KR101885038B1

KR101885038B1 - 바이러스 rna를 추출하는 방법

Info

Publication number: KR101885038B1
Application number: KR1020170125547A
Authority: KR
Inventors: 박기범; 조용훈; 한연수
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2018-08-03

Abstract

본 발명은 바이러스 RNA를 추출하는 방법에 관한 것으로, 시료로부터 다양한 오염원(예를 들어, 곰팡이, 세균, 꽃가루 등) 등을 효과적으로 제거하므로, 더욱 민감하게 시료 유래 바이러스의 진단을 가능하게 하며, 기존 RNA 추출 방법에 비하여 저렴한 시약을 사용하기 때문에 질병을 매개하는 바이러스 진단 실험 및 다양한 감시 사업의 규모를 더욱 확대할 수 있고, 그에 따라 공중보건에 기여할 수 있다.

Description

바이러스 RNA를 추출하는 방법{Method for Isolating Virus RNA}

본 발명은 바이러스 RNA를 추출하는 방법에 관한 것이다.

종래의 RNA 고체상 추출 기술은 카오트로픽 염(Chaotropic salt)인 구아니딘 염(Guanidine salt)을 이용하여 RNA를 추출한다. 기존 연구 논문에 따르면, 구아니딘 염은 강력한 카오트로픽 염으로, 세포 또는 바이러스를 감싸는 단백질 막을 변형시켜 조직 또는 세포로부터 RNA를 방출하게 한다. 방출된 RNA는 실리카 멤브레인과 반응시킨다. 고염도(High salt) 조건에서 실리카 멤브레인의 (-) 전하(charge)에 (+) 전하 염(salt) 브릿지가 형성되며 이 브릿지에 핵산의 (-) 전하 부위가 결합하게 된다. 이후 저염도의 물 또는 특정한 버퍼를 이용하여 실리카 멤브레인으로부터 RNA 등 핵산을 추출할 수 있다.

이러한 카오트로픽 염을 이용한 RNA 추출 방법은 실험 과정이 간편하며 독성이 낮고 초보자도 매뉴얼을 충실히 따르면 고품질의 핵산을 추출할 수 있으나, 키트의 가격이 높아 대량의 시료로부터 RNA를 추출할 때 경제적인 문제가 발생한다.

한편, 트리졸(Trizol)을 이용한 액체상 상분리 RNA 추출 기법의 경우, 페놀, 클로로포름, 구아니딘 티오시안산염(Guanidine thiocyanate)을 사용한다. 각 성분은 모두 세포 또는 생물 조직의 단백질 막을 파괴하고 내부의 DNA 또는 RNA를 용출시키는 역할을 한다. 이러한 트리졸을 이용한 액체상 상분리 RNA 추출 기법은 고체막을 이용하지 않고 원심분리를 통해 층을 나눠 RNA를 분리한다는 점에서 실리카 멤브레인을 이용한 방법과 차이가 있다.

트리졸을 이용한 액체상 상분리 RNA 추출 기법은 단백질이 페놀에 용해된다는 점과 페놀이 클로로포름에 용해된다는 점, DNA가 RNA에 비하여 산성 조건에서 쉽게 분리가 된다는 점에 착안하여, 원심분리를 통해 단백질층(페놀층>1.49 g/cm³), DNA층(1.03>중간층>1.49 g/cm³), RNA층(1 g>수층>1.03 g/cm³)으로 나누고, 상층액을 이소프로파놀로 침전시켜 순수한 RNA를 추출할 수 있도록 한다. 가격이 저렴하기 때문에 샘플의 양이 많거나 숫자가 많을 때 이를 처리하기 위한 목적으로 사용된다. 그러나 숙련된 실험 테크닉이 필요하고 페놀, 클로로포름 같은 휘발성 독성물질을 사용하기 때문에 적절한 유해물질 노출 방지 설비가 구축되어 있지 않은 경우 실험자의 건강에 위해를 끼칠 수 있게 된다.

본 발명자들은 시료로부터 RNA를 추출하여 바이러스 보유 여부를 진단하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인체에 유해한 물질의 사용을 배제하면서 곰팡이, 꽃가루 등에서 유래한 오염원(예를 들어, 단백질, RNA, DNA, 탄수화물 등)을 제거하고, 바이러스 유래 RNA를 효율적으로 분리할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 바이러스 RNA를 추출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태는 다음의 단계를 포함하는 바이러스 RNA를 추출하는 방법에 관한 것이다:

(a) 시료를 균질화하는 균질화 단계;

(b) 균질화된 용액을 원심분리하는 제1원심분리 단계;

(c) 제1원심분리 상층액에 용해 버퍼를 혼합하는 제1혼합 단계;

