WO2020022821A1 - 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 rna 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 rna 추출 방법 - Google Patents

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WO2020022821A1
WO2020022821A1 PCT/KR2019/009299 KR2019009299W WO2020022821A1 WO 2020022821 A1 WO2020022821 A1 WO 2020022821A1 KR 2019009299 W KR2019009299 W KR 2019009299W WO 2020022821 A1 WO2020022821 A1 WO 2020022821A1
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WO
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viral rna
sample
rna
nacl
buffer
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/009299
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English (en)
French (fr)
Inventor
박기범
조용훈
한연수
Original Assignee
전남대학교 산학협력단
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation

Definitions

  • the present invention was made by the task number 2018027102 under the support of the Ministry of Science and ICT, the research management professional organization of the task is the Korea Research Foundation, the research project name "Development and industrialization of low-cost harmless viral RNA extraction automation system", research The project name is "Development and Industrialization of Low-cost Harmless Viral RNA Extraction Automated System", Host Organization is Chonnam National University Industry-Academic Cooperation Group, and research period is 2018.04.01 ⁇ 2018.07.31.
  • the present invention relates to a composition for extracting viral RNA using silica coated magnetic beads and a method for extracting viral RNA using the same.
  • RNA extraction kits are optimized for extracting nucleic acids from relatively clean samples such as cell-free, cell culture fluid, and plasma. Usually, expensive products tend to use chaotropic salts, while lower cost products tend to use phenol and chloroform.
  • chaotropic salts In the case of chaotropic salts, it strongly deprives the water around the protein molecule to modify the protein. In the case of one of the chaotropic salts, guanidine thiocyanate, the protein is cyanated and permanently modified. By completely inactivating the powerful enzyme ribonuclease (Rnase), it helps to extract RNA completely.
  • Rnase ribonuclease
  • the protein solubility of phenol is used to separate RNA and protein from the sample, and chloroform is used to separate the RNA layer and the protein layer to help extract high purity RNA.
  • viral samples can contain a variety of organisms (fungi). , Plants, nematodes, bacteria, etc.) and detects viruses from very large amounts of samples.
  • the chaotropic salt-based products are too expensive and have too strong lysis activity.
  • the chaotropic salt-based products have a limitation in that the treatment process is complicated because the virus diagnosis rate is low and the method is designed to diagnose human diseases.
  • Inexpensive phenol-based products are further divided into phase separation type and solid phase extraction type, which, like chaotropic salt-based products, use strong chemicals and thus sensitivity At the same time, toxic phenols are released into the atmosphere during use, so the experimenter who uses the product inhales them, which risks permanent damage to the subject's body in vector surveillance, which processes a large number of samples.
  • RNA can be effectively extracted only from animal samples. Viruses cause serious problems not only in animals but also in plants.
  • a kit for plant virus RNA extraction is sold separately. This is because a variety of polysaccharides (glucose), glucose (glucose), chlorophyll (chlorophyll) and the like contained in the plant and a wash buffer (wash buffer) is additionally included.
  • the phase-separation type generally does not extract RNA of the quality that can be used for molecular diagnosis. This is because the finally processed RNA contains abundant polysaccharides and polyphenols, which strongly inhibits PCR.
  • nucleic acid extraction kit used for virus monitoring is developed for the purpose of diagnosing human diseases, so that the price is high. Therefore, the higher the sample throughput, the greater the expense.
  • RNA layer > 1.49 g / cm 3
  • DNA layer (1.03> middle layer> 1.49 g / cm 3
  • RNA layer (1 g> aqueous layer> 1.03 g / cm 3
  • supernatant precipitated with isopropanol To extract Because of their low cost, they are used for processing large samples or large numbers. However, the need for skilled experimentation techniques and the use of volatile toxins such as phenol and chloroform can pose a risk to the health of the experimenter if no appropriate hazardous exposure controls are in place.
  • silica coated magnetic nanoparticles which has been developed in Korea and China and is being mass-produced, are 100 times cheaper than a column.
  • the present invention relates to a composition for extracting viral RNA using silica coated magnetic beads and a method for extracting viral RNA using the same.
  • composition of the present invention is inexpensive and harmless to the user, and the experimental step is simpler than conventional commercial products, and in particular, the step of removing insoluble contaminants after homogenizing a sample is easy and the removal conditions are mild.
  • RNA extraction method using a spin column (spin column) method of the present invention can be applied to the magnetic nanoparticles, it is possible to apply the extraction automation system and to process more efficiently when processing a large number of samples have.
  • composition for viral RNA extraction comprising:
  • a homogenization solution comprising 1-30 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 0.1-2.0% (v / v) NaCl (sodium chloride) relative to the total amount of homogenization solution;
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • NaCl sodium chloride
  • a dissolution buffer comprising NaCl and 0.1-10.0%
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • a primary wash buffer comprising sodium chloride at a concentration of 0.1 to 5.0 M relative to the total amount of primary wash buffer
  • Secondary wash buffer comprising an aqueous ethanol solution at a concentration of 50-80% (v / v) relative to the total amount of first wash buffer.
  • Viral RNA extracted from the viral RNA extracting composition may be used to diagnose the presence of virus in the sample.
  • RNA extraction kits use high-priced reagents such as guanidine thiocyanate, sodium iodide, and guanidine hydrochloride. Therefore, when extracting RNA using a conventional viral RNA extraction kit for a large number of insects and performing experiments for diagnosing virus retention, the economic burden is high, and strong kao such as guanidine salts included in the kit. Experimental materials such as phenols and chloroform contained in tropic salts or trizole are harmful to the human body and therefore pose a risk to the health of the experimenter after prolonged exposure.
  • Conventional viral RNA extraction kits use powerful chaotropic salts to extract not only insect and viral-derived RNAs but also RNA from contaminants such as fungi, bacteria, and plant material (e.g. pollen). There is no step to remove the PCR inhibitor.
  • RNA and PCR inhibitors derived from various contaminants act as inhibitors in the process of polymerase chain reaction (PCR) performed in a diagnostic experiment, thereby lowering the sensitivity of virus stock diagnosis.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present invention is to solve the problem that occurs when extracting the viral RNA from the sample using chaotropic salt, low solubility of contaminants such as mold, pollen, etc., the RNA solubility is extracted by using a high solubility buffer The problem was solved.
  • centrifugation removes contaminants (eg, small RNA, protein, DNA, carbohydrate, etc.) as much as possible, increasing the sensitivity of diagnostic experiments when diagnosing whether a sample has a virus, and comparing it with a conventional viral RNA extraction kit.
  • contaminants eg, small RNA, protein, DNA, carbohydrate, etc.
  • the use of inexpensive chemicals has significantly lowered the cost of RNA extraction.
  • the Trizol method of purifying and recovering RNA through the layer separation through centrifugation of the PCR inhibitor, it does not use chloroform and phenol for layer separation, thereby avoiding the hazard.
  • the virus since it does not require more than 15 minutes of centrifugation in the refrigerator, which is required by the conventional Trizol method, the virus can be used to reduce the user's risk when extracting the virus and the extraction time is also shortened.
  • composition for extracting viral RNA of the present invention may be to extract viral RNA from a sample.
  • the sample may be a liquid, but is not limited thereto.
  • the liquid may be seawater, tap water, bottled water or farm water, but is not limited thereto.
  • the sample may be obtained from an animal, but is not limited thereto.
  • the animal may be an arthropod, for example, may be an insect, arachnid or polypod, but is not limited thereto.
  • insects may be, but are not limited to bees, mosquitoes, flies, butterflies, moths, ants, dragonflies, cockroaches, mantis, worms, grasshoppers, cicada or beetles.
  • the arachnid may be a spider, a scorpion or a tick, but is not limited thereto.
  • the poly paper may be a centipede, songme or grima, but is not limited thereto.
  • the sample when the sample is an animal, the sample may be an individual, tissue, organ or cell of an animal, but is not limited thereto.
  • the animal may be collected outdoors, for example, may be insects collected outdoors, but is not limited thereto.
  • composition for viral RNA extraction of the present invention may comprise a homogenization solution.
  • homogenization refers to crushing a sample into a homogeneous solution, for example, mixing a sample collected for extracting viral RNA into a homogenization solution and crushing it using a homogenizer to homogenize.
  • the homogenization solution may include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and sodium chloride (NaCl).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • NaCl sodium chloride
  • EDTA in the homogenization solution is 1 to 30 mM, 1 to 28 mM, 1 to 25 mM, 1 to 22 mM, 3 to 30 mM, 3 to 28 mM, 3 to 25 mM, 3 to 22 mM, 5 to 30 mM , 5 to 28 mM, 5 to 25 mM, 5 to 22 mM, 8 to 30 mM, 8 to 28 mM, 8 to 25 mM, 8 to 22 mM, 10 to 30 mM, 10 to 28 mM, 10 to 25 mM , 10 to 22 mM, 12 to 30 mM, 12 to 28 mM, 12 to 25 mM, 12 to 22 mM, 15 to 30 mM, 15 to 28 mM, 15 to 25 mM, 15 to 22 mM, 18 to 30 mM , 18 to 28 mM, 18 to 25 mM, 18 to 22 mM or 19 to 21 mM concentration, for example, may be included at a
  • the NaCl is 0.1 to 2.0% (w / v), 0.1 to 1.8% (w / v), 0.1 to 1.5% (w / v), 0.1 to 1.2% (w / v), 0.1 to 1% in a homogenization solution (w / v), 0.3 to 2% (w / v), 0.1 to 1.8% (w / v), 0.3 to 1.5% (w / v), 0.3 to 1.2% (w / v), 0.3 to 1% (w / v), 0.5 to 2% (w / v), 0.5 to 1.8% (w / v), 0.5 to 1.5% (w / v), 0.5 to 1.2% (w / v), 0.5 to 1% (w / v), 0.8 to 2% (w / v), 0.8 to 1.8% (w / v), 0.8 to 1.5% (w / v), 0.8 to 1.2% (w / v), 0.8 to 1.2% (w / v), 0.8
  • composition for viral RNA extraction of the present invention may comprise a lysis buffer.
  • the lysis buffer may include sodium dodecyl sulfate (SDS) and sodium chloride (NaCl).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • NaCl sodium chloride
  • SDS in the lysis buffer is 0.1 to 10.0% (v / v), 0.1 to 9.0% (v / v), 0.1 to 8.0% (v / v), 0.1 to 7.0% (v / v), 0.5 to 10.0% (v / v), 0.5 to 9.0% (v / v), 0.5 to 8.0% (v / v), 0.5 to 7.0% (v / v), 1.0 to 10.0% (v / v), 1.0 to 9.0% (v / v), 1.0 to 8.0% (v / v), 1.0 to 7.0% (v / v), 2.0 to 10.0% (v / v), 2.0 to 9.0% (v / v), 2.0 to 8.0% (v / v), 2.0 to 7.0% (v / v), 3.0 to 10.0% (v / v), 3.0 to 9.0% (v / v), 3.0 to 8.0% (v / v), 3.0 to 7.0% (v / v), 4.0 to 10.0% (v /
  • the concentration of SDS in the lysis buffer (LnB) was determined to be 4.0% (v / v).
  • the concentration of SDS which is the main component, is estimated to be about 1.0 to 5.0% (v / v). Based on this, the final concentration of SDS is 1.0%. (v / v) or higher, it was determined that RNAse can be effectively inactivated, and in terms of ease of use and RNA protection, the concentration of SDS when the solution containing RNA is finally brought into contact with silica coated magnetic beads is weak.
