KR20220095743A

KR20220095743A - 식물 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 방법 및 핵산 추출 키트

Info

Publication number: KR20220095743A
Application number: KR1020200187561A
Authority: KR
Inventors: 박기범
Original assignee: 주식회사 인바이러스테크
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-07-07

Abstract

핵산 추출 방법만 달리함으로써 폴리페놀 및/또는 다당류를 풍부하게 함유하는 시료 및 RNA 분해 효소를 풍부하게 함유하는 시료 모두로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 버퍼 조성물 및 이를 포함하는 핵산 추출용 키트가 제공된다. 상기 버퍼 조성물은 4.2M 내지 4.8M의 염화소듐; 및 80mM 내지 120mM의 염화칼륨, 염화칼슘, 염화 제2 철, 염화 제1 철, 알루미늄암모늄 또는 황산암모늄을 포함한다.

Description

식물 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 방법 및 핵산 추출 키트{METHOD AND KIT FOR EXTRACTING NUCLEIC ACID FROM PLANT SAMPLE}

본 발명은 시료로부터 핵산을 추출하는 방법에 관한 것이다. 상세하게, 식물 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 시약 조성물 및 이를 포함하는 핵산 추출 키트에 관한 것이다.

핵산(nucleic acid)은 뉴클레오티드(nucleotide)라는 단위체로 구성된 중합체로서 생체 분자의 일종이다. 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid)와 RNA(ribonucleic acid)로 대별될 수 있다.

핵산이 가진 유전 정보는 핵산의 염기 서열에 포함되어 있고, 생합성 과정을 통해 단백질의 형태로 발현된다. 그리고 발현된 단백질이나 효소는 세포의 성장, 유지 및 분열 등에 중요한 역할을 하기 때문에 서로 다른 생명체는 DNA와 RNA의 염기서열 조합이 다를 수 있다. 또한 같은 생명체라 하더라도 외부 환경 조건, 영양상태, 병원체 감염 유무, 발달 단계, 조직 분화, 생장 상태 등에 따라 유전자의 발현 양상이 달라질 수 있다.

이 때 달라지는 유전자의 발현 양상은 RNA 발현양, 유전자 발현량, gene expression pattern, RNA transcription level, RNA 전사량 변화, 전사체 프로파일 등으로 표현될 수 있다. 이러한 이유로 특정 생물종을 분자생물학적 도구를 통해 생명의 원리, 감염 유무, 시약의 테스트 등을 수행할 때 기본적으로 처음 수행되는 것이 RNA 또는 DNA를 시료에서 정제하는 것이다.

일반적으로 정제된 DNA는 functional genomics 연구에 활용되며 또는 DNA의 특정 부위. 예를 들어 COI barcode, ITS barcode, ribosomal RNA sequencing 등을 통해 정제된 DNA의 서열을 확보하고 Genbank 등의 public database와 1:1 비교를 통해 생물종동정(biological identification)에 활용될 수 있다. 이외에도 정제된 DNA는 유전자 조작 등 다양한 분자생물학적 기초연구의 핵심 기초재료로 사용된다.

정제된 RNA는 Reverse transcription을 통해 complement DNA로 합성될 수 있으며 이렇게 합성된 DNA는 cDNA library로 명하기도 한다. cDNA는 방법과 절차에 따라 specific primer만 사용하는 1^st RT-PCR법으로 준비될 수도 있으며, 10-20 mer 사이의 oligo dT 또는 5~20 mer 사이의 random sequence를 사용하여 cDNA library를 구축할 수 있다. 이렇게 합성된 cDNA library로 PCR을 수행할 경우 two step RT-PCR 과정이라고 말한다. 이와 같은 과정을 통해 합성된 DNA는 taq polymerase와 sequence specific DNA oligo를 이용하여 taq polymerase의 고유한 특성인 polymerase chain reaction을 통해 특정 염기서열의 DNA를 지수함수적으로 증폭할 수 있다. 이러한 원리를 통해 증폭된 DNA의 양을 실시간으로 추적하여 유전자의 발현량을 추정하는 quantitative real-time PCR과 유전자 발현 상대정량법이 개발되어 전세계적으로 널리 사용하고 있다.

또한 PCR의 고유 현상인 특정 서열의 특이적 증폭 원리를 기반으로 증폭된 DNA를 감염된 시료, 또는 비감염된 시료와 비교함으로써 유전학적 질병의 진단이나 또는 세균, 바이러스 등의 감염성 질환 진단에 이용할 수 있다. 이와 같이 PCR 기법은 현대생물학의 기초적이며 가장 핵심적인 연구 도구이며 현재 유전 물질을 조작하여 실험하는 거의 모든 과정에서 사용하는 방법이다.

대한민국 등록특허 제10-0486179호, 2005.05.03., 핵산을 분리하고 정제하기 위한 세포 용해 조성물, 방법 및 키트 미국 등록특허 제5,234,809호, 1993.08.10., Process for isolating nucleic acid 대한민국 등록특허 제10-2094079호, 2020.03.27., 실리카 코팅 자성 비드를 이용한 바이러스 RNA 추출용 조성물 및 이를 이용한 RNA 추출 방법

Aranda, P. S., LaJoie, D. M., & Jorcyk, C. L. (2012). Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis, 33(2), 366-369.

전술한 것과 같이 PCR 기법은 매우 강력한 도구이기는 하나, PCR의 핵심요소인 DNA polymerase와 RNA를 cDNA로 합성하는 reverse transcriptase는 기능을 갖는 단백질 효소이므로 효소를 저해하는 인자인 저해제에 민감하게 반응한다. 이들 저해제는 농도 의존적으로 효소의 활성을 저해하기 때문에 성공적인 PCR 실험을 위해선 모든 과정에서 저해제가 낮은 농도로 유지되어야 한다.

특수한 실험이 아닌 이상 저해제는 효소 반응 직전에 포함된 정제된 RNA 산물 또는 DNA 산물에 포함되어 있고, 최초 시료로부터 추출된 핵산의 품질에 따라 진단 및 실험 결과가 크게 좌우되기 때문에 보다 정확한 PCR 과정을 위해서는 고품질의 핵산을 추출하는 것이 무엇보다 중요하다.

핵산을 추출하는 방법은 시료의 세포벽을 파괴하고 그 내부의 핵산을 용출시키며 핵산 외 불순물을 걸러내는 것을 기본으로 한다. 핵산 추출에 사용되는 시약은 주로 카오트로픽염(chaotropic salt)을 포함하는 제품군과 페놀, 클로로포름 등을 포함하는 제품군으로 대별될 수 있다.

카오트로픽염 기반 제품은 단백질 분자 주변의 수분을 강하게 빼앗아 단백질을 변형시키는 원리를 기반으로 RNA 분해 효소를 불활성화시킴으로서 고품질의 RNA를 추출할 수 있다. 반면 페놀 기반 제품은 단백질 용해능을 이용하여 RNA와 단백질을 분리하고, 클로로포름을 이용하여 RNA층과 단백질층을 분리함으로써 고품질의 RNA를 추출할 수 있도록 한다.

현재 퀴아젠社의 핵산 추출 키트가 보편적으로 이용되고 있다. 퀴아젠社의 핵산 추출 키트는 실험실 수준에서 불특정 시료를 대상으로 1차적으로 적용 가능한 범용 키트(universal kit)이다.

그러나 전술한 것과 같이 가능한 높은 수준의 분자 진단 검사 결과를 요구하는 산업 분야에서, 특히 감염병의 진단 분야에 있어서, 검사 결과의 신뢰성과 정확성을 높이고 검사에 소요되는 인력과 시간을 단축시키기 위해서는 고품질의 핵산을 추출하는 것이 무척 중요하다.

특히 시료가 동물인지 식물인지에 따라, 또한 같은 식물이라 하더라도 식물들의 생물학적 특징, 예컨대 잎 또는 조직에 고농도로 존재하는 2차 대사 산물에 의해 핵산의 추출 효율은 전혀 달라질 수 있다.

다른 예를 들어, 동일한 검출 버퍼(또는 시약)를 이용하여 동일한 방법으로 핵산을 추출하는 경우에도, 어느 시료를 대상으로는 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 반면, 다른 시료를 대상으로는 그렇지 못하거나, 심지어 또 다른 시료를 대상으로는 핵산이 전혀 추출되지 않을 수도 있다.

한편, 식물은 800종이 넘는 바이러스에 노출 및 감염되는 것으로 알려져 있다. 특히 식물은 동물과 다르게 바이러스 감염병에 대한 치료가 실질적으로 곤란하기 때문에 한번 감염되면 해당 지역을 폐쇄할 수 밖에 없는 문제가 있다. 반면 최근 식용 작물의 수출 및 수입 시장 규모가 확대됨에 따라 어느 지역에서 발생한 작물 병해가 타지역으로 확대되는 일이 빈번해지고 있다. 이러한 이유로 각국 정부에서는 수출입물을 대상으로 꼼꼼한 검역을 수행하여 바이러스에 감염된 작물로 인한 피해 확대를 예방하고 있으나, 진단 결과의 모호성 등으로 인해 검역 진단에 소요되는 기간이 짧지 않은 실정이다.

식물은 생물학적 특징으로 인해 동물에 비해 상대적으로 다양한 DNA 및 RNA 추출 저해 성분을 풍부하게 포함하고 있으며, 상대적으로 고품질의 핵산 추출이 쉽지 않다.

예를 들어, 식물의 잎은 바이러스가 증식하는 주요 기관이기 때문에 식물의 바이러스 진단에 가장 많이 활용되는 시료이다. 동시에, 식물의 잎은 빛과 온도 및 해충에 가장 많이 노출되기 때문에 식물의 보호 기작(protective mechanism)에 의해 잎 내에 폴리페놀과 다당류를 고농도로 축적하고 있다.