(d) 제1원심분리 상층액과 용해 버퍼의 혼합물을 원심분리하는 제2원심분리 단계;

(e) 제2원심분리 상층액에 이소프로파놀(isopropanol)을 혼합하는 제2혼합 단계;

(f) 제2원심분리 상층액과 이소프로파놀의 혼합물을 실리카 멤브레인(silica membrane) 컬럼에 통과시키는 단계;

(g) 실리카 멤브레인 컬럼에 세척 버퍼를 통과시켜 실리카 멤브레인 컬럼을 세척하는 세척단계; 및

(h) 실리카 멤브레인 컬럼으로부터 RNA를 용출시키는 용출 단계.

본 발명은 바이러스 RNA를 추출하는 방법에 관한 것으로, 이를 통해 추출한 RNA를 이용하여 시료의 바이러스 보유 여부를 진단할 수 있다.

기존의 바이러스 RNA 추출 키트들은 가격대가 높은 시약인 구아니딘 티오시안산염, 소듐 아이오다이드, 구아니딘 염산염 등을 이용하고 있다. 따라서 개체수가 많은 곤충에 대하여 기존의 바이러스 RNA 추출 키트를 이용하여 RNA를 추출하고, 바이러스 보유 여부를 진단하는 실험을 수행하는 경우, 경제적인 부담이 크다.

아울러, 키트에 포함된 구아니딘 염과 같은 강한 카오트로픽 염 또는 트리졸에 포함된 페놀, 클로로포름과 같은 실험 재료는 인체에 유해하기 때문에 장기간 노출 시 실험자의 건강에 위해를 끼친다.

기존의 바이러스 RNA 추출 키트와 추출 방법들은 인체 유래 시료 또는 세포 배양액에서 바이러스를 추출하는 것을 기준으로 한다. 따라서, 초기 샘플 자체에 오염 물질이 많이 존재하지 않는다. 그러나 곤충 개체의 경우, 야외에서 채집되는 경우가 많으며, 이 경우에는 다양한 오염원(예를 들어, 곰팡이, 세균, 꽃가루 등)이 존재하게 된다.

기존의 바이러스 RNA 추출 키트의 경우, 강력한 카오트로픽 염을 이용하기 때문에 곤충의 RNA와 바이러스 유래 RNA　뿐만 아니라 오염원인 곰팡이, 세균, 식물성 물질(예를 들어, 꽃가루 등)의 RNA를 모두 추출하게 된다. 이러한 다양한 오염원으로부터 유래된 RNA는 결과적으로 진단 실험에서 실시하는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 과정에서 억제제로 작용하여 바이러스 보유 진단의 민감도를 낮추게 된다.

본 발명은 카오트로픽 염을 이용하여 시료로부터 바이러스 RNA를 추출할 때 발생하는 문제점을 해결하기 위한 것이다. 구체적으로, 곰팡이, 꽃가루 등과 같은 오염원의 용해도는 낮고, 바이러스 용해도는 높은 용해 버퍼를 이용하여 RNA를 추출하였다.

또한, 원심분리를 통해 오염원(예를 들어, small RNA, 단백질, DNA, 탄수화물 등)을 최대한 제거하여, 시료의 바이러스 보유 여부 진단 시 진단 실험의 민감도를 높였으며, 기존 바이러스 RNA 추출 키트와 비교하여 가격이 저렴한 화학물질을 사용함으로써 RNA 추출 비용을 현저히 낮추었다.

현재 질병을 매개하는 바이러스 진단 실험 및 다양한 감시 사업이 경제적인 이유로 제한되어 있다. 그 중 모기로부터 RNA를 추출하는 과정이 가장 비용이 많이 드는데 이 과정을 본 발명을 통해 더욱 저렴하게 수행할 수 있다면 감시 사업의 규모를 더욱 확대할 수 있고 그에 따라 공중보건에 기여하는 역할을 할 수 있을 것이라 예상된다.

본 발명의 바이러스 RNA 추출 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

(a) 시료의 균질화

시료로부터 바이러스의 RNA를 추출하기 위해 먼저 시료를 균질화한다.

상기 시료는 동물 개체, 조직(tissue), 기관(organ) 또는 세포, 바닷물, 수돗물, 생수 또는 양식장 물일 수 있고, 예를 들어, 절지동물 개체, 조직 또는 기관일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 절지동물은 곤충류, 거미류 또는 다지류일 수 있다. 상기 곤충류는 벌, 모기, 파리, 나비, 나방, 개미, 잠자리, 바퀴벌레, 사마귀, 대벌레, 메뚜기, 매미 및 딱정벌레를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.

