JP2964439B2 - プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は組換技術により製造され
るプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質に関する。本
発明はヒト由来のプラスミノーゲンアクチベーター蛋白
質をコードする図１の制限酵素地図で表されるポリデオ
キシリボヌクレオチドセグメントを挿入したプラスミド
ベクターにより形質転換された大腸菌中で産生され、線
維素溶解活性を示し且つヒトウロキナーゼに対する抗体
によって認識されるプラスミノーゲンアクチベーター蛋
白質に関するものである。特に、本発明はヒト由来のプ
ラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードするポリ
デオキシリボヌクレオチドセグメントを挿入したプラス
ミドベクターにより形質転換された大腸菌中で産生さ
れ、該ポリデオキシリボヌクレオチドセグメントは図１
の制限酵素地図で表されるＤＮＡ配列を持つことことか
らなる、線維素溶解活性を示し且つヒトウロキナーゼに
対する抗体によって認識されるプラスミノーゲンアクチ
ベーター蛋白質に関するものである。 【０００２】 【従来の技術とその課題】静脈および動脈の凝血、肺塞
栓、心臓内の血栓および組織塞栓などの急性血栓症候群
は処理の困難なものである。閉塞自体のための現在の医
学的治療には抗血液凝固が含まれる。現在の医学的アプ
ローチはその基本的過程を停止させ、そして血液の流れ
を回復して血管の閉塞または組織の破壊の程度を限定す
るための通常の生理学機構に依存している。血栓溶解作
用または血栓溶解の治療は不快な血栓を溶解させるため
の手段としてかなり興味あるものといえる。抗血液凝固
と血栓溶解治療との双方を使用することによって、医学
的実施は血栓を迅速に溶解してその再発を防ぐ手段をも
つことになるであろう。最近、血栓溶解治療への数種の
アプローチが観察されており、その一つは天然に産する
線維素分解酵素系（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚ
ｙｎｍｅ ｓｙｓｔｅｍ）の活性剤の組織内注入による
ものである。広範な研究の行われたこのような試剤はウ
ロキナーゼである。ウロキナーゼはプラスミノーゲンか
らプラスミンへの転化を通して活性な血栓溶解剤であ
る。プラスミノーゲンは天然に産するプラズマ前駆体で
あり、このものは活性剤の存在下、線維素（ｆｉｂｒｉ
ｎ）を加水分解しうる蛋白分解酵素たるプラスミンに転
化する。ウロキナーゼは構造未知の複雑な蛋白質であ
り、ヒト尿中に痕跡量見出される。ウロキナーゼは有力
な血栓熔解剤であり、血液中に自然に依存する量よりも
遥かに多量を注射すると血栓熔解を促進する。ウロキナ
ーゼは１９５１年にはじめて記載され、その後ヒト尿か
らのウロキナーゼの分離および精製のための方法が開発
された。ウロキナーゼの分離および精製法は多くの刊行
物、たとえは米国特許第２，９８３，６４７号；同第
３，２５６，１５８号；同第３，４７７，９１０号〜第
３，４７７，９１３号および第３，５４４，４２７号に
記載されている。然しながら、尿の収集と処理の業務は
ウロキナーゼのこの資源を非実用的なものにしている。
４００万ＣＴＡ単位（ＣＴＡはＣｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏ
ｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓの略語）
のウロキナーゼは約１，５００リットルの尿の処理を必
要とするからである。後にヒトの腎臓細胞の培養中に線
維素分解活性が発表され、そしてこの活性は尿のウロキ
ナーゼと免疫学的に区別がつかないことが見出された。
組織培養法を使用してさえ、生産コストが高くつき、そ
の結果、ウロキナーゼの製造のための他の方法が望まれ
ている。 【０００３】 【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトのウロキ
ナーゼに関するプラスミノーゲンアクチベーターをコー
ドするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を組入れた修飾プラ
スミドを提供することにも関連し、この修飾プラスミド
はバクテリアまたは他の微生物に導入することができ、
ついでこのものを培養して抗生物質化合物の製造と同じ
ようにしてウロキナーゼ様物質を製造することができ
る。この修飾プラスミドはプラスミド中のヌクレオチド
配列の直接操作によってえられる。記述のために、本発
明をバクテリウムＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株Ｘ１７７
６ならびプラスミドおよびそこからのベクターｐＢＲ３
２２を参照して以下に述べる。前者はＲａｖｅｎ Ｐｒ
ｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）発行、Ｂｅｅｒｓ，Ｒ．
Ｆ．およびＢａｓｓｅｔｔ，Ｅ．Ｇ．共著「Ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｉｍｐａｃｔ ｏ
ｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｏｃｉｅｔｙ」（１９
７７年）第４５頁に記載されており、後者はＢｏｌｉｖ
ａｒら（Ｇｅｎｅ，２，第９５頁，１９７７年）によっ
て記述されている。本発明者はヒトのプラスミノーゲン
アクチベーターであるウロキナーゼをコードするＤＮＡ
セグメントをバクテリアに組入れた。このようにしてこ
の微生物はヒトの胎生腎臓細胞の組織培養から分離した
ウロキナーゼと類似の免疫学的なおよびプラスミノーゲ
ン活性剤の性質を有するプラスミノーゲンアクチベータ