그러나 폴리페놀 및/또는 다당류는 핵산, 예컨대 RNA 또는 DNA의 추출 과정에서 저해제(inhibitor)로 기능할 수 있다. 특히 상용화된 핵산 추출 키트들은 고농도의 구아니딘염(guanidine salt)을 사용하는 것이 일반적이나, 이 같은 카오트로픽염(chaotropic agent)이 형성하는 버퍼 조건은 폴리페놀과 다당류가 핵산과 반응하여 결합 분자 또는 불용성 복합체를 형성하는 것을 촉진시킬 수 있고, 이는 바이러스 등의 진단 민감도를 저하시키거나 유전자 발현연구에 활용할 수 있는 cDNA library 구축을 현저하게 방해할 수 있다. 그리고 그 결과, 진단에 소요되는 시간과 비용 상승을 초래할 수 있으며, 잘못된 음성판정 또는 실험 결과를 도출하게 된다.

다른 예를 들어, RNA 분해 효소 등 또한 저해제로 기능할 수 있고, 이러한 시료로부터 고품질의 핵산을 추출하는 것 또한 매우 어려운 실정이다.

이러한 현상이 수십억 원 규모로 거래되는 농작물의 수출입 검역 과정에서 발생한다면 잘못된 음성결과로 인해 수입대상국 또는 수출대상국에서 바이러스 감염을 이유로 모든 농작물을 임의 폐기처분을 할 수 있으며, 이는 책임소재에 따라 국내에 경제적인 피해를 입힐 수 있는 문제이다.

그러나 일반적으로 잘 알려진 핵산 추출 버퍼를 이용하여 폴리페놀 및/또는 다당류를 풍부하게 함유하는 시료, 또는 RNA 분해 효소 등을 풍부하게 함유하는 시료로부터 고품질의 핵산을 추출 및 회수하는 것은 곤란한 실정이다. 식물 중에서도, 특히 폴리페놀 및/또는 다당류를 풍부하게 함유하는 시료로는 배, 바나나, 딸기, 망고, 포도, 토마토, 복숭아, 애기장대, 파인애플 등의 작물, 이들의 열매, 이들의 줄기, 이들의 뿌리 및/또는 이들의 잎을 예시할 수 있다. 또, RNA 분해 효소를 풍부하게 함유하는 시료로는 고추, 또는 피망 등의 작물, 이들의 열매, 이들의 줄기, 이들의 뿌리 및/또는 이들의 잎을 예시할 수 있다.

이처럼 식물의 종류에 따라 핵산 추출용 시약은 그들이 함유하는 저해제를 무력화할 수 있는 성분을 이용하여 핵산을 추출하도록 고안될 필요가 있다. 그러나 매우 다양한 식물의 종류, 그리고 이들이 갖는 고유의 저해제 성분이 모두 다르기 때문에 각 식물별로 서로 상이한 성분의 핵산 추출 시약을 이용하게 되며, 이는 핵산 추출에 소요되는 비용 상승과 불편함을 초래하게 된다.

이러한 이유로 하나의 키트를 이용하여 다양한 식물 시료에 대응 가능한 핵산의 추출 방법을 제공하는 것은 본 기술 분야에서 오랜 연구 과제로 여겨져 왔다.

즉 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 폴리페놀 및/또는 다당류가 풍부하게 함유된 시료로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

동시에, RNA 분해 효소가 풍부하게 함유된 시료로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 폴리페놀 및/또는 다당류가 풍부하게 함유된 시료로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 시약 내지는 버퍼를 제공하는 것이다.

동시에, RNA 분해 효소가 풍부하게 함유된 시료로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 시약 내지는 버퍼를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 폴리페놀 및/또는 다당류가 풍부하게 함유된 시료로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 시약 내지는 버퍼를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

동시에, RNA 분해 효소가 풍부하게 함유된 시료로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있는 시약 내지는 버퍼를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산을 추출하는 방법은, 폴리페놀 및/또는 다당류가 풍부하게 함유된 시료로부터 핵산을 추출하는 방법으로서, Tris-HCl(트리스(히드록시메틸)아미노메테인-HCl)을 포함하는 제1 버퍼를 시료와 혼합하는 단계; 황산도데실소듐(sodium dodecyl sulfate, SDS)을 포함하는 제2 버퍼를 시료와 혼합하는 단계; 염화소듐(NaCl)을 포함하는 제3 버퍼를 시료와 혼합하는 단계; 및 구아니딘염산(Gu-HCl)을 포함하는 제4 버퍼를 시료와 혼합하는 단계를 포함한다.

상기 단계들은 순차적으로 이루어질 수 있다.

상기 제1 버퍼는, 0.8M 내지 1.2M의 Tris-HCl을 포함할 수 있다.

또 상기 제1 버퍼는 20mM 내지 30mM의 에틸렌 다이아민 테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 0.3%(w/v) 내지 0.7%(w/v)의 메타중아황산소듐(sodium metabisulfite), 아황산나트륨, 산성아황산나트륨 또는 황산나트륨, 및 1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v)의 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함할 수 있다.

상기 제2 버퍼는, 3%(w/v) 내지 8%(w/v)의 SDS를 포함할 수 있다.

또 상기 제2 버퍼는 20mM 내지 30mM의 EDTA, 120mM 내지 180mM의 소듐시트레이트(sodium citrate), 및 15mM 내지 25mM의 Tris-HCl을 더 포함할 수 있다.

상기 제3 버퍼는, 4.2M 내지 4.8M의 염화소듐을 포함할 수 있다.

또 상기 제3 버퍼는 80mM 내지 120mM의 염화칼륨, 염화칼슘, 염화 제2 철, 염화 제1 철, 알루미늄암모늄 또는 황산암모늄, 및 1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v)의 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함할 수 있다.

상기 제4 버퍼는, 3.5M 내지 4.5M의 구아니딘염산을 포함할 수 있다.

또 상기 제4 버퍼는 10mM 내지 20mM의 Tris-HCl을 더 포함할 수 있다.

상기 제1 버퍼와 상기 제2 버퍼의 사용 부피비는 1:1.1 내지 1:1.2일 수 있다.

상기 제1 버퍼와 상기 제3 버퍼의 사용 부피비는 1:0.6 내지 1:0.8일 수 있다.

상기 제1 버퍼와 상기 제4 버퍼의 사용 부피비는 1:0.9 내지 1:1.1일 수 있다.

상기 제1 버퍼의 사용 부피는 350㎕ 내지 450㎕일 수 있다.

상기 제1 버퍼를 시료와 혼합하는 단계는, 상기 제1 버퍼, 상기 시료 및 환원제 40㎕ 내지 60㎕를 혼합하는 단계, 및 상기 시료를 파쇄하는 단계를 포함할 수 있다.

여기서 상기 환원제는 β-메르캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 0.3M 내지 0.7M의 TCEP-HCl 또는 0.8M 내지 1.2M의 디티오트레톨(dithiothreitol, DTT)을 포함할 수 있다.

또, 상기 제1 버퍼와 상기 환원제의 사용 부피비는 1:0.08 내지 1:0.15일 수 있다.

몇몇 실시예에서, 상기 제2 버퍼를 혼합한 후 상기 제3 버퍼를 혼합하기 전에, 혼합물을 55℃ 내지 65℃에서 2분 내지 8분 배양하는 제1 배양 단계; 상기 제3 버퍼를 혼합한 후 상기 제4 버퍼를 혼합하기 전에, 혼합물을 30초 내지 5분 배양하는 제2 배양 단계; 상기 제2 배양 단계 후 상기 제4 버퍼를 혼합하기 전에, 배양물을 원심 분리하는 제1 원심 분리 단계; 및 상기 제4 버퍼를 혼합한 후, 혼합물을 실온에서 30초 내지 5분 배양하는 제3 배양 단계; 배양물을 혼합물을 원심 분리하는 제2 원심 분리 단계; 및 상기 제2 원심 분리 단계의 상층액과 이소프로판올(isopropanol)을 혼합하여 컬럼에 로딩하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제4 버퍼를 혼합하는 단계는, 제1 원심 분리 단계의 상층액과 상기 제4 버퍼를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

몇몇 실시예에서, 이소프로판올 및 염화소듐을 포함하는 제5 버퍼로 컬럼을 세척하는 제1 세척 단계; 에탄올, Tris-HCl 및 구아니딘-염산을 포함하는 제6 버퍼로 컬럼을 세척하는 제2 세척 단계; 및 에탄올 및 Tris-HCl을 포함하는 제7 버퍼로 컬럼을 세척하는 제3 세척 단계; 및 핵산을 회수하는 단계를 순차적으로 더 포함할 수 있다.

상기 시료는, 배, 바나나, 딸기, 망고, 포도, 토마토, 복숭아, 애기장대, 또는 파인애플을 포함하는 과수작물로부터 유래한 것일 수 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 핵산의 추출 방법은 RNA 분해 효소가 풍부하게 함유된 시료로부터 핵산을 추출하는 방법으로서, 구아니딘염산(Gu-HCl)을 포함하는 제4 버퍼를 시료와 혼합하는 단계; 염화소듐(NaCl)을 포함하는 제3 버퍼를 혼합하는 단계; Tris-HCl(트리스(히드록시메틸)아미노메테인-HCl)을 포함하는 제1 버퍼를 혼합하는 단계; 및 황산도데실소듐(sodium dodecyl sulfate, SDS)을 포함하는 제2 버퍼를 혼합하는 단계를 포함한다.

상기 단계들은 순차적으로 이루어질 수 있다.

몇몇 실시예에서, 상기 제1 버퍼를 혼합하는 단계와 상기 제2 버퍼를 혼합하는 단계 사이에, 상기 제4 버퍼를 추가로 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제1 버퍼는, 0.8M 내지 1.2M의 Tris-HCl을 포함할 수 있다.

상기 제2 버퍼는, 3%(w/v) 내지 8%(w/v)의 SDS를 포함할 수 있다.

최초 혼합되는 상기 제4 버퍼와 상기 제3 버퍼의 사용 부피비는 1:1.1 내지 1:1.2일 수 있다.

최초 혼합되는 상기 제4 버퍼와 상기 제1 버퍼의 사용 부피비는 1:0.6 내지 1:0.8일 수 있다.

최초 혼합되는 상기 제4 버퍼와 상기 제2 버퍼의 사용 부피비는 1:1.1 내지 1:1.2일 수 있다.

상기 제4 버퍼의 최초 사용 부피는 350㎕ 내지 450㎕일 수 있다.

