JP2005528911A - スプライセオソーム媒介型ｒｎａトランススプライシング、及びスプライセオソーム媒介型ｒｎａトランススプライシングを利用した第ｖｉｉｉ因子の遺伝的欠陥の修正 - Google Patents

Abstract

本発明の組成物は、標的前駆体メッセンジャーＲＮＡ分子（標的プレｍＲＮＡ）と相互作用し、新規なキメラＲＮＡ分子（キメラＲＮＡ）の生成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するよう設計された、プレトランススプライシング分子（ＰＴＭ）を含む。特に、本発明のＰＴＭは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）標的プレｍＲＮＡと相互作用し、これにより血友病Ａを引き起こす凝固因子ＦＶＩＩＩの遺伝的欠陥が修正されるように遺伝的に操作されたものを含む。本発明の組成物はさらに、本発明のＰＴＭを発現可能な組換えベクター系、及び該ＰＴＭを発現する細胞を含む。本発明の方法は、本発明のＰＴＭとＦＶＩＩＩ標的プレｍＲＮＡとを、ＰＴＭの一部が標的プレｍＲＮＡの一部にトランススプライシングされてｍＲＮＡ分子を形成するような条件下にて接触させることを含み、この方法ではＦＶＩＩＩ遺伝子の遺伝的欠陥が修正される。本発明の方法及び組成物は、血友病ＡなどのＦＶＩＩＩ障害の修正のための遺伝子治療に用いることができる。

Description

１．緒論
本発明は、標的化スプライセオソーム媒介型トランススプライシングによって新規な核酸分子を作製する方法及び組成物を提供する。本発明の組成物は、標的前駆体メッセンジャーＲＮＡ分子（標的プレｍＲＮＡ）と相互作用し、新規なキメラＲＮＡ分子（キメラＲＮＡ）の生成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するよう設計された、プレトランススプライシング分子（ＰＴＭ）を含む。本発明のＰＴＭは、以下のような特徴を含むように設計され、標的ｍＲＮＡへより効率的にスプライシングされる：すなわち、（ｉ）標的イントロンの３’スプライスシグナルに近接してイントロン配列にターゲティングする結合ドメイン、（ｉｉ）ミニイントロン、（ｉｉｉ）ＩＳＡＲ（イントロンスプライシングアクチベーター及びリプレッサー）のコンセンサス結合部位、並びに／又は（ｉｖ）リボザイム配列。

本発明の方法及び組成物は、癌などの増殖性疾患の治療、又は遺伝疾患、自己免疫疾患若しくは感染性疾患の治療のための細胞遺伝子調節、遺伝子修復及び自殺遺伝子治療に使用しうる。また、本発明の方法及び組成物は、標的化スプライセオソームトランススプライシングにより、植物において新規な核酸分子を生成するためにも使用できる。

さらに、本発明のＰＴＭは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）標的プレｍＲＮＡと相互作用し、これにより血友病Ａを引き起こす凝固因子ＦＶＩＩＩの遺伝的欠陥が修正されるように遺伝的に操作されたものを含む。本発明の組成物はさらに、本発明のＰＴＭを発現可能な組換えベクター系、及び該ＰＴＭを発現する細胞を含む。本発明の方法は、本発明のＰＴＭとＦＶＩＩＩ標的プレｍＲＮＡとを、ＰＴＭの一部が標的プレｍＲＮＡの一部にトランススプライシングされてｍＲＮＡ分子を形成するような条件下にて接触させることを含み、この方法ではＦＶＩＩＩ遺伝子の遺伝的欠陥が修正される。本発明の方法及び組成物は、血友病ＡなどのＦＶＩＩＩ障害の修正のための遺伝子治療に用いることができる。

２．発明の背景
２．１．ＲＮＡスプライシング
染色体のＤＮＡ配列は、コード領域（エキソン）を含み、そして通常は介在非コード領域（イントロン）も含有するプレｍＲＮＡへと転写される。イントロンはシススプライシングと呼ばれる精密なプロセスでプレｍＲＮＡから除かれる（Chowら, 1977, Cell 12: 1-8；及びBerget, S.M.ら, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 3171-3175）。スプライシングは、いくつかの小さなリボヌクレオタンパク質粒子（ｓｎＲＮＰ）と、集合してスプライセオソームとして知られる酵素複合体を形成する多くのタンパク質因子との協調した相互作用として起こる（Mooreら, 1993, The RNA World, R.F. Gestland及びJ.F. Atkins編（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）；Kramer, 1996, Annu. Rev. Biochem., 65:367-404；Staley及びGuthrie, 1998, Cell 92: 315-326）。

ほとんどの場合、スプライシング反応は同じプレｍＲＮＡ分子内で起こり、これはシススプライシングと呼ばれる。独立して転写された２つのプレｍＲＮＡの間のスプライシングをトランススプライシングと呼ぶ。トランススプライシングはトリパノソーマで初めて発見され（Sutton及びBoothroyd, 1986, Cell 47: 527；Murphyら, 1986, Cell 47:517）、続いて線虫（Krause及びHirsh, 1987, Cell 49:753）；扁虫（Rajkovicら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8879；Davisら, 1995, J. Biol. Chem. 270: 21813）及び植物のミトコンドリア（Malekら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:553）で発見された。寄生虫であるトリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）では、全てのｍＲＮＡがトランススプライシングによりその５’末端にスプライスリーダー（ＳＬ）ＲＮＡを獲得する。カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）においても、いくつかの遺伝子で５’リーダー配列がトランススプライシングされる。この機構は多くの異なる転写産物に単一の共通配列を付加するのに好適である。

スプライスリーダートランススプライシング機構は従来のシススプライシング機構とほとんど同じであり、２つのホスホリル転移反応によって起こる。まず、２’−５’ホスホジエステル結合が形成され、シススプライシングの場合の輪縄状の中間体に等しい「Ｙ」型の分岐を持つ中間体が生じる。第２の反応であるエキソン連結は従来のシススプライシングと同様に起こる。また、３’スプライス部位の配列及びトランススプライシング反応を触媒するｓｎＲＮＰのいくつかは、シススプライシングに関与するそれらの対応物とよく似ている。

またトランススプライシングは、あるプレｍＲＮＡのイントロンが別のプレｍＲＮＡのイントロンと相互作用して、２つの通常のプレｍＲＮＡ間のスプライス部位の組換えを促進するという、また違ったプロセスについてもいう場合がある。このタイプのトランススプライシングは、トランスジェニックマウスにおいて内因性の定常領域に連結されたヒト免疫グロブリン可変領域配列をコードする転写産物を説明するために仮定されたものである（Shimizuら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8020）。さらにまた、ｃ−ｍｙｂ ｐｒｅ−ＲＮＡのトランススプライシングが実証され（Vellard, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci., 1992 89:2511-2515）、もっと最近では、培養細胞及び核抽出物中に、互いにトランススプライシングされたクローン化ＳＶ４０由来のＲＮＡ転写産物が検出された（Eulら, 1995, EMBO. J. 14:3226）。しかし、哺乳動物プレｍＲＮＡの天然に存在するトランススプライシングは極めて稀な事象であると考えられる（Flouriot G.ら, 2002 J. Biol. Chem；Finta, C.ら, 2002 J. Biol Chem 277:5882-5890）。

いくつかのグループにより、スプライシング機構を調べるモデル系としてｉｎ ｖｉｔｒｏトランススプライシングが用いられている（Konarska及びSharp, 1985, Cell 46:165-171；Solnick, 1985, Cell 42:157；Chiara及びReed, 1995, Nature 375:510；Pasman及びGarcia-Blanco, 1996, Nucleic Acids Res. 24:1638）。かなり効率的なトランススプライシング（シススプライシングされた類似体の３０％）が互いに塩基対合可能なＲＮＡ間で達成されたが、塩基対合によって結びつかないＲＮＡのスプライシングはさらに１０分の１に低くなった。基質間で明確なＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を必要としない他のｉｎ ｖｉｔｒｏトランススプライシング反応が、Chiara及びReed（1995, Nature 375: 510）、Bruzik J.P.及びManiatis, T.（1992, Nature 360:692）並びにBruzik J.P.及びManiatis, T.（1995, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92: 7056-7059）によって観察されている。これらの反応は比較的低い頻度でしか起こらず、下流５’スプライス部位又はエキソンスプライシングエンハンサーなどの特殊なエレメントを要する。

ＲＮＡを正しく切断して連結するよう作用する複数のタンパク質の前駆体ｍＲＮＡへの結合を含むスプライシング機構に加えて、第３の機構としてはイントロン自身によるＲＮＡの切断及び連結を含み、これは触媒ＲＮＡ分子又はリボザイムと呼ばれる。このリボザイムの切断活性は、リボザイムに別の「ハイブリダイゼーション」領域を組み込むことにより特定のＲＮＡにターゲティングされている。標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、このリボザイム切断触媒領域は標的を切断する。このようなリボザイム活性は、外来の又は異常なＲＮＡの産生を特徴とするヒト疾患の治療など、ｉｎ ｖｉｖｏにおける標的ＲＮＡの不活性化又は切断に有用であることが示唆されている。このような例では、小さなＲＮＡ分子を標的ＲＮＡとハイブリダイズさせ、標的ＲＮＡに結合させることによって標的ＲＮＡの翻訳を妨げるか、あるいはヌクレアーゼの活性化によりＲＮＡの破壊を起こすように設計する。また、特定のＲＮＡのターゲティング及び破壊のためのもう１つの機構として、アンチセンスＲＮＡの使用も提案されている。

テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のグループＩリボザイムを用いて、標的化トランススプライシングが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Sullenger B.A.及びCech. T.R., 1994, Nature 341:619-622）、マウス繊維芽細胞（Jones, J.T.ら, 1996, Nature Medicine 2:643-648）、ヒト繊維芽細胞（Phylacton, L.A.ら Nature Genetics 18:378-381）及びヒト赤血球前駆細胞（Lanら, 1998, Science 280:1593-1596）で実証された。ＲＮＡを改変するための臨床的に関連する技術の概説については、Sullenger及びGilboa, 2002 Nature 418:252-8を参照されたい。本発明は、標的化ｍＲＮＡのコード配列を再プログラムする又は改変するための、天然の哺乳動物スプライシング機構、すなわちスプライセオソームにより媒介される標的化（ターゲティング）トランススプライシングの使用に関する。

米国特許第６，０８３，７０２号、同第６，０１３，４８７号及び同第６，２８０，９７８号は、ＰＴＭを用い、標的前駆体ｍＲＮＡと接触させることによりトランススプライシング反応を媒介して新規なキメラＲＮＡを生成することを記載している。本発明は、ＦＶＩＩＩ欠陥遺伝子を修正するために設計された特異的ＰＴＭ分子を提供する。本発明の特異的ＰＴＭは、種々のＦＶＩＩＩ障害（血友病Ａなど）を治療するために用い得る。

２．２．第ＶＩＩＩ因子の遺伝的欠陥
血友病Ａは、凝固因子である第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠損により生じる遺伝的欠陥である。この欠損は、高頻度に自然発生する関節内関節（intra-articular joint）と軟組織出血事象を呈する伴性劣性遺伝病である（Roberts及びHoffman, 1995）。ＦＶＩＩＩ欠損の表現型は、血友病患者全体の８０％を構成し、これは血漿中に循環する機能的ＦＶＩＩＩのレベルと直接関連している。例えば、正常ＦＶＩＩＩ活性の１％未満しかない患者は、高頻度の出血事象を示す重篤な表現型であり、血漿由来又は組換えのＦＶＩＩＩ製品による治療を必要とする。中程度の疾患症候を示す患者は、５％〜３０％以上の正常ＦＶＩＩＩレベルを維持し、典型的には自発的な出血事象はあまり示さないが、このような患者でも依然として外傷誘発性出血の危険性がある。因子レベルが１〜５％の場合には、自発的な出血の頻度が中程度である。

出血時における血漿から精製された又は組換えのＦＶＩＩＩタンパク質による治療は、血友病患者にとって標準的な処置である。研究により、１週間に３回の予防的なＦＶＩＩＩ注入処置が関節出血の頻度及び重篤度の低減に対して顕著な効果を有していることが証明されている（Lofqvistら, 1997）。従って、ＦＶＩＩＩ遺伝子導入の目的は、因子の産生を５％以上のレベルに長期間にわたり維持することであり、これにより、重篤な罹患患者を中程度の表現型へと有効に転換させうる。

ＦＶＩＩＩの生物学及び生化学は、Kaufmanら, 1997により十分に概説されている。ＦＶＩＩＩ遺伝子は、２６のエキソンから構成される９ＫｂのｍＲＮＡをコードする。細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞は機能的ＦＶＩＩＩを分泌するが、肝臓がその合成の主要源である（Wionら, 1985）。肝臓においては、洞様毛細血管内皮細胞及び肝細胞の両方がＦＶＩＩＩを合成及び分泌することができる（Doら, 1999；Hollestelleら, 2001）。ＦＶＩＩＩのｃＤＮＡは２３５１アミノ酸の一本鎖ポリペプチドをコードし（Burkeら, 1986）、これがタンパク質分解的切断をうけて、重鎖及び軽鎖からなる２８０ＫＤの成熟ヘテロ二量体性タンパク質を生じる。

血友病患者の遺伝的分析によって、ＦＶＩＩＩ遺伝子における広い範囲の種々の変異が明らかになっている。２５００人もの血友病患者におけるＦＶＩＩＩ遺伝子のクローニングが調べられ、その疾患の遺伝的な根拠が判定されている。かかる研究は、特定の変異の種類と疾患の表現型との相関を特定している。例えば、重篤な全血友病患者の４０％はエキソン１と２２とにわたる染色体内交差（intrachromosonal crossing）に続いて逆位を有する（Waceyら, 1996）。残りの６０％の血友病患者は、大きな欠失、フレームシフト、ミスセンス変異及びナンセンス変異を有する。軽度から中程度の疾患を示す患者の８０％以上がミスセンス変異を有する。

全長ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡのサイズ（７〜９Ｋｂ）が大きいため、ｉｎ ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩを組織に送達するためのベクター系の設計能力に限界がある。スプライセオソーム媒介型ＲＮＡトランススプライシング技術を用いることにより、ＦＶＩＩＩ遺伝子の修正を、全長ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現を必要とせずに行うことができ、それによりベクターサイズの限界に伴う問題を回避する。