ーを製造する新しい能力を獲得する。この遺伝子工学の
方法は簡単にいうと（１）ヒトの胎生腎臓細胞からのメ
ッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の分離、（２）分離
したｍＲＮＡの存在の実証、（３）組換えＤＮＡ合成に
適するｍＲＮＡからの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の実験室
的合成、（４）上記（３）で合成したＤＮＡとベクター
またはプラスミドＤＮＡとを含む組換えＤＮＡの合成、
（５）この組換えＤＮＡによるバクテリアの形質転換な
らびにプラスミノーゲンアクチベーター生産のため形質
転換細胞の検出および選択、および（６）形質転換細胞
からのプラスミノーゲンアクチベーターの分離と化学的
および生物学的性質の特性の記述からなる。 【０００４】ヌクレオチド配列のこの新しい操作技術
は、一菌株もしくは種からの周知のもしくは同定された
ヌクレオチド配列を別のものへ導入しこれによって所望
の性質を付与することを可能にする。ＤＮＡの二重らせ
ん構造に関して、ＤＮＡ分子のからみ合った相補性のス
トランドはホスフェート基を通して結合する４つのデオ
キシリボヌクレオチド即ちデオキシ−リボアデノシン−
５′−ホスフェート（ｄＡＭＰ）、チミジン−５′−ホ
スフェート（ＴＭＰ）、デオキシ−リボグアノシン−
５′−ホスフェート（ｄＧＭＰ）およびデオキシ−リボ
シチジン−５′−ホスフェート（ｄＣＭＰ）から作られ
ている。それぞれのストランドの遺伝子情報はデオキシ
リボヌクレオチドの特定の配列において具体化される。
あるＤＮＡ分子中のヌクレオチドの配列はある特定の蛋
白質の配列を決定し、そしてアミノ酸の配列はまた蛋白
質の構造と機能とを確立する。それ故、ＤＮＡのヌクレ
オチド配列は有機体の性質を作る蛋白質を正確に規定す
る。 【０００５】組換えＤＮＡの操作はバクテリアから分離
される制限エンドヌクレアーゼ酵素として知られる蛋白
質によるＤＮＡのストランドの開裂により始まる。その
酵素はＤＮＡ鎖を特定の配列部位で切断する。その切断
は必ずしも二つのストランドの同じ位置で起きるとはい
えないで、その分けられたストランドは相補性の末端を
持ちそのため適当な条件下で一緒に結合して端部対端部
でそれらが結合しうる。２種の異なった資源からのＤＮ
Ａ（その両者は適切な標識配列をもつ）について同一の
制限酵素を使用するならば、結合性の端部を有する配列
がその結果生ずるであろう。それ故、任意の資源からの
２つの配列を組換えて単一のＤＮＡ分子にすることがで
きる。組換え用ＤＮＡを取得する別の方法は、メッセン
ジャーＲＮＡを二重ストランド相補ＤＮＡに逆転写する
ことである。合成されたＤＮＡは次いでこれを以下に述
べるようにしてプラスミド中に組入れることかできる。
ＤＮＡ取得のこの方法は好ましいものである。それは、
哺乳動物染色体のＤＮＡの遺伝子が蛋白質を伝達しない
配列を多くの場合含み、そのためＤＮＡから蛋白質への
遺伝子情報伝達の直線性が中断されるからである。Ｅ．
Ｃｏｌｉのようなバクテリアの場合、その単純な円形染
色体に加えて、それは細胞の染色体から物理的に分離し
ている遺伝子単位であるプラスミドもしくは余分の染色
体要素として知られる一個またはそれ以上の独立に複製
されるサークル状物をもつこともできる。これらのプラ
スミドもしくはベクターはバクテリアから分離すること
ができ、制限酵素によって開口もしくは開裂することが
でき、そして組換えの一成分として使用することができ
る。組入れるべきＤＮＡをプラスミドＤＮＡに接合した
後、この円形プラスミドはこれを閉じることができ、そ
してプラスミドは細胞にもどされうる。そこでそれはそ
れ自身の自然のヌクレオチド配列のみならず加えたもの
をも転写しつつ複製を再び始めるであろう。それ故、え
られるバクテリアの菌株はバクテリアの繁殖の際に、組
入れたヌクレオチド配列のコピーを維持するであろう。 【０００６】本発明は添付した図を参照することによっ
て更によく理解されるであろう。図１はウロキナーゼに
関連したプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質を伝達
するプラスミド含有ＤＮＡの制限酵素地図を図式的に説
明するものである。 図２は形質転換細胞からのウロキナ
ーゼ様物質のアフィニティークロマトグラフィーからえ
られたデータを説明するグラフである。 【０００７】プラスミドは二重ストランドＤＮＡからな
り少なくとも１つの複製部位を含むものと信じられてい
る。添付した図１を参照して、そこにはウロキナーゼに
関連したプラスミノーゲンアクチベーターをコードする
ＤＮＡセグメントを組入れたＥ．Ｃｏｌｉプラスミドｐ
ＢＲ３２２を図式的に示してある。Ｅ．Ｃｏｌｉプラス
ミドもしくはベクターｐＢＲ３２２プラスミドはＢｏｌ
ｉｖａｒらによって記述されている（Ｇｅｎｅ，２，第
９５頁，１９７７年）。図１に示すように、このｐＢＲ
３２２プラスミドはＰｓｔＩの位置として以後に述べる
部位において制限酵素によって開裂されており、プラス
ミノーゲンアクチベーターをコードするＤＮＡセグメン
トがその中に組入れられている。一つのストランド上の
配列が相補的に直接向き合って存在するため結合が起こ
る。その相補性はそれぞれヌクレオチド類シトシンおよ
びグアニンまたはアデニンおよびチミンの間の化学的親
和性に依存する。ストランドの長さにそってくりかえさ
れるこれらの結合の合計はストランドを一緒に保持す
る。２つのＤＮＡ断片を結合する別法はリガーゼを使用
するブラント末端の連結（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ）による方法である。図１に示す数値はそこ
に示す部位の間の塩基ペアの数（実際には近似値）であ
る。例えば、ｐＢＲ３２２プラスミドのもとのＰｓｔＩ
部位の間に組入れられた塩基ペアの数は約４，２００で