몇몇 실시예에서, 최초 혼합되는 상기 제4 버퍼와 이후에 혼합되는 상기 제4 버퍼의 혼합비는 1:0.9 내지 1:1.1일 수 있다.

상기 제4 버퍼를 시료와 혼합하는 단계는, 상기 제4 버퍼, 상기 시료 및 환원제 40㎕ 내지 60㎕를 혼합하는 단계, 및 상기 시료를 파쇄하는 단계를 포함할 수 있다.

또, 상기 제4 버퍼와 상기 환원제의 사용 부피비는 1:0.08 내지 1:0.15일 수 있다.

몇몇 실시예에서, 상기 제3 버퍼를 혼합한 후 상기 제1 버퍼를 혼합하기 전에, 혼합물을 55℃ 내지 65℃에서 2분 내지 8분 배양하는 제1 배양 단계; 상기 제1 버퍼를 혼합한 후, 혼합물을 원심 분리하는 제1 원심 분리 단계; 상기 제1 원심 분리 단계 후, 혼합물을 30초 내지 5분 배양하는 제2 배양 단계; 상기 제2 버퍼를 혼합한 후, 혼합물을 30초 내지 5분 배양하는 제3 배양 단계; 상기 제3 배양 단계의 배양물을 원심 분리하는 제2 원심 분리 단계; 상기 제2 원심 분리 단계의 상층액과 이소프로판올(isopropanol)을 혼합하여 컬럼에 로딩하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제2 버퍼를 혼합하는 단계는, 제1 원심 분리 단계의 상층액, 또는 제1 원심 분리 단계의 상층액의 배양물과 상기 제2 버퍼를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 시료는, 고추 또는 피망을 포함하는 과수작물로부터 유래한 것일 수 있다.

상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 시약 조성물은, 0.8M 내지 1.2M의 Tris-Hcl; 0.3%(w/v) 내지 0.7%(w/v)의 메타중아황산소듐, 아황산나트륨, 산성아황산나트륨 또는 황산나트륨; 및 1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v)의 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리비닐폴리피롤리돈을 포함한다.

몇몇 실시예에서, 상기 시약 조성물은 20mM 내지 30mM의 에틸렌 다이아민 테트라산을 더 포함할 수 있다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 키트는 전술한 제1 시약 조성물; 및 황산도데실소듐을 포함하는 제2 시약 조성물을 포함한다.

몇몇 실시예에서, 상기 핵산 추출 키트는 염화소듐을 포함하는 제3 시약 조성물; 및 구아니딘염산을 포함하는 제4 시약 조성물을 더 포함할 수 있다.

또, 상기 제1 시약 조성물 내지 제4 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 프로토콜 매뉴얼을 더 포함할 수 있다.

또는, 상기 제4 시약 조성물, 상기 제3 시약 조성물, 상기 제1 시약 조성물 및 상기 제2 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 프로토콜 매뉴얼을 더 포함할 수 있다.

또는, 상기 제1 시약 조성물 내지 제4 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 제1 프로토콜 매뉴얼; 및 상기 제4 시약 조성물, 상기 제3 시약 조성물, 상기 제1 시약 조성물 및 상기 제2 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 제2 프로토콜 매뉴얼을 더 포함할 수 있다.

상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 시약 조성물은 3%(w/v) 내지 8%(w/v)의 황산도데실소듐; 120mM 내지 180mM의 소듐시트레이트; 및 15mM 내지 25mM의 Tris-HCl을 포함한다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 핵산 추출 키트는 상기 제2 시약 조성물; 및 염화소듐을 포함하는 제3 시약 조성물을 포함한다.

몇몇 실시예에서, 상기 핵산 추출 키트는 구아니딘염산을 포함하는 제4 시약 조성물을 더 포함할 수 있다.

또, 상기 제2 시약 조성물 내지 제4 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 프로토콜 매뉴얼을 더 포함할 수 있다.

또는, 상기 제4 시약 조성물, 상기 제3 시약 조성물 및 상기 제2 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 프로토콜 매뉴얼을 더 포함할 수 있다.

또는, 상기 제2 시약 조성물 내지 제4 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 제1 프로토콜 매뉴얼; 및 상기 제4 시약 조성물, 상기 제3 시약 조성물 및 상기 제2 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 제2 프로토콜 매뉴얼을 더 포함할 수 있다.

상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 시약 조성물은 4.2M 내지 4.8M의 염화소듐; 및 80mM 내지 120mM의 염화칼륨, 염화칼슘, 염화 제2 철, 염화 제1 철, 알루미늄암모늄 또는 황산암모늄을 포함한다.

몇몇 실시예에서, 상기 시약 조성물은 1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v)의 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함할 수 있다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 핵산 추출 키트는 전술한 제3 시약 조성물; 및 구아니딘염산을 포함하는 제4 시약 조성물을 포함한다.

상기 제3 시약 조성물과 제4 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 프로토콜 매뉴얼을 더 포함할 수 있다.

또는, 상기 제4 시약 조성물과 상기 제3 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 프로토콜 매뉴얼을 더 포함할 수 있다.

또는, 상기 제3 시약 조성물과 제4 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 제1 프로토콜 매뉴얼; 및 상기 제4 시약 조성물과 상기 제3 시약 조성물을 순차적으로 혼합할 것을 가이드하는 제2 프로토콜 매뉴얼을 더 포함할 수 있다.

기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명의 실시예들에 따르면, 제1 버퍼 내지 제4 버퍼를 포함하는 키트를 이용하여 핵산 추출 방법만 달리함으로써 폴리페놀 및/또는 다당류를 풍부하게 함유하는 시료 및 RNA 분해 효소를 풍부하게 함유하는 시료 모두로부터 고품질의 핵산을 추출할 수 있다.

즉, 하나의 키트에 포함된 같은 종류의 시약들을 이용하되, 시료의 특성에 따른 핵산의 추출 방법만 달리함으로써, 예컨대 시료에 따른 핵산의 추출 방법 프로토콜을 다르게 가이드함으로써 다양한 식물들로부터 우수한 품질의 핵산을 추출할 수 있다.

본 발명의 실시예들에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.

도 1은 및 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산의 추출 방법을 나타낸 순서도이다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 핵산의 추출 방법을 나타낸 순서도이다.
도 5는 실시예 2에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 6은 실시예 3에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 7은 실시예 4에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 8은 비교예 1-1에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 9는 비교예 1-2에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 10은 비교예 2-1에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 11은 비교예 2-2에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 12는 비교예 3에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 13은 비교예 4들에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 14는 비교예 5에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 15는 비교예 6에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 16은 비교예 7에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 17은 비교예 8에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 18은 비교예 9들에 따라 핵산을 추출하고 전기 영동한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 19 내지 도 21은 실험예 1에 따라 측정한 핵산의 순도 등을 나타낸 이미지들이다.
도 22 내지 도 29는 실험예 2에 따른 증폭 곡선 및 융해 곡선을 나타낸 이미지들이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 즉, 본 발명이 제시하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

본 명세서에서, '및/또는'은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 또, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. '내지'를 사용하여 나타낸 수치 범위는 그 앞과 뒤에 기재된 값을 각각 하한과 상한으로서 포함하는 수치 범위를 나타낸다. '약' 또는 '대략'은 그 뒤에 기재된 값 또는 수치 범위의 20% 이내의 값 또는 수치 범위를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '버퍼(buffer)' 또는 '시약'은 핵산의 추출 과정에서 첨가되거나, 혼합되거나, 추가되는 물질을 의미하며, 완충용액의 의미에 제한되는 것은 아니다. 용어 '버퍼'와 '시약'은 혼용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '프라이머'는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)을 갖는 핵산 서열로, 핵산의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base fair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 핵산 서열을 의미한다.

이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

제1 버퍼 조성물

제1 버퍼 조성물은 시료의 산성 또는 염기성의 pH를 약 7.0의 중성으로 중화시키고 시료의 항산화 물질의 산화과정을 억제할 수 있다. 예를 들어, 주요 항산화인자인 폴리페놀이 산화하며 발생하는 ROS, quinone 등이 발생하지 않도록 고안된 버퍼일 수 있고 또는 폴리페놀을 흡착하여 핵산과 화학적으로 반응하지 않도록 방해하는 목적일 수 있다. 또, 제1 버퍼 조성물은 bead beating 같은 고열이 발생하는 균질과정에서 시료의 온도가 급격히 올라가지 않도록 방지하는 균질화 용액으로 기능할 수 있다.

제1 버퍼 조성물은 Tris-HCl(Tris 완충용액)을 포함하고, 에틸렌다이아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 메타중아황산소듐(sodium metabisulfite), 및 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone)을 더 포함할 수 있다.

Tris-HCl의 농도는 약 0.8M 내지 1.2M, 또는 약 0.9M 내지 1.1M일 수 있다. Tris-HCl의 pH는 약 6.9 내지 7.1, 또는 약 7.0일 수 있다.

Tris-HCl의 함량이 너무 적으면 완충효과가 감소하여 시료 균질 시 시료 내에서 유래한 산성 또는 염기성 물질에 의해 균질물의 pH가 급격히 변할 수 있다. 이러한 경우 추출 목적물인 핵산의 품질 또는 수율이 급격히 감소할 수 있다. 반면 Tris-HCl의 함량이 너무 많으면 삼투압이 증가하여 원하지 않는 단계에서 내인성 RNAse, DNAase가 다량 방출되어 핵산의 수율이 감소할 수 있다.

또, EDTA의 농도는 약 20mM 내지 30mM, 또는 약 22mM 내지 28mM, 또는 약 24mM 내지 26mM일 수 있다.

EDTA의 함량이 너무 적으면 DNAse의 활성을 감소시키지 못해 DNA 추출효율이 낮아질 수 있으며 Calcium ion 또는 기타 iron ion을 제거하지 못해 세포벽의 파괴가 원활히 이뤄질 수 없다. 반대로 EDTA의 함량이 너무 많으면 조성물의 pH가 상승하여 본래 목적인 pH 완충효과를 잃어버릴 수 있다.

몇몇 실시예에서, Tris-HCl과 EDTA의 몰(mol) 비는 약 35:1 내지 45:1, 또는 약 36:1 내지 44:1, 또는 약 37:1 내지 43:1, 또는 약 38:1 내지 42:1, 또는 약 39:1 내지 41:1, 또는 약 40:1일 수 있다.