３．発明の概要
本発明は、スプライセオソーム媒介型標的トランススプライシングを介して新規な核酸分子を作製するための改良された組成物及び方法に関する。本発明の組成物は、天然の標的プレｍＲＮＡ分子（以下、「プレｍＲＮＡ」という）と相互作用しかつ新規なキメラＲＮＡ分子（以下、「キメラＲＮＡ」という）の形成をもたらすスプライセオソームトランススプライシング反応を媒介するように設計された、プレトランススプライシング分子（以下、「ＰＴＭ」という）を含む。本発明の新規ＰＴＭは、トランススプライシング反応の効率を高めるために設計された以下のような特徴の１以上を含む：すなわち、（ｉ）標的イントロンの３’スプライスシグナルに近接してイントロン配列にターゲティングする結合ドメイン、（ｉｉ）ミニイントロン配列、（ｉｉｉ）ＩＳＡＲ（イントロンスプライシングアクチベーター及びリプレッサー）のコンセンサス結合部位、並びに／又は（ｉｖ）リボザイム配列。

本発明の方法は、本発明のＰＴＭと天然標的プレｍＲＮＡとを、ＰＴＭの一部が天然プレｍＲＮＡにスプライシングされて新規なキメラＲＮＡを形成するような条件下で接触させることを含む。本発明のＰＴＭは、トランススプライシング反応から生じた新規なキメラＲＮＡそれ自体がＲＮＡの翻訳を阻害するといった機能を遂行するか、あるいはまた、キメラＲＮＡが細胞内で欠陥のある又は不活性なタンパク質を補完するタンパク質をコードするか、又は特定の細胞を死滅させる毒素をコードするように遺伝子操作される。一般に、標的プレｍＲＮＡは、それが特定の細胞型で発現され、それにより新規なキメラＲＮＡの発現を選択された細胞型に標的化（ターゲティング）するための手段を提供するという理由で選択される。標的細胞としては、限定されるものではないが、ウイルスその他の感染性病原因子に感染した細胞、良性又は悪性新生物、あるいは自己免疫疾患又は組織拒絶に関わる免疫系の成分が挙げられる。また本発明のＰＴＭは、遺伝病に関与することが分かっている遺伝子変異を修正するためにも使用できる。特に、内部エキソンを置換するために二重トランススプライシング反応を用いることができる。本発明のＰＴＭはまた、標的プレｍＲＮＡにおいてイントロン／エキソン境界を同定する方法としてｍＲＮＡ分子のエキソン配列にタグを付す（エキソンタギング）ために遺伝子操作することもできる。本発明はさらに、特定の細胞型で発現されるタンパク質を精製及び同定する際に用いるペプチドアフィニティー精製タグをコードするよう遺伝子操作されるＰＴＭ分子の使用に関する。本発明の方法及び組成物は遺伝子調節、遺伝子修復及び標的化された細胞死に使用することができる。このような方法及び組成物は限定されるものではないが、遺伝病、感染性疾患又は自己免疫疾患、及び癌などの増殖性疾患の治療並びに植物における遺伝子発現の調節に使用できる。

本発明の組成物は、ＦＶＩＩＩ標的プレｍＲＮＡ分子（以下、「ＦＶＩＩＩプレｍＲＮＡ」と称する）と相互作用し、スプライセオソームトランススプライシング反応を媒介して、新規キメラＲＮＡ分子（以下、「キメラＲＮＡ」と称する）の生成を生じさせるように設計された、プレトランススプライシング分子（以下「ＰＴＭ」と称する）を含む。

本発明の組成物は、ＦＶＩＩＩ標的プレｍＲＮＡ分子と相互作用し、スプライセオソームトランススプライシング反応を媒介して、新規キメラＲＮＡ分子の生成を生じさせるように設計されたＰＴＭを含む。かかるＰＴＭは、凝固因子ＦＶＩＩＩ遺伝子における欠陥を修正するように設計される。ＰＴＭの一般的な設計、構築及び遺伝子操作、並びにそれらの細胞内でのトランススプライシング反応の媒介能力の証明は、米国特許第６，０８３，７０２号、同第６，０１３，４８７号及び同第６，２８０，９７８号、並びに特許出願第０９／７５６，０９５号、同０９／７５６，０９６号、同０９／７５６，０９７号及び同０９／９４１，４９２号に詳細に記載されており、これらの開示内容は、その全体を参照により本明細書に援用する。

本発明の方法は、本発明のＰＴＭとＦＶＩＩＩ標的プレｍＲＮＡとを、ＰＴＭの一部が標的プレｍＲＮＡにスプライシングされて新規キメラＲＮＡを形成するような条件下にて接触させることを含む。本発明の方法は、本発明のＰＴＭとＦＶＩＩＩ標的プレｍＲＮＡを発現する細胞とを、ＰＴＭが細胞により取り込まれて、合成ＰＴＭの一部が標的プレｍＲＮＡの一部にトランススプライシングされて、ＦＶＩＩＩ遺伝的欠陥の修正をもたらす新規キメラＲＮＡ分子を形成するような条件下にて接触させることを含む。あるいは、ＰＴＭをコードする核酸分子は標的細胞に送達され、その後、該核酸分子が発現されて、トランススプライシング反応を媒介することができるＰＴＭが形成させうる。本発明のＰＴＭは、トランススプライシング反応により生じる新規キメラＲＮＡが細胞内において欠陥又は不活性ＦＶＩＩＩタンパク質を補完する又は修正するように遺伝子操作されている。本発明の方法及び組成物は、種々の疾患、例えば限定されるものではないが、血友病ＡなどのＦＶＩＩＩの遺伝的障害、を治療するための遺伝子修復に用いることができる。

４．図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については下記参照）。

５．発明の詳細な説明
本発明はプレトランススプライシング分子（ＰＴＭ）を含む新規な組成物、及び新規な核酸分子を作製するためのかかる分子の使用に関する。本発明のＰＴＭは、（ｉ）プレｍＲＮＡに特異的に結合するように設計された１以上の標的結合ドメイン、（ｉｉ）分岐点、ピリミジン領域、並びに３’スプライス受容部位及び／又は５’スプライス供与部位を含む３’スプライス領域、を含み、さらに以下の特徴の少なくとも１つを含んでもよい：（ａ）標的結合ドメインをＲＮＡスプライス部位と隔てる１以上のスペーサー領域、（ｂ）ミニイントロン配列、（ｃ）ＩＳＡＲ（イントロンスプライシングアクチベーター及びリプレッサー）のコンセンサス結合部位、並びに／又は（ｄ）リボザイム配列。本発明のＰＴＭは、さらに、標的結合ドメインをＲＮＡスプライス部位と隔てる１以上のスペーサー領域、及び／又は別のヌクレオチド配列（翻訳可能なタンパク質産物をコードするものなど）を含んでもよい。

本発明の方法は、本発明のＰＴＭと天然プレｍＲＮＡとを、ＰＴＭの一部が天然プレｍＲＮＡの一部へとトランススプライシングされて新規なキメラＲＮＡを形成するような条件下で接触させることを含む。標的プレｍＲＮＡは、それが特定の細胞型で発現し、従って、新規なＲＮＡの発現を選択された細胞型へターゲティングする機構をもたらすことから、標的として選択される。得られるキメラＲＮＡは、特定の細胞型で所望の機能をもたらすか、又は遺伝子産物を産生しうる。特定の細胞としては、限定されるものではないが、ウイルスその他の感染性病原因子に感染したもの、良性又は悪性新生物、あるいは自己免疫疾患又は組織拒絶に関わる免疫系の成分が挙げられる。特異性はＰＴＭの結合ドメインを標的内因性プレｍＲＮＡに結合するように改変することで主に達成される。キメラＲＮＡによりコードされる遺伝子産物は、例えば治療遺伝子又はマーカー遺伝子並びに毒素をコードする遺伝子など、臨床的に有用な遺伝子をはじめとするいずれの遺伝子であってもよい。

本発明はさらに、プレトランススプライシング分子（ＰＴＭ）を含む組成物、及び新規な核酸分子を作製するためのかかる分子の使用に関する。本発明のＰＴＭは、（ｉ）プレｍＲＮＡに特異的に結合するように設計された１以上の標的結合ドメイン、（ｉｉ）分岐点、ピリミジン領域、並びに３’スプライス受容部位及び／又は５’スプライス供与部位を含む３’スプライス領域を含む。また、本発明のＰＴＭは、任意のヌクレオチド配列、例えば翻訳可能なタンパク質産物をコードするものなど、及び標的結合ドメインをＲＮＡスプライス部位と隔てる１以上のスペーサー領域を含むように操作することもできる。

本発明の方法は、本発明のＰＴＭとＦＶＩＩＩ標的プレｍＲＮＡとを、ＰＴＭの一部が標的プレｍＲＮＡの一部へとトランススプライシングされて、ＦＶＩＩＩ遺伝的欠陥の修正をもたらす新規なキメラＲＮＡを形成するような条件下で接触させることを含む。

５．１．プレトランススプライシング分子の構造
本発明は、標的化トランススプライシングにより新規なキメラ核酸分子を作出するのに用いる改良された組成物を提供する。本発明のＰＴＭは、（ｉ）ＰＴＭのプレｍＲＮＡへの結合をターゲティングする１以上の標的結合ドメイン、（ｉｉ）分岐点、ピリミジン領域、並びに３’スプライス受容部位及び／又は５’スプライス供与部位を含む３’スプライス領域、を含み、そしてまた（ｉｉｉ）以下の特徴の少なくとも１つ：（ａ）標的イントロンの３’又は５’スプライスシグナルに近接してイントロン配列にターゲティングする結合ドメイン、（ｂ）ミニイントロン、（ｃ）ＩＳＡＲ（イントロンスプライシングアクチベーター及びリプレッサー）のコンセンサス結合部位、並びに／又は（ｄ）リボザイム配列、を含んでもよい。本発明のＰＴＭは、さらに、標的結合ドメインをＲＮＡスプライス部位と隔てる１以上のスペーサー領域を含んでもよい。また、このＰＴＭは翻訳可能なタンパク質産物をコードする任意のヌクレオチド配列を含むように操作することもできる。本発明のさらにもう１つの実施形態では、ＰＴＭはキメラＲＮＡ分子の翻訳を阻害するヌクレオチド配列を含むように操作することができる。例えば、このヌクレオチド配列は、翻訳終止コドン又は二次構造を形成することにより翻訳を阻害するヌクレオチド配列を含んでもよい。あるいは、キメラＲＮＡはアンチセンス分子として働き、それによりそれが結合するＲＮＡの翻訳を阻害するものであってもよい。

かかるＰＴＭの一般的な設計、構築及び遺伝子操作、並びにそれらの細胞内でのトランススプライシング反応の媒介能力の証明については、米国特許第６，０８３，７０２号、同第６，０１３，４８７号及び同第６，２８０，９７８号、並びに特許出願第０９／９４１，４９２号、同第０９／７５６，０９５号、同０９／７５６，０９６号及び同０９／７５６，０９７号に詳細に記載されており、これらの開示内容は、その全体を参照により本明細書に援用する。

ＰＴＭの標的結合ドメインは、標的プレｍＲＮＡに対する結合親和性を有するＰＴＭを与える。本明細書において、標的結合ドメインは、結合の特異性を与え、核のスプライセオソームプロセシング機構が合成ＰＴＭの一部をプレｍＲＮＡの一部へとトランススプライシングできるように該合成ＰＴＭと近接してプレｍＲＮＡをつなぎ止める任意の分子（すなわち、ヌクレオチド、タンパク質、化学化合物など）として定義される。

ＰＴＭの標的結合ドメインは、選択されたプレｍＲＮＡのターゲティング領域に対して相補的、かつ、アンチセンス配向である複数の結合ドメインを含みうる。この標的結合ドメインは数千までのヌクレオチドを含みうる。本発明の好ましい実施形態では、この結合ドメインは少なくとも１０ないし３０、数百以上までのヌクレオチドを含みうる。ＰＴＭの特異性は標的結合ドメインの長さを増加させることによって著しく高めることができる。例えば標的結合ドメインは数百又はそれより多いヌクレオチドを含んでもよい。さらにまた、標的結合ドメインは「直鎖状」であってもよいが、このＲＮＡは、複合体を安定化させて、それによりスプライシング効率を高めうる二次構造を形成するように折りたたまれると考えられる。第２の標的結合領域は分子の３’末端に位置してもよく、本発明のＰＴＭに組み込むことができる。絶対的な相補性が好ましいが、必ずしも必要ではない。本明細書に関してＲＮＡの一部に「相補的な」配列とは、その標的プレＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重らせんを形成しうるのに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズ能は相補性の程度及び核酸の長さの両方に依存しうる（例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York参照）。一般にハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡとミスマッチする塩基をより多く含んでなお安定した二重らせんを形成する。当業者ならば、標準的な方法を用いてハイブリダイズした複合体の安定性を調べることにより、二重らせんのミスマッチ又は長さの許容度を確かめることができる。

また、結合は、その他の機構、例えば三重らせんの形成、アプタマー相互作用、抗体相互作用又はＰＴＭが特定のＲＮＡ結合タンパク質、すなわち特定の標的プレｍＲＮＡと結合したタンパク質を認識するように操作されているものなど、タンパク質／核酸相互作用によって達成することもできる。あるいは、本発明のＰＴＭは、例えばＲＮＡ分子内のヌクレオチド間の分子内塩基対合によって生じるヘアピン構造などの二次構造を認識するように設計してもよい。

本発明の特定の実施形態において、５’エキソン置換ＰＴＭの結合ドメインは、イントロン配列の３’スプライスシグナルに近接して該イントロン配列に結合するようにターゲティングする。ＰＴＭのイントロンの３’末端へのターゲティングは、ＰＴＭ供与部位が標的受容部位と近接するようにすることを意図している。本発明の実施形態において、ＰＴＭ結合部位は、３’イントロン配列から２０〜数千ヌクレオチドにおいて結合するようターゲティングする。