상기 거미류는 거미 및 전갈을 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.

상기 다지류는 지네, 노래미 및 그리마를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시료는 야외에서 채집한 곤충류일 수 있다.

상기 균질화는 시료를 파쇄하여 균질한 용액으로 만드는 것으로, 예를 들어, 바이러스 RNA를 추출하기 위해 채집한 시료를 균질화 용액에 혼합하고 균질기를 이용하여 파쇄하여 균질화할 수 있다.

상기 균질화는 균질화 용액 총량에 대하여 1 내지 30 mM 농도의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 균질화 용액 총량에 대하여 0.1 내지 2%(v/v) 농도의 NaCl을 포함하는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 실시할 수 있다.

상기 EDTA는 균질화 용액 총량에 대하여 1 내지 30 mM, 1 내지 28 mM, 1 내지 25 mM, 1 내지 22 mM, 3 내지 30 mM, 3 내지 28 mM, 3 내지 25 mM, 3 내지 22 mM, 5 내지 30 mM, 5 내지 28 mM, 5 내지 25 mM, 5 내지 22 mM, 8 내지 30 mM, 8 내지 28 mM, 8 내지 25 mM, 8 내지 22 mM, 10 내지 30 mM, 10 내지 28 mM, 10 내지 25 mM, 10 내지 22 mM, 12 내지 30 mM, 12 내지 28 mM, 12 내지 25 mM, 12 내지 22 mM, 15 내지 30 mM, 15 내지 28 mM, 15 내지 25 mM, 15 내지 22 mM, 18 내지 30 mM, 18 내지 28 mM, 18 내지 25 mM, 18 내지 22 mM 또는 19 내지 21 mM 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 20 mM 농도로 포함될 수 있다.

상기 NaCl은 균질화 용액에 대하여 0.1 내지 2%(v/v), 0.1 내지 1.8%(v/v), 0.1 내지 1.5%(v/v), 0.1 내지 1.2%(v/v), 0.1 내지 1%(v/v), 0.3 내지 2%(v/v), 0.1 내지 1.8%(v/v), 0.3 내지 1.5%(v/v), 0.3 내지 1.2%(v/v), 0.3 내지 1%(v/v), 0.5 내지 2%(v/v), 0.5 내지 1.8%(v/v), 0.5 내지 1.5%(v/v), 0.5 내지 1.2%(v/v), 0.5 내지 1%(v/v), 0.8 내지 2%(v/v), 0.8 내지 1.8%(v/v), 0.8 내지 1.5%(v/v), 0.8 내지 1.2%(v/v), 0.8 내지 1%(v/v) 또는 0.8 내지 0.9%(v/v) 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 0.9%(v/v) 농도로 포함될 수 있다.

(b) 제1원심분리

상기 균질화한 용액을 제1원심분리하여 바이러스 RNA를 포함하는 상층액을 수득한다.

(c) 제1원심분리 상층액에 용해 버퍼를 혼합

상기 제1원심분리하여 얻은 상층액에 용해 버퍼를 혼합한다.

상기 용해 버퍼는 SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 NaCl(sodium chloride)를 포함할 수 있다.

상기 용해 버퍼에서 SDS는 0.1 내지 10%(v/v), 0.1 내지 9.0%(v/v), 0.1 내지 8.0%(v/v), 0.1 내지 7.0%(v/v), 0.5 내지 10%(v/v), 0.5 내지 9.0%(v/v), 0.5 내지 8.0%(v/v), 0.5 내지 7.0%(v/v), 1.0 내지 10%(v/v), 1.0 내지 9.0%(v/v), 1.0 내지 8.0%(v/v), 1.0 내지 7.0%(v/v), 2.0 내지 10%(v/v), 2.0 내지 9.0%(v/v), 2.0 내지 8.0%(v/v), 2.0 내지 7.0%(v/v), 3.0 내지 10%(v/v), 3.0 내지 9.0%(v/v), 3.0 내지 8.0%(v/v), 3.0 내지 7.0%(v/v), 4.0 내지 10%(v/v), 4.0 내지 9.0%(v/v), 4.0 내지 8.0%(v/v), 4.0 내지 7.0%(v/v), 5.0 내지 10%(v/v), 5.0 내지 9.0%(v/v), 5.0 내지 8.0%(v/v) 또는 5.0 내지 7.0%(v/v) 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 6.0%(v/v) 농도로 포함될 수 있다.

