JP2009000120A - スプライソソーム媒介rnaトランス−スプライシングにおける使用のための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の前−トランス−スプライシング分子は、前−トランス−スプライシング分子と特定の標的細胞において唯一発現される、前−mRNAとの間のトランス−スプライシング反応のための基質である。インビボでのトランス−スプライシング反応は、mRNAとして機能的な又は、ターゲット細胞において発現されるべきタンパクをコードする。mRNAの発現生成物は、細胞又は宿主生物に対して治療上の価値を持つタンパクであるか、特定の細胞の死を誘発する毒素か、またはそのような細胞に通常存在しないタンパクである。本発明はさらに、エキソンタグ方法を用いて前−mRNAのエキソン/イントロンの境界を同定するための、遺伝子操作されたPTMsを提供する。本発明のPTMsは、特定の細胞タイプにおいて発現されるタンパクの精製及び同定に用いることができる、ペプチドアフィニティ精製タグをコードするキメラRNAの製造を生じる。
【選択図】なし
Description
本発明は、標的を定めたスプライセオソーム(spliceosomal)トランス−スプライシング(trans-splicing)により新規核酸分子を創造するための方法および組成物を提供する。本発明による組成物は、天然標的メッセンジャーRNA先駆体(標的Pre−mRNA)(target pre-trans-mRNA) と相互作用し、また新規キメラRNA分子(キメラRNA)の創造を生じさせるトランス−スプライシング反応を媒介するようにデザインされているトランス−スプライシング分子先駆体(pre-trans-splicing molecules)(PTM)を含有する。本発明によるPTMは一般に、それ自体がRNAの翻訳の抑制などの機能を果たすことができ、または細胞における誘導蛋白質または不活性蛋白質を相補する蛋白質をコードする、または特定の細胞を殺滅するトキシンをコードする新規キメラRNAが生成されるように操作される。一般に、標的Pre−mRNAは、特定の細胞種内で発現されることから、標的として選択され、これにより新規キメラRNAの発現を、選択された細胞種に標的を定めるための手段が提供される。
染色体中のDNA配列は、コード領域(エキソン)を含有し、および一般にまた、非コード領域(イントロン)を含有するPre−mRNAに転写される。イントロンは、スプライシングと称される正確な方法でPre−mRNAから分離される[ChowらによるCell 12:1〜8(1977);およびBergerらによるProc.Natl.Acad.Sci.USA,74:3171〜3175(1977)]。スプライシングは、数個の小型核を有するリボ核蛋白質粒子(snRNP)とスプライセオソームとして知られている酵素複合体を形成するように組み立てられる、かなり多くの蛋白質因子との配位相互反応として生じる[MooreらによるThe RNA wORLD,R.F.Gestiand and J.F.Athns eds(ColdSpring Harbor Laboratory Press,(Cold Spring Harbor,N.Y.)(1993);KramerらによるAnnu.Rev.Biochem.,65:367〜404(1996);StaleyおよびGuthrieによるCell,92:315〜326(1998)]。
本発明は、スプライセオソームが媒介する標的を定めたトランス−スプライシングにより新規核酸分子を創造するための方法および組成物に関する。本発明による組成物は、天然標的Pre−mRNA分子(以下の記載において、Pre−mRNAと記す)と相互作用し、また新規キメラRNA分子(以下の記載において、キメラRNAと記す)の創造を生じさせるスプライセオソームによるトランス−スプライシング反応を媒介するようにデザインされているトランス−スプライシング分子先駆体(以下の記載において、PTMと記す)を含有する。本発明の方法は、本発明によるPTMを、当該PTMの蛋白質が天然Pre−mRNAの蛋白質にスプライシングされ、新規キメラRNAが形成される条件下に、標的Pre−mRNAと接触させることを包含する。本発明によるPTMは、トランス−スプライシング反応から生じる新規キメラRNAがそれ自体で、RNAの翻訳の抑制などの機能を果たすことができ、または別様に、キメラRNAが細胞における不完全または不活性蛋白質を相補する蛋白質をコードする、または特定の細胞を殺滅するトキシンをコードすることができるように、遺伝子操作される。
本発明は、ターゲット化(targeted)トランス−スプライシングによる新規なキメラ核酸分子の生成に用いるための組成物を提供する。本発明のPTMは(i)pre−mRNAへのPTMの結合をターゲットとする1つ以上のターゲット結合ドメイン、(ii)分枝点、ピリミジン・トラクト(pyrimidine tract)及び3’スプライス受容部位及び/又は5’スプライス供与部位を包含する3’スプライス領域;並びに(iii)RNAスプライス部位をターゲット結合ドメインから分離するスペーサー領域を含む。さらに、翻訳可能なタンパク質生成物をコードする任意のヌクレオチド配列を含有するように、PTMを操作することができる。本発明のさらに他の実施態様では、キメラRNA分子の翻訳を阻害するヌクレオチド配列を含有するように、PTMを操作することができる。例えば、ヌクレオチド配列は翻訳終止コドン、又は二次構造を形成することによって翻訳を阻害するヌクレオチド配列を含有することができる。或いは、キメラRNAはアンチセンス分子として機能することによって、それが結合するRNAの翻訳を阻害することができる。
本願発明の核酸分子は、RNAもしくはDNA、またはその誘導体もしくは修飾変形種、一本鎖または二本鎖でもよい。核酸によって、PTM分子またはPTM分子をコードする核酸分子が、デオキシリボヌクレオチドからなるのか、リボヌクレオシドからなるのか、及びリン酸ジエステル結合からなるのか、修飾された結合からなるのか示されることになる。核酸という語はまた、具体的には、5つの天然の塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル)以外の塩基からなる核酸も含む。
5.3.1. 遺伝子調節、遺伝子修復及びターゲット細胞死のためのPTMの使用
本発明の組成物及び方法は、遺伝子調節、遺伝子修復、ターゲット細胞死などの各種に適用できる。トランスースプライシングは、毒性を有する蛋白を細胞に導入するのに用いることができる。更に、PTMをウイルスmRNAに結合しウイルスmRNAの機能を破壊するように、あるいはウイルスmRNAを発現する細胞を破壊するように工夫することができる。本発明の他の態様では、有害なmRNA転写物にストップコドンを設けて転写物の発現を減少させるようにPTMを工夫することもできる。
