオシ[ハナディルル合体(10mM)を含イ1する
R S I−う溶液(10m 7!lリス−塩酸、r、
H7,5、I Om M N a Ci1!、1.5
mM MgC7!2)800 m (!に再五口濁した
。その後、界面活性剤N I)−40を最終濃度0.0
5%となるよ・うに加え、ゆるやかに混合し7、K11
1胞核を300 Orpm 、5i’)、4℃で遠心分
1テ)1(シて除去した。S l) S ((]、 5
5%およびEI〕i’Δ(5mM)を上清液・\加え、
同量のフェノールを加えて細胞質RN八を抽出した。
フェノールによる抽出を3回繰返した後、RNΔば2倍
量のエタノールにより沈澱せしめ、本沈澱物を遠心によ
り集め、pH7,5のl Om M lリス−塩酸に溶
解した。得られたR N A量は196 rn gであ
った。
量のエタノールにより沈澱せしめ、本沈澱物を遠心によ
り集め、pH7,5のl Om M lリス−塩酸に溶
解した。得られたR N A量は196 rn gであ
った。
m RN Aの分画はオリゴ(dT)−セルロース(P
、 L、 BiochemicalS+ Type 7
)のアフィニティークロマ1−グラフィーを使用して
行なった。吸着液は2QmMLリスー塩酸、0.5M
NaC7!、1 m M E I) T Aおよび0.
5%SDSを含むp tt7.5のン容ン夜であり、?
8出はカラムを緩衝ン反(20mM)リス−塩酸、pH
7,5,0,5M NaCff、れたmRNAL;J:
3.6 m gであった。次に、この得られたmRNA
2.4 m gを蔗糖密度勾配遠心法(50mMトリ
ス−塩酸、1 m M E I−) TΔ、0.2M
NaC7!を含9pH7,5の溶液中でJVj(Iにj
密度勾配5−2.5%、26000rpmで4゛(:、
24時間遠心)により分画した。mRNAの11から1
2S画分が分画No、12.13.14へ分画され、そ
の量はそれぞれ59 tt g、46μg、60μgで
あった。
、 L、 BiochemicalS+ Type 7
)のアフィニティークロマ1−グラフィーを使用して
行なった。吸着液は2QmMLリスー塩酸、0.5M
NaC7!、1 m M E I) T Aおよび0.
5%SDSを含むp tt7.5のン容ン夜であり、?
8出はカラムを緩衝ン反(20mM)リス−塩酸、pH
7,5,0,5M NaCff、れたmRNAL;J:
3.6 m gであった。次に、この得られたmRNA
2.4 m gを蔗糖密度勾配遠心法(50mMトリ
ス−塩酸、1 m M E I−) TΔ、0.2M
NaC7!を含9pH7,5の溶液中でJVj(Iにj
密度勾配5−2.5%、26000rpmで4゛(:、
24時間遠心)により分画した。mRNAの11から1
2S画分が分画No、12.13.14へ分画され、そ
の量はそれぞれ59 tt g、46μg、60μgで
あった。
(4) No、 13の分画に得られたmRNAをアフ
リカッ71 カI )Lt (Xcnopus Ia竺
U)の卵母細胞へ注入した(5 Q n gml’<N
A/卵)。この卵母細胞の培養上清液をI i −2活
性測定に供した。表11.”−示す如く、 ’l1−T
d Rの取込みのト昇および゛活性化1′リンパ球数
の増加が舘認、され、明らかにこの分画中のm IイN
ΔはヒトI L−2mRNAを含んでいることが)′7
証された。
リカッ71 カI )Lt (Xcnopus Ia竺
U)の卵母細胞へ注入した(5 Q n gml’<N
A/卵)。この卵母細胞の培養上清液をI i −2活
性測定に供した。表11.”−示す如く、 ’l1−T
d Rの取込みのト昇および゛活性化1′リンパ球数
の増加が舘認、され、明らかにこの分画中のm IイN
ΔはヒトI L−2mRNAを含んでいることが)′7
証された。
表 1
(al
×:(210] 6:〕
*jijイ☆は1+robiL an旧ysisに従っ
て標j41i l 1.、−2(1(l ji’+、イ
r”7. / m !l )の’H−Tdlン取込Iノ
計と比較するごとにより算出した。
て標j41i l 1.、−2(1(l ji’+、イ
r”7. / m !l )の’H−Tdlン取込Iノ
計と比較するごとにより算出した。
(5)その後、11、−2 mRNAを含む11〜12
3mRNへのNo13分画からin vitroでc
I) N Aを合成した。組換えDNAはプラスミトヘ
クターp B R322を用いて構成した。組換えl)
i’JΔを用いてエシェリヒア・ご1りを形質転換し
、11゜2C,I)NAクローンを51g1jL した
りI:I−ンを以下のようにして選択した。
3mRNへのNo13分画からin vitroでc
I) N Aを合成した。組換えDNAはプラスミトヘ
クターp B R322を用いて構成した。組換えl)
i’JΔを用いてエシェリヒア・ご1りを形質転換し
、11゜2C,I)NAクローンを51g1jL した
りI:I−ンを以下のようにして選択した。
(51) 5 (1mM I・リス−塩酸緩衝液(pH
7,5) 、3 (l mM N a C4,6mM
MgCI!2.5mM ジヂメスレイトール(以後i)
I) Tと略記する。) 、0.5 mMの各dAT
P、dGTP、mRNAおよびl 5 jl’位AMV
逆転二li、酵素(,1,W。
7,5) 、3 (l mM N a C4,6mM
MgCI!2.5mM ジヂメスレイトール(以後i)
I) Tと略記する。) 、0.5 mMの各dAT
P、dGTP、mRNAおよびl 5 jl’位AMV
逆転二li、酵素(,1,W。
11eard )を混合し、41’Cで90分保った。
反応柊了抜、D NAはフェノール処理後、エタノール
沈澱物として回収し、このDNAを20+nMl・リス
およびI m M E l) i−Aを含むpH7,5
の?容液に溶解した。
沈澱物として回収し、このDNAを20+nMl・リス
およびI m M E l) i−Aを含むpH7,5
の?容液に溶解した。
s s r、; [)NA 2.5 II gが合成さ
れた。本反応液よりm RNAを除くために反応液にN
a OHを加えて0.33NNaOtl溶液とし、室
温にて15時間置き、次いでpl−17,5のIMl−
リス−塩酸を同量加え″(中和し、セファデックスG−
50カラJ、をi、ill L、た。回収されたcl)
NAは18μ8であった。
れた。本反応液よりm RNAを除くために反応液にN
a OHを加えて0.33NNaOtl溶液とし、室
温にて15時間置き、次いでpl−17,5のIMl−
リス−塩酸を同量加え″(中和し、セファデックスG−
50カラJ、をi、ill L、た。回収されたcl)
NAは18μ8であった。
(52) 5 [1mM リンfllltk衝液(pH
7,5)、10mM MgCP2.10mM DTT−
0,75mMの各d A T I)、d G ’]”
l)、d CT’ l)、d′丁” ′I’ 1)(d
cTPは’ I−1で放射標識したものを含む)、1.
8Mg 5s−=cDNAおよび8単位ポリメラーゼ1
(BRL、米国)を混合し15時間、15”Cで反応を
行なった。反応終了後、DNAをフェノールおよびクロ
ロボルムで処理したのもエタノール沈澱物として回収し
た。1.10Mgのd S −cl)NAが生成した。
7,5)、10mM MgCP2.10mM DTT−
0,75mMの各d A T I)、d G ’]”
l)、d CT’ l)、d′丁” ′I’ 1)(d
cTPは’ I−1で放射標識したものを含む)、1.
8Mg 5s−=cDNAおよび8単位ポリメラーゼ1
(BRL、米国)を混合し15時間、15”Cで反応を
行なった。反応終了後、DNAをフェノールおよびクロ
ロボルムで処理したのもエタノール沈澱物として回収し
た。1.10Mgのd S −cl)NAが生成した。
50mM酢酸ソーダ(pH4,5) 、0.2M Na
C1,,1mM ZnCffzおよび1.11)8g
ds−cDNΔの混合物を37°Cで20分間インキュ
ベートした後、(125j’p、位のヌクレアーゼSl
(三共eI製)を力11え、さらに15分間インキュ
ベートした。反応終了後、フェノール処理を2回行なっ
た反応生成物をセファデックスG−50ヘイ共し、ds
−cDNAo、55μgを得た。
C1,,1mM ZnCffzおよび1.11)8g
ds−cDNΔの混合物を37°Cで20分間インキュ
ベートした後、(125j’p、位のヌクレアーゼSl
(三共eI製)を力11え、さらに15分間インキュ
ベートした。反応終了後、フェノール処理を2回行なっ
た反応生成物をセファデックスG−50ヘイ共し、ds
−cDNAo、55μgを得た。
(5−3)0.14Mカコジル酸カリウム、30mM
トリス塩基、0.1 mM DT′r’、1mMCoC
6z 、 0.6 4mM ”P−dcTI’ (上ヒ
活性2.7x106cpm/nmol )、[]、55
58gds−c l) NAおコひ5−ti+、位のタ
ーミナルトランスフェラーゼ(BRl、)の混合物を3
7 ’Cで7分間インキプルへ一トシた後、ソlノール
処理し、次いでセファデックスG−50カラムに供し、
エタノール沈澱物として0.5.0Mg (7) I)
N Aを得た。回収したDNAは約50個のdCMP
残基が両3′末端に付加されていることが判明した。
トリス塩基、0.1 mM DT′r’、1mMCoC
6z 、 0.6 4mM ”P−dcTI’ (上ヒ
活性2.7x106cpm/nmol )、[]、55
58gds−c l) NAおコひ5−ti+、位のタ
ーミナルトランスフェラーゼ(BRl、)の混合物を3
7 ’Cで7分間インキプルへ一トシた後、ソlノール
処理し、次いでセファデックスG−50カラムに供し、
エタノール沈澱物として0.5.0Mg (7) I)
N Aを得た。回収したDNAは約50個のdCMP
残基が両3′末端に付加されていることが判明した。
pBR322])NAIOμgを制限酵素n−(、士で
切断したのら、(i Ci−Pの代りにd G T P
を用いたこと以夕1は−上述のds−cDN△にdCM
Pを付加したときに用いた方法と全く同じ条件Qこまり
、切l枡した1)NAの3′末端にd G M I)鎖
をイ・J加した。
切断したのら、(i Ci−Pの代りにd G T P
を用いたこと以夕1は−上述のds−cDN△にdCM
Pを付加したときに用いた方法と全く同じ条件Qこまり
、切l枡した1)NAの3′末端にd G M I)鎖
をイ・J加した。
(5−4) 50rnM l−リス−塩酸<pH7,5
’)0、IM NaC(1,5rnM EDTΔ、0.