종래 연구에 따르면 등에 따르면 작업용액(working solution)에서 SDS 농도가 최종적으로 2.0%(v/v) 정도면 시료로부터 RNA를 추출하는데 충분한 것으로 알려져 있다(Appl Environ Microbiol. 2011 Jun; 77(12): 3975-3981). 실험을 통해 SDS를 1.0%(v/v), 1.5%(v/v) 농도로 사용하였을 때도 문제없이 RNA가 추출되는 것으로 확인되었으나 아래와 같은 문제가 발생하였다.

DNA와 단백질 등을 제거하는 SDS 및 NaCl을 이용한 침전반응 시 SDS 농도가 낮으면 침전된 펠릿의 크기가 작아 상층액을 분리하기 어려웠으며 이보다 농도가 높을 경우 거품이 많이 생기고 실험 직전에 녹이는 과정이 어려워 실험을 수행하기에 용이하지 않았다. 따라서 최종적으로 용해 버퍼(LnB)에서 SDS 농도를 6.0%(v/v)로 결정하였다.

추가적으로 RNA를 분해하는 효소인 RNAase를 제거하는 RNAse ZAP의 경우, 주성분인 SDS의 농도가 1 내지 5%(v/v) 정도인 것으로 추정되는데, 이를 기초로 판단하였을 때 SDS의 최종농도가 1.0%(v/v) 이상이어야 RNAse를 효과적으로 불활성화 시킬 수 있을 것으로 판단하였고, 최종적으로 RNA를 포함하는 용액을 컬럼에 통과시킬 때 SDS의 농도가 약 2.0%(v/v)가 되도록 용해 버퍼(LnB)의 SDS 농도를 6.0%(v/v)로 결정하였다.

상기 용해 버퍼에서 NaCl은 0.5 내지 1.0 M, 0.5 내지 0.9 M, 0.5 내지 0.8 M, 0.5 내지 0.75 M, 0.6 내지 1.0 M, 0.6 내지 0.9 M, 0.6 내지 0.8 M, 0.6 내지 0.75 M, 0.7 내지 1.0 M, 0.7 내지 0.9 M, 0.7 내지 0.8 M, 0.7 내지 0.75 M 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 0.75 M 농도로 포함될 수 있다.

상기 용해 버퍼에서 NaCl이 1 M 이상 포함되는 경우, SDS가 불용성(insoluble) 형태가 되어 석출되며, 0.5 M 미만 포함되는 경우 삼투압이 낮아 균질화된 용액 내 곤충 세포를 효과적으로 용해시킬 수 없다.

상기 용해 버퍼는 상기 균질화 용액을 시료에 첨가하여 균질화 시킨 균질화 용액을 제1 원심분리하여 얻은 상층액에 대하여 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v) 또는 0.9 내지 1.0배(v/v) 혼합하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1.0배(v/v) 혼합하는 것일 수 있다.

일반적으로 핵산을 바인딩하는데 사용하는 컬럼의 최대 볼륨은 700 ㎕로, 약 600 ㎕의 시료를 컬럼에 로딩해야 컬럼을 통과한 웨이스트(waste)에 의한 컬럼 멤브레인 오염이 적다. 제1 원심분리 상층액을 100 ㎕ 사용했을 때 용해 버퍼 100 ㎕, 5 M NaCl 수용액 100 ㎕를 첨가하면 총 혼합액의 볼륨은 300 ㎕가 된다.

핵산을 멤브레인에 바인딩하기 위해 사용하는 이소프로파놀의 최종 농도가 50%(v/v)가 되도록 하기 때문에(일반적으로 DNA 또는 RNA 침전 시 최종 50%(v/v) 농도로 수행한다) 원심분리 상층액, 용해 버퍼 및 5 M NaCl 수용액의 총 혼합액이 300 ㎕ 일 때, 이소프로파놀은 300 ㎕를 사용하며, 컬럼에 로딩하는 혼합액의 볼륨은 최종적으로 600 ㎕가 된다. 따라서 용해 버퍼는 제1 원심분리 상층액에 대하여 1.0배(v/v) 혼합하는 것으로 결정하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 용해 버퍼는 상기 균질화 용액을 시료에 첨가하여 균질화 시킨 균질화 용액을 제1 원심분리하여 얻은 상층액과 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 원심분리하여 얻은 상층액과 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 NaCl을 첨가할 수 있다.

상기 첨가되는 NaCl은 NaCl 수용액 상태인 것일 수 있다.

상기 NaCl 수용액은 1 내지 10 M, 1 내지 8 M, 1 내지 7 M, 1 내지 6 M, 2 내지 10 M, 2 내지 8 M, 2 내지 7 M, 2 내지 6 M, 3 내지 10 M, 3 내지 8 M, 3 내지 7 M, 3 내지 6 M, 4 내지 10 M, 4 내지 8 M, 4 내지 7 M 또는 4 내지 6 M 농도 일 수 있으며, 예를 들어, 5 M NaCl 수용액일 수 있다.