  • the SDS concentration of the lysis buffer (LnB) was determined to be 4.0% (v / v) to be at least 1.0% (v / v).
  • NaCl in the lysis buffer is 0.5 to 1.0 M, 0.5 to 0.9 M, 0.5 to 0.8 M, 0.5 to 0.75 M, 0.6 to 1.0 M, 0.6 to 0.9 M, 0.6 to 0.8 M, 0.6 to 0.75 M, 0.7 to 1.0 M , 0.7 to 0.9 M, 0.7 to 0.8 M, 0.7 to 0.75 M may be included, for example, may be included at a concentration of 0.75 M.
  • the lysis buffer is 0.6 to 1.3 times (v / v), 0.6 to 1.2 times (v / v), 0.6 to 1.1 times (v / v), 0.6 to 1.0 times with respect to the homogenized sample by adding a homogenization solution to the sample (v / v), 0.7 to 1.3 times (v / v), 0.7 to 1.2 times (v / v), 0.7 to 1.1 times (v / v), 0.7 to 1.0 times (v / v), 0.8 to 1.3 times (v / v), 0.8 to 1.2 times (v / v), 0.8 to 1.1 times (v / v), 0.8 to 1.0 times (v / v), 0.9 to 1.3 times (v / v), 0.9 to 1.2 times (v / v), 0.9 to 1.1 times (v / v) or 0.9 to 1.0 times (v / v) may be mixed, for example, 1.0 times (v / v) may be mixed.
  • the final dilution ratio of isopropanol and the mixture used to bind the nucleic acid to the silica coated magnetic particles is 1: 2 (v / v) (typically 50% of the DNA or RNA precipitation during membrane column type / v) concentration)
  • v / v typically 50% of the DNA or RNA precipitation during membrane column type / v
  • concentration typically 50% of the DNA or RNA precipitation during membrane column type / v
  • the lysis buffer may be mixed with the homogenized sample by the same amount (v / v) by adding a homogenization solution to the sample.
  • NaCl may be added to the mixture of the homogenized sample and the dissolution buffer.
  • the added NaCl may be in an aqueous NaCl solution.
  • the NaCl aqueous solution is 1 to 10 M, 1 to 8 M, 1 to 7 M, 1 to 6 M, 2 to 10 M, 2 to 8 M, 2 to 7 M, 2 to 6 M, 3 to 10 M, 3 To 8 M, 3 to 7 M, 3 to 6 M, 4 to 10 M, 4 to 8 M, 4 to 7 M or 4 to 6 M concentration, for example, 5 M NaCl aqueous solution.
  • the NaCl aqueous solution is 0.6 to 1.3 times (v / v), 0.6 to 1.2 times (v / v), 0.6 to 1.1 times (v / v), 0.6 to 1.0 with respect to the mixture of the homogenized sample and the dissolution buffer.
  • Times (v / v), 0.7 to 1.3 times (v / v), 0.7 to 1.2 times (v / v), 0.7 to 1.1 times (v / v), 0.7 to 1.0 times (v / v), 0.8 to 1.3 Times (v / v), 0.8 to 1.2 times (v / v), 0.8 to 1.1 times (v / v), 0.8 to 1.0 times (v / v), 0.9 to 1.3 times (v / v), 0.9 to 1.2 Pear (v / v), 0.9 to 1.1 times (v / v) or 0.9 to 1.0 times (v / v) may be mixed, for example, may be mixed in the same amount (v / v).
  • the NaCl aqueous solution added to the mixture of the homogenized sample and the dissolution buffer may be mixed with the homogenized sample in the same amount (v / v).
  • 100 ul of the dissolution buffer may be mixed with 100 ul of the homogenized sample, followed by mixing 100 ul of an aqueous 5 M NaCl solution.
  • Isopropanol may be mixed with the supernatant obtained by centrifuging the mixture of the homogenized sample and the lysis buffer.
  • the isopropanol is 0.1 to 1.3 times (v / v), 0.1 to 1.2 times (v / v), 0.1 to 1.1 times (v / v), 0.1 to 1.0 times (v / v) with respect to the supernatant obtained by centrifugation , 0.1 to 0.9 times (v / v), 0.1 to 0.8 times (v / v), 0.1 to 0.7 times (v / v), 0.1 to 0.6 times (v / v), 0.2 to 1.3 times (v / v) , 0.2 to 1.2 times (v / v), 0.2 to 1.1 times (v / v), 0.2 to 1.0 times (v / v), 0.2 to 0.9 times (v / v), 0.2 to 0.8 times (v / v) , 0.2 to 0.7 times (v / v), 0.2 to 0.6 times (v / v), 0.3 to 1.3 times (v / v), 0.1 to 1.2
  • isopropanol is used to isolate RNA from aqueous solution (www.thermofisher.com/en/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html) . If ethanol is used, 2.5 times the dilution with dissolved RNA should be used, but isopropanol is known to only mix the same amount of dilution with dissolved RNA. However, when extracting the viral nucleic acid using the silica-coated magnetic particles, the PCR diagnosis rate was the highest when 0.5 volume of isopropanol was mixed in 1 volume of the supernatant obtained after centrifugation.
  • the mixture of isopropanol mixed with the supernatant obtained by centrifugation may be contacted with silica coated magnetic beads to bind viral RNA contained in the mixture.
  • composition for viral RNA extraction of the present invention may comprise a primary wash buffer comprising sodium chloride.
  • the primary wash buffer comprises sodium chloride at 0.1 to 5.0 M, 0.1 to 4.5 M, 0.1 to 4.0 M, 0.1 to 3.5 M, 0.5 to 5.0 M, 0.5 to 4.5 M, 0.5 to 4.0 M, 0.5 to 3.5 M, 1.0 To 5.0 M, 1.0 to 4.5 M, 1.0 to 4.0 M, 1.0 to 3.5 M, 1.5 to 5.0 M, 1.5 to 4.5 M, 1.5 to 4.0 M, 1.5 to 3.5 M, 2.0 to 5.0 M, 2.0 to 4.5 M, 2.0 To 4.0 M, 2.0 to 3.5 M, 2.5 to 5.0 M, 2.5 to 4.5 M, 2.5 to 4.0 M, 2.5 to 3.5 M may be included, for example, may be included at a 3.0 M concentration.
  • the pH of the primary wash buffer may be 4.0 to 6.0, 4.5 to 6.0 or 5.0 to 6.0, for example, may be 5.5.
  • composition for extracting a viral RNA of the present invention may include a secondary wash buffer containing an aqueous ethanol solution.
  • the secondary wash buffer is 60 to 90% (v / v), 65 to 90% (v / v), 70 to 90% (v / v), 75 to 90% (v / v), 60 to 85% (v / v), 65-85% (v / v), 70-85% (v / v), 75-85% (v / v) aqueous ethanol solution, for example 80% (v / v) ethanol It may be an aqueous solution.
  • the silica coating magnetic beads may be washed with the secondary washing buffer to remove the previously used buffer component.
  • RNA may be eluted by contacting the washed silica coated magnetic beads with an elution buffer.
  • the elution buffer may be water free of RNAase.
  • the viral RNA extracting composition of the present invention can be carried out through the following steps to extract the viral RNA:
  • the sample is first homogenized to extract viral RNA from the sample.
  • the sample may be an animal or a liquid.
  • the animal may be an arthropod, for example, may be an insect, arachnid or polypod, but is not limited thereto.
  • the liquid may be seawater, tap water, bottled water or farm water, but is not limited thereto.
  • insects may be, but are not limited to bees, mosquitoes, flies, butterflies, moths, ants, dragonflies, cockroaches, mantis, worms, grasshoppers, cicada or beetles.
  • the arachnid may be a spider, a scorpion or a tick, but is not limited thereto.
  • the poly paper may be a centipede, songme or grima, but is not limited thereto.
  • the sample when the sample is an animal, the sample may be an individual, tissue, organ or cell of an animal, but is not limited thereto.
  • the animal may be collected outdoors, for example, may be insects collected outdoors, but is not limited thereto.
  • the homogenization is to crush the sample into a homogeneous solution state, for example, the sample collected for extracting the viral RNA can be mixed with the homogenization solution and crushed using a homogenizer to homogenize.
  • the homogenization may be performed by adding a homogenization solution containing EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) at a concentration of 1 to 30 mM relative to the total amount of homogenization solution and NaCl at a concentration of 0.1 to 2.0% (v / v) relative to the total amount of homogenization solution.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the EDTA is 1 to 30 mM, 1 to 28 mM, 1 to 25 mM, 1 to 22 mM, 3 to 30 mM, 3 to 28 mM, 3 to 25 mM, 3 to 22 mM, 5 to 30 mM in homogenization solution.
  • the NaCl is 0.1 to 2.0% (v / v), 0.1 to 1.8% (v / v), 0.1 to 1.5% (v / v), 0.1 to 1.2% (v / v), 0.1 to 1.0% in a homogenization solution (v / v), 0.3 to 2% (v / v), 0.1 to 1.8% (v / v), 0.3 to 1.5% (v / v), 0.3 to 1.2% (v / v), 0.3 to 1.0% (v / v), 0.5 to 2.0% (v / v), 0.5 to 1.8% (v / v), 0.5 to 1.5% (v / v), 0.5 to 1.2% (v / v), 0.5 to 1.0% (v / v), 0.8 to 2.0% (v / v), 0.8 to 1.8% (v / v), 0.8 to 1.5% (v / v), 0.8 to 1.2% (v / v), 0.8 to 1.0% (v / v) or from
  • the lysis buffer is mixed with the supernatant obtained by centrifugation.
  • the lysis buffer may include sodium dodecyl sulfate (SDS) and sodium chloride (NaCl).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • NaCl sodium chloride
  • the SDS concentration of the lysis buffer is 0.1 to 10.0% (v / v), 0.1 to 9.0% (v / v), 0.1 to 8.0% (v / v), 0.1 to 7.0% (v / v), 0.5 to 10.0 % (v / v), 0.5 to 9.0% (v / v), 0.5 to 8.0% (v / v), 0.5 to 7.0% (v / v), 1.0 to 10.0% (v / v), 1.0 to 9.0 % (v / v), 1.0 to 8.0% (v / v), 1.0 to 7.0% (v / v), 2.0 to 10.0% (v / v), 2.0 to 9.0% (v / v), 2.0 to 8.0 % (v / v), 2.0 to 7.0% (v / v), 3.0 to 10.0% (v / v), 3.0 to 9.0% (v / v), 3.0 to 8.0% (v / v), 3.0 to 7.0 % (v / v),
  • the concentration of SDS in the lysis buffer (LnB) was determined to be 4.0% (v / v).
  • the concentration of SDS which is the main component, is estimated to be about 1.0 to 5.0% (v / v). Based on this, the final concentration of SDS is 1.0%. (v / v) was determined to be able to effectively inactivate RNAse, and finally, when the solution containing RNA is contacted with silica coated magnetic beads, the concentration of SDS is about 1.0% (v / v) or more.
  • the SDS concentration of lysis buffer (LnB) was determined to be 4.0% (v / v).
  • the concentration of NaCl in the lysis buffer is 0.5 to 1.0 M, 0.5 to 0.9 M, 0.5 to 0.8 M, 0.5 to 0.75 M, 0.6 to 1.0 M, 0.6 to 0.9 M, 0.6 to 0.8 M, 0.6 to 0.75 M, 0.7 to It may be 1.0 M, 0.7 to 0.9 M, 0.7 to 0.8 M, 0.7 to 0.75 M, for example, may be 0.75 M. If the concentration of NaCl is 1.0 M or more, the SDS becomes insoluble and precipitates. If the concentration is less than 0.5 M, the osmotic pressure is low to effectively dissolve insect cells in the homogenized solution.