ある。図１の直径にそった場所もしくは部位は特定配列
のヌクレオチドが生じ且つ特定の制限エンドヌクレアー
ゼ酵素によって開裂しうる場所を示す。図１中の記号は
それぞれの部位の大体の場所ならびにヌクレオチドの特
定配列においてＤＮＡストランドを切断する特定の制限
酵素を示す。図１は本発明の一態様を示すものであり、
ウロキナーゼ様物質をコードするＤＮＡを組入れたＥ．
Ｃｏｌｉプラスミドを例示するものである。組換えＤＮ
Ａ，すなわちウロキナーゼ様物質をコードするＤＮＡを
含む再構成されたプラスミドはＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ−１２
菌株Ｘ１７７６として例示されているような適当な宿主
有機体すなわち単一細胞宿主にもどされる。そこではそ
の有機体はそれ自身の自然の配列のみならず組入れた配
列をも転写しつつ複製を始める。 【０００８】他の適当な有機体はエシェリシア属、サッ
カロマイセス属、バチルス属、ニューロスポラ属または
ストレプトマイセス属からえらぶことができる。このよ
うに単一細胞宿主を使うことができる。適当な微生物の
種を例示すれば、エシェリシアコリイ（Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ）、サッカロマイセスセレビシアエ、バチルスサブチ
リスおよびニューロスポラクラサである。 【０００９】本発明は、免疫学的および生物学的特質に
おいてウロキナーゼに関連するプラスミノーゲンアクチ
ベーター蛋白質を生産する適当なプラスミドを含有させ
たエシェリシア属からのバクテリアを特に提供するもの
である。Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｘ１７７６ｐＡＢＢ２６の培養
物は米国イリノイ州ペオリアの米国農務省のＡＲＳカル
チュアーコレクションに寄託され、寄託番号Ｂ １２１
２２が付せられた。 【００１０】本発明のプラスミノーゲンアクチベーター
蛋白質をコードするポリデオキシリボヌクレオチドセグ
メントによって発現され且つ実質的にウロキナーゼの特
性を有するプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質生成
物は、天然由来のウロキナーゼと同様に血栓溶解剤とし
て有用であることが見出された。本発明の血栓溶解剤
は、治療上有効量の上記プラスミノーゲンアクチベータ
ー蛋白質生成物に加えて、薬学上許容しうる担体を混合
して含有しているものであってよい。 【００１１】このような担体としては通常の蛋白質製剤
で使用し得るものであれば特に限定されない。この担体
としては注射剤に通常用いられるものが挙げられ、例え
ば無菌蒸留水、生理食塩水、リンゲル液及びその他の適
当な水性溶液があげられる。 【００１２】これらの担体には必要に応じて更に緩衝
剤、等張化剤、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化
剤、保存剤等を加えることができる。上記緩衝剤として
は例えばクエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等があげられ
る。 【００１３】上記安定剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウ
ム、１−アスコルビン酸等の抗酸化剤、ＥＤＴＡ、チオ
グリコール酸、チオ乳酸等のキレート化剤、水溶性有機
溶剤等があげられ、上記懸濁化剤としては有機酸、有機
塩基、界面活性剤、多価アルコール、アミノ酸等があげ
られる。上記保存剤としてはアルキルパラベン類、ベン
ジルアルコール、フェノール、クレゾール等があげられ
る。 【００１４】本発明の血栓溶解剤は、好ましくはその処
置を必要とされる患者に非経口的に投与されることがで
きる。このような方法としては具体的には静脈内あるい
は動脈内に投与することによって行われるが、場合によ
っては直接患部に投与することも好ましい。本発明の血
栓溶解剤は注射剤とされて静脈内に投与することが特に
好ましい。 【００１５】本発明の血栓溶解剤は、その有効成分であ
る蛋白質生成物の凍結乾燥物を、何も含まない無菌水に
溶解するかあるいはアニトール、グルコース、デキスト
ロース、ゼラチン及び／又はポリビニルピロリドンを含
有する無菌水に溶解し、次に生理的に等張化することに
より実際の投与形態にすることができる。 【００１６】本発明の血栓溶解剤は適当な用量で患者に
投与されることができる。 【００１７】本発明の血栓溶解剤はその酵素活性を基準
にして相当する天然型のウロキナーゼと同様にして用い
ることもできる。 【００１８】本発明の血栓溶解剤は、投与対象者の種
類、年齢、体重等の諸条件や、本薬剤に対する応答性、
投与目的等に応じて適宜その用量及び投与回数を選択す
ることができる。 【００１９】本発明の血栓溶解剤はその１回投与量とし
てウロキナーゼ換算で１，０００単位から２，０００，
０００単位までを含むようにして用いることができる。 【００２０】本発明の血栓溶解剤は５％のヒトアルブミ
ンを含有する生理食塩水中に溶解し、１回投与量として
ウロキナーゼ換算で好ましくは２０，０００単位〜６
０，０００単位を含む１０ｍｌ注射液として用いること
ができる。 【００２１】また本発明の血栓溶解剤による治療は必要
に応じて長期間行うこともでき、例えば１日〜３０日間
治療を加えることもできる。 【００２２】本発明の血栓溶解剤の投与法としては、さ
らに初回に４０，０００単位〜３００，０００単位を投
与して後、以後投与量を漸減して約１週間程投与すると
いうことによって行うこともできる。 【００２３】 【実施例】 実施例１ ヒトの胎生腎臓細胞からのｍＲＮＡの分離 ウロキナーゼ産生細胞から全ｍＲＮＡを次のとおり分離
した。１０％の胎生子牛血清を含むイーグル媒質（Ｅ１
９９）中でヒトの胎生腎臓（ＨＥＫ）細胞を合計７〜１
