KR100439736B1 - 친화선택방법을 통해 ｍＲＮＡ 라이브러리로부터 새로운표적 ｍＲＮＡ를 탐색하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새롭게 알려진 인간 게놈 유전자를 적극적으로 활용하여 좀 더 빠르고 간편하게 새로운 목표 mRNA를 동정하는 동시에, 이 목표물을 제어할 수 있는 화합물을 알아내는 새로운 방법을 제공하고자, mRNA와 mRNA에 접합할 수 있는 가능성을 가진 여러 화합물과의 친화선택과정에 의해서 선택하고, 선택된 mRNA 중에서 어느 것이 병인 특이적 mRNA 인가를 확인한 후, 병의 원인이 되는 생리학적 현상을 관찰하게 된다. 따라서 본 발명은 병인 특이적 mRNA와 그것에 접합하여 그 기능을 제어할 수 있는 화합물을 동시에 발굴하는 방법에 관한 것이다.

Description

친화선택방법을 통해 ｍＲＮＡ 라이브러리로부터 새로운 표적 ｍＲＮＡ를 탐색하는 방법{METHOD OF SELECTING NEW TARGET mRNA FROM mRNA LIBRARIES BY USING AFFINITY SELECTION}

인간 게놈 사업으로 인간의 모든 유전자가 밝혀지고 있으며, 인간 게놈 사업이 종료되면 이와 같은 유전자 사업은 인체에 해로운 모든 병원균에 대한 유전자 밝힘으로 진행될 것이다. 이와 같은 수 많은 유전자가 코딩 할 수 있는 단백질로부터 새로운 목표 단백질 또는 목표 RNA 등에 대한 정보를 알 수 있게 된다.

일반적으로 기존의 치료제라 함은 생체 내에서 만들어진 단백질에 적합하여 그 기능을 제어하여 효능을 나타내는 것으로 인식되어 있다. 실제로 지금까지 쓰이는 약 80%의 치료제가 생체 내의 단백질 중에 효소나 수용체에 특이적 접합을 하여 단백질의 기능을 저해하는 분자량 1000 이하의 소분자이다. 그러나 단백질이 정작 좋은 치료제의 목표물로 판정 받기 위해서는 단백질의 치료제적 효과가 있는 현상을 규명하여야 한다. 또한 규명된 효과를 입증하기 위하여 단백질을 대량으로 발현하고 이를 정제한 후에, 이와 같은 단백질이 알려진 여러 가지 생리학적 현상을 제어 할 수 있는지를 규명해야만 한다. 또한 이와 같은 단백질을 대량으로 만들어 여러 가지 후보 화합물과의 접합 연구를 통하여 이 단백질을 제어할 수 있는 후보 화합물 군을 도출해내야 한다.

따라서, 비록 어떤 단백질이 목표 단백질의 후보가 되었다고 해도 이들 단백질의 약효를 입증하기 위해서는 위에서 나열한 노동과 돈이 많이 드는 단백질의 분리와 정제가 선행되어야만 한다. 더구나 거의 모든 단백질들이 번역후 변형(post-translational modification)을 통하여 활성화된 형태를 가지기 때문에, 활성화된 단백질을 가지고 실험을 수행하는 것이 무엇보다도 중요하다. 그러므로, 이들 단백질을 제어할 수 있는 수단을 찾기 위해서는 언제나 단백질을 활성화된 상태로 발현시켜야 하지만, 번역후 변형을 통한 활성화 된 단백질은 오직 특정한 세포에서 특정한 조건에서 만들어질 수 있으므로 이와 같은 조건을 잡기가 무척 까다롭다. 더구나 고성능검색장치 (High Throughput Screening) 등에서 쓸 수 있는 많은 양의 단백질들이 이와 같은 활성화 된 단백질을 필요로 하기 때문에, HTS 검색을 위한 다량의 단백질 발현은 그리 만만한 일이 아니다.

RNA나 DNA를 목표로 하고 있는 의약품은 단백질을 목표로 하고 있는 신약보다는 빈도가 적지만 전체 치료제의 약 5% 정도가 이 부분에 해당한다. DNA를 목표물로 하고 있는 치료제는 세포독성을 가지는 항암제로서, 특이성이 결여된 것이 대부분이다. 그러나, RNA를 목표로 하고 있는 신약들은 RNA의 특정 염기서열을 인식할 수 있는 특이적인 치료제를 염두에 둔 예가 많이 있다. 이와 같은 특이적 치료제로는 인체 내의 특정한 mRNA의 염기서열과 짝을 이루어 mRNA와 접합하는 안티센스(antisense) 치료제가 있다. 대장균의 rRNA를 목표로 한 아미노글리코시드 등도RNA의 염기서열 특이적인 약으로 알려져 있다. 특히 이들 아미노글리코시드의 치료제의 기전을 이해하기 위하여, 최근 많은 구조 생물학적인 연구가 진행되었는데, 이들의 기전은 우선 rRNA가 3차원적인 구조를 형성한 후에 3차원적으로 형성된 주머니에 아미노글리코시드가 접합하여, 일부의 막 형성 단백질 등의 단백질 합성을 방해하게 된다. 세포막을 형성하는 일부 단백질의 합성 저하로 인하여 세포막이 약하게 되며, 이로 인하여 더욱 많은 치료제가 세포 안으로 들어와 세포가 괴멸되게 된다.

이처럼 rRNA등 염기서열 특이적인 형태를 갖추고 있는 생체 분자들은 위의 괴멸 기작에서 설명한 것처럼 좋은 치료제의 목표물이 될 수 있다. 즉, 좀 더 폭을 넓혀서 모든 RNA 분자를 본다면 단백질을 코딩하는 mRNA의 염기서열은 모두 다르기 때문에, 특이적으로 공략할 수 있는 새로운 목표물임을 쉽게 감지할 수 있다. 최근 특정한 핵산들이 단백질 못지 않은 중요한 목표 분자가 될 수 있다는 것이 여러 연구에 의하여 밝혀지고 있다. 그 예로서 많은 DNA 결합 단백질들의 기능을 차단하기 위하여 DNA와의 접합을 차단하는 치료제를 개발하려 하고 있다. 또한 많은 RNA 결합 단백질 등도 매우 중요한 치료 효과를 지닐 수 있는 가능성이 증명되고 있다. 특히, mRNA가 스스로 독특한 3차원적 배열을 한 후에 이것이 여러 가지 단백질들과 선별적 결합을 하여 선별적으로 번역을 저해하는 효과가 밝혀지고 있다. 최근의 연구결과는 또한 mRNA가 만드는 3차원적 배열이 여러 가지가 있을 수 있으며, 이중 특이적인 배열이 이루어졌을 경우 단백질과 접합하여 신호전달을 할 수 있는 사실 등이 밝혀지고 있으므로, 특이적인 mRNA의 구조를 공략하는 것이 새로운 치료제의가능성으로 등장하고 있다.