메타중아황산소듐의 농도는 약 0.3%(w/v) 내지 0.7%(w/v), 또는 약 0.4%(w/v) 내지 0.6%(w/v), 또는 약 0.5%(w/v) 내지 0.6%(w/v)일 수 있다. 본 명세서에서, 다르게 정의되지 않는 한 용액 중의 % 농도는 %(w/v, weight/volume)을 의미한다.

메타중아황산소듐의 함량이 너무 적으면 폴리페놀의 산화를 방지하지 못해 RNA, DNA의 추출 효율이 낮아지며, 너무 많으면 이후 버퍼인 용해버퍼의 용해력을 감소시켜 RNA, DNA의 추출 효율이 낮아질 수 있다.

다른 실시예에서, 메타중아황산소듐 대신에, 또는 추가로 아황산나트륨, 산성아황산나트륨 및/또는 황산나트륨을 더 포함할 수도 있다. 이 경우, 메타중아황산소듐, 아황산나트륨, 산성아황산나트륨 및 황산나트륨의 함량의 합은 전술한 농도 내에 있을 수 있다.

폴리비닐피롤리돈의 농도는 약 1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v), 또는 약 1.9%(w/v) 내지 2.1%(w/v), 또는 약 2.0%(w/v)일 수 있다. 다른 실시예에서, 폴리비닐피롤리돈 대신에, 또는 추가로 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함할 수도 있다. 이 경우, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜의 함량의 합은 전술한 농도 내에 있을 수 있다.

폴리비닐피롤리돈(또는 폴리비닐폴리피롤리돈, 또는 폴리에틸렌글리콜)의 함량이 너무 적으면 폴리페놀의 흡착량이 적어져서 이후 침전 단계에서 폴리페놀을 효과적으로 제거할 수 없다. 이러할 경우 폴리페놀이 핵산과 반응하여 RNA, DNA의 추출 효율이 낮아진다. 너무 많으면 용액의 점성이 증가하여 균질과정이 곤란해지며 이후 액체 조작 과정에서 난이도가 증가할 수 있다.

몇몇 실시예에서, 메타중아황산소듐 등과 폴리비닐피롤리돈 등의 중량 비는 약 1:3.8 내지 1:4.2, 또는 약 1:3.9 내지 1:4.1, 또는 약 1:4일 수 있다.

예시적인 실시예에서, 제1 버퍼 조성물은 구아니딘 염(guanidine salt), 페놀, 클로로포름, 이소아밀알콜(iso-amyl alcohol) 및/또는 세틸트리메틸암모늄브로마이드(cetyl trimethylammonium bromide, CTAB) 등의 양이온성 계면활성제를 불포함할 수 있다.

후술할 바와 같이 제1 버퍼 조성물은 폴리페놀 및/또는 다당류가 풍부하게 함유된 파쇄된 시료와 가장 먼저 혼합되는 버퍼일 수 있다. 이 때, 본 실시예에 따른 제1 버퍼 조성물은 구아니딘염을 불포함하여 폴리페놀과 다당류가 화학 반응하는 것을 미연에 방지할 수 있다.

또, 페놀, 클로로포름 및/또는 이소아밀알콜과 같이 휘발성이 강하고, 인체에 유해한 물질을 불포함함으로써 핵산을 추출하는 작업자의 안전을 도모할 수 있고, 복잡한 설비를 갖추지 않고 상대적으로 마일드한 조건 하에서 안정적으로 작업을 수행할 수 있기 때문에 현장 진단용 키트로 구현하는 것이 가능하다. 또한 세틸트리메틸암모늄브로마이드를 불포함하기 때문에 액체 질소의 사용이 필수적이지 않을 수 있고, 에탄올 공침법을 사용하지 않아도 되므로 시료에 따라 선택적으로 액체 질소 또는 에탄올 공침법을 사용하지 않을 경우, 핵산의 추출 공정이 간단해지는 것은 물론, 액체 질소를 이용한 시료의 파쇄 및 균질화 과정에서 시료가 오염되는 문제를 방지할 수 있으며, 핵산 추출에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.

제1 버퍼 조성물의 제조 방법

제1 버퍼 조성물은 Tris-HCl을 혼합하고, EDTA, 메타중아황산소듐 및 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 더 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.

예시적인 실시예에서, 제1 버퍼 조성물은 2M Tris-HCl(pH 7.0)을 25ml, 0.5M EDTA를 2.5ml, 메타중아황산나트륨(분말상)을 0.25g 및 폴리비닐피롤리돈(pH value 3.0 내지 5.0, 몰평균분자량 25,000 내지 35,000, 분말상) 1.0g을 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제1 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.

다만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 전술한 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량을 도출할 수 있는 경우, 각 혼합 성분의 중량 및 부피는 제한되지 않는다. 또, 각 성분의 몰농도(M)는 시판 제품을 그대로 이용하거나, 또는 희석하여 이용할 수 있음은 물론이다.

제1 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하, 또는 약 40ml 이하, 또는 약 30ml 이하일 수 있다.

제1 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.

제2 버퍼 조성물

제2 버퍼 조성물은 계면활성제를 포함하여 세포 및 단백질을 파괴 및 변형하고, 단백질을 흡착시킬 수 있다. 또, 다당류를 적어도 부분적으로 제거할 수 있다.

제2 버퍼 조성물은 황산도데실소듐(sodium dodecyl sulfate, SDS)을 포함하고, EDTA, 소듐시트레이트(sodium citrate) 및 Tris-HCl(Tris 완충용액)을 더 포함할 수 있다.

SDS의 농도는 약3%(w/v) 내지 8%(w/v), 또는 약4%(w/v) 내지 7%(w/v), 또는 약5%(w/v) 내지 6%(w/v)일 수 있다.

SDS의 함량이 너무 적으면 단백질의 변성력 예를 들어 RNase의 변성도가 낮아져 용출된 RNA를 분해할 수 있고. 세포 파괴 효율이 낮아져 RNA 또는 DNA의 용출량이 줄어들 수 있어 RNA, DNA의 추출 효율이 떨어질 수 있다. 너무 많으면 단백질 또는 버퍼 조성물의 기타 화합물과 과다하게 반응하여 이후 단계의 조작 난이도가 증가할 수 있고, RNA, DNA도 같이 흡착하여 추출 효율이 낮아질 수 있다.

EDTA의 함량이 너무 적으면 DNAse의 활성을 감소시키지 못해 DNA 추출효율이 낮아질 수 있으며 Calcium ion 또는 기타 iron ion을 제거하지 못해 세포벽의 파괴가 원활히 이뤄질 수 없다. 너무 많으면 조성물의 pH가 상승하여 본래 목적인 pH 완충효과를 잃어버릴 수 있다.

소듐시트레이트의 농도는 약 120mM 내지 180mM, 또는 약 130mM 내지 170mM, 또는 약 140mM 내지 160mM, 또는 약 150mM일 수 있다.

소듐시트레이트의 함량이 너무 적으면, DNAse의 활성을 감소시키지 못해 DNA 추출효율이 낮아질 수 있으며 Calcium ion 또는 기타 iron ion을 제거하지 못해 세포벽의 파괴가 원활히 이뤄질 수 없다. 너무 많으면 조성물의 pH가 상승하여 본래 목적인 pH 완충효과를 잃어버릴 수 있다.

몇몇 실시예에서, EDTA와 소듐시트레이트의 몰비는 약 1:4 내지 1:8, 또는 약 1:5 내지 1:7, 또는 약 1.6일 수 있다.

또, Tris-HCl의 농도는 약 15mM 내지 25mM, 또는 약 16mM 내지 24mM, 또는 약 17mM 내지 23mM, 또는 약 18mM 내지 22mM, 또는 약 19mM 내지 21mM일 수 있다. Tris-HCl의 pH는 약 7.4일 수 있다.

Tris-HCl의 함량이 너무 적으면 완충효과가 감소하여 시료 균질 시 시료 내에서 유래한 산성 또는 염기성 물질에 의해 균질물의 pH가 급격히 변할 수 있다. 이러한 경우 추출 목적물인 핵산의 품질 또는 수율이 급격히 감소할 수 있다. 너무 많으면 삼투압이 증가하여 원하지 않는 단계에서 내인성 RNAse, DNAase가 다량 방출되어 핵산의 수율이 감소할 수 있다.

몇몇 실시예에서, EDTA와 Tris-HCl의 몰비는 약 1:1 내지 1.5:1, 또는 약 1.1:1 내지 1.4:1, 또는 약 1.2:1 내지 1.3:1, 또는 약 1.25:1일 수 있다.

제2 버퍼 조성물의 제조 방법

제2 버퍼 조성물은 SDS를 혼합하고, EDTA, 소듐시트레이트 및 Tris-HCl을 더 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.

예시적인 실시예에서, 제2 버퍼 조성물은 20% SDS를 12.5ml, 0.5M EDTA를 2.5ml, 소듐시트레이트(분말상)를 1.93g, 1.0M Tris-HCl(pH 7.4)을 1.0ml 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제2 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.

제2 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하, 또는 약 40ml 이하, 또는 약 30ml 이하일 수 있다.

제2 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.

제3 버퍼 조성물

제3 버퍼 조성물은 높은 삼투압을 형성하고 제2 버퍼 조성물로 인해 용출된 핵산의 표면 전하를 중화하여 용매상 용해율을 감소시킬 수 있다. 또, 제2 버퍼 조성물의 SDS를 흡착시키거나 및/또는 침전시켜 제거할 수 있고 단백질과 다당류를 침전시킬 수 있으며, 핵산의 바인딩에 도움을 줄 수 있다. 뿐만 아니라, 소듐 이온이 핵산의 인산과 반응하여 표면을 코팅하므로 RNAse, DNase 같은 핵산분해효소가 접근하지 못하도록 방해할 수 있다.

제3 버퍼 조성물은 염화소듐(NaCl)을 포함하고, 염화칼륨(KCl) 및 폴리비닐피롤리돈을 더 포함할 수 있다.