05u+3dGM))残恭イ」加pF3 R322およ
び0,01MgdCMP イ(j加(: I) N A
の混合物をまず65℃で2分間、次いで46℃で120
分間、さらるこ37°Cで60分間、1酸後に室温で6
0分間インキュベートした。
’)0、IM NaC(1,5rnM EDTΔ、0.
05u+3dGM))残恭イ」加pF3 R322およ
び0,01MgdCMP イ(j加(: I) N A
の混合物をまず65℃で2分間、次いで46℃で120
分間、さらるこ37°Cで60分間、1酸後に室温で6
0分間インキュベートした。
エシェリヒア・コリ χ1776 (カーチスIltら
、in Mo1ecular にIoninに of
RecombinanL ONA。
、in Mo1ecular にIoninに of
RecombinanL ONA。
(W、A、5cout&R,Wernered、)八c
ademicPress、 (] 977) )を!5
0 m j!のし培地(10(1Mg / m 7!の
ジアミノピメリン酸、501’ t: / m 1のチ
ミジン、1%トリプトファン キス、0.5%NaCj!および0.1%グルコースを
含む)に接種し、培養液の吸光度が5 6 2 n m
で◇ 0、3(”I近になるまで37℃で振とう培養し。培養
終了後、培養液を30分間0 ’cに保持し、菌体を遠
心分離により集め、次いで5rnM トリス−塩#(p
I−]7.6)、0.IM NaC7!、5 nl M
MgCff2およびlomMRbcffを含む熔ン1i
25mβで2回洗浄した。
ademicPress、 (] 977) )を!5
0 m j!のし培地(10(1Mg / m 7!の
ジアミノピメリン酸、501’ t: / m 1のチ
ミジン、1%トリプトファン キス、0.5%NaCj!および0.1%グルコースを
含む)に接種し、培養液の吸光度が5 6 2 n m
で◇ 0、3(”I近になるまで37℃で振とう培養し。培養
終了後、培養液を30分間0 ’cに保持し、菌体を遠
心分離により集め、次いで5rnM トリス−塩#(p
I−]7.6)、0.IM NaC7!、5 nl M
MgCff2およびlomMRbcffを含む熔ン1i
25mβで2回洗浄した。
得られた菌体を5mM トリス−塩酸(+)117、6
) 、0.2 5M KG7!、5rnMMgCj!z
、0、 1 M C a C 1.2および10mMR
bCffを含む溶液2 (l m il!に懸濁し、0
゛Cで25分間静置後、菌体を集め上記と同じ溶液1m
lに菌体を再ju ?b’Jし、得られた菌体!U濁液
のQ, 2m 7!に上記組換えI)NAを入れ、()
°Cで60分間静置した。その後、L ti”j地(1
. 7 m 1.を加え37°Cで30分間振とう培養
した。、二うして得られた培養液(0. 、1 m (
1 )を1 0 0 it g/m Rジアミノピメリ
ン酸、5 0 、17 g/mp.チミシンオ9よひ1
5 tr g / m (!テ1ーラ′リーイクリン
を含むI,培地から成る1.5%寒天培地上に一面に伶
抹し、37°Cで2日間インキj、−・−トした。
) 、0.2 5M KG7!、5rnMMgCj!z
、0、 1 M C a C 1.2および10mMR
bCffを含む溶液2 (l m il!に懸濁し、0
゛Cで25分間静置後、菌体を集め上記と同じ溶液1m
lに菌体を再ju ?b’Jし、得られた菌体!U濁液
のQ, 2m 7!に上記組換えI)NAを入れ、()
°Cで60分間静置した。その後、L ti”j地(1
. 7 m 1.を加え37°Cで30分間振とう培養
した。、二うして得られた培養液(0. 、1 m (
1 )を1 0 0 it g/m Rジアミノピメリ
ン酸、5 0 、17 g/mp.チミシンオ9よひ1
5 tr g / m (!テ1ーラ′リーイクリン
を含むI,培地から成る1.5%寒天培地上に一面に伶
抹し、37°Cで2日間インキj、−・−トした。
(5−5)出現した432のコロニーを1 8のクルー
プに分り、(その各グループは24の異なるハタテリア
クII−ンを含む)I(101rg/丁nβの7アミノ
ピメリン酸、50Mg / m (!のチミジンおよび
l O ti3のテトラサインクリンを含む1. lf
y地20C)mffに接119シ、37°0で5〜7時
間振とう培養した。次に、最終濃度170μ+S /
rn yとなるようりI′Jラムフェニコーローを含む
7斤だなI−1ζ〜地2 Q Om/を加え、さらに−
晩培養した。
プに分り、(その各グループは24の異なるハタテリア
クII−ンを含む)I(101rg/丁nβの7アミノ
ピメリン酸、50Mg / m (!のチミジンおよび
l O ti3のテトラサインクリンを含む1. lf
y地20C)mffに接119シ、37°0で5〜7時
間振とう培養した。次に、最終濃度170μ+S /
rn yとなるようりI′Jラムフェニコーローを含む
7斤だなI−1ζ〜地2 Q Om/を加え、さらに−
晩培養した。
このようにし7−(増強されたプラスミl’ l) N
Aを常法に従い411製した。
Aを常法に従い411製した。
1 1、 − 2 c i)NAを有するりII+−ン
はm R NΔハイフリダイゼーションートランスレー
ションア7セイ (以後11−1”アッセイと略記する
。)により選択した。
はm R NΔハイフリダイゼーションートランスレー
ションア7セイ (以後11−1”アッセイと略記する
。)により選択した。
ここで用いられたII −1”アッセイは以下の如く行
なった。
なった。
純化したI) NΔ(25μg)を制御;■¥素石す一
肌により開裂し、フェノールで3回、フLノール−りロ
ロボルムおよびクロロボルムで各々処理し、エタノール
で沈澱させ、Σ)0%エタノールで洗浄し、80%ポル
ムアミF’ 40 m eにY容解した。
肌により開裂し、フェノールで3回、フLノール−りロ
ロボルムおよびクロロボルムで各々処理し、エタノール
で沈澱させ、Σ)0%エタノールで洗浄し、80%ポル
ムアミF’ 40 m eにY容解した。
反応混合物を変性させるため、90℃で5分間加熱後、
l0XSSC(1,5M NaCff、0.15Mクエ
ン酸ソーダ)1.3m7!に希釈した。その後、本DN
Aをニトロセルロース濾紙1シロこ固定し、これを80
’Cで3時間乾燥さ−l、50%ポルノ、−lミ t
、p 1f(i、5 の 2 0 m M Pepe
s 、0. 7 5 MNaC/、5mMEDTΔ、0
.2%S D SおよびJ−111細胞由来)poly
(八) m ]’2 N A 250Mgを含む溶液
中で37℃、18時間インキュベートし、濾紙上に固定
されたl) N AとI +−−2m RN Aをハイ
フリクイズした。
l0XSSC(1,5M NaCff、0.15Mクエ
ン酸ソーダ)1.3m7!に希釈した。その後、本DN
Aをニトロセルロース濾紙1シロこ固定し、これを80
’Cで3時間乾燥さ−l、50%ポルノ、−lミ t
、p 1f(i、5 の 2 0 m M Pepe
s 、0. 7 5 MNaC/、5mMEDTΔ、0
.2%S D SおよびJ−111細胞由来)poly
(八) m ]’2 N A 250Mgを含む溶液
中で37℃、18時間インキュベートし、濾紙上に固定
されたl) N AとI +−−2m RN Aをハイ
フリクイズした。
次に、その濾紙を65℃で1) 116.512) 1
0 rnMPipes、0.15M NaCl2、I
mM Pipes、 l OmMNaCβから1戊る溶
液で3凹洗浄し、0,5mMEDTA、0.1% SD
S?容液で95°C11分間処理し濾紙からハイフリク
イズしたm RN八を回収した。
0 rnMPipes、0.15M NaCl2、I
mM Pipes、 l OmMNaCβから1戊る溶
液で3凹洗浄し、0,5mMEDTA、0.1% SD
S?容液で95°C11分間処理し濾紙からハイフリク
イズしたm RN八を回収した。
このようにして抽出したm I? NΔを常法にIJt
っ−でオリml’ d ’I”−セル−ニ!−スカラJ
、−1::−(i6製し、アフリカッメガエル卵母細胞
へ注入し、へ11訳された蛋白の1”+−−−2活1生
を4111定した。
っ−でオリml’ d ’I”−セル−ニ!−スカラJ
、−1::−(i6製し、アフリカッメガエル卵母細胞
へ注入し、へ11訳された蛋白の1”+−−−2活1生
を4111定した。
各々24り1−1−ンからなる18クループのう4)0
) 1グループが前述の30〜T 、] R取込めによ
るアッセイで48中8位/ m Rの11.−27占1
牛1湯1牛を示した。一方、他のグループ目明らかに陰
+’lごあった。
) 1グループが前述の30〜T 、] R取込めによ