RNA 분자의 경우에는 단백질과 달리 활성화 된 형태가 활성화되지 않은 상태에 비하여 매우 그 변화가 적다. 따라서 활성화 된 목표 RNA를 쉽고 간편하면서도 대량으로 만들 수 있는 장점을 가지고 있다. 따라서, 이와 같은 대량 생산이 어려운 단백질에 비하여 그 실험 재료를 쉽게 구할 수 있으며, 고성능검색장치를 통하여 결합력이 강한 소분자 물질을 찾아내는 것이 매우 용이할 것으로 보인다.

문제는 우리 몸 속에 존재하는 모든 mRNA 분자들 중에, 독특한 형태를 가지고 있어서 치료제의 목표가 될 수 있는 RNA를 골라내는 일이다. 병인 세포와 보통세포의 cDNA 양상의 연구를 통하여 많은 목표 RNA를 동정 할 수 있다. 하지만 이와 같은 방법으로 동정된 비교적 많은 종류의 mRNA 염기서열 중 어느 것이 가장 그럴듯한 목표 RNA 인가를 빨리 확인하는 연구의 형태가 필요하다.

이미 선행 연구에 의하여, HIV RNA 중에 단백질에 결합하는 독특한 형태의 RNA가 HIV의 목표 RNA로 정립되어 있으며, 대장균의 rRNA의 경우에도 특이적인 결합 부위와 이 부위에 특이적으로 결합하는 아미노글리코시드가 알려져 있다. 그러나, 많은 목표물이 존재하고 있는 현 시점에서 선행 연구에 의하여 도출된 목표 RNA 분자만을 공략하는 것은 지나치게 수동적인 연구 자세이며, 이와 같은 낡은 전략으로 신약 개발을 할 수 없을 것으로 보인다. 그러나 병인이 되는 RNA 염기서열을 쉽게 찾아내는 방법이 결여되어 있다. 더구나 여러 가지 생물학적 방법으로 병인이 되는 특이적 mRNA 염기서열을 알아냈다 하더라도, 이것에 대한 저해제를 찾기 위해서는 다음 과정으로 소분자 라이브러리와의 인식을 통하여 강한 접합을 할 수있는 소분자를 고성능 검색장치를 통하여 선택해 내야한다.

본 발명에서는 병인이 되는 세포의 모든 mRNA 염기서열 중에 병인 특이적 mRNA와 이를 제어할 수 있는 소분자를 동시에 검색하는 새로운 방법에 관한 것으로서, 인간 유전자 사업 또는 병원체의 유전자 사업의 결과로 얻어진 많은 유전자중에 병인이 되는 mRNA를 조기에 발견하고 이것에 특이적으로 접합하는 분자를 동정하는 새로운 신약 개발을 촉진하는데 큰 기여를 할 수 있는 방법이다. 또한, 표적이 알려진 기존의 약물의 다른 표적 RNA을 찾아냄으로써 기존의 알려진 약물의 다른 약리학적 용도를 발견하는데도 유용하다.

본 발명은 병인이 되는 세포의 모든 mRNA 염기서열 중에 병인 특이적 mRNA와 이에 접합가능한 분자를 동시에 검색하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 (1) 친화선택방법(SELEX)을 이용하여, RNA 라이브러리중에서 목적 화합물과 특이적 친화성을 갖는 mRNA를 선택하고,(2) 정상세포 cDNA, 또는 정상세포 cDNA가 고정된 DNA 칩상에 상기 선택된 mRNA를 혼성화하여 병인세포 특이적 mRNA를 확인하는 것을 포함하는, 목적 화합물에 특이적인 표적 mRNA를 찾는 방법에 관한 것이다. 추가로 본 3발명의 방법은 병인 특이적 mRNA와 목적 화합물과의 특이적 접합력을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 표면 플라즈몬 공명법, 형광 이방성법, 및 방사선 표적자를 이용하는 방법중에서 선택된 방법에 의해서 행해질 수 있다.

상기 RNA 라이브러리가 게놈 RNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 제조된 RNA 라이브러리일 수 있다.

본 발명의 일례에서, 각 탐색단계는 구체적으로 다음과 같을 수 있다.

병인세포 및 병원균의 게놈 RNA 또는 mRNA 라이브러리의 구성

병인세포에서는 독특한 유전자가 있어서 그것을 mRNA와 단백질로 발현하여, 이것들이 병인을 제공해 주기도 한다. 그러나, 이와는 달리, 유전인자는 보통세포와 같지만, 여러 가지 전사체가 존재하고 이와 같은 전사체 중에 일부가 병인으로 작용하거나, 일부 전사체가 상대적으로 많은 양이 발현되어 병을 유발하는 것이 관측되었다. 따라서 이와 같은 병인세포가 되는 mRNA를 찾기 위하여, mRNA 전체를 병인세포로부터 분리해내고 이것을 cDNA 라이브러리로 변형시킨 후에 PCR을 통하여 많은 양의 cDNA 라이브러리를 얻는다. 이것으로부터 무작위한 부분과 T7 프로모터가 있는 개시제를 사용하여 클로닝하고 이를 이용하여 적당한 크기의 cDNA 라이브러리를 제조하고 시험관 효소반응에 의하여 mRNA 라이브러리를 제조한다. 대장균과 같은 원핵세포의 게놈 DNA를 병인세포로부터 추출하여 이것으로 mRNA 라이브러리를 제조할 수 있지만 진핵세포에서는 많은 양의 인트론때문에 mRNA를 cDNA에서 제조하여야 한다.

화합물의 선택과 화합물의 고정화 반응

RNA에 잘 접합하는 종류의 화합물이 알려져 있다. 이들은 주로 RNA의 포스페이트 골격구조와 정전기적 상호작용에 의한 인식을 하는 아미노글리코시드 등이다. 이와 같은 종류는 여러 가지가 있다. 그러나 아미노글리코시드의 특이성이 부족할경우를 대비하여 모핵에 아미노산을 한 두 개씩 접합한 화합물들을 쉽게 양산했으며, 이와 같이 변조된 화합물은 모핵만을 가진 아미노글리코시드에 비하여 특정한 RNA를 인식할 수 있는 가능성이 매우 높아졌다. 이와 같은 화합물들은 주로 아미노기가 많이 존재하고 있어서 이들을 고체 표면에 연결하는 화학은 쉽게 이룰 수 있었다.