  • the lysis buffer is 0.6 to 1.3 times (v / v), 0.6 to 1.2 times (v / v), 0.6 to 1.1 times (v / v), 0.6 to 1.0 with respect to the homogenized sample homogenized by adding a homogenization solution to the sample.
  • it may be 1.0 times (v / v) mixing.
  • the lysis buffer may be mixed with the homogenized sample homogenized by adding a homogenization solution to the sample in the same amount (v / v).
  • NaCl may be added to the mixture of the homogenized sample and the dissolution buffer.
  • the added NaCl may be in an aqueous NaCl solution.
  • the NaCl aqueous solution is 1 to 10 M, 1 to 8 M, 1 to 7 M, 1 to 6 M, 2 to 10 M, 2 to 8 M, 2 to 7 M, 2 to 6 M, 3 to 10 M, 3 To 8 M, 3 to 7 M, 3 to 6 M, 4 to 10 M, 4 to 8 M, 4 to 7 M or 4 to 6 M concentration, for example, 5 M NaCl aqueous solution.
  • the NaCl aqueous solution is 0.6 to 1.3 times (v / v), 0.6 to 1.2 times (v / v), 0.6 to 1.1 times (v / v), 0.6 to 1.0 with respect to the mixture of the homogenized sample and the dissolution buffer.
  • Times (v / v), 0.7 to 1.3 times (v / v), 0.7 to 1.2 times (v / v), 0.7 to 1.1 times (v / v), 0.7 to 1.0 times (v / v), 0.8 to 1.3 Times (v / v), 0.8 to 1.2 times (v / v), 0.8 to 1.1 times (v / v), 0.8 to 1.0 times (v / v), 0.9 to 1.3 times (v / v), 0.9 to 1.2 Pear (v / v), 0.9 to 1.1 times (v / v) or 0.9 to 1.0 times (v / v) may be mixed, for example, may be mixed in the same amount (v / v).
  • the NaCl aqueous solution added to the mixture of the homogenized sample and the dissolution buffer may be mixed with the homogenized sample in the same amount (v / v).
  • 100 ul of the homogenized sample and 100 ul of a dissolution buffer may be mixed, followed by mixing 100 ul of an aqueous 5 M NaCl solution.
  • the supernatant is obtained by centrifuging the mixture of the homogenized sample and the lysis buffer.
  • the isopropanol is 0.6 to 1.3 times (v / v), 0.6 to 1.2 times (v / v), 0.6 to 1.1 times (v / v), 0.6 to 1.0 times (v / v) with respect to the supernatant obtained by centrifugation.
  • isopropanol mixed with the supernatant obtained by centrifugation may be mixed in a volume ratio of 2: 1.
  • the mixture obtained by centrifugation of the supernatant and isopropanol is contacted with silica coated magnetic beads.
  • the silica coated magnetic beads are washed by adding a primary wash buffer.
  • the first wash buffer may be one containing sodium chloride.
  • the concentration of sodium chloride is 0.1 to 5.0 M, 0.1 to 4.5 M, 0.1 to 4.0 M, 0.1 to 3.5 M, 0.5 to 5.0 M, 0.5 to 4.5 M, 0.5 to 4.0 M, 0.5 to 3.5 M, 1.0 to 5.0 M , 1.0 to 4.5 M, 1.0 to 4.0 M, 1.0 to 3.5 M, 1.5 to 5.0 M, 1.5 to 4.5 M, 1.5 to 4.0 M, 1.5 to 3.5 M, 2.0 to 5.0 M, 2.0 to 4.5 M, 2.0 to 4.0 M , 2.0 to 3.5 M, 2.5 to 5.0 M, 2.5 to 4.5 M, 2.5 to 4.0 M, 2.5 to 3.5 M, for example, may be 3.0 M.
  • the pH of the primary wash buffer may be 4.0 to 6.0, 4.5 to 6.0 or 5.0 to 6.0, for example, may be 5.5.
  • Silica coated magnetic beads washed with the primary wash buffer are further washed with a secondary wash buffer.
  • the secondary wash buffer is 60 to 90% (v / v), 65 to 90% (v / v), 70 to 90% (v / v), 75 to 90% (v / v), 60 to 85% (v / v), 65-85% (v / v), 70-85% (v / v), 75-85% (v / v) aqueous ethanol solution, for example 80% (v / v) ethanol It may be an aqueous solution.
  • Secondary washing of the silica coated magnetic beads with the second wash buffer may remove the previously used buffer components.
  • RNA is eluted from the washed silica coated magnetic beads.
  • RNA elution may be performed by contacting the elution buffer with silica coated magnetic beads.
  • the elution buffer may be water without RNA degrading enzyme, but is not limited thereto.
  • % used to denote the concentration of a particular substance is (w / w)% solids / solids, (w / v)%, and liquids / The liquid is (v / v)%.
  • the present invention relates to a composition for extracting viral RNA using a silica-coated magnetic beads and a method for extracting a viral RNA using the same, which effectively removes various contaminants from a sample, thereby enabling a more sensitive diagnosis of a virus derived from a sample, and extracting existing RNA
  • the use of inexpensive reagents compared to the use of the composition can eliminate the step of pooling the sample for cost reasons, enabling accurate monitoring of virus outbreaks, as well as increasing the scale of disease-borne virus diagnostics and various surveillance projects. It can expand and thus contribute to public health.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a viral RNA extraction method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a viral RNA extraction process according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a diagram showing the steps used in the molecular diagnostic process performed for the virus RNA extraction method for mosquito-mediated virus retention monitoring according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4a is a lysis curve created by detecting the amplified gene sequence after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4b is a result of electrophoresis of the amplified product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5a is a lysis curve created by detecting the amplified gene sequence after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5b is a result of electrophoresis of the amplified product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • Figure 6a is a lysis curve generated by detecting the amplified gene sequence after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6b is a result of electrophoresis of the amplified product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • Figure 7a is a lysis curve generated by detecting the amplified gene sequence after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extraction composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7b is a result of electrophoresis of the amplified product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • 8A is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using viral RNA RNA extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment using a one-step real-time PCR.
  • Figure 8b is the result of electrophoresis of the amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extraction composition according to an embodiment of the present invention
  • Figure 9a is a lysis curve created by detecting the amplified gene sequence after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9b is a result of electrophoresis of the amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • Figure 10a is a lysis curve created by detecting the amplified gene sequence after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10b is a result of electrophoresis of the amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • 11A is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using a one step real-time PCR as a template of viral RNA extracted using a viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11b is a result of electrophoresis of the amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template to the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • 12A is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using a one-step real-time PCR as a template of viral RNA extracted using a viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12b is a result of electrophoresis of the amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 13A is a lysis curve prepared by detecting amplified gene sequences after amplification using viral RNA extracted as a template using a one-step real-time PCR as a template.
  • Figure 13b is a result of electrophoresis of the amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • 14A is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using a one step real time PCR as a template of viral RNA extracted using a viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 14b is a result of electrophoresis of the amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extraction composition according to an embodiment of the present invention
  • 15A is a lysis curve prepared by detecting amplified gene sequences after amplification using viral RNA RNA extracted using a composition for viral RNA extraction according to an embodiment of the present invention using one-step real-time PCR.
  • Figure 15b is the result of electrophoresis of the amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • Figure 16a is a lysis curve created by detecting the amplified gene sequence after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 16b is the result of electrophoresis of the amplified product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • Figure 17a is a lysis curve created by detecting the amplified gene sequence after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 17b is a result of electrophoresis of the amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • 18A is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using a one step real time PCR as a template of viral RNA extracted using a viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • 18B is a result of electrophoresis of an amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of viral RNA extracted using a viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • 19A is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using viral RNA extracted as a template using a one-step real-time PCR as a template.
  • Figure 19b is a result of electrophoresis of the amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • 19C is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using viral RNA extracted as a template using one step real time PCR as a template.
  • 19D is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using a one step real-time PCR as a template of viral RNA extracted using a viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • 19E is a result of electrophoresis of an amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of viral RNA extracted using a viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • 20A is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using a one step real-time PCR as a template of viral RNA extracted using a viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • 20B is a result of electrophoresis of an amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of viral RNA extracted using a viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 21A is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using viral RNA extracted as a template using a one-step real-time PCR as a template.
  • Figure 21b is a result of electrophoresis of the amplification product after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 22A is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using viral RNA RNA extracted according to an embodiment of the present invention using a one-step real-time PCR as a template.
  • FIG. 22A is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using viral RNA RNA extracted according to an embodiment of the present invention using a one-step real-time PCR as a template.
  • 22B is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using viral RNA RNA extracted using a composition for extracting viral RNA according to an embodiment using a one-step real-time PCR.
  • Figure 22c is a lysis curve created by detecting the amplified gene sequence after amplification using a one-step real-time PCR as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extraction composition according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 22D is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using viral RNA RNA extracted using a composition for viral RNA extraction according to an embodiment of the present invention using one-step real-time PCR.
  • FIG. 22E is a lysis curve generated by detecting amplified gene sequences after amplification using a one-step real-time PCR as a template of viral RNA extracted using a viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 23a is amplified after amplification using a one-step qRT-PCR tagman probe kit that specifically recognizes Japanese encephalitis virus as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention This is an amplification curve created by detecting the gene sequence.
  • Figure 23b is amplified after amplification using a one-step qRT-PCR tagman probe kit that specifically recognizes Japanese encephalitis virus as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention This is an amplification curve created by detecting the gene sequence.
  • Figure 23c is amplified after amplification using a one-step qRT-PCR tagman probe kit that specifically recognizes Japanese encephalitis virus as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extraction composition according to an embodiment of the present invention This is an amplification curve created by detecting the gene sequence.
  • Figure 23d is amplified after amplification using a one-step qRT-PCR tagman probe kit that specifically recognizes Japanese encephalitis virus as a template of the viral RNA extracted using the viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention This is an amplification curve created by detecting the gene sequence.
  • FIG. 24 shows the results of electrophoresis of amplification products after RT-PCR was performed using three kinds of primers as a template of viral RNA extracted using a viral RNA extracting composition according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention relates to a composition for extracting viral RNA using the Silica coated magnetic beads and a method of extracting the viral RNA using the same.
  • the sample In extracting nucleic acids, the sample must be homogenized and dispersed throughout the virus extraction solution. In the dispersed tissue, RNA is dissolved into the buffer by the extraction solution, and at the same time, the nuclease such as ribonuclease is inactivated by the buffer component to protect the nucleic acid.
  • the nuclease such as ribonuclease
  • EDTA-NaCl (0.9% NaCl, 20 mM EDTA) was added per 100 mg of insects. Then, it was homogenized using a bead homogenizer.
  • the protein and DNA were removed by centrifuging the lysis buffer mixture at 3,500 rpm for 15 minutes at room temperature or 4 minutes at 13,000 rpm for room temperature.
  • sources of external factors are removed.
  • the pollutant of the external factor means a nontarget organism outside of the insect.
  • the mixture of centrifugal supernatant and isopropanol was mixed up and down using an adapter of a clean magnetic holder. Beads were recovered after inserting the adapter into a 96 well magnetic holder.