상기 NaCl 수용액은 제1 원심분리하여 얻은 상층액과 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 대하여, 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v) 또는 0.9 내지 1.0배(v/v) 혼합되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.

상기 제1 원심분리하여 얻은 상층액과 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 첨가되는 NaCl 수용액은 상기 상층액과 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 원심분리하여 얻은 상층액 100 ㎕에 용해 버퍼 100 ㎕를 혼합한 다음, 5 M NaCl 수용액 100 ㎕를 혼합할 수 있다.

(d) 용해 버퍼 혼합물을 원심분리( 제2원심분리 )

상기 제1원심분리하여 얻은 상층액과 용해 버퍼를 혼합한 혼합물을 제2원심분리한다.

(e) 원심분리 상층액에 이소프로파놀을 혼합

상기 제2원심분리하여 얻은 상층액을 새 튜브로 옮긴 뒤 이소프로파놀을 혼합한다.

상기 이소프로파놀은 제2 원심분리하여 얻은 상층액에 대하여 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v) 또는 0.9 내지 1.0배(v/v) 혼합되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 동량으로 혼합되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2원심분리하여 얻은 상층액과 혼합되는 이소프로파놀은 제2원심분리하여 얻은 상층액과 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.

(f) 이소프로파놀 혼합물을 컬럼에 통과

상기 제2원심분리하여 얻은 상층액과 이소프로파놀을 혼합한 혼합물을 실리카 멤브레인(silica membrane) 컬럼에 통과시킨다.

상기 실리카 멤브레인 컬럼은 실리카 재질의 컬럼인 한 특별히 제한되지 않는다.

(g) 컬럼 세척

상기 실리카 멤브레인 컬럼에 세척 버퍼를 첨가한 다음, 원심분리하여 컬럼을 세척한다.

상기 세척 버퍼는 세척 버퍼 총량에 대하여 1 내지 5 M 농도의 초산 나트륨(sodium acetate)를 포함할 수 있다.

상기 세척 버퍼의 초산 나트륨은 세척 버퍼 총량에 대하여 1 내지 5 M, 1 내지 4 M, 1 내지 3 M, 2 내지 5 M, 2 내지 4 M, 2 내지 3 M, 3 내지 5 M 또는 3 내지 4 M 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 3 M 농도로 포함될 수 있다.

상기 1차 세척 버퍼의 pH는 4.0 내지 6.0, 4.0 내지 5.5, 4.5 내지 6.0, 4.5 내지 5.5, 5.0 내지 5.5 또는 5.0 내지 6.0일 수 있으며, 예를 들어, 5.5일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 1차 세척 버퍼로 세척한 실리카 멤브레인 컬럼을 2차 세척 버퍼로 추가적으로 세척하는 것일 수 있다.

상기 2차 세척 버퍼는 70 내지 90%(v/v) 에탄올 수용액, 예를 들어, 80%(v/v) 에탄올 수용액일 수 있다.

상기 에탄올 수용액으로 실리카 멤브레인 컬럼을 세척하여 앞서 사용한 버퍼 성분을 제거할 수 있다.

(h) RNA 용출

상기 세척한 실리카 멤브레인 컬럼으로부터 RNA를 용출시킨다.

상기 RNA 용출은 실리카 멤브레인 컬럼에 용출 버퍼를 투입하여 원심분리하여 수행할 수 있다.

상기 용출 버퍼는 RNA 분해효소가 없는 물일 수 있다.

본 발명은 바이러스 RNA를 추출하는 방법에 관한 것으로, 시료로부터 다양한 오염원(예를 들어, 곰팡이, 세균, 꽃가루 등) 등을 효과적으로 제거하므로, 더욱 민감하게 시료 유래 바이러스의 진단을 가능하게 하며, 기존 RNA 추출 방법에 비하여 저렴한 시약을 사용하기 때문에 질병을 매개하는 바이러스 진단 실험 및 다양한 감시 사업의 규모를 더욱 확대할 수 있고 그에 따라 공중보건에 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 곤충 시료로부터 바이러스 RNA를 추출하는 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 채집된 꿀벌로부터 RNA 추출 후 꿀벌로부터 추출된 바이러스를 PCR을 통해 검출한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 명세서 전체에 거쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

1. 실시예

1-1. 균질화 단계

곤충 300 mg당 20 mM EDTA-0.9% NaCl 용액 1 ml을 첨가하여 균질화하여 균질화된 용액을 수득하였다.

1-2. 제1 원심분리 단계

균질화된 용액을 5,000 g/10분 조건으로 제1 원심분리하여 상층액을 수득하였다.