るアッセイで48中8位/ m Rの11.−27占1
牛1湯1牛を示した。一方、他のグループ目明らかに陰
+’lごあった。
次に、陽性のグループに属する24の各q′し−・コロ
ニーを既述と同じ組成の17培地2 (10m 7!へ
接種し、37℃で5〜7時間好気的に培養し、同様にタ
ロラムフェニ:1−ル含有の新鮮なり、培地をさらに添
加した。
ニーを既述と同じ組成の17培地2 (10m 7!へ
接種し、37℃で5〜7時間好気的に培養し、同様にタ
ロラムフェニ:1−ル含有の新鮮なり、培地をさらに添
加した。
一晩培養して、プラスミドDNAを増強後、プラスミl
” I) NΔを標準法に従って同様に精製した。
” I) NΔを標準法に従って同様に精製した。
II i n d IIIで各プラスミドD N A約
51!8を開裂後、各ブリスミlをニトロセルロース濾
紙へ同様に固定し7た。その)原紙をIL−2mRN八
とハイブリダイスし、ハイフリクイズしたrn RNΔ
を回収し、アフリカッメガエルの卯RJ:細胞へ、油太
し、翻訳された蛋白のII、−2活性を測定した。
51!8を開裂後、各ブリスミlをニトロセルロース濾
紙へ同様に固定し7た。その)原紙をIL−2mRN八
とハイブリダイスし、ハイフリクイズしたrn RNΔ
を回収し、アフリカッメガエルの卯RJ:細胞へ、油太
し、翻訳された蛋白のII、−2活性を測定した。
表2に示す如く、p316と表示した中−コIZに一か
ら精製されたプラスミドl)N△のめが陽性の+ t、
−2+活性を示した。それ故、木りI〜1−ンか1[、
2(,1つN八をイJするりし!−ン(上シlリヒア・
コリχ1776/p3−16 八J11995(F巳R
M−F3P−225))と同定された。、二のようにプ
ラスミ1−I) N△、r+3 16はIL−2ロ+R
NAと特異的ハイブリッドを形成する能力のあるDNA
N +−−2i11仏子)を確かに有していることが
仔認された。
ら精製されたプラスミドl)N△のめが陽性の+ t、
−2+活性を示した。それ故、木りI〜1−ンか1[、
2(,1つN八をイJするりし!−ン(上シlリヒア・
コリχ1776/p3−16 八J11995(F巳R
M−F3P−225))と同定された。、二のようにプ
ラスミ1−I) N△、r+3 16はIL−2ロ+R
NAと特異的ハイブリッドを形成する能力のあるDNA
N +−−2i11仏子)を確かに有していることが
仔認された。
表 2
に1)
*プラスミI・p316からの(: l、) N八とハ
イブリダイズしたmRNA プラスミドp3−16のc DNAインザートは制限酵
素久−屋−七上により1部位で、また且−シ1N土によ
り2部位(X b a ’L開裂部位の一1〕流および
下流)で切断されるという特徴を示した。しかしながら
、プラスミドp 3−16は約650塩ノみ対より構成
されるC I) N Aインザートを含んでおり、これ
は明らかに11〜12Sの大きさのI 1−2m RN
Aの一部分に相当するものである。それ故、他のcl
)NΔライブラリーを、鋳型として115−2 mRN
Aを用い、ランドらの方法(ラント′ら。
イブリダイズしたmRNA プラスミドp3−16のc DNAインザートは制限酵
素久−屋−七上により1部位で、また且−シ1N土によ
り2部位(X b a ’L開裂部位の一1〕流および
下流)で切断されるという特徴を示した。しかしながら
、プラスミドp 3−16は約650塩ノみ対より構成
されるC I) N Aインザートを含んでおり、これ
は明らかに11〜12Sの大きさのI 1−2m RN
Aの一部分に相当するものである。それ故、他のcl
)NΔライブラリーを、鋳型として115−2 mRN
Aを用い、ランドらの方法(ラント′ら。
Nuclcic Ac1deRes、、 vol 9.
p2551゜(1981))rJこ従って作製した。
p2551゜(1981))rJこ従って作製した。
−木鎮cDNΔ(1,6t)g)を、dCMP残基を伺
加したI 1−−2mRNΔ4μgを用いて合成し、d
s −c、DNAを、DNAポリメラーゼI (りし
・ノウ断片)によりプライマーとしてオリゴ(dG)+
2−18を用いることにより合成した。680塩暴対I
) N Aザイズマーカーより長いcDNA((1,6
μg)は蔗+)#密度勾配遠心法によって得られ、標準
的なC−Cティリング法によりp [3R322のPs
t1部位−・挿入した。組換えD N A によるエシ
ェリヒア・−1すχ1776の形質転換後、その場所で
プローブとしてニック翻訳されたp3−16cDNAイ
ンザー 1−を用い、グルンスティン ボグネスのハイ
ゾリダイゼーション法により約2 (10(1コロニー
を選別し、およそ850塩基幻を含むプラスミドplL
2 50Aを含有するコロニーおよび形質転換されたり
I」−ン(エシェリヒア・−1すχ1776/plL、
2−60Δ、Δ、J 119 !l 6(FERM−1
3P 22fi))を同定した。
加したI 1−−2mRNΔ4μgを用いて合成し、d
s −c、DNAを、DNAポリメラーゼI (りし
・ノウ断片)によりプライマーとしてオリゴ(dG)+
2−18を用いることにより合成した。680塩暴対I
) N Aザイズマーカーより長いcDNA((1,6
μg)は蔗+)#密度勾配遠心法によって得られ、標準
的なC−Cティリング法によりp [3R322のPs
t1部位−・挿入した。組換えD N A によるエシ
ェリヒア・−1すχ1776の形質転換後、その場所で
プローブとしてニック翻訳されたp3−16cDNAイ
ンザー 1−を用い、グルンスティン ボグネスのハイ
ゾリダイゼーション法により約2 (10(1コロニー
を選別し、およそ850塩基幻を含むプラスミドplL
2 50Aを含有するコロニーおよび形質転換されたり
I」−ン(エシェリヒア・−1すχ1776/plL、
2−60Δ、Δ、J 119 !l 6(FERM−1
3P 22fi))を同定した。
plL、2−5oへのcl)N△イン−ナー1の制御I
J酵酵素切IjJi図を第1図に示した。
J酵酵素切IjJi図を第1図に示した。
形質転換したエシェリヒア・:ノリχ1776p I
+2−50八からの11.2ペプタイ1をII−ドして
いる遺伝r−を単離するため、プラスミド1) NΔを
常法に従い、菌体からl)NΔを1)す;1(後、制御
tl酵素−↓ヒ1J↓−により切1υiした。このよう
にして生成する2つのDNΔ断ハ9うらより小さな断片
はl L−2ペプタイISを」−トしているl)NΔ遺
伝子であった。pH,2−50八からのp s tIイ
ンザーI・の完全なヌクレオチド配列はマキシムおよび
ギルバートの方法(マキサムら Unzym。
+2−50八からの11.2ペプタイ1をII−ドして
いる遺伝r−を単離するため、プラスミド1) NΔを
常法に従い、菌体からl)NΔを1)す;1(後、制御
tl酵素−↓ヒ1J↓−により切1υiした。このよう
にして生成する2つのDNΔ断ハ9うらより小さな断片
はl L−2ペプタイISを」−トしているl)NΔ遺
伝子であった。pH,2−50八からのp s tIイ
ンザーI・の完全なヌクレオチド配列はマキシムおよび
ギルバートの方法(マキサムら Unzym。
65.499−560.1980)により決定した。全
構造を第2図に示す。
構造を第2図に示す。
B、I 1.、−2 ポリペプチドをロー1する遺伝子
の製造(2) ニジ、】−リヒア・コリ細胞てヒト IL−2の合−面
会するプラスミドを以下の如く構築しノこ。
の製造(2) ニジ、】−リヒア・コリ細胞てヒト IL−2の合−面
会するプラスミドを以下の如く構築しノこ。
口ら、41ユ化学53,967、(1981))および
IL−2cDNAを含むpH,2−50八から構築した
。プラスミl’ p T r S −3は1工」プロモ
ーターとp B +? 322の1ンc 」」−上部位
とcl a 1部位の間にSl+ine I)alga
rno (以後SDと略記する)の領域の挿入を含む。
IL−2cDNAを含むpH,2−50八から構築した
。プラスミl’ p T r S −3は1工」プロモ
ーターとp B +? 322の1ンc 」」−上部位
とcl a 1部位の間にSl+ine I)alga
rno (以後SDと略記する)の領域の挿入を含む。
本プラスミドは第3図に示した如く、tll、−の5p
h1部位と同様にS D配列の下流13 b pにA
T G開始二1−トンを含んでいる。
h1部位と同様にS D配列の下流13 b pにA
T G開始二1−トンを含んでいる。
言及している蛋白に対応するI) NΔ配列がA TG
コローンの丁度ド流の部位に挿入されると、そのヘクタ
ーはこの蛋白を414.産するには非雷に効果的である