  • the magnetic holder transferred to the first washing plate containing the first wash buffer having the composition of Table 2 was separated and the mixed solution was mixed up and down. This process eliminated insect pigments, proteins, DNA and carbohydrates.
  • the magnetic holder was combined again, it was transferred to a secondary washing plate including the secondary washing buffer having the composition shown in Table 3, the magnetic holder was separated, and the mixed solution was mixed up and down. Through this step, the lysis buffer and the first wash buffer components used in the experiment were removed.
  • RNA was mixed again, lifted in, and beads were collected and allowed to air dry for 1 to 5 minutes while being mounted on a stand. 50-180 ul of distilled water or Tris-EDTA was mixed to allow RNA to elute, followed by third centrifugation to obtain RNA. This can be used for molecular diagnostics such as PCR.
  • Viral RNA was extracted from the mosquitoes collected for one year in 2017 through the composition and method for extracting the viral RNA of the present invention, and flaviviruses possessed by the collected mosquitoes were detected by PCR.
  • the virus-borne mosquito, Culex pipiens was attracted using BG sentinel trap and dry ice in Im-dong, Buk-gu, Gwangju.
  • Samples were prepared by adding 1 ml of EDTA-NaCl (0.9% NaCl, 20 mM EDTA) per 100 mg of collected red wool mosquitoes. Homogenize using a bead homogenizer. Centrifuged at 3500 rpm for 10 minutes and the supernatant was transferred to a new tube. 200ul of the supernatant solution was dissolved in 200ul of lysis buffer heated at 70 ° C and stirred briefly. Then, 200 ⁇ l of 5.0 M NaCl was added and waited for 1 minute, followed by centrifugation for 15 minutes at 3500 RPM and 4 ° C.
  • the beads were allowed to loosen well in the D.W, and the beads were collected again by the magnetic holder.
  • the extracted RNA was used for detection PCR by 5ul, and the remaining solution was sealed with a plate and then stored at -80'C.
  • virus RNA can be extracted and used for PCR-based molecular diagnosis more easily than the existing technology in monitoring and screening viruses distributed in the environment.
  • the present invention relates to a composition for extracting viral RNA using silica coated magnetic beads and a method for extracting viral RNA using the same.

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Abstract

본 발명은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법에 관한 것으로, 시료로부터 다양한 오염원을 효과적으로 제거하므로, 더욱 민감하게 시료 유래 바이러스의 진단을 가능하게 하며, 기존 RNA 추출용 조성물에 비하여 저렴한 시약을 사용하기 때문에 비용문제로 샘플을 풀링(pooling) 하는 단계를 생략함으로써 정밀한 바이러스 발생 감시를 가능하게 할 뿐만 아니라 질병을 매개하는 바이러스 진단 실험 및 다양한 감시 사업의 규모를 더욱 확대할 수 있고 그에 따라 공중보건에 기여할 수 있다.

Description

실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법
본 발명은 대한민국 과학기술정보통신부의 지원 하에서 과제번호 2018027102에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "저가 인체 무해성 viral RNA 추출 자동화 시스템 개발 및 산업화" , 연구과제명은 "저가 인체 무해성 viral RNA 추출 자동화 시스탬 개발 및 산업화" , 주관기관은 전남대학교 산학협력단, 연구기간은 2018.04.01 ~ 2018.07.31이다.
본 특허출원은 2018년 07월 27일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2018-0087986호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법에 관한 것이다.
기존 바이러스 RNA 추출 키트는 무세포(cell-free), 세포 배양 플루이드(cell culture fluid), 플라스마(plasma) 등 비교적 깨끗한 샘플로부터 핵산을 추출하는 것에 최적화 되어있다. 대게는 고가의 제품군에선 카오트로픽 염(Chaotropic salt)를 사용하는 경향이 있고 저가의 제품군에선 페놀, 클로로포름 등을 사용하는 경향이 있다.
카오트로픽 염 같은 경우 단백질 분자 주변의 물을 강하게 빼앗아 단백질을 변형시키며 카오트로픽 염 중 하나인 구아니딘 티오시안산염(guanidine thiocyanate)의 경우 단백질을 시안화하여 영구히 변형을 시키는데 이 원리를 기반으로 RNA를 분해하는 강력한 효소인 리보뉴클레아제(Rnase)를 완전히 불활성화 시킴으로써 RNA를 온전히 뽑을 수 있도록 돕는다.
페놀 기반 제품의 경우 페놀의 단백질 용해능을 이용하여 샘플로부터 RNA와 단백질을 분리하고, 클로로포름을 이용하여 RNA층과 단백질층을 나눠 순도 높은 RNA를 추출할 수 있도록 돕는다.
두 제품군 모두 인체유래 또는 동물유래 샘플에 사용하기에 적합하나 주변환경에 존재하는 바이러스를 검출하고 신종바이러스의 발생을 미리 예측하는 과업인 벡터 감시(vector surveillance) 분야의 경우 바이러스 샘플이 다양한 생물(곰팡이, 식물, 선충, 세균 등)에 의해 오염되어있고 굉장히 많은 양의 샘플로부터 바이러스를 검출해야 한다는 특징이 있다.
이러한 상황에서 카오트로픽 염 기반의 제품은 너무 고가이며 너무 강력한 lysis 활성을 가지고 있으므로 고가임에도 불구하고 오히려 바이러스 진단율이 떨어지고 인체질병을 진단하도록 고안된 방법이기 때문에 처리 과정이 복잡하다는 한계가 있다.
저가의 페놀 기반 제품의 경우 다시 상 분리 타입(phase separation type)과 고체상 추출 타입(solid phase extraction type)으로 나눠지는데, 이 또한 카오트로픽 염 기반 제품과 마찬가지로 강력한 케미칼(chemical)을 사용하기 때문에 민감도가 떨어짐과 동시에 사용 중 유독한 페놀 등이 대기 중으로 방출되므로 제품을 사용하는 실험자가 이를 흡입하므로 굉장히 많은 샘플을 처리하는 벡터 감시(vector surveillance)에서 실험자의 신체를 영구적으로 손상시킬 위험성이 있다.
언급한 두 가지 형태의 주요제품 모두 가장 큰 문제점은 바로 동물샘플에서만 효과적으로 바이러스 RNA를 추출할 수 있다는 점이다. 바이러스는 동물뿐만 아니라 식물에서도 큰 문제를 일으키고 있는데, 카오트로픽 염 기반 제품의 경우 식물 바이러스 RNA 추출 전용키트를 따로 판매하고 있다. 이는 식물이 포함하고 있는 다양한 다당류(polysaccharide), 글루코즈(glucose), 엽록소(chlorophyll) 등을 제거하는 단계와 세척 버퍼(wash buffer)가 추가적으로 포함되기 때문이다.
페놀 기반의 제품 중 일반적으로 상 분리 타입의 경우에는 분자진단에 사용할 수 있는 품질의 RNA를 거의 추출하지 못한다. 최종적으로 처리된 RNA에 다당류, 폴리페놀 등이 풍부하게 포함되어 PCR을 강력하게 저해하기 때문이다.
또한, 바이러스 감시에 사용되는 핵산추출키트는 인체질병진단을 목표로 개발되어 가격대가 높아, 따라서 샘플 처리량이 많을수록 큰 지출이 요구된다.
트리졸을 이용한 액체상 상분리 RNA 추출 기법은 단백질이 페놀에 용해된다는 점과 페놀이 클로로포름에 용해된다는 점, DNA가 RNA에 비하여 산성 조건에서 쉽게 분리가 된다는 점에 착안하여, 원심분리를 통해 단백질층(페놀층>1.49 g/cm3), DNA층(1.03>중간층>1.49 g/cm3), RNA층(1 g>수층>1.03 g/cm3)으로 나누고, 상층액을 이소프로판올로 침전시켜 순수한 RNA를 추출할 수 있도록 한다. 가격이 저렴하기 때문에 샘플의 양이 많거나 숫자가 많을 때 이를 처리하기 위한 목적으로 사용된다. 그러나 숙련된 실험 테크닉이 필요하고 페놀, 클로로포름 같은 휘발성 독성물질을 사용하기 때문에 적절한 유해물질 노출 방지 설비가 구축되어 있지 않은 경우 실험자의 건강에 위해를 끼칠 수 있게 된다.
숙련자 기준 샘플 준비 단계부터 핵산추출 단계까지 3시간 이상 소요되며, 핵산 품질 및 신뢰도는 핵산추출시간에 종속인 관계로, 숙련자와 비숙련자간의 핵산추출시간의 차이는 핵산의 품질 및 신뢰도를 낮춰 나쁜 실험 결과를 도출하는 문제가 있다.
환경모니터링은 다양한 오염인자가 포함된 샘플을 처리해야 하나, 현재 상용화된 바이러스 핵산추출키트는 플라즈마(plasma), 소변(urine), 혈청(serum) 같은 무세포(cell-free) 시료를 목적으로 설계되어, 추출된 핵산으로부터 진단을 수행할 때 위양성 결과 도출 비율이 높은 문제점이 있으며, 인체질병매개 모기, 진드기와 식물바이러스 매개체로부터 바이러스 RNA 분리용 저가 및 고효율 분리 키트 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 기존 스핀-컬럼 방식은 컬럼이라는 매체의 기본가격 때문에 비용을 낮추기가 쉽지 않았다. 최근 국내 및 중국에서 개발되어 대량생산 중인 실리카 코팅 자성 나노 입자(silica coated magnetic bead)는 컬럼에 비하여 가격이 100배 이상 저렴하다. 추가적으로 나성 나노 입자에 적합한 조성의 저가, 고효율 버퍼 시스템을 개발하여 비용 문제를 해결하였다.
또한, 비용문제로 인해 다양한 기관, 연구소, 대학, 국가에선 트리졸(Trizol)을 사용하거나 페놀 기반 RNA추출 버퍼 시스템을 사용하고 있다. 또한, 상용제품 중에 리보뉴클레아제를 불활성화 시키기 위해 베타-머캅토페놀(beta-mercaptoethanol)을 사용하는데 이러한 물질은 인체에 매우 유독하다. 따라서 사용자에게 반드시 악영향을 끼치게 되는 문제점이 있어, 본 발명에서는 인체에 무해한 화합물만 사용하여 사용자의 건강을 보호할 수 있게 고안하였다.
이에, 본 발명의 목적은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 저가이며 사용자에게 무해하고 실험단계가 기존 상용제품에 비하여 간단하고, 특히, 샘플을 균질화한 이후 불용성 오염물질을 제거하는 단계가 쉽고 제거조건이 마일드하다.
또한, 기존 스핀 컬럼(spin column)을 이용한 RNA 추출 방법과 달리 본 발명의 방법은 자성 나노 입자에도 적용할 수 있으므로, 추출자동화 시스템의 적용이 가능하며 대량의 샘플을 처리할 때 더욱 효과적으로 처리할 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 바이러스 RNA 추출용 조성물에 관한 것이다:
(a) 균질화 용액 총량에 대하여 1 내지 30 mM의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 0.1 내지 2.0 %(v/v)의 NaCl(sodium chloride)을 포함하는 균질화 용액;
(b) 용해 버퍼 총량에 대하여 0.1 내지 1.5 M 농도의 NaCl 및 0.1 내지 10.0 %(v/v)의 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 포함하는 용해 버퍼;
(c) 1차 세척 버퍼 총량에 대하여 0.1 내지 5.0 M 농도의 소듐 클로라이드(sodium chloride)을 포함하는 1차 세척 버퍼; 및
(d) 1차 세척 버퍼 총량에 대하여 50 내지 80 %(v/v) 농도의 에탄올 수용액을 포함하는 2차 세척 버퍼.