1-3. 제1 혼합 단계

제 1원심분리하여 균질화된 용액의 상층액 100 ㎕에 70℃가 되도록 가열한 표 1의 용해 버퍼(Lysis and binding buffer, LnB) 를 100 ㎕ 넣고 섞은 다음, 100 ㎕의 5 M NaCl 수용액을 넣고 볼텍싱(Vortexing)하였다.

성분	용량	최종 농도
20% SDS 용액	15 ml	6%
5 M NaCl	7.5 ml	0.75 M
증류수	27.5 ml	-

1-4. 제2 원심분리 단계

그 다음, 용해 버퍼 혼합물을 14,000 rpm, 4℃ 조건으로 5분 동안 제2 원심분리하였다. 이 과정을 통해 단백질 및 DNA를 제거하였다. 이 단계에서 외부 요인의 오염원이 제거된다.

상기 외부 요인의 오염원은 곤충 체외의 비표적 생물(nontarget organism)을 의미한다.

0.5 내지 6.0%(v/v) 농도의 SDS와 0.4 M 농도 이상의 NaCl수용액을 혼합하면 SDS가 분리되어 침전된다. 이 과정에서 SDS와 결합했던 단백질과 DNA가 함께 침전되어 상층액에서 대부분 제거되기 때문에 SDS와 NaCl 침전물과 함께 침전된 비용해성 물질이 상층액을 옮길 때 같이 섞여 들어가 컬럼을 막는 현상(column clogging)을 방지할 수 있다.

1-5. 제2 혼합 단계

제2 원심분리 후 얻은 상층액을 새 튜브에 옮긴 후 동량의 이소프로파놀을 넣고 혼합하였다.

1-6. 컬럼 통과 단계

제2 원심분리 상층액 및 이소프로파놀의 혼합액을 실리카 멤브레인 컬럼(바이오니아: KA-0133, DNA binding column tube for K-3034, 엘피스: EBD-1021, Spin Column (mini), Zymoresearch: R2050, Spin column(miniprep), Qiagen: QIAamp Viral RNA mini kit 내의 column)에 넣고 1분간 원심분리하고 컬럼을 통과한 액체를 제거하였다. 이 과정에서 컬럼을 통과한 액체가 컬럼에 닿지 않도록 유의한다.

1-7. 1차 세척 단계

표 2의 조성을 가진 1차 세척 버퍼(wash buffer)를 실리카 멤브레인 컬럼에 600 ㎕ 넣고 1분간 원심분리하고 컬럼을 통과한 액체를 제거하였다. 이 과정을 통해 곤충 색소, 단백질, DNA, 탄수화물 등을 제거하였다. 이때 컬럼을 통과한 액체가 컬럼에 닿지 않도록 유의하여야 한다.

성분	용량	최종 농도	pH
초산 나트륨(sodium acetate)	12.3 g	3 M	-
증류수	세척 버퍼 최종 부피가 50 ml이 되도록 첨가함.	-	5.5

1-8. 2차 세척단계

표 3의 조성을 가진 2차 세척 버퍼를 600 ㎕ 넣고 2분간 원심분리하고 컬럼을 통과한 액체를 제거하였다. 이 단계를 통해 상기 실험과정에서 사용한 용해 버퍼, 1차 세척 버퍼 성분을 제거하였다. 이 과정에서 컬럼을 통과한 액체가 컬럼에 닿지 않도록 유의하여야 한다.

성분	용량	최종 농도
99% 에탄올	40 ml	80%
증류수	10 ml	-

1-9. 용출 단계

10 내지 50 ㎕의 증류수를 컬럼에 넣어 RNA가 용출되도록 한 다음, 제3 원심분리하여 RNA를 수득하였다.

2. 대조군

본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물에 대한 효율을 평가하기 위해, 대조군으로 퀴아젠 사(Qiagen)의QIAamp Viral RNA mini kit를 이용하여 동일한 곤충 샘플에 대하여 RNA를 추출하였다.

실험예 1. 흡광도 측정

본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 꿀벌 RNA를 대상으로 230 nm, 260 nm, 280 nm 및 320 nm 파장에 대한 흡광도를 측정하고 260 nm/230 nm 및 260 nm/280 nm 비율을 계산하여, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

핵산의 순도, 특히 RNA의 순도를 측정하기 위해서 260 nm에서의 흡광도뿐만 아니라, 280 nm에서의 흡광도를 동시에 측정하여 260/280의 비율을 계산하였다. 280 nm에서 측정하는 이유는 단백질에 포함된 방향 고리 구조를 가지는 타이로신과 트립토판 같은 아미노산이 280 nm에서 최대 흡수도를 보이기 때문에, 이 비율을 계산하여 분리된 RNA 용액이 어느 정도의 단백질을 함유하고 있는지를 알 수 있다.