그러나 최근에 나타난 연구 결과에 의하면, RNA에 잘 접합하는 분자는 이처럼 친수성 물질도 있지만, 염기쌍을 형성하는 친지질성 부분에 접합할 수 있는 친 지질성 분자들도 많이 소개되어 있으므로 광범위한 화합물을 특정 mRNA 분자를 선택하는 소분자로 사용하였다.

친화선택과정(SELEX)의 자동화와 mRNA의 선택

기존에 존재하고 있는 많은 화합물, 또한 본 발명을 위하여 새롭게 제조한 신약 후보 물질, 많은 천연물 등, 목표 mRNA를 선택하기 위한 화합물은 매우 많이 있다. 특정한 화합물(후보물질)에 잘 접합하는 RNA를 찾아내기 위하여 친화선택과정(SELEX)을 이용하였다. 이와 같이 다양한 후보물질과 mRNA 라이브러리의 친화선택과정을 친화크로마토그래피에 의하여 수행하는 것이 매우 어려우므로, 후보물질을 고정화시키고 이를 이용하여 자동화장치를 이용하는 모든 친화 선택과정을 진행하였다. 친화선택과정은 후보물질을 고정화시키고 이에 RNA 라이브러리를 접합시켜 결합력이 강한 것들을 골라내는 방법이다. 후보물질을 고정화시키는 방법으로는 아가로스 비드나 아크릴 비드에 특정한 작용기가 붙어있어 활성화된 것에 반응시켜 화학적으로 결합시키는 방법 및 웰 플레이트를 사용하는 방법을 모두 사용할 수 있다. 아가로스 비드나 아크릴 비드를 사용하는 방법은 비드의 종류와 반응할 수 있는 작용기가 비교적 한정되어 있고 후보물질에 작용기가 있어야 하는 단점이 있는다. 한편, 웰 플레이트를 사용하는 방법에 있어서 96웰 플레이트를 사용하는 경우, 플라스틱의 표면에 정전기적 인력이나 소수성 상호작용을 이용하여 후보물질을 고정화시킬 수 있고, 따라서 짧은 시간에 다양한 분자에 대해 결과를 도출할 수 있다. 그러므로, 좀 더 바람직하고 신속한 결과를 도출하기 위하여 96웰 플레이트를 사용하는 방법을 적용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 보다 바람직한 방법으로 고성능검색에 적합한 96웰 플레이트를 사용하는 방법을 선택하였다. 친화선택과정을 수행하기 위한 RT-PCR 반응이나 전사반응도 96-웰 포멧을 사용하여 모든 과정을 자동화 할 수 있도록 하였다. 친화선택방법(SELEX)은 'Libraries for genomic SELEX' Singer, B. S., Shtatland, T., Brown, D., Gold, L. Nucleoic Acids Res. (1997) 25, pp781-786등에 자세히 기재되어 있다.

보통세포와의 비교에 의한 병인 mRNA의 발견

발견된 RNA의 병인 특이성을 알아보기 위해서 정상적인 cDNA가 고정되어 있는 cDNA 미세기판에 혼성화 실험을 수행하였다. 이와 같은 혼성화 실험에서 음성인 한 RNA 만을 골라 PCR하여, 선택된 RNA가 병인세포 특이적 RNA임을 확인하였다. 또한 이제까지 알려진 많은 정보를 통하여 여러 가지 가능성 중에 병인 특이적 mRNA를 선택해 낼 수 있다.

선별된 RNA의 클로닝과 염기서열의 확인 및 접합 상수의 측정

선택된 RNA 클로닝하여 pUC 백터에 삽입했으며, 이것들을 DNA 서열분석기에의하여 그 염기 서열을 확인했다. 같은 염기서열이 발견되는 것은 친화선택과정에서 좋은 친화도를 가진 RNA가 선택되었다는 증거이다. 이와 같은 RNA는 다시 대량으로 만들어 표면 플라즈몬 공명 또는 형광 이방성법(Anisotropy), 방사선 표적자 등의 방법을 이용하여 그 접합 상수를 측정할 수 있다.

본 발명의 구체적 일례에서, 네오마이신에 특이적 접합하는 RNA를 헬리코박터 피롤리의 게놈RNA로부터 선택함으로서, 선택된 RNA가 목표 RNA가 될 수 있음을 알 수 있다. 즉, 이제 까지 알려지지 않았던 새로운 목표 RNA를 얻음으로서 이제 새롭게 변조된 화합물을 가지고 고성능검색법에 의하여 기존에 알려지지 않은 새로운 mRNA에 잘 결합하는 화합물을 쉽게 찾을 수 있는 목표물이 도입되었다.

본 발명은 새로운 RNA 서열을 밝혀냄으로서 새로운 각도에서 병인세포를 선택적으로 제거할 수 있는데 그 목표를 두고 있으며 이를 위하여, 네오마이신에 의하여 헬리코박터. 피롤리가 괴멸될 수 있는 지를 조사할 것이다.

이와 같은 연구 방법은 약물로부터 출발하여, 이 약물에 특이적으로 결합할 수 있는 mRNA를 찾아내어 그 mRNA를 약의 목표로 하는 역 신약 개발 방법이다. 이와 같은 방법의 장점으로 이미 알려진 목표물 이외에 새로운 목표 mRNA를 찾을 가능성이 매우 높으며, 새로운 목표 mRNA에 대한 리간드가 이미 돌출되어 있으므로 신약 개발이 정상적인 방법에 비하여 매우 빠르고 신속하게 진행될 수 있는 장점을 가지고 있다.

이와 같은 역 신약 개발법은 목표 단백질을 대상으로 상당히 많은 연구가 진행되고 있지만, 목표 mRNA를 가지고 하는 연구는 본 연구가 거의 초유의 결과이며이를 본 발명에서 발표하고자 한다. 본 연구에서는 네오마이신 이라는 기존의 항생제를 사용하였지만, 이와 같은 화합물의 종류는 약효를 가질 수 있는 모든 화합물로 바꿀 수 있다. 또한 게놈 라이브러리에서 얻은 mRNA 라이브러리도 본 연구에서는 헬리코박터. 피롤리에 국한해서 실험을 진행했지만, 이와 같은 라이브러리도 같은 방법으로 어떤 병원체의 게놈 라이브러리로도 이 일을 진행할 수 있다.

다음의 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본발명의 보호범위가 그 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

일반적인 실험조건

본 발명에서 사용된 물은 모두 0.1%의 디에틸피로카보네이트(DEPC)가 첨가된 것을 이용했다. DEPC가 0.1% 되게 3차 증류수에 첨가하고, 자석막대로 교반한 후, 멸균해서 사용했다. 실험에 사용되는 팁이나 튜브 등 모든 기구는 멸균하고 180℃에서 하루 건조시켜 사용했다. DEPC는 (Cat# D-5758)는 SIGMA에서 구입했다. 실험에 사용한 헬리코박터 피롤리(Helicobactor pyroli) 균은 배양한 후에 실시예 2에 기재된 방법에 의하여 RNA 라이브러리를 만들었다(Libraries for genomic SELEX: Singer, B. S., Shtatland, T., Brown, D., Gold, L. Nucleoic Acids Res. (1997) 25, 781-786.)

