JP2005518211A - 遺伝子発現のトランススプライシング媒介型イメージング - Google Patents
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Abstract
本発明は細胞における遺伝子発現のイメージングのための方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、細胞内で発現された標的メッセンジャーRNA前駆体分子(標的プレmRNA)と相互作用し、リポーター分子をコードすることができる新規なキメラRNA分子(キメラRNA)の生成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するようデザインされたプレ-トランススプライシング分子(PTM)を含む。本発明のPTMは、標的プレmRNAと相互作用し、それにより標的プレmRNA発現の検出方法を提供するようデザインされている。本発明の方法および組成物は細胞内において特定の遺伝子の発現をモニターするために用いうる。特定の遺伝子発現が疾病に関連する場合、本発明は診断方法および診断組成物を提供する。このような疾病としては、いくつか挙げれば、感染性疾患、癌などの増殖性疾患、遺伝疾患、神経疾患および代謝障害がある。さらに、本発明は、遺伝子発現をモジュレートしうる化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、またはタンパク質／タンパク質相互作用を同定するためにデザインされたアッセイにおいて用いることができる。本発明は、細胞内におけるパピローマウイルスの遺伝子発現を生物発光アッセイ系を用いて検出した例によって実証される。
Description
1. 緒論
本発明は、細胞における遺伝子発現のイメージングのための方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、細胞内で発現された標的メッセンジャーRNA前駆体分子(標的プレmRNA)と相互作用し、リポーター分子をコードすることができる新規なキメラRNA分子(キメラRNA)の生成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するようデザインされたプレ-トランススプライシング分子(PTM)を含む。本発明のPTMは、標的プレmRNAと相互作用し、それにより標的プレmRNA発現の検出方法を提供するようデザインされている。本発明の方法および組成物は細胞内において特定の遺伝子の発現をモニターするために用いうる。特定の遺伝子発現が疾病に関連する場合、本発明は診断方法および診断組成物を提供する。このような疾病としては、いくつか挙げれば、感染性疾患、癌などの増殖性疾患、遺伝疾患、神経疾患および代謝障害がある。さらに、本発明は、遺伝子発現をモジュレートしうる化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、またはタンパク質／タンパク質相互作用を同定するためにデザインされたアッセイにおいて用いることができる。本発明は、細胞内におけるパピローマウイルスの遺伝子発現を生物発光アッセイ系を用いて検出した例によって実証される。
本発明は、細胞における遺伝子発現のイメージングのための方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、細胞内で発現された標的メッセンジャーRNA前駆体分子(標的プレmRNA)と相互作用し、リポーター分子をコードすることができる新規なキメラRNA分子(キメラRNA)の生成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するようデザインされたプレ-トランススプライシング分子(PTM)を含む。本発明のPTMは、標的プレmRNAと相互作用し、それにより標的プレmRNA発現の検出方法を提供するようデザインされている。本発明の方法および組成物は細胞内において特定の遺伝子の発現をモニターするために用いうる。特定の遺伝子発現が疾病に関連する場合、本発明は診断方法および診断組成物を提供する。このような疾病としては、いくつか挙げれば、感染性疾患、癌などの増殖性疾患、遺伝疾患、神経疾患および代謝障害がある。さらに、本発明は、遺伝子発現をモジュレートしうる化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、またはタンパク質／タンパク質相互作用を同定するためにデザインされたアッセイにおいて用いることができる。本発明は、細胞内におけるパピローマウイルスの遺伝子発現を生物発光アッセイ系を用いて検出した例によって実証される。
2. 発明の背景
染色体中のDNA配列はコード領域(エキソン)を含み、また通常は、介在する非コード領域(イントロン)も含んだプレmRNAへと転写される。イントロンはスプライシングと呼ばれる精密なプロセスでプレmRNAから除かれる。ほとんどの場合、スプライシング反応は同じプレmRNA分子内で起こり、これはシススプライシングと呼ばれる。独立して転写された2つのプレmRNAの間のスプライシングをトランススプライシングと呼ぶ。トランススプライシングはトリパノソーマで初めて発見され(Sutton & Boothroyd, 1986, Cell 47: 527; Murphyら, 1986, Cell 47:517)、続いて線虫(Krause & Hirsh, 1987, Cell 49:753);扁形動物(Rajkovicら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8879; Davisら, 1995, J. Biol. Chem. 270: 21813)および植物のミトコンドリア(Malekら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:553)で発見された。寄生虫トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)では、全てのmRNAがトランススプライシングによりその5’末端にスプライスリーダー(SL)RNAを獲得する。C.エレガンス(Caenorhabditis elegans)でも、いくつかの遺伝子で5’リーダー配列がトランススプライシングされる。この機構は多くの異なる転写物に単一のコンセンサス配列を付加するのに好適である。
染色体中のDNA配列はコード領域(エキソン)を含み、また通常は、介在する非コード領域(イントロン)も含んだプレmRNAへと転写される。イントロンはスプライシングと呼ばれる精密なプロセスでプレmRNAから除かれる。ほとんどの場合、スプライシング反応は同じプレmRNA分子内で起こり、これはシススプライシングと呼ばれる。独立して転写された2つのプレmRNAの間のスプライシングをトランススプライシングと呼ぶ。トランススプライシングはトリパノソーマで初めて発見され(Sutton & Boothroyd, 1986, Cell 47: 527; Murphyら, 1986, Cell 47:517)、続いて線虫(Krause & Hirsh, 1987, Cell 49:753);扁形動物(Rajkovicら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8879; Davisら, 1995, J. Biol. Chem. 270: 21813)および植物のミトコンドリア(Malekら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:553)で発見された。寄生虫トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)では、全てのmRNAがトランススプライシングによりその5’末端にスプライスリーダー(SL)RNAを獲得する。C.エレガンス(Caenorhabditis elegans)でも、いくつかの遺伝子で5’リーダー配列がトランススプライシングされる。この機構は多くの異なる転写物に単一のコンセンサス配列を付加するのに好適である。
スプライシングされたリーダートランススプライシングの機構は従来のシススプライシング機構とほとんど同じであり、2つのホスホリル転移反応によって起こる。まず、2’-5’ホスホジエステル結合が形成され、シススプライシングの場合の投縄型の中間体に相当する「Y」型の分岐を持つ中間体が生じる。第2の反応であるエキソン連結は従来のシススプライシングと同様に起こる。また、3’スプライス部位の配列およびトランススプライシング反応を触媒するsnRNPのいくつかは、シススプライシングに関与するそれらの対応物とよく似ている。
またトランススプライシングは、あるプレmRNAのイントロンが別のプレmRNAのイントロンと相互作用して、2つの通常のプレmRNA間のスプライス部位の組換えを促進するという、また違ったプロセスについてもいう場合がある。このタイプのトランススプライシングは、トランスジェニックマウスにおいて内因性の定常領域に連結されたヒト免疫グロブリン可変領域配列をコードする転写物を説明するために仮定されたものである(Shimizuら, 1989, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 86:8020)。さらにまた、c-myb プレRNAのトランススプライシングが実証され(Vellard, M.ら, Proc. Nat’l. Acad. Sci., 1992 89:2511-2515)、培養細胞および核抽出物中に、SV40からのトランススプライシングされたRNA転写物が検出され(Eulら, 1995, EMBO. J. 14:3226)、もっと最近では、ヒト肝臓のp450遺伝子由来の転写物がトランススプライシングされることが示された(Fintaら, 2002, J. Biol. Chem 22:5882-5890)。しかし、一般に、哺乳類プレmRNAの天然に存在するトランススプライシングは極めてまれであると考えられる。
スプライシング機構を調べるモデル系として、いくつかのグループにより、in vitroトランススプライシングが用いられている(Konarska & Sharp, 1985, Cell 46:165-171; Solnick, 1985, Cell 42:157; Chiara & Reed, 1995, Nature 375:510; PasmanおよびGarcia-Blanco, 1996, Nucleic Acids Res. 24:1638)。かなり効率的なトランススプライシング(シススプライシングされた類似体の30%)が互いに塩基対合可能なRNA間で達成されたが、塩基対合によって結びつかないRNAのスプライシングはさらに10倍低くなった。基質間で明確なRNA-RNA相互作用を必要としない他のin vitroトランススプライシング反応が、Chiara & Reed (1995, Nature 375: 510), Bruzik J.P. & Maniatis, T. (1992, Nature 360:692)ならびにBruzik J.P.およびManiatis, T. (1995, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92: 7056-7059)によって観測されている。これらの反応は比較的低い頻度でしか起こらず、下流5’スプライス部位またはエキソンスプライシングエンハンサーなどの特殊なエレメントを要する。
米国特許第6,083,702号、同第6,013,487号および同第6,280,978号は、PTMを用い、標的mRNA前駆体を接触させることによりトランススプライシング反応を媒介して新規なキメラRNAを生成することを記載している。結果として生じたRNAは、細胞もしくは宿主生物に対し治療価値があるタンパク質、特定の細胞の死滅を引き起こすジフテリア毒サブユニットAなどの毒素、または細胞には通常存在しない新規なタンパク質をはじめとするいずれかの遺伝子産物をコードし得る。このようなPTMはまた、エキソンタグ付け法を用いたプレmRNA分子のエキソン／イントロン境界の同定のために、また、特定の細胞種で発現されるタンパク質を精製および同定するために使用できるペプチドアフィニティー精製タグをコードするものをはじめとするキメラタンパク質の生成のために、遺伝子工学的に操作することもできる。
分子技術における最近の進歩は遺伝子発現の分子的基礎の理解の増進をもたらした。多くの疾患または疾病において特定の遺伝子の発現がその疾患または疾病の存在と関連している可能性がある。よって、このような遺伝子発現を検出および／または定量するようデザインされた方法は、細胞内での遺伝子発現を研究するため、また、遺伝子発現をモジュレートしうる化合物を同定するため、また、被験体において疾病を診断するための有用な手段を提供する。本発明は生きた細胞内の特定の標的遺伝子の発現をリアルタイムで検出するための有力な新しい手段を提供する。
3. 発明の概要
本発明は、細胞内における遺伝子発現のイメージングのための方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、リポーター分子を発現するよう遺伝子工学的に操作された、プレ-トランススプライシング分子(PTM)と、細胞内で特定の遺伝子の発現を検出するためのこのような分子の使用を含む。このようなリポーター分子としては、限定されるものではないが、蛍光分子および生物発光分子、酵素、受容体、ならびにペプチドタグが挙げられる。
本発明は、細胞内における遺伝子発現のイメージングのための方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、リポーター分子を発現するよう遺伝子工学的に操作された、プレ-トランススプライシング分子(PTM)と、細胞内で特定の遺伝子の発現を検出するためのこのような分子の使用を含む。このようなリポーター分子としては、限定されるものではないが、蛍光分子および生物発光分子、酵素、受容体、ならびにペプチドタグが挙げられる。
本発明の方法および組成物は、リポーター遺伝子産物の発現を特定の細胞腫へターゲットするための機構を提供する。本発明の方法は、本発明のPTMと細胞とを、PTMの一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされてキメラRNAを形成するような条件下で接触させることを含む。標的プレmRANは、目的がプレmRNAの発現を検出することである場合、植物細胞をはじめいずれの細胞種で発現される任意のプレmRNAであってもよい。このような細胞種としては、限定されるものではないが、ウイルスその他の感染性病原体に感染した細胞、良性または悪性新生物、自己免疫疾患または組織拒絶に関わる免疫系の成分を発現する細胞、あるいは疾病と関連することが知られている任意の標的プレmRNAを発現する細胞が挙げられる。さらにまた、本発明は、遺伝子発現をモジュレートしうる化合物を同定するようデザインされたスクリーニングアッセイ、またはタンパク質／タンパク質相互作用を同定するようデザインされたアッセイを提供する。
4. 図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については後述）
5. 発明の詳細な説明
本発明は生きた細胞中で遺伝子発現をイメージングする方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、リポーター分子を発現するよう作製されたプレ-トランススプライシング分子(PTM)と、新規な核酸分子を生成するためのこのような分子の使用を含む。本発明のPTMは、標的プレmRNAと相互作用するように作製されているが、その意図は細胞内で標的プレmRNA発現を検出することである。本発明のPTMは、標的プレmRNAに特異的に結合するようにデザインされた1以上の標的結合ドメイン；3’スプライス受容部位および／または5'スプライス供与部位を含む3’スプライス領域を含んでなる。このPTMはさらに分岐点、ピリミジントラクトおよびスプライス部位と標的結合ドメインとを隔てる1以上のスペーサー領域を含んでなる。