０日間組織培養により生育させた。収集前に更に７日間
この細胞を血清なしで蛋白質加水分解物質中に保持し
た。ＨＥＫ細胞をローラボトルからこすり取り、ヘパリ
ン（１０単位／ｍｌ）含有塩水中で洗い、グアニジン塩
による抽出をリン酸塩で緩衝した塩水（ＰＢＳ）緩衝液
中でｐＨ７．０で行った以外はウルリッヒらのグアニジ
ンチオシアネート法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６，第１３
１３頁，１９７７年）により全ＲＮＡを分離した。この
ＲＮＡをエタノールにより沈澱させ、２３ｍＭのＮ−２
−ヒドロキシ−エチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンス
ルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液に溶解した。デーレイら
の（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，第８３１０頁，
１９７７年）記述のようにポリウリジル酸（Ｐｏｌｙ
Ｕ）セファデックスＧ−１０カラム上の親和クロマトグ
ラフにより全ＲＮＡからｍＲＮＡを含有するポリアデニ
ル酸（Ｐｏｌｙ Ａ）を分離した。カラム物質はコフィ
ンらの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８６，第３７３
頁，１９７４年）に従い合成した。ＲＮＡをカラム中に
２回通して全ｍＲＮＡをえた（全ＲＮＡ３９ｍｇから
１．１ｍｇ）。ウロキナーゼｍＲＮＡを更に濃縮し、シ
ュクロース密度傾斜遠心分離により全ｍＲＮＡから分離
した。全ＲＮＡをＴＥＳ−２緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；２０ｍＭ ＮａＣｌ；０．５
ｍＭ ＥＤＴＡ；０．４％のナトリウムドデシルサルフ
ェート）に約１０Ａ_２６０／ｍｌの濃度でとかした。こ
のＲＮＡを６５℃で１５分間加熱し、ベックマンＬ５−
６５超遠心分離器中で２５，０００ｒｍｐにおいて２０
℃で１２時間ＳＷ２７ロータ中で線状（１０〜３０％）
シュクロース傾斜および遠心分離に付した。次いで傾斜
物を各フラクション（０．５ｍｌ／フラクション）に分
け、Ａ_２６０の読みを決定した。２８Ｓより大きいＲＮ
Ａをプールし、エタノールで沈澱させ、７０％エタノー
ル中の３３ｍＭ ＮａＣｌで洗い、次いで９５％エタノ
ールで洗った。これを乾燥し、ｐＨ７．０の３３ｍＭの
ＨＥＰＥＳにとかした。傾斜に付したＲＮＡの１ｍｇか
ら、２８Ｓより大きいＲＮＡ７３ｕｇをえた。このＲＮ
Ａを使用して無細胞蛋白質合成でウロキナーゼｍＲＮＡ
の存在を実証しそしてｃＤＮＡの合成を行った。 【００２４】実施例２ 無細胞蛋白質合成による分離ＲＮＡ調製物中のウロキナ
ーゼｍＲＮＡの存在の実施 ウサギの網内皮細胞からの無細胞蛋白質合成系をペルヘ
ムおよびジャクソンの方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，６７，第２４７頁，１９７６年）によりヌクレア
ーゼ処理して内生のｍＲＮＡを消化処理した。無細胞で
の蛋白質の合成および免疫沈澱をローデスらの方法
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８，第２０３１頁，１
９７３年）に従い実施した。２０％（Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）
の網内皮細胞溶解物、２ｍＭのアデノシントリホスフェ
ート（ＡＴＰ）、０．２Ｍのグアニジントリホスフェー
ト（ＧＴＰ）、１０ｍＭのクレアチンホスフェート、２
ｕｇのクレアチンキナーゼ、３ｍＭのジチオスレイトー
ル、７５ｍＭのＫＣＬ、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、３０ｍＭ
のＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、２０ｕＭのアミノ酸混合物
（メチオニンなし）、５ｕＣｉ ^３５Ｓ−メチオニンお
よび１ｕｇの精製メッセンジャーＲＮＡを含む最終容量
４５ｕｌ中で培養を行った。混合物を２５℃で１時間培
養し、次いで冷却および０．１Ｍメチオニン、１０％ト
リトンＸ−１００および１０％ナトリウムデオキシコレ
ートからなる液２５ｕｌの添加により停止した。５ｕｌ
づつの分別量を０．３ＭＭフィルターペーパーディスク
上にピペットで移し、０．２％のＤ，Ｌ−メチオニンを
含むトリクロル酢酸（ＴＣＡ）中で洗うことにより、と
り込まれたもの全体のトリクロル酢酸不溶解カウントを
えた。次いでこのペーパーディスクを同じＴＣＡ−メチ
オニン溶液中で９０℃で１５分間加熱し、シンチレーシ
ョンカウンターでカウントする前に乾燥した。 【００２５】合成した^３５Ｓ−ペプチドの免疫沈澱をロ
ーデスらの方法（上記文献参照）により行った。ただ
し、それぞれの抗原−抗体沈澱物を０．５Ｍシュクロー
ス、１％トリトンＸ−１００、１％ナトリウムデオキシ
コレートおよび０．２ＭのＤＬ−メチオニンからなる液
２００ｕｌからなるシュクロースクッション中を沈降さ
せるという変形を用いた。精製ウロキナーゼ（０．５ｕ
ｇ）をキャリヤーとして反応混合物に加え、ウサギの抗
ウロキナーゼ（ＩｇＧ フラクション）の５〜１０ｕｇ
を加えることによって免疫沈澱を行った。第二抗体（ヤ
ギの抗ウサギＩｇＧ，１００〜２００ｕｇ）を加え、反
応混合物を更に４℃で１８時間培養した。最終の沈澱物
を洗い、１０Ｍの尿素、５％ＳＤＳおよび５％メルカプ
トエタノール中で再懸濁させて６０℃で３０分間加熱し
た。分別量をシンチレーションカウンター中でカウント
して^３５Ｓとり込み量を求めた。ウロキナーゼ特異ｍＲ
ＮＡのカウントをＴＣＡにより沈澱された全カウント分
の免疫沈澱カウントのパーセントとして表示した。この