실시예 1

헬리코박터 피롤리 균의 게놈 DNA 추출

약 10⁸정도의 H. 피롤리균을 TEN 완충용액(10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA, 0.1M NaCl) 1ml에 현탁시킨 후 3000rpm으로 5분 원심분리하여 세포를 얻었다. 이를 10% 수크로스 용액 10ml에 현탁시키고 0.5M EDTA pH 8.0 1ml, 라이소자임 10 mg/ml 1ml, RNase A 2mg/ml 0.5ml를 첨가한 후 실온에서 10분간 방치하였다. 이 혼합액에 2M Tris 0.5ml, 10% SDS 1ml을 첨가하고 잘 섞어주고 2.5ml의 3M CH₃COOK/CH₃COOH 용액을 넣어준다. 이를 50ml 원심분리 튜브에 옮긴 후, 4℃에서 15분간 11000rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 페놀:클로로포름 용액 10ml로 3번 씻어내고 7.5ml의 이소프로파놀을 첨가하여 실온에서 15분간 방치한다. 이 용액을 1.5ml 튜브에 나누어 담고 4℃에서 30분간 14000rpm으로 원심분리하여 DNA 침전을 얻었다. 이를 70% 에탄올로 2번 씻어 주었다. 얻어진 게놈 DNA의 양은 140㎍이었다.

실시예 2

헬리코박터 피롤리 균의 RNA 라이브러리 제조

120㎍의 헬리코박터. 피롤리의 게놈 DNA에 B_ran프라이머 (3'-NNNNNNNNNGTCTGCTGCTCGCCCT-5') 농도가 12 μM되게 첨가하고 93℃에서 3분방치 후 얼음에 급랭시킨다. 이에 Klenow 2.5 유니트과 dNTP 최종농도 300 μM되게 첨가하고 얼음에서 5분, 25℃에서 25분, 50℃에서 5분간 반응시켰다. 페놀 용액으로 추출하고 에탄올로 침전하여 DNA를 얻는다. 프라이머를 제거하기 위해 위 용액을 마이크로스핀 S-400 HR 칼럼 (Pharmacia)에 통과시켰다. 이 DNA에 A_ran프라이머(5'-AGGGAGGACGATGCGGNNNNNNNNN-3')를 이용해 위에서 기술한 방법으로 클레노우 반응(Klenow reaction)을 다시 실시하였다. 최종적으로 얻은 DNA에 염료를 첨가하여 잘 섞은 후 65℃에서 5분간 가열하고 얼음에 꽂아서 급랭시켰다. 7 M UREA가 포함된 6% 변성 PAGE 겔(10*8cm)에 걸어 30 mA로 30분간 준비시키고 겔을 장파장 UV로 쬐면서 적당한 크기의 밴드만 정확하게 잘라서 용출 완충액 (0.5 M 암모늄 아세테이트, 1 mM EDTA (ph 8.0), 0.2% SDS)이 든 튜브로 옮겼다. 하룻밤 방치한 후 겔조각을 제거하고 페놀 용액으로 추출하고 에탄올 침전에 의해 DNA를 얻는다. 이 DNA를 증폭할 때는 T7 프로모터를 가진 A 프라이머 (5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3')와 B 프라이머(3'-GTCTGCTGCTCGCCCT-5')를 이용해 PCR로 증폭하였다.

실시예 3

목표분자의 고체상의 부착

N-옥시숙신이미드 표면 아민 결합 96-웰 플레이트에 네오마이신 설페이트(Sigma)를 N-[2-히드록시에틸]-피페라진-N'-2-에탄술폰산] (HEPES; 100 mM, pH 8.0) 완충액으로 녹여 200 ㎕를 넣고 1시간 25℃에서 반응시킨 후 최종농도가 1.0 M이 되게끔 에탄올아민을 첨가하고 1시간 더 같은 조건에서 반응시켰다. 0.2 ml의 HEPES 완충액으로 웰을 10번 씻고 0.2mL의 동일 용액으로 평형시켜 4℃에서 보관했다. 네오마이신 설페이트는 UV로 농도를 측정할 수가 없어, 닌히드린 테스트(ninhydrin test)로 96-웰 플레이트에 결합되어 있는 지를 확인했다 (E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, & P. I. Cook (1970) Color TestDetection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-Phase Synthesis of Peptides:Anal. Biochem. 34, 595-598). 자유 아미노기가 노출되어 있으면 닌히드린 시약과 반응하여 청색으로 변하며, 존재하는 아미노기의 양이 많을수록 청색이 진해진다. 닌히드린 시약 I (10 ml 에탄올중 500 mg 닌히드린), II (20 ml 에탄올중 80 mg 페놀), III (100 ml의 피리딘중 2 ml의 0.001 M KCN)을 각각 50 ul씩 첨가했다. 100℃로 5분간 가열하면 플레이트와 용액의 색이 짙은 청록으로 변하는 것을 확인할 수 있었다. 음성 대조구로서 네오마이신 설페이트를 결합시키기 않은 웰 50 ul로 같이 반응시켰는데, 용액 색의 변화가 없었다.

실시예 4

SELEX 과정에 의한 RNA의 선택

선별에 사용되는 결합 완충용액의 조성은 SELEX를 이용한 여러 논문에 기술된 것들 중 3가지를 골라서, 이 중 게놈 RNA가 목표분자가 붙어있지 않은 96-웰에는 적게 붙고, 붙어있는 웰에는 많이 결합하도록 하는 것을 선택해 이용했다. 완충용액 1의 조성은 250 mM NaCl, 1 mM MgCl12, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 완충용액 2는 250 mM NaCl, 5 mM MgCl12, 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 완충용액 3은 1 M NaCl, 5 mM MgC12, 25 mM MgC12, 25 mM HEPES (pH 7.4)를 사용하였다. 실험결과 완충용액 1을 사용하였다.

RNA를 방사선 동위원소로 표지할 때의 조성은 다음과 같이 사용하였다. 최초 단일가닥 DNA 1 ㎍, 100 mM DTT 6 ㎕, AGC 혼합물 (2.5 mM ATP, GTP, CTP) 6 ㎕,100 uM UTP 1㎕, [α-³²P]UTP (25 uCi/㎕) 2 ㎕, 5 X 완충액 5 ㎕, T7 RNA 폴리머라제 50 유니트와 물을 섞어 전체 반응 양을 30 ㎕로 37℃에서 2시간 반응시키고 RQ1 RNase가 없는 DNase (1 u/㎕)를 1 ㎕ 첨가하여 10분간 더 반응시킨다. 동일한 양의 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 혼합물(25:24:1) (from Amersham LIFE SCIENCE, equilibrated to pH 8.0)를 첨가하여 강하게 잘 섞은 후 상온에서 14000 rpm으로 원심분리 시켜 위층만 잘 취해서 새로운 튜브로 옮겼다.