（図面の簡単な説明については後述）
5. 発明の詳細な説明
本発明は生きた細胞中で遺伝子発現をイメージングする方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、リポーター分子を発現するよう作製されたプレ-トランススプライシング分子(PTM)と、新規な核酸分子を生成するためのこのような分子の使用を含む。本発明のPTMは、標的プレmRNAと相互作用するように作製されているが、その意図は細胞内で標的プレmRNA発現を検出することである。本発明のPTMは、標的プレmRNAに特異的に結合するようにデザインされた1以上の標的結合ドメイン；3’スプライス受容部位および／または5'スプライス供与部位を含む3’スプライス領域を含んでなる。このPTMはさらに分岐点、ピリミジントラクトおよびスプライス部位と標的結合ドメインとを隔てる1以上のスペーサー領域を含んでなる。
さらにまた、本発明のPTMはリポーター分子として働くタンパク質産物をコードする任意のヌクレオチド配列を含むよう操作される。このようなリポーター分子としては、限定されるものではないが、蛍光および生物発光分子、酵素、受容体、ならびにタンパク質／ペプチドタグ、抗体またはそのフラグメント、およびイオンチャネルまたはそのサブユニットが挙げられる。場合によってはリポーター分子自体が検出シグナルを提供してもよいし、リポーター分子に対して親和性を有するリポータープローブまたはトレーサーが、検出シグナル、すなわち蛍光、生物発光または放射性標識を提供してもよい。
本発明の方法は、本発明のPTMと細胞内で発現された特定の標的プレmRNAとを、PTMの一部が標的プレmRNAの一部へとトランススプライシングされてリポーター分子をコードしうるキメラRNAを生じるような条件下で接触させることを含む。標的プレmRNAは、その発現が特定の疾病に関連しており、従って被験体において疾病の存在を診断する機構をもたらすことから選択される。このような疾病としては例えば、良性または悪性新生物などの増殖性疾患、遺伝疾患、代謝障害、神経疾患または免疫疾患が挙げられる。例えば、自己免疫疾患または組織拒絶に関わる免疫系の成分をターゲットしてもよい。さらに、ウイルスまたは他の種の感染性病原体に感染した細胞をターゲットしてもよい。本発明はまた、遺伝子発現をモジュレートしうる因子を同定するようデザインされたスクリーニング方法も提供する。あるいは、本発明の方法および組成物は特定の細胞種内で発現されるmRNAのレパートリーを同定するため、またはタンパク質／タンパク質相互作用を同定するために利用してもよい。
5.1. プレ-トランススプライシング分子の構造
本発明はターゲットトランススプライシングによりリポーター分子をコードする新規なキメラ核酸分子を作製するのに用いる組成物を提供する。図１は種々のタイプのトランススプライシング反応の模式図である。本発明のPTMは(i)PTMの結合をプレmRNA標的へターゲットする1以上の標的結合ドメイン、(ii)3’スプライス受容部位および／または5'スプライス供与部位を含む3’スプライス領域；ならびに(iii)リポーター分子をコードしうるヌクレオチドを含んでなる。場合によっては、本発明のPTMは標的結合ドメインを用いずに、またはランダム標的結合ドメインおよび／またはセーフティー配列を用いて、操作してもよい。さらにまた、本発明のPTMはRNAスプライス部位と標的結合ドメインを隔てる1以上のスペーサー領域をさらに含んでもよい。
本発明はターゲットトランススプライシングによりリポーター分子をコードする新規なキメラ核酸分子を作製するのに用いる組成物を提供する。図１は種々のタイプのトランススプライシング反応の模式図である。本発明のPTMは(i)PTMの結合をプレmRNA標的へターゲットする1以上の標的結合ドメイン、(ii)3’スプライス受容部位および／または5'スプライス供与部位を含む3’スプライス領域；ならびに(iii)リポーター分子をコードしうるヌクレオチドを含んでなる。場合によっては、本発明のPTMは標的結合ドメインを用いずに、またはランダム標的結合ドメインおよび／またはセーフティー配列を用いて、操作してもよい。さらにまた、本発明のPTMはRNAスプライス部位と標的結合ドメインを隔てる1以上のスペーサー領域をさらに含んでもよい。
PTMの標的結合ドメインは、選択されたプレmRNAの標的領域に対して相補的、かつ、アンチセンス配向である複数の結合ドメインを含んでもよい。本明細書において標的結合ドメインは、結合の特異性を与え、核のスプライセオソームプロセッシング機構がPTMの一部をプレmRNAの一部へとトランススプライシングできるように近接してプレmRNAを結合するいずれかの配列として定義される。これらの標的結合ドメインは数千までのヌクレオチドを含みうる。本発明の好ましい実施形態では、これらの結合ドメインは少なくとも10ないし30、数百までのヌクレオチドを含みうる。PTMの特異性は標的結合ドメインの長さを増加させることによって著しく高めることができる。さらにまた、標的結合ドメインは「直鎖状」であってもよいが、このRNAは、結合ドメインがその標的に遭遇するまでPTMスプライス部位の活性化を妨げることで複合体を安定化させ、それによりトランススプライシングの特異性を高めうる二次構造を形成するように折りたたまれていてもよいものと理解される。第2の標的結合領域は分子の3’末端に位置してもよく、本発明のPTMに組み込むことができる。絶対的な相補性が好ましいが、必ずしも必要ではない。本明細書に関してRNAの一部に「相補的な」配列とは、そのRNAとハイブリダイズして安定な二重らせんを形成しうるのに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズ能は相補性の程度および核酸の長さの両方に依存しうる(例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York参照)。一般にハイブリダイズする核酸が長いほど、RNAとミスマッチな塩基をより多く含むが、それはなお安定した二重らせんを形成する。当業者ならば、標準的な方法を用いてハイブリダイズした複合体の安定性を調べることにより、ミスマッチまたは二重らせんの長さの許容度を確かめることができる。
本発明の一実施形態では、PTMの標的結合ドメインは、標的プレmRNA分子に対して相補的で、かつ、アンチセンス配向にある配列を含み、その目的は標的プレmRANの発現を検出することである。例えば、PTM結合部位は、標的プレmRNAの発現が疾患または疾病に関連するような任意の標的プレmRNAと結合するよう操作してもよい。このような疾患としては、限定されるものではないが、増殖性疾患、免疫疾患、代謝障害または遺伝疾患が挙げられる。本発明のある特定の実施形態では、増殖性疾患を検出するために、β-絨毛性ゴナドトロピン6プレ標的mRNAおよび／または上皮増殖因子受容体プレ標的mRNA（双方とも腫瘍細胞で過剰発現することが知られている）をターゲットすることができる。あるいは、PTMの標的結合ドメインは感染性病原体によりコードされているプレmRNA分子に相補的な配列を含む。例えば、標的結合ドメインはウイルス、細菌または寄生虫のプレmRNAと結合するようにデザインしてもよく、それにより感染性疾患の検出のための診断方法が提供される。図２は用いうるHPV-16、β-HCG6およびEGFRプレmRNA標的の模式図である。
特定の目的遺伝子の発現をモジュレートしうる因子を同定するためにデザインされたスクリーニングアッセイでは、PTMの標的結合ドメインは目的遺伝子に相補的な配列を含む。
また、結合はその他の機構、例えば三重らせんの形成によって、またはPTMが特定のRNA結合タンパク質、すなわち特定の標的プレmRNAと結合したタンパク質を認識するように操作されているものなどのタンパク質／核酸相互作用によって達成することもできる。あるいは、本発明のPTMは、例えばRNA分子内のヌクレオチド間の分子内塩基対合によって生じるヘアピン構造などの二次構造を認識するようにデザインしてもよい。
また、PTM分子は分岐点、ピリミジントラクトおよび3' スプライス受容AG部位および／または5'スプライス供与部位を含みうる3’スプライス領域を含む。RNA スプライシングに用いる5’スプライス供与部位および3’スプライス領域のコンセンサス配列は当技術分野で周知のものである(Mooreら, 1993, The RNA World, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 303-358参照)。さらにまた、本発明の実施において、5'供与スプライス部位および3’スプライス領域として機能する能力を維持する改変コンセンサス配列を用いてもよい。要するに、5’スプライス部位コンセンサス配列はAG/GURAGU(ここで、A=アデノシン、U=ウラシル、G=グアニン、C=シトシン、R=プリンおよび/=スプライス連結部)である。3’スプライス部位は分岐点または分岐部位、ポリピリミジントラクトおよび3'コンセンサス配列(YAG)の3つの異なる配列エレメントからなる。哺乳類の分岐点コンセンサス配列は YNYURAC(Y=ピリミジン)である。下線を引いたAは分岐形成部位である。ポリピリミジントラクトは、分岐点とスプライス部位受容部との間に位置し、効率的な分岐点利用および3’スプライス部位認識に重要なものである。
さらに、3'受容部位(AG)を含んでなるPTMを遺伝子操作することができる。このようなPTMはピリミジントラクトおよび／または分岐点配列をさらに含んでもよい。
最近、ジヌクレオチドAUで始まり、ジヌクレオチドACで終わるプレメッセンジャーRNAイントロンが確認され、U12イントロンと呼ばれている。U12イントロン配列ならびにスプライス受容／供与配列として機能するいずれかの配列をPTMで用いてもよい。
また、標的結合ドメインとRNAスプライス部位とを隔てるスペーサー領域もPTMに含めてよい。このスペーサー領域は標的プレmRNAへのトランススプライシングを促進する配列などの特徴を有しうる。本発明の特定の実施形態では、スプライシングされていないRNAの選択的分解をターゲットし、それにより核から細胞質に向かうスプライシングされていないRNAの翻訳および発現を妨げる機構として、開始コドンと未成熟停止コドンを本発明のPTMに組み込んでもよい(Kimら, 2001 Science 293:1832-1836参照)。
本発明のある好ましい実施形態では、スペーサー、結合ドメイン、またはPTM内の他のいずれかの場所に「セーフティー」を組み込んで非特異的トランススプライシングを妨げる。これは比較的弱い相補性によってPTMの3'および／または5’スプライス部位のエレメントを覆って非特異的トランススプライシングを妨げるPTMの一領域である。PTMは、結合ドメインと特定の標的プレmRNAとのハイブリダイゼーションの際には 3'および／または5'スプライス部位は覆われず、完全活性型となるようにデザインされる。「セーフティー」機構の模式図は図４に示されている。
「セーフティー」は、PTM分岐点、ピリミジントラクト、3’スプライス部位および／または5’スプライス部位(スプライシングエレメント)の片側または両側に弱く結合する1以上のシス配列の相補的ストレッチからなる(または、第2の別個の核酸鎖でありうる)か、あるいは、スプライシングエレメントそれ自体の一部と結合しうる。この「セーフティー」結合はスプライシングエレメントが活性になるのを妨げ、すなわちU2 snRNPその他のスプライシング因子がPTMスプライス部位認識エレメントと結合するのを妨げる。この「セーフティー」の結合はPTMの標的結合領域が標的プレmRNAに結合することにより破壊され、その結果露出させ、PTMスプライシングエレメントを活性化し、それらを標的プレmRNAへとトランススプライシングされるようにする。
本発明のPTMには、リポーター分子を生成しうる翻訳可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。このようなリポーター遺伝子としては、限定されるものではないが、生物発光分子および蛍光分子、受容体、イオンチャネル成分、抗体またはそのフラグメント、酵素およびタンパク質／タンパク質タグが挙げられる(Yuら, 2000 Nature Medicine 6:933-937; MacLarentら, 2000 Biol Psychiatry 48:337-348; Zaretら, 2001 J. Nuclear Cardiology March/April 256-266; Rayら, 2001 Seminars in Nuclear Medicine 31:312-320; Lok, 2001 Nature 412:372-374; Allportら, 2001 Experimental Hematology 29:1237-1246; Berger and Gambhir, 2000 Breast Cancer Research 3:28-35; Cherry and Gambhir, 2001, ILAR Journal 42:219-232)。生物発光分子としては、限定されるものではないが、ホタル、ウミシイタケ(Renilla)または細菌のルシフェラーゼが挙げられる。蛍光分子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質が挙げられる。図３はルシフェラーゼリポーター分子を発現するようデザインされた原型PTMを示したものである。図４はセーフティー機構を含む、ルシフェラーゼをコードするPTMを示す。
本発明のさらにもう一つの実施形態では、リポーター分子としては、いくつか挙げれば、β-ガラクトシダーゼ(Louieら, 2000 Nature Biotechnology 15:321-325)、シトシンデアミナーゼ、I型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、クレアチンキナーゼ(Yaghoubiら, 2001 Human Imaging of Gene Expression 42:1225-1234; Yaghoubi et al., 2001 Gene Therapy 8:1072-1080; Iyer et al., 2001 J. Nuclear Medicine 42:96-105)、またはアルギニンキナーゼがある。この酵素は、選択されたトレーサーに対する酵素の作用によって特定の放射性標識トレーサーを捕捉できるその能力のために選択される。
あるいは、ヌクレオチド配列は、発現されたマーカータンパク質に対して結合親和性を有する標識トレーサーと結合しうる、受容体などの細胞内および／または細胞外マーカータンパク質をコードしてもよい。このようなタンパク質としては、例えば、ドーパミン2受容体、ソマトスタチン受容体、オキソテクネタート結合融合タンパク質、ガストリン放出ペプチド受容体、カテプシンD、トランスフェリン受容体またはCFTR C1イオンチャネルが挙げられる。
ペプチドタグをコードするヌクレオチド配列はエピトープタグとも呼ばれるが、これを本発明のPTMの構造に含めてもよい。本発明のある好ましい実施形態では、エピトープは特定の抗体によって認識されるか、または特定のリガンドと結合するものであり（それらの抗体やリガンドの各々を標識してもよい）、それにより標的プレmRNAを発現する細胞をイメージングする方法が提供される。用いうるエピトープとしては、限定されるものではないが、AU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、プロテインC、S-Tag、T7、V5またはVSV-Gが挙げられる。