末端が欠失した又は点変異を含む転写物を修復するためにターゲットトランスースプライシングを用いることができる。本発明のPTMは、特定の変異の上流または下流あるいは未熟3’の上流のターゲット転写物を解裂し、変異を含む転写物の部分を機能的配列に置換するトランス−スプライシングにより変異転写物を修正するようにデザインされている。
嚢胞性繊維症(CF)は、最も一般的な致命的なヒトの遺伝病である。遺伝子及び分子分析により、嚢胞性繊維症関連遺伝子が単離されその蛋白生産物が推定されている(Kerem,B.S.et al.,1989,Science 245:1073-1080;Riordan et al.,1989,Science 245:1066-1073;Rommans, et al.,1989,Science245:1059-1065)。CF関連遺伝子の蛋白生産物は、嚢胞性繊維症膜転移コンダクタンスレギュレーター(CFTR)と呼ばれている。本発明の特定の態様では、嚢胞性繊維症膜転移コンダクタンスレギュレーター(CFTR)をコードするDNAにおける欠損を修正して、嚢胞性繊維症膜転移コンダクタンスレギュレーターをコードするDNAが発現され機能的塩素イオンチャンネルが患者のエアウエイ表皮細胞に生じるように、PTMを用いる事が出来る。
リポソームへのカプセル化、マイクロ粒子、マイクロカプセル、組成物を発現できる組換え細胞、レセプター仲介エンドサイトーシス(Wu and Wu,1987,J.Bol.Chem.262:4429-4432)、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築、DNAのインジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシクム仲介トランスフェクションなどの各種のデリバリーシステムが知られており、これらは、本発明の組成物を細胞へ導入するのに用いられる。
本発明の組成物及び方法は、特定のタイプの細胞の除去又は変異が効果的な癌、及び他の重篤な疾患、自己免疫疾患および他の病原性症状などの治療に有効である。更に、本発明の組成物及び方法は、遺伝的な遺伝子疾患を有する個人の細胞に機能的で生物学的に活性な分子をコードする遺伝子を提供して、欠失した又は変異した遺伝子生産物の発現により正常な表現型を形成するのに用いることが出来る。
特定の態様では、核酸はin vivoで直接的に投与されて発現してPTMを産生する。これは、当業界で公知の各種の方法、例えば、核酸を適当な核酸発現ベクターの一部として構築してそれを分子内物となるように投与する方法、欠損又は変性レトロウイルス又は他のベクター(U.S.P.No.4,980,286)を用いた感染法、裸のベクターとして直接投与による方法、マイクロ粒子の射突による方法(ジーンガン:Biolistic,Dupont)、脂質又は細胞表面レセプター又はトランスフェクション試薬での皮膜による方法、リポゾームへのカプセル化による方法、マイクロ粒子又はマイクロカプセルによる方法、核に進入することが知られているペプチに核酸を結合させて投与する方法(Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)などにより、行うことができる。
特定の態様では、PTMを含むウイルスベクターを用いることができる。例えば、ウイルスゲノムのパッケージング及び宿主細胞DNAへの導入に必要でないレトロウイルス配列を削除したレトロウイルスベクター(Milier et al.,1993,Meth.Enzymol.217:581-599)を利用することが出来る。あるいは、アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスベクターを、細胞又は組織への遺伝子デリバリーに用いることができる(アデノウイルスに基づく遺伝子デリバリーの総説としてKozarsky and Wilson,1993,Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503)。
また本発明は、薬学的に許容できる担体と共に、有効量のPTM又はPTMをコードする核酸を含む薬学的組成物が提供される。特定の態様では、薬学的に許容できるとは、連邦政府又は国家の規則代理人によって許可されるもの、U.S.Pharmacopedia又は他の一般的に動物用に特にヒト用に認められた薬局方に記載されたものを意味する。担体とは、薬物と一緒に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、ビークルなどを意味する。適当な担体の例は、E.W.MartinのRemington's Pharmaceutical Scienceに記載されている。
及び/又はキメラmRNAの存在を検出及び/又は視覚化することによるキメラmRNAの形成を検出するアッセイなどが挙げられる。
PTMは、ターゲット細胞で望ましい効果を生み出すような効果的な量で投与される。PTMの効果的な投与は、生物学的活性半減期、バイオアベイラビリテー、毒性などのパラメーターを考慮した公知の手法により決定される。本発明の組成物の有効な量は、治療する病気及び障害の本質に依存し、標準的な臨床技術により決定できる。更に最適投与量を同定するために、in vitroアッセイを任意に用いることができる。
現在のヒト及び他の生物のゲノムの配列決定及び特徴決定の努力の点から、そのような特徴決定を容易にする方法に対するニーズが存在する。現在入手されるゲノムマッピング及び配列決定により得られる情報の大部分は、cDNAへのmRNAの逆転写により作られる相補性DNA(cDNA)ライブラリーから誘導される。不幸にも、この工程は、イントロン配列及びエキソン/イントロン境界の位置に関する情報のロスを生じる。
を含む、上記方法を包含する。
本発明の他の態様において、PTM媒介トランス−スプライシング反応は、細胞中に発現される未だ検出されていない、未知のタンパクの同定に用いることができる。この方法は、なかんずく、タンパクのサイズの小ささ、タンパクの低濃度により、または二次元電気泳動において、他のタンパクと類似する移動パターンを示すことによる検出の失敗により、二次元の電気泳動、又は他の方法により検出することができないタンパク質の同定に特に有用である。
以下の節は、PTMsの製造及びそのような分子がトランス−スプライシング反応を媒介することができ、キメラmRNA分子の製造をなし得ることの例証を説明する。
6.1.1. プレ−mRNA分子の構築