RNA 정제는 동일 부피의 RNA 염료를 첨가하여 잘 섞은 후 65℃에서 5분간 가열하고 얼음에 꽂아서 급랭시켰다. 7 M UREA가 포함된 6% 변성 PAGE 겔 (10*8cm)에 걸어 30 mA로 30분간 로딩시키고 겔을 강화필름에 올려놓고 UV를 비추면서100-mer 크기의 밴드만 정확하게 잘라서 용출 완충액 (0.5 M 암모늄 아세테이트, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0.2% SDS)이 든 튜브로 옮겼다. 이 때 크기 마커로는 콜드 NTP 믹스만 사용한 시험관 전사반응에서 얻었던 100-mer RNA를 이용했다.

RNA의 양은 β-계수기를 이용하여 측정하였다. 37℃에서 4시간 배양한 다음 발리 회전시켜 용액만 새 튜브로 옮겨 에탄올 농축했다. 이를 30 ul의 물로 녹이고 1 ul를 취해서 5 ml 신틸레이션 칵테일 (Ultima Gold^TM, PACKARD)이 든 바이얼 (super polyethylene 바이얼^TM, from PACKARD)로 옮겨서 β-계수기로 CPM을 측정했는데 정확성을 기하기 위해 3번을 반복해서 계수해서 평균값을 구했다. 이렇게 구한 CPM값에서 3*10⁴CPM만을 이용하고 나머지는 -20℃에서 보관했다. 3*4⁴CPM을300 ul의 결합 완충액으로 희석하여 65℃에서 5분간 변성시키고 상온까지 천천히 온도를 낮춘 후, 목표분자가 붙어있지 않은 비드가 든 에펜돌프 튜브와 목표분자가 붙어있는 비드가 든 에펜돌프 튜브 각각으로 옮겨 잘 섞으면서 20분간 반응시켰다. 그런 후에, 결합 완충용액 500 ul로 5번 씻어주고, 다시 500 ul의 결합 완충용액으로 비드를 현택시킨 후 각각을 5 ml의 신틸레이션 칵테일 (Ultima Gold^TM, PACKARD)를 함유한 바이얼 (super polyethylene 바이얼^TM, from PACKARD)로 옮겨 β-계수기를 이용해서 cpm값을 측정했다.

RNA정량은 PCR에서 얻어진 DNA 1 ug을 주형으로 해서 100 ul 부피의 시험관 전사 반응에 이용했다. DNA의 양은 260 nm에서 UV 흡광도를 조사함으로써 계산할 수 있는데, 260 nm에서의 UV 흡광도가 1인 경우, 이중사슬 DNA의 양은 50 ug/ml, 단일사슬 RNA는 40 ug/ml 농도로 존재하는 것으로 정했다. 또한 260 nm와 280 nm에서의 UV 흡광도를 조사하여 O.D₂₆₀: O.D₂₈₀의 비율이 1.8에서 2.0 사이이면 준비된 샘플의 순수도가 높았다.

전사반응의 반응액은 PCR DNA 1 ug, 5 X 완충액 20 ul, 100 mM DTT 10 ul, 2.5 mM NTP 믹스 20 ul, 그리고 T7 RNA 폴리머라제(PROMEGA Cat# P2075) 10 unit을 이용했다. 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 1 ul의 RQ1 RNase-없는 DNase (1 u/ul) (PROMEGA Cat# M610A)를 첨가하여 10분간 같은 조건에서 더 반응시키고 페놀 혼합액으로 추출해서 단백질을 제거한 후, -70℃에서 1시간 에탄올 농축시켰다. 7M의 UREA가 포함된 0.8% 변성 PAGE 겔에 로딩해서 100-mer의 정확한 크기의 밴드만 잘라서 용출 완충액(0.5 M 암모늄 아세테이트, 1mM EDTA (pH 8.0), 0.2% SDS) 400 ul가 든 에펜돌프 튜브에 넣고 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후, 용액만 새 에펜돌프 튜브로 옮겨서 페놀로 추출한 후, 샘플 층을 다시 새 튜브로 옮겨서 에탄올 농축했다. 이렇게 해서 얻은 RNA를 UV로 정량해서 선별에 이용했는데, 첫 번째 SELEX 주기에서는 100 ug을 이용했고 이후, 2∼4번째 주기에서는 20 ug, 그 후의 주기에서는 5 ug씩을 이용했다.

RNA의 선택은 RNA를 결합 완충액 200 ul로 묽혀서 65℃에서 5분간 가열하여 변성시켰다가 상온까지 서서히 온도를 내림으로써 분자내 염기쌍 형성으로 인한 3 차원적 구조를 이루게 한 후, 먼저 목표분자가 붙어있지 않은 비드가 들어있는 에펜돌프 튜브에 넣어 20분간 부드럽게 잘 섞어주면서 반응시켰다. 이렇게 하여 RNA가 목표분자가 아닌 웰 자체에 붙어 선별될 수 있는 가능성을 제거한 후, 상등액을 취해서 목표분자가 붙은 웰로 옮겼다. 30분간 교반한 후에 200 ul의 결합 완충액으로 6번 웰을 씻어서 목표분자에 약하게 붙은 RNA를 제거한 후, 결합 완충액으로 녹인 목표분자 (네오마이신 설페이트 20 mM) 용액 200 ul를 넣어서 30분간 잘 섞으면서 반응시켜 친화성을 이용해 용출했다. 이렇게 얻은 RNA 분자들을 -70℃에서 1시간 에탄올 농축시킨 후, 역전사에 사용함으로써 다음 SELEX 주기로 넘긴다.

역전사 반응은 에탄올 농축시켜 펠렛으로 존재하는 RNA를 55 ul의 물로 녹이고 3'-프라이머 (25 uM) 2 ul를 첨가하여 65℃에서 5분간 가열하고 얼음에서 급속 냉각시킨 후 16 ul의 5 X 완충액, 6 ul의 10 mM dNTP 믹스와 1 ul의 M-MLV 역전사 효소 (50 U/ul) (PROMEGA Cat# M170A)를 첨가하여 37℃에서 60분간 반응시킨 후,95℃에서 5분간 가열하고 얼음에서 급랭시켰다. 이렇게 얻은 cDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭시켜 다음 주기를 위한 이중사슬 DNA를 준비하였다.