상기 바이러스 RNA 추출용 조성물을 통해 추출한 바이러스 RNA를 이용하여 시료의 바이러스 보유 여부를 진단할 수 있다.
기존의 바이러스 RNA 추출 키트들은 가격대가 높은 시약인 구아니딘 티오시안산염, 소듐 아이오다이드, 구아니딘 염산염 등을 이용하고 있다. 따라서, 개체수가 많은 곤충에 대하여 기존의 바이러스 RNA 추출 키트를 이용하여 RNA를 추출하고, 바이러스 보유 여부를 진단하는 실험을 수행하는 경우, 경제적인 부담이 크며, 키트에 포함된 구아니딘 염과 같은 강한 카오트로픽 염 또는 트리졸에 포함된 페놀, 클로로포름과 같은 실험 재료는 인체에 유해하기 때문에 장기간 노출 시 실험자의 건강에 위해를 끼친다.
또한, 기존의 바이러스 RNA 추출 키트와 추출 방법들은 인체 유래 시료 또는 세포 배양액에서 바이러스를 추출하는 것을 기준으로 하기 때문에, 초기 샘플 자체에 오염 물질이 많이 존재하지 않는다. 그러나 곤충 개체의 경우에는 야외에서 채집되는 경우가 많기 때문에 다양한 오염원(예를 들어, 곰팡이, 세균, 꽃가루 등)이 존재하게 된다.
기존의 바이러스 RNA 추출 키트의 경우, 강력한 카오트로픽 염을 이용하기 때문에 곤충의 RNA와 바이러스 유래 RNA　뿐만 아니라, 오염원인 곰팡이, 세균, 식물성 물질(예를 들어, 꽃가루 등)의 RNA를 모두 추출하게 되며, PCR 인히비터(inhibitor)를 제거하는 단계가 없다.
이러한 다양한 오염원으로부터 유래된 RNA와 PCR 인히비터는 결과적으로 진단 실험에서 실시하는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 과정에서 억제제로 작용하여 바이러스 보유 진단의 민감도를 낮추게 된다.
본 발명은 카오트로픽 염을 이용하여 시료로부터 바이러스 RNA를 추출할 때 발생하는 문제점을 해결하기 위한 것으로, 곰팡이, 꽃가루 등과 같은 오염원의 용해도는 낮고, 바이러스 용해도는 높은 용해 버퍼를 이용하여 RNA를 추출하여 상기 문제점을 해결하였다.
또한, 원심분리를 통해 오염원(예를 들어, small RNA, 단백질, DNA, 탄수화물 등)을 최대한 제거하여, 시료의 바이러스 보유 여부 진단 시 진단 실험의 민감도를 높였으며, 기존 바이러스 RNA 추출 키트와 비교하여 가격이 저렴한 화학물질을 사용함으로써 RNA 추출 비용을 현저히 낮추었다.
또한, PCR 인히비터를 원심분리를 통한 층분리를 통해 RNA를 정제하고 회수하는 Trizol법의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 층분리를 위한 클로로포름(chloroform), 페놀(phenol)을 사용하지 않아 유해성을 회피하였으며, 기존 트리졸(Trizol)법에서 필요한 15분 이상의 냉장고속원심 분리를 필요로 하지 않으므로, 본 기술을 사용하여 바이러스 RNA추출 시 사용자의 위해도를 줄일 수 있으며 추출 시간 또한 단축된다.
현재 질병을 매개하는 바이러스 진단 실험 및 다양한 감시 사업이 경제적인 이유로 제한되어 있다. 그 중 모기로부터 RNA를 추출하는 과정이 가장 비용이 많이 든다. 이 과정을 본 발명을 통해 더욱 저렴하게 수행할 수 있다면 감시 사업의 규모를 더욱 확대할 수 있고, 그에 따라 공중보건에 기여하는 역할을 할 수 있을 것이라 예상된다.
본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 시료로부터 바이러스 RNA를 추출하는 것일 수 있다.
상기 시료는 액체인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 액체는 바닷물, 수돗물, 생수 또는 양식장 물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 시료는 동물로부터 수득한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 동물은 절지동물인 것을 수 있으며, 예를 들어, 곤충류, 거미류 또는 다지류인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 곤충류는 벌, 모기, 파리, 나비, 나방, 개미, 잠자리, 바퀴벌레, 사마귀, 대벌레, 메뚜기, 매미 또는 딱정벌레일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 거미류는 거미, 전갈 또는 진드기인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 다지류는 지네, 노래미 또는 그리마인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 시료가 동물인 경우, 상기 시료는 동물의 개체, 조직(tissue), 기관(organ) 또는 세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 동물은 야외에서 채집한 것일 수 있으며, 예를 들어, 야외에서 채집한 곤충류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 균질화 용액을 포함할 수 있다.
상기 용어 "균질화"는 시료를 파쇄하여 균질한 용액으로 만드는 것으로, 예를 들어, 바이러스 RNA를 추출하기 위해 채집한 시료를 균질화 용액에 혼합하고 균질기를 이용하여 파쇄하여 균질화하는 것을 의미한다.
상기 균질화 용액은 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 NaCl(sodium chloride)을 포함할 수 있다.
상기 균질화 용액에서 EDTA는 1 내지 30 mM, 1 내지 28 mM, 1 내지 25 mM, 1 내지 22 mM, 3 내지 30 mM, 3 내지 28 mM, 3 내지 25 mM, 3 내지 22 mM, 5 내지 30 mM, 5 내지 28 mM, 5 내지 25 mM, 5 내지 22 mM, 8 내지 30 mM, 8 내지 28 mM, 8 내지 25 mM, 8 내지 22 mM, 10 내지 30 mM, 10 내지 28 mM, 10 내지 25 mM, 10 내지 22 mM, 12 내지 30 mM, 12 내지 28 mM, 12 내지 25 mM, 12 내지 22 mM, 15 내지 30 mM, 15 내지 28 mM, 15 내지 25 mM, 15 내지 22 mM, 18 내지 30 mM, 18 내지 28 mM, 18 내지 25 mM, 18 내지 22 mM 또는 19 내지 21 mM 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 20 mM 농도로 포함될 수 있다.
상기 NaCl은 균질화 용액에 0.1 내지 2.0 %(w/v), 0.1 내지 1.8%(w/v), 0.1 내지 1.5%(w/v), 0.1 내지 1.2%(w/v), 0.1 내지 1%(w/v), 0.3 내지 2%(w/v), 0.1 내지 1.8%(w/v), 0.3 내지 1.5%(w/v), 0.3 내지 1.2%(w/v), 0.3 내지 1%(w/v), 0.5 내지 2%(w/v), 0.5 내지 1.8%(w/v), 0.5 내지 1.5%(w/v), 0.5 내지 1.2%(w/v), 0.5 내지 1%(w/v), 0.8 내지 2%(w/v), 0.8 내지 1.8%(w/v), 0.8 내지 1.5%(w/v), 0.8 내지 1.2%(w/v), 0.8 내지 1%(w/v) 또는 0.8 내지 0.9%(w/v) 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 0.9%(w/v) 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 용해 버퍼를 포함할 수 있다.
상기 용해 버퍼는 SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 NaCl(sodium chloride)를 포함할 수 있다.
상기 용해 버퍼에서 SDS는 0.1 내지 10.0%(v/v), 0.1 내지 9.0%(v/v), 0.1 내지 8.0%(v/v), 0.1 내지 7.0%(v/v), 0.5 내지 10.0%(v/v), 0.5 내지 9.0%(v/v), 0.5 내지 8.0%(v/v), 0.5 내지 7.0%(v/v), 1.0 내지 10.0%(v/v), 1.0 내지 9.0%(v/v), 1.0 내지 8.0%(v/v), 1.0 내지 7.0%(v/v), 2.0 내지 10.0%(v/v), 2.0 내지 9.0%(v/v), 2.0 내지 8.0%(v/v), 2.0 내지 7.0%(v/v), 3.0 내지 10.0%(v/v), 3.0 내지 9.0%(v/v), 3.0 내지 8.0%(v/v), 3.0 내지 7.0%(v/v), 4.0 내지 10.0%(v/v), 4.0 내지 9.0%(v/v), 4.0 내지 8.0%(v/v), 4.0 내지 7.0%(v/v), 5.0 내지 10.0%(v/v), 5.0 내지 9.0%(v/v), 5.0 내지 8.0%(v/v) 또는 5.0 내지 7.0%(v/v) 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 6.0%(v/v) 농도로 포함될 수 있다.
종래 연구에 따르면 등에 따르면 작업용액(working solution)에서 SDS 농도가 최종적으로 2.0 %(v/v) 정도면 시료로부터 RNA를 추출하는데 충분한 것으로 알려져 있다(Appl Environ Microbiol. 2011 Jun; 77(12): 3975-3981). 실험을 통해 SDS를 1.0%(v/v), 1.5%(v/v) 농도로 사용하였을 때도 문제없이 RNA가 추출되는 것으로 확인되었으나 아래와 같은 문제가 발생하였다.
DNA와 단백질 등을 제거하는 SDS 및 NaCl을 이용한 침전반응 시 SDS 농도가 낮으면 침전된 펠릿의 크기가 작아 상층액을 분리하기 어려웠으며 이보다 농도가 높을 경우 거품이 많이 생기고 실험 직전에 녹이는 과정이 어려워 실험을 수행하기에 용이하지 않았을 뿐만 아니라 비드에 결합하는 RNA의 수율이 낮아지는 문제가 발생하여 최종적으로 용해 버퍼(LnB)에서 SDS 농도를 4.0%(v/v)로 결정하였다.
추가적으로 RNA를 분해하는 효소인 RNAase를 제거하는 RNAse ZAP의 경우, 주성분인 SDS의 농도가 1.0 내지 5.0 %(v/v) 정도인 것으로 추정되는데, 이를 기초로 판단하였을 때 SDS의 최종농도가 1.0%(v/v) 이상이어야 RNAse를 효과적으로 불활성화 시킬 수 있을 것으로 판단하였고, 사용상의 간편함과 RNA의 보호라는 측면에서 최종적으로 RNA를 포함하는 용액을 실리카 코팅 자성 비드와 접촉시킬 때 SDS의 농도가 약 1.0%(v/v) 이상이 되도록 용해 버퍼(LnB)의 SDS 농도를 4.0%(v/v)로 결정하였다.
상기 용해 버퍼에서 NaCl은 0.5 내지 1.0 M, 0.5 내지 0.9 M, 0.5 내지 0.8 M, 0.5 내지 0.75 M, 0.6 내지 1.0 M, 0.6 내지 0.9 M, 0.6 내지 0.8 M, 0.6 내지 0.75 M, 0.7 내지 1.0 M, 0.7 내지 0.9 M, 0.7 내지 0.8 M, 0.7 내지 0.75 M 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 0.75 M 농도로 포함될 수 있다.
상기 용해 버퍼에서 NaCl이 1.0 M 이상 포함되는 경우, SDS가 불용성(insoluble) 형태가 되어 석출되며, 0.5 M 미만 포함되는 경우 삼투압이 낮아 균질화된 용액 내 곤충 세포를 효과적으로 용해시킬 수 없다.
상기 용해 버퍼는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 균질화된 시료에 대하여 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v) 또는 0.9 내지 1.0배(v/v) 혼합하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1.0배(v/v) 혼합하는 것일 수 있다.