本発明の特定の実施形態において、標的結合ドメインは、トランススプライシングのためにターゲティングされるＦＶＩＩＩ標的プレｍＲＮＡの領域に近接した配列と相補的であり、かつアンチセンス配向である。例えば、標的結合ドメインは、結合の特異性を与え、核のスプライセオソームプロセシング機構がＰＴＭの一部をＦＶＩＩＩプレｍＲＮＡの一部へとトランススプライシングできるように該ＰＴＭと近接してＦＶＩＩＩプレｍＲＮＡをつなぎ止める、任意の分子（すなわち、ヌクレオチド、タンパク質、化学化合物など）として定義されうる。

また、ＰＴＭ分子は、分岐点配列、並びに３’スプライス受容ＡＧ部位及び／又は５’スプライス供与部位を含む３’スプライス領域を含む。３’スプライス領域は、さらにポリピリミジン領域（polypyrimidine tract）を含んでもよい。ＲＮＡスプライシングに用いる５’スプライス供与部位及び３’スプライス領域のコンセンサス配列は当技術分野で周知のものである（Mooreら, 1993, The RNA World, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 303-358参照）。さらにまた、本発明の実施において、５’供与スプライス部位及び３’スプライス領域として機能する能力を維持する修飾コンセンサス配列を用いてもよい。簡単に説明すると、５’スプライス部位のコンセンサス配列はＡＧ／ＧＵＲＡＧＵ（ここで、Ａ＝アデノシン、Ｕ＝ウラシル、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝プリン及び／＝スプライス部位）である。３’スプライス部位は分岐点又は分岐部位、ポリピリミジン領域及び３’コンセンサス配列（ＹＡＧ）の３つの異なる配列エレメントからなる。哺乳動物の分岐点のコンセンサス配列はＹＮＹＵＲＡＣ（Ｙ＝ピリミジン、Ｎ＝任意のヌクレオチド）である。下線を引いたＡは分岐形成部位である。ポリピリミジン領域は、分岐点とスプライス部位受容部位との間に位置し、様々な分岐点利用及び３’スプライス部位認識に重要なものである。最近、ジヌクレオチドＡＵで始まり、ジヌクレオチドＡＣで終わるプレメッセンジャーＲＮＡイントロンが確認され、Ｕ１２イントロンと呼ばれている。Ｕ１２イントロン配列並びにスプライス受容／供与配列として機能するいずれかの配列を本発明のＰＴＭを作製するために用いてもよい。

また、標的結合ドメインをＲＮＡスプライス部位と隔てるスペーサー領域もＰＴＭに含めることができる。このスペーサー領域は、非スプライスＰＴＭの翻訳を遮断する終止コドン、及び／又は標的プレｍＲＮＡへのトランススプライシングを促進する配列などの特徴を含むように設計されうる。

本発明の好ましい実施形態では、スペーサー、結合ドメイン、又はＰＴＭの他のいずれかの場所に「セーフティー」を組み込んで非特異的トランススプライシングを妨げる。これは比較的弱い相補性によってＰＴＭの３’及び／又は５’スプライス部位のエレメントを覆って非特異的トランススプライシングを妨げるＰＴＭの１領域である。ＰＴＭは、ＰＴＭの結合／ターゲティング部分のハイブリダイゼーションの際に３’及び／又は５’スプライス部位は覆われず、完全活性型となるように設計される。

「セーフティー」は、ＰＴＭ分岐点、ピリミジン領域、３’スプライス部位及び／又は５’スプライス部位（スプライシングエレメント）の片側又は両側に結合する１以上のシス配列の相補的ストレッチからなる（又は、第２の個別の核酸鎖でありうる）か、あるいは、スプライシングエレメントそれ自体の一部と結合しうる。この「セーフティー」結合はスプライシングエレメントが活性となるのを防ぐ（すなわちＵ２ ｓｎＲＮＰその他のスプライシング因子がＰＴＭスプライス部位認識エレメントと結合するのを妨げる）。この「セーフティー」の結合はＰＴＭの標的結合領域が標的プレｍＲＮＡに結合して露出し、ＰＴＭスプライシングエレメントを活性化する（それらを標的プレｍＲＮＡへとトランススプライシングされやすくする）ことで阻害されうる。

本発明のＰＴＭには、細胞死などの作用をもたらしうる翻訳可能なタンパク質、あるいはマーカーとしての欠損した機能又は作用を回復するものをコードするヌクレオチド配列が含まれる。例えば、ヌクレオチド配列は公知の遺伝病で欠損又は変異している遺伝子産物をコードする配列を含みうる。あるいは、ヌクレオチド配列は、細胞の同定又は画像化に用いうるマーカータンパク質又はペプチドをコードすることができる。本発明のさらに別の実施形態では、アフィニティー精製に用いるＰＴＭ分子には、ＨＩＳタグ（６つの連続するヒスチジン残基）（Janknechtら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端（Smith及びJohnson, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8703-8707）（Pharmacia）、ＦＬＡＧ（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys）（Eastman Kodak/IBI, Rochester, NY）、又はＣＤＣ２ ＰＳＴＡＩＲＥエピトープタグなどのアフィニティータグをコードするヌクレオチド配列を含めてもよい。

さらに、本発明のＰＴＭは、ＦＶＩＩＩ遺伝的欠陥を修正するために設計されたＦＶＩＩＩエキソン配列を含みうる。種々の異なるＰＴＭ分子を、欠陥又は不活性ＦＶＩＩＩタンパク質を補完する新規キメラＲＮＡの作製に用いるために合成しうる。本発明のＰＴＭは、ＦＶＩＩＩ標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされた場合に、機能的ＦＶＩＩＩタンパク質をコード可能な合成物又はキメラＲＮＡの形成をもたらしうる、ＦＶＩＩＩエキソン配列を含みうる。ＦＶＩＩＩ遺伝子のヌクレオチド配列は公知であり、本明細書にその全体を援用する（ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｍ８８６２８−Ｍ８８６４８；Truettら, 1985, DNA 4:333-349；http://europium.csc.mrc.ac.uk/usr/WWW/WebPages/main.dir/main.htmも参照されたい）。

ＰＴＭの構造に含められるＦＶＩＩＩエキソン配列は、修正のためにターゲティングされる特定のＦＶＩＩＩ変異に応じて異なりうる。例えば、ＦＶＩＩＩのエキソン１６における変異の修正をターゲティングする場合には、ＰＴＭは、図９に示すようにＦＶＩＩＩのエキソン１６〜２６の配列を含むように設計されうる。かかる場合、３’エキソン置換により、機能的ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするキメラＲＮＡ分子が形成され得る。本発明のＰＴＭは、単一のＦＶＩＩＩエキソン配列、複数のＦＶＩＩＩエキソン配列、あるいは２６のエキソン配列の完全なセットを含むように操作しうる。ＰＴＭに使用するＦＶＩＩＩ配列の数及び種類は、ターゲティングされるＦＶＩＩＩ変異、及び引き起こそうとするトランススプライシング反応の種類（すなわち、５’エキソン置換、３’エキソン置換又は内部エキソン置換）に応じて異なりうる。

本発明の特異的ＰＴＭは、限定するものではないが、ＦＶＩＩＩのエキソン１−２６、２−２６、３−２６、４−２６、５−２６、６−２６、７−２６、８−２６、９−２６、１０−２６、１１−２６、１２−２６、１３−２６、１４−２６、１５−２６、１６−２６、１７−２６、１８−２６、１９−２６、２０−２６、２１−２６、２２−２６、２３−２６、２４−２６、２５−２６又は２６単独をコードする核酸を含むものが挙げられる。かかるＰＴＭは、図８に示すような３’エキソン置換トランススプライシング反応を媒介するために使用しうる。

本発明の特異的ＰＴＭは、限定するものではないが、ＦＶＩＩＩのエキソン１、又はエキソン１−２、１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−８、１−９、１−１０、１−１１、１−１２、１−１３、１−１４、１−１５、１−１６、１−１７、１−１８、１−１９、１−２０、１−２１、１−２２、１−２３、１−２４若しくは１−２５をコードする核酸を含むものが挙げられる。かかるＰＴＭは、図８に示すような５’エキソン置換トランススプライシング反応を媒介するために使用しうる。

さらに、本発明のＰＴＭは、単一のＦＶＩＩＩエキソン、又は２以上のＦＶＩＩＩエキソンの組み合わせを含み得る。

またさらに、ＰＴＭのサイズを制限するために、分子は、ＦＶＩＩＩ遺伝子の非必須領域に欠失を含んでもよい。例えば、エキソン１４によりコードされるＢドメインの欠失は、生物学的活性を保持することが見出されている。

本発明はさらに、ＰＴＭのコード領域がミニイントロンを含むように操作されているＰＴＭ分子を提供する。ミニイントロンのＰＴＭのコード配列への挿入は、エキソンの境界を明確にし、ＰＴＭ供与部位の認識を増強するように設計される。ＰＴＭのコード領域に挿入すべきミニイントロンの配列には、天然の小さなイントロン、又は、分岐点、３’スプライス部位及び場合によりピリミジン領域を含む、５’コンセンサス供与部位及び３’コンセンサス配列を含む任意のイントロン配列、例えば合成ミニイントロンが含まれる。

ミニイントロン配列は、約６０〜１５０ヌクレオチド長であることが好ましいが、さらに長さが長いミニイントロン配列を使用することも可能である。本発明の好ましい実施形態において、ミニイントロンは、内因性イントロンの５’及び３’末端を含む。本発明の好ましい実施形態において、５’イントロン断片は約２０ヌクレオチド長であり、３’末端は約４０ヌクレオチド長である。

本発明の特定の実施形態において、以下の配列を含む５２８ヌクレオチドのイントロンを用いることができる。イントロン構築物の配列は以下の通りである：

本発明のまた別の実施形態においては、コンセンサスＩＳＡＲ配列を本発明のＰＴＭに含める（Jonesら, NAR 29:3557-3565）。タンパク質は、Ｕ１ ＳｎＲＮＰによる５’スプライス部位認識に必要なウリジンリッチ領域を含むＩＳＡＲスプライシングアクチベーター及びリプレッサーのコンセンサス配列に結合する。１８ヌクレオチドのＩＳＡＲコンセンサス配列は、次の配列：GGGCUGAUUUUUCCAUGUを含む。ＩＳＡＲコンセンサス配列は、本発明のＰＴＭに挿入する場合には、イントロン配列の５’供与部位に近接してＰＴＭの構造に挿入される。本発明の実施形態において、ＩＳＡＲ配列は、５’供与部位から１００ヌクレオチド以内に挿入される。本発明の好ましい実施形態において、ＩＳＡＲ配列は５’供与部位から５０ヌクレオチド以内に挿入される。本発明のより好ましい実施形態において、ＩＳＡＲ配列は５’供与部位から２０ヌクレオチド以内に挿入される。

本発明の組成物は、シス作用性リボザイム配列を含むように操作されたＰＴＭをさらに含む。かかる配列の導入は、トランススプライシングの不在下でのＰＴＭの翻訳を低減し、又は特定の長さ若しくは所定の末端を有するＰＴＭを生成するために設計される。ＰＴＭに挿入しうるリボザイム配列は、シス作用性（自己切断性）ＲＮＡスプライシング反応を媒介可能な任意の配列を含む。かかるリボザイムには、限定されるものではないが、ハンマーヘッド型、ヘアピン型及び肝炎デルタウイルスリボザイムが含まれる（Chowら 1994, J Biol Chem 269:25856-64参照）。

本発明の実施形態において、スプライシングエンハンサー、例えばエキソンスプライシングエンハンサーと称される配列など、が合成ＰＴＭの構造に含まれてもよい。トランス作用性スプライシング因子、すなわちセリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質は、かかるエキソンスプライシングエンハンサーと相互作用し、スプライシングをモジュレートすることが示されている（Tackeら, 1999, Curr. Opin. Cell Biol. 11:358-362；Tianら, 2001, J. Biological Chemistry 276:33833-33839；Fu, 1995, RNA 1:663-680参照）。またＰＴＭ分子には核局在化シグナルが含まれてもよい（Dingwell及びLaskey, 1986, Ann .Rev. Cell Biol. 2:367-390；Dingwell及びLaskey, 1991, Trends in Biochem. Sci. 16:478-481）。かかる核局在化シグナルを用いて、トランススプライシングが生じる核への合成ＰＴＭの輸送を高めることができる。

ＰＴＭ分子の前後いずれかにさらなる特徴（例えば、ＲＮＡ発現／安定性を改変するためのポリアデニル化シグナル若しくはスプライシングを促進するための５’スプライス配列、さらなる結合領域、「セーフティー」自己相補領域、さらなるスプライス部位、又は分子の安定性を調節し、分解を防ぐための保護基など）を有する翻訳可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を付加することができる。さらに、ＰＴＭ構造に終止コドンを含有させて、スプライシングされていないＰＴＭの翻訳を防止しうる。核局在化及びスプライセオソームの組み込み、並びに細胞内安定性を促進又は補助するため、ＰＴＭに３’ヘアピン構造、環化ＲＮＡ、ヌクレオチド塩基修飾又は合成類似体などのさらなるエレメントを組み込むことができる。

また、キメラトランススプライシング産物の作製に二重トランススプライシング反応を必要とするＰＴＭも作製することができる。このようなＰＴＭは、例えばＦＶＩＩＩ遺伝子修復に使用できる内部エキソンを置換するのに使用できる。２つのトランススプライシング反応を促進するように設計されたＰＴＭは上記のように作製されるが、それらは５’供与部位と３’スプライス受容部位の双方を含む。さらに、ＰＴＭは２以上の結合ドメイン及びスプライサー領域を含んでもよい。これらのスプライサー領域は複数の結合ドメインとスプライス部位との間、あるいはまた複数の結合ドメイン間で置換してもよい。