野生型のジフテリア毒素サブユニットA(DT−A、野生型寄託番号K01722)及びDT−A変異体(CRM197、酵素活性なし)を含むプラスミドをVirginia Johnson博士、Food and Drug Administration、Bethesda、Marylandから得た(Uchidaら、1973、J.Biol.Chem.248:3838)。インビトロ実験のため、DT−Aをプライマー:DT−1F
及びDT−2R
を用いて増幅し、PstI及びHindIIIにより切断し、PstI及びHindIII消化したpBS(−)ベクター(Stratagene,La Jolla、CA)中へクローニングした。得られたクローンpDTAを個々のPTMsを構築するのに用いた。(1)pPTM+:ターゲットした構築物。IN3−1
及びIN2−4
プライマーをEcoRI及びPstI消化pDTA中へインサートすることにより作製。(2)pPTM+Sp:pPTM+と同様に、但し、BDとBPとの間に30bpのスぺーサーを有する。
pPTM+をXholで消化し、オリゴヌクレオチド中、スぺーサーS
及びスペーサーAS
をリゲートすることにより作製。インビボ研究のため、pcPTM+SpのEcoRI及びHindIII断片を哺乳類の発現ベクターpcDNA3.1(Invitrogen)中にCMVプロモーターの制御下でクローンした。また、コドン14のメチオニンをイソロイシンに代え、翻訳の誘発を防止した。得られたプラスミドをpcPTM+Spと指定した。(3)pPTM+CRM:pPTM+Spと同様に、ただし、野生型DT−AをCRM変異体DT−A(T.Uchidaら、1973、J.Biol.Chem.248:3838)。これは、プライマーDT−1F及びDT−2Rを用いたDT−A変異体(G52Eにおける変異)のPCR増幅により作製された。インビボ研究のためには、PTM+CRMのEcoRI HindIII断片を、pc3.1DNA中へクローンし、pcPTM+ARMとした。(4)PTM−:非ターゲット構築。PTM+のEcoRI及びPstIによる消化、結合ドメインの除去のためゲル精製し、次にオリゴヌクレオチド
のリゲートにより作製。(5)PTM−Sp、PTM−と同一のバージョン、但し、PstI部位に30bpのスペーサー配列を有する点を除く。同様に、スプライス変異体[Py(−)AG(−)及びBP(−)Py(−)AG(−)]及び安全変異体(safety variants)[PTM+SF-Py1,PTM+SF-Py2,PTM+SFBP3及びPTM+SFBP3-Py1]を、特定の配列の挿入、欠失(表1参照)のいずれかにより作製した。
インビトロ標的プレmRNAを作成するために、βHCG遺伝子6(受託番号X00266)のSacl断片をpBS(−)にクローニングした。これによりヌクレオチド460−1265(これは5’非翻訳領域、開始コドン、エクソン1、イントロン1、エクソン2及びイントロン2のほとんどを含む)から805bp挿入体を作成した。インビボ研究のために、EcoR1及びBamH1断片を哺乳類発現ベクター(pc3.1DNA)の中にクローニングしてβHCG6を作成した。
インビトロスプライシング実験のために、βHCG6、β−グロビンプレmRNA及び様々なPTMmRNAをT7mRNAポリメラーゼ(Pasman & Garcia-Blanco,1996,Nucleic Acids Res.24:1638)を用いて、BamH1及びHindIII消化プラスミドDNAのインビトロ転写によってそれぞれ合成した。合成されたmRNAを変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により精製し、生成物を切り取って溶出した。
PTM及び標的プレmRNAを98℃に加熱してアニーリングし、次いで30−34℃にゆっくりと冷やした。各反応液は12.5μlの最終体積中に、4μlのアニールされたmRNA複合体(100ngの標的と200ngのPTM)、1Xスプライスバッファー(2メモランダムMgCl2、1メモランダムATP、5メモランダムのリン酸クレアチニン及び40メモランダムのKCl)、及び4μlのHeLaスプライス核抽出物(Promega)を含んでいた。反応液を30℃で指示された時間インキュベートし、反応を等量の高濃度塩バッファー(7M尿素、5%SDS、100メモランダムLiCl、10メモランダムEDTA及び10メモランダムトリスHCl、pH7.5)の添加により止めた。核酸をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(50:49:1)による抽出、次いでエタノール沈殿により精製した。
RT−PCR分析をEZ−RT PCRキット(パーキンエルマー、Foster City、カリフォルニア)を用いて行った。各反応液は50μl反応体積中に、10ngのシス若しくはトランススプライストmRNA又は1−2μgの全mRNA、0.1μlの各3’及び5’特異的プライマー、0.3メモランダムの各dNTP、1X EZバッファー(50メモランダム ビシン、115メモランダム 酢酸カリウム、4%グリセロール、pH8.2)、2.5メモランダム 酢酸マグネシウム、及び5UのrTthDNAポリメラーゼを含んでいた。逆転写を60℃で45分間行い、次いで得られたcDNAのPCR増幅を以下のように行った。1サイクルの94℃、30秒間の初期変性、及び25サイクルの94℃、18秒間の変性及び60℃、40秒間のアニーリングと伸張、次いで70℃で7分の最終伸張。反応生成物をアガロースゲルで電気泳動により分離した。
ヒト肺がん細胞系H1299(ATCC受託番号CRL−5803)を10%ウシ胎仔血清で補充したRPMI培地で37℃、5%CO2環境で増殖させた。細胞を、pcSp+CRM(CRMは非機能性毒素)、PTMを発現するベクター又はリポフェクタミン試薬(Life Technologies,Gaithersburg,MD)を用いたベクター単独(pcDNA3.1)でトランスフェクトした。トランスフェクションの2週間後にネオマイシン抵抗性(neor)コロニー形成について検定のスコア付けをした。4つのneorコロニーを選択し、継続したneo選択下で拡張した。全細胞mRNAをRNAエクソール(BioChain Institute,Inc.,San Leandro,CA)を用いて単離し、RT−PCRのために使用した。