또한, RNA의 경우 260/280의 비율 이외에도 260/230의 비율도 계산하였다. 230 nm에서는 페놀과 같은 용매, 염과 단백질 등이 높은 흡광도를 보이므로 이러한 물질의 오염 여부를 알 수 있다.

순수하게 분리된 RNA의 260/280 값은 1.9 내지 2.2를 가지며, 260/230 값은 1.8 이상의 값을 가진다. 즉, 260/230의 값이 1.8 이하이면 분리된 RNA는 추출 과정 중 사용한 시약 중 페놀, 티오시안산염(thiocyanate), 구아니딘, 알코올과 기타 유기 용매에 의해 오염되었음을 말해준다.

Sample Read#	Location	260	280	230	260/280	260/230	ng/μL
1	F2	0.149	0.068	0.061	2.181	2.441	118.932
1	F3	0.15	0.069	0.062	2.18	2.435	120.127
1	G2	0.143	0.066	0.059	2.182	2.434	114.532
1	G3	0.133	0.061	0.055	2.187	2.432	106.128

표 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 방법을 통해 추출한 RNA의 260/280 비율은 평균 2.18, 260/230 비율은 평균 2.43을 나타내 높은 순도를 갖는 것으로 확인되었다.

실험예 2. 꿀벌 바이러스 진단

6개 꿀벌 샘플에 대하여 본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 RNA와 Qiagen의 QIAamp Viral RNA mini kit를 이용하여 추출한 RNA(대조군)에 대하여, 꿀벌 바이러스 7종(CBPV: Chronic bee paralysis virus, BQCV: Black queen cell virus, ABPV: Acute bee paralysis virus, KBV: Kashmir bee virus, SBV: Sacbrood virus, DWV: Deformed wing virus, IAPV: Israeli acute paralysis virus)에 특이적인 프라이머 쌍으로 바이러스 RNA를 검출하였다.

바이러스	명명	서열번호	프라이머 서열(5'-3')
CBPV	mpBEE-CBPV-F-774	1	AACCTGCCTCAACACAGGCAAC
CBPV	mpBEE-CBPV-R-774	2	ACATCTCTTCTTCGGTGTCAGCC
BQCV	mpBEE-BQCV-F-536	3	CTTTATCGAGGAGGAGTTCGAGT
BQCV	mpBEE-BQCV-R-536	4	GCAATAGATAAAGTGAGCCCTCC
ABPV	mpBEE-ABPV-F-460	5	GGTGCCCTATTTAGGGTGAGGA
ABPV	mpBEE-ABPV-R-460	6	ACTACAGAAGGCAATGTCCAAGA
KBV	mpBEE-KBV-F-415	7	GATGAACGTCGACCTATTGA
KBV	mpBEE-KBV-R-415	8	TGTGGGTGGCTATGAGTCA
SBV	mpBEE-SBV-F-342	9	CGTAATTGCGGAGTGGAAAGATT
SBV	mpBEE-SBV-R-342	10	AGATTCCTTCGAGGGTACCTCATC
DWV	mpBEE-DWV-F-269	11	TGGTCAATTACAAGCTACTTGG
DWV	mpBEE-DWV-R-269	12	TAGTTGGACCAGTAGCACTCAT
IAPV	mpBEE-IAPV-F-158	13	GGTGCCCTATTTAGGGTGAGGA
IAPV	mpBEE-IAPV-R-158	14	GGGAGTATTGCTTTCTTGTTGTG

사전 변성(PreDenature)	94℃	2분
변성(Denature)	94℃	30초
프라이머 어닐링(Primer Annealing)	56℃	30초
연장(Extension)	72℃	55초
30사이클
최종 연장(Final Extension)	72℃	10분

*) 1스텝 PCR일 경우 cDNA 합성 50℃ 30분,

*) 효소 활성화 95℃ 15분

*) DiaStar™ 2X OneStep Multiplex qRT-PCR Smart mix (for Probe) 사용

	샘플 1	샘플 2	샘플 3	샘플 4	샘플 5	샘플 6
CBPV	VV	VV	V			VV
BQCV	V	V	VV	VV	VV	V
ABPV
KBV
SBV					V
DWV
IAPV

도 2 및 표 7에서 확인할 수 있듯이, 실시예의 경우, 샘플 1, 2, 3 및 6에서 CBPV 및 BQCV가 검출되었고, 샘플 4에서 BQCV가 검출되었으며, 샘플 5에서 BQCV 및 SBV가 검출되었다.