실시예 5

선택된 RNA 분자의 클로닝

네오마이신에 의하여 10번 선택과정을 거친 PCR DNA 풀을 클로닝에 이용했고, 정확한 크기의 삽입체를 얻기 위해 페놀 추출법를 이용해서 PCR 산물을 정제했다. 각각을 1.5% 저비점 아가로스에서 전기 영동 시킨 후, 131-mer 크기의 밴드만 잘라서 각각의 겔 조각을 에펜돌프 튜브에 따로 옮기고, 겔 조각의 3배의 부피가 되도록 TE (pH 8.0) 완충액 (10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA)을 첨가하고 잘 섞은 후, 65℃에서 5분간 가열하고 다시 37℃로 옮겨 10분간 배양시켰다. 동일량의 페놀 혼합액을 첨가하고 완전히 잘 섞은 후 14000 rpm에서 8분간 원심분리 시켰다. 중간의 하얀 겔층을 경계로 아래층에는 페놀 혼합액이 있고, 상층액에는 샘플이 있게 되는데, 샘플이 있는 상층만 취해서 새 에펜돌프 튜브로 옮기고 1/10 부피의 3 M NaOAc, 2.5 부피의 100% 에탄올 (-20℃로 미리 냉각시킨 것)을 넣고 4℃, 14000 rpm에서 30분간 원심분리해서 펠렛을 건들지 않도록 조심해서 용액만을 제거했다. 70%의 에탄올로 5분간 같은 조건에서 원심분리해서 씻는다. 펠렛을 완전히 말린 후 20 ul의 물로 녹였다.

접합반응은 PCR로 증폭하여 얻은 DNA 산물에는 3' 말단에 여분의 아데노신이 하나 더 생기는 성질을 이용하여 클로닝을 간편하게 하기 위해 PROMEGA에서 구입한pGEM^R-T Easy Vector system (part# TM042)을 이용했다. T-벡터는 3' 말단에 여분의 티미딘을 하나 더 지니고 있는 직선형을 지니고 있으므로 PCR DNA (insert) 산물과의 접합에 있어서 제한효소로 PCR DNA나 벡터를 따로 자를 필요 없이 바로 이용할 수 있는 장점이 있을 뿐만 아니라, β-갈락토시다제 코딩 영역에 다중 클로닝 자리(CMS)와 T7, SP6 프로모터가 나열되어 있어 삽입체의 유무여부를 색선별법으로 쉽게 확인할 수도 있고, pUC/M13 정방향 프라이머 결합자리와 역방향 프라이머 결합자리가 있어 서열분석에 이용할 수 있게끔 되어 있다. pGEM^R-T Easy Vector 1 ul (50 ng/ul), T4 DNA 리가제 10 X 완충액 1 ul, PCR산물 6.5 ng, T4 DNA 리가제 1 ul (3 Weiss units/ul), 그리고 물을 첨가하여 ligation 부피가 10 ul가 되게 했다. 삽입체와 벡터간의 물비율이 3:1일 대 최적의 접합효율을 가지므로 약 3 kb 크기의 pGEM^R-T Easy Vector 50 ng에 비추어 131b 크기의 PCR산물을 6.5 ng 사용하게 되었다. 접합반응은 4℃에서 하루 반응시켰다.

LB (Luria-Bertani) 배지 1 L을 제조하고 pH가 7.5가 되게끔 NaOH로 맞춰준 후, 오토클레이브해서 이용했다. 아가판은 LB 배지 500 ml에 박토-아가 7.5g 넣고 오토클레이브한 후 약 50℃가지 식으면 최종농도가 50 ug/ml이 되게끔 암피실린을 첨가해서 잘 흔들어 섞고 페트리-디쉬에 기포가 생기지 않도록 잘 부어 굳게 한 후, 4℃에 보관하면 10일 가량 사용할 수 있다. LB 배지나 아가판 모두 곰팡이를 비롯한 여러 가지 다른 미생물에 의해서 오염되지 않도록 각별히 주의해서 사용해야 한다.

컴피턴트 세포(Competent cell) 준비는E.ColiDH5α 세포가 콜로니상태로 보관 중이던 LB 배지상에서 콜로니를 2-3개 취해서 LB 배지 2 ml에 접종한 후 하루 배양했다. 다음 날 배양액 중에서 1 ml을 취해서 100 ml LB 배지가 담긴 플라스크로 옮겨 600 nm에서의 UV 흡광도가 0.4가 될 때까지 37℃ 진탕배양기에서 배양한 후 (보통 3-4 시간 소요) 50 ml 튜브로 옮겨 얼음 상에서 10분간 두었다. 4℃, 4000 RPM으로 10분간 원심 분리시킨 다음 상층 액을 완전히 제거하고 미리 차게 해 둔 0.1 M 여과된 CaCl₂100 ml로 펠렛을 녹여 얼음에서 15분간 둔 후 다시 4℃, 4000 RPM으로 10분간 원심분리시킨 다음 상층 액을 버리고 5 ml의 CaCl₂로 펠렛을 녹인다. 얼음에 30분간 둔 후 미리 차게 해 두었던 에펜돌프 튜브에 200 ul씩 분주해서 -70℃에서 보관했다.