11匹のヌードマウスを、1x107H1299ヒト肺腫瘍細胞で背側の腹側部皮下スペースの両側に注射した(但し、B10、B11及びB12は一つの腫瘍を持っていた)(第1日目)。第14日目にマウスに適量の麻酔薬を投与し、いくつかの配向でのエレクトロポレーションで又はエレクトロポレーションなしで、pcβHCG6又はpcPTM+Spとともに若しくはそれなしで、100μgのpcSp+CRMを含む全量100μlの生理食塩水を注射した。右側の腫瘍に注射した溶液には針の跡を印すためにインディアインクも含ませた。48時間後に動物を殺し、腫瘍を切り取り、ただちに−80℃で凍結した。分析のため、10mgの各腫瘍をホモジェネートし、mRNAをDynabeadsmRNAダイレクトキット(Dynal)を用いて、製造者の指示書に従って単離した。精製したmRNA(10μl全体積のうちの2μl)を先述のようにβHCG−F及びDT−5Rプライマーを用いてRT−PCTに付した。すべての試料をD−3R、入れ子のDT−Aプライマー及びビオチン化したβHCG−Fを用いて再増幅し、生成物を2%アガロースゲル上で電気泳動により分析した。バンドを形成した試料をM280 Streptavidin Dynabeadsを用いて一本鎖DNAへと処理し、毒素特異的プライマー(DT−3R)を用いて配列決定した。
6.2.1 PTMの合成
18nt標的結合ドメイン(βHCG6イントロン1に相補的)、30ヌクレオチドスペーサー領域、分岐点(BP)配列、ポリピリミジン領域(tract)(PPT)及びジフテリア毒素サブユニットA(DT-A)をコードするエキソンのすぐ上流の3’スプライス部位のAGジヌクレオチド(Uchida et al.,1973,J.Biol.Chem.248:3838)を含む、原型のトランススプライシングmRNA分子、pcPTM+Sp(図1A)を構築した。その後DT−Aエキソンを修飾してコドン14の翻訳開始部位を除去した。PTM構築体をトランススプライシングを発現すべく最大活性を示すように設計した。それゆえ、それらは強力な3’スプライスエレメントを含んでいた(酵母BP及び哺乳類PPT)(Moore et al.,1993,In The mRNA World,R.F.Gesteland and J.F.Atkins,eds.(Cold Spring Harbor,New York,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。βHCG6プレmRNA(Talmadge et al.,1984,Nucleic Acids Res.12:8415)を、この遺伝子がほとんどの腫瘍細胞において発現されるのでモデル標的として選ばれた。それは、下垂体腺及び性腺におけるいくつかの例外はあるが正常な成人細胞では発現されない。(Acevedo et al.,1992,Cancer76:1467;Hoon et al.,1996,Int J.Cancer 69:369;Bellet et al.,1997,Cancer Res.57:516)。図1Cに示すように、pcPTM+Spは従来のワトソンクリック塩基対を、βHCG6イントロン1の3’末端を持ったその結合ドメインにより形成し、標的のイントロニック3’スプライスシグナルをマスクする。この特徴は標的とPTMの間のトランススプライシングを容易にするよう設計される。
pcPTM+SpとβHCG6標的の間のトランススプライシングが正確であることを確認するために、RT−PCT増幅生成物を5’ビオチニル化βHCG−F及び非ビオチニル化DT−3Rプライマーを用いて生成した。この生成物は一本鎖DNAに変えて、Mitchel及びMerril(1989,Anal.Biochem.178:239)の方法を用いて、プライマーDT−3R(DT−A特異的逆プライマー)で直接配列決定した。トランススプライシングは予想されたスプライス部位(図3)の間で正確に起こり、従来のプレmRNAがスプライシングの間遺伝子工学PTM構築体により侵入され得ること、さらにこの反応が正確であることを確認した。
一般に、3’スプライス部位は三つの要素を含んでいる。1)アクセプター部位の5’に位置するBP配列、2)短いピリミジン残基からなるPPT、及び3)イントロン−エキソン境界におけるYAGトリヌクレオチドスプライス部位アクセプター(Senapathy et al.,1990,Cell 91:875;Moore et al.,1993)。これらの配列要素の一つの削除又は変更はスプライシングを減少させるか、あるいはなくしてしまうことが知られている(Aebi et al.,1986;Reed & Maniatis 1988,Genes Dev.2:1268;Reed,1989,Genes Dev.3:2113;Roscigno et al.,1993,J.Bio.Chem.268:11222;Coolidge et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:888)。標的トランススプライシングにおけるこれらの保存された要素の役割は実験的に処理された。一つのケース[(BP(−)Py(−)AG(−)]では、すべての三つの要素(BP、PPT及びAGジヌクレオチド)をランダムな配列で置き換えた。PPT及び3’スプライス部位アクセプターが突然変異を受けランダム配列で置き換わっている第二のスプライシング突然変異体[(Py(−)AG(−)]が構築された。いずれの構築体もインビトロではトランススプライシングを支持することはできなかった(図2A、レーン5−8)。これは、従来のシススプライシングの場合と同様に、PTMトランススプライシングプロセスもまた3’スプライス部位において機能的なBP、PPT及びAGアクセプターを要するということを示唆するものである。
結合領域の封入によりまたはPTMを短縮することにより達成される標的特異性の水準を改良するために、数種のPTM構造の標的結合領域は(”安全なPTM”と称される)3’スプライス部位をマスクするための分子内茎部を造るために修飾された。安全な茎部はPTM3’スプライス部位またはこれに隣接する配列の領域と部分的に塩基対にし、それにより標的獲得のまえにPTM3’スプライス部位へのスプライシング複合体成分の接近を遮断する、結合領域の部分により形成される(図4A、PTM+SF)。PTM結合領域およびβHCG6の遊離部分間の塩基対は、安全な茎部を巻戻してU2AFのようなスプライシングファクターをPTM3’スプライス部位に結合させそしてトランススプライシングを開始させるのを可能にする(図4B)。