新規なｌａｃＺ系アッセイが、所望のトランススプライシング反応を媒介するための最適ＰＴＭ配列を同定するために開発されている（図３）。このアッセイにより、多数のＰＴＭをそのトランススプライシング能力について非常に迅速にかつ簡便に試験することが可能となる。ＬａｃＺ ＦＶＩＩＩキメラ標的を図３に示す。この標的は、ＬａｚＺのコード領域（中心コード領域から−１２０ヌクレオチド）から構成され、５’「エキソン」及び２’「エキソン」に分割される。これらのエキソンの分離は、マウスの第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロン１５、エキソン１６及びイントロン１７を含むゲノム断片である。この標的における供与部位及び受容部位の全ては機能的であるが、ＬａｃＺ−ＦＶＩＩＩキメラｍＲＮＡを生成するシススプライシングされる標的は、β−ｇａｌ活性については非機能的である。ＰＴＭと標的との間のトランススプライシングにより、全長機能的ＬａｃＺ ｍＲＮＡが生成される。

試験しようとする新規ＰＴＭの各々は、リポフェクトアミン試薬を用いて、ＬａｃＺ−ＦＶＩＩＩ標的と共に一過性に共トランスフェクトし、その後、４８時間後にβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイする。総ＲＮＡサンプルをまた調製し、正確にスプライシングされた修復産物の存在及び修復産物のレベルについて標的及びＰＴＭ特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより評価しうる。各トランススプライシングドメイン（ＴＳＤ）及び結合ドメインは、複数の特有の制限部位を用いて操作し、それにより好適な配列が同定された場合（β−ガラクトシダーゼ活性及びＲＴ−ＰＣＲデータに基づく）に、ＴＳＤの全長又は一部が容易に第ＶＩＩＩ因子ＰＴＭにサブクローニングされうるようにしうる。

特異的ＰＴＭをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成しようとする場合（合成ＰＴＭ）、かかるＰＴＭは、例えば分子の安定性、標的ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション、細胞への輸送などを向上させるために塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格を改変することができる。例えば全体としての電荷を小さくするようＰＴＭを修飾すると、分子の細胞への取り込みを向上させることができる。さらにまた、ヌクレアーゼ分解又は化学的分解に対する感受性を低減する改変を行うこともできる。核酸分子は、ペプチド（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで宿主細胞受容体をターゲティングするため）、又は細胞膜（例えば、Letsingerら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitreら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652；１９８８年１２月１５日公開のＰＣＴ公開Ｗ０８８／０９８１０参照）又は血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日公開のＰＣＴ公開Ｗ０８９／１０１３４）を通過する輸送を補助する薬剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Krolら, 1988, BioTechniques 6:958-976参照）又はインターカレート剤（例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549）などのその他の分子と結合させるように合成してもよい。この目的で核酸分子は、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤などにコンジュゲートしてもよい。

核酸分子への種々のその他周知の改変が細胞内安定性及び半減期を上昇させる手段として導入できる。可能な改変としては、限定されるものではないが、分子の５’及び／又は３’末端へのリボヌクレオチドのフランキング配列の付加が挙げられる。安定性の上昇が望まれるいくつかの環境では、２’−Ｏ−メチル化などの改変型のヌクレオシド内結合を有する核酸が好ましいものでありうる。改変型のヌクレオシド内結合を含む核酸は当業者に周知の試薬及び方法を用いて合成することができる（Uhlmannら, 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneiderら, 1990, Tetrahedron Lett. 31:335及びその中に挙げられている参照文献参照）。

本発明の合成ＰＴＭは、好ましくは細胞内でのそれらの安定性が高まるように修飾される。ＲＮＡ分子は細胞性リボヌクレアーゼによる切断に対して感受性があることから、ＲＮＡ結合配列の作用を模倣するが、ヌクレアーゼ分解に対する感受性の低い化学修飾オリゴヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチドの組合せ）を競合阻害剤としても用いるのが好ましい場合がある。さらに、合成ＰＴＭは、ヌクレアーゼによる分解を防止するために、安定性が増強したヌクレアーゼ耐性環状分子として産生させることもできる（Puttarajuら, 1995, Nucleic Acids Symposium Series No. 33:49-51；Puttarajuら, 1993, Nucleic Acid Research 21:4253-4258）。例えば、結合を増強するため、細胞内取り込みを増強するため、薬理特性若しくは薬物動態を向上させるため、又はその他の医薬上望ましい特性を向上させるために、他の修飾もまた必要とされる場合がある。

合成ＰＴＭの構造に対してなし得る修飾としては、限定されるものではないが、（ｉ）ホスホロチオエート（Ｘ又はＹ又はＷ又はＺ＝Ｓ、又は残りのものがＯである２以上の任意の組合せ）、例えば、Ｙ＝Ｓ（Stein, C. A.ら, 1988, Nucleic Acids Res., 16:3209-3221）、Ｘ＝Ｓ（Cosstick, R.ら, 1989, Tetrahedron Letters, 30, 4693-4696）、Ｙ及びＺ＝Ｓ（Brill, W. K.-D.ら, 1989, J. Amer. Chem. Soc., 111:2321-2322）；（ｉｉ）メチルホスホネート（例えば、Ｚ＝メチル（Miller, P. S.ら, 1980, J. Biol. Chem., 255:9659-9665）；（ｉｉｉ）ホスホルアミダート（Ｚ＝Ｎ−（アルキル）_２、例えばアルキルメチル、エチル、ブチル）（Ｚ＝モルホリン又はピペラジン）（Agrawal, S.ら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079-7083）（Ｘ又はＷ＝ＮＨ）（Mag, M.ら, 1988, Nucleic Acids Res., 16:3525-3543）；（ｉｖ）ホスホトリエステル（Ｚ＝Ｏ−アルキル、例えば、メチル、エチルなど）（Miller, P. S.ら, 1982, Biochemistry, 21:5468-5474）；及び（ｖ）リンを含まない結合（例えば、カルバメート、アセトアミデート、アセテート）（Gait, M. J.ら, 1974, J. Chem. Soc. Perkin I, 1684-1686；Gait, M. J.ら, 1979, J. Chem. Soc. Perkin I, 1389-1394）の使用などの骨格修飾が挙げられる。

さらに、本発明のＰＴＭ中に糖修飾を組み込んでもよい。このような修飾としては、（ｉ）２’−リボヌクレオシド（Ｒ＝Ｈ）；（ｉｉ）２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシド（Ｒ＝ＯＭｅ）（Sproat, B. S.ら, 1989, Nucleic Acids Res., 17:3373-3386）；及び（ｉｉｉ）２’−フルオロ−２’−リボキシヌクレオシド（Ｒ＝Ｆ）（Krug, A.ら, 1989, Nucleosides and Nucleotides, 8:1473-1483）の使用が挙げられる。

さらに、ＰＴＭに対してなし得る塩基修飾としては、限定されるものではないが、（ｉ）５位で置換（例えば、メチル、ブロモ、フルオロなど）されたか、又はカルボニル基がアミノ基に置換しているピリミジン誘導体（Piccirilli, J. A.ら, 1990, Nature, 343:33-37）；（ｉｉ）特定の窒素原子を欠いたプリン誘導体（例えば、７−デアザアデニン、ヒポキサンチン）又は８位で官能基化されたプリン誘導体（例えば、８−アジドアデニン、８−ブロモアデニン）（総説としては、Jones, A. S., 1979, Int. J. Biolog. Macromolecules,1:194-207参照）が挙げられる。

さらにまた、ＰＴＭは、（ｉ）プソラレン類（Miller, P. S.ら, 1988, Nucleic Acids Res., Special Pub. No. 20, 113-114）、フェナントロリン類（Sun, J-S.ら, 1988, Biochemistry, 27:6039-6045）、マスタード類（Vlassov, V. V.ら, 1988, Gene, 72:313-322）（補助試薬を必要とする、又は必要としない不可逆的架橋剤）；（ｉｉ）アクリジン（インターカレート剤）（Helene, C.ら, 1985, Biochimie, 67:777-783）；（ｉｉｉ）チオール誘導体（タンパク質との可逆的ジスルフィド形成）（Connolly, B. A.及びNewman, P. C., 1989, Nucleic Acids Res., 17:4957-4974）；（ｉｖ）アルデヒド類（シッフの塩基形成）；（ｖ）アジド、ブロモ基（ＵＶ架橋）；又は（ｖｉ）エリプチシン類（光分解架橋）（Perrouault, L.ら, 1990, Nature, 344:358-360）などの反応性官能基と共有結合させてもよい。

本発明の１つの実施形態では、糖とヌクレオシド間結合、すなわち、ヌクレオチドユニットの骨格が、新規の基で置換されたオリゴヌクレオチドミメティクスが使用できる。例えば、天然オリゴヌクレオチドに対するよりもＤＮＡ及びＲＮＡに対して高い親和性で結合することが示されているこのようなある種のオリゴヌクレオチドミメティクスはペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる（総説としては、Uhlmann, E. 1998, Biol. Chem. 379:1045-52参照）。このように、ＰＮＡは、それらの安定性及び／又は標的プレｍＲＮＡに対する結合親和性を高めるために合成ＰＴＭへ組み込んでよい。

本発明のもう１つの実施形態では、合成ＰＴＭは親油基又は細胞による取り込みを向上し得るその他の試薬と共有結合させてもよい。例えば、ＰＴＭ分子は、ＰＴＭが細胞へ送達される効率を高めるため、（ｉ）コレステロール（Letsinger, R. L.ら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553-6556）；（ｉｉ）ポリアミン類（Lemaitre, M.ら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84:648-652）；その他の可溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）と共有結合させてもよい。さらにまた、安定性及び標的細胞へのＰＴＭの送達を増強するために上記で示した修飾の組合せを用いてもよい。本発明のＰＴＭは、標的細胞内で新規なキメラＲＮＡを産生するよう設計された方法で用いることができる。本発明のこの方法は、当業者であれば使用し得る任意の形態のＰＴＭ（例えば、ＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子に転写されるＤＮＡベクター）を標的細胞へ送達することを含み、該ＰＴＭはプレｍＲＮＡへ結合し、プレｍＲＮＡの一部へとスプライシングされたＰＴＭ分子の一部を含むキメラＲＮＡの形成をもたらすトランススプライシング反応を媒介する。

本発明の特定の実施形態において、本発明のＰＴＭは、標的細胞において新規キメラＲＮＡを作製し、それにより凝固因子ＦＶＩＩＩの凝固欠陥を修正するように設計された方法において用いることができる。本発明の方法は、当業者であれば使用し得る任意の形態のＰＴＭ（例えば、ＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子に転写されるＤＮＡベクター）を細胞へ送達することを含み、該ＰＴＭはＦＶＩＩＩプレｍＲＮＡへ結合し、プレｍＲＮＡの一部へとスプライシングされるＰＴＭ分子の一部を含むキメラＲＮＡの形成をもたらすトランススプライシング反応を媒介する。

５．２．トランススプライシング分子の合成
本発明の核酸分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡであってもよいし、あるいはその誘導体又は修飾形態であってもよいし、一本鎖又は二本鎖であってもよい。核酸とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成されるか、及びホスホジエステル結合又は修飾型結合から構成されるかに関わらず、ＰＴＭ分子又はＰＴＭ分子をコードする核酸分子を意味する。用語「核酸」とはまた、特に５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の塩基からなる核酸も含む。さらにまた、本発明のＰＴＭは、ＰＴＭの安定性を高めるよう設計されたＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／タンパク質又はＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質のキメラ分子を含み得る。

本発明のＰＴＭは、核酸分子の合成に関して当技術分野で公知の任意の方法により調製することができる。例えば、核酸は市販の試薬及び当技術分野で周知の方法による合成装置を用いて化学的に合成してもよい（例えば、Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England参照）。

あるいは、合成ＰＴＭは目的のＰＴＭをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって作製することもできる。このようなＤＮＡ配列はＴ７、ＳＰ６又はＴ３ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターから下流の広範なベクターへと組み込むことができる。コンセンサスＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は以下のものを含む：

太字の塩基は転写の際にＲＮＡへ組み込まれる最初の塩基である。下線は効率的な転写に必要な最小配列を示している。

ＲＮＡは、ＳＰＳ６５及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Promega Corporation, Madison, WI）などのプラスミドを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により高収量で得られる。さらにまた、目的のＰＴＭの作製にはＱ−β増幅などのＲＮＡ増幅法を用いることができる。

ＰＴＭは、当技術分野において周知の任意の好適な手段によって精製しうる。例えば、ＰＴＭは、ゲル濾過、アフィニティ若しくは抗体相互作用、逆相クロマトグラフィー又はゲル電気泳動によって精製することができる。もちろん当業者ならば、精製方法が精製する核酸の大きさ、電荷及び形状によってある程度異なることが分かるであろう。

本発明のＰＴＭは、化学的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで又はｉｎ ｖｉｖｏで合成されるかに関わらず、ＰＴＭの安定性、取込み、又は標的プレｍＲＮＡへの結合を増大するために修飾ヌクレオチド又は置換ヌクレオチドの存在の下で合成することができる。さらに、ＰＴＭの合成後、ＰＴＭを、例えば、ＰＴＭ分子の物理学的性質を増強するために、ペプチド、化学試薬、抗体又は核酸分子で修飾してもよい。かかる修飾は当業者に周知である。

ＰＴＭをコードする核酸分子を用いる場合、核酸分子の発現ベクターへのクローニングには当技術分野で公知のクローニング技術を用いることができる。使用できる当技術分野で一般に知られている組換えＤＮＡ技術の方法は、Ausubelら(編), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY;及びKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。

目的のＰＴＭをコードするＤＮＡは、ＤＮＡの大規模複製も提供し、かつ、ＰＴＭの転写を指令する必須エレメントも含む様々な宿主ベクター系に組換え操作することができる。患者の標的細胞をトランスフェクトすることを目的にこのような構築物を用いると、内因的に発現したプレｍＲＮＡ標的（例えば、ＦＶＩＩＩプレｍＲＮＡ標的など）と相補的塩基対を形成し、それにより複合化した核酸分子間のトランススプライシング反応を促進するのに十分な量のＰＴＭの転写が起こる。例えば、ベクターは、細胞に取り込ませ、ＰＴＭ分子の転写を命令することができるようにｉｎ ｖｉｖｏで導入することができる。このようなベクターは、転写されて目的のＲＮＡ（すなわちＰＴＭ）を生成する限り、エピソームとして維持されるものであっても染色体に組み込まれるものであってもよい。このようなベクターは当技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術によって構築することができる。