。この△i’Gコードンはp Tr S−3の五■h
I消化に引続きT4DNAポリメラーゼによる処理によ
って生成する。それ故、プラスミドp Tr S −3
(30メl g )は制限酵素5phlで常法により切
断し、引続きフェノール、りU I:1ボルム処理、エ
タノール沈澱法により回収し、両末端をi゛41)N△
ポリ不う−ゼ処理によりフラッシュした。
コローンの丁度ド流の部位に挿入されると、そのヘクタ
ーはこの蛋白を414.産するには非雷に効果的である
。この△i’Gコードンはp Tr S−3の五■h
I消化に引続きT4DNAポリメラーゼによる処理によ
って生成する。それ故、プラスミドp Tr S −3
(30メl g )は制限酵素5phlで常法により切
断し、引続きフェノール、りU I:1ボルム処理、エ
タノール沈澱法により回収し、両末端をi゛41)N△
ポリ不う−ゼ処理によりフラッシュした。
次に、同様の方法によりフェノール、クロl」ホルム処
■里及びコータノールン尤社法によりI)N八(21,
4μg)を回収した。他方、I +−−2cl)NΔを
含むpl!−72−50Δ 38011 gはPSt■
により切断し、IL−2cl)NΔインザートをアガ1
」−スゼル電気泳動により’!”−#I[l。
■里及びコータノールン尤社法によりI)N八(21,
4μg)を回収した。他方、I +−−2cl)NΔを
含むpl!−72−50Δ 38011 gはPSt■
により切断し、IL−2cl)NΔインザートをアガ1
」−スゼル電気泳動により’!”−#I[l。
た。cDNΔインリ゛−1−(11,+1g) は−リ
−g、−iへ」−により切断し、’l”?lDNA ポ
リメラーゼによって処理し、大きい方の部分のDNA1
Oμgをアガl]−スゲル電気泳法により単離した。不
法に従って132個のアミノ酸をコードするc D N
Δ<1.211g>が得られ、このDNA断片はプラン
トエンドを有していた(第4図(a))。
−g、−iへ」−により切断し、’l”?lDNA ポ
リメラーゼによって処理し、大きい方の部分のDNA1
Oμgをアガl]−スゲル電気泳法により単離した。不
法に従って132個のアミノ酸をコードするc D N
Δ<1.211g>が得られ、このDNA断片はプラン
トエンドを有していた(第4図(a))。
次に、このようにして得られたcDNA断片をA TG
配列の丁度下流で、前もって)」−焦土により消化され
T4DNA ポリメラーゼにより処理されたp T r
S −3ヘクターへ連結した。このように連結したプ
ラスミドは次いで、常法に従いエシェリヒア・コリHB
IOIへ形質転換した。この連結は次のようにして行な
った。l 1.−2(:DNA(0,4μg)の前述の
大きい力のIjJi片およびpTrs−3ヘクターDN
A0.2ttgを6.6mM Mg(1!2.1mM
A”「PおよびlornMD ’r′Fを含むp H7
,5(2)66mM )リス−塩酸中でT41)NΔ
リガーゼ0.8単位と共に混合し、混合物を4℃で一晩
反応させた。−1ンピシリンを含むI7培地寒天プレー
ト上に出現するl・ランスポーマントの中で、132個
のアミノ酸をコードしているIL−2cDNA部分を含
むプラスミドを持つコlコニ−をその場でコしに−ハイ
ブリダイゼーションアノセイ法により選択した。こうし
て選択したコロニーを再び培養(10m7りし、リゾデ
ーム処理および凍結、融解による処理によりプラスミl
” l) N八を調製した。このプラスミドDNAをヱ
−1」−■−ζ冬balで切断し、その結果の生成物を
アゴ1コースゲル電気泳動により分析し、cDNΔがp
Tr S−3のATG配列に正しい方向で連結してい
るp ′FI L −2−22を同定した。
配列の丁度下流で、前もって)」−焦土により消化され
T4DNA ポリメラーゼにより処理されたp T r
S −3ヘクターへ連結した。このように連結したプ
ラスミドは次いで、常法に従いエシェリヒア・コリHB
IOIへ形質転換した。この連結は次のようにして行な
った。l 1.−2(:DNA(0,4μg)の前述の
大きい力のIjJi片およびpTrs−3ヘクターDN
A0.2ttgを6.6mM Mg(1!2.1mM
A”「PおよびlornMD ’r′Fを含むp H7
,5(2)66mM )リス−塩酸中でT41)NΔ
リガーゼ0.8単位と共に混合し、混合物を4℃で一晩
反応させた。−1ンピシリンを含むI7培地寒天プレー
ト上に出現するl・ランスポーマントの中で、132個
のアミノ酸をコードしているIL−2cDNA部分を含
むプラスミドを持つコlコニ−をその場でコしに−ハイ
ブリダイゼーションアノセイ法により選択した。こうし
て選択したコロニーを再び培養(10m7りし、リゾデ
ーム処理および凍結、融解による処理によりプラスミl
” l) N八を調製した。このプラスミドDNAをヱ
−1」−■−ζ冬balで切断し、その結果の生成物を
アゴ1コースゲル電気泳動により分析し、cDNΔがp
Tr S−3のATG配列に正しい方向で連結してい
るp ′FI L −2−22を同定した。
p”rz、−z 22を含むエシェリヒア・コリ)I
8101をT、、k /ト物の増殖のために知られてい
る常法で培養した6細胞は25μg / m p、スト
レプトマイシンおよび25/J g / m Aのアン
ピシリンを含むχ培地(2,5%ハタトドリプ1ン、1
%酵母エキス、0.1%グ/レニI−ス、20mM M
g SOs 。
8101をT、、k /ト物の増殖のために知られてい
る常法で培養した6細胞は25μg / m p、スト
レプトマイシンおよび25/J g / m Aのアン
ピシリンを含むχ培地(2,5%ハタトドリプ1ン、1
%酵母エキス、0.1%グ/レニI−ス、20mM M
g SOs 。
50 mM l−リス−塩酸、pII7.5)10m7
!中で37゛C1−晩増殖させた。次いで、培養懸濁液
1rn Itを同じχ培地(100n1e)へ接種し、
37°Cで培養した。650 mμの吸光度がおよそ1
.5−2.0に達した時点で3−インドール−j′クリ
ル酸(IΔ△)を加えた。インチ1−4ノーの添加3時
間後に細胞を集め、20mMl−リス−塩M (pl、
(7,5,3(]rnM Na Cj!を含む)で洗浄
し、同し緩衝液11 m lI 4ご再び!詭濁した。
!中で37゛C1−晩増殖させた。次いで、培養懸濁液
1rn Itを同じχ培地(100n1e)へ接種し、
37°Cで培養した。650 mμの吸光度がおよそ1
.5−2.0に達した時点で3−インドール−j′クリ
ル酸(IΔ△)を加えた。インチ1−4ノーの添加3時
間後に細胞を集め、20mMl−リス−塩M (pl、
(7,5,3(]rnM Na Cj!を含む)で洗浄
し、同し緩衝液11 m lI 4ご再び!詭濁した。
’1’ r pプロモーターの効果的な機能発現のため
に、IAへの如きインデユー・す°−を最終深度50/
’ g / m eになるように添加した。かくして細
菌細胞中に産生される蛋白をソニック処理(0°C22
分間)またはリゾチーム(8メII+)消化(0”Cl
2O分)に引き続き凍結融解を3回行なう事εこより抽
出した。この方法により、l l −2は微生物から抽
出された。抽出されたI+、−2’/ili性は100
00から120(100単位/m7!の範囲であ−っ)
こ。
に、IAへの如きインデユー・す°−を最終深度50/
’ g / m eになるように添加した。かくして細
菌細胞中に産生される蛋白をソニック処理(0°C22
分間)またはリゾチーム(8メII+)消化(0”Cl
2O分)に引き続き凍結融解を3回行なう事εこより抽
出した。この方法により、l l −2は微生物から抽
出された。抽出されたI+、−2’/ili性は100
00から120(100単位/m7!の範囲であ−っ)
こ。
p T l 1.122を含むエシェリヒア・:lすH
13101(ΔJ 12009 )はF I”、 RM
−B P245として寄託されている。
13101(ΔJ 12009 )はF I”、 RM
−B P245として寄託されている。
C,IL−2ポリペプチドをコートする遺伝子の製造(
3) エシェリヒア・コリ細胞でヒl−I L−2の合成を指
令−するプラスミlを以下の如く構築した。プラスミド
p T l +、 2−21は第41ヌ1(b)で図
解されているように、一連の改変方法によりp Tr
S−3(西、■[1す、生化学5 :j、967 (1
9B + ) )およびI 1.、−2 c INN八
を含むpl1..2−50八から構築した。プラスミI
・p Tr S−:3は−:j1.r 2ブlニアモー
ターとp H3R322のM−入、−o、 5+−+−
+++s (<1と−L、ニー1a、上−上位部位4.