PTM分子における翻訳可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列の前又は後ろに、さらなる特徴、例えばポリアデニル化シグナル、スプライシングを促進するための5’スプライス配列、さらなる結合領域、「セーフティー」自己相補領域、さらなるスプライス部位、または分子の安定性をモジュレートし、分解を防ぐための保護基などを付加することができる。
本発明のPTMへ組み込みうるさらなる特徴としては、スプライシングされていないプレmRNAの発現を防ぐための、結合ドメインとスプライス部位の間の領域に存在する停止コドンまたはその他のエレメントが挙げられる。本発明の別の実施形態では、PTMは、3’標的イントロンまたはエキソンへの結合を促進するために、また、固定された真のシス5’スプライス部位(U5および／またはU1結合部位)を遮断するために、翻訳可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列から下流にある第2のアンチセンス結合ドメインを伴って生成することができる。
また、キメラトランススプライシング産物の生成に二重トランススプライシング反応を必要とするPTMも作製することができる。2つのトランススプライシング反応を促進するようにデザインされたPTMは上記のように作製されるが、それらは5’供与部位と3’スプライス受容部位の双方を含む。さらに、PTMは2以上の結合ドメインおよびスペーサー領域を含んでもよい。これらのスペーサー領域は複数の結合ドメインとスプライス部位との間、あるいはまた複数の結合ドメイン間に配置してもよい。
細胞の取り込みを増大させるため、あるいは、核局在化およびスプライセオソームの認識、ならびに安定性を促進するため、合成PTMに3’ヘアピン構造、環状RNA、ヌクレオチド塩基修飾または合成類似体などのさらなるエレメントを組み込むことができる。
PTM分子には、ポリアデニル化シグナル、またはスプライシングを促進するためのエンハンサー配列、さらなる結合領域、「セーフティー」自己相補領域、さらなるスプライス部位、または分子の安定性をモジュレートし、分解を防ぐための保護基などのさらなる特徴を付加することができる。本発明のある実施形態では、その合成PTM構造中にエキソンスプライシングエンハンサーと呼ばれる配列を含んでもよい。トランス作用スプライシング因子、すなわちセリン／アルギニンリッチ(SR)タンパク質は、このようなエキソンスプライシングエンハンサーと相互作用し、スプライシングをモジュレートすることが示されている(Tackeら, 1999, Curr. Opin. Cell Biol. 11:358-362; Tianら, 2001, J. Biological Chemistry 276:33833-33839; Fu, 1995, RNA 1:663-680参照)。このPTM分子中には核局在シグナルもまた含んでよい(DingwellおよびLaskey, 1986, Ann .Rev. Cell Biol. 2:367-390; Dingwell and Laskey, 1991, Trends in Biochem. Sci. 16:478-481)。このような核局在シグナルは合成PTMの核(ここでトランススプライシングが起こる)への輸送を増強するために用いることができる。さらに、核におけるスプライシングされていないPTMの保持を増強する配列を用いてもよい(Boelansら, 1995 RNA 1:273-83; Goodら, 1997 Gene Ther. 4: 45-54)。
さらにまた、植物細胞で用いるPTMを操作する際には、分岐点配列またはポリピリミジントラクトは、これらの配列は植物でのイントロンのプロセッシングに一般に用いられないので必ずしも含む必要はない。しかし、脊椎動物および酵母のスプライシングに必要なものなど、3’スプライス受容部位および／または5’スプライス供与部位は含まれる。さらに、植物でのスプライシング効率はUAリッチなイントロン配列も含めることによって増大させることができる。当業者ならば、植物におけるトランススプライシング反応を媒介しうるいずれの配列を用いてもよいことが分かるであろう。
合成PTMを用いる場合、本発明のPTMは、例えば分子の安定性、標的mRNAへのハイブリダイゼーション、細胞への輸送などを向上させるために塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を改変することができる。例えば全体としての電荷を小さくするようPTMを改変すると、分子の細胞への取り込みを向上させることができる。さらにまた、ヌクレアーゼ分解または化学分解に対する感受性を低減させる改変を行うこともできる。核酸分子は、例えばペプチド(例えば、in vivoで宿主細胞受容体をターゲットするため)、あるいは、細胞膜(例えば、Letsingerら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitreら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; 1988年12月15日公開のPCT公開W088/09810参照)もしくは血液脳関門(例えば、1988年4月25日公開のPCT公開W089/10134)を通過する輸送を補助する薬剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤(例えば、Krolら, 1988, BioTechniques 6:958-976参照)またはインターカレート剤(例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549)などのその他の分子とコンジュゲートするように合成してもよい。この目的で核酸分子は、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤などにコンジュゲートしてもよい。
核酸分子への種々のその他周知の改変を、安定性および半減期を増大させる手段として導入できる。可能な改変としては、限定されるものではないが、分子の5’および／または3’末端へのリボヌクレオチドのフランキング配列の付加が挙げられる。安定性の増大が望まれるいくつかの環境では、2’-O-メチル化などの改変型のヌクレオシド間結合を有する核酸が好ましいものでありうる。改変型のヌクレオシド間結合を含む核酸は当技術分野で周知の試薬および方法を用いて合成することができる(Uhlmannら, 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneiderら, 1990, Tetrahedron Lett. 31:335およびその中に挙げられている参照文献参照)。
本発明の合成PTMは好ましくはそれらの安定性が高まるように修飾される。RNA分子は細胞リボヌクレアーゼによる切断に対して感受性があることから、RNA結合配列の作用を模倣するが、ヌクレアーゼ切断に対する感受性の低い化学修飾オリゴヌクレオチド(またはオリゴヌクレオチドの組合せ)を競合阻害剤として用いるのが好ましい場合がある。さらに、合成PTMは安定性が増強したヌクレアーゼ耐性環状分子として生成させることもできる(Puttarajuら, 1995, Nucleic Acids Symposium Series No. 33:49-51; Puttarajuら, 1993, Nucleic Acid Research 21:4253-4258)。例えば、結合を増強するため、細胞取り込みを増強するため、薬理性もしくは薬物動態を改善するため、または その他の医薬上望ましい特性を改善するために他の修飾もまた必要とされる場合がある。
合成PTMの構造に対してなし得る修飾としては、限定されるものではないが、(i)ホスホロチオエート(XまたはYまたはWまたはZ=S、または残りをOとして有する2以上の任意の組合せ)、例えば、Y=S(Stein, C. A.ら, 1988, Nucleic Acids Res., 16:3209-3221)、X=S(Cosstick, R.ら, 1989, Tetrahedron Letters, 30, 4693-4696)、YおよびZ=S(Brill, W. K.-D.ら, 1989, J. Amer. Chem. Soc., 111:2321-2322)；(ii)メチルホスホネート(例えば、Z=メチル(Miller, P. S.ら, 1980, J. Biol. Chem., 255:9659-9665)；(iii)ホスホルアミダート(Z=N-(アルキル)2、例えばアルキルメチル、エチル、ブチル)(Z=モルホリンまたはピペラジン)(Agrawal, S.ら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079-7083)(XまたはW=NH)(Mag, M.ら, 1988, Nucleic Acids Res., 16:3525-3543)；(iv)ホスホトリエステル(Z=O-アルキル、例えば、メチル、エチルなど)(Miller, P. S.ら, 1982, Biochemistry, 21:5468-5474)；および(v)リンを含まない結合(例えば、カルバメート、アセトアミデート、アセテート)(Gait, M. J.ら, 1974, J. Chem. Soc. Perkin I, 1684-1686; Gait, M. J.ら, 1979, J. Chem. Soc. Perkin I, 1389-1394)の使用などの骨格修飾が挙げられる。また、Sazaniら, 1974, Nucleic Acids Research 29:3965-3974も参照。
さらに、本発明のPTMに糖修飾を組み込んでもよい。このような修飾としては、限定されるものではないが、(i)2'-リボヌクレオシド(R=H)；(ii)2'-O-メチル化ヌクレオシド(R=OMe)(Sproat, B. S.ら, 1989, Nucleic Acids Res., 17:3373-3386)；および(iii)2'-フルオロ-2'-リボヌクレオシド(R=F)(Krug, A.ら, 1989, Nucleosides and Nucleotides, 8:1473-1483)の使用が挙げられる。
さらに、PTMに対してなし得る塩基修飾としては、限定されるものではないが、(i)5位で置換した(例えば、メチル、ブロモ、フルオロなど)か、またはカルボニル基をアミノ基に置換したピリミジン誘導体(Piccirilli, J. A.ら, 1990, Nature, 343:33-37)；(ii)特定の窒素原子を欠いたプリン誘導体(例えば、7-デアザアデニン、ヒポキサンチン)または8位で官能化されたプリン誘導体(例えば、8-アジドアデニン、8-ブロモアデニン)(総説としては、Jones, A. S., 1979, Int. J. Biolog. Macromolecules,1:194-207参照)が挙げられる。
さらにまた、PTMは、(i)プソラレン類(Miller, P. S.ら, 1988, Nucleic Acids Res., Special Pub. No. 20, 113-114)、フェナントロリン類(Sun, J-S.ら, 1988, Biochemistry, 27:6039-6045)、マスタード類(Vlassov, V. V.ら, 1988, Gene, 72:313-322)(補助試薬を必要とする、または必要としない不可逆的架橋剤)；(ii)アクリジン(インターカレート剤)(Helene, C.ら, 1985, Biochimie, 67:777-783)；(iii)チオール誘導体(タンパク質との可逆的ジスルフィド形成)(Connolly, B. A.およびNewman, P. C., 1989, Nucleic Acids Res., 17:4957-4974)；(iv)アルデヒド類(シッフの塩基形成)；(v)アジド、ブロモ基(UV架橋)；または(vi)エリプチシン類(光分解架橋)(Perrouault, L.ら, 1990, Nature, 344:358-360)などの反応性官能基と共有結合させてもよい。
本発明のある実施形態では、糖とヌクレオシド間結合、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が新規の基で置換されたオリゴヌクレオチドミメティクスが使用できる。例えば、天然オリゴヌクレオチドに対するよりもDNAおよびRNAに対して高い親和性で結合することが示されているこのようなオリゴヌクレオチドミメティクスのあるものはペプチド核酸(PNA)と呼ばれる(総説としては、Uhlmann, E. 1998, Biol. Chem. 379:1045-52参照)。ここでPNAは、それらの安定性および／または標的プレmRNAに対する結合親和性を高めるために合成PTMへ組み込んでよい。
本発明のもう1つの実施形態では、合成PTMは親油基または細胞による取り込みを向上し得るその他の試薬と共有結合させてもよい。例えば、PTM分子は、PTMが細胞へ送達される効率を高めるため、(i)コレステロール(Letsinger, R. L.ら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553-6556)；(ii)ポリアミン類(Lemaitre, M.ら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84:648-652)；その他の可溶性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)と共有結合させてもよい。さらにまた、PTMの安定性および標的細胞への送達を増強するために上記で明確にされた修飾の組合せを用いてもよい。
本発明のPTMは疾患または疾病に関連しうる遺伝子を発現する細胞を同定するようデザインされた診断方法で用いることができる。本発明のこの方法は、PTMを標的細胞へ送達することを含んでなり、該PTMは当業者が用いるいずれの形態、例えば合成RNA分子、またはRNA分子へ転写されるDNAベクターの形態であってよく、該PTMは標的プレmRNAと結合し、プレmRNAの一部へトランススプライスされるリポーター分子をコードするPTM分子の一部を含んでなるキメラRNAの形成をもたらすトランススプライシング反応を媒介する。
5.2. トランススプライシング分子の合成
本発明の核酸分子は、RNAもしくはDNAまたはその誘導体もしくは改変型であってよく、一本鎖もしくは二本鎖であってよい。核酸とは、デオキシリボヌクレオチドからなる場合であれ、リボヌクレオチドからなる場合であれ、また、ホスホジエステル結合からなる場合であれ、改変型の結合からなる場合であれ、PTM分子、またはPTM分子をコードする核酸分子を意味する。また、核酸という用語には、生物学的に生成される5つの塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)以外の塩基からなる核酸も特に含まれる。
本発明の核酸分子は、RNAもしくはDNAまたはその誘導体もしくは改変型であってよく、一本鎖もしくは二本鎖であってよい。核酸とは、デオキシリボヌクレオチドからなる場合であれ、リボヌクレオチドからなる場合であれ、また、ホスホジエステル結合からなる場合であれ、改変型の結合からなる場合であれ、PTM分子、またはPTM分子をコードする核酸分子を意味する。また、核酸という用語には、生物学的に生成される5つの塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)以外の塩基からなる核酸も特に含まれる。