トランススプライシングにおける3’スプライス部位の役割をより良く理解するために、PPTがプリンとの置換により弱められそして(または)BPが塩基置換により修飾されているかのいずれかである一連の安全PTMが構成された(表1参照)。安全(PTM+SF)のインビトロトランススプライシング効率が3種の安全変異体比較され、それはトランススプライシングに対する減少した能力を示した。最も大きな効果に変異体2(PTM+SFPy2)を用いて観察され、これはトランススプライシング不能であった(図4C、レーン5〜6)。トランススプラインシングのこの阻止は弱められたPPTおよび(または)安全茎部のより高いTmに起因している可能性がある。対照的に、BP配列における変異(PTM+SFBP3)はトランススプライシングに顕著に影響しなかった。このことは、導入された修飾が哺乳動物の分岐点コンセンサス範囲YNYURAC(但し、Y=ピリミジン、R=プリンおよびN=任意のヌクレオチド)内であったので驚くべきことではない(Moore等、1993)。この発見は、分枝点配列がスプライシング効率に影響することなしに除去されることが出来ることを示している。PPTにおける変化(PTM+SF−Pyl)はトランススプライシングにおける水準を減少させた(レーン3〜4)。同様に、BPおよびPPTの両方が変化されたPTM+SFBP3−Pylであった場合に、それらはトランススプライシングにおいてさらに減少を生じさせた(図4C、レーン9〜10)。これらの安全な変異体のトランススプライシング効率の順序はPTM+SF>PTM+SFBP3>PTM+SFPyl>PTM+SFBP3−Pyl>PTM+SFPy2である。これらの結果はPPTおよびBPの両方が有効なインビトロトランススプライシングのために重要であることを確認する(Roscigno等のJ.Biol.Chem.268:11222(1993))。
PTMの濃度を増大させることによるpre−mRNAシス スプライシングを遮断することが可能であるかどうかを調べるために、トランススプライシングに対する反応を駆動するために実験を行なった。それらのスプライシング反応は、一定量のβHCG6pre−mRNA標的および種々の濃度のトランススプライシングPTMを用いて行なわれた。シススプライシングはβHCG−F(エキソン1)およびβHCG−R2(エキソン2)に対するプライマーを用いるRT−PCRにより監視された。これは予期された125bPシススプライシングされた生成物および478bPスプライシングされていない生成物を増幅させた(図6A)。プライマーβHCG−FおよびDT−3Rがトランススプライシングされた生成物を検出するために用いられた(図6B)。PTMの低い濃度で、シススプライシング(図6A、レーン1〜4)は、トランススプライシング(図6B、レーン1〜4)よりも優勢であった。シススプライシングは標的よりも1.5倍大きいPTM濃度で約50%減少された。標的の3倍の濃度にPTMmRNA濃度を増大させると、90%よりも大きくシススプライシングを阻止し(図6A、レーン7〜9)、同時にトランススプライシングされた生成物を増大させている(図6B、レーン6〜10)。競合PT−PCRは1つの反応においてすべての3種のプライマー(βHCG−F、HCG−R2およびDT−3R)を包含させることによりシススプライシングされた生成物およびトランススプライシングされた生成物の両方を同時に増幅させるために行なわれた。この実験は図6において見られる結果と同様な結果を示し、インビトロ条件下に、PTMは標的pre−mRNAシススプライシングを有効に遮断しそしてそれを特別に設計されたトランススプライシングされたキメラmRNAの生産に置き換えることを示している。
細胞培養モデルにおけるトランス−スプライシングのメカニズムを例証するため、ヒト肺ガン細胞株H1299(βHCG6陽性)をSP−CRM(非機能的なジフテリア毒素)を発現するベクター又はベクター単独(pcDNA3.1)でトランスフェクトし、ネオマイシン(neomycin)の存在下で成長させた。四つのネオマイシン耐性のコロニーを14日後に個々に回収し、続いてのネオマイシンの存在下に拡張した。mRNA全体を欠くコロニーから単離し、プライマーβHCG−F及びDT−3Rを用いたRT−PCRにより分析した。これにより、四つの選択したコロニーのうち三つから、予想される196bpのトランス−スプライスした生成物が得られた(図7A、第2,3,及び4レーン)。増幅したクローン番号2からの生成物を直接配列決定し、PTM誘導のトランス−スプライシングが、ヒト細胞において、内因的に発現されたβHCG6ターゲットエキソン1及びDT−Aの第一ヌクレオチドの、予想されたスプライス部位で正確に生じたことを確認した(図7B)。
インビボにおけるトランス−スプライシングのメカニズムを例証するため、以下の実験をアシミック(athymic)(ヌード)マウスにおいて行った。107のH1299細胞を背側の側腹部の皮下空間中に注射して、腫瘍を発生させた。14日目に、PTM発現プラスミドを腫瘍へ注射した。大部分の腫瘍を次に、電気穿孔に付し、プラスミドの送達を容易にした(以下の表2参照)。48時間後、腫瘍を除去し、ポリA−mRNAを単離し、RT−PCRで増幅した。19のPTM処理腫瘍のうち8つにおいて、トランス−スプライシングが検出された。二つの試料が、一回のRT−PCRのラウンドで、mRNAから、予想されたトランス−スプライスされた生成物(466bp)を製造した。次に、6つの更なる腫瘍が、ネストしたプライマーのセットを用いた第二のPCRの増幅によりトランス−スプライスについて陽性であり、予想された196bpの生成物を製造した(表2)。各陽性のサンプルを配列決定し、βHCG6エキソン1が予想されたスプライス部位において、DT−Aのコード配列(野生型又はCRM変異体)に正確にトランス−スプライスされることを例証した。陽性試料の6つが、人工的にターゲット前−mRNAの濃度を増やした、プラスミドpcPTM+CRM及びpcHCG6の共トランスフェクション(cotransfection)を受けた処理グループ由来であった。これは、トランス−スプライスされる現象を検出する可能性を高めるために行われた。他の二つの陽性腫瘍は、pcPTM+Sp(野生型DT−A)のみを受けたグループ由来であった。これらの腫瘍は、βHCG6発現プラスミドによりトランスフェクトされず、再度、6.2.7節で述べた組織培養モデルと同様に、トランス−スプライシングが、腫瘍細胞により製造される、PTMと内因的なβHCG6前−mRNAとの間で起こったことを例証した。
特異的プレmRNA標的とPTMの間のスプライソソーム介在標的トランス−スプライシングの機構の普遍性を明白にし、評価するために、酵素β−ガラクトシダーゼに基づいた単純なモデルシステムを開発した。以下の節においては、特異標的とPTMの間のスプライソソーム介在標的トランス−スプライシングの成功例を明らかにする結果を記載する。