핵산을 실리카 코팅 자성입자에 바인딩하기 위해 사용하는 이소프로판올과 혼합액의 최종 희석비율이 1:2(v/v)가 되도록 하기 때문에(일반적으로 멤브레인 컬럼 방식의 경우 DNA 또는 RNA 침전 시 최종 50%(v/v) 농도로 수행한다) 원심분리 상층액, 용해 버퍼 및 5 M NaCl 수용액의 총 혼합액이 100 ul 일 때, 이소프로판올은 100 ul를 사용하여, 용해 버퍼는 균질화된 시료에 대하여 1.0배(v/v) 혼합하는 것으로 결정하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 용해 버퍼는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 균질화된 시료와 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 NaCl을 첨가할 수 있다.
상기 첨가되는 NaCl은 NaCl 수용액 상태인 것일 수 있다.
상기 NaCl 수용액은 1 내지 10 M, 1 내지 8 M, 1 내지 7 M, 1 내지 6 M, 2 내지 10 M, 2 내지 8 M, 2 내지 7 M, 2 내지 6 M, 3 내지 10 M, 3 내지 8 M, 3 내지 7 M, 3 내지 6 M, 4 내지 10 M, 4 내지 8 M, 4 내지 7 M 또는 4 내지 6 M 농도 일 수 있으며, 예를 들어, 5 M NaCl 수용액일 수 있다.
상기 NaCl 수용액은 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 대하여, 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v) 또는 0.9 내지 1.0배(v/v) 혼합되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.
상기 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 첨가되는 NaCl 수용액은 균질화된 시료와 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 균질화된 시료 100 ul에 용해 버퍼 100 ul를 혼합한 다음, 5 M NaCl 수용액 100 ul를 혼합할 수 있다.
균질화된 시료 100 ul에 용해 버퍼 100 ul를 혼합한 다음, 5 M NaCl 수용액을 50 ul 첨가한 경우, SDS가 분리되지 않아서 이후 세척 단계에서 거품이 일어나는 것이 관찰되었다. 거품이 일어날 경우 잘 세척되지 않아 실리카 코팅 자성 비드에 결합된 오염물이 세척단계에서 분리되지 않을 수 있다. 5 M NaCl 수용액은 200 ul까지 첨가할 수 있는데 200 ul 이상 첨가할 경우, 이소프로판올을 혼합하는 다음 과정에서 NaCl이 석출될 수 있다.
상기 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물을 원심분리하여 얻은 상층액에 이소프로판올을 혼합할 수 있다.
상기 이소프로판올은 원심분리하여 얻은 상층액에 대하여 0.1 내지 1.3배(v/v), 0.1 내지 1.2배(v/v), 0.1 내지 1.1배(v/v), 0.1 내지 1.0배(v/v), 0.1 내지 0.9배(v/v), 0.1 내지 0.8배(v/v), 0.1 내지 0.7배(v/v), 0.1 내지 0.6배(v/v), 0.2 내지 1.3배(v/v), 0.2 내지 1.2배(v/v), 0.2 내지 1.1배(v/v), 0.2 내지 1.0배(v/v), 0.2 내지 0.9배(v/v), 0.2 내지 0.8배(v/v), 0.2 내지 0.7배(v/v), 0.2 내지 0.6배(v/v), 0.3 내지 1.3배(v/v), 0.3 내지 1.2배(v/v), 0.3 내지 1.1배(v/v), 0.3 내지 1.0배(v/v), 0.3 내지 0.9배(v/v), 0.3 내지 0.8배(v/v), 0.3 내지 0.7배(v/v), 0.3 내지 0.6배(v/v), 0.4 내지 1.3배(v/v), 0.4 내지 1.2배(v/v), 0.4 내지 1.1배(v/v), 0.4 내지 1.0배(v/v), 0.4 내지 0.9배(v/v), 0.4 내지 0.8배(v/v), 0.4 내지 0.7배(v/v), 0.4 내지 0.6배(v/v), 혼합되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.5배(v/v) 혼합되는 것일 수 있다.
일반적으로 RNA를 수용액에서 분리할 때 이소프로판올을 사용한다(www.thermofisher.com/kr/ko/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html). 에탄올을 사용할 경우에는 RNA가 녹아있는 희석액의 2.5배를 사용해야 하나 이소프로판올은 RNA가 녹아있는 희석액의 동량만 섞으면 된다고 알려져 있다. 그러나 실리카 코팅 자성입자를 이용한 바이러스 핵산추출 시 따라서, 원심분리 후 얻은 상층액 1 볼륨(volume)에 0.5 볼륨의 이소프로판올을 넣고 혼합하였을 경우 PCR 진단율이 가장 높았다.
상기 원심분리하여 얻은 상층액에 이소프로판올을 혼합한 혼합물을 실리카 코팅 자성 비드와 접촉시켜 혼합물 내에 포함된 바이러스 RNA를 바인딩시킬 수 있다.
본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 소듐 클로라이드(sodium chloride)를 포함하는 1차 세척 버퍼를 포함할 수 있다.
상기 1차 세척 버퍼는 소듐 클로라이드를 0.1 내지 5.0 M, 0.1 내지 4.5 M, 0.1 내지 4.0 M, 0.1 내지 3.5 M, 0.5 내지 5.0 M, 0.5 내지 4.5 M, 0.5 내지 4.0 M, 0.5 내지 3.5 M, 1.0 내지 5.0 M, 1.0 내지 4.5 M, 1.0 내지 4.0 M, 1.0 내지 3.5 M, 1.5 내지 5.0 M, 1.5 내지 4.5 M, 1.5 내지 4.0 M, 1.5 내지 3.5 M, 2.0 내지 5.0 M, 2.0 내지 4.5 M, 2.0 내지 4.0 M, 2.0 내지 3.5 M, 2.5 내지 5.0 M, 2.5 내지 4.5 M, 2.5 내지 4.0 M, 2.5 내지 3.5 M 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 3.0 M 농도로 포함하는 것일 수 있다.
상기 1차 세척 버퍼의 pH는 4.0 내지 6.0, 4.5 내지 6.0 또는 5.0 내지 6.0 일 수 있으며, 예를 들어, 5.5 일 수 있다.
본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 에탄올 수용액을 포함하는 2차 세척 버퍼를 포함할 수 있다.
상기 2차 세척 버퍼는 60 내지 90 %(v/v), 65 내지 90 %(v/v), 70 내지 90 %(v/v), 75 내지 90 %(v/v), 60 내지 85%(v/v), 65 내지 85 %(v/v), 70 내지 85 %(v/v), 75 내지 85 %(v/v) 에탄올 수용액, 예를 들어, 80 %(v/v) 에탄올 수용액일 수 있다.
상기 2차 세척 버퍼로 실리카 코팅 자성 비드를 세척하여 앞서 사용한 버퍼 성분을 제거할 수 있다.
상기 세척한 실리카 코팅 자성 비드에 용출 버퍼를 접촉하여 RNA를 용출시킬 수 있다.
상기 용출 버퍼는 RNA 분해효소가 없는 물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물은 다음 단계를 통해 실시하여 바이러스 RNA를 추출할 수 있다:
시료를 균질화하는 균질화 단계;
균질화된 시료에 용해 버퍼를 혼합하는 제1 혼합 단계;
용해 버퍼 혼합물을 원심분리하는 원심분리 단계;
원심분리 상층액에 이소프로판올(isopropanol)을 혼합하는 제2 혼합 단계;
제2 혼합물과 실리카 코팅 자성 비드를 혼합하는 비드 혼합 단계;
실리카 코팅 자성 비드를 세척 버퍼로 세척하는 세척단계; 및
RNA를 용출시키는 용출 단계.
(a) 시료의 균질화
시료로부터 바이러스의 RNA를 추출하기 위해 먼저 시료를 균질화한다.
상기 시료는 동물 또는 액체일 수 있다.
상기 동물은 절지동물인 것을 수 있으며, 예를 들어, 곤충류, 거미류 또는 다지류인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 액체는 바닷물, 수돗물, 생수 또는 양식장 물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 곤충류는 벌, 모기, 파리, 나비, 나방, 개미, 잠자리, 바퀴벌레, 사마귀, 대벌레, 메뚜기, 매미 또는 딱정벌레일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 거미류는 거미, 전갈 또는 진드기인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 다지류는 지네, 노래미 또는 그리마인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 시료가 동물인 경우, 상기 시료는 동물의 개체, 조직(tissue), 기관(organ) 또는 세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 동물은 야외에서 채집한 것일 수 있으며, 예를 들어, 야외에서 채집한 곤충류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 균질화는 시료를 파쇄하여 균질한 용액 상태로 만드는 것으로, 예를 들어, 바이러스 RNA를 추출하기 위해 채집한 시료를 균질화 용액에 혼합하고 균질기를 이용하여 파쇄하여 균질화할 수 있다.
상기 균질화는 균질화 용액 총량에 대하여 1 내지 30 mM 농도의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 균질화 용액 총량에 대하여 0.1 내지 2.0 %(v/v) 농도의 NaCl을 포함하는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 실시할 수 있다.
상기 EDTA는 균질화 용액에 1 내지 30 mM, 1 내지 28 mM, 1 내지 25 mM, 1 내지 22 mM, 3 내지 30 mM, 3 내지 28 mM, 3 내지 25 mM, 3 내지 22 mM, 5 내지 30 mM, 5 내지 28 mM, 5 내지 25 mM, 5 내지 22 mM, 8 내지 30 mM, 8 내지 28 mM, 8 내지 25 mM, 8 내지 22 mM, 10 내지 30 mM, 10 내지 28 mM, 10 내지 25 mM, 10 내지 22 mM, 12 내지 30 mM, 12 내지 28 mM, 12 내지 25 mM, 12 내지 22 mM, 15 내지 30 mM, 15 내지 28 mM, 15 내지 25 mM, 15 내지 22 mM, 18 내지 30 mM, 18 내지 28 mM, 18 내지 25 mM, 18 내지 22 mM 또는 19 내지 21 mM 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 20 mM 농도로 포함될 수 있다.
상기 NaCl은 균질화 용액에 0.1 내지 2.0%(v/v), 0.1 내지 1.8%(v/v), 0.1 내지 1.5%(v/v), 0.1 내지 1.2%(v/v), 0.1 내지 1.0%(v/v), 0.3 내지 2%(v/v), 0.1 내지 1.8%(v/v), 0.3 내지 1.5%(v/v), 0.3 내지 1.2%(v/v), 0.3 내지 1.0%(v/v), 0.5 내지 2.0%(v/v), 0.5 내지 1.8%(v/v), 0.5 내지 1.5%(v/v), 0.5 내지 1.2%(v/v), 0.5 내지 1.0%(v/v), 0.8 내지 2.0%(v/v), 0.8 내지 1.8%(v/v), 0.8 내지 1.5%(v/v), 0.8 내지 1.2%(v/v), 0.8 내지 1.0%(v/v) 또는 0.8 내지 0.9%(v/v) 농도로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 0.9%(v/v) 농도로 포함될 수 있다.
(b) 원심분리 상층액에 용해 버퍼를 혼합
원심분리하여 얻은 상층액에 용해 버퍼를 혼합한다.
상기 용해 버퍼는 SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 NaCl(sodium chloride)를 포함할 수 있다.