염화소듐의 농도는 약 4.2M 내지 4.8M, 또는 약 4.3M 내지 4.7M, 또는 약 4.4M 내지 4.6M, 또는 약 4.5M일 수 있다.

염화소듐의 함량이 너무 적으면 삼투압이 낮아져 상기 설명한 삼투압 형성, 핵산의 표면 전하 중화, 핵산의 바인딩, 단백질과 다당류 침전, SDS의 흡착 및 침전 효과를 얻을 수 없다. 너무 많으면 용액이 포화되어 염화소듐 및 다른 첨가물이 석출될 수 있다.

염화칼륨의 농도는 약 80mM 내지 120mM, 또는 약 90mM 내지 110mM일 수 있다. 다른 실시예에서, 염화칼륨 대신에, 또는 추가로 염화 제2 철, 염화 제1 철, 알루미늄암모늄 및/또는 황산암모늄을 더 포함할 수도 있다. 이 경우, 염화칼슘, 염화 제2 철, 염화 제1 철, 알루미늄암모늄 및 황산암모늄의 함량의 합은 후술할 농도 내에 있을 수 있다.

염화칼륨의 함량이 너무 적으면 SDS와 NaCl의 결합력을 촉진시킬 수 없어서 침전물의 안정도가 떨어질 수 있다. 너무 많으면 핵산이 칼륨과 반응하여 마지막 회수단계에서 칼륨이 용출될 수 있으며 이는 PCR 과정을 방해하거나 오작동을 일으킬 수 있다

몇몇 실시예에서, 염화소듐과 염화칼륨 등의 몰비는 약 40:1 내지 50:1, 또는 약 41:1 내지 49:1, 또는 약 42:1 내지 48:1, 또는 약 43:1 내지 47:1, 또는 약 44:1 내지 46:1, 또는 약 45:1일 수 있다.

제3 버퍼 조성물의 제조 방법

제3 버퍼 조성물은 염화소듐을 혼합하고, 염화칼륨 및 폴리비닐피롤리돈을 더 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.

예시적인 실시예에서, 제3 버퍼 조성물은 5M의 염화소듐을 45ml, 염화칼륨(분말상)을 0.37g, 및 폴리비닐피롤리돈(pH value 3.0 내지 5.0, 몰평균분자량 25,000 내지 35,000, 분말상) 1.0g을 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제3 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.

제3 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하, 또는 약 40ml 이하, 또는 약 30ml 이하일 수 있다.

제3 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.

제4 버퍼 조성물

제4 버퍼 조성물은 제2 버퍼 조성물의 SDS 및 폴리페놀과 결합된 폴리비닐피롤리돈을 침전시킬 수 있다. 또, 잔여 단백질을 변성시킬 수 있으며, 핵산의 바인딩에 도움을 줄 수 있다.

제4 버퍼 조성물은 구아니딘염산(Guanidine-HCl)을 포함하고, Tris-HCl을 더 포함할 수 있다.

구아니딘염산의 농도는 약 3.5M 내지 4.5M, 또는 약 3.6M 내지 4.4M, 또는 약 3.7M 내지 4.3M, 또는 약 3.8M 내지 4.2M, 또는 약 3.9M 내지 4.1M일 수 있다.

구아니딘염산의 함량이 너무 적으면 폴리페놀과 결합한 PVP를 침전시킬 수 없고, 그 결과 추출된 핵산이 폴리페놀로 오염될 수 있다. 또한 핵산이 실리카막과 결합하는 효율이 줄어들어 핵산의 추출효율이 감소할 수 있다. 너무 많으면 용액이 포화되어 3버퍼 조성물의 염화소듐 및 다른 첨가물이 석출될 수 있다.

또, Tris-HCl의 농도는 약 10mM 내지 20mM, 또는 약 12mM 내지 18mM, 또는 약 14mM 내지 16mM일 수 있다. Tris-HCl의 pH는 약 7.4일 수 있다. 제4 버퍼 조성물의 Tris-HCl 함량 내지는 농도는 제2 버퍼 조성물의 Tris-HCl 함량 보다 작을 수 있다.

Tris-HCl의 함량이 너무 적으면 완충효과가 줄어들 수 있고, 너무 많으면 pH가 급격히 증가 또는 기타 첨가물이 석출될 수 있다.

몇몇 실시예에서, 구아니딘염산과 Tris-HCl의 몰비는 250:1 내지 280:1, 또는 약 260:1 내지 270:1, 또는 약 265:1 내지 268:1, 또는 약 266:1 내지 267:1일 수 있다.

제4 버퍼 조성물의 제조 방법

제4 버퍼 조성물은 구아니딘염산을 혼합하고, Tris-HCl을 더 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.

예시적인 실시예에서, 제4 버퍼 조성물은 구아니딘염산(분말상)을 19.1g 및 1.0M Tris-HCl(pH 7.4)을 0.75ml 혼합하여 제조될 수 있다. 이 경우, 제조된 제4 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.

제4 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하, 또는 약 40ml 이하, 또는 약 30ml 이하일 수 있다.

제4 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.

제5 버퍼 조성물

제5 버퍼 조성물은 컬럼에 로딩 후 1차 세척 버퍼일 수 있다. 제5 버퍼 조성물은 이소프로판올, 염화소듐 및 비이온계 계면활성제를 포함할 수 있다. 특히 식물 조직에 다량 포함되어있는 클로로필 등 특유의 색소를 제거하는 것을 목적으로 할 수 있다.

이소프로판올의 농도는 약 55%(v/v, volume/volume) 내지 65%(v/v), 또는 약 60%(v/v)일 수 있다.

이소프로판올의 함량이 너무 적으면 핵산이 용해물에서 석출되지 않아 실리카막 등과 결합하기에 곤란하며, 너무 많으면 전체 혼합물의 부피가 증가하여 조작 난이도가 증가하고 또한, 핵산 이외의 물질도 석출되어 핵산의 오염도가 증가할 수 있다.

또, 염화소듐의 농도는 약 120mM 내지 180mM, 또는 약 130mM 내지 170mM, 또는 약 140mM 내지 160mM일 수 있다.

염화소듐의 함량이 너무 적으면 세척 시 실리카막 등의 고체지지상과 핵산의 결합력이 줄어들어 세척 과정에서 핵산을 잃을 수 있고, 너무 많으면 염화소듐이 석출되어 염화소듐의 오염도가 증가하는 등 세척 효율을 떨어트릴 수 있다.

비이온계 계면활성제의 농도는 약 0.1%(v/v) 내지 0.3%(v/v), 또는 약 0.15%(v/v) 내지 0.25%(v/v), 또는 약 0.2%(v/v)일 수 있다.

비이온계 게면활성제가 너무 적으면 실리카막 등의 고체지지상과 세척용 버퍼의 접촉부위가 감소할 수 있고 실리카막 자체의 소수성으로인해 세척 효율이 감소할 수 있다. 너무 많으면 과정 중 거품이 발생하여 조작 난이도가 증가하고 생성된 거품이 파괴될 때 비산되는 입자에 의해 시료간 오염 가능성이 증가할 수 있다.

제5 버퍼 조성물의 제조 방법

제5 버퍼 조성물은 이소프로판올, 염화소듐 및 비이온계 계면활성제를 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.

예시적인 실시예에서, 제5 버퍼 조성물은 99% 이소프로판올을 30ml, 5M 염화소듐을 1.5ml 및 99% 트윈-21(tween-21)을 10㎕ 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제5 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.

제5 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하일 수 있다. 제5 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.

제6 버퍼 조성물

제6 버퍼 조성물은 2차 세척 버퍼일 수 있다. 제6 버퍼 조성물은 에탄올, 구아니딘염산(Gu-HCl) 및 Tris-HCl을 포함할 수 있다. 특히 구아니딘염산을 첨가함으로써 단백질의 변성을 초래하여 실리카막 등 고체지지상에서 단백질을 제거하는 목적으로 사용할 수 있다.

에탄올의 농도는 약 55%(v/v, volume/volume) 내지 65%(v/v), 또는 약 60%(v/v)일 수 있다.

에탄올의 함량이 너무 적으면 핵산이 버퍼 조성물에 용해되어 세척 과정 중 핵산을 손실할 수 있고, 너무 많으면 첨가물인 구아니딘 염산이 석출되어 목적하는 바인 단백질 제거효율이 감소할 수 있다.

또, 구아니딘염산의 농도는 약 1.5M 내지 2.0M, 또는 약 1.6M 내지 1.8M, 또는 약 1.65M 내지 1.7M일 수 있다.

구아니딘염산의 함량이 너무 적으면 단백질의 변성효율이 감소하여 단백질 제거가 원활하게 이뤄질 수 없고 또한 핵산이 세척 과정 중 용출되어 핵산의 품질 및 수율이 감소할 수 있다. 너무 많으면, 이후 세척과정에서 구아니딘염산이 제거되지 않아 핵산추출 후 후속과정인 PCR, RT-PCR 등 분석과정을 방해할 수 있다.

Tris-HCl의 농도는 약 10mM 내지 20mM, 또는 약 12mM 내지 18mM, 또는 약 14mM 내지 16mM일 수 있다. Tris-HCl의 pH는 약 7.4일 수 있다. 제6 버퍼 조성물의 Tris-HCl 함량 내지는 농도는 제2 버퍼 조성물의 Tris-HCl 함량 보다 작을 수 있다.

제6 버퍼 조성물의 제조 방법

제6 버퍼 조성물은 에탄올, 구아니딘염산 및 Tris-HCl을 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.

예시적인 실시예에서, 제6 버퍼 조성물은 99% 에탄올을 30ml, 1.67M 구아니딘염산(분말상)을 7.98g 및 1.0M Tris-HCl(pH 7.4)을 0.75ml 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제6 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.

제6 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하일 수 있다. 제6 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.

제7 버퍼 조성물

제7 버퍼 조성물은 3차 세척 버퍼일 수 있다. 제7 버퍼 조성물은 에탄올, 염화소듐 및 Tris-HCl을 포함할 수 있다. 특히 앞선 조성물의 고농도염을 제거하는 목적과 남아있는 실리카막 또는 고체지지상에 남아있는 색소를 제거하는 것을 목적으로 할 수 있다.