本発明のRNAおよびDNA分子は、DNAおよびRNA分子の合成に関して当技術分野で公知のいずれの方法によっても調製することができる。例えば、核酸は当技術分野で周知の方法により市販の試薬および合成機を用いて化学的に合成してもよい(Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England)。あるいはRNA分子は、RNA分子をコードするDNA配列のin vitroおよびin vivo転写によって作製することもできる。このようなDNA配列はT7またはSP6ポリメラーゼなどの適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込んだ様々なベクターへ組み込むことができる。RNAはSPS65(Promega Corporation, Madison, WI)などのプラスミドを用いるin vitro転写を介して高収率で産生することができる。さらにまた、Q-β増幅などのRNA増幅法を利用してRNAを産生することもできる。
これらの核酸分子は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、細胞への輸送などを改善するために塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を改変することができる。例えば全体としての電荷を小さくするようPTMを改変すると、分子の細胞への取り込みを向上させることができる。さらにまた、ヌクレアーゼ分解に対する感受性を低減させる改変を行うこともできる。核酸分子は、ペプチド(例えば、in vivoで宿主細胞受容体をターゲットするため)、あるいは、細胞膜(例えば、Letsingerら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitreら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; 1988年12月15日公開のPCT公開W088/09810参照)もしくは血液脳関門(例えば、1988年4月25日公開のPCT公開W089/10134)を通過する輸送を補助する薬剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤(例えば、Krolら, 1988, BioTechniques 6:958-976参照)またはインターカレート剤(例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549)などのその他の付加的な基を含んでもよい。この目的で核酸分子は、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤などにコンジュゲートしてもよい。核酸分子への種々のその他周知の改変が細胞内安定性および半減期を増大させる手段として導入できる。可能な改変としては、限定されるものではないが、分子の5’および／または3’末端へのリボまたはデオキシヌクレオチドのフランキング配列の付加が挙げられる。安定性の増大が望まれるいくつかの環境では、2’-O-メチル化などの改変型のヌクレオシド間結合を有する核酸が好ましいものでありうる。改変型のヌクレオシド間結合を含む核酸は当技術分野で周知の試薬および方法を用いて合成することができる(Uhlmannら, 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneiderら, 1990, Tetrahedron Lett. 31:335およびその中に挙げられている参照文献参照)。
核酸は当技術分野において周知であるような好適な手段のいずれかによって精製しうる。例えば、核酸は逆相クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動によって精製することができる。もちろん当業者ならば、精製方法が精製する核酸の大きさおよび電荷によってある程度異なることが分かるであろう。
PTMをコードする核酸分子を用いる場合、核酸分子の発現ベクターへのクローニングには当技術分野で公知のクローニング技術を用いればよい。組換えDNA技術の分野で一般に知られている使用可能な方法は、Ausubelら(編), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY;およびKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。
目的のPTMをコードするDNAは、DNAの大スケール複製も提供し、かつ、PTMの転写を指令する必須エレメントも含む様々な宿主ベクター系へと組換え法で作製することができる。患者の標的細胞をトランスフェクトするためにこのような構築物を用いると、内因的に発現したプレmRNA標的と相補的塩基対を形成し、それにより複合化した核酸分子間でトランススプライシング反応を促進するPTMが十分な量で転写される。例えば、ベクターは、細胞に取り込ませ、PTM分子の転写を指令することができるようにin vivoで導入することができる。このようなベクターは、転写されて目的のRNAを産生することができる限り、エピソームとして維持されるものであっても染色体に組み込まれるものであってもよい。このようなベクターは当技術分野で標準的な組換えDNA技術によって構築することができる。
目的のPTMをコードするベクターは、プラスミド、ウイルス、または哺乳類細胞で複製および発現させるのに用いる当技術分野で公知のその他のものであってよい。PTMをコードする配列の発現は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞で機能するように当技術分野で公知のいずれかのプロモーターによってモジュレートすることができる。このようなプロモーターは誘導性のものであっても構成性のものであってもよい。このようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、SV40初期プロモーター領域(Benoist, C.およびChambon, P. 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamotoら, 1980, Cell 22: 787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42)、CMVウイルスプロモーター、ヒト絨毛性ゴナドトロピン-βプロモーター(Hollenbergら, 1994, Mol. Cell. Endocrinology 106:111-119)などが挙げられる。任意の種類のプラスミド、コスミド、YACまたはウイルスベクターを用いて、組織部位へ直接導入できる組換えDNA構築物を作製することができる。あるいは、所望の標的細胞へ選択的に感染するウイルスベクターを用いることもできる。
5.3 遺伝子発現のPTM媒介型イメージング
本発明は、細胞における遺伝子発現のイメージングのための方法および組成物を提供する。本発明の組成物および方法は癌、またはウイルス、細菌、寄生虫もしくは真菌感染症、自己免疫疾患、および病状が特定のmRNAの発現と関連しているその他の病態の診断に使用できる。本発明はまた、遺伝子発現をモジュレートしうる因子を同定するためのスクリーニングアッセイ、および細胞内でのタンパク質／タンパク質、DNA／タンパク質およびRNA／タンパク質相互作用を同定するためのアッセイも提供する。本発明の方法および組成物はさらに、生物または細胞が毒性または非毒性化合物などの特定の化合物に曝された場合を示すようにデザインされた検出系として用いてもよい。
本発明は、細胞における遺伝子発現のイメージングのための方法および組成物を提供する。本発明の組成物および方法は癌、またはウイルス、細菌、寄生虫もしくは真菌感染症、自己免疫疾患、および病状が特定のmRNAの発現と関連しているその他の病態の診断に使用できる。本発明はまた、遺伝子発現をモジュレートしうる因子を同定するためのスクリーニングアッセイ、および細胞内でのタンパク質／タンパク質、DNA／タンパク質およびRNA／タンパク質相互作用を同定するためのアッセイも提供する。本発明の方法および組成物はさらに、生物または細胞が毒性または非毒性化合物などの特定の化合物に曝された場合を示すようにデザインされた検出系として用いてもよい。
本発明の診断方法は被験体または被験体由来のサンプルとPTMまたはPTMをコードする核酸分子とを接触させることを含む。標的プレmRNAがサンプルまたは被験体で発現されれば、トランススプライシング反応が起こってリポーター分子をコードしうるキメラRNA分子が生じる。リポーター分子が検出されれば、基質、疾患または疾病の存在が示される。
例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、組成物を発現しうる組換え細胞、受容体により媒介されるエンドサイトーシス(例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照)、レトロウイルスその他のベクターの一部としての核酸の構築、DNA注入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションなど、種々の送達系が知られており、本発明の組成物を細胞へ導入するのに用いることができる。
当技術分野で利用可能な宿主細胞への遺伝子送達の方法はいずれも本発明に従って使用することができる。遺伝子送達法の一般的な総説としては、Strauss, M.およびBarranger, J.A., 1997, Concepts in Gene Therapy, by Walter de Gruyter & Co., Berlin; Goldspielら, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 33:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932;ならびにMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; 1993, TIBTECH 11(5):155-215を参照。方法例を以下に記載する。
特定の実施形態では、核酸は直接in vivo投与し、そこで発現させてPTMを産生させる。これは例えばそれを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内に存在するように投与することにより、あるいは例えば欠陥または弱毒化レトロウイルスその他のウイルスベクターを用いた感染(米国特許第4,980,286号参照)により、あるいは裸のDNAの直接注入により、あるいは微粒子衝撃(例えば、遺伝子銃; Biolistic, Dupont)の使用により、あるいは脂質もしくは細胞表面受容体またはトランスフェクション剤によるコーティング、あるいはリポソーム、微粒子またはマイクロカプセルへの封入により、あるいは核へ入ることが知られているペプチドに結合させて投与することにより、あるいは受容体媒介エンドサイトーシスを受けるリガンドへ結合させて投与する(例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)ことによるなど、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかによって達成することができる。
特定の実施形態では、PTMを含むウイルスベクターを使用することができる。例えば、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組み込みに必要でないレトロウイルス配列を削除するように改変されたレトロウイルスベクターを用いることができる(Millerら, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599参照)。あるいは、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターを細胞または組織への遺伝子送達に使用することができる(アデノウイルスに基づく遺伝子送達の総説としてはKozarskyおよびWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503参照)。
細胞へのPTM送達に対する別のアプローチとしては、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法により組織培養細胞へPTMを導入することを含む。
本発明はまた、有効量のPTMまたはPTMをコードする核酸および許容される担体を含んでなる医薬組成物も提供する。特定の実施形態では、「医薬上許容される」とは、連邦政府または州政府の規制機関によって認可されているか、または米国薬局方またはその他動物用、より好ましくはヒト用として汎用されている薬局方に挙げられていることを意味する。「担体」とは、PMTとともに投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルをさす。好適な医薬担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。
PTM分子を試験サンプルまたは被験体と接触させたところで、リポーター分子の発現を検出するために細胞をイメージングするかまたはアッセイする。リポーター分子がイメージングのための標識を提供しない場合は、酵素基質またはトレーサー分子を加えてリポーター分子の発現を検出する。トレーサー分子は、限定されるものではないが、蛍光、生物発光および放射性標識をはじめとする種々の異なる方法で標識することができる。トレーサーはリポーター分子と結合し、それにより標的プレmRNAを発現する細胞に対してシグナルを提供するようデザインする。
細胞は当技術分野で周知の様々な方法を用いてイメージングすることができる。このような方法としては、例えば、CCD高感度モニターシステム、陽電子放射断層撮影法(positron emission tomography, PET)、単一光子放射型コンピューター断層写真法(single photon emission computed tomography, SPECT)、磁気共鳴イメージング(magnetic resonance imaging, MRI)、超音波(US)、および内視鏡光断層法が挙げられる。
診断用途の他、本発明は、例えば作物植物などの植物において特定の遺伝子発現を検出するために用いてもよい。このような特定の遺伝子発現は植物病原体によってコードされるRNAの発現、または感染もしくは傷害に応答して植物体内で活性化される遺伝子の発現を含む。
本発明の方法および組成物はまた、生物が特定の化合物に曝されたかどうかを示すようにデザインされた検出系において用いてもよい。このような化合物としては、例えば、毒性および／または非毒性化合物が含まれる。本発明のかかる実施形態では、PTMは、その発現が化合物暴露により誘導される特定の標的プレmRNAに相補的な標的結合ドメインを含むようにデザインされる。
本発明のさらにもう一つの実施形態では、遺伝子発現をモジュレートしうる因子の同定のためのスクリーニングアッセイが提供される。本発明のアッセイは、(i)目的のプレmRNAをターゲットし、かつ、リポーター分子を発現しうるPTMを含む細胞と被験因子とを接触させ；(ii)細胞内で発現したリポーター分子のレベルを測定し、そのレベルと被験因子の不在下で得られたレベルとを比較することを含んでなり、被験因子の不在下と比較して被験因子の存在下のリポーター分子の量に違いがあれば、それは遺伝子発現をモジュレートしうる因子が同定されたことを示す。