目的のＰＴＭをコードするベクターは、プラスミド、ウイルス、又は哺乳動物細胞で複製及び発現させるのに用いる当技術分野で公知のその他のものであってもよい。ＰＴＭをコードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞で機能させるために当技術分野で公知のいずれかのプロモーター／エンハンサー配列によって調節することができる。このようなプロモーター／エンハンサーは誘導性のものであっても構成的なものであってもよい。このようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Benoist, C.及びChambon, P. 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの長い３’末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamotoら, 1980, Cell 22: 787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42）、ＣＭＶウイルスプロモーター、ヒト漿膜ゴナドトロピン−βプロモーター（Hollenbergら, 1994, Mol. Cell. Endocrinology 106:111-119）などが挙げられる。

本発明の特定の実施形態において、肝臓特異的プロモーター／エンハンサー配列を用いて、ＦＶＩＩＩ欠陥の修正のために、肝臓細胞におけるＰＴＭの合成を促進しうる。かかるプロモーターとしては、例えば、アルブミン、トランスサイレチンＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター、ＡｐｏＥエンハンサーα１−抗トリプシンプロモーター、及び内因性ＦＶＩＩＩプロモーター配列が含まれる。さらに、ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現のために最適化された肝臓特異的ミクログロブリンプロモーターカセット、並びにウッドチャック翻訳後調節配列（ＷＰＲＥ）などの翻訳後配列を用いることも可能である。

いずれの種類のプラスミド、コスミド、ＹＡＣ又はウイルスベクターを用いて、直接組織部位へ導入できる組換えＤＮＡ構築物を作製することができる。あるいは、所望の標的細胞へ選択的に感染するウイルスベクターを用いることもできる。本発明の実施に用いるベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルス種に由来するものなどウイルス発現ベクターをはじめとするいずれかの真核発現ベクターが挙げられる。

限定されるものではないが、それぞれｔｋ欠損、ｈｇｐｒｔ欠損又はａｐｒｔ欠損細胞における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の発現についての選択をはじめ、いくつかの選択系を使用することができる。また、メトトレキサート耐性を付与するジヒドロ葉酸トランスフェラーゼ（ｄｈｆｒ）、ミコフェノール酸耐性を付与するキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するネオマイシン（ｎｅｏ）、及びハイグロマイシン耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒｏ）に関する選択に基づく代謝拮抗物質耐性を使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、いずれの細胞にも１個のベクター又は限られた数のベクターしか存在しないように、培養細胞を細胞に対して低率のベクターで形質転換する。

５．３．トランススプライシング分子の使用及び投与
５．３．１．遺伝子調節、遺伝子修復及び標的化細胞死のためのＰＴＭ分子の使用
本発明の組成物及び方法は、遺伝子修復、遺伝子調節及び標的化細胞死をはじめとする種々の異なる用途を有する。例えば、トランススプライシングは毒性を有するタンパク質を細胞に導入するために使用できる。さらにＰＴＭは、ウイルスｍＲＮＡと結合してウイルスｍＲＮＡの機能を破壊するか、あるいは、ウイルスｍＲＮＡを発現するいずれの細胞も破壊しうるように操作することができる。本発明のさらに別の実施形態では、ＰＴＭは、有害なｍＲＮＡ転写産物に終止コドンを配置し、それにより転写産物の発現を低下させるように操作することができる。二重トランススプライシング反応、３’エキソン置換及び／又は５’エキソン置換をはじめとする標的化トランススプライシングを用い、末端切断型又は点突然変異を含む転写産物を修復又は修正することができる。本発明のＰＴＭは、特定の突然変異の上流若しくは下流、又は未成熟３’の上流で標的転写産物を切断し、突然変異を含む転写産物の部分を機能的配列で置換するトランススプライシング反応を介して変異転写産物を修正するように設計されている。

本発明の方法及び組成物はまた、植物での遺伝子発現を調節するためにも使用できる。例えば、いずれかの操作された遺伝子の発現を選択された標的植物遺伝子の本来の調節下に置くためにトランススプライシングを用いてもよく、それにより操作された遺伝子の発現が調節される。トラススプライシングはまた、非宿主植物において操作された遺伝子の発現を妨げたり、あるいは内因性の遺伝子産物をさらに望ましい産物又は毒性（害虫に対する毒性）産物へと変換するためにも使用できる。

本発明の特定の実施形態では、トランススプライシングはＢｔトキシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を産生する殺虫遺伝子の発現を調節するためにも使用できる。例えば、昆虫が植物を食害した後にはじめて発現する傷害応答遺伝子（プレｍＲＮＡ）へとトランススプライシングされるようにＰＴＭを設計することができる。このようにして、植物の全細胞がＰＴＭ中にＢｔ遺伝子を有するようになるが、これらの細胞は昆虫が植物を傷害した際に傷害した場所でしかＢｔは産生されない。植物の残りの部分は、ほとんどあるいはまったくＢｔを作らない。ＰＴＭは、所望の発現パターンで、Ｂｔ遺伝子を選択された任意の遺伝子へとトランススプライシングすることができる。さらに、ＰＴＭをターゲティングして植物の食用部分ではＢｔを産生しないようにすることができるはずである。

ＰＴＭの使用に関する１つの利点は、ＰＴＭが標的遺伝子の本来の遺伝子制御エレメントを獲得していることから、操作した遺伝子の上流にある適当な調節配列を同定・再構成するのに費やす時間や労力が軽減される。このようにＰＴＭによって調節される遺伝子の発現は、標的プレｍＲＮＡを含む植物細胞でしか起こらないはずである。消費者は組換え遺伝子から作られたタンパク質を食べたがらないので、植物の食用部分又は花粉で発現しない遺伝子をターゲティングすることで、トランススプライシングは遺伝子組換え植物に対する抵抗を緩和することができる。かかる作物の食用部分は、遺伝子組換えタンパク質が含まれていないことを試験する必要がある。

また、ＰＴＭは他の植物には存在しない宿主細胞特有の配列へターゲティングすることができる。従って、ＰＴＭをコードする遺伝子（ＤＮＡ）がたとえ他の植物種に移動（jump）したとしても、そのＰＴＭ遺伝子にはトランススプライシングの適当な標的がないことになる。このようにトランススプライシングは他の植物種へ遺伝子が「移動」することを防ぐ「フェイルセーフ（ｆａｉｌ−ｓａｆｅ）」様式を与え、ＰＴＭ遺伝子は、適当な標的プレｍＲＮＡを含む操作された植物宿主でしか発現しない。操作されていない植物での発現は不可能なのである。

トランススプライシングはまた、ある遺伝子産物を別のものへと変換するより効率的な経路を提供する。例えば、トランススプライシングリボザイム及びキメラオリゴをトウモロコシゲノムに組み込んで飽和油と不飽和油の比率を改変することができる。トランススプライシングはまた、ある遺伝子産物を別のものへと変換するのに用いることができる。

本発明の組成物及び方法は、ＦＶＩＩＩ遺伝的欠陥を修正するために用いることも可能である。具体的には、二重トランススプライシング反応、３’エキソン置換及び／又は５’エキソン置換を含む標的化トランススプライシングを用い、末端切断型又は点突然変異を含むＦＶＩＩＩ転写産物を修復又は修正することができる。本発明のＰＴＭは、特定の突然変異の上流若しくは下流、又は未成熟３’の上流で標的化されたＦＶＩＩＩ転写産物を切断し、突然変異を含む転写産物の一部を機能的配列で置換するトランススプライシング反応を介して変異転写産物を修正するように設計されている。

例えば、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、組成物を発現しうる組換え細胞、受容体により媒介されるエンドサイトーシス（例えば、Wu及びWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照）、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はその他のベクターの一部としての核酸の構築、ＤＮＡ注入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムにより媒介されるトランスフェクションなど、種々の送達系が知られており、本発明の組成物を細胞へ導入するのに用いることができる。

これらの組成物及び方法は、癌及びその他の重篤なウイルス感染、自己免疫疾患、並びに特定の細胞型の改変又は除去が有益なその他の病状を治療するために使用できる。また、これらの組成物及び方法は、欠損又は変異遺伝子産物の発現が正常な表現型をもたらす遺伝性の遺伝子疾患を有する患者の細胞に、機能的生物活性分子をコードする遺伝子を提供するために使用することもできる。

上記組成物及び方法は、機能的な生物学的活性を有するＦＶＩＩＩ分子をコードする配列を、欠損する又は変異型ＦＶＩＩＩ遺伝子産物の発現により正常な表現型（すなわち血液凝固）をもたらす遺伝性遺伝子疾患を有する個体の細胞に提供するために用いることができる。

好ましい実施形態では、ＰＴＭ機能を促進するために、遺伝子送達及び宿主細胞での発現という方法で、ＰＴＭをコードする配列を含む核酸を投与する。本発明のこの実施形態では、核酸はＰＴＭ生成を促進することにより作用を媒介する。当技術分野で利用できる宿主細胞に対する遺伝子送達の方法はいずれも本発明に従って使用できる。遺伝子送達法の総説としては、Strauss, M.及びBarranger, J.A., 1997, Concepts in Gene Therapy, Walter de Gruyter & Co., Berlin；Goldspielら, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu及びWu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 33:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；並びにMorgan及びAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; 1993, TIBTECH 11(5):155-215を参照。方法例を以下に記載する。

宿主細胞へのＰＴＭの送達は、ＰＴＭ若しくはＰＴＭをコードする核酸分子への直接的な曝露であっても、又は間接的（すなわち、まず、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて宿主細胞をＰＴＭ若しくはＰＴＭをコードする核酸分子で形質転換した後、宿主へ移植する場合）であってもよい。これらの２つの手法はそれぞれｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子送達として知られている。

特定の実施形態では、核酸は直接ｉｎ ｖｉｖｏ投与し、そこで発現させてＰＴＭを生成させる。これは例えばそれを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内のものとなるように投与することにより、あるいは例えば欠陥又は弱毒レトロウイルスその他のウイルスベクターを用いた感染（米国特許第４，９８０，２８６号参照）により、あるいは裸のＤＮＡの直接注入により、あるいは微粒子衝撃（例えば、遺伝子ガン；Biolistic, Dupont, Bio-Rad）の使用により、あるいは脂質若しくは細胞表面受容体又はトランスフェクション剤によるコーティング、あるいはリポソーム、マイクロパーティクル又はマイクロカプセルへの封入により、あるいは核へ入ることが知られているペプチドに結合させて投与することにより、あるいは受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを受けるリガンドへ結合させて投与する（例えば、Wu及びWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432）ことによるなど、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかによって達成することができる。

特定の実施形態では、ＰＴＭを含むウイルスベクターを使用することができる。例えば、ウイルスゲノムのパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要でないレトロウイルス配列を削除するように改変されたレトロウイルスベクターを用いることができる（Millerら, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599参照）。あるいは、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターを細胞又は組織への遺伝子送達に使用することができる（アデノウイルスを基にした遺伝子送達の総説としてはKozarsky及びWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503参照）。

本発明の好ましい実施形態において、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて、ＰＴＭをコード可能な核酸分子を送達しうる。このベクターは、所望の発現レベルに応じて、選択したプロモーター及び／又はエンハンサー配列が該ベクターに挿入されるように設計される。

細胞への遺伝子送達に対する別の手法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを媒介とするトランスフェクション、又はウイルス感染のような方法により組織培養細胞へ遺伝子を導入することが挙げられる。通常、導入方法は細胞への選択マーカーの導入を含む。次にこれらの細胞を、導入遺伝子を取り込み、それを発現している細胞を単離する選択下に置く。得られた組換え細胞は当技術分野で公知の種々の方法により宿主へ送達することができる。好ましい実施形態では、遺伝子送達に用いる細胞は宿主細胞自身のものである。

本発明の特定の実施形態において、肝臓幹細胞、楕円細胞又は肝細胞を、出血障害を有する被験者から取り出し、ＦＶＩＩＩ遺伝的欠陥を修正するために設計されたＰＴＭをコード可能な核酸分子でトランスフェクトしうる。さらに当業者に公知の慣用法を用いてゲノムに核酸分子が組み込まれた細胞を選択し、それにより目的のＰＴＭを発現する安定な細胞系を得る。次に、かかる細胞を被験者に移植し、ＦＶＩＩＩタンパク質の供与源を提供する。

本発明はまた、有効量のＰＴＭ又はＰＴＭをコードする核酸及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物も提供する。特定の実施形態では、「製薬上許容される」とは、連邦政府又は州政府の規制機関によって認可されているか、又は米国薬局方又はその他動物用、より好ましくはヒト用として汎用されている薬局方に挙げられていることを意味する。「担体」とは、それとともに治療薬を投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルをさす。好適な医薬担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。

特定の実施形態では、医薬組成物は、（１）例えばそのタンパク質を欠損する、遺伝的に欠陥がある、生物学的に不活性若しくは活性が不十分な、又は発現が十分でない宿主において内因性タンパク質又は機能が存在しないか、そのレベルが低い（正常又は望ましいものに比べて）疾病又は疾患、あるいは（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイによって特定のタンパク質の機能を阻害するＰＴＭの利便性が示される疾病又は疾患、において投与する。ＰＴＭにより媒介されるトランススプライシング反応から生じたキメラｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性は、例えば宿主組織サンプル（例えば、生検組織から）を得、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡ又はタンパク質レベル、発現したキメラｍＲＮＡの構造及び／又は活性に関してアッセイすることで容易に検出することができる。

特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質が欠損している、遺伝的に欠陥がある、生物学的に不活性である若しくは活性が低い、又は過少発現である宿主において、内因性ＦＶＩＩＩタンパク質のレベル又は機能の不在又は低減（正常又は所望のものと比較して）を示す疾患又は障害に投与する。かかる障害としては、限定されるものではないが血友病Ａが含まれる。ＰＴＭが媒介するトランススプライシング反応から生じるキメラ又は複合ｍＲＮＡによりコードされるＦＶＩＩＩタンパク質の活性は、例えば、宿主組織サンプル（例えば生検組織）を入手し、発現されたキメラｍＲＮＡのｍＲＮＡ若しくはタンパク質レベル、構造及び／又は活性についてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイすることにより、容易に検出しうる。