lacZ標的プレmRNA(pc3.1、lacT1)を、以下のPCR産物のクローニングによって構築した:(i)lacZの5’フラグメント、次いで(ii)βHCG6イントロン1:(iii)およびlacZの3’フラグメント。lacZ遺伝子の5’および3’断片を、以下のプライマーを使用して、テンプイレートpcDNA3.1/His/lacZ(Invitrogen,SanDiego,CA)からPCR増幅した:5’lac−1Fおよび5’lac1R(5’断片用)、および3’lac−1Fおよび3’lac−1R(3’断片用)。増幅したlacZ5’断片は開始コドンを含む1788bp長であり、増幅した3’断片は1385bp長で、分枝点、ポリピリミジントラクトおよびβHCG6イントロン1、に加えて、天然の5’および3’スプライス部位を有している。βHCG6イントロン1は、以下のプライマーを用いてPCR増幅された:HCG−In1FおよびHCG−In1R。
プレ−トランス−スプライシング分子、pc3.1PTM1は、PstIおよびHindIIIでpTM+Spを消化し、DT−AトキシンをコードするDNA断片を、lacZの機能的3’末端をコードするDNA断片で置換することによって創製した。この断片を以下のプライマーを用いてPCR増幅することによって産生した:3’lac1Fおよび3’lac1R。細胞培養実験のために、HCGイントロン1に対する結果領域、30bpスペーサー、酵母分枝点(TACTAAC)、および強いポリピリミジントラクトと次いでクローン化したlacZを含有するpc3.1PTM2の、EcoRIおよびHindIII断片をpcDNA3.1にクローン化した。
ヒト胚腎細胞(293T)を、10%FBSを補充したDMEM倍地で37℃、5%CO2にて増殖させた。細胞を、製造元の指示書に従ってLipofectaminePlus[LifeTechnologies(Gaithersburg,MD)]を用いて、pc3.1LacT1およびpc3.1PTM2またはpc3.1LacT2およびpc3.1PTMで同時トランスフェクトした。24時間の後トランスフェクションで、細胞は収穫された;総RNAを単離し、RT−PCRを標的用およびPTM用特異性プライマーを用いて実行した。β−ガラクトシダーゼ活性は、β−gal染色キット(Invitrogen,SanDiego,CA)を使用して、細胞を染色することによりモニターされた。
7.2.1.lacZスプライス標的は、効率よくシス・スプライスして、機能的β−ガラクトシダーゼを産生する
スプライス標的プレmRNAのシス・スプライス効率の性能を比較するため、pc3.1lacT1を、LipofectaminePlus試薬[LifeTechnologies(Gaithersburg,MD)]を使用して、次いで総RNAのRT−PCR解析により、293T細胞にトランスフェクトした。シス・スプライスしたRT−PCRの配列解析は、スプライシングは正確であり、予測されたスプライス部位に正確に起こったことを示した(図12B)。更に、標的プレmRNA分子の正確なシス・スプライシングは、β−ガラクトシダーゼ、即ちx−galの、加水分解を触媒し、顕微鏡下で、可視化することができる青色を産生する活性β−ガラクトシダーゼをコードすることのできるmRNAの生成をもたらす。標的プレmRNAの正確なシス・スプライシングは、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を成功裏に検出することにより、更に確認された。
トランス・スプライシングをアッセイするため、lacZ標的プレmRNAおよびPTM2を293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションに次いで、総RNAをRT−PCRを用いて分析した。PCR反応には、以下のプライマーを使用した:lacZ−TR1(lacZ5’エキソン特異的)およびHCGR2(βHCGRエキソン2特異的)。RT−PCR反応は、予測された195bpトランス・スプライス産物(図11、レーン2および3)を産生し、lacZ標的プレmRNAおよびPTM2の間の効率的なトランス・スプライシングを明らかにした。レーン1は、PRM2を含まない、対照を示す。
嚢胞性繊維症(CF)は、世界で最も普通の遺伝性疾患の一つである。CFに関連する遺伝子は、単離され、そのタンパク質産物が推定された(kerem,B.S.et al.1989,Science,245:1073-1080;Riordan et al.,1989,Scienece,245:1066-1073;Rommans,et al.,1989,Science,245:1059-1065)。CF関連遺伝子のタンパク質産物は、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質(CFTR)と称されている。全ての突然変異アレルのおよそ〜70%を数える、突然変異起因性の最も普通の疾病は、位置508(△F508)のフェニルアラニンをコードするエキソン10における3つのヌクレオチドの欠損である。以下の節では、スプライソソーム介在トランス・スプライシングを使用した嚢胞性繊維症遺伝子の成功した修復を記載し、モデルシステムの修復CFTRの実行可能性を明らかにする。
8.1.1. プレトランススプライシング分子
CFTRプレ・トランス・スプライシング・分子(PTM)は、CFTRイントロン9(3’末端、−13から−31)に相補性の23ヌクレオチド結合領域、30ヌクレオチドスペーサー領域(スプライソソーム成分の効率的な結合を許容する)、分岐点(BP)配列、ポリピリミジントラクト(PPT)およびCFTRエキソン10をコードする配列の直上流の3’スプライス部位にあるAGジヌクレオチド(F508を含む野生型配列)からなる。この最初のPTMは、トランススプライシングを明らかにするために最大活性を表すよう設計された:それゆえ、PTMはUACUAACの酵母コンセンサスBP配列および大きなPPTを含む。18ヌクレオチドHISタグ(6ヒスタミンコドン)は、特異的増幅およびトランス・スプライシング産物の単離、および内部CFTRを有さないことを許容する野生型エキソン10コード配列の後に含まれる。2フラグメントを産生するに使用されるオリゴヌクレオチドは、ユニークな制限部位を含み、(それぞれ、ApaIおよびPstI、およびPstIおよびNotI)哺乳類発現ベクターpcDNA3.1に増幅したDNAを直接クローニングすることができる。
CFTRミニ遺伝子標的は、図13に示され、CFTRエキソン9;イントロン9の機能的5’および3’領域(それぞれ、各末端から260および265ヌクレオチド);エキソン10[△F508];およびイントロン10の5’領域(90ヌクレオチド)からなる。更に、図16に示したように、CFTRエキソン9−10および10−24を含むミニ標的遺伝子は、嚢胞性繊維症突然変異の修正のためのトランス・スプライシング介在スプライソソームの使用をテストするために使用することができる。図17は、嚢胞性繊維症突然変異の修正のために使用することができる二重スプライシングPTMを示す。示したように、二重スプライシングPTMは、CFTR・BDイントロン9、スペーサー、分岐点、ポリピリミジントラクト、3’スプライス部位、CFTRエキソン10、スペーサー、分岐点、ポリミリミジントラクト、5’スプライス部位およびCFTR・BDエキソン10を含有する。