형질전환 및 색선별법은 3개의 아가판(w/Amp)를 37℃ 배양기에 넣어둔 후, -70℃에서 보관한 컴피턴트 세포 튜브를 하나 꺼내서 얼음 위에서 천천히 녹이고, 하루 반응시킨 접합 용액을 5 ul 취해서 컴피턴트 세포과 잘 섞음으로서 시작하였다. 얼음에 30분간 둔 후, 42℃에서 2분간 가열 쇼크를 주고 다시 얼음으로 옮겨 LB 배지 1 ml을 첨가하여 37℃ 진탕 배양기에서 40분간 방치했다. 이 시간동안 이소프로필티오-β-D-갈락토시드 (IPTG) 4 ul (200 mg/ml)와 x-갈 40 ul (20 mg/ml)을 미리 따뜻하게 해 두었던 아가판 (w/Amp)에 떨어뜨린 후, 100% 에탄올에 처리하여 프레임으로 가열하여 멸균한 유리막대로 잘 문질러서 플레이트 전반에 골고루 퍼지게 했다. 3 개의 아가판 밑면에 1 X, 3 X, 5 X라고 표기하고, 그에 비추어 농도를 다르게 하여 배양액을 도말 했다. 40분간의 형질전환 반응이 끝난 배양액에서 150 ul를 취해서 1 X라고 표기된 아가판에 떨어뜨리고, 나머지 배양액은 8000 RPM에서 1분간 원심분리시켜 300 ul만 남기고 상층액을 버린 후, 피펫으로 펠렛과 배지를 잘 섞어 120 ul는 3 X라고 표기된 플레이트에, 나머지 180 ul는 5 X라고 표기된 플레이트로 각각 옮겨서 멸균된 유리막대로 잘 문질러 도말했다. 배양액이 플레이트 전반에 걸쳐 완전히 퍼지도록 한 후, 37℃ 배양기에서 하루 배양하였다. 다음 날 보면 아가판상에 많은 집락이 생겨났을 것인데, 암피실린이 들어있는 아가판에서 집락들은 Amp^r유전자가 있는 pGEM^R-T Easy Vector를 지니고 있을 것이고, 이 중에서 벡터에 삽입체가 들어간 집락들은 β-갈락토시다제가 발현되지 못하여 x-gal이 분해되지 않아 푸른색을 나타내지 못하고 흰색을 띄게 된다. 그러므로 아가판상에 형성된 여러 콜로니들 중에서 흰색 콜로니만이 삽입체가 들어간 벡터가 DH5α세포에 형질전환되어 생긴 것이다. 3개의 아가판상에서 비교적 다른 콜로니들과 따로 떨어져서 자라는 흰색콜로니만을 멸균된 집게로 취해서 각각을 3 ml의 LB 배지가 들어있는 15 ml 튜브로 옮겨 37℃ 진탕 배양기에서 하루 배양했다. 다음 날, 배양액이 뿌옇게 자랐음을 확인하고 200 ul만 취해서 800 ml의 LB 배지 (40% 글리세롤이 포함된)가 든 에펜톨프 튜브로 옮겨 잘 흔들어 섞은 후, -70℃에 스톡세포로 보관했다. 나머지 2.8ml의 배양액은 플라스미드 미니-프레프에 이용하게 된다.

본 실험에서는 알칼라인 분해방법으로 플라스미드가 얻었다. (T. Maniatis, et al., 1982, molecular cloning) 이 방법을 위해 용액 I (50 mM 글루코스, 25 mMTris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0)), II (0.2 N NaOH, 1% SDS), III (5 M KOAc 60 ml, 빙초산 11.5 ml, H2O 28.5 ml)를 준비하여야 하며, 특히 용액 II의 경우 미니-프레프할 때마다 가능한 한 새로 만들어 사용하는 것이 좋다.

흰색 콜로니만 골라서 LB 배지로 3 ml 배양하고 이 중 0.2 ml은 스톡세포로 보관하고, 나머지 2.8 ml을 이용해서 플라스미드를 얻었다. 먼저 2개의 에펜돌프 튜브로 1.4 ml씩의 배양액을 옮기고 8000 RPM에서 2분간 원심분리시켜 펠렛만 남기고 상등액은 버린 후, 4℃에서 보관한 100 ul의 용액 I으로 펠렛을 녹이고 상온에서 5분간 보관했다. 200 ul의 용액 II를 첨가하고 튜브를 아래위로 흔들어 잘 섞고 얼음 상에서 5분간 둔 후, 마지막으로 150 ul의 용액 III를 첨가하여 잘 섞은 후 어음 상에서 5분간 더 방치한 후, 8000 RPM에서 5분간 원심분리 시키면 세포벽을 포함한 여러 가지 세포 부스러기가 하얗게 뭉쳐져서 튜브 아랫부분으로 가라앉고 플라스미드 DNA와 RNA등은 상등액에 존재하게 되는데, 상등액만 취해서 각각 새로운 에펜돌프 튜브로 옮겼다. 다시 한번 8000 RPM에서 5분간 원심분리 시켜 따라온 세포 부스러기는 튜브 밑으로 가라앉히고 상등액만 취해서 다시 새로운 에펜돌프 튜브로 옮긴 후, DNase-없는 RNase A(1mg/ml) 25 ul를 첨가하고 37℃에서 3시간 배양시키고 페놀 추출함으로써 상등액에 남아있던 RNA를 제거했다. 에탄올 농축해서 각 플라스미드를 펠렛으로 떨어드린 후, 각각을 30 ul의 물로 녹인 후, 1 ul씩을 덜어서 9 ul의 물과 2 ul의 6 X DNA dye (0.25% 브로모페놀블루, 30% glycerol, 0.5 x TBE)와 섞어 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동시켜 겔상에 나타난 각 밴드의 진하기를 관찰하여 플라스미드의 추출여부와 상대적인 농도를 측정했다. 각각의 플라스미드DNA를 2 ul씩 더 들어 EcoR1과 Sacl으로 자르고 1.5% 저비점 아가로스에 로딩해서 삽입체의 유무를 확인했다. 플라스미드내 삽입 유무 여부는 플라스미드을 주형으로 한 PCR에 의해서도 확인이 가능했다. PCR 산물를 1.5% 저비점 아가로스 겔에 로딩해보면 삽입체의 존재여부와 크기가지도 쉽게 확인할 수 있었다. 또한 이 플라스미드-PCR에 의해 생겨난 PCR DNA 산물을 시험관 전사반응에 사용하여 간단하게, 그리고 대량으로 각 클론들의 RNA를 얻을 수도 있었다.