mSl目nerlalBarno (以72.s+〕と
略記する。)の領域の挿入を含む。
3) エシェリヒア・コリ細胞でヒl−I L−2の合成を指
令−するプラスミlを以下の如く構築した。プラスミド
p T l +、 2−21は第41ヌ1(b)で図
解されているように、一連の改変方法によりp Tr
S−3(西、■[1す、生化学5 :j、967 (1
9B + ) )およびI 1.、−2 c INN八
を含むpl1..2−50八から構築した。プラスミI
・p Tr S−:3は−:j1.r 2ブlニアモー
ターとp H3R322のM−入、−o、 5+−+−
+++s (<1と−L、ニー1a、上−上位部位4.
mSl目nerlalBarno (以72.s+〕と
略記する。)の領域の挿入を含む。
ブラスミl’pTrs −3(l 0pB)を先ず制f
lu n’l素−:−aIす“ζ切1υiし1.5a−
1リ一部位をl)NΔポリメラーゼ(フレノウ断Jに)
あるいはT41)N△ポリメラーゼ処理によりフラノシ
フ、した・−〔母−3−」−で切断後、trpプVノモ
ーター領域を有する大きい方の断ハを常法lに従ってア
ガI+−スリール電気床動により曵tilt精製し、I
)N△371gを回収した。
lu n’l素−:−aIす“ζ切1υiし1.5a−
1リ一部位をl)NΔポリメラーゼ(フレノウ断Jに)
あるいはT41)N△ポリメラーゼ処理によりフラノシ
フ、した・−〔母−3−」−で切断後、trpプVノモ
ーター領域を有する大きい方の断ハを常法lに従ってア
ガI+−スリール電気床動により曵tilt精製し、I
)N△371gを回収した。
他方、l’sLI・\挿入したp I I−2−50A
I 1μgは−I□i 、A、−jで切断し、1”4
1)NAボリメラーセ処理し、大きい方の断片をアガロ
ースゲル電気泳動により単離精製した。このようにして
II。
I 1μgは−I□i 、A、−jで切断し、1”4
1)NAボリメラーセ処理し、大きい方の断片をアガロ
ースゲル電気泳動により単離精製した。このようにして
II。
−2の132個のアミノ酸をコートするc 1.) N
△断ハが1.2ttg得られた。次に、t r p −
7’l:I % −ター(ト記)を含む断片0.45μ
[、]L−2cDNΔを含む肚giAl−Pstl断片
0.5 p gおよび双方とも5′未満でリン酸化して
いる合成オリゴヌクレオチド(5”) CGAT八八G
へへATGGC八(へ ′ ) と (3”) TAT
TCGAT八CCGT へ(,5’ ) (各各20p
mole )を6.6mM MgC1!2. l mM
ΔTP及び10 rnM DD Tを含むp II7.
5の66mM I・リス−塩酸中でT4 DNΔリガー
ゼIjij位で連結し、この混合物を4℃で、1晩反応
さ一1qだ。このように連結されたプラスミ1はエシェ
リヒア・コリHB 101に形質転換された。アンピシ
リンを含むI、培地寒天プレート」二に出現したトラン
スポーマントの中で、目標とするトランスポーマント は、IL−2cL)NAおよび合成オリゴヌクレオチド
の両方とハイブリダイズ可能な1−ランスボーマントが
コIコニーハイブリダイゼーション法により選択された
。次に、△T G に CΔ配列(2) J度下流に第
2図ta+θ月11から113の位置のccT配列から
始まるi) NΔ断片(CC’l’八〇゛1へ )が挿
入されているプラスミl” I) NAを持、ったトラ
ンスポーマント 選択した。p Tl i 2−2 1 aまたはp ’
FI L 2−21bを含ム二c−7.r− ’) L
−7 ・ニー1 ’J It 丁3 ] 0 1を1
敦生物の増91白のために知られている常法で培養した
。細胞は2 5 p [: / m /lストレプトマ
=(シンおよび25μF; / m 1のアンピシリン
を含むχ培地(2.5%ハク(・1−リブトン、1%酵
母エキス、0.1%グルコース、2 0rnM MgS
O,、5 0mMトリス−塩酸. pt17.5) I
0mff中で37°C、−晩増殖させた。次いで、培
養懸濁r1′9.1 ITI i!を同じχ培地( 1
0 0丁n /りへ接種し、37°Cて培■した。6
5 0 m pの吸光度がおよそ1. 5−2. 0
4こ達した時点で3−インドールアクリル酸(1△A
)を加えた。インデューサーの添加3時間後に細胞を集
め、2 0 III M lリス−塩酸(p117.4
’1. 30mMN’ac7!を含む)で洗浄し、同じ
緩衝液8m 7!中にDiひQ 濁した。
△断ハが1.2ttg得られた。次に、t r p −
7’l:I % −ター(ト記)を含む断片0.45μ
[、]L−2cDNΔを含む肚giAl−Pstl断片
0.5 p gおよび双方とも5′未満でリン酸化して
いる合成オリゴヌクレオチド(5”) CGAT八八G
へへATGGC八(へ ′ ) と (3”) TAT
TCGAT八CCGT へ(,5’ ) (各各20p
mole )を6.6mM MgC1!2. l mM
ΔTP及び10 rnM DD Tを含むp II7.
5の66mM I・リス−塩酸中でT4 DNΔリガー
ゼIjij位で連結し、この混合物を4℃で、1晩反応
さ一1qだ。このように連結されたプラスミ1はエシェ
リヒア・コリHB 101に形質転換された。アンピシ
リンを含むI、培地寒天プレート」二に出現したトラン
スポーマントの中で、目標とするトランスポーマント は、IL−2cL)NAおよび合成オリゴヌクレオチド
の両方とハイブリダイズ可能な1−ランスボーマントが
コIコニーハイブリダイゼーション法により選択された
。次に、△T G に CΔ配列(2) J度下流に第
2図ta+θ月11から113の位置のccT配列から
始まるi) NΔ断片(CC’l’八〇゛1へ )が挿
入されているプラスミl” I) NAを持、ったトラ
ンスポーマント 選択した。p Tl i 2−2 1 aまたはp ’
FI L 2−21bを含ム二c−7.r− ’) L
−7 ・ニー1 ’J It 丁3 ] 0 1を1
敦生物の増91白のために知られている常法で培養した
。細胞は2 5 p [: / m /lストレプトマ
=(シンおよび25μF; / m 1のアンピシリン
を含むχ培地(2.5%ハク(・1−リブトン、1%酵
母エキス、0.1%グルコース、2 0rnM MgS
O,、5 0mMトリス−塩酸. pt17.5) I
0mff中で37°C、−晩増殖させた。次いで、培
養懸濁r1′9.1 ITI i!を同じχ培地( 1
0 0丁n /りへ接種し、37°Cて培■した。6
5 0 m pの吸光度がおよそ1. 5−2. 0
4こ達した時点で3−インドールアクリル酸(1△A
)を加えた。インデューサーの添加3時間後に細胞を集
め、2 0 III M lリス−塩酸(p117.4
’1. 30mMN’ac7!を含む)で洗浄し、同じ
緩衝液8m 7!中にDiひQ 濁した。
i’ r pゾロモークーの効果的な機能発現のために
、lΔΔの911きインデューサーを最終濃度501’
I; / m 7!になるように添加した。かくして
細菌細胞中に産律される蛋白をソニック処理( 0 ℃
。
、lΔΔの911きインデューサーを最終濃度501’
I; / m 7!になるように添加した。かくして
細菌細胞中に産律される蛋白をソニック処理( 0 ℃
。
2分間)またはリブチーJ、(8μg)消化( fl
’c 。
’c 。
2()分)に引き続き凍結融解を3回行ノ、1)こと心
こより抽出した。この方法によりl L − 2をii
ikイ1:物から抽出した。抽出したIL−2活性4;
I I (1 (1 0 F+から12000(+中.
位/m7!の範囲であった。
こより抽出した。この方法によりl L − 2をii
ikイ1:物から抽出した。抽出したIL−2活性4;
I I (1 (1 0 F+から12000(+中.
位/m7!の範囲であった。
p′r’ IL 2 − 2 1 、3を含むjニジl
リヒー,−、1 、 ::+す11131(11(ΔJ
I2013)およびp i’ I L 2 − 2 l
bを含む:1−シェリヒア・コリIIT3 1 0 1
(A 、112014)はそれぞれ、FI乙R M
− 1も1) 2 4. 8 。
リヒー,−、1 、 ::+す11131(11(ΔJ
I2013)およびp i’ I L 2 − 2 l
bを含む:1−シェリヒア・コリIIT3 1 0 1
(A 、112014)はそれぞれ、FI乙R M
− 1も1) 2 4. 8 。
1・゛するI,! M − 13 P 2 4 9とし
′ζ寄託されている。
′ζ寄託されている。
D. l L − 2 ヲ製1?t l’J能な酵1υ
の製造1’l¥ ltJ 二1ニソ1ーリヒア・−1リ
ノヤトルヘクターpAM82は++rsl, 2 t
t m oriおよびlcu2(7)マーカーおよび酵
1りの酸性フメスファターI!(ΔPase)遺伝子に
対するプI」モーターを持−、′(いる。このヘクター
はアンピシリン耐性マーカー(AI)’)を(、冒−J
I) T3 R 3 2 2の3 7 0 0塩Wか
らなる1つNA画分と傾製オリジンを持っている(第5
図)。△l’ a seブ[1モーターは培養液中で高
濃度リン酸を低濃度リン酸にシフトすることに,1、り
誘導される。
の製造1’l¥ ltJ 二1ニソ1ーリヒア・−1リ
ノヤトルヘクターpAM82は++rsl, 2 t
t m oriおよびlcu2(7)マーカーおよび酵
1りの酸性フメスファターI!(ΔPase)遺伝子に
対するプI」モーターを持−、′(いる。このヘクター
はアンピシリン耐性マーカー(AI)’)を(、冒−J
I) T3 R 3 2 2の3 7 0 0塩Wか
らなる1つNA画分と傾製オリジンを持っている(第5
図)。△l’ a seブ[1モーターは培養液中で高
濃度リン酸を低濃度リン酸にシフトすることに,1、り
誘導される。
予めB −q 1− lでLJJ ltlしたキ11換
えDNA p TI L−218 (1,+1を丁)お
よび予め5′末端をリン酸化しノこXh−91リンカ−
(lopmol)をEi.6rnMMgc#2,I m
M ATPおよび10mMDTTを含むpH7、5の6
6mMl−リス 塩酸中で”l″+ D NAソリカー
ゼ単位用いて4°(:で1晩つなき合一Uた。ごのよう
にしてつなき合一UたI)NAを1− シy−リヒー3
4 ・=+すI−I B I O lに舎人し、jj−
a−11部位に代ってX II O 1部位を有するプ
ラスミ1(pTIl、2 XI6)を持つ1ランスフメ
ーマントーを選tRシた。次いで、予め一朋−p a.