反応条件において、精製ウサギのグロビンのメッセンジ
ャーＲＮＡの１ｕｇを反応混合物中に使用するときに反
応混合物１ｕｌ当たり１×１０^５ｃｐｍがＴＣＡにより
沈澱しうる。１％以下の放射能がウサギのヘモグロビン
ｍＲＮＡコントロール中でウロキナーゼ抗体によって免
疫沈澱された。一方、人間の胎生腎臓（ＨＥＫ）細胞か
らのＰｏｌｙ Ａを含むｍＲＮＡは免疫沈澱しうるカウ
ントとして１０％のＴＣＡ不溶性放射能を与えた。シュ
クロース密度傾斜遠心分離による２８Ｓより大きいメッ
センジャーＲＮＡはウロキナーゼ抗体により４０〜６０
％のＴＣＡ不溶性放射能が免疫沈澱したことを示した。 【００２６】加えたｍＲＮＡに依存する無細胞での蛋白
質の合成はまたロバーツおよびピーターソン（ＰＮＡ
Ｓ，７０，第２３３０頁，１９７３年）によって述べら
れている小麦発芽系中で行った。ウサギの網内皮細胞系
中で上述の如く免疫沈澱を行った。シュクロース密度傾
斜からの２８Ｓより大きいメッセンジャーＲＮＡは免疫
沈澱しうるカウントとしてＴＣＡ不溶性カウントの９０
％をも与えた。 【００２７】実施例３ ｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成 フリードマンおよびロスバッシュの方法（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４，第３４５５頁，１９７
７年）に従いｍＲＮＡの逆転写によって単一ストランド
ｃＤＮＡを合成した。ただし次の変形を用いた。ｍＲＮ
ＡでオリゴｄＴプライマーをアニール化するための反応
混合物（５００ｕｌ）は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ８．５、２０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ_２、
２０ｕｇのＰｏｌｙ Ａ含有のｍＲＮＡおよび１．５ｕ
ｇのｄＴ_３０を含んでいた。ｃＤＮＡ合成のための最終
反応混合物（１ｍｌ）は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ８．５、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ_２、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０
ｕｇのアクチノマイシンＤ、各１ｍＭのデオキシアデノ
シントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシグアニジ
ントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、チミジントリホスフ
ェート（ＴＴＰ）、８００ｕＭ〔α−３２ｐ〕ｄＣＴＰ
および３２５単位のＡＭＶ逆転写酵素を含んでいた。４
２℃で３０分間培養後、酵素３２５単位を別に加えた。
２時間の培養後、０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）の５０ｕｌを加えることによって反応を停
止した。この溶液に１０ＭのＮａＯＨの４０ｕｌを加
え、次いで室温で１８〜２０時間培養した。次いで、ゆ
っくりかきまぜながらＨＥＰＥＳを加えることによって
溶液をｐＨ８．５に中和した。次いでこの溶液をフェノ
ール抽出、セフアクリルＳ−３００ゲル濾過および高分
子量のｃＤＮＡを含有する排除フラクションをメタノー
ル沈澱に付した。収率は１５〜２５％であった。ｃＤＮ
Ａ生成物を７Ｍ尿素中の３．５％ポリアクリルアミド−
スラブゲル（２０×４０×０．３ｃｍ）中の電気泳動に
付した。長さのマーカーとしてラムダＤＮＡのＨｉｎｄ
ＩＩＩエンドヌクレアーゼ消化を使用した。ゲルの放
射線写真後、主たる種として３，０００から６，０００
のヌクレオチド残基を有する単一ストランドｃＤＮＡを
検出した。 【００２８】ジャコブセンらによって述べられた反応条
件（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４５，第６２３
頁，１９７４年）に類似して、イーコリィからのＤＮＡ
ポリメラーゼの大きな断片を使用することによって、ｃ
ＤＮＡの第二のストラントを合成した。反応は反応容量
２００ｕｌ中に１．４ｎモルのｃＤＮＡ、０．１ＭのＨ
ＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、それぞれ４００ｕＭのｄＡＴ
Ｐ、デオキシシトシントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、
ｄＧＴＰおよびＴＴＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍ
Ｍのジチオスレイトールならびに７０ｍＭのＫＣｌを含
んでいた。１５℃で１．５時間培養を行った。次いで
０．５ＭのＥＤＴＡの２０ｕｌを加え、そしてＤＮＡを
フェノール抽出およびエタノール沈澱によって精製し
た。 【００２９】次いで上述の二重ストランドｃＤＮＡを、
３０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６、１ｍＭのＺｎ
ＳＯ_４、２５０ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｕｇ／ｍｌ
のイーコリィｔＲＮＡの存在下において、１５℃で３時
間Ｓ_１ヌクレアーゼ（１２５０単位）により処理した。
ＤＮＡの約５８％（ほぼ０．５ｕｇ）が処理後に回収さ
れた。ベックマンＬ５−７５超遠心分離器中の４０，０
００ｒｐｍ揺動バケツＳＷ４０ロータ中の線状シュクロ
ース密度傾斜〔１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉ
ｓ ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡからなる塩水−Ｔｒ