PTM及びターゲットプレ−mRNAを293胎児性腎細胞中に、リポフェクタミン(lipofectamine)(Life Technologies,Gaithersburg,MD)を用いて共トランスフェクションした。細胞をトランスフェクション後24時間で回収し、RNAを単離した。RT−PCR反応において、PTM及びターゲット特異性のプライマーを用いて、その中でターゲットプレ−mRNAの変異体エキソン10がPTMの野生型エキソン10(図14)と置き換わっている、トランス−スプライスした生成物を検出した。トランス−スプライスした生成物の配列分析により、三つのヌクレオチド欠失の回復、及びスプライシングが正確であり、予想されたスプライス部位に生じること(図15)が確認され、初めて嚢胞性線維症遺伝子CFTRのRNA修復を例証した。
Claims (37)
- それぞれの細胞が核酸分子を含み、該核酸分子が:
a)該細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)ブランチポイント、ピリミジン域及び3’スプライス受容部位を含む、3’スプライス領域;
c)該3’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列;
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
細胞の集団。 - 該核酸分子が5’供与部位をさらに含む、請求項1に記載の細胞の集団。
- 該核酸分子が該3’スプライス領域の一又はそれ以上の面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1に記載の細胞の集団。
- 該ターゲットプレ−mRNAへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項1に記載の細胞の集団。
- 該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされる該ヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項1に記載の細胞の集団。
- 該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされる該ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項1に記載の細胞の集団。
- それぞれの細胞が核酸分子を含み、該核酸分子が:
a)該細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)5’スプライス部位;
c)該5’スプライス部位を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
細胞の集団。 - それぞれの細胞が組換えベクターを含み、該ベクターは、
a)該細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)ブランチポイント、ピリミジン域及び3’スプライス受容部位を含む、3’スプライス領域;
c)該3’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列;
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
細胞の集団。 - 核酸分子が5’供与部位をさらに含む、請求項8に記載の細胞の集団。
- それぞれの細胞が組換えベクターを含み、該ベクターが、
a)該細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)5’スプライス部位;
c)該5’スプライス部位を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
細胞の集団。 - キメラRNA分子を細胞中で製造する方法であって:
該細胞内で発現されるターゲットプレ−mRNAを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
該核酸分子の一部が該ターゲットプレ−mRNAの一部へとトランス−スプライスされて該細胞内にキメラRNAを生成する条件下で、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
a)該細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)ブランチポイント、ピリミジン域及び3’スプライス受容部位を含む、3’スプライス領域;
c)該3’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列;
を含む、上記方法。 - 該核酸分子が5’供与部位をさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 該キメラRNA分子がヌクレオチド配列タグを含む、請求項11に記載の方法。
- キメラRNA分子を細胞中で製造する方法であって:
該細胞内で発現されるターゲットプレ−mRNAを、
核スプライシング成分により認識される核酸分子と、
接触させることを含み、
該核酸分子が、
a)該細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)5’スプライス部位;
c)該5’スプライス部位をターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記方法。 - 該キメラRNA分子が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項14に記載の方法。
- a)細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)ブランチポイント、ピリミジン域及び3’スプライス受容部位を含む、3’スプライス領域;
c)該3’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該3’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列;
e)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列;
を含み、
細胞内の核スプライシング成分によって認識される、