このように、限定されるものではないが、キメラｍＲＮＡによりコードされるタンパク質を検出及び／又は可視化する免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロット、免疫沈降とその後のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫組織化学など）、及び／又はキメラｍＲＮＡの存在を検出及び／又は可視化することによるキメラｍＲＮＡの発現の形成を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び逆転写ＰＣＲなど）などをはじめとする、当技術分野で標準的な多くの方法を利用することができる。

特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は治療を必要とする領域に局所投与するのが望ましい。これは限定されるものではないが例えば、手術中の局部注入、例えば術後の外傷用医薬材料と組み合わせた局所適用、注射、カテーテル、坐剤、あるいはインプラント（インプラントはシアラスティック（sialastic）メンブラン又はファイバーなどの膜をはじめとする多孔質、非多孔質、又はゼラチン素材のものである）によって達成できる。ナノ粒子、徐放性ポリマー、ヒドロゲルなどの母材など、その他の放出制御性薬物送達系もある。

ＰＴＭはターゲティングされる細胞で所望の作用をもたらすのに有効な量で投与する。ＰＴＭの有効量は生物学的半減期、バイオアベラビリティー及び毒性などのパラメーターに着目する当業者に周知の手法によって決定することができる。有効である本発明の組成物の量は、治療する凝固障害の重篤度によって異なり、標準的な臨床技術によって決定することができる。かかる技術には、血液サンプルを分析して凝固時間を測定する方法が含まれる。さらにまた、最適用量範囲を確定する助けとして所望によりｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いてもよい。

本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上の成分を、所望により容器を伴い、充填させた１以上の容器を含む医薬パック又はキットも提供し、このような容器は医薬又は生物製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形態で認知でき、なお、この認知はヒトにおける投与を目的とする製造、使用又は販売の政府機関による認可を反映している。

５．３．２．エキソンタギングのためのＰＴＭ分子の使用
ヒトその他の生物のゲノムを配列決定し、特性解析する現在の努力を鑑みれば、このような特性解析を容易にする方法が必要である。ゲノムマッピング及びシーケンシングによって現在得られる情報の大部分はｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写によって生成される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーから得られるものである。残念なことに、このプロセスはイントロン配列及びエキソン／イントロン境界の位置に関する情報を欠落させる。

本発明は、（ｉ）プレトランススプライシング分子とプレｍＲＮＡ分子を、そのプレトランススプライシング分子の一部が標的プレｍＲＮＡへとトランススプライシングされてキメラｍＲＮＡを形成するような条件下で接触させ、（ｉｉ）そのキメラｍＲＮＡ分子を増幅し、（ｉｉｉ）増幅した分子を選択的に精製し、さらに（ｉｖ）増幅した分子のヌクレオチド配列を決定し、それによりイントロン−エキソン境界を決定することを含む、プレｍＲＮＡ分子のエキソン−イントロン境界をマッピングする方法を包含する。

本発明のある実施形態では、プレｍＲＮＡ分子のエキソン−イントロン境界を位置決定するためのトランススプライシング反応でＰＴＭを用いることができる。イントロン−エキソン境界のマッピングに用いるＰＴＭは上記第５．１節のものと類似した構造を有する。具体的にはＰＴＭは、（ｉ）多くのプレｍＲＮＡと結合するように設計された標的結合ドメイン、（ｉｉ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位、又は５’スプライス供与部位を含む３’スプライス領域、（ｉｉｉ）そのｍＲＮＡスプライス部位を標的結合ドメインと隔てるスペーサー領域、及び（ｉｖ）プレｍＲＮＡへとトランススプライシングされるタグ領域を含む。さらに、ＰＴＭは、（ａ）標的結合部位をＲＮＡスプライス部位と隔てる１以上のスペーサー領域、（ｂ）ミニイントロン、（ｃ）ＩＳＡＲ（イントロンスプライシングアクチベーター及びリプレッサー）のコンセンサス結合部位、（ｄ）エンハンサー型配列、並びに／又はリボザイム配列、を含みうる。あるいは、エキソン−イントロン境界を位置決定するのに用いるＰＴＭは標的結合ドメインを含まないように操作することもできる。

イントロン−エキソンマッピングのためには、ランダムヌクレオチド配列を含む標的結合ドメインを含むようにＰＴＭを遺伝子操作する。このランダムヌクレオチド配列は、プレｍＲＮＡと結合してそれをつなぎ止めることができる少なくとも１５〜３０で数百までのヌクレオチド配列を含み、これにより核のスプライセオソームプロセシング機構がＰＴＭの一部（タグ又はマーカー領域）をプレｍＲＮＡの一部へとトランススプライシングすることができる。短い標的結合ドメインを含有する、又はイノシンを含有するＰＴＭはストリンジェントでない条件下でプレｍＲＮＡ分子と結合する。さらに、強い分岐点配列及びピリミジン領域はＰＴＭトランススプライシングの非特異性を増強する働きをする。

ＰＴＭ分子において標的結合ドメインとして用いるランダムヌクレオチド配列は、限定されるものではないが、制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの部分消化、又はＤＮＡの物理的剪断をはじめとする様々に異なる方法を用いて作製することができる。このようなランダムヌクレオチド配列の使用は、細胞内で発現された各標的プレｍＲＮＡに関して種々の結合活性を有するＰＴＭ分子の膨大なアレイを作製するように設計される。オリゴヌクレオチドのランダムライブラリーは、遺伝子操作されたＰＴＭ分子をプラスミドベクターへクローニングするための各末端にある適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いて合成することができる。ランダムオリゴヌクレオチドを連結して発現させると、ランダムなＰＴＭの結合ライブラリーが得られる。

本発明の特定の実施形態では、ランダムヌクレオチド配列を含む標的結合ドメインを含むＰＴＭ分子をコードする発現ライブラリーは、当業者に周知の種々の方法を用いて作製することができる。理想的には、このライブラリーは細胞内で発現された各標的プレｍＲＮＡと相互作用しうるＰＴＭ分子を含むのに十分複雑なものである。

例を挙げれば、図９はイントロン−エキソン境界のマッピングに利用できる２形態のＰＴＭの模式図である。左のＰＴＭはプレｍＲＮＡ３’スプライス部位へと非特異的にトランススプライシングされうるが、右のＰＴＭはプレｍＲＮＡ５’スプライス部位へとトランススプライシングされうる。ＰＴＭと標的プレｍＲＮＡとの間のトランススプライシングの結果、原型エキソンの３’又は５’いずれかの末端に特定のヌクレオチド配列「タグ」を有するキメラｍＲＮＡ分子が産生される。

選択的精製の後、ＰＴＭのタグヌクレオチド配列内で始まり、タグが付されたエキソン配列へと進行するプライマーを用いてＤＮＡシーケンシング反応を行う。このタグヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドのすぐ後の配列がエキソン境界を表す。イントロン−エキソンタグの同定のためには、当業者に周知の方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで本発明のトランススプライシング反応を行うことができる。

５．３．３．細胞内で発現したタンパク質の同定のためのＰＴＭ分子の使用
本発明のさらにもう１つの実施形態では、ＰＴＭにより媒介されるトランススプライシング反応は、細胞内で発現する、これまでには検出されなかった未知のタンパク質を同定するために使用できる。この方法は、とりわけタンパク質サイズが小さい、あるいはタンパク質が低濃度であるために二次元電気泳動又は他の方法では検出できない、あるいは二次元電気泳動では他のタンパク質と同様の移動パターンを示すためにタンパク質を検出できないタンパク質の同定に特に有用である。

本発明は、（ｉ）ランダムな標的結合ドメイン及びペプチドタグをコードするヌクレオチド配列を含有するプレトランススプライシング分子とプレｍＲＮＡ分子を、そのプレトランススプライシング分子の一部が標的プレｍＲＮＡの一部へとトランススプライシングされて融合ポリペプチドをコードするキメラｍＲＮＡを形成するような条件下で接触させるか、あるいはゲル電気泳動によってそれを分離すること、（ｉｉ）融合ポリペプチドをアフィニティー精製すること、（ｉｉｉ）融合タンパク質のアミノ酸配列を決定すること、あるいは（ｉｖ）当業者に公知のほかの試験手段を含む、細胞内で発現したタンパク質を同定する方法に関する。

細胞内で発現したタンパク質を同定するためには、本発明のＰＴＭを、（ｉ）ランダム化ヌクレオチド配列を含む標的結合ドメイン、（ｉｉ）分岐点、ピリミジン領域、並びに３’スプライス受容部位及び／又は５’スプライス供与部位を含む３’スプライス領域、（ｉｉｉ）ＰＴＭスプライス部位を標的結合ドメインと隔てるスペーサー領域、及び（ｉｖ）マーカー又はペプチドアフィニティー精製タグをコードするヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作する。このようなペプチドタグとしては、限定されるものではないが、ＨＩＳタグ（６ヒスチジン連続残基）（Janknechtら, 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Smith, D.B.及びJohnson, K.S., 1988, Gene 67:31）（Pharmacia）又はＦＬＡＧ（Ｋｏｄａｋ／ＩＢＩ）タグ（Nisson, J.ら, J. Mol. Recognit., 1996, 5:585-594）が挙げられる。

このようなＰＴＭを用いたトランススプライシング反応の結果、マーカー又はペプチドアフィニティー精製タグに結合した細胞内で通常発現されるタンパク質配列を含む融合タンパク質をコードするキメラｍＲＮＡ分子が形成される。このような方法の望ましい到達点は細胞内で合成された全てのタンパク質がマーカー又はペプチドアフィニティータグを受け取り、それにより細胞内で発現した各タンパク質を同定する方法を提供することである。

本発明の特定の実施形態では、ランダムヌクレオチド配列を含む種々の標的結合ドメインを有するＰＴＭをコードするＰＴＭ発現ライブラリーを作製する。望ましい到達点は細胞内で発現された各プレｍＲＮＡに結合しうるＰＴＭを産生するに十分複雑なＰＴＭ発現ライブラリーを作り出すことである。好ましい実施形態では、このライブラリーを哺乳動物発現ベクターにクローニングし、１個の細胞につき１つ、又はせいぜい数個のベクターが存在するようにする。

キメラタンパク質の発現を同定するには、宿主細胞をこのＰＴＭライブラリーで形質転換し、１個のＰＴＭベクターを含有する個々のコロニーが増殖及び精製可能なようにプレーティングする。単一のコロニーを選択、単離し、適当な培地で増殖させ、例えばアフィニティー精製タグを用い、標識されたキメラタンパク質エキソン断片を他の細胞タンパク質から分離する。例えば、アフィニティークロマトグラフィーはＦＬＡＧタグなどのペプチドタグに特異的に結合する抗体の使用を含みうる。あるいは、ＨＩＳタグを用いる場合には融合タンパク質は、イミダゾールを含有するバッファーで溶出した結合ペプチドを選択的に溶出させるＮｉ^２＋ニトリロ酢酸アガロースカラムを用いて精製される。ＧＳＴタグを用いる場合には融合タンパク質はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアガロースビーズを用いて精製する。次にこれらの融合タンパク質は遊離グルタチオンの存在下で溶出させることができる。

キメラタンパク質の精製後、分析を行って融合タンパク質のアミノ酸配列を決定する。融合タンパク質のアミノ酸配列はエドマン分解とその後のＨＰＬＣ、質量分析又はアミノ酸分析を用いたアミノ酸解析など、当業者に周知の技術を用いて決定する。同定したところで、そのペプチド配列をＧｅｎＢａｎｋなどのタンパク質データベースで入手できる配列と比較する。部分的なペプチド配列が既知であれば、さらなる分析は行わない。部分的なタンパク質配列が未知であれば、そのタンパク質のより完全な配列決定を行って全タンパク質配列を決定することができる。融合タンパク質が全長タンパク質の一部のみを含む場合には、全長タンパク質をコードする核酸は通常の方法を用いて単離することができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブ又はＰＣＲプライマーとして用いるには、部分タンパク質配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを生成することができる。

６．実施例：効率的なトランススプライシング分子の作製
下節ではトランススプライシングの効率を高めるよう設計された新規なＰＴＭ分子を記載する。これら新規なＰＴＭは下記の特徴の１以上を含む：（ｉ）イントロンの３’スプライスシグナルに近接している、イントロン配列にターゲティングする５’エキソン置換ＰＴＭの結合ドメイン；（ｉｉ）ＰＴＭのコード領域に挿入されたミニイントロン配列；（ｉｉｉ）ＰＴＭ供与部位の下流に、これに近接して挿入されたＩＳＡＲ（イントロンスプライシングアクチベーター及びリプレッサー）のコンセンサス結合部位、並びに／又はリボザイム配列。

６．１．材料及び方法
６．１．１．プラスミドの構築
各ＰＴＭのＬａｃＺコード配列は、ＰＣＲにより、又は既存のＬａｃＺミニ遺伝子標的から断片をサブクローニングすることにより得た。結合ドメイン、スペーサー配列及び５’スプライス部位を含むトランススプライシングドメイン（ＴＳＤ）は、既存のプラスミド鋳型を用いたＰＣＲ産物から、オリゴヌクレオチドのアニーリングによって作製した。次に、これらの種々の断片（ＴＳＤ及びコード配列）を、適当な制限部位を用いてｐｃＤＮＡ３．１（−）にクローニングした。オリゴデオキシヌクレオチドプライマーはSigma Genosys（The Woodlands, TX）から入手した。各ＲＥＤＴａｑ（Sigma, St. Louis, MO）ＤＮＡポリメラーゼ又はクローニングＰｆｕ（Stratagene, La Jolla, CA）ＤＮＡポリメラーゼを用いて全てのＰＣＲ産物を作製した。増幅用のＰＣＲプライマーは定方向クローニングのための制限部位を含んだ。ＰＣＲ産物を適当な制限酵素で消化し、哺乳動物発現プラスミドｐｃ３．１ＤＮＡ（−）（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングした。

６．１．２．細胞培養及びトランスフェクション
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（Life Technologies, Gaithersburg, MD）を用いて、構築物をヒト胎性腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ（１．５×１０^６細胞／６０ｍｍポリ−ｄ−リジンコーティングディッシュ）に共トランスフェクトし、トランスフェクション開始から４８時間後に細胞を回収した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清（Hyclone, Inc., Logan, UT）を添加したダルベッコの改変イーグル培地（Life Technologies）で増殖させた。細胞は全て、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーターで維持した。