6. ルシフェラーゼの外来発現遺伝子へのトランススプライシング
次の実施例はリポーター分子をコードするようデザインされたPTMの生産について記載する。
次の実施例はリポーター分子をコードするようデザインされたPTMの生産について記載する。
6.1. 材料及び方法
6.1.1. PTMのデザインおよび構築
PTMの結合ドメインはPCR産物またはアニーリングされたオリゴヌクレオチドのいずれかから構築する。ホタルルシフェラーゼのコード配列は市販のプラスミドcDNA (Promega)を用いてPCRにより作製する。トランススプライシングに先立ちPTMの自己発現の可能性を小さくするため、PCR増幅の際にコード配列からイニシエーターAUG コドンを削除してもよい。一例として、図3に示されたLuc-PTM1は、β-HCG6イントロン1に相補的な100〜200ntのアンチセンス標的結合ドメイン、スペーサー配列、酵母分岐点コンセンサス配列(UACUAAC)、延長ポリピリミジントラクト(12〜15ピリミジン)、3'アクセプター部位(AG ジヌクレオチド)、それに続く、開始コドンを除くホタルルシフェラーゼの完全コード配列からなる。ユニーク制限部位は各PTMエレメントの間に位置して個々のエレメントの置換を促進する。さらに、結合ドメインはリポーター遺伝子の読み枠から外れて転写を開始する代替部位を含んでもよく、それにより非スプライシングPTMの翻訳および発現は妨げられる。
6.1.1. PTMのデザインおよび構築
PTMの結合ドメインはPCR産物またはアニーリングされたオリゴヌクレオチドのいずれかから構築する。ホタルルシフェラーゼのコード配列は市販のプラスミドcDNA (Promega)を用いてPCRにより作製する。トランススプライシングに先立ちPTMの自己発現の可能性を小さくするため、PCR増幅の際にコード配列からイニシエーターAUG コドンを削除してもよい。一例として、図3に示されたLuc-PTM1は、β-HCG6イントロン1に相補的な100〜200ntのアンチセンス標的結合ドメイン、スペーサー配列、酵母分岐点コンセンサス配列(UACUAAC)、延長ポリピリミジントラクト(12〜15ピリミジン)、3'アクセプター部位(AG ジヌクレオチド)、それに続く、開始コドンを除くホタルルシフェラーゼの完全コード配列からなる。ユニーク制限部位は各PTMエレメントの間に位置して個々のエレメントの置換を促進する。さらに、結合ドメインはリポーター遺伝子の読み枠から外れて転写を開始する代替部位を含んでもよく、それにより非スプライシングPTMの翻訳および発現は妨げられる。
PTMの最適化： 以下に記載するようにルシフェラーゼPTMの特性を向上させるためにいくつかのアプローチをとることができる。
結合ドメイン： いくつかの異なる形態の結合ドメインを使用できる。プレスクリーニングモデルとしてlacZを用い(図５)、より短い結合ドメインを有するPTMに比べて、より長い結合ドメインを有する数種のPTMが、より高い頻度で目的の標的プレmRNAへとトランススプライシングされたことが証明された(Puttarajuら, 2001)。このデータは、結合ドメインが長いほどPTMと標的との相互作用が増大しうることを示唆している。標的とPTMの間の相互作用の増大はトランススプライシング反応の効率および特異性の双方を高めうる。
まず、100〜200ヌクレオチドにわたる結合ドメインを有するPTMを構築し、アッセイする。また、ステムループ結合ドメインを有するセーフティーPTMを作製してもよい。トランススプライシング反応の効率に基づき、必要であれば、これより長い結合ドメイン(200〜400nt)を用いることもできる。結合ドメインはまた、同じイントロンの異なる領域、例えば受容部位よりも供与部位に近い結合ドメイン、または完全に異なるイントロンにターゲットされる結合ドメインをターゲットするようデザインすることができる。
PTMシススプライシングのスクリーニング： 結合をターゲットするのに先立ち、PTMのトランススプライシングドメイン(TSD)におけるシススプライシングの可能性を小さくするため、TSD配列を、可能性のある5’および3’潜在スプライス配列 (GU-AGおよびAT-AC, U12型イントロン)が存在するかどうかについて結合ドメインの構築に先立ってアッセイした。これは特に直鎖結合ドメインPTM(下記参照)にとって重要であるが、これはそれらの意図されるスプライス部位がいつでも結合スプライシング因子によって利用されうるからである。各場合について、3’潜在スプライス部位として用いられる可能性のあるTSD中の単一部位は通常、TAG/GからTTGCへ変更される。このPTMは予測できない大きさの主要産物(シスまたはトランス)が存在するかどうかを確認するRT-PCRによりスクリーニングすることができる。PTMコード配列はまた、必要であれば同じようにしてスクリーニングし、さらに改変してもよい。
3’スプライスエレメント： また、分岐点(BP)、ポリピリミジントラクト(PPT)および3’受容部位(AGジヌクレオチド)を含む3’スプライスエレメントを含んでもよい。トランススプライシングはBPの配列、ならびにPPTの長さおよび組成を変更することによりモジュレートすることができる。酵母コンセンサス分岐点配列UACUAACは哺乳類細胞におけるトランススプライシング率の向上をもたらす(Puttarajuら, 1999)。
「セーフティー」ステムによる特異性のモジュレート： トランススプライシング効率を最大にするため、「直鎖」PTMを用いて最初の実験を行うことができる。直鎖PTMは標的への塩基対合およびトランススプライシング効率を最大にするために一本鎖構造で存在するようにデザインされた結合ドメインを有する。より高い程度のターゲット特異性およびトランススプライシングを達成するため、トランススプライシングドメインを、結合をターゲットするのに先立ちスプライセオソーム成分由来のPTMに含まれている3’スプライシングエレメントをマスクするようデザインされた分子内ステム(「セーフティーPTM」と呼ばれる)を含むようにデザインする。PTM結合ドメインのフリーの部分と標的との間の塩基対合は、セーフティーステムの巻き戻しを促進し、その結果スプライシング因子がスプライス部位に接近して結合し、トランススプライシングを誘導することを可能とすると考えられる。セーフティー機構の模式図は図４に示されている。一連のセーフティーPTMのデザインは、セーフティーステムの強度を変化させ、トランススプライシング効率と特異性を評価することにより、構築および試験する。例えば、CFTRプレmRNAをターゲットするセーフティーPTMとしては、特異性が向上し、その親PTMと同等のトランススプライシング効率を有するものがデザインされている(Mansfieldら, 2000)。
非翻訳領域： また、RNAのプロセッシングおよび安定性を増強するため、3’UTRおよびRNAプロセッシングシグナルの改変を行う。トランススプライシングメッセージの安定性、最終的にはルシフェラーゼ活性のレベルを増強するため、選択的ポリアデニル化シグナルを3’非翻訳配列において遺伝子工学的に操作してもよい。トランススプライシングされたmRNAの3’末端切断およびポリアデニル化の効率を最大にするため、各PTM構築物を、ポリAシグナルの下流にGTリッチ配列(コンセンサスYGTGTTYY)を含めることにより改変することができる。このコンセンサスは、最初に単純ヘルペスウイルス遺伝子で同定され、多くの哺乳類遺伝子に存在していることが示されている。他の改変も可能である。
6.1.2. 細胞モデル
上記のPTM改変を次の細胞に基づくモデルで試験する。CaSkiおよびSiHa細胞をはじめとする、HPV感染／発現細胞系は、それぞれ高レベルおよび低レベルのHPV RNAを発現する子宮頚癌細胞系である。β-HCG6細胞系としてはH1299が挙げられ、これは低レベルの標的転写物を発現する肺腺癌細胞系である。JEG-3は極めて高レベルのβ-HCG6 mRNAを発現する絨毛癌腫細胞系である。EGFR発現細胞株としては、EGFRおよびMCF7を過剰発現する上皮様癌腫細胞系であるA431が挙げられる。上皮乳癌細胞系は癌の研究に広く用いられている。さらに、Ecclesらは、種々のレベルのEGFRを発現した種々の腫瘍細胞系で報告している(O-Charoenratら, 2000)。
上記のPTM改変を次の細胞に基づくモデルで試験する。CaSkiおよびSiHa細胞をはじめとする、HPV感染／発現細胞系は、それぞれ高レベルおよび低レベルのHPV RNAを発現する子宮頚癌細胞系である。β-HCG6細胞系としてはH1299が挙げられ、これは低レベルの標的転写物を発現する肺腺癌細胞系である。JEG-3は極めて高レベルのβ-HCG6 mRNAを発現する絨毛癌腫細胞系である。EGFR発現細胞株としては、EGFRおよびMCF7を過剰発現する上皮様癌腫細胞系であるA431が挙げられる。上皮乳癌細胞系は癌の研究に広く用いられている。さらに、Ecclesらは、種々のレベルのEGFRを発現した種々の腫瘍細胞系で報告している(O-Charoenratら, 2000)。
6.1.3. トランススプライシングの分析：内因性転写物のターゲット
細胞を、リポフェクタミンまたはトランスファスト試薬を用いてPTMプラスミドでトランスフェクトする。トランススプライシング効率および特異性を、細胞のルシフェラーゼ活性アッセイおよびRT-PCR分析(一時的トランスフェクトまたはネオマイシン選択集団)を行うことにより評価する。
細胞を、リポフェクタミンまたはトランスファスト試薬を用いてPTMプラスミドでトランスフェクトする。トランススプライシング効率および特異性を、細胞のルシフェラーゼ活性アッセイおよびRT-PCR分析(一時的トランスフェクトまたはネオマイシン選択集団)を行うことにより評価する。
ルシフェラーゼ活性アッセイ： まず、トランススプライシングにより媒介されるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)を用いて細胞抽出液についてモニターする。必要であれば、トランススプライシングの特異性を評価する手段として二重リポーターを用いる。このアプローチにより、細胞の生存性、トランスフェクション効率および細胞溶解効率の違いによって生じる実験変動を考慮するのに有用な内部標準を提供する。これらの研究は、例えばホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼをはじめとするルシフェラーゼに基づくPTMを用いて行う。各マーカーは区別可能な動態および発光スペクトル、類似性のない構造、異なる基質要求性、それら個々の生物発光反応間を選択的に識別可能とする特性を有する。ルシフェラーゼと標的との間のキメラ産物が組換え産生されない可能性を排除するため対照試験を行う。
トランスフェクトした細胞をCCD高感度モニターシステムを用いてイメージングする。さらに、標的とPTM特異的プライマーを用いた全RNAサンプルのリアルタイム定量的RT-PCR分析により、トランススプライシング効率をRNAレベルで測定する。
まず、安定的に組み込まれたミニ遺伝子構築物から標的RNAを発現する細胞系を用い、最もよいPTM候補をプレmRNA標的に対して選択するのがより効率的でありうる。この系の利点としては以下のようなものが挙げられる：(i)これらの細胞系は内生系を再現するゲノム遺伝子座から標的RNAを発現すること；(ii)これらの細胞はトランスフェクトが容易であること；および(iii)高レベルの標的転写物を産生し、そのため迅速かつ容易にPTM間の効率および特異性の違いを評価できること。また、異なるレベルの標的プレmRNAを発現するか、または発現レベルをモジュレートする誘導性プロモーターを用いる細胞系を用いてもよい。誘導性プロモーターはトランススプライシングの感受性の決定および標的mRNA濃度とルシフェラーゼシグナルの相関付けを容易にする。
また、β-ガラクトシダーゼ修復モデルに基づいた簡単なプレスクリーニングモデル(Puttarajuら, 2001)(図5A)も使用できる。この系はβ-HCG6、HPVまたはEGFR由来の標的イントロンを突然変異ルシフェラーゼ遺伝子へ挿入することを含む。この標的は安定細胞系で確立されるか、またはPTMとともに同時トランスフェクトする。効率はRT-PCRおよびルシフェラーゼ活性アッセイにより迅速に評価される。このタイプの系はPTM結合ドメイン配列のプレスクリーニングとして極めて有用であることが分かっている(Puttarajuら, 2001)。
7. 実施例：トランススプライシングについてのルシフェラーゼモデル
遺伝子発現のリアルタイム分子イメージングに対するスプライセオソームにより媒介されるRNAトランススプライシングの使用の可能性を評価するため、ルシフェラーゼスクリーニングモデルを開発した。細胞および小動物モデルにおいてトランススプライシングにより生じるルシフェラーゼのレベルを定量するため、ヒトパピローマウイルス(HPV)由来のHPV E7のコード配列およびE7のすぐ上流にあるHPVの配列に連結した合成ウミシイタケ・ルシフェラーゼ配列の一部を発現するプレmRNA標的を構築した(図６)。このキメラプレmRNA標的は通常のシススプライシングを受けてmRNAを生じるが、ルシフェラーゼ活性は持たない。標的イントロンと塩基対を形成し、3’ルシフェラーゼの「エキソン」を、ルシフェラーゼ活性を生じうる全長ルシフェラーゼmRNAを生じる標的へとトランススプライシングするはずのプレ-トランススプライシング分子(PTM)を作製した(図７および８)。このPTM(Luc-PTM13)は、HPV mRNAのイントロン1に相補的な80bpのターゲッティングドメイン、分岐点(UACUAAC)およびポリピリミジントラクト、AGジヌクレオチドアクセプター、続いて3’ヘミルシフェラーゼ「エキソン」を含む。この領域はHPV mRNA中のこの臨床上関連のあるスプライス部位をターゲットする結果に基づいて選択されたものであり、細胞培養モデルでは70%という高いトランススプライシング効率が達成された。また、分岐点およびポリピリミジン配列の双方を欠失させることにより、スプライス変異体を構築した。これらの構築物を用い、ヒト細胞において、ルシフェラーゼPTM13(Luc-PTM13)の、HPV-LucT1標的への正確なトランススプライシングを証明した。ヒト胎児腎細胞を、いずれかの標的で、または対照としてはPTM単独でトランスフェクトするか、あるいは標的およびPTM発現プラスミドの双方で同時トランスフェクトした。個別のトランスフェクションにて、標的とスプライス変異体PTMを同時トランスフェクトした。標的およびPTM特異的プライマーを用い、全RNAのRT-PCR分析を行ったところ、標的およびPTMの双方を含んでいた細胞でだけ予測されたトランススプライシング産物(435bp)が生じ、対照(標的、PTM単独、および標的＋スプライス変異体PTM)では生じなかった(図９)。