ｉｓ−ＥＤＴＡ（ＳＴＥ）中１５〜３０％〕中で２０℃
で１６時間ＤＮＡを遠心分離した。２，０００個の塩基
ペアより大きいＤＮＡをプールし、エタノール沈澱し
て、組換えＤＮＡ合成のためＰｏｌｙ Ｃ束をつけるの
に使用した。 【００３０】実施例４ 組換えＤＮＡの合成 二重ストランドｃＤＮＡへのホモポリマー束の添加をロ
イコウドハリィ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ
， ３，第８６３頁，１９７６年）によって述べられ
ているようにエキソヌクレアーゼを使用することなしに
行った。反応混合物（３００ｕｌ）は１００ｍＭのカリ
ウムカコジレートｐＨ６．９、３０ｍＭのＴｒｉｓ塩
基、１ｍＭのＣｏＣｌ_２、２００ｕＭのＤＴＴ、６ｎモ
ルの二重ｃＤＮＡ（全ヌクレオチド残基中）、１００ｕ
Ｍの〔α−３２ｐ〕ｄＣＴＰおよび２４０単位のターミ
ナルトランスフェラーゼを含んでいた。２０分後に０．
５ＭのＥＤＴＡの３０ｕｌおよび中和したフェノール３
００ｕｌを添加して反応を停止した。十分に混合した
後、内容物を１５００ｘｇで１０分間遠心分離して水性
層を除いた。１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）の１
０ｕｌによりフェノール層を二回抽出し、また集めた水
性層をエーテル抽出し、エタノール沈澱した。 【００３１】二重ストランドｃＤＮＡ中に３′−ＯＨ端
部のほぼ２０ｐモルから、１４００ｐモルまでの〔３２
ｐ〕ｄＣＭＰがとり込まれた。これはＤＮＡストランド
当たり７０個のｄＣＭＰ残基が添加されることを示すも
のであった。線状プラスミドを次の如くしてえた。反応
混合物（１００ｕｌ）は１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ７．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＤＴ
Ｔ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｕｇのｐＢＲ３２２ＤＮ
Ａおよび５単位のＰｓｔ Ｉを含んでいた。反応混合物
の一分別量（５ｕｌ）をアガロースゲル電気泳動により
分析して消化の完全なことを調べた。次いで線状ＤＮＡ
をフェノール抽出し、エタノール沈澱により分離した。 【００３２】このＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０および０．５ｍＭのＥＤＴＡからなる液
の１００ｕｌ中に懸濁させ、１００ｕＭの〔３Ｈ〕ｄＴ
ＴＰおよび２４０単位のターミナルトラスフェラーゼを
含む上述のターミナルトランスフェラーゼ緩衝液中で培
養した。４２℃で０分、１分、２分、３分、４分および
５分の間隔で分別物（各５ｕｌ）を酸不溶性放射能につ
いてモニターした。培養５分後の残りの溶液をフェノー
ル抽出しそしてエタノール沈澱した。この期間中、全１
３０ｐモルのｄＧＭＰ残基がとり込まれた。３′−ＯＨ
末端の５．４ｐモルを含むこのＤＮＡサンプルに、ｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡのストランド当たり平均２４個の残基を
付加した。 【００３３】ポリデオキシシチジル酸（ｐｏｌｙ ｄ
Ｃ）（約０．１５ｐモル）をつけた大きな二重ストラン
ドｃＤＮＡを容量１００ｕｌの０．１ＭのＮａＣｌ中で
当量のポリデオキシグアニリジン酸（ｐｏｌｙ ｄＧ）
をテイル付加したｐＢＲ３２２ＤＮＡにアニール化し
た。混合物を６５℃で３時間加熱して４２℃で１６時間
放置してこのＤＮＡ調製物をアニール化した。 【００３４】実施例５ イーコリィの形質転換 カーチスらの方法（ＣＲＣプレス発行，１９７８年，Ｃ
ｈａｒｋｒａｂａｒｔｙ，Ａ．Ｍ，編集の「Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｌｉｎｇ」のＷ．Ｓａｌｓｅｒ
による第３章，第３頁に記載の方法）を使用してアニー
ル化したＤＮＡ混合物によりＸ１７７６（Ｆ−ｔｏｎ
Ａ５３ ｄａｐ Ｄ８ ｍｉｎ Ａ１ｍｉｎ Ｂ２ Ｓ
ｕｐ Ｅ４２ ｇａｌΔ４０⁻ｒｆｂ−２ ｎａｌ Ａ
２５ｏｍｓ−２ ｔｈｙ Ａ５７ ｍｅｔ Ｃ６５ ｏ
ｍｓ−１〔ｂｉｏＨ−ａｓｄ〕Δ２９ ｃｙｃ Ｂ２
ｃｙｃ Ａ１ ｈｓｄ Ｒ２）を形質転換した。補充Ｌ
液（ジアミノピメリン酸１００ｕｇ／ｍｌ、ナリジキシ
ン酸２５ｕｇ／ｍｌおよびチミン４０ｕｇ／ｍｌ）中で
細胞を３７℃で０．３Ａ_６００にまで生育し、室温で１
０分間１７００ｘｇで遠心分離してペレットを集めた。 【００３５】細胞を１０ｍＭのＮａＣｌ（１／２容量）
中に懸濁させ、遠心分離し、再び１／２容量のＣａ緩衝
液（７５ｍＭのＣａＣｌ_２，１４０ｍＭのＮａＣｌ，１
０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）中に懸濁させ
た。室温で３０分後、細胞を遠心分離し、再び１／１０
容量のＣａ緩衝液に懸濁し、そして０℃に冷却した。２
容量の細胞を１容量のＤＮＡと混合し、０℃で３０分間
保ち、４２℃で１分間加熱し、そして室温で十分間放置
し、１０容量の補充Ｌ液と混合し、そして３７℃で１０
０分間培養した。培養物を少しづつピペットにより２ｍ
ｌのソフトＬ−カンテン（０．６％）中に移しそのプレ
ート上に敷くことによって、細胞を１２．５ｕｇのテト
ラサイクリンを含有する補充Ｌ−カンテン上にプレート
状においた。このプレートを３７℃で２日間培養した。
全３２種類のテトラサイクリン耐性形質転換体をえた。
これらのうち、４種類はアンピシリン感受性（ＡＭ
Ｐ^ｓ）であり、そのプラスミド中に組換え体をもってい
た。３種類は約４．２キロの塩基ペアの類似組換え体を
もっていた。 【００３６】実施例６ 形質転換細胞中のプラスミノーゲンアクチベーター蛋白