Iで切断しプこ p i’ I L 2−X 1 6
( l メl g) と、X j+ 、、o− 1
リ ンカー( 1 0 pmol)をに記と同様の方法
で1中位の”r’41)NAを用いてつなき合一Uだ。
えDNA p TI L−218 (1,+1を丁)お
よび予め5′末端をリン酸化しノこXh−91リンカ−
(lopmol)をEi.6rnMMgc#2,I m
M ATPおよび10mMDTTを含むpH7、5の6
6mMl−リス 塩酸中で”l″+ D NAソリカー
ゼ単位用いて4°(:で1晩つなき合一Uた。ごのよう
にしてつなき合一UたI)NAを1− シy−リヒー3
4 ・=+すI−I B I O lに舎人し、jj−
a−11部位に代ってX II O 1部位を有するプ
ラスミ1(pTIl、2 XI6)を持つ1ランスフメ
ーマントーを選tRシた。次いで、予め一朋−p a.
Iで切断しプこ p i’ I L 2−X 1 6
( l メl g) と、X j+ 、、o− 1
リ ンカー( 1 0 pmol)をに記と同様の方法
で1中位の”r’41)NAを用いてつなき合一Uだ。
つなき合−lたI) N Aをエシェリヒア・コリHB
101にm人し、用土21部位に代って−X−頃−隻1
を有するプラスミド(pT I L 2−X 2)を持
つトランスフォーマントを選択した。プラスミドp ’
「I 1.2− X 2 (30tt g )を制限酵
素γ−逗−9=■で切断し、Il、−2cDNΔを持つ
一メ九−隻I(略1.6Kb)を分離し、アガロースゲ
ル電気泳動により精製しDNA 5μgを得た。
101にm人し、用土21部位に代って−X−頃−隻1
を有するプラスミド(pT I L 2−X 2)を持
つトランスフォーマントを選択した。プラスミドp ’
「I 1.2− X 2 (30tt g )を制限酵
素γ−逗−9=■で切断し、Il、−2cDNΔを持つ
一メ九−隻I(略1.6Kb)を分離し、アガロースゲ
ル電気泳動により精製しDNA 5μgを得た。
酵母−エシェリヒア・コリ シャ1〜ルヘクターpAM
82 (2μg)をX kt o lて同様に切断し、
υ月枡したpΔM82と一χ」ノー■断片217 gと
を′!゛キDNAリガーゼ1単位、6.6mM MgC
p、2゜ImM Δ′1゛Pおよびl Om M I)
i” ′T”を含むp H7,50)66mトリス−
塩酸中で混合し、この混合物を4℃で1晩保持した。
82 (2μg)をX kt o lて同様に切断し、
υ月枡したpΔM82と一χ」ノー■断片217 gと
を′!゛キDNAリガーゼ1単位、6.6mM MgC
p、2゜ImM Δ′1゛Pおよびl Om M I)
i” ′T”を含むp H7,50)66mトリス−
塩酸中で混合し、この混合物を4℃で1晩保持した。
このよ・うにしζ゛つなき合−U′だプラスミドを用い
てエシェリヒア・コリ1113101に形質転換した。
てエシェリヒア・コリ1113101に形質転換した。
アンピシリンを含む1.培地寒天プレー1−1 &こ出
現するトランスフォーマン1−の中で133 (IJ+
+のアミノ酸をコードするIL−2cDNΔ部分を含む
二10ニーを前述の二口=1ごm−)人イブリタイセー
ソジュ/γノセインノ6cこより選1尺した。
現するトランスフォーマン1−の中で133 (IJ+
+のアミノ酸をコードするIL−2cDNΔ部分を含む
二10ニーを前述の二口=1ごm−)人イブリタイセー
ソジュ/γノセインノ6cこより選1尺した。
選1尺した] I+ユニーそれぞれ培養しC4+111
1包を得、細胞中のプラストl” IJ N△を分Ml
l Lだ。望ましい組(便えD N A &、l: &
勺700013;r、)、ζからな’) X 、、1−
)−a−1m1片と約2500塩基からなる〆−[)、
1り断J″1を1、+1つべきであり、次いて一冬一セ
ーa−1すJ断により望ましい糾換えDNAとして約7
000塩基からなるプ」ユ11制)と約2500塩ム(
から入立/]I断ノ1から成るものを選択し−c L)
NΔかpΔM82内の酸フメスファターセプロモータ
ーθ月・流に位置するp Y I +−12−21a、
pYIl2−20)を得た。
1包を得、細胞中のプラストl” IJ N△を分Ml
l Lだ。望ましい組(便えD N A &、l: &
勺700013;r、)、ζからな’) X 、、1−
)−a−1m1片と約2500塩基からなる〆−[)、
1り断J″1を1、+1つべきであり、次いて一冬一セ
ーa−1すJ断により望ましい糾換えDNAとして約7
000塩基からなるプ」ユ11制)と約2500塩ム(
から入立/]I断ノ1から成るものを選択し−c L)
NΔかpΔM82内の酸フメスファターセプロモータ
ーθ月・流に位置するp Y I +−12−21a、
pYIl2−20)を得た。
次に、得られたプラスミドr) Y I L 2−21
aおよびpYIl、2−11bをサッカIコミセス・
セレヒンエへ1122’\以ト−の如くm人した。す、
カロミセス・セI/ヒシエA 1122のl1lII1
1 (ICu 2゜bis 4. can l 、 c
ir ” )を500rn6’$振とうフラスコ中のI
O(l m Q Y P D培地(1%f4’4.
fiミニキス2%ポリペプトン、2%グルコース、pH
5,3)で30℃に゛ζ好気的に振とう培養した。指数
増殖jUl中期(610nmにお心)る吸光度0.8)
に3500rpmで5分間遠心分離してイ111胞を集
め、T E緩衝液(I snM l−リス−塩酸、p
117.5.0.1mMEDT八)で1回洗浄し、同じ
緩衝?ll5m、6jに懸濁した。この細胞懸濁液の0
.5m4を試験管にとり、これに(1,2M CH3C
00L iまたは1.0MC5C/2を同量添加し、次
いで)緊、濁液を30゛Cで1時間振とうした。懸濁液
の細胞を350 Orpmで5分間遠心分乱して集め、
IMソルヒ1〜−ルて1回洗浄し、チモリアー−4i’
(Zy+++olyas50’ 00ン8プ皮(IM
ソルヒ゛1・−ル、 0. ] Mクエン11工)緩f
ffi ンIQ −10m M IF、 D i” Δ
−0,4m g /rn (1ナモリアーゼ5000
) I m 7!L、S丙ヒ!’H;i、濁シk。
aおよびpYIl、2−11bをサッカIコミセス・
セレヒンエへ1122’\以ト−の如くm人した。す、
カロミセス・セI/ヒシエA 1122のl1lII1
1 (ICu 2゜bis 4. can l 、 c
ir ” )を500rn6’$振とうフラスコ中のI
O(l m Q Y P D培地(1%f4’4.
fiミニキス2%ポリペプトン、2%グルコース、pH
5,3)で30℃に゛ζ好気的に振とう培養した。指数
増殖jUl中期(610nmにお心)る吸光度0.8)
に3500rpmで5分間遠心分離してイ111胞を集
め、T E緩衝液(I snM l−リス−塩酸、p
117.5.0.1mMEDT八)で1回洗浄し、同じ
緩衝?ll5m、6jに懸濁した。この細胞懸濁液の0
.5m4を試験管にとり、これに(1,2M CH3C
00L iまたは1.0MC5C/2を同量添加し、次
いで)緊、濁液を30゛Cで1時間振とうした。懸濁液
の細胞を350 Orpmで5分間遠心分乱して集め、
IMソルヒ1〜−ルて1回洗浄し、チモリアー−4i’
(Zy+++olyas50’ 00ン8プ皮(IM
ソルヒ゛1・−ル、 0. ] Mクエン11工)緩f
ffi ンIQ −10m M IF、 D i” Δ
−0,4m g /rn (1ナモリアーゼ5000
) I m 7!L、S丙ヒ!’H;i、濁シk。
この懸濁液を37°Cご1時間緩かに猟とうし′(プロ
トプラストを調製した。このプ+:+ l−プラストを
IMのソルビ1−−ルで3回洗浄し、IMツルピト−7
1/’−’ l (1mM Ca C1!2−10mM
I・リス−塩酸のi’a7Pj、1. Om 12
(p 117.5 )に再)冒、濁しノこ。フ。
トプラストを調製した。このプ+:+ l−プラストを
IMのソルビ1−−ルで3回洗浄し、IMツルピト−7
1/’−’ l (1mM Ca C1!2−10mM
I・リス−塩酸のi’a7Pj、1. Om 12
(p 117.5 )に再)冒、濁しノこ。フ。
ラスミドDNAを20 tt g/ m 7!となるよ
うPラストl Hp濁?1Mに添加し、この混合物を5
分間室温でイン−1−、、−< −1・した。次いで、
40%ポリ1チL/7グリ11−/し4000−10r
nM Ca (L)j!z−1OrnMl−リス 塩酸
のン容?I(j (p 117.5ン 5 m l!を
ごの混合物に加え、10分俊速心分Hq(t してプI
−2ドブラストを沈澱・uしめ、IMソルビトール−1
0m M C: a C7!2 − ] (Ilm M
l□リス−塩酸の)容シ良(p Hl、 5 ) !