遺伝子発現のリアルタイム分子イメージングに対するスプライセオソームにより媒介されるRNAトランススプライシングの使用の可能性を評価するため、ルシフェラーゼスクリーニングモデルを開発した。細胞および小動物モデルにおいてトランススプライシングにより生じるルシフェラーゼのレベルを定量するため、ヒトパピローマウイルス(HPV)由来のHPV E7のコード配列およびE7のすぐ上流にあるHPVの配列に連結した合成ウミシイタケ・ルシフェラーゼ配列の一部を発現するプレmRNA標的を構築した(図６)。このキメラプレmRNA標的は通常のシススプライシングを受けてmRNAを生じるが、ルシフェラーゼ活性は持たない。標的イントロンと塩基対を形成し、3’ルシフェラーゼの「エキソン」を、ルシフェラーゼ活性を生じうる全長ルシフェラーゼmRNAを生じる標的へとトランススプライシングするはずのプレ-トランススプライシング分子(PTM)を作製した(図７および８)。このPTM(Luc-PTM13)は、HPV mRNAのイントロン1に相補的な80bpのターゲッティングドメイン、分岐点(UACUAAC)およびポリピリミジントラクト、AGジヌクレオチドアクセプター、続いて3’ヘミルシフェラーゼ「エキソン」を含む。この領域はHPV mRNA中のこの臨床上関連のあるスプライス部位をターゲットする結果に基づいて選択されたものであり、細胞培養モデルでは70%という高いトランススプライシング効率が達成された。また、分岐点およびポリピリミジン配列の双方を欠失させることにより、スプライス変異体を構築した。これらの構築物を用い、ヒト細胞において、ルシフェラーゼPTM13(Luc-PTM13)の、HPV-LucT1標的への正確なトランススプライシングを証明した。ヒト胎児腎細胞を、いずれかの標的で、または対照としてはPTM単独でトランスフェクトするか、あるいは標的およびPTM発現プラスミドの双方で同時トランスフェクトした。個別のトランスフェクションにて、標的とスプライス変異体PTMを同時トランスフェクトした。標的およびPTM特異的プライマーを用い、全RNAのRT-PCR分析を行ったところ、標的およびPTMの双方を含んでいた細胞でだけ予測されたトランススプライシング産物(435bp)が生じ、対照(標的、PTM単独、および標的＋スプライス変異体PTM)では生じなかった(図９)。
このRT-PCR産物の直接配列決定を行ったところ、標的とPTMの間の正確なトランススプライシングが確認された(図１０)。トランススプライシングにより媒介される機能回復の効率はルシフェラーゼ活性のアッセイによりタンパク質レベルで確認された。これらの結果は図１１にまとめられている。特定の標的とLuc-PTM13との同時トランスフェクションの結果、バックグラウンドに対し4 logのオーダーでルシフェラーゼ機能が修復および回復された。対照またはスプライス変異体PTMではバックグラウンドを超えるルシフェラーゼ活性を検出されなかったが、このことはルシフェラーゼ機能の回復がトランススプライシングによるものであることを示唆している(図１１)。
並行した研究で、完全なルシフェラーゼコード体(最初のATGコドンは除く)をβ-HCG6プレmRNA標的へとトランススプライシングするPTMを構築した。予備的結果は、これらのPTMが自己発現することを示唆している。これらのPTMは翻訳のためにルシフェラーゼのコード配列に含まれている内部メチオニンの1つを用いうるので、これはそれほど驚くべきことではない。これを回避するためには次のアプローチをとりうる：(1)ルシフェラーゼコード配列の例えば8位と27位のアミノ酸のメチオニンをイソロイシンへ変換する；(2) 5’末端に核保持シグナル(U6 snRNA)を付加してトランススプライシング前のPTMの運び出しを妨げる：および(3) PTMがトランススプライシンを受けずに細胞質へ運び出されるならば、読み枠を外れた翻訳を開始するようPTMをデザインする。
8. 実施例：合成PTM RNAを用いた細胞における遺伝子発現のイメージング
8.1. 材料および方法
8.1.1. RNAのin vitro転写および精製
鋳型DNA: T7プロモーターを含むプラスミド、pc3.1Luc-PTM13、pc3.1Luc-PTM14およびpc3.1Luc-13-BP/PPT(スプライス変異体PTM)を37℃にてHind III制限酵素で消化した。生成物を緩衝フェノール、次にクロロホルムで抽出するか、またはQiaquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製した。エタノール沈殿によりDNAを回収し、70%エタノールで2回洗浄し、5分間風乾し、無菌水に再懸濁し、in vitro転写に用いた。
8.1. 材料および方法
8.1.1. RNAのin vitro転写および精製
鋳型DNA: T7プロモーターを含むプラスミド、pc3.1Luc-PTM13、pc3.1Luc-PTM14およびpc3.1Luc-13-BP/PPT(スプライス変異体PTM)を37℃にてHind III制限酵素で消化した。生成物を緩衝フェノール、次にクロロホルムで抽出するか、またはQiaquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製した。エタノール沈殿によりDNAを回収し、70%エタノールで2回洗浄し、5分間風乾し、無菌水に再懸濁し、in vitro転写に用いた。
in vitro転写: 製造業者のプロトコール(Ambion)に従い、キャップ化RNAに対するMESSAGE mMACHINE高収率キャップ化RNA転写キットと1μgの直鎖化プラスミドDNA鋳型を用いて20μl反応液中でin vitro転写を行った。反応液を37℃で2〜3時間インキュベートした後、1μlのDNアーゼ1(2U/μ1)を添加し、37℃でさらに45分間インキュベーションを続けることによりDNA鋳型を破壊した。このポリAテール(約150〜200nt)は、ポリAテーリングキット(Ambion)を用い、反応液大腸菌(E. coli)ポリAポリメラーゼおよびATPを加えた反応液を37℃で60分間インキュベートすることにより、in vitro転写したRNAに付加した。氷上に試験管を置くことにより反応を停止させ、以下に記載のように精製した。
RNAの精製: in vitro転写されたポリAテールを有するRNAを、組み込まれなかった遊離のヌクレオチド、短いオリゴヌクレオチド、タンパク質およびRNA由来の塩を除去するようにデザインされたMEGAclear精製キット(Ambion)を用いて精製した。簡単に説明すると、RNAをフィルターカートリッジに結合させ、洗浄バッファーで洗浄し、低塩バッファーで溶出させた。
8.1.2. 合成RNAのトランスフェクション
トランスフェクション前日、1×106個の293T細胞を、10%FBSを添加した5mlのDMEM増殖培地の入った60mm組織培養プレートに播いた。細胞をCO2インキュベーター中、37℃で12〜14時間、あるいは約70〜80%コンフルエントになるまでインキュベートした。トランスフェクション前に、細胞を、血清を低減したOpti-MEM 1培地2mlで洗浄した。2ml試験管に1.7mlのOpti-MEM 1を加えた後、8μlのDMRIE-Cトランスフェクション試薬(Invitrogen)を加え、軽く混合することによりRNA-脂質複合体を調製した。in vitroで転写され、ポリAテールを付加し、精製したRNAを既知量で上記の混合物に加え、軽くボルテックスにかけてすぐに細胞へ滴下した。細胞を37℃で4時間インキュベートした後、トランスフェクション培地を完全増殖培地(10% FBSを含むDMEM)に置き換えた。さらに24〜48時間インキュベートした後、プレートをPBSで1回すすぎ、細胞を回収し、MasterPure RNA精製キット(Epicenter Technologies, Madison, WI)を用いて全RNAを単離した。RNA調製物中に混入しているDNAは、37℃で30〜45分間、DNアーゼ1で処理することにより除去し、RNA産物を該キットで推奨されている方法に従って精製した。
トランスフェクション前日、1×106個の293T細胞を、10%FBSを添加した5mlのDMEM増殖培地の入った60mm組織培養プレートに播いた。細胞をCO2インキュベーター中、37℃で12〜14時間、あるいは約70〜80%コンフルエントになるまでインキュベートした。トランスフェクション前に、細胞を、血清を低減したOpti-MEM 1培地2mlで洗浄した。2ml試験管に1.7mlのOpti-MEM 1を加えた後、8μlのDMRIE-Cトランスフェクション試薬(Invitrogen)を加え、軽く混合することによりRNA-脂質複合体を調製した。in vitroで転写され、ポリAテールを付加し、精製したRNAを既知量で上記の混合物に加え、軽くボルテックスにかけてすぐに細胞へ滴下した。細胞を37℃で4時間インキュベートした後、トランスフェクション培地を完全増殖培地(10% FBSを含むDMEM)に置き換えた。さらに24〜48時間インキュベートした後、プレートをPBSで1回すすぎ、細胞を回収し、MasterPure RNA精製キット(Epicenter Technologies, Madison, WI)を用いて全RNAを単離した。RNA調製物中に混入しているDNAは、37℃で30〜45分間、DNアーゼ1で処理することにより除去し、RNA産物を該キットで推奨されている方法に従って精製した。
8.1.3 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)
トランスフェクションから得られた全RNA(2.5μg)を、50単位のRNアーゼ阻害剤(Invitrogen)と200ngのLuc-11R PTM特異的プライマー(5'AAGCTTTTACTGCTCGTTCTTCAGCACGC)を添加し、製造業者のプロトコールに従って25μl反応液中でMMLV逆転写酵素(Promega)を用いてcDNAへ変換した。CDNA合成反応液を42℃で60分間インキュベートした後、95℃で5分間インキュベートした。このcDNA鋳型をPCR反応に用いた。PCR増幅は、50μlのPCR反応液当たり100ngのプライマーと1μlの鋳型 (RT反応液)を用いて行った。典型的な反応液には、約25ngのcDNA鋳型、100ngのプライマー：
Luc-33R (5'-CAGGGTCGGACTCGATGAAC)および
Luc-34F (5'-GGATATCGCCCTGATCAAGAG)、
1×REDTaq PCRバッファー(10mM Tris-HCl, pH8.3、50mM KCl、1.1 mM MnCl2および0.1% ゼラチン)、200μM dNTPsおよび1.5 単位のREDTaq DNAポリメラーゼ(Sigma, Saint Louis, Missouri)を含めた。PCR反応は、94℃で2分30秒の最初の予熱の後、94℃にて30秒(変性)、60℃にて36秒(アニーリング)および72℃にて1分(伸長)のサイクルを25サイクル、その後72℃で7分の最終伸長により行った。次に、このPCR産物を2%アガロースゲル上で分析し、DNAバンドを臭化エチジウム染色で可視化した。
トランスフェクションから得られた全RNA(2.5μg)を、50単位のRNアーゼ阻害剤(Invitrogen)と200ngのLuc-11R PTM特異的プライマー(5'AAGCTTTTACTGCTCGTTCTTCAGCACGC)を添加し、製造業者のプロトコールに従って25μl反応液中でMMLV逆転写酵素(Promega)を用いてcDNAへ変換した。CDNA合成反応液を42℃で60分間インキュベートした後、95℃で5分間インキュベートした。このcDNA鋳型をPCR反応に用いた。PCR増幅は、50μlのPCR反応液当たり100ngのプライマーと1μlの鋳型 (RT反応液)を用いて行った。典型的な反応液には、約25ngのcDNA鋳型、100ngのプライマー：
Luc-33R (5'-CAGGGTCGGACTCGATGAAC)および
Luc-34F (5'-GGATATCGCCCTGATCAAGAG)、
1×REDTaq PCRバッファー(10mM Tris-HCl, pH8.3、50mM KCl、1.1 mM MnCl2および0.1% ゼラチン)、200μM dNTPsおよび1.5 単位のREDTaq DNAポリメラーゼ(Sigma, Saint Louis, Missouri)を含めた。PCR反応は、94℃で2分30秒の最初の予熱の後、94℃にて30秒(変性)、60℃にて36秒(アニーリング)および72℃にて1分(伸長)のサイクルを25サイクル、その後72℃で7分の最終伸長により行った。次に、このPCR産物を2%アガロースゲル上で分析し、DNAバンドを臭化エチジウム染色で可視化した。
8.1.4 ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性のアッセイ
トランスフェクション48時間後、細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回すすぎ、標準的な手順に従って回収した。細胞ペレットを100μlの溶解バッファーに再懸濁して溶解し、ウミシイタケ(Renilla)・ルシフェラーゼ活性をTurner 20/20 TD照度計を用いてウミシイタケ(Renilla)・ルシフェラーゼアッセイ系(Promega, Madison, WI, USA)により測定した。
トランスフェクション48時間後、細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回すすぎ、標準的な手順に従って回収した。細胞ペレットを100μlの溶解バッファーに再懸濁して溶解し、ウミシイタケ(Renilla)・ルシフェラーゼ活性をTurner 20/20 TD照度計を用いてウミシイタケ(Renilla)・ルシフェラーゼアッセイ系(Promega, Madison, WI, USA)により測定した。
8.2 結果
in vitroで合成したPTM RNAを遺伝子材料として用い、合成PTMをヒト細胞における遺伝子発現のイメージングに使用できることが実証された。上記のように、トランススプライシングにより生じた合成ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性のレベルを定量するため、合成ウミシイタケ・ルシフェラーゼモデル系を開発した(図８参照)。合成PTMの使用を実証するため、Luc-PTM13、Luc-PTM14、Luc-13ΔBP/PPT(図12)およびHPV-ルシフェラーゼキメラ標的(HPV-LucT1) RNA(キャップ化され、ポリAテールが付加されたもの)を、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを用いてin vitroで合成した。混入しているDNAはRNアーゼフリーDNアーゼ1で処理することにより破壊し、RNAを精製してトランスフェクションに用いた。
in vitroで合成したPTM RNAを遺伝子材料として用い、合成PTMをヒト細胞における遺伝子発現のイメージングに使用できることが実証された。上記のように、トランススプライシングにより生じた合成ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性のレベルを定量するため、合成ウミシイタケ・ルシフェラーゼモデル系を開発した(図８参照)。合成PTMの使用を実証するため、Luc-PTM13、Luc-PTM14、Luc-13ΔBP/PPT(図12)およびHPV-ルシフェラーゼキメラ標的(HPV-LucT1) RNA(キャップ化され、ポリAテールが付加されたもの)を、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを用いてin vitroで合成した。混入しているDNAはRNアーゼフリーDNアーゼ1で処理することにより破壊し、RNAを精製してトランスフェクションに用いた。
トランスフェクションは上記のようにDIMRE-C試薬を用いて行った。トランスフェクション48時間後、全細胞RNAを MasterPure RNA単離キットを用いて単離し、上記のようにして標的(Luc-34F)およびPTM (Luc-33R)特異的プライマーをを用いてRT-PCRにより分析した。図１３に示されるように、模擬体(Mock)、標的またはPTM単独の対照トランスフェクションからのRNAサンプルでは産物は検出されなかった(図１〜４)。HPV-ルシフェラーゼ標的と機能的PTMで同時トランスフェクトされた細胞由来のRNAには、特異的な298bpの産物が産生された(図１３のレーン６および７)。このような産物は、標的とスプライス変異体PTM(Luc13ΔPB/PPT)[機能的3’スプライス部位を含まない(分岐点もポリピリミジントラクトも含まない)]で同時トランスフェクトされた細胞由来のRNAでは検出されなかった(レーン５)。これらの結果は、トランススプライシングにとっては分岐点とピリミジントラクトの双方が重要であることを実証するだけでなく、298bpの産物の生成がトランススプライシングによるものであることも確認するものである。HPV-LucT1標的プレmRNAとLuc-PTM13およびLuc-PTM14の間のトランススプライシングの正確性はRT-PCR産物の直接配列決定により確認された。