核酸分子。 - a)細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)5’スプライス部位;
c)該5’スプライス部位を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該5’スプライス部位の一の面又は両面に結合する一又はそれ以上の相補的な配列を含む安全配列;
e)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含み、
細胞内の核スプライシング成分によって認識される、
核酸分子。 - 該核酸分子が5’供与部位をさらに含む、請求項16又は17に記載の核酸分子。
- 該ターゲットプレ−mRNAへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項16又は17に記載の核酸分子。
- 該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされる該ヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項16又は17に記載の核酸分子。
- 該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされる該ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項16又は17に記載の核酸分子。
- 該ターゲットプレ−mRNAへの該核酸分子の結合が相補性、三重らせん形成、又はタンパク質−核酸相互作用によって介される、請求項18に記載の核酸分子。
- 該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされる該ヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項18に記載の核酸分子。
- 該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされる該ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項18に記載の核酸分子。
- 真核生物発現ベクターであって、該ベクターが
a)細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)ブランチポイント、ピリミジン域及び3’スプライス受容部位を含む、3’スプライス領域;
c)該3’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列;
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記ベクター。 - 該核酸分子が5’供与部位をさらに含む、請求項25に記載のベクター。
- 真核生物発現ベクターであって、該ベクターが、
a)該細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)5’スプライス部位;
c)該5’スプライス部位を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記ベクター。 - 該ターゲットプレ−mRNAへスプライスされる該ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列タグを含む、請求項26又は27に記載のベクター。
- 該ターゲットプレ−mRNAへスプライスされる該ヌクレオチド配列が翻訳可能なポリペプチドタグをコードする配列を含む、請求項26又は27に記載のベクター。
- 組換え発現ベクターを含む発現ライブラリーであって、
該ベクターが、
a)細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、ランダムに選択されたヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)ブランチポイント、ピリミジン域及び3’スプライス受容部位を含む、3’スプライス領域;
c)該3’スプライス領域を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列;
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記発現ライブラリー。 - 核酸分子が5’供与部位をさらに含む、請求項30に記載の発現ライブラリー。
- 組換え発現ベクターを含む発現ライブラリーであって、
該ベクターが、
a)細胞内で発現されるプレ−mRNAに結合する、ランダムに選択されたヌクレオチド配列である一又はそれ以上のターゲット結合ドメイン;
b)5’スプライス部位;
c)該5’スプライス部位を該ターゲット結合ドメインから隔離するスペーサー領域;及び
d)該ターゲットプレ−mRNAへトランス−スプライスされるヌクレオチド配列、
を含む核酸分子を発現し、
該核酸分子が該細胞内の核スプライシング成分により認識される、
上記発現ライブラリー。 - a)核酸分子の一部がターゲットプレ−mRNAの一部へトランス−スプライスされ、キメラmRNAを生成する条件下で、
ターゲットプレ−mRNAに結合する、発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列であるターゲット結合ドメインを含む核酸分子と接触させ;
b)該キメラmRNA分子を増幅させ;
c)増幅された分子を選択的に精製し;そして、
d)増幅された分子のヌクレオチド配列を決定し、それによりイントロン−エキソン境界を同定すること、
を含むプレ−mRNA分子中のエキソン−イントロン境界をマッピングする方法。 - a)ペプチドタグ又はマーカーをコードするヌクレオチド配列及び発現ベクターライブラリーから選択されるヌクレオチド配列であるターゲット結合ドメインを含む核酸分子を、
プレ−mRNA分子と、
プレ−トランス−スプライシング分子の一部が該ターゲットプレ−mRNAの一部へとトランス−スプライスされ、融合ポリペプチドをコードするキメラmRNAを生成する条件下で接触させ;
b)該融合ポリペプチドをアフィニティー精製し;そして、
c)該融合タンパク質のペプチド配列を決定すること、
を含む、細胞中に発現されるタンパク質を同定する方法。 - 該融合ポリペプチドがHISポリペプチドである、請求項34に記載の方法。
- 該融合ポリペプチドがFLAGポリペプチドである、請求項34に記載の方法。
- 該融合ポリペプチドがグルタチオン−S−トランスフェラーゼポリペプチドである、請求項34に記載の方法。
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