−+ m 7!に再懸濁した。)脈濁液の一部Q、2r
nβをl it m 9−1Tj生寒天培地に加え、0
.1Mソルヒ川用−ル、 (1,67%ティフ:I・イ
ースト・す+3) イしロシェン ・\−ス52%タル
:I−ス・アミノ酸混合溶液(1、−グルタミン酸5■
、−)′スバラギン酸、L−アラニン、L−ブl」リン
、L−スレオニン、1.−セリン、1.、−1−リゾl
−フ・rン、1. イソIlイシン、1. バリン、1
.−フT、ニルアラニン。
うPラストl Hp濁?1Mに添加し、この混合物を5
分間室温でイン−1−、、−< −1・した。次いで、
40%ポリ1チL/7グリ11−/し4000−10r
nM Ca (L)j!z−1OrnMl−リス 塩酸
のン容?I(j (p 117.5ン 5 m l!を
ごの混合物に加え、10分俊速心分Hq(t してプI
−2ドブラストを沈澱・uしめ、IMソルビトール−1
0m M C: a C7!2 − ] (Ilm M
l□リス−塩酸の)容シ良(p Hl、 5 ) !
−+ m 7!に再懸濁した。)脈濁液の一部Q、2r
nβをl it m 9−1Tj生寒天培地に加え、0
.1Mソルヒ川用−ル、 (1,67%ティフ:I・イ
ースト・す+3) イしロシェン ・\−ス52%タル
:I−ス・アミノ酸混合溶液(1、−グルタミン酸5■
、−)′スバラギン酸、L−アラニン、L−ブl」リン
、L−スレオニン、1.−セリン、1.、−1−リゾl
−フ・rン、1. イソIlイシン、1. バリン、1
.−フT、ニルアラニン。
I7−チI」シン7 (、−メチオニン、グルシン、1
、−グルタミン、1.−アスパラギン、L、−リジン、
■、−ラスチン51. ヒスチジンおよび1.−アルキ
ニン各5 m B /l+ /!を含む)および2%寒
天から成る最小寒天ブレート(p l(5,3) 、、
L、に展開し、1、刊゛トララスフォ゛−マントを選択
した。
、−グルタミン、1.−アスパラギン、L、−リジン、
■、−ラスチン51. ヒスチジンおよび1.−アルキ
ニン各5 m B /l+ /!を含む)および2%寒
天から成る最小寒天ブレート(p l(5,3) 、、
L、に展開し、1、刊゛トララスフォ゛−マントを選択
した。
p Y I L 2−212またはp Y I L 2
−2 l bを含む八](22を30℃で好気的にヒス
チジン(201!g/m7りを補充した1 00 m
7!の高リン酸バー」ルダー(high−phosph
ate Burkl+older)最小培地(2(1,
Og//! グルコース、2.0g/l アスパラギン
、 l、 5 g / d’l K 112P O−。
−2 l bを含む八](22を30℃で好気的にヒス
チジン(201!g/m7りを補充した1 00 m
7!の高リン酸バー」ルダー(high−phosph
ate Burkl+older)最小培地(2(1,
Og//! グルコース、2.0g/l アスパラギン
、 l、 5 g / d’l K 112P O−。
2.0g/7! (NH4)zsOn、0.5g/j2
MgSOn−71(20,0,33g/ j! Ca
C1,z・21120.0.1mg/IlK 1.0.
25nHr、7’ j2FeS047HzO,[1,(
14mg/ff Mn5On’ 411zO,0,02
mg/7! (NH4) 6M0.0z4・4H20,
0,60mg/ 7! H:+BO:+、0.04mg
/I! CuSO4・5H20,+1.31mg/ff
ZnS○a ・71120.’ 0.20 m g/
p−サイアミン塩酸塩、10.0mg/j! イノシト
−ル、0.2m g/lパントテン酸カルシウ、/=、
0.2mg/j!ピリドキシン塩酸塩、 0.05 m
g /ynl パラ−アミノ安息香酸、9.20mg
/ρ ニコチン酸および2.0γ/7! ビオチンを含
有、p H5,3)中で培養した。5411胞密度が6
L On mにおりる吸光度で0.4に達しな1lJ
j、()°ンプルを取出し遠心分離して低リン酸最小培
地(20,0g/7! クルコース。
MgSOn−71(20,0,33g/ j! Ca
C1,z・21120.0.1mg/IlK 1.0.
25nHr、7’ j2FeS047HzO,[1,(
14mg/ff Mn5On’ 411zO,0,02
mg/7! (NH4) 6M0.0z4・4H20,
0,60mg/ 7! H:+BO:+、0.04mg
/I! CuSO4・5H20,+1.31mg/ff
ZnS○a ・71120.’ 0.20 m g/
p−サイアミン塩酸塩、10.0mg/j! イノシト
−ル、0.2m g/lパントテン酸カルシウ、/=、
0.2mg/j!ピリドキシン塩酸塩、 0.05 m
g /ynl パラ−アミノ安息香酸、9.20mg
/ρ ニコチン酸および2.0γ/7! ビオチンを含
有、p H5,3)中で培養した。5411胞密度が6
L On mにおりる吸光度で0.4に達しな1lJ
j、()°ンプルを取出し遠心分離して低リン酸最小培
地(20,0g/7! クルコース。
211g/x )′スパラギン、1.5g/7! K(
1!。
1!。
2.0 g/(! 、 (N114) 2SO4,0,
5g/I。
5g/I。
MgSO4・711zo、0.33 g/RCa cR
z・2H20,(1’、I+ng/j! K’1.0.
25mg、/7!FeSO4・71120.0.04m
g/j! Mn5O。
z・2H20,(1’、I+ng/j! K’1.0.