에탄올의 농도는 약 70%(v/v) 내지 80%(v/v), 또는 약 71%(v/v) 내지 79%(v/v), 또는 약 72%(v/v) 내지 78%(v/v), 또는 약 73%(v/v) 내지 77%(v/v), 또는 약 74%(v/v) 내지 76%(v/v)일 수 있다.

에탄올의 함량이 너무 적으면 핵산이 고체지지상에서 용해되어 세척과정 중 핵산을 손실할 수 있다. 너무 많으면 잔여 염류가 용해되지 않아 마지막 추출과정에서 염이 함께 용출될 수 있다.

염화소듐의 농도는 약 15mM 내지 25mM, 또는 약 16mM 내지 24mM, 또는 약 17mM 내지 23mM, 또는 약 18mM 내지 22mM, 또는 약 19mM 내지 21mM일 수 있다.

제7 버퍼 조성물의 제조 방법

제7 버퍼 조성물은 에탄올, 염화소듐 및 Tris-HCl을 혼합하여 제조될 수 있다. 각 성분의 몰(mol), 부피(ml) 및 중량(g) 기반 함량과 농도, 그리고 대체 가능한 물질은 전술한 바와 같다.

예시적인 실시예에서, 제7 버퍼 조성물은 99% 에탄올 37.5ml, 5M 염화소듐 0.2ml 및 1M Tris-HCl(pH 7.4)을 0.75ml 혼합하여 제조할 수 있다. 이 경우, 제조된 제7 버퍼 조성물의 부피는 약 50ml일 수 있다.

제7 버퍼 조성물의 총량(부피)은 약 100ml 이하, 또는 약 90ml 이하, 또는 약 80ml 이하, 또는 약 70ml 이하, 또는 약 60ml 이하, 또는 약 50ml 이하일 수 있다. 제7 버퍼 조성물의 총량의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 고품질의 핵산 추출 측면에서 약 300㎕ 이상, 또는 약 350㎕ 이상, 또는 약 400㎕ 이상, 또는 약 450㎕ 이상, 또는 약 500㎕ 이상, 또는 약 550㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 650㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 750㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 850㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 950㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다.

폴리 페놀 및/또는 다당류를 풍부하게 함유하는 시료로부터 핵산의 추출 방법

도 1은 및 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산의 추출 방법을 나타낸 순서도이다.

본 발명에 따른 핵산의 추출 방법은 시료와 제1 버퍼를 혼합하는 단계(S10), 환원제를 더 혼합하여 시료를 파쇄하는 단계(S20), 제2 버퍼를 더 혼합하고 이를 배양하는 단계(S30), 제3 버퍼를 더 혼합하고 이를 배양 및 원심 분리하는 단계(S40), 제4 버퍼를 더 혼합하고 이를 원심 분리하는 단계(S50), 이소프로판올을 더 혼합하여 컬럼에 로딩하는 단계(S60)를 포함하고, 제5 버퍼로 세척하는 단계(S70), 제6 버퍼로 세척하는 단계(S80), 및 제7 버퍼로 세척하는 단계(S90)를 더 포함할 수 있다.

우선 시료를 준비한다. 예시적인 실시예에서, 시료는 식물, 식물의 잎, 식물의 과육, 식물의 줄기 및/또는 식물의 뿌리로부터 유래한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 식물은 배, 바나나, 딸기, 망고, 포도, 토마토, 복숭아, 애기장대 또는 파인애플 등 폴리페놀과 다당류를 풍부하게 함유한 터프한 식물일 수 있다. 전술한 바와 같이 종래의 핵산 추출 방법에 있어서, 폴리페놀 및/또는 다당류는 저해제(inhibitor)로 기능하기 때문에 터프한 식물로부터 고품질의 핵산을 추출하는 것은 극히 곤란하였다. 그러나 전술한 버퍼 조성물들, 그리고 후술할 핵산의 추출 방법에 따를 경우 고품질의 핵산 추출이 가능하며, 진단 결과의 신뢰성과 정확성을 높이고 진단에 소요되는 시간을 현저하게 단축시킬 수 있다.

그리고 시료와 제1 버퍼를 혼합한다(S10). 시료 100mg을 기준으로 제1 버퍼는 약 350㎕ 내지 450㎕, 또는 약 360㎕ 내지 440㎕, 또는 약 370㎕ 내지 430㎕, 또는 약 380㎕ 내지 420㎕, 또는 약 390㎕ 내지 410㎕ 혼합될 수 있다. 제1 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.

그 다음 튜브에 환원제를 더 혼합한다(S20). 환원제는 β-메르캅토에탄올(beta-mercaptoethanol)(99% 용액), 0.5M TCEP-HCl 또는 1M 디티오트레톨(dithiothreitol, DTT)을 포함할 수 있다. 제1 버퍼와 환원제의 사용 부피비는 약 1:0.07 내지 1:0.16, 또는 약 1:0.08 내지 1:0.15, 또는 약 1:0.08 내지 1:0.13일 수 있다. 예를 들어, 환원제는 약 30㎕ 내지 70㎕, 또는 약 40㎕ 내지 60㎕, 또는 약 50㎕ 혼합될 수 있다. 환원제는 RNA 분해 효소의 불활성화에 기여할 수 있다. 환원제를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.

그리고 시료, 제1 버퍼 및 환원제를 혼합된 튜브를 흔들어 시료를 파쇄한다. 시료를 파쇄하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 비드 비팅 튜브(bead beating tube)를 이용하거나, 액체 질소 파쇄법을 이용할 수 있으며, 시료의 상태, 예컨대 수분 함유량 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다.

그 다음 튜브에 제2 버퍼를 더 혼합한다(S30). 제1 버퍼와 제2 버퍼의 사용 부피비는 약 1:1.05 내지 1:1.25, 또는 약 1:1.1 내지 1:1.2일 수 있다. 예를 들어, 제2 버퍼는 약 400㎕ 내지 500㎕, 또는 약 410㎕ 내지 490㎕, 또는 약 420㎕ 내지 480㎕, 또는 약 430㎕ 내지 470㎕, 또는 약 440㎕ 내지 460㎕ 혼합될 수 있다. 제2 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다. 제2 버퍼를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.

그리고 제2 버퍼가 혼합된 혼합물을 약 55℃ 내지 65℃, 또는 약 60℃의 조건 하에서 약 2분 내지 8분, 또는 약 3분 내지 7분 동안 배양한다(제1 배양 단계).

전술한 제1 버퍼를 혼합하고, 환원제를 혼합하고, 제2 버퍼를 혼합 및 배양하는 단계를 통해 핵산을 용출시키며 RNA 분해 효소를 불활성화시킬 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.

그 다음 튜브에 제3 버퍼를 더 혼합한다(S40). 제1 버퍼와 제3 버퍼의 사용 부피비는 약 1:0.5 내지 1:0.9, 또는 약 1:0.6 내지 1:0.8, 또는 약 1:0.65 내지 1:0.75일 수 있다. 예를 들어, 제3 버퍼는 약 250㎕ 내지 350㎕, 또는 약 260㎕ 내지 340㎕, 또는 약 270㎕ 내지 330㎕, 또는 약 280㎕ 내지 320㎕, 또는 약 290㎕ 내지 310㎕ 혼합될 수 있다. 제3 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다. 제3 버퍼를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.

그리고 제3 버퍼가 혼합된 혼합물을 실온, 예컨대 약 20℃ 내지 30℃의 조건 하에서 약 30초 내지 5분, 또는 약 1분 내지 3분 동안 배양한다(제2 배양 단계).

또, 배양된 배양물을 원심 분리한다(제1 원심 분리 단계). 원심 분리는 0℃ 내지 10℃, 또는 약 2℃ 내지 8℃, 또는 약 3℃ 내지 7℃, 또는 약 4℃ 내지 6℃의 조건 하에서 약 10,000rpm 내지 20,000rpm, 또는 약 11,000rpm 내지 18,000rpm, 또는 약 12,000rpm 내지 17,000rpm의 속도로 약 3분 내지 10분, 또는 약 4분 내지 7분 동안 수행될 수 있다.

전술한 제3 버퍼를 혼합 및 배양하는 단계를 통해 단백질과 다당류를 적어도 부분적으로 제거할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.

그 다음 원심 분리된 상층액(제1 원심 분리 단계의 상층액), 예를 들어 상층액 대략 2.0ml을 취하여 다른 튜브에 넣고, 제4 버퍼와 혼합한다(S50). 제1 버퍼와 제4 버퍼의 사용 부피비는 약 1:0.8 내지 1:1.2, 또는 약 1:0.9 내지 1:1.1일 수 있다. 다른 측면에서, 제1 원심 분리 단계의 상층액과 제4 버퍼의 부피비는 약 1:0.1 내지 1:0.3, 또는 약 1:0.15 내지 1:0.25일 수 있다. 예를 들어, 제4 버퍼는 약 350㎕ 내지 450㎕, 또는 약 360㎕ 내지 440㎕, 또는 약 370㎕ 내지 430㎕, 또는 약 380㎕ 내지 420㎕, 또는 약 390㎕ 내지 410㎕ 혼합될 수 있다. 제4 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다. 제4 버퍼를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.

그리고 제4 버퍼가 혼합된 혼합물을 예컨대 약 20℃ 내지 30℃의 조건 하에서 약 30초 내지 5분, 또는 약 1분 내지 3분 동안 배양한다(제3 배양 단계).

또, 배양된 배양물을 원심 분리한다(제2 원심 분리 단계). 원심 분리는 0℃ 내지 10℃, 또는 약 2℃ 내지 8℃, 또는 약 3℃ 내지 7℃, 또는 약 4℃ 내지 6℃의 조건 하에서 약 10,000rpm 내지 20,000rpm, 또는 약 11,000rpm 내지 18,000rpm, 또는 약 12,000rpm 내지 17,000rpm의 속도로 약 1분 내지 8분, 또는 약 2분 내지 5분 동안 수행될 수 있다.

전술한 제4 버퍼를 혼합 및 배양하는 단계를 통해 폴리페놀을 적어도 부분적으로 제거할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.