６．１．３．溶液中のβ−ガラクトシダーゼアッセイ及びｉｎ ｓｉｔｕ染色
発現プラスミドでトランスフェクトした細胞から、凍結解凍法により全細胞タンパク質を単離し、β−ｇａｌアッセイキット（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬（BIO-RAD, Hercules, CA）を用いて、色素結合アッセイにより測定した。β−ｇａｌ染色キット（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い、細胞を機能的β−ガラクトシダーゼの発現に関してモニターした。

６．２．結果
新規なＰＴＭのいくつかの特徴は、ＰＴＭの、標的プレｍＲＮＡ分子へのトランススプライシングを促進することが分かった。新規な設計特徴を示す５’ＬａｃＺ構築物の模式図は図２に示されている。各新規構築物の修復効率を評価する上で用いた変異型ＬａｃＺ標的の詳細は図３に示されている。

イントロンの３’スプライス配列に近接してイントロン配列に結合するようターゲティングされたＰＴＭ結合ドメインはトランススプライシングの効率を高めることが分かった。従来のＰＴＭ構築物では、それらの構築物が同じイントロンの５’スプライス部位を埋めるように設計されていたことから、この特定の設計特徴は独特である。ＰＴＭの、イントロンの３’末端へのターゲティングは、ＰＴＭ供与部位を標的受容部位に近接させることを意図したものである（図４及び５）。

エキソンの特定性を高め、ＰＴＭ供与部位の認識を高めるために、ＰＴＭのコード配列へのミニイントロンの導入が設計されている。ミニイントロン（約４００ｂｐ長）はＣＦＴＲイントロン９の機能的末端の融合により作製されたものである。このミニイントロンをＰＴＭに挿入し、スプライシング効率に関して試験した。図６に示されているように、スプライシング効率はミニイントロンインサートを含むＰＴＭを用いると上昇した。

ＩＳＡＲタンパク質と呼ばれるタンパク質は、Ｕリッチ配列（「ＩＳＡＲ配列」）の後に５’スプライス部位を含むプレｍＲＮＡと選択的に結合する。Ｕリッチ領域と結合するＩＳＡＲは、Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる５’スプライス部位認識を促進すると考えられている。図６に示されているように、ＩＳＡＲ配列を含むＰＴＭは、ＩＳＡＲ配列を含まないＰＴＭより高い効率でトランススプライシング反応を媒介することができた。シス作用型リボザイムをＰＴＭトランススプライシングドメインの末端に挿入し、トランススプライシングに関して試験した。これらのリボザイム配列を、ＰＴＭ構造に導入すると、トランススプライシングがなくともＰＴＭ翻訳が低下した。図７に示されているように、ＰＴＭ構造にリボザイム配列を含めると、トランススプライシングの効率が高まった。

７．実施例：３’エキソン置換を用いた第ＶＩＩＩ因子遺伝子の修正
血友病は血液凝固因子の１つの欠損によって起こる出血性の疾患である。全症例の約８０％を占める血友病Ａは第ＶＩＩＩ凝固因子の欠損により起こる。下節では、スプライセオソーム媒介型のトランススプライシングを用いた第ＶＩＩＩ凝固因子遺伝子の修復の成功を記載し、遺伝子療法を用いて第ＶＩＩＩ因子の修復が実現可能であることを示す。

マウス第ＶＩＩＩ因子ＰＴＭのコード領域（エキソン１６〜２４）を、定方向クローニングのための特有の制限部位を含んだプライマーを用い、ｃＤＮＡプラスミド鋳型からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は全て、クローニングＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて作製した。このコード配列を、ＥｃｏＲＶ及びＰｍｅＩ制限部位を用いてｐｃ３．１ＤＮＡ（−）にクローニングした。結合ドメイン（ＢＤ）は、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲにより作製した。プライマーは定方向クローニングのための特有の制限部位を含んでいた。このＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩ及びＳａｃＩＩ制限部位を用い、既存のＰＴＭプラスミド（ＰＴＭ−ＣＦ２４，ｐｃ３．１ＤＮＡ）にクローニングした。このプラスミドはすでに、スペーサー配列、ポリピリミジン領域（ＰＰＴ）、分岐点（ＢＰ）及び３’受容部位を含むＴＳＤの残りの要素を含んでいた。次に、このＴＳＤ全体を、第ＶＩＩＩ因子ＰＴＭコード配列を含むベクター（上記）にサブクローニングした。最後に、別のプラスミドクローン由来のウシ成長ホルモン３’非翻訳配列を、ＰｍｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を用いて、上記ＰＴＭにサブクローニングした。

この構築物全体を配列決定した後、ＲＴ−ＰＣＲにより、可能性のある潜在スプライシングに関して分析し、その後、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を用いてＡＡＶプラスミドｐＤＬＺ２０−Ｍ２にサブクローニングした（Chao et al., 2000, Gene Therapy 95:1594-1599; Flotte and Carter, 1998, Methods Enzymol., 292:717-32）。いくつかのウイルス送達系（非ウイルス送達系）では、治療薬の大きさが重要である。アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターは、（ｉ）それらが広範な宿主域を持つ非病原性ウイルスであること、（ｉｉ）それらが、アデノウイルスベクターと比べた場合に低い炎症応答しか引き起こさないこと、及び（ｉｉｉ）それは分裂細胞にも非分裂細胞にも感染する能力を有することから好ましい。しかしながら、ｒＡＡＶのパッケージング能は野生型ゲノムの大きさのおよそ１１０％、すなわち約４．９ｋＢに限られ、従って、プロモーターやエンハンサーなどの大きな調節配列のための空きがほとんど残っていない。Ｂドメインが欠損したヒト第ＶＩＩＩ因子はＡＡＶのパッケージングサイズに近いため、トランススプライシングにより、調節配列の付加を許容しつつ、より小さなトランスジーンを送達する可能性が得られる。

ＸｈｏＩ ＰＴＭクローニング部位の上流にあるプレｍＲＮＡの潜在的供与部位を排除するため、エキソン１の一部とイントロン１配列の全部を含む元のＡＡＶ構築物から約１７０ｂｐの配列を除いた（図１４Ｃ参照）。

図１４Ｄの修復モデルは、エキソン１〜１４、イントロン１４、エキソン１５、イントロン１６及びネオマイシン遺伝子の挿入を含むエキソン１６〜２６から構成されるマウス第ＶＩＩＩ因子のプレｍＲＮＡ標的（内在遺伝子）の簡略化したモデルを示している。この図面に示されているＰＴＭはエキソン１６〜２６コード配列と、その固有のスプライシング要素（供与部位、分岐点及びピリミジン領域）及び結合ドメインを有するトランススプライシングドメイン、から構成される。この結合ドメインの詳細は図１４Ａ及び１４Ｂに示されている。この結合ドメインはイントロン１５及びエキソン１６の一部（５’末端）のスプライス部位に相補的である。

遺伝子修復に関して３’エキソン置換を用いることの重要な利点は、（ｉ）構築物が全長遺伝子構築物より小さな配列及び空間しか必要とせず、それにより調節配列のためにより大きな空間を残せること、（ｉｉ）トランススプライシング修復は標的遺伝子を発現する細胞でのみ起こり、そのため、修復されたＲＮＡの異所発現に伴う潜在的問題がなくなること、及び（ｉｉｉ）トランススプライシングがＢドメインを含む全長ｍＲＮＡを作り出すことである。

プラスミド注入のために、各ＦＶＩＩＩ欠損マウスを鎮静させ、解剖顕微鏡下に置き、腹部正中を垂直に１ｃｍ切開した。リン酸緩衝生理食塩水中約１００μｇのＰＴＭプラスミドＤＮＡを肝門脈に注入した。注入後１日、２日、３日及び２０日の間隔で眼後方の網状血管から採血し、Ｃｏａｔｅｓｔアッセイを用いて、第ＶＩＩＩ因子活性に関してアッセイした。

マウスから採取した血液サンプルの第ＶＩＩＩ因子活性を、Ｃｏａｔｅｓｔアッセイと呼ばれる標準的な試験を用いてアッセイした。アッセイは製造業者の使用説明書（Chromgenix AB, Milan, Italy）に従って行った。第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスにおける第ＶＩＩＩ因子の修復を示すデータは図１６に示されている。

ヒトにおける血友病Ａ欠陥は著しいＤＮＡ再配列、単一のＤＮＡ塩基の置換、欠失及び挿入を含むいくつかのカテゴリーに大きく分けられる。エキソン２３〜２６から離れたエキソン１〜２２（イントロンを伴う）の逆位及び転座を含むＤＮＡの再配列は重篤な血友病Ａの全症例の約４０％の原因となっていることが判明している。また、イヌ血友病Ａモデルも極めてよく似た著しい再配列を示す。この突然変異はヒト及びイヌ第ＶＩＩＩ因子ＰＴＭの設計における重要な観点である。

ヒト第ＶＩＩＩ因子ＰＴＭを構築するための方法は、ヒトｃＤＮＡから異なるコード領域（エキソン１５〜２６など）を増幅すること、結合ドメインがヒトゲノム配列鋳型（全ゲノムＤＮＡ又はゲノムクローン）から増幅されること、そして、ＰＴＭにおいて、修復された第ＶＩＩＩ因子タンパク質の検出を容易にするためにＣ末端タグを導入し得ること以外は、マウスＰＴＭに関して上述したものと同じである。スペーサー配列、ポリピリミジン領域（ＰＰＴ）、分岐点（ＢＰ）及び３’受容部位を含むトランススプライシングドメインの残りの要素は既存のＰＴＭから得られる。必要であれば、ＰＴＭ内での潜在的なスプライシングをなくすために結合ドメイン配列を変化させうる。最終的なＰＴＭを、ｐＤＬＺ２０−Ｍ２などのＡＡＶプラスミドベクターにサブクローニングする。このプラスミドからウイルスを調製することができる。イヌ第ＶＩＩＩ因子ＰＴＭは、これらの設計法を用い、イヌｃＤＮＡ及びゲノムプラスミドを組み込むことによって作製することができる（図１１及び１２参照）。

本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態にその範囲を限定されるものではない。実際に、以上の説明及び添付の図面から、当業者には、本明細書に記載したものの他に本発明の種々の変形が明らかとなる。このような変形も添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。本明細書には種々の参照文献が挙げられているが、これらの開示は参照により本明細書にそのまま組み入れられる。

プレトランススプライシングＲＮＡのモデルである。 モデルＰＴＭ構築物及び標的化トランススプライシング手法である。第一世代ＰＴＭの概略図（ＰＴＭ＋Ｓｐ及びＰＴＭ−Ｓｐ）。ＢＤ，結合ドメイン；ＮＢＤ，非結合ドメイン；ＢＰ，分岐点；ＰＰＴ，ピリミジン領域；ｓｓ，スプライス部位；及びＤＴ−Ａ，ジフテリアトキシンサブユニットＡ。ＰＴＭＳ内の特有の制限部位は一文字で示されている：Ｅ，ＥｃｏＲＩ；Ｘ，Ｘｈｏｌ；Ｋ，Ｋｐｎｌ；Ｐ，Ｐｓｔｌ；Ａ，Ａｃｃｌ；Ｂ，ＢａｍＨＩ及びＨ，ＨｉｎｄＩＩＩ。 従来のワトソンクリック塩基対合によるＰＴＭ＋ＳｐとβＨＣＧ６標的プレｍＲＮＡとの結合、並びに提案されるシス及びトランススプライシング機構を示した概略図である。 トランススプライシング効率を高める新規の設計特徴を示すＬａｃＺ−ＣＦＴＲ ５’エキソン置換ＰＴＭの概略図である。設計特徴には、ミニイントロン、Ｔｉａ−１コンセンサス結合部位及びリボザイム配列が含まれる。 トランススプライシング効率を評価するためのＬａｃＺ−ＣＦＴＲ修復モデルである。ＰＴＭは、ＬａｃＺ−ＣＦＴＲミニ遺伝子標的とプレｍＲＮＡレベルで結合することが示される。正確にトランススプライシングされた標的により、機能的ｌａｃＺタンパク質が形成される。 標的イントロンの５’供与部位にターゲティングする（ＰＴＭ４５）又は同じイントロンの３’末端にターゲティングする（ＰＴＭ５２）、２つのＬａｃＺ構築物の比較を示す。標的イントロンの３’末端へのターゲティングは活性を約３倍増大した。値は平均±ＳＥ（ｎ＝４）である。 標的イントロンの５’供与部位にターゲティングする（ＰＴＭ５０）又は同じイントロンの３’末端にターゲティングする（ＰＴＭ５３）、２つのＬａｃＺ構築物の比較を示す。標的イントロンの３’末端にターゲティングするこの形態の構築物は活性を約８倍増大した。値は平均±ＳＥ（ｎ＝３）である。 ３つの異なるＬａｃＺ構築物の比較を示す。Ｔｉａ−１エレメントを含む構築物（ＰＴＭ５８）は、このエレメントを含まないＰＴＭ（ＰＴＭ５９）と比較して２５％高い活性を示す。ＬａｃＺコード中にミニイントロンを含む構築物（ＰＴＭ５８）はそれを含まないもの（ＰＴＭ５４）よりも約３倍の活性がある。値は平均±ＳＥ（ｎ＝２）である。 シス作用性リボザイムを有するＬａｃＺ構築物（ＰＴＭ４７及びＰＴＭ４８）とそれを含まない構築物（ＰＴＭ４５）の比較である。値は平均±ＳＥ（ｎ＝３）である。 種々のトランススプライシング反応の概略図である。（ａ）標的の５’スプライス部位とＰＴＭの３’スプライス部位とで起こるトランススプライシング反応、（ｂ）標的の３’スプライス部位とＰＴＭの５’スプライス部位とで起こるトランススプライシング反応、並びに（ｃ）ＰＴＭが３’及び５’スプライス部位の両方を有する、二重トランススプライシング反応による内部エキソンの置換。ＢＤ，結合ドメイン；ＢＰ，分岐点配列；ＰＰＴ，ポリピリミジン領域、及びｓｓ，スプライス部位。 トランススプライシングによる変異型マウスＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡの修正のモデル系である。 ＬａｃＺ及びＦＶＩＩＩゲノムＰＴＭの概略図である。 イヌＦＶＩＩＩ修復モデルである。 イヌＦＶＩＩＩ ＰＴＭの概略図である。 イントロン１４に結合し、エキソン１５〜２６を置換するように設計されたヒトＦＶＩＩＩ ＰＴＭである。 イントロン１４に結合し、エキソン１５〜２６を置換するように設計されたヒトＦＶＩＩＩ ＰＴＭである。 イントロン１４に結合し、エキソン１５〜２６を置換するように設計されたヒトＦＶＩＩＩ ＰＴＭである。 エキソン１６〜２６の正常なマウス配列を含むマウス第ＶＩＩＩ因子ＰＴＭの詳細な構造である。ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモン３’ＵＴＲ（非翻訳配列）；結合ドメイン＝１２５ｂｐ；潜在部位（cryptic site）を排除するための塩基変化は丸で示す；Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８＝プライマー部位。 マウス第ＶＩＩＩ因子遺伝子における結合ドメインの範囲を示す概略図である。 マウスＰＴＭ結合ドメインの上流の配列における潜在供与部位を排除するための、ＡＡＶベクターｐＤＬＺ２０及びｐＤＬＺ２０−Ｍ２におけるプロモーターの変化である。 マウス第ＶＩＩＩ因子修復モデルである。マウス第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロン１５の３’スプライス部位に結合するＰＴＭの概略図である。 排除されるトランススプライシングドメインを有するＦ８ ＰＴＭの概略図である。これは、修復がトランススプライシング又はタンパク質レベルでの補完の結果であるかどうかを試験するための対照ＰＴＭを表す。 第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスにおける第ＶＩＩＩ因子の修復を示すデータである。血液を、Ｃｏａｔｅｓｔアッセイを用いて第ＶＩＩＩ因子の活性についてアッセイした。 エキソン１６〜２６の正常配列とＣ末端ＦＬＡＧタグを含むマウス第ＶＩＩＩ因子ＰＴＭの詳細な構造である。ＢＧＨ＝ウシ成長ホルモン３’ＵＴＲ；結合ドメイン＝１２５ｂｐ。 エキソン２３〜２６の正常配列を含むヒト又はイヌ第ＶＩＩＩ因子ＰＴＭの詳細な構造である。