トランススプライシングにより媒介されるmRNA修復と合成ウミシイタケ・ルシフェラーゼ機能の回復の効率は酵素活性のアッセイによって確認された。図１４に示すように、標的またはPTM単独対照トランスフェクションにおける合成ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性は、本質的に模擬体トランスフェクションで見られるバックグラウンドレベルであった。Luc-PTM13またはLuc-PTM14とともに特異的HPV-ルシフェラーゼ標的(HPV-LucT1)を同時トランスフェクションしたところ、標的プレmRNAが修復され、合成ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性が、同じ実験条件下で、スプライス変異体PTMにおいて見られるバックグラウンドの2000倍のレベルまで回復した。これらの結果は、合成PTMが遺伝子発現のイメージングに首尾良く使用できることを実証した。
9. 実施例: 3’エキソンの置換によるイメージング
PTMはAUG開始コドンを除いたホタルルシフェラーゼの完全コード体を含む。このトランススプライシングドメインは一連の強力な3’スプライスエレメント(酵母コンセンサス分岐点、長いピリミジントラクトおよび3’受容部位を含む)、スペーサー配列、およびヒトパピローマウイルス(HPV)のエキソンE6またはE7の間のイントロンの3’末端に相補的な125ヌクレオチドの結合ドメインからなる(図１５)。このPTMのトランススプライシングモデルは図１６に示されている。トランススプライシングの不在下でのPTM翻訳を防ぐため、PTMコードの5’末端のいくつかのメチオニンを修飾した。これは部位指定突然変異誘発によって行い、メチオニンを保存的置換と考えられるコドン(他のルシフェラーゼ遺伝子とのアミノ酸アライメントに基づいて)へ変換した。
PTMはAUG開始コドンを除いたホタルルシフェラーゼの完全コード体を含む。このトランススプライシングドメインは一連の強力な3’スプライスエレメント(酵母コンセンサス分岐点、長いピリミジントラクトおよび3’受容部位を含む)、スペーサー配列、およびヒトパピローマウイルス(HPV)のエキソンE6またはE7の間のイントロンの3’末端に相補的な125ヌクレオチドの結合ドメインからなる(図１５)。このPTMのトランススプライシングモデルは図１６に示されている。トランススプライシングの不在下でのPTM翻訳を防ぐため、PTMコードの5’末端のいくつかのメチオニンを修飾した。これは部位指定突然変異誘発によって行い、メチオニンを保存的置換と考えられるコドン(他のルシフェラーゼ遺伝子とのアミノ酸アライメントに基づいて)へ変換した。
可能性のある1つの問題として、PTM自体が翻訳される場合があるということがある。3’エキソン置換ルシフェラーゼPTMは完全ルシフェラーゼコード体(AUG開始コドンを除く)を含むが、全長cDNAの断片は含まないことから(一番最初のPTMの場合と同様)、トランススプライシングの不在下で非スプライシングPTMが細胞質に輸送され、翻訳されるという問題はない。こうして、5’エキソン置換を遂行できるウミシイタケ・ルシフェラーゼに基づくPTMが作製された。この形態のPTMは、ポリAシグナルを含めずに構築物を作製することができることから、PTM翻訳を減少させるという利点の可能性を有する。このシグナルの不在下では、RNAは適切にプロセッシングおよび翻訳を受けることができない。
ウミシイタケ・ルシフェラーゼ5’エキソン置換PTMの構造は図１８に示されている。それは、ミニイントロンによって隔てられた、2つの「エキソン」に分割されたウミシイタケ・ルシフェラーゼの全長コードからなる。このトランススプライシングドメインは、コンセンサス5’供与部位、短いスペーサー配列、およびヒトパピローマウイルス(HPV)のエキソンE6またはE7の間のイントロンの3’末端に相補的な結合ドメインを含む。このPTMのトランススプライシングモデルを図１９に示す。
ホタルルシフェラーゼPTMを、293T細胞中に、HPVミニ遺伝子標的(図１６参照)とともに、またはそれを伴わずに同時トランスフェクトした。48時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。これらの実験により、標的を含むサンプルは約2倍高い活性をもたらしたこと（これはミニ遺伝子標的でもトランススプライシングが起こったことを示唆する)、およびPTMの翻訳が減少したことが示された(図１７参照)。
10. 実施例: ヘミリポーターモデル標的およびPTM
図２０は、遺伝子発現のイメージングに用いたヘミリポーターモデル標的およびPTMを示している。ミニ遺伝子プレmRNA標的は、ヒトパピローマウイルス(HPV16)のE6〜E7イントロン領域および隣接するE7コード配列に連結された、「5’エキソン」として機能するヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼ(hRluc)の5’部分からなる。
図２０は、遺伝子発現のイメージングに用いたヘミリポーターモデル標的およびPTMを示している。ミニ遺伝子プレmRNA標的は、ヒトパピローマウイルス(HPV16)のE6〜E7イントロン領域および隣接するE7コード配列に連結された、「5’エキソン」として機能するヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼ(hRluc)の5’部分からなる。
図２０に示されているように、リポーター分子の残りの部分からなるPTMを、mRNAを修復し機能を回復するように作製した。「HPV」標的イントロンに相補的な「結合ドメイン」、3’スプライス部位(BP、PPTおよびアクセプターAGヌクレオチドからなる)、および3’エキソンとしての残りのhRL配列からなるいくつかのPTMを構築した。これらのPTM間の唯一の違いは「3’エキソン」の大きさであり、255nt〜50ntの範囲である。その結合ドメインによって、PTMは標的プレmRNAと塩基対を形成し、一緒に局在することが期待される。これは標的「5’エキソン」とPTMの「3’エキソン」のスプライス部位間でのトランススプライシングを促進し、これにより標的プレmRNAが修復され、酵素活性が生じる。
PTM14、PTM28およびPTM37のトランススプライシング効率を比較するため、ヒト胎児腎(293T)細胞を標的および上記のPTMでトランスフェクトした。トランスフェクション48時間後、全細胞RNAを単離し、標的およびPTM特異的プライマーを用いてRT-PCRにより分析した。半定量評価に基づけば、Luc-PTM28およびLuc-PTM37はLuc-PTM14に比べてより効率的なトランススプライシング(約2〜4倍)を示した(図２１)。なお、大きなPTMよりも小さなPTMの方が効率的にトランススプライシングされた。
トランススプライシングにより媒介されるmRNAの修復およびルシフェラーゼ機能の回復の効率を酵素活性のアッセイにより確認した。図２２に示されるように、標的またはPTM単独対照トランスフェクションでのルシフェラーゼ活性は、本質的に模擬体トランスフェクションにおいて見られるバックグラウンドレベルである。特定のHPV-ルシフェラーゼヘミリポーター標的、HPV-LucT1、HPV-LucT2またはHPV-LucT3をそれぞれLuc-PTM14、Luc-PTM28またはLuc-PTM37とともに同時トランスフェクトしたところ、プレmRNA標的の効率的な修復がもたらされ、バックグラウンドに対して3〜4 logのオーダーでルシフェラーゼ活性が回復した(図２２)。Luc-PTM37により生じたルシフェラーゼ活性はLuc- PTM14に比べて約3倍高い。
11. 実施例: 全長リポーターPTMを用いた遺伝子発現のイメージング
全長イメージングPTM(Luc-PTM27)は、AUG開始コドンを除いたヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼ(hRL)の完全コード配列を含む。トランススプライシングドメインは、強力な3’スプライスエレメント(酵母コンセンサス分岐点(BP)、長いピリミジントラクト(PPT)および3’受容部位を含む)、スペーサー配列およびヒトパピローマウイルス（HPV-16)のエキソンE6とE7の間のイントロンの3’末端に相補的な80ヌクレオチドの結合ドメイン(BD)からなる(図２３Ａ)。トランススプライシングにより媒介されるルシフェラーゼ機能の模式図は図２３Ｂに示されている。
全長イメージングPTM(Luc-PTM27)は、AUG開始コドンを除いたヒト化ウミシイタケ・ルシフェラーゼ(hRL)の完全コード配列を含む。トランススプライシングドメインは、強力な3’スプライスエレメント(酵母コンセンサス分岐点(BP)、長いピリミジントラクト(PPT)および3’受容部位を含む)、スペーサー配列およびヒトパピローマウイルス（HPV-16)のエキソンE6とE7の間のイントロンの3’末端に相補的な80ヌクレオチドの結合ドメイン(BD)からなる(図２３Ａ)。トランススプライシングにより媒介されるルシフェラーゼ機能の模式図は図２３Ｂに示されている。
全長イメージングPTMを、HPVミニ遺伝子標的とともに、またはそれを伴わずに293細胞へ同時トランスフェクトした。トランスフェクション48時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。図２４に示された結果は、標的を含む細胞が約3倍高いルシフェラーゼ活性を生じたことを示し、これはHPVミニ遺伝子標的とPTMの間の適切なトランススプライシングを示唆するものである。これらの結果はまた、この特定のPTMが(標的の不在下で)リポーターを発現することも示し、このことは一つには(i)PTMの直接翻訳、(ii)PTMのシススプライシングと翻訳、または(iii)非特異的トランススプライシングによるものでありうる。
ルシフェラーゼ機能の回復がRNAのトランススプライシングによるものであるかどうかを調べるため、ルシフェラーゼスプライス変異体PTMを構築した(図２５Ｂ)。このPTMは、BP、PPTおよびアクセプターAGジヌクレオチドなどの3’スプライスエレメントがPCR突然変異誘発により改変され、配列決定により確認されたLuc-PTM38の誘導体(図２５Ａ)である。
293T細胞に対し、機能的PTMまたはスプライス変異体PTMのいずれかを用いて、HPVミニ遺伝子標的とともに、またはそれを伴わずに同時トランスフェクトした。48時間後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ機能をアッセイした。図２６に示されているように、スプライス変異体PTMでトランスフェクトした細胞、そして、HPVミニ遺伝子標的とともに、またはそれを伴わずにトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性は、模擬体トランスフェクションにおいて見られたバックグラウンドと同等である。これに対し、Luc-PTM38(機能的PTM)および標的で同時トランスフェクトされた細胞は、PTM38単独の場合に比べて約4〜5倍高いルシフェラーゼ活性をもたらした。
12. 実施例: 遺伝子発現のin vivoイメージング
mRNA発現を検出し、そのレベルを定量することができるイメージング法は、感染性疾患、増殖性疾患、神経疾患および代謝障害などの疾病に関連するものをはじめとする遺伝子のin vivo発現を検出するのに有用である可能性がある。下記の結果は、スプライセオソームにより媒介されるRNAトランススプライシングにより首尾よく遺伝子発現のin vivo検出ができることを示している。下記の実験結果は、リポーター分子配列をターゲットし、目的の内在性プレmRNAへとトランススプライシングして、スプライセオソームにより媒介されるRNAトランススプライシングによりリポーター遺伝子をコードするキメラmRNAを生じうるPTMを、首尾よく開発できることを示している。このアプローチはリポータータンパク質のイメージングによってmRNAレベルを間接的にイメージングする方法を提供する。mRNAをターゲットするためにアンチセンス分子を用いるイメージングアプローチとは対照的に、スプライセオソームにより媒介されるRNAのトランススプライシングは直接的なシグナル増幅をもたらす。
mRNA発現を検出し、そのレベルを定量することができるイメージング法は、感染性疾患、増殖性疾患、神経疾患および代謝障害などの疾病に関連するものをはじめとする遺伝子のin vivo発現を検出するのに有用である可能性がある。下記の結果は、スプライセオソームにより媒介されるRNAトランススプライシングにより首尾よく遺伝子発現のin vivo検出ができることを示している。下記の実験結果は、リポーター分子配列をターゲットし、目的の内在性プレmRNAへとトランススプライシングして、スプライセオソームにより媒介されるRNAトランススプライシングによりリポーター遺伝子をコードするキメラmRNAを生じうるPTMを、首尾よく開発できることを示している。このアプローチはリポータータンパク質のイメージングによってmRNAレベルを間接的にイメージングする方法を提供する。mRNAをターゲットするためにアンチセンス分子を用いるイメージングアプローチとは対照的に、スプライセオソームにより媒介されるRNAのトランススプライシングは直接的なシグナル増幅をもたらす。
ヒトパピローマウイルス(HPV)E6およびE7のコード配列、ならびにすぐ上流のイントロン配列に連結されたhRluc配列の5’部分を持ったプレmRNA標的を構築した。HPV-LucT1のシススプライシングはhRluc活性を生じない。3’エキソンとして残りのhRluc配列を含むいくつかのPTMを遺伝子操作した。そのターゲッティングドメインを介して、PTMはHPV-LucT1イントロンと塩基対を形成し、3’ルシフェラーゼエキソンをトランススプライシングし、それによりプレmRNA標的を修復し、続いて酵素活性を回復する。これらのPTMはHPV-LucT1のイントロンに相補的なターゲッティングドメイン、分岐点(BP)およびピリミジントラクト(Py)を含む。In vivo適用のためには、PTMをトランスフェリンポリエチリンアミン(Tf-PEI)(Hildebrandt, I.ら, 2002, Molecular Therapy 5: S421)とともに複合体化した。
遺伝子発現のin vivoイメージングを試験するため、1日目に2.5×106個の293T細胞をPTM14、標的または標的+PTM14(10μg/プレート)でトランスフェクトした。PTMと標的の比率は1:1とした。2日目に、細胞をPBSで洗浄し、1×106細胞をマウスに皮下注射した。3日目、コエレンテラジン基質を尾静脈から注射した直後、冷却CCDカメラを用いて細胞をイメージングした(Bhaumik & Gambhir, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:377-382)。図２７に示されているように、標的(T)またはPTM(P)単独でトランスフェクトされた細胞ではシグナルは検出されなかった。これに対して、標的とPTMで同時トランスフェクトされた細胞(T+P)では高いシグナルレベルが生じた。これらの結果はin vivoにおいてRNAトランススプライシングが首尾よく遺伝子発現をイメージングできることを明らかに示唆している。