그 다음 원심 분리된 상층액(제2 원심 분리 단계의 상층액), 예를 들어 상층액 대략 900㎕ 내지 1,100㎕를 취하여 다른 튜브에 넣고, 이소프로판올과 혼합한다(S60). 이소프로판올의 혼합량은 약 400㎕ 내지 600㎕, 또는 약 450㎕ 내지 550㎕일 수 있다. 예를 들어, 제2 원심 분리의 상층액과 이소프로판올의 혼합 비율(v/v)은 약 1:1.5 내지 1:2.5, 또는 약 1:1.8 내지 1:2.3, 또는 약 1:2.0일 수 있다. 이소프로판올을 혼합한 후 완전히 흔들어 혼합시켜주는 것이 바람직하다.

그리고 이소프로판올 혼합물을 컬럼에 로딩한다. 예를 들어, 이소프로판올 혼합물을 스핀 컬럼에 로딩하여 핵산의 추출을 시작할 수 있다. 컬럼에 로딩하는 단계는 두번 이상으로 나누어 진행할 수 있다. 컬럼은 양이온 금속 비드, 또는 양이온 흡착 섬유로 패킹된 핵산 흡착성 컬럼일 수 있다.

다만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 컬럼을 이용한 회수 대신에 에탄올 침전법, 핵산 침전법, 또는 자성 비드법 등을 이용할 수도 있다.

그 다음 제5 버퍼로 세척한다(S70). 세척에 사용되는 제5 버퍼의 양은 약 500㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다. 제5 버퍼 양의 상한은 특별히 제한되지 않으나, 약 1,500㎕ 이하일 수 있다. 제5 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.

세척은 원심 분리를 통해 수행될 수 있다. 원심 분리는 0℃ 내지 10℃, 또는 약 2℃ 내지 8℃, 또는 약 3℃ 내지 7℃, 또는 약 4℃ 내지 6℃의 조건 하에서 약 10,000rpm 내지 20,000rpm, 또는 약 11,000rpm 내지 18,000rpm, 또는 약 12,000rpm 내지 17,000rpm의 속도로 약 10초 내지 60초, 또는 약 20초 내지 50초, 또는 약 30초 내지 40초 수행될 수 있다.

본 단계를 통해 시료의 색소를 제거할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.

몇몇 실시예에서, 제5 버퍼를 이용한 세척 단계 이후, DNA 분해 효소(DNAse) 처리를 더 수행할 수 있다. DNA 분해 효소 처리 및 처리 조건 등에 대해서는 공지의 방법을 이용할 수 있다. DNA 분해 효소를 이용하여 유전체 DNA(genomic DNA)를 제거할 수 있다.

그 다음 제6 버퍼로 세척한다(S80). 세척에 사용되는 제6 버퍼의 양은 약 500㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다. 제6 버퍼의 양은 제5 버퍼의 양 보다 작을 수 있다. 제6 버퍼 양의 상한은 특별히 제한되지 않으나, 약 1,500㎕ 이하일 수 있다. 제6 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.

몇몇 실시예에서, 제6 버퍼를 로딩한 후 원심 분리 전에 소정의 시간 동안 대기하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 약 10초 내지 60초, 또는 약 20초 내지 50초, 또는 약 30초 내지 40초 동안 대기한 이후 원심 분리를 수행할 수 있다.

본 단계를 통해 분해된 DNA와 DNA 분해 효소를 제거하고, 잔존하는 토탈 RNA(total RNA)를 재결합할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.

그 다음 제7 버퍼로 세척한다(S90). 세척에 사용되는 제7 버퍼의 양은 약 500㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다. 제7 버퍼의 양은 제5 버퍼의 양 보다 작을 수 있다. 제7 버퍼 양의 상한은 특별히 제한되지 않으나, 약 1,500㎕ 이하일 수 있다. 제7 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.

몇몇 실시예에서, 제7 버퍼를 이용한 세척 단계는 복수번 수행될 수 있다. 즉, 제7 버퍼를 로딩 후 원심 분리를 수행하고, 다시 제7 버퍼를 로딩 후 원심 분리를 수행할 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

본 단계를 통해 잔존하는 염(salt)을 제거할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.

이후 도면으로 표시하지 않았으나, 컬럼을 건조하여 에탄올을 제거하고, 핵산 분해효소 free water 또는 그에 준하는 저염 버퍼를 컬럼에 넣고 원심 분리하여 RNA 또는 DNA를 회수하는 등의 단계를 더 포함하여 핵산을 회수 내지는 추출할 수 있다.

RNA 분해 효소를 풍부하게 함유하는 시료로부터 핵산의 추출 방법

도 3은 및 도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 핵산의 추출 방법을 나타낸 순서도이다.

본 발명에 따른 핵산의 추출 방법은 시료와 제4 버퍼를 혼합하는 단계(S10), 환원제를 더 혼합하여 시료를 파쇄하는 단계(S20), 제3 버퍼를 더 혼합하고 이를 배양하는 단계(S30), 제1 버퍼를 더 혼합하고 이를 배양 및 원심 분리하는 단계(S40), 제4 버퍼를 추가로 더 혼합하고 배양하는 단계(S50), 제2 버퍼를 더 혼합하고 이를 배양 및 원심 분리하는 단계(S60), 이소프로판올을 더 혼합하여 컬럼에 로딩하는 단계(S70)를 포함하고, 제5 버퍼로 세척하는 단계(S80), 제6 버퍼로 세척하는 단계(S90), 및 제7 버퍼로 세척하는 단계(S100)를 더 포함할 수 있다.

우선 시료를 준비한다. 예시적인 실시예에서, 시료는 식물, 식물의 잎, 식물의 과육, 식물의 줄기 및/또는 식물의 뿌리로부터 유래한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 식물은 고추 또는 피망 등 RNA 분해 효소를 풍부하게 함유한 터프한 식물일 수 있다. 전술한 바와 같이 종래의 핵산 추출 방법에 있어서, RNA 분해 효소는 저해제(inhibitor)로 기능하기 때문에 이러한 식물로부터 고품질의 핵산을 추출하는 것은 극히 곤란하였다. 그러나 전술한 버퍼 조성물들, 그리고 후술할 핵산의 추출 방법에 따를 경우 고품질의 핵산 추출이 가능하며, 진단 결과의 신뢰성과 정확성을 높이고 진단에 소요되는 시간을 현저하게 단축시킬 수 있다.

그리고 시료와 제4 버퍼를 혼합한다(S10). 시료 100mg을 기준으로 제4 버퍼는 약 350㎕ 내지 450㎕, 또는 약 360㎕ 내지 440㎕, 또는 약 370㎕ 내지 430㎕, 또는 약 380㎕ 내지 420㎕, 또는 약 390㎕ 내지 410㎕ 혼합될 수 있다. 제4 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.

그 다음 튜브에 환원제를 더 혼합한다(S20). 환원제는 β-메르캅토에탄올(beta-mercaptoethanol)(99% 용액), 0.5M TCEP-HCl 또는 1M 디티오트레톨(dithiothreitol, DTT)을 포함할 수 있다. 제4 버퍼와 환원제의 사용 부피비는 약 1:0.07 내지 1:0.16, 또는 약 1:0.08 내지 1:0.15, 또는 약 1:0.08 내지 1:0.13일 수 있다. 예를 들어, 환원제는 약 30㎕ 내지 70㎕, 또는 약 40㎕ 내지 60㎕, 또는 약 50㎕ 혼합될 수 있다. 환원제는 RNA 분해 효소의 불활성화에 기여할 수 있다. 환원제를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.

그리고 시료, 제4 버퍼 및 환원제를 혼합된 튜브를 흔들어 시료를 파쇄한다. 시료를 파쇄하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 비드 비팅 튜브(bead beating tube)를 이용하거나, 액체 질소 파쇄법을 이용할 수 있으며, 시료의 상태, 예컨대 수분 함유량 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다.

그 다음 튜브에 제3 버퍼를 더 혼합한다(S30). 제4 버퍼와 제3 버퍼의 사용 부피비는 약 1:1.05 내지 1:1.25, 또는 약 1:1.1 내지 1:1.2일 수 있다. 예를 들어, 제3 버퍼는 약 400㎕ 내지 500㎕, 또는 약 410㎕ 내지 490㎕, 또는 약 420㎕ 내지 480㎕, 또는 약 430㎕ 내지 470㎕, 또는 약 440㎕ 내지 460㎕ 혼합될 수 있다. 제3 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다. 제3 버퍼를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.

그리고 제3 버퍼가 혼합된 혼합물을 약 55℃ 내지 65℃, 또는 약 60℃의 조건 하에서 약 2분 내지 8분, 또는 약 3분 내지 7분 동안 배양한다(제1 배양 단계).

전술한 제4 버퍼를 혼합하고, 환원제를 혼합하고 시료를 파쇄하며, 제3 버퍼를 혼합 및 배양하는 단계를 통해 핵산을 용출시키고 RNA 분해 효소를 불활성화시킬 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.

그 다음 튜브에 제1 버퍼를 더 혼합한다(S40). 제4 버퍼와 제1 버퍼의 사용 부피비는 약 1:0.5 내지 1:0.9, 또는 약 1:0.6 내지 1:0.8, 또는 약 1:0.65 내지 1:0.75일 수 있다. 예를 들어, 제1 버퍼는 약 250㎕ 내지 350㎕, 또는 약 260㎕ 내지 340㎕, 또는 약 270㎕ 내지 330㎕, 또는 약 280㎕ 내지 320㎕, 또는 약 290㎕ 내지 310㎕ 혼합될 수 있다. 제1 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다. 제1 버퍼를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.

그리고 제1 버퍼가 혼합된 혼합물을 원심 분리한다(제1 원심 분리 단계). 원심 분리는 0℃ 내지 10℃, 또는 약 2℃ 내지 8℃, 또는 약 3℃ 내지 7℃, 또는 약 4℃ 내지 6℃의 조건 하에서 약 10,000rpm 내지 20,000rpm, 또는 약 11,000rpm 내지 18,000rpm, 또는 약 12,000rpm 내지 17,000rpm의 속도로 약 3분 내지 10분, 또는 약 4분 내지 7분 동안 수행될 수 있다.