質生産の検出、分離および特性表示 組換えＤＮＡを含有するアンピシリン感受性、テトラサ
イクリン耐性イーコリィ形質転換体をえらんで免疫学的
検知方法を使用してウロキナーゼ様物質の可能な発現を
スクリーニングした。プラスチックミクロタイタープレ
ートを使用する固相放射性免疫試験（ＲＩＡ）をヒッツ
エマンらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，１９７９
年）に従い、ただしやや変形して行った。シアノーゲン
プロマイドにより活性化したペーパーを使用する直接Ｒ
ＩＡ法において、ウロキナーゼもしくはウロキナーゼ様
物質をシアノーゲンブロマイドにより活性化したペーパ
ーと直接反応させ、次いで^１２５Ｉで標識した抗ウロキ
ナーゼ抗体の結合によって検出した。 【００３７】細胞溶解物はスィーバーグらの方法（Ｎａ
ｔｕｒｅ，２７６，第７９５頁，１９７８年）により調
製した。イーコリィ形質転換体の５００ｍｌを一夜生育
し、１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離することによ
り細胞を集めた。細胞を１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．
０）および１ｍＭのＥＤＴＡで洗い、同じ緩衝液５．０
ｍｌ中に再び懸濁させた。リゾチーム（５ｍｇ／ｍｌ）
の０．５ｍｌを添加した後、混合物を氷上に３０分間保
った。ＭｇＣ１_２を加えて最終濃度１０ｍＭ〔それぞれ
０．１ｍｌのＤＮアーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＲＮアーゼ
（５ｍｇ／ｍｌ）およびＮＰ−４０（５％）〕にした。
培養を４℃で１時間進行させ、混合物を遠心分離（１
０，０００ｘｇ，２０分，０℃）により清澄にした。上
澄み液を使用してウロキナーゼ様物質のスクリーニング
を行った。 【００３８】ａ． 溶解物の分別物をシアノーゲンブロ
マイドペーパー（直接ＲＩＡ法）上に滴下してヒッツエ
マンらの方法（上記参照）により前述の如く^１２５ Ｉ
−ウロキナーゼと反応させた。既知量のウロキナーゼも
陽性のコントロールとして滴下した。組換えＤＮＡ，ｐ
ＡＢＢ２６を内蔵している一種の形質転換体は強い陽性
反応を示した。 ｂ． 溶解物の分別物を緩衝液（０．１Ｍのカリウムホ
スフェート，ｐＨ７．０および０．１ＭのＮａＣｌ）で
１０倍にうすめ、１×５ｍｌのベンツアミジン親和カラ
ム（ホルムバークら、ＢＢＡ４４５，第２１５頁、１９
７６年）上に充填した。このカラムをＡ_２８０の読みが
バックグラウンドに達するまで緩衝液で十分に洗った。
このカラムを溶出緩衝液（０．１Ｍの酢酸ナトリウム、
ｐＨ４．０および０．４ＭのＮａＣｌ）で溶出してフラ
クションを集めた。それぞれのフラクションからの分別
物を固相ＲＩＡで分析した。 【００３９】形質転換体Ｘ１７７６（ｐＡＢＢ２６）か
らの細胞溶解物がベンツアミジン親和カラム中を通過す
るとき、溶解物からの若干のＡ_２８０物質がカラム中に
保持され、低いｐＨおよび高度の塩によってのみ溶出さ
れた。これらの保持物質はウロキナーゼの固相ＲＩＡに
おいて陽性反応を示したが、形質転換体Ｘ１７７６（ｐ
ＢＲ３２２）からのコントロール溶解物は陰性であった
（図１）。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およ
びそれにつづくシアノーゲンブロマイド活性化ペーパー
上へのフィルター親和性移動（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５４，第１２２４０頁，１９７９年）により、生
成物をその分子の大きさについて更に特徴づけた。
^１２５Ｉ−標識のウロキナーゼ−特異抗体はおおよその
分子量３２，０００、５２，０００、８７，０００、１
２４，０００および１５４，０００の５種の別々の大き
さのプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質を示した。 【００４０】プラスミノーゲンアクチベーターの活性
は、アンケレスらの方法（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３
７，第８５−１１１頁，１９７３年）から変形した敏感
な^１２５Ｉフィブリノリシス分析を使用して測定した。
硬質ミクロタイタープレートを^１２５Ｉフィブリノーゲ
ン（２ｕｇ，１０^５ｃｐｍ／ｗｅｌｌ）で被覆し、この
フィブリノーゲンをプラスミノーゲンのないトロンビン
（０．１単位／ｗｅｌｌ）を使用してフィブリンクロッ
トに転化した。０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．
１、０．０２５％のヒト血清のアルブミン、およびリジ
ンセファロース上の親和クロマトグラフによって調製し
た２．５ｕｇ／ｍｌのプラスミンのないプラスミノーゲ
ンを含む全容量７０ｕｌ中で分析を行った。分析の範囲
は０．０５プロウグ（Ｐｌｏｇ）単位／ｍｌから１０単
位／ｍｌであったが、０．００２単位まで検出すること
はできた。イーコリィの粗溶解物はこの分析で阻害され
ているので、形質転換体調製物はイオン交換クロマトグ
ラフまたはベンツアミジン−セファロース上の親和クロ
マトグラフによって、分析前に部分的に精製した（表１
参照）。 【００４１】形質転換細胞Ｘ１７７６（ｐＡＢＢ２６）
のウロキナーゼ親和カラム溶出物をこの分析を使用して
試験したとき、かなりの線維素溶解活性が検出されたが
ｐＢＲ３２２により形質転換したＸ１７７６からの試料
はこのような活性を示さなかった。更に、ヒトのウロキ
ナーゼに特有な抗血清による免疫沈澱はこの活性を溶液
から除くことができた。これは形質転換細胞Ｘ１７７６
（ｐＡＢＢ２６）からのプラスミノーゲンアクチベータ
ー活性とヒトのウロキナーゼとの間の免疫化学的関連の
確認を与えるものである（表１参照）。 【００４２】 【表１】 【００４３】（ａ）プラスミノーゲンアクチベーターの