	샘플 1	샘플 2	샘플 3	샘플 4	샘플 5	샘플 6
CBPV	VV	VV				VV
BQCV	V	V	VV	VV	VV	V
ABPV
KBV
SBV					V
DWV
IAPV

한편, 도 3 및 표 8에서 확인할 수 있듯이, 대조군(QIAamp Viral RNA mini kit를 이용)의 경우, 샘플 1, 2 및 6에서 CBPV 및 BQCV가 검출되었고, 샘플 3 및 4에서 BQCV가 검출되었으며, 샘플 5에서 BQCV 및 SBV가 검출되었다.

대조군(QIAamp Viral RNA mini kit를 이용)의 경우, 샘플 3에서 CBPV를 검출하지 못하였으나, 실시예에서는 샘플 3에서 CBPV를 검출하였다.

또한, 대조군의 경우 RNA를 추출하고 7종 바이러스의 유무를 확인하는데 약3만3천원의 비용이 드는데 반해, 실시예의 경우에는 약 3천원의 비용이 발생하였다.

본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 꿀벌을 대상으로 실험한 결과, 동일한 샘플을 사용했을 때 대조군(QIAamp Viral RNA mini kit를 이용)과 비교하여 10배 정도 저렴하나 바이러스는 1종류 더 많이 검출되었다..

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for Isolating Virus RNA <130> PN170166 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-CBPV-F-774 <400> 1 aacctgcctc aacacaggca ac 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-CBPV-R-774 <400> 2 acatctcttc ttcggtgtca gcc 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-BQCV-F-536 <400> 3 ctttatcgag gaggagttcg agt 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-BQCV-R-536 <400> 4 gcaatagata aagtgagccc tcc 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-ABPV-F-460 <400> 5 ggtgccctat ttagggtgag ga 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-ABPV-R-460 <400> 6 actacagaag gcaatgtcca aga 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-KBV-F-415 <400> 7 gatgaacgtc gacctattga 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-KBV-R-415 <400> 8 tgtgggtggc tatgagtca 19 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-SBV-F-342 <400> 9 cgtaattgcg gagtggaaag att 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-SBV-R-342 <400> 10 agattccttc gagggtacct catc 24 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-DWV-F-269 <400> 11 tggtcaatta caagctactt gg 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-DWV-R-269 <400> 12 tagttggacc agtagcactc at 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-IAPV-F-158 <400> 13 ggtgccctat ttagggtgag ga 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mpBEE-IAPV-R-158 <400> 14 gggagtattg ctttcttgtt gtg 23

Claims

다음 단계를 포함하는 바이러스 RNA를 추출하는 방법.
(a) 균질화 용액 총량에 대하여 1 내지 30 mM의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 0.1 내지 2%(v/v)의 NaCl을 포함하는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 시료를 균질화하는 균질화 단계;
(b) 균질화된 용액을 원심분리하는 제1원심분리 단계;
(c) 제1원심분리 상층액에 용해 버퍼 총량에 대하여 0.1 내지 1.5 M 농도의 NaCl(sodium chloride) 및 0.1 내지 10 %(v/v)의 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 포함하는 용해 버퍼를 혼합하고 1 내지 10 M의 NaCl 수용액을 첨가하여 혼합하는 제1혼합 단계;
(d) 용해 버퍼 혼합물을 원심분리하는 제2원심분리 단계;
(e) 제2원심분리 상층액에 이소프로파놀(isopropanol)을 혼합하는 제2혼합 단계;
(f) 이소프로파놀 혼합물을 실리카 멤브레인(silica membrane) 컬럼에 통과시키는 단계;
(g) 실리카 멤브레인 컬럼에 세척 버퍼 총량에 대하여 1 내지 5 M 농도의 초산 나트륨(sodium acetate)을 포함하는 세척 버퍼를 통과시켜 실리카 멤브레인 컬럼을 세척하는 세척단계; 및
(h) 실리카 멤브레인 컬럼으로부터 RNA를 용출시키는 용출 단계.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 세척 단계는 70 내지 90%(v/v) 의 에탄올로 컬럼을 세척하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 바이러스 RNA를 추출하는 방법.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 용출 단계는 상기 컬럼에 용출 버퍼를 투입하여 원심분리하는 단계를 포함하는 것인, 바이러스 RNA를 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 시료는 동물의 개체, 조직(tissue), 기관(organ) 또는 세포인 것인, 바이러스 RNA를 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 시료는 바닷물, 수돗물, 생수 또는 양식장 물인 것인, 바이러스 RNA를 추출하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 동물은 절지동물인 것인, 바이러스 RNA를 추출하는 방법.