もう1つの実験では、1日目に2.5×106個のN2a細胞をHPV-LucT1標的プラスミド(10μg)で一時的にトランスフェクトした。2日目に、細胞をPBSで洗浄し、約5×106個の細胞を3〜4週齢のヌードマウスに移植した。移植後、次に、トランスフェリンポリエチリンアミン(Tf-PEI)とコンジュゲートしたLuc-PTM-14 50μgを、マウスの尾静脈に注射した。3日目に、80μgのコエレンテラジン基質を尾静脈から注射した直後、冷却CCDカメラを用いてマウスを5分間イメージングした。図２８に示されているように、HPV-LucT1プレmRNA標的を発現する腫瘍はシグナルを生じ、それは統計学的に有意であった(P<0.05)。これに対し、N2a対照腫瘍ではシグナルは検出されなかった。図２８に示した結果は、標的細胞にPTMを静脈内送達した後のin vivoにおける遺伝子発現のイメージングを示す。
本発明は本明細書に記載の特定の実施形態に範囲を限定されるものではない。実際、当業者には以上の記載および添付の図面から、本明細書に記載されているものの他にも本発明の様々な改変が明らかになろう。このような改変も添付の特許請求の範囲内に入るものとする。本明細書には種々の参照文献が挙げられているが、それらの開示の全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (52)
- 核酸分子を含んでなる細胞であって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された標的プレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点、ピリミジントラクトおよび3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域；
c) 3’スプライス領域と標的結合ドメインを隔てるスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるリポーター分子をコードするヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記細胞。 - 核酸分子を含んでなる細胞であって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された標的プレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 3’スプライス領域と標的結合ドメインを隔てるスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるリポーター分子をコードするヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記細胞。 - 核酸分子を含んでなる細胞であって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された標的プレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記細胞。 - 前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項１に記載の細胞。
- 前記核酸分子が3’または5’スプライス領域の1以上の側部に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１、２、３または４に記載の細胞。
- 前記リポーター分子が蛍光シグナルをもたらす、請求項１、２、３、４または５に記載の細胞。
- 前記リポーター分子が生物発光シグナルをもたらす、請求項１、２、３、４または５に記載の細胞。
- 前記リポーター分子が放射性シグナルをもたらす、請求項１、２、３、４または５に記載の細胞。
- 前記リポーター分子が(i)酵素、(ii)受容体、(iii)タンパク質、(iv)ペプチドタグ、(iv)イオンチャネル、または(v)抗体からなる群から選択される、請求項１、２、３、４または５に記載の細胞。
- 前記リポーター分子が標識プローブまたはトレーサーに対して親和性を有する、請求項１、２、３、４または５に記載の細胞。
- 前記標的プレmRNAが感染性病原体に由来する、請求項１、２、３、４または５に記載の細胞。
- 前記標的プレmRNAがウイルスに由来する、請求項１、２、３、４または５に記載の細胞。
- 標的プレmRNAの発現が増殖性疾患と関連している、請求項１、２、３、４または５に記載の細胞。
- リポーター分子をコードしているキメラRNA分子を細胞内で生成する方法であって、細胞内で発現された標的プレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、該核酸分子の一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされて細胞内でキメラRNAを形成する条件下で接触させることを含んでなり、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現された標的プレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点、ピリミジントラクトおよび3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域；
c) 3’スプライス領域と標的結合ドメインを隔てるスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるリポーター分子をコードするヌクレオチド配列；
を含んでなる、上記方法。 - リポーター分子をコードしているキメラRNA分子を細胞内で生成する方法であって、細胞内で発現された標的プレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、該核酸分子の一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされて細胞内でキメラRNAを形成する条件下で接触させることを含んでなり、該核酸分子が、
a)細胞内で発現された標的プレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 3’スプライス領域と標的結合ドメインを隔てるスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるリポーター分子をコードするヌクレオチド配列；
を含んでなる、上記方法。 - リポーター分子をコードしているキメラRNA分子を細胞内で生成する方法であって、細胞内で発現された標的プレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含んでなり、該核酸分子が、
a)細胞内で発現された標的プレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位と標的結合ドメインを隔てるスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるリポーター分子をコードするヌクレオチド配列；
を含んでなり、該キメラRNA分子が細胞内で生成される、上記方法。 - 前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項１４に記載の方法。
- 前記核酸分子が3’または5’スプライス領域の1以上の側部に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１４、１５、１６または１７に記載の細胞。
- 前記リポーター分子が蛍光シグナルをもたらす、請求項１４、１５、１６または１７に記載の細胞。
- 前記リポーター分子が生物発光シグナルをもたらす、請求項１４、１５、１６または１７に記載の細胞。
- 前記リポーター分子が放射性シグナルをもたらす、請求項１４、１５、１６または１７に記載の細胞。
- 前記リポーター分子が(i)酵素、(ii)受容体、(iii)タンパク質、(iv)ペプチドタグ、(iv)イオンチャネル、または(v)抗体からなる群から選択される、請求項１４、１５、１６または１７に記載の細胞。
- 前記リポーター分子が標識プローブまたはトレーサーに対して親和性を有する、請求項１４、１５、１６または１７に記載の細胞。
- 前記標的プレmRNAが感染性病原体に由来する、請求項１４、１５、１６または１７に記載の細胞。
- 前記標的プレmRNAがウイルスに由来する、請求項１４、１５、１６または１７に記載の細胞。
- 標的プレmRNAの発現が増殖性疾患と関連している、請求項１４、１５、１６または１７に記載の細胞。
- a) 細胞内で発現された標的プレmRNAに核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点、ピリミジントラクトおよび3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域；
c) 3’スプライス領域と標的結合ドメインを隔てるスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるリポーター分子をコードするヌクレオチド配列；
を含んでなり、細胞内で核スプライシング成分により認識される、核酸分子。 - a) 細胞内で発現された標的プレmRNAに核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 3’スプライス領域と標的結合ドメインを隔てるスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるリポーター分子をコードするヌクレオチド配列；
を含んでなり、細胞内で核スプライシング成分により認識される、核酸分子。 - a) 細胞内で発現された標的プレmRNAに核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位と標的結合ドメインを隔てるスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるリポーター分子をコードするヌクレオチド配列；
を含んでなり、細胞内で核スプライシング成分により認識される、核酸分子。 - 5’供与部位をさらに含んでなる、請求項２７に記載の核酸分子。
- 3’または5’スプライス領域の1以上の側部に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項２７に記載の核酸分子。
- 前記リポーター分子が蛍光シグナルをもたらす、請求項２８、２９、３０または３１に記載の核酸分子。
- 前記リポーター分子が生物発光シグナルをもたらす、請求項２８、２９、３０または３１に記載の核酸分子。
- 前記リポーター分子が放射性シグナルをもたらす、請求項２８、２９、３０または３１に記載の核酸分子。
- 前記リポーター分子が(i)酵素、(ii)受容体、(iii)タンパク質、(iv)ペプチドタグ、(iv)イオンチャネル、または(v)抗体からなる群から選択される、請求項２８、２９、３０または３１に記載の核酸分子。
- 前記リポーター分子が標識プローブまたはトレーサーに対して親和性を有する、請求項２８、２９、３０または３１に記載の核酸分子。
- 前記標的プレmRNAが感染性病原体に由来する、請求項２８、２９、３０または３１に記載の核酸分子。
- 前記標的プレmRNAがウイルスに由来する、請求項２８、２９、３０または３１に記載の核酸分子。
- 標的プレmRNAの発現が増殖性疾患と関連している、請求項２８、２９、３０または３１に記載の核酸分子。
- 宿主細胞において標的プレmRNAの発現を検出する方法であって、
(i) 該宿主細胞と核酸分子とを接触させること［該核酸分子は
a) 細胞内で発現された標的プレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点、ピリミジントラクトおよび3’スプライス受容部位を含む3’スプライス部位；
c) 3’スプライス領域と標的結合ドメインを隔てるスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるリポーター分子をコードするヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである]、および
(ii) 該リポーター分子の発現を検出すること
を含んでなる、上記方法。 - 宿主細胞において標的プレmRNAの発現を検出する方法であって、
(i) 該宿主細胞と核酸分子とを接触させること［該核酸分子は
a) 細胞内で発現された標的プレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 3’スプライス領域と標的結合ドメインを隔てるスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるリポーター分子をコードするヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである]、および
(ii)該リポーター分子の発現を検出すること
を含んでなる、上記方法。 - 宿主細胞において標的プレmRNAの発現を検出する方法であって、
(i) 該宿主細胞と核酸分子とを接触させること［該核酸分子は
a) 細胞内で発現された標的プレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位と標的結合ドメインを隔てるスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を含んでなり、該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである]、
および
(ii)該リポーター分子の発現を検出すること
を含んでなる、上記方法。 - 前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項４０に記載の方法。
- 前記核酸分子が3’または5’スプライス領域の1以上の側部に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項４０に記載の核酸分子。
- 前記リポーター分子が蛍光シグナルをもたらす、請求項４０、４１、４２、４３または４５に記載の方法。
- 前記リポーター分子が生物発光シグナルをもたらす、請求項４０、４１、４２、４３または４５に記載の方法。
- 前記リポーター分子が放射性シグナルをもたらす、請求項４０、４１、４２、４３または４５に記載の方法。
- 前記リポーター分子が(i)酵素、(ii)受容体、(iii)タンパク質、(iv)ペプチドタグ、(iv)イオンチャネル、または(v)抗体からなる群から選択される、請求項４０、４１、４２、４３または４５に記載の方法。
- 前記リポーター分子が標識プローブまたはトレーサーに対して親和性を有する、請求項４０、４１、４２、４３または４５に記載の方法。
- 前記標的プレmRNAが感染性病原体に由来する、請求項４０、４１、４２、４３または４５に記載の方法。
- 前記標的プレmRNAがウイルスに由来する、請求項４０、４１、４２、４３または４５に記載の方法。
- 標的プレmRNAの発現が増殖性疾患と関連している、請求項４０、４１、４２、４３または４５に記載の方法。
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