活性は実施例１に記載のとおりにして測定した。 （ｂ）ＰＢＳの指示でウサギ抗血清の１：１０希釈液１
０ｕｌを氷上で３０分間試料溶液（２５ｕｌ）に加え
た。ケスラーの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．，１
１，５，第１６１７頁，１９７５年）に従い、ダルター
ルアルデヒドで固定したエスアウレウスの１０％（Ｖ／
Ｖ）懸濁液２５ｕｌを使用して、免疫錯体を溶液から清
澄化した。えられた上澄液の３５ｕｌを分析した。 （ｃ）ＮＲＳ………ふつうのウサギの血清 【００４４】このようにして得られたプラスミノーゲン
アクチベーター蛋白質生成物は、組換えＤＮＡ技術によ
りその大量取得が比較的容易であることから、容易に高
純度のものとすることができる。したがって、ヒトに投
与する医薬として長期間投与したりあるいは大量に投与
した場合でも問題がより少ないという利点を指摘しう
る。 【００４５】さらにまた天然由来のウロキナーゼは糖鎖
を有しているが、この点でも本発明の生成物が同様な活
性を有していることは驚くべきことである。このように
して得られたプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質生
成物は、従来公知の方法でより生成することができる。
上記プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質生成物はそ
れを混合状態のままでも、あるいはより分離精製され
て、それぞれ単独であるいは混合されて用いることがで
きる。 【００４６】実施例７ 非経口投与用医薬製剤 実施例１から得られたプラスミノーゲンアクチベーター
蛋白質生成物を含有する溶液を透析後凍結乾燥する。こ
のものの６０，０００単位ウロキナーゼ活性を有するも
のを２５ｍｇマニトール及び４５ｍｇの塩化ナトリウム
と共に注射用無菌水で再構成する。 【００４７】本発明の上記プラスミノーゲンアクチベー
ター蛋白質生成物は血栓症の生体モデルで有効であるこ
とが検証しうる。本発明の血栓溶解剤は抗原性あるいは
副作用の点からも問題が少ない。本発明の上記プラスミ
ノーゲンアクチベーター蛋白質生成物はマウス及びラッ
トに対する急性毒性試験において通常用量で何ら異常を
認めることがない。 【００４８】実施例８ イーコリ菌株Ｘ１７７６（ｐＡＢＢ２６）の生育 イーコリ形質転換体Ｘ１７７６（ｐＡＢＢ２６）の細菌
を、１２．５ｗｇ／ｍｌのテトラサイクリン塩酸塩を含
むＬ−液（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，１９７２年）中で生育した。更に、０．５％
カザミノ酸、０．５％グルコース、０．５ｕｇのＤ−ビ
オチン、１００ｕｇのＬ−ジアミノピメリン酸、４０ｕ
ｇのナルジキン酸および１２．５ｕｇのテトラサイクリ
ン塩酸塩（すべてｍｌ当たり）を含むＭ９媒質（Ｊ．
Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９
７２年）も生育および上記菌株からのプラスミノーゲン
アクチベーターの製造のために使用した。振とうしなが
ら細胞を３７゜で生育し、十分な生育達成後に、プラス
ミノーゲンアクチベーター生産を検出する目的で回収し
た。

【図面の簡単な説明】【図１】 図１はウロキナーゼに関連したプラスミノーゲ
ンアクチベーター蛋白質をコードするプラスミド含有Ｄ
ＮＡの制限酵素地図を図式的に説明するものであり、円
内の数値はそこに示す部位の間の塩基ペアの数を示し、
円外の記号はそれぞれの部位においてＤＮＡを切断する
特定の制限酵素を示し、Ｐｓｔなる記号で示す太い円周
部分はプラスミノーゲンアクチベータをコードするＤＮ
Ａ部分の組入れられる場所である 。【図２】 図２は形質転換体からのウロキナーゼ様物質の
アフィニティークロマトグラフィーから得られたデータ
を示すグラフであり、横軸はフラククション数を示し、
縦軸は毎分のカウント数を示す。実線のグラフは形質転
換体細胞からの溶解物のデータを示し、破線のグラフは
コントロールからの溶解物のデータを示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 マイケル チエングーイエン チエン アメリカ合衆国ニューヨーク州 14870 ペインテッド ポスト クノール ブ ロック ウエスト 12 (72)発明者 シャウーガング リー アメリカ合衆国イリノイ州 60048 リ バテイビル ウエクフォード コート 907 (72)発明者 ベリー ジョセフ ラズキン アメリカ合衆国テキサス州 77096 ハ ウストン クラリッジ 5711 (72)発明者 ウイリィ ユーゲン スコレンク 西ドイツ デイー8120 ウエイルヘイム キエファンストラーセ ４ (56)参考文献 特開 昭55−37129（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−26878（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−113488（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/64 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．ヒト由来のプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質
   をコードする下記の制限酵素地図で表されるポリデオキ
   シリボヌクレオチドセグメントを挿入したプラスミドベ
   クターにより形質転換された大腸菌中で産生されたこと
   を特徴とする線維素溶解活性を示し且つヒトウロキナー
   ゼに対する抗体によって認識されるプラスミノーゲンア
   クチベーター蛋白質。 【化１】