실시예 6

방사선 동위원소를 이용한 RNA 친화력 측정

게놈 DNA, 중간 단계에서 선택된 PCR DNA, 그리고 가장 많이 선별된 PCR DNA를 주형으로 삼아서 각각을 25 ul 부피로 시험관 전사반응 했다. 이 때, 표지되지 않은 UTP와 표지된 UTP([α-³²P]UTP)를 섞어 사용함으로써 합성되는 100-mer RNA 분자내에 있는 일부의 우리딘이 [α-³²P]UTP로 표지했다. PCR DNA 1 ug, 100 mM DTT 5 ul, 2.5 mM A,G,C NTP 믹스 4 ul, 100 uM 표지되지 않은 UTP 0.5 ul, 20 mCi/ml hot [α-³²P]UTP 2 ul, 5 X 완충액 5 ul, T7 RNA 폴리머라제 50 유니트과 물을 섞어 37℃에서 2시간 반응시키고 RQ1 RNase가 없는 DNase (1 u/ul)를 1 ul 첨가하여 10분간 더 반응시킨다. 같은 부피의 페놀 혼합액을 첨가하여 강하게 잘 섞은 후 상온에서 14000 rpm으로 원심분리 시켜 위층만 잘 취해서 새로운 튜브로 옮기고 같은 부피의 RNA 염료(0.1% 브로모페놀블루, 80% 포름아미드, 0.5 x TBE)를 첨가하여 잘 섞은 후 65℃에서 5분간 가열하고 얼음에 꽂아서 급냉시킨다. 7 M UREA가 포함된6% 변성 PAGE 겔 (10*8cm)에 걸어 30 mA로 30분간 로딩시키고 겔을 강화필름에 올려놓고 핸드UV로 위에서 내려 쬐면서 110-mer 크기의 밴드만 정확하게 잘라서 용출 완충액이 든 튜브로 옮긴다. 이 때 크기 마커로는 표지하지 않은 NTP 믹스만 사용한 시험관 전사 반응에서 새 튜브로 옮겨 에탄올 농축했다. 이를 30 ul의 물로 녹이고 1 ul를 취해서 5 ml 신틸레이션 칵테일이 든 바이얼로 옮겨서 β-계수기로 CPM을 측정했는데 정확성을 기하기 위해 3번을 반복해서 계수하여 평균값을 구했다. 이렇게 구한 CPM값에서 4*10⁴CPM만을 이용하고 나머지는 -20℃에서 보관했다. 4*10⁴CPM을 300 ul의 결합 완충액으로 묽혀서 65℃에서 5분간 변성시키고 상온까지 천천히 온도를 낮춘 후, 먼저 목표분자가 붙어있지 않은 웰에서 잘 섞으면서 20분간 배양하고 상등액만 취해서 네오마이신 설페이트가 든 웰로 옮겨 30분간 잘 섞으면서 배양했다. 목표분자에 붙지 않은 RNA 용액을 조심스레 취해서 5 ml 신틸레이션 칵테일이 든 바이얼로 옮겨 계수했다. 결합 완충액 200 ul로 웰을 씻고 용액을 계수했다. 5번 더 반복해서 씻고 매번 계수했다. 결합 완충액에 목표분자를 녹인 용액 (20 mM의 네오마이신중) 200 ul를 첨가하여 잘 섞으면서 30분간 반응했다. 빨리 회전시켜 용액만 조심스레 취해서 β-계수기로 cmp 값을 계수했다.

실시예 7

염기서열의 확인

미니-프레프(Mini-prep)로 얻은 플라스미드 DNA를 주형으로 하고, M13 일반적인 정방향 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 해서 ABI PRISM^TMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with AmpliTaq^ⓡDNA Polymerase, FS (part# 402080, from PERKIN ELMER)을 이용하여, Perkin-Elmer Model 2400 thermal cycler로 PCR해서 ABI 373 자동 DNA 서열분석기(Applied Biosystems, U.S.A)로 서열을 분석하였다. 98℃에서 5분간 먼저 변성시키고 이후 98℃에서 10초, 50℃에서 5초, 그리고 60℃에서 4분으로 해서 25 주기를 진행시키고, 반응이 끝나면 4℃로 유지되도록 하는 프로그램을 이용했다. PCR 반응 용액의 조성은 Terminator Ready Reaction 믹스 8.0ul, 플라스미드 DNA 200-500 ng, M13 정방향 올리고뉴클레오타이드 4 몰, 그리고 증류수를 첨가하여 반응 부피는 20 ul로 맞췄다.

Terminator Ready Reaction 믹스는 A-염료 종결자, C-염료 종결자, G-염료 종결자, T-염료 종결자, dITP, dATP, dCTP, Tris-HCL (pH 9.0), MgCl₂, 열안정성 피로포스페타제, 그리고 AmpliTaq DNA 폴리머라제, FS로 이루어져 있는데, 반응산물의 형광차이를 분석하여 서열을 분석하였다.

실시예 8

형광 이방성법에 의한 선택된 RNA의 아미노글리코시드에 대한 접합력 실험

클론 된 RNA를 공지된 논문에 의하여 대량으로 제조하고 공지의 방법에 의하여 네오마이신 등 여러 가지 아미노글리코시드와 그 접합력을 비교하였다.

따라서, 방사선 동위원소 추적에 대한 결과 선택 과정이 반복될 수록 많은 RNA가 웰에 접합함을 알 수 있었다. 본 발명에서는 게놈풀, 5번, 그리고 10번의 선택과정을 거친 풀을 주형으로 하여 합성한 RNA를 가지고 네오마이신에 대한 특이적결합을 동위원소가 웰에 많이 남아 있음을 확인했으며, 네오마이신에 의한 친화성 용출 과정에서도 선택이 많이 될수록 특이적인 용출이 많은 것으로 조사되었다. 두 번째, 5개의 RNA를 클로닝하고 이것의 염기서열을 알아본 결과 모든 염기서열이 일치하였으며, 프라이머 영역을 제외한 서열은 다음과 같다.

tgatttagag ccgtatttag gttttttaca cccaattta accagcgatt ttgaaaacaa ccctaatgaa caatcagcgc tctttgtctt acccctttca

세 번째, 실제로 클로닝된 RNA가 네오마이신에 잘 결합하는가를 측정한 결과 네오마이신에 2.5 μM(KD), 파로모마이신에 6.3 μM에 비교적 강한 접합을 하는 것으로 나타났으며, 토브라마이신 (KD = 10.6 μM), 카나마이신(KD = 40 μM)에는 그 접합력이 떨어지는 것을 관측했다. 또한 젠타마이신 (KD = 20.8 μM) 정도의 결합력을 가지고 있어서 네오마이신의 골격구조를 비교적 잘 인식하는 것으로 조사되었다.

본 발명은 병인 특이적 mRNA와 이에 접합할 수 있는 가능성을 가진 여러 화합물과의 친화선택과정에 의해서 선택하고, 선택된 mRNA 중에서 어느 것이 병인 특이적 mRNA 인가를 확인하여 목적 화합물과 병인특이적 mRNA를 동시에 탐색하는 방법을 제공하고자 한다. 따라서, 새롭게 알려진 인간 게놈 유전자를 적극적으로 활용하여 좀 더 빠르고 간편하게 새로운 목표 mRNA를 동정하는 동시에, 이 목표물을 제어할 수 있는 화합물을 알아내는 새로운 방법을 제공하는 것이 장점이다.

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Claims (7)

1. (1) 친화선택방법(SELEX)을 이용하여, 헬리코박터 피롤리로부터 얻어진 RNA 라이브러리중에서 항생제와 특이적 친화성을 갖는 mRNA를 선택하고,

   (2) 정상세포 cDNA, 또는 정상세포 cDNA가 고정된 DNA 칩상에 상기 선택된 mRNA를 혼성화하여 병인세포 특이적 mRNA를 확인하는 것을 포함하는,

   항생제에 특이적으로 접합하는 표적 mRNA를 찾는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 친화선택방법이 웰 플레이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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4. 제 1 항에 있어서, 병인 특이적 mRNA와 항생제와의 특이적 접합력을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 단계를 표면 플라즈몬 공명법, 형광 이방성법(Anisotropy), 및 방사선 표적자를 이용하는 방법중에서 선택된 방법에 의하여 수행하는 방법.
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