25mg、/7!FeSO4・71120.0.04m
g/j! Mn5O。
・41120.0.02rnr、/ I−(NH4)
6M0702A41120、(1,6mFX/j! H
3B(1+、0.04mH/7IC:uSO4・511
20.0.31rrzx//Z n SOs ・711
zo、 0.2rng/ ’! サイ”1ミン塩酸塩、
1(1,(1mg/7! イノシトール、’ 0.2
m (H/p パントテン酸カルシウム、 0.2 m
g/ /!ビリ1−キシン塩酸塩、0.05rrtg
/+2 パラアミノ安息香酸、9.irng/(l ニ
ー1チンaQ a n (12、Or/j! ビオチン
と含4.p H5,3> + 00 m p。
6M0702A41120、(1,6mFX/j! H
3B(1+、0.04mH/7IC:uSO4・511
20.0.31rrzx//Z n SOs ・711
zo、 0.2rng/ ’! サイ”1ミン塩酸塩、
1(1,(1mg/7! イノシトール、’ 0.2
m (H/p パントテン酸カルシウム、 0.2 m
g/ /!ビリ1−キシン塩酸塩、0.05rrtg
/+2 パラアミノ安息香酸、9.irng/(l ニ
ー1チンaQ a n (12、Or/j! ビオチン
と含4.p H5,3> + 00 m p。
中で懸濁して誘発させた。高リン酸最小培地を用いた他
は対照の°リンプルを同様に処理した。[i 10nm
におりる細胞密度が吸光度で0.8に達した時、誘発し
た培養液と誘発しなかった培養液のサンプル] OOr
n 7!を遠心分離した。
は対照の°リンプルを同様に処理した。[i 10nm
におりる細胞密度が吸光度で0.8に達した時、誘発し
た培養液と誘発しなかった培養液のサンプル] OOr
n 7!を遠心分離した。
得られた細胞をチモリアーセ500 (100μg/m
I2.) 、 1.2Mソルビトール、50mMリン酸
塩(pH7,2)および14mM2−メルカプト:にタ
ノールを含む溶液5mn中に懸濁し、懸濁液を30℃で
30分間インキュへ−1−シた。遠心分離してブt11
〜プラストを集め、01%トリトン100150rnM
リン酸塩(pH7、2)1m7!およびフェニルメチル
スルフォニルフロライド中に分離した。分離物(lys
aLe)を1100Orpmで20分間遠心分離して清
澄にした。低すン酸誘発ザンプルの清澄化した分離物の
I L − 2活性は1 0 0 0−1 0 0 0
0単位/ m j2であった。高リン酸誘発サンプル
中には11、−2活性は見られなかった。
I2.) 、 1.2Mソルビトール、50mMリン酸
塩(pH7,2)および14mM2−メルカプト:にタ
ノールを含む溶液5mn中に懸濁し、懸濁液を30℃で
30分間インキュへ−1−シた。遠心分離してブt11
〜プラストを集め、01%トリトン100150rnM
リン酸塩(pH7、2)1m7!およびフェニルメチル
スルフォニルフロライド中に分離した。分離物(lys
aLe)を1100Orpmで20分間遠心分離して清
澄にした。低すン酸誘発ザンプルの清澄化した分離物の
I L − 2活性は1 0 0 0−1 0 0 0
0単位/ m j2であった。高リン酸誘発サンプル
中には11、−2活性は見られなかった。
pYIL.2−21aを有するザノカ1、Iミセス・セ
レビシェAH22 (AJ l 46 1 3)および
p Y I L 2 − 2 l bを有するザノカロ
ミセス・セレビシェAH22 (AJ14614)はそ
れぞれFERt−P7 3 (1 3およびI” IF
.rンM−P1304として寄託されている。ザノカロ
ミセス・セレヒシコニA I( 2 2は1列えば11
9[□9左. N,IL−!−.す(」、且亘。
レビシェAH22 (AJ l 46 1 3)および
p Y I L 2 − 2 l bを有するザノカロ
ミセス・セレビシェAH22 (AJ14614)はそ
れぞれFERt−P7 3 (1 3およびI” IF
.rンM−P1304として寄託されている。ザノカロ
ミセス・セレヒシコニA I( 2 2は1列えば11
9[□9左. N,IL−!−.す(」、且亘。
USA vol. 75.4 1929−1933頁5
1983年4月に開示され、公知である。
1983年4月に開示され、公知である。
第1図はl +.. − 2活性を有するポリペプチド
をコードするクローあ伝子の制限酵素エン(−ヌクレア
ーゼによるり月祈マツプを示し、第2図(a)はりiコ
ーン化遺伝イの塩基配列を示し、第2図fblはIL−
2活性をイ1するポリペプチドのアミノ酸配列1.11
および111を示す。第3図はプラスミドヘクターpT
rS−3を示す。第4図(alおよび第4図fblはヘ
クターとしてp T r S−3を用いた組換えDNA
(pl’lL2−22.p’Fll、2−2 1 )
の構成を示すフローチャートである。第5図はヘクター
としζpAM82を用いた組換えl) NΔ(pY I
L2 −2 1)の構成を示すフローチャートである
。 図中、Δ,G.Cおよび′Fはそれぞれデオキシアデニ
ル酸、デオキソグアニル酸、デオキシシチジル酸および
チミジル酸を表わす。 ′IM:許出願人出願人素株式会社 ■ 2 (O : Φ −」 」 工 」 」 1 」 ψ ) フ α −ψ 2 コ − φ Φ 飄 ψ ω 0 」 Q Oく Σ o く 」 〉 Φ Φ 0 ぷ ? 王 女 P ! ンψ」> J
< (D J □ −1−2−Φ L の 〉 −ト 只 と 3 訊 肩 と 3− 〇 −
L Q ω L ) フ コ ψ Z−OL−< −1−J
: 5テロ3i( −−e Φ J>CDH手番53二とと Φ 0 − に
をコードするクローあ伝子の制限酵素エン(−ヌクレア
ーゼによるり月祈マツプを示し、第2図(a)はりiコ
ーン化遺伝イの塩基配列を示し、第2図fblはIL−
2活性をイ1するポリペプチドのアミノ酸配列1.11
および111を示す。第3図はプラスミドヘクターpT
rS−3を示す。第4図(alおよび第4図fblはヘ
クターとしてp T r S−3を用いた組換えDNA
(pl’lL2−22.p’Fll、2−2 1 )
の構成を示すフローチャートである。第5図はヘクター
としζpAM82を用いた組換えl) NΔ(pY I
L2 −2 1)の構成を示すフローチャートである
。 図中、Δ,G.Cおよび′Fはそれぞれデオキシアデニ
ル酸、デオキソグアニル酸、デオキシシチジル酸および
チミジル酸を表わす。 ′IM:許出願人出願人素株式会社 ■ 2 (O : Φ −」 」 工 」 」 1 」 ψ ) フ α −ψ 2 コ − φ Φ 飄 ψ ω 0 」 Q Oく Σ o く 」 〉 Φ Φ 0 ぷ ? 王 女 P ! ンψ」> J
< (D J □ −1−2−Φ L の 〉 −ト 只 と 3 訊 肩 と 3− 〇 −
L Q ω L ) フ コ ψ Z−OL−< −1−J
: 5テロ3i( −−e Φ J>CDH手番53二とと Φ 0 − に
Claims (2)
- (1)インターロイキン−2活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子が挿入されており、サツカロミセス
属酵母菌体内で増殖できるプラスミドヘクターを有する
り′ノカロミセス属酵母を培養し、生産されたインター
ロイキン−2を採取することを特徴とするインターロイ
キン−2の製造方法。 - (2)”す′ノカロミセス属酵母か勺ソ力ロミセス・セ
レビシェである特許請求の範囲第1項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB838327880A GB8327880D0 (en) | 1983-10-18 | 1983-10-18 | Saccharomyces cerevisiae |
GB8327880 | 1983-10-18 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6091995A true JPS6091995A (ja) | 1985-05-23 |
Family
ID=10550399
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59200595A Pending JPS6091995A (ja) | 1983-10-18 | 1984-09-27 | サツカロミセス属酵母によるインターロイキン‐2の製造方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0142268A1 (ja) |
JP (1) | JPS6091995A (ja) |
GB (1) | GB8327880D0 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100426286B1 (ko) * | 1996-01-09 | 2004-06-30 | 주식회사 엘지생명과학 | 효모를이용한인간인터루킨-11의제조방법 |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
US4853332A (en) * | 1982-10-19 | 1989-08-01 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins |
JPS61500586A (ja) * | 1983-11-14 | 1986-04-03 | チロン コ−ポレイシヨン | インタ−ロイキン−2産生のための方法及び組成物 |
US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
US4908434A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Process for preparing purified interleukin-2 |
US4908433A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Uses of interleukin-2 |
DE3712985A1 (de) * | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
US4992367A (en) * | 1986-05-12 | 1991-02-12 | Hoffmann-La Roche Inc. | Enhanced expression of human interleukin-2 in mammalian cells |
IL89989A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts |
WO1991005052A1 (en) * | 1989-09-28 | 1991-04-18 | Leningradsky Gosudarstvenny Universitet | Method for obtaining a polypeptide with human-interleukin-2 activity, secreted by yeast cells, saccharomyces cerevisiae |
US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
CA2090969C (en) * | 1990-09-04 | 2001-08-21 | Russell Arthur Brierley | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
EP0578746B1 (en) * | 1991-04-01 | 2002-07-03 | Merck & Co., Inc. | GENES WHICH INFLUENCE $i(PICHIA) PROTEOLYTIC ACTIVITY, AND USES THEREFOR |
IL157713A0 (en) | 2001-03-29 | 2004-03-28 | Schering Corp | Aryl oxime-piperazines useful as ccr5 antagonists |
JP4485520B2 (ja) | 2003-03-24 | 2010-06-23 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 逆転写酵素阻害剤としてのベンジル−ピリダジノン類 |
JP2009515826A (ja) | 2005-10-19 | 2009-04-16 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | フェニル−アセトアミドnnrt阻害剤 |
CN101501002B (zh) | 2006-08-16 | 2012-06-27 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 非核苷逆转录酶抑制剂 |
RU2469032C2 (ru) | 2006-12-13 | 2012-12-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Производные 2-(пиперидин-4-ил)-4-фенокси- или фениламинопиримидина в качестве ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы |
DE102007014752A1 (de) | 2007-03-28 | 2008-10-02 | Dusek, Niels, Dr. | Verwendung von humanidentischem oder humanaequivalentem rekombinantem Interleukin-2 (heqlL-2) als Therapeutikum in der Human- und Veterinärmedizin |
EP2155692B1 (en) | 2007-05-30 | 2015-06-17 | F. Hoffmann-La Roche AG | Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors |
KR101610415B1 (ko) | 2007-12-21 | 2016-04-07 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 헤테로사이클릭 항바이러스 화합물 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58170798A (ja) * | 1982-03-31 | 1983-10-07 | Japan Found Cancer | メツセンジヤ−rnaおよびその調製法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0091539B2 (en) * | 1982-03-31 | 1996-11-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells |
EP0775771A1 (de) * | 1995-11-22 | 1997-05-28 | Jensen Ag Burgdorf | Vorrichtung und Verfahren zum Behandeln von Wäschestücken |
-
1983
- 1983-10-18 GB GB838327880A patent/GB8327880D0/en active Pending
-
1984
- 1984-09-27 JP JP59200595A patent/JPS6091995A/ja active Pending
- 1984-10-11 EP EP84306934A patent/EP0142268A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPS58170798A (ja) * | 1982-03-31 | 1983-10-07 | Japan Found Cancer | メツセンジヤ−rnaおよびその調製法 |
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KR100426286B1 (ko) * | 1996-01-09 | 2004-06-30 | 주식회사 엘지생명과학 | 효모를이용한인간인터루킨-11의제조방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB8327880D0 (en) | 1983-11-16 |
EP0142268A1 (en) | 1985-05-22 |
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