상기 용해 버퍼의 SDS 농도는 0.1 내지 10.0%(v/v), 0.1 내지 9.0%(v/v), 0.1 내지 8.0%(v/v), 0.1 내지 7.0%(v/v), 0.5 내지 10.0%(v/v), 0.5 내지 9.0%(v/v), 0.5 내지 8.0%(v/v), 0.5 내지 7.0%(v/v), 1.0 내지 10.0%(v/v), 1.0 내지 9.0%(v/v), 1.0 내지 8.0%(v/v), 1.0 내지 7.0%(v/v), 2.0 내지 10.0%(v/v), 2.0 내지 9.0%(v/v), 2.0 내지 8.0%(v/v), 2.0 내지 7.0%(v/v), 3.0 내지 10.0%(v/v), 3.0 내지 9.0%(v/v), 3.0 내지 8.0%(v/v), 3.0 내지 7.0%(v/v), 4.0 내지 10.0%(v/v), 4.0 내지 9.0%(v/v), 4.0 내지 8.0%(v/v), 4.0 내지 7.0%(v/v), 5.0 내지 10.0%(v/v), 5.0 내지 9.0%(v/v), 5.0 내지 8.0%(v/v) 또는 5.0 내지 7.0%(v/v)인 것일 수 있으며, 예를 들어, 6.0%(v/v)인 것일 수 있다.
종래 연구에 따르면 등에 따르면 작업용액(working solution)에서 SDS 농도가 최종적으로 2.0%(v/v) 정도면 시료로부터 RNA를 추출하는데 충분한 것으로 알려져 있다(Appl Environ Microbiol. 2011 Jun; 77(12): 3975-3981). 실험을 통해 SDS를 1.0%(v/v), 1.5%(v/v) 농도로 사용하였을 때도 문제없이 RNA가 추출되는 것으로 확인되었으나 아래와 같은 문제가 발생하였다.
DNA와 단백질 등을 제거하는 SDS 및 NaCl을 이용한 침전반응 시 SDS 농도가 낮으면 침전된 펠릿의 크기가 작아 상층액을 분리하기 어려웠으며 이보다 농도가 높을 경우 거품이 많이 생기고 실험 직전에 녹이는 과정이 어려워 실험을 수행하기에 용이하지 않았을 뿐만 아니라 비드에 결합하는 RNA의 수율이 낮아지는 문제가 발생하여 최종적으로 용해 버퍼(LnB)에서 SDS 농도를 4.0%(v/v)로 결정하였다.
추가적으로 RNA를 분해하는 효소인 RNAase를 제거하는 RNAse ZAP의 경우, 주성분인 SDS의 농도가 1.0 내지 5.0%(v/v) 정도인 것으로 추정되는데, 이를 기초로 판단하였을 때 SDS의 최종농도가 1.0%(v/v) 이상이어야 RNAse를 효과적으로 불활성화 시킬 수 있을 것으로 판단하였고, 최종적으로 RNA를 포함하는 용액을 실리카 코팅 자성 비드와 접촉시킬 때 SDS의 농도가 약 1.0%(v/v)이상이 되도록 용해 버퍼(LnB)의 SDS 농도를 4.0%(v/v)로 결정하였다.
상기 용해 버퍼의 NaCl의 농도는 0.5 내지 1.0 M, 0.5 내지 0.9 M, 0.5 내지 0.8 M, 0.5 내지 0.75 M, 0.6 내지 1.0 M, 0.6 내지 0.9 M, 0.6 내지 0.8 M, 0.6 내지 0.75 M, 0.7 내지 1.0 M, 0.7 내지 0.9 M, 0.7 내지 0.8 M, 0.7 내지 0.75 M인 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.75 M인 것일 수 있다. NaCl의 농도가 1.0 M 이상인 경우에는 SDS가 불용성(insoluble) 형태가 되어 석출되며, 0.5 M 미만인 경우에는 삼투압이 낮아 균질화된 용액 내 곤충 세포를 효과적으로 용해시킬 수 없다.
상기 용해 버퍼는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 균질화 시킨 균질화 시료에 대하여 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v), 0.9 내지 1.0배(v/v), 1.7 내지 1.9배(v/v) 또는 2.0 내지 2.5배(v/v) 혼합하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1.0배(v/v) 혼합하는 것일 수 있다.
핵산을 바인딩하기 위해 사용하는 이소프로판올과 혼합액의 최종 희석비율이 1:2(v/v)가 되도록 하기 때문에(일반적으로 DNA 또는 RNA 침전 시 최종 50%(v/v) 농도로 수행한다) 원심분리 상층액, 용해 버퍼 및 5 M NaCl 수용액의 총 혼합액이 100 ul 일 때, 이소프로판올은 50 ul를 사용한다. 따라서 용해 버퍼는 균질화된 시료에 대하여 2.0배(v/v) 혼합하는 것으로 결정하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 용해 버퍼는 균질화 용액을 시료에 첨가하여 균질화 시킨 균질화된 시료와 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 NaCl을 첨가할 수 있다.
상기 첨가되는 NaCl은 NaCl 수용액 상태인 것일 수 있다.
상기 NaCl 수용액은 1 내지 10 M, 1 내지 8 M, 1 내지 7 M, 1 내지 6 M, 2 내지 10 M, 2 내지 8 M, 2 내지 7 M, 2 내지 6 M, 3 내지 10 M, 3 내지 8 M, 3 내지 7 M, 3 내지 6 M, 4 내지 10 M, 4 내지 8 M, 4 내지 7 M 또는 4 내지 6 M 농도 일 수 있으며, 예를 들어, 5 M NaCl 수용액일 수 있다.
상기 NaCl 수용액은 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 대하여, 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v) 또는 0.9 내지 1.0배(v/v) 혼합되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.
균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물에 첨가되는 NaCl 수용액은 균질화된 시료와 동량(v/v)으로 혼합되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 균질화된 시료 100 ul와 용해 버퍼 100 ul를 혼합한 다음, 5 M NaCl 수용액 100 ul를 혼합할 수 있다.
(d) 원심분리
상기 균질화된 시료와 용해 버퍼를 혼합한 혼합물을 원심분리하여 상층액으수득한다.
(e) 원심분리 상층액에 이소프로판올을 혼합
원심분리하여 얻은 상층액을 새 튜브로 옮긴 뒤 이소프로판올을 혼합한다.
상기 이소프로판올은 원심분리하여 얻은 상층액에 대하여 0.6 내지 1.3배(v/v), 0.6 내지 1.2배(v/v), 0.6 내지 1.1배(v/v), 0.6 내지 1.0배(v/v), 0.7 내지 1.3배(v/v), 0.7 내지 1.2배(v/v), 0.7 내지 1.1배(v/v), 0.7 내지 1.0배(v/v), 0.8 내지 1.3배(v/v), 0.8 내지 1.2배(v/v), 0.8 내지 1.1배(v/v), 0.8 내지 1.0배(v/v), 0.9 내지 1.3배(v/v), 0.9 내지 1.2배(v/v), 0.9 내지 1.1배(v/v), 1.1 내지 2.0배(v/v) 또는 2.1 내지 2.5배(v/v) 혼합되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 2.0배(v/v)로 혼합되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 원심분리하여 얻은 상층액과 혼합되는 이소프로판올은 2:1의 부피비로 혼합되는 것일 수 있다.
(f) 이소프로판올 혼합물을 실리카 코팅 자성 비드와 접촉
원심분리하여 얻은 상층액과 이소프로판올을 혼합한 혼합물을 실리카 코팅 자성 비드와 접촉시킨다.
(g) 실리카 코팅 자성 비드세척
실리카 코팅 자성 비드에 1차 세척 버퍼를 첨가하여 세척한다.
상기 1차 세척 버퍼는 소듐 클로라이드(sodium chloride)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 소듐 클로라이드의 농도는 0.1 내지 5.0 M, 0.1 내지 4.5 M, 0.1 내지 4.0 M, 0.1 내지 3.5 M, 0.5 내지 5.0 M, 0.5 내지 4.5 M, 0.5 내지 4.0 M, 0.5 내지 3.5 M, 1.0 내지 5.0 M, 1.0 내지 4.5 M, 1.0 내지 4.0 M, 1.0 내지 3.5 M, 1.5 내지 5.0 M, 1.5 내지 4.5 M, 1.5 내지 4.0 M, 1.5 내지 3.5 M, 2.0 내지 5.0 M, 2.0 내지 4.5 M, 2.0 내지 4.0 M, 2.0 내지 3.5 M, 2.5 내지 5.0 M, 2.5 내지 4.5 M, 2.5 내지 4.0 M, 2.5 내지 3.5 M인 것일 수 있으며, 예를 들어, 3.0 M인 것일 수 있다.
상기 1차 세척 버퍼의 pH는 4.0 내지 6.0, 4.5 내지 6.0 또는 5.0 내지 6.0 일 수 있으며, 예를 들어, 5.5 일 수 있다.
상기 1차 세척 버퍼로 세척한 실리카 코팅 자성 비드를 2차 세척 버퍼로 추가적으로 세척한다.
상기 2차 세척 버퍼는 60 내지 90 %(v/v), 65 내지 90 %(v/v), 70 내지 90 %(v/v), 75 내지 90 %(v/v), 60 내지 85%(v/v), 65 내지 85 %(v/v), 70 내지 85 %(v/v), 75 내지 85 %(v/v) 에탄올 수용액, 예를 들어, 80 %(v/v) 에탄올 수용액일 수 있다.
상기 2차 세척 버퍼로 실리카 코팅 자성 비드를 2차 세척하여 앞서 사용한 버퍼 성분을 제거할 수 있다.
(h) RNA 용출
세척한 실리카 코팅 자성 비드로부터 RNA를 용출시킨다.
RNA 용출은 실리카 코팅 자성 비드에 용출 버퍼를 접촉시켜 수행하는 것일 수 있다.
상기 용출 버퍼는 RNA 분해효소가 없는 물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는일 수 것은 아니다.
본 명세서의 용어 중 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는 (w/w)%, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v)%이다.
본 발명은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법에 관한 것으로, 시료로부터 다양한 오염원을 효과적으로 제거하므로, 더욱 민감하게 시료 유래 바이러스의 진단을 가능하게 하며, 기존 RNA 추출용 조성물에 비하여 저렴한 시약을 사용하기 때문에 비용문제로 샘플을 풀링(pooling) 하는 단계를 생략함으로 써 정밀한 바이러스 발생 감시를 가능하게 할 뿐만 아니라 질병을 매개하는 바이러스 진단 실험 및 다양한 감시 사업의 규모를 더욱 확대할 수 있고 그에 따라 공중보건에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출 방법의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출 과정을 도식화한 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출 방법이 모기 매개 바이러스 보유감시를 위해 수행되는 분자진단 과정에서 사용되는 단계를 보여주는 그림이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 13a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 14a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 14b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 15b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 16a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 17a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 17b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 18a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 18b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 19a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 19b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 19c는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 19d는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 19e는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 20a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 20b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영통한 결과이다
도 21a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 21b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다
도 22a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 22b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 22c는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 22d는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 22e는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 1스텝 리얼타임 PCR을 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 용해 곡선이다.
도 23a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 일본뇌염바이러스를 특이적으로 인식하는 1스텝 qRT-PCR 태그맨 프로브 키트를 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 증폭곡선이다.
도 23b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 일본뇌염바이러스를 특이적으로 인식하는 1스텝 qRT-PCR 태그맨 프로브 키트를 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 증폭곡선이다.
도 23c는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 일본뇌염바이러스를 특이적으로 인식하는 1스텝 qRT-PCR 태그맨 프로브 키트를 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 증폭곡선이다.