Claims (122)

1. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
   ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
   ｂ）分岐点、ピリミジン領域（pyrimidine tract）及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
   ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
2. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
   ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
   ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
   ｃ）イントロンスプライシングアクチベーター及びリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
   ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
3. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
   ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
   ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
   ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列。
4. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
   ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロンの３’末端に位置するイントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
   ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
   ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
5. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
   ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
   ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
   ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；並びに
   ｄ）リボザイム配列。
6. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
   ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
   ｂ）３’受容部位；及び
   ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
7. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
   ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
   ｂ）３’受容部位；
   ｃ）スプライシングエンハンサー、並びに／あるいはイントロンスプライシングアクチベーター配列及び／又はリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
   ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
8. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
   ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
   ｂ）３’受容部位；及び
   ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのミニイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列。
9. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
   ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
   ｂ）３’受容部位；及び
   ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
10. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’スプライス受容部位；
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；及び
    ｄ）リボザイム配列。
11. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
12. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；
    ｃ）イントロンスプライシングアクチベーター及びリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
13. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのミニイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列。
14. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロンの３’末端に位置するイントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
15. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；及び
    ｄ）リボザイム配列。
16. 該核酸分子が、標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞。
17. 該核酸分子が、標的結合ドメインと５’スプライス部位を隔てるスペーサー領域をさらに含む、請求項１１〜１５のいずれかに記載の細胞。
18. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
19. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
    ｃ）スプライシングエンハンサー、並びに／あるいはイントロンスプライシングアクチベーター配列及び／又はリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
20. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列。
21. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロンの３’末端に位置するイントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
22. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；並びに
    ｄ）リボザイム配列。
23. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
24. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；
    ｃ）スプライシングエンハンサー、並びに／あるいはイントロンスプライシングアクチベーター配列及び／又はリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
25. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのミニイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列。
26. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
27. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’スプライス受容部位；
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；及び
    ｄ）リボザイム配列。
28. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、標的プレｍＲＮＡイントロンの３’末端に位置するイントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
29. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；
    ｃ）スプライシングエンハンサー、並びに／あるいはイントロンスプライシングアクチベーター配列及び／又はリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
30. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのミニイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列。
31. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロンの３’末端に位置するイントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
32. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；及び
    ｄ）リボザイム配列。
33. 該核酸分子が、標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域をさらに含む、請求項１８〜２７のいずれかに記載の細胞。
34. 該核酸分子が、標的結合ドメインと５’スプライス部位を隔てるスペーサー領域をさらに含む、請求項２８〜３２のいずれかに記載の細胞。
35. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
36. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
    ｃ）イントロンスプライシングアクチベーター及びリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
37. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列。
38. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロンの３’末端に位置するイントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
39. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；並びに
    ｄ）リボザイム配列。
40. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
41. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；
    ｃ）スプライシングエンハンサー、並びに／あるいはイントロンスプライシングアクチベーター配列及び／又はリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
42. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのミニイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列。
43. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロンの３’末端に位置するイントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
44. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’スプライス受容部位；
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；及び
    ｄ）リボザイム配列。
45. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、標的プレｍＲＮＡイントロンの３’末端に位置するイントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
46. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；
    ｃ）イントロンスプライシングアクチベーター及びリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
47. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのミニイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列。
48. 下記ａ）〜ｃ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロンの３’末端に位置するイントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列。
49. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；及び
    ｄ）リボザイム配列。
50. 標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域をさらに含む、請求項３５〜４４のいずれかに記載の核酸分子。
51. 標的結合ドメインと５’スプライス部位を隔てるスペーサー領域をさらに含む、請求項４５〜４９のいずれかに記載の核酸分子。
52. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｃ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
53. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｄ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
    ｃ）イントロンスプライシングアクチベーター及びリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
54. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｃ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのミニイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
55. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｃ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロンの３’末端に位置するイントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；並びに
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
56. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｄ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点、ピリミジン領域及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；並びに
    ｄ）リボザイム配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
57. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｃ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
58. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｄ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；
    ｃ）スプライシングエンハンサー、並びに／あるいはイントロンスプライシングアクチベーター配列及び／又はリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
59. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｃ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのミニイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
60. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｃ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）３’受容部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
61. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｄ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’スプライス受容部位；
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；及び
    ｄ）リボザイム配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
62. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｃ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
63. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｄ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；
    ｃ）スプライシングエンハンサー、並びに／あるいはイントロンスプライシングアクチベーター配列及び／又はリプレッサーのコンセンサス結合部位；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
64. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｃ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、少なくとも１つのミニイントロン配列のインサートを含む、該ヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
65. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｃ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、イントロンの３’末端に位置するイントロン配列と結合する、該結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；及び
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
66. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｄ）：
    ａ）細胞内で発現された標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；
    ｃ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列；及び
    ｄ）リボザイム配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
67. 該核酸分子が、標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域をさらに含む、請求項５２〜６２のいずれかに記載の方法。
68. 該核酸分子が、標的結合ドメインと５’スプライス部位を隔てるスペーサー領域をさらに含む、請求項６３〜６６のいずれかに記載の方法。
69. ５’供与部位をさらに含む、請求項１〜５及び１８〜２２のいずれかに記載の細胞。
70. ５’供与部位をさらに含む、請求項３５〜３９のいずれかに記載の核酸分子。
71. 核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項５２〜５６のいずれかに記載の方法。
72. 核酸分子が、３’スプライス部位の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティー配列をさらに含む、請求項１〜１５及び１８〜３２のいずれかに記載の細胞。
73. ３’スプライス部位の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティー配列をさらに含む、請求項３５〜４９のいずれかに記載の核酸分子。
74. ３’スプライス部位の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティー配列をさらに含む、請求項５０に記載の核酸分子。
75. ３’スプライス部位の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティー配列をさらに含む、請求項５１に記載の核酸分子。
76. 核酸分子が、３’スプライス部位の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティー配列をさらに含む、請求項５２〜６６のいずれかに記載の方法。
77. 核酸分子が、３’スプライス部位の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティー配列をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
78. 核酸分子が、３’スプライス部位の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティー配列をさらに含む、請求項６７に記載の方法。
79. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
    ｃ）標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
80. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’スプライス受容部位；
    ｃ）標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
81. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；
    ｃ）標的結合ドメインと５’スプライス部位を隔てるスペーサー領域；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
82. 核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項８１に記載の細胞。
83. ３’スプライス領域がピリミジン領域をさらに含む、請求項８１に記載の細胞。
84. 核酸分子が、５’スプライス部位の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティー配列をさらに含む、請求項８１、８２又は８３に記載の細胞。
85. 核酸分子が、３’スプライス部位の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含む、請求項８１、８２又は８３に記載の細胞。
86. 標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合が、相補性、三重らせんの形成、又はタンパク質−核酸相互作用により媒介される、請求項８１に記載の細胞。
87. トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列が第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、請求項８１に記載の細胞。
88. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
    ｃ）標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
89. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’スプライス受容部位；
    ｃ）標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
90. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する組換えベクターを含有する細胞であって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記細胞：
    ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；
    ｃ）標的結合ドメインと５’スプライス部位を隔てるスペーサー領域；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
91. 核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項９０に記載の細胞。
92. ３’スプライス領域がピリミジン領域をさらに含む、請求項９０に記載の細胞。
93. 核酸分子が、３’スプライス領域の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含む、請求項９０、９１又は９２に記載の細胞。
94. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、細胞内で核酸分子の一部が標的プレｍＲＮＡの一部へとトランススプライシングされてキメラＲＮＡを形成する条件下で接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｄ）：
    ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）分岐点及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
    ｃ）標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列、
    を含むものである、前記方法。
95. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、細胞内で核酸分子の一部が標的プレｍＲＮＡの一部へとトランススプライシングされてキメラＲＮＡを形成する条件下で接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｄ）：
    ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）３’スプライス受容部位；
    ｃ）標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列、
    を含むものである、前記方法。
96. 細胞内でキメラＲＮＡ分子を作製する方法であって、細胞内で発現された標的第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子は、下記ａ）〜ｄ）：
    ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
    ｂ）５’スプライス部位；
    ｃ）標的結合ドメインと５’スプライス部位を隔てるスペーサー領域；並びに
    ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列、
    を含むものであり、また該核酸分子は細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、前記方法。
97. 核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項９６に記載の方法。
98. ３’スプライス領域がピリミジン領域をさらに含む、請求項９６に記載の方法。
99. 核酸分子が、３’スプライス領域の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含む、請求項９６、９７又は９８に記載の方法。
100. トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列が第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、請求項９６に記載の方法。
101. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
     ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
     ｂ）分岐点及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
     ｃ）標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域；並びに
     ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
102. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
     ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
     ｂ）３’スプライス受容部位；
     ｃ）標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域；並びに
     ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
103. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子であって、細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記核酸分子：
     ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
     ｂ）５’スプライス部位；
     ｃ）標的結合ドメインと５’スプライス部位を隔てるスペーサー領域；並びに
     ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
104. ５’供与部位をさらに含む、請求項１０３に記載の核酸分子。
105. ３’スプライス領域がピリミジン領域をさらに含む、請求項１０３に記載の核酸分子。
106. ３’スプライス領域の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０３、１０４又は１０５に記載の核酸分子。
107. 標的プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合が、相補性、三重らせんの形成、又はタンパク質−核酸相互作用により媒介される、請求項１０３、１０４、１０５又は１０６に記載の核酸分子。
108. トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列が第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、請求項１０３、１０４、１０５又は１０６に記載の核酸分子。
109. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する真核細胞発現ベクターであって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記真核細胞発現ベクター：
     ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
     ｂ）分岐点及び３’スプライス受容部位を含む、３’スプライス領域；
     ｃ）標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域；並びに
     ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
110. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する真核細胞発現ベクターであって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記真核細胞発現ベクター：
     ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
     ｂ）３’スプライス受容部位；
     ｃ）標的結合ドメインと３’スプライス領域を隔てるスペーサー領域；並びに
     ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
111. 下記ａ）〜ｄ）を含む核酸分子を発現する真核細胞発現ベクターであって、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記真核細胞発現ベクター：
     ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメイン；
     ｂ）５’スプライス部位；
     ｃ）標的結合ドメインと５’スプライス部位を隔てるスペーサー領域；並びに
     ｄ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
112. 核酸分子が５’供与部位をさらに含む、請求項１１１に記載のベクター。
113. ３’スプライス領域がピリミジン領域をさらに含む、請求項１１１に記載のベクター。
114. 核酸分子が、３’スプライス領域の片側又は両側に結合する１以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１１１、１１２、１１３又は１１４に記載のベクター。
115. ウイルスベクターである、請求項１１１、１１２、１１３又は１１４に記載のベクター。
116. 核酸分子の発現が肝細胞特異的プロモーターにより制御される、請求項１１１、１１２、１１３又は１１４に記載のベクター。
117. 生理学的に許容される担体及び請求項１０３〜１１０のいずれかに記載の核酸分子を含む組成物。
118. 被験体における第ＶＩＩＩ因子の遺伝的欠陥を修正する方法であって、下記ａ）及びｂ）を含む核酸分子を該被験体に投与することを含み、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識される、前記方法：
     ａ）細胞内で発現された第ＶＩＩＩ因子プレｍＲＮＡへの核酸分子の結合をターゲティングする、１以上の標的結合ドメインであって、該プレｍＲＮＡは第ＶＩＩＩ因子遺伝子欠陥を含む遺伝子によりコードされている、上記結合ドメイン；及び
     ｂ）トランススプライシングされて標的プレｍＲＮＡとなるヌクレオチド配列であって、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、該ヌクレオチド配列。
119. 該核酸がセーフティー配列をさらに含む、請求項９５に記載の細胞。
120. 該核酸がセーフティー配列をさらに含む、請求項１００及び１０１に記載の方法。
121. 該核酸がセーフティー配列をさらに含む、請求項１０８に記載の核酸分子。
122. 該核酸がセーフティー配列をさらに含む、請求項１１６に記載のベクター。

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