도 23d는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 일본뇌염바이러스를 특이적으로 인식하는 1스텝 qRT-PCR 태그맨 프로브 키트를 이용하여 증폭 후 증폭된 유전자 서열을 탐지하여 작성한 증폭곡선이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스 RNA 추출용 조성물을 이용하여 추출한 바이랄 RNA를 주형으로 3 종류의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행 후 증폭 산물을 전기영동한 결과이다.
본 발명은 실리차 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
1. 실시예
1-1. 균질화 단계
핵산을 추출하는데 있어서 시료가 균질화 되어 바이러스 추출 용액 전체에 분산되어야 한다. 분산된 조직은 추출 용액에 의해 RNA가 버퍼로 용해되며 동시에 버퍼 구성요소에 의해 리보뉴클레아제 등 핵산분해효소가 불활성화되어 핵산을 보호할 수 있다.
구체적으로, 곤충 100 mg당 1ml의 EDTA-NaCl(0.9% NaCl, 20mM EDTA)을 넣은었다. 후, 비드 균질기(Bead homogenizer)를 이용하여 균질화하였다.
1-2. 제1 혼합 단계
균질화된 시료 100 ul에 65℃가 되도록 가열한 표 1의 용해 버퍼(Lysis and binding buffer, LnB) 100 ul 넣고 섞은 다음, 100 ul의 5.0 M NaCl 수용액을 넣고 볼텍싱(Vortexing)하였다.
Figure PCTKR2019009299-appb-T000001
1-3. 원심분리 단계
그 다음, 용해 버퍼 혼합물을 3,500 rpm, 상온 조건으로 15분 동안 또는 13,000rpm 상온 조건으로 4분 동안 원심분리하는 과정을 통해 단백질 및 DNA를 제거하였다. 이 단계에서 외부 요인의 오염원이 제거된다. 상기 외부 요인의 오염원은 곤충 체외의 비표적 생물(nontarget organism)을 의미한다.
0.5 내지 6.0%(v/v) 농도의 SDS와 0.4 M 농도 이상의 NaCl수용액을 혼합하면 SDS가 분리되어 침전된다. 이 과정에서 SDS와 결합했던 단백질과 DNA가 함께 침전되어 상층액에서 대부분 제거된다.
1-4. 제2 혼합 단계
원심분리 후 얻은 침전물을 제외한 상층액 100ul를 바인딩 플래이트에 옮긴 후 동량의 이소프로판올을 넣고 혼합하였다.
1-5. 바인딩 단계
원심분리 상층액 및 이소프로판올의 혼합액을 깨끗한 자성 홀더(magnetic holder)의 어댑터를 이용하여 혼합액을 위아래로 섞어주었다. 96 웰 자성 홀더에 어댑터를 끼운 후 비드를 회수하였다.
1-6. 1차 세척 단계
표 2의 조성을 가진 1차 세척 버퍼(wash buffer)가 담긴 1차 세척 플래이트로 옮긴 자성 홀더를 분리하고 혼합액을 위아래로 섞어주었다. 이 과정을 통해 곤충 색소, 단백질, DNA, 탄수화물 등을 제거하였다.
Figure PCTKR2019009299-appb-T000002
1-7. 2차 세척단계
다시 자성 홀더를 결합시킨 후, 표 3의 조성을 가진 2차 세척 버퍼를 포함하는 2차 세척 플레이트로 옮긴 후 자성 홀더를 분리하고 혼압액을 위아래로 섞어주었다. 이 단계를 통해 상기 실험과정에서 사용한 용해 버퍼, 1차 세척 버퍼 성분을 제거하였다.
Figure PCTKR2019009299-appb-T000003
1-8. 용출 단계
다시 자성 홀더를 결합시키고 그대로 들어서 비드를 회수하고 스탠드에 거치해 놓은 상태로 1 내지 5분간 비드를 자연 건조시켰다. 50 내지 180 ul의 증류수 또는 Tris-EDTA를 혼합하여 RNA가 용출되도록 한 다음, 제3 원심분리하여 RNA를 수득하였다. 이를 통해 PCR 등의 분자진단과정에 사용할 수 있다.
실험예 1. 바이러스 RNA 추출
2017년 1년간 채집된 모기로부터 본 발명의 바이러스 RNA 추출용 조성물과 방법을 통해 바이러스 RNA를 추출하고 채집된 모기가 보유한 플라비바이러스를 PCR을 통해 검출하였다.
구체적으로, 바이러스 매개 모기인 빨간집모기 (Culex pipiens)를 광주광역시 북구 임동에서 BG sentinel trap과 드라이아이스를 이용하여 유인 채집하였다. 채집된 빨간집모기 100mg당 1ml의 EDTA-NaCl(0.9% NaCl, 20mM EDTA)을 넣어 시료를 준비하였다. 비드 균질화기를 이용하여 균질화한다. 3500rpm 이상으로 10분간 원심분리하고, 상층액을 새 튜브에 옮겼다. 상층액 200ul에 70℃로 가열해놓은 용해 버퍼 200ul를 넣고 짧게 교반하였다. 그 다음, 5.0 M NaCl 200ul를 넣고 1분간 기다린 후, 3500RPM, 4℃ 조건에서 15분간 원심분리하였다.
원심분리가 끝난 상층액 100ul를 바인딩 플래이트(이소프로판올 50ul, 자성 비드 5ul)에 옮겼다. 깨끗한 빈 어댑터로 혼합물을 위아래로 섞어주었다. 96 웰 자성 홀더에 어댑터를 끼운 후 비드를 회수하였다. 1차 세척 플래이트(70% Et-OH 180ul)로 옮긴 후 자성 홀더를 분리하고 혼합물을 위아래로 섞어주었다. 다시 자성 홀더를 결합시키고 2차 세척 플래이트(70% Et-OH 180ul)로 옮긴 후 자성 홀더를 분리하고 혼합물을 위아래로 섞어주었다. 다시 자성 홀더를 결합시키고 그대로 들어서 스탠트에 거치해 놓은 상태로 1 내지 5분간 비드를 건조시켰다. 다시 자성 홀더를 용출 플래이트(D.W 50ul)에 넣은 후 비드가 D.W에 잘 풀리게 한 후, 다시 자성 홀더로 비드를 회수하였다. 추출된 RNA를 5ul씩 검출용 PCR에 사용한 후, 남은 용액은 플래이트채로 봉인 후 -80' C에 보관하였다.
실험예 2. 플라비바이러스 유래 RNA 탐지
2-1. qRT-PCR
Extracted RNA 5ul, AccuPower® GreenStar™ RT-qPCR Master Mix 10ul, 하기 표 4의 프라이머 세트 각각 1pmole/rxn 내지 20pmole/rxn, DEPC 처리된 물 20ul를 준비하여, cDNA synthesis 50℃ 15분, Thermo-start activation 95℃ 5분, Denaturation 95℃에서 15초 40사이클 및 Annealing/Extension 60℃ 60초(Data collection) 조건에서 수행하였다.
Figure PCTKR2019009299-appb-T000004
2-2. 융해 곡선 분석
Denaturation 95℃ 30초, 시작 온도 60℃ 30초 및 융해 단계 60℃에서 90℃ (0.5℃씩 사이클마다 승온)
양성의심시료 전기영동 및 PCR 산물을 확인하였다. 융해 곡선(melting peak) 온도가 85℃ 이상일 경우 양성 의심 판정하였으며, 후 아가로즈 겔을 이용한 전기영동을 통해 PCR 산물의 밴드 사이즈를 확인하였다.
구체적으로, 1% 아가로즈 겔 (0.5x TBE 버퍼)을 제조하였다. 그 다음, PCR 산물 20ul에 6x DNA 로딩 염료 4ul를 혼합하였다. PCR 산물 5ul를 겔에 로딩 후 100v/20분 조건으로 전기영동하였다. 이미지 장비(Gel documentation)를 이용하여 겔 밴드를 촬영하고 서열 분석 등을 실시하였다. 그 결과를 도 4 내지 23 및 표 5 내지 8에 나타내었다.
Figure PCTKR2019009299-appb-T000005
Figure PCTKR2019009299-appb-T000006
Figure PCTKR2019009299-appb-T000007
Figure PCTKR2019009299-appb-T000008
도 4 내지 23 및 표 4 내지 7에서 확인할 수 있듯이, 본 방법을 사용함으로써 flavivirus의 일종인 일본뇌염바이러스, 모기특이적인 플라비바이러스(Aedes flavivirus, Culex flavivirus) 그리고 차오양바이러스의 존재유무를 야외에서 채집된 모기로부터 바이러스 RNA를 추출하고 추출된 RNA로부터 PCR법을 사용하여 바이러스 유래 유전물질을 증폭하고, 그 결과를 전기영동, 실시간 PCR, 서열분석, 계통분석 등 다양한 downstream analysis를 할 수 있음을 확인하였다.
본 방법을 통해 환경에 분포되어있는 바이러스를 감시하고 스크리닝 하는 업무에 있어서 기존 기술대비 보다 간편하며 사용자에게 무해하게 바이러스 RNA를 추출하고 이를 PCR 기반 분자진단에 사용할 수 있음을 보였다.
본 발명은 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 RNA 추출 방법에 관한 것이다.

Claims (7)

  1. 하기의 단계를 포함하는 바이러스 RNA 추출 방법:
    시료를 균질화하는 균질화 단계;
    균질화된 시료에 용해 버퍼를 혼합하는 제1 혼합 단계;
    균질화된 시료를 원심분리하는 원심분리 단계;
    원심분리 상층액에 이소프로판올(isopropanol)을 혼합하는 제2 혼합 단계;
    실리카 코팅 자성 비드에 상층액을 접촉시키는 바인딩 단계;
    실리카 코팅 자성 비드를 1차 세척 버퍼로 세척하는 1차 세척단계;
    실리카 코딩 자성 비드를 2차 세척 버퍼로 세척하는 2차 세척 단계; 및
    RNA를 용출시키는 용출 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용해 버퍼는 0.1 내지 1.5 M의 NaCl(sodium chloride) 및 0.1 내지 10.0 %(v/v)의 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 포함하는 것인, 바이러스 RNA를 추출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 1차 세척 버퍼는 0.1 내지 5.0 M의 소듐 클로라이드(sodium chloride)을 포함하는 것인, 바이러스 RNA를 추출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 2차 세척 버퍼는 60 내지 80%(v/v)의 에탄올 수용액을 포함하는 것인, 바이러스 RNA를 추출하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 균질화는 균질화 용액 총량에 대하여 1 내지 30 mM의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 0.1 내지 2.0 %(w/v)의 NaCl을 포함하는 균질화 용액을 첨가하여 실시하는 것인, 바이러스 RNA를 추출하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 혼합 단계는 1 내지 10 M의 NaCl 수용액을 첨가하여 혼합하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 바이러스 RNA를 추출하는 방법.
  7. 다음을 포함하는 바이러스 RNA 추출용 조성물:
    (a) 1 내지 30 mM의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 0.1 내지 2.0 %(v/v)의 NaCl(sodium chloride)을 포함하는 균질화 용액;
    (b) 0.1 내지 1.5 M의 NaCl 및 0.1 내지 10.0 %(v/v)의 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 포함하는 용해 버퍼;
    (c) 0.1 내지 5.0 M의 소듐 클로라이드(sodium chloride)을 포함하는 1차 세척 버퍼;
    (d) 60 내지 90 %(v/v)의 에탄올 수용액을 포함하는 2차 세척 버퍼; 및
    (e) 실리카 코팅 자성 비드.
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