폴리페놀의 산화 및 흡착을 위해 제1 버퍼가 추가로 혼합되며 이후 원심분리하는 단계를 통해 제3 버퍼의 성분이 다당류를 적어도 부분적으로 제거할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.

몇몇 실시예에서, 그 다음 원심 분리된 상층액(제1 원심 분리 단계의 상층액), 예를 들어 상층액 대략 2.0ml을 취하여 다른 튜브에 넣고, 제4 버퍼와 혼합한다(S50). 즉, 제4 버퍼를 추가로 혼합할 수 있다. 최초 혼합된 제4 버퍼와 본 단계에서 혼합된 제4 버퍼의 사용 부피비는 약 1:0.9 내지 1:1.1, 또는 약 1:1일 수 있다.

제1 버퍼를 추가하며 제1 버퍼의 구성물질에 의해 폴리페놀이 흡착된다 (S40). 이후 제4 버퍼를 추가로 넣어 구아니딘염의 농도를 높여 폴리페놀을 흡착한 폴리비닐피롤리돈이 응집되도록 한다.

다른 실시예에서, 2차 제4 버퍼의 혼합 단계(S50)는 생략될 수도 있다.

그리고 제4 버퍼가 추가로 혼합된 혼합물(또는 제1 버퍼의 혼합물)을 실온, 예를 들어 약 20℃ 내지 30℃의 조건 하에서 약 30분 내지 5분, 또는 약 1분 동안 배양한다(제2 배양 단계).

그 다음 튜브에 제2 버퍼를 더 혼합한다(S60). 제4 버퍼와 제2 버퍼의 사용 부피비는 약 1:0.8 내지 1:1.2, 또는 약 1:0.9 내지 1:1.1일 수 있다. 예를 들어, 제2 버퍼는 약 350㎕ 내지 450㎕, 또는 약 360㎕ 내지 440㎕, 또는 약 370㎕ 내지 430㎕, 또는 약 380㎕ 내지 420㎕, 또는 약 390㎕ 내지 410㎕ 혼합될 수 있다. 제2 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다. 제2 버퍼를 혼합한 후 튜브를 흔들어 완전히 혼합시켜주는 것이 바람직하다.

그리고 제2 버퍼가 혼합된 혼합물을 실온, 예를 들어 약 20℃ 내지 30℃의 조건 하에서 약 30초 내지 5분, 또는 약 1분 내지 3분 동안 배양한다(제3 배양 단계).

전술한 제2 버퍼를 혼합 및 배양하는 단계를 통해 분쇄된 시료를 용해하고 단백질을 흡착시켜 부분적으로 제거할 수 있으며 이후 원심분리를 통해 흡착된 단백질과 제1 버퍼와 제4 버퍼에 의해 응집된 폴리페놀을 부분적으로 제거할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니다.

그 다음 원심 분리된 상층액(제2 원심 분리 단계의 상층액), 예를 들어 상층액 대략 900㎕ 내지 1,100㎕를 취하여 다른 튜브에 넣고, 이소프로판올과 혼합한다(S70). 이소프로판올의 혼합량은 약 400㎕ 내지 600㎕, 또는 약 450㎕ 내지 550㎕일 수 있다. 예를 들어, 제2 원심 분리의 상층액과 이소프로판올의 혼합 비율(v/v)은 약 1:1.5 내지 1:2.5, 또는 약 1:1.8 내지 1:2.3, 또는 약 1:2.0일 수 있다. 이소프로판올을 혼합한 후 완전히 흔들어 혼합시켜주는 것이 바람직하다.

그 다음 제5 버퍼로 세척한다(S80). 세척에 사용되는 제5 버퍼의 양은 약 500㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다. 제5 버퍼 양의 상한은 특별히 제한되지 않으나, 약 1,500㎕ 이하일 수 있다. 제5 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.

그 다음 제6 버퍼로 세척한다(S90). 세척에 사용되는 제6 버퍼의 양은 약 500㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다. 제6 버퍼의 양은 제5 버퍼의 양 보다 작을 수 있다. 제6 버퍼 양의 상한은 특별히 제한되지 않으나, 약 1,500㎕ 이하일 수 있다. 제6 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.

그 다음 제7 버퍼로 세척한다(S100). 세척에 사용되는 제7 버퍼의 양은 약 500㎕ 이상, 또는 약 600㎕ 이상, 또는 약 700㎕ 이상, 또는 약 800㎕ 이상, 또는 약 900㎕ 이상, 또는 약 1,000㎕ 이상일 수 있다. 제7 버퍼의 양은 제5 버퍼의 양 보다 작을 수 있다. 제7 버퍼 양의 상한은 특별히 제한되지 않으나, 약 1,500㎕ 이하일 수 있다. 제7 버퍼에 대해서는 전술한 바 있으므로 중복되는 설명은 생략한다.

바이러스 진단

본 발명에 따라 핵산을 추출한 이후 바이러스의 유무를 진단할 수 있다. 바이러스 유무의 진단을 위해 증폭하는 방법은 공지의 증폭 방법, 예를 들어 PCR법, Nested-PCR법, RT-PCR법, ICAN법, UCAN법, LAMP법 등을 이용할 수 있다.

PCR법은 특정 DNA 영역을 사이에 둔 2종류의 프라이머와 DNA 중합효소에 의한 DNA 합성반응의 반복을 통해 해당 DNA 영역을 증폭하는 방법으로, 경우에 따라 Nested-PCR법 및 RT(real-time) PCR법을 포괄하는 용어로 사용될 수 있다.

Nested-PCR법은 외측의 프라이머와 내측의 프라이머를 사용하여 2단계의 PCR을 수행하는 방법이다. 1회차에서 표적 핵산이 충분히 증폭되지 않는 경우에도, 2회차에서 더욱 증폭시키는 것이 가능하다. 또, 1회차 PCR에서 비특이적 증폭 산물이 생성된 경우, 이들 비특이적 증폭 산물은 2회차 PCR에서의 프라이머와 유사한 배열을 가질 확률이 낮고, 따라서 2회차 PCR에서는 표적의 배열을 갖는 단편 만을 증폭할 확률이 높아질 수 있다. RT-PCR은 PCR의 전 단계로서, 역전사효소를 이용하여 역전사 반응을 수행하는 단계를 포함하는 PCR법이다.

핵산의 증폭 이후 진단 시약을 혼합하여 증폭된 핵산 시료에 표적 DNA가 존재하는지 검출하는 단계를 수행할 수 있다. 검출 단계는 프로브 분석 반응(probe assay), 혼성화 분석 반응(hybridization assay), 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석 반응(oligonucleotide ligation assay), PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction) 등에 사용되는 시약을 이용해 수행될 수 있다.

또, 표적 DNA의 검출은 DNA 칩, 겔 전기 영동법, 방사성 측정, 형광/인광 측정 등을 통해 수행될 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되지 않음은 물론이다.

검출 대상 바이러스는 apple necrosis 바이러스(NC040469, NC040470, NC040471 등), banana bunchy top 바이러스(NC003473, NC003474, NC003475, NC003476, NC003477, NC003479 등), cherry leaf roll 바이러스(NC015414, NC015415 등), cherry necrotic rusty mottle 바이러스(NC002468 등), citrus psorosis 바이러스(NC006314, NC006315, NC006316 등), citrus ringspot 바이러스(NC003093 등), citrus vein enation 바이러스(NC021564 등), grapevine fanleaf 바이러스(NC003615, NC003623 등), peach phony 바이러스, peach rosette mosaic 바이러스, peach wart 바이러스, plum line pattern 바이러스(NC003451, NC003452, NC003453 등), prune dwarf 바이러스(NC008037, NC008038, NC008039 등), raspberry ringspot 바이러스(NC005266, NC005267 등), tomato black ring 바이러스(NC004439, NC004440 등), 또는 tomato bushy stunt 바이러스(NC001554 등)일 수 있으나 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실험예를 참조하여 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1. 버퍼의 제조

실시예 1-1. 제1 버퍼의 제조

2M의 Tris-HCl(pH 7.0)을 25ml, 0.5M의 EDTA를 2.5ml, 메타중아황산나트륨(분말상)을 0.25g, PVP K30(분말상)을 1.0g 혼합하여 최종부피가 50ml가 되도록 혼합하였다. 제1 버퍼의 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.

실시예 1-2. 제2 버퍼의 제조

20%의 SDS를 12.5ml, 0.5M의 EDTA를 2.5ml, 소듐 시트레이트(분말상)을 1.93g, 1M의 Tris-HCl(pH 7.4)을 1.0ml 혼합하여 최종부피가 50ml가 되도록 혼합하였다. 제2 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.

실시예 1-3. 제3 버퍼의 제조

5M의 염화소듐을 45ml, 염화칼륨(분말상)을 0.37g, 소듐 시트레이트(분말상)을 1.93g, PVP K30(분말상)을 1.0g 혼합하여 최종부피가 50ml가 되도록 혼합하였다. 제3 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.

실시예 1-4. 제4 버퍼의 제조

구아니딘염산(Gu-HCl)(분말상)을 19.1g, 1M의 Tris-HCl(pH 7.4) 0.75ml 혼합하여 최종부피가 50ml가 되도록 혼합하였다. 제4 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.

실시예 1-5. 제5 버퍼의 제조

99% 이소프로판올 용액을 30ml, 5M의 염화소듐을 1.5ml, 99% 트윈-21 용액을 10㎕ 혼합하여 최종부피가 50mL가 되도록 혼합하였다. 제5 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.

실시예 1-6. 제6 버퍼의 제조

99% 에탄올 용액을 30ml, 구아니딘염산(Gu-HCl)(분말상)을 7.976g, 1M의 Tris-HCl(pH 7.4)을 0.75ml 혼합하여 최종부피가 50mL가 되도록 혼합하였다. 제6 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.

실시예 1-7. 제7 버퍼의 제조

99% 에탄올 용액을 37.5ml, 5M의 염화소듐을 0.2ml, 1M의 Tris-HCl(pH 7.4)을 0.75ml 혼합하여 최종부피가 50mL가 되도록 혼합하였다. 제7 버퍼의 최종 pH는 7.0 내지 7.4 범위에 있었다.

실시예 2. 바나나 등으로부터 RNA 추출

실시예 2-1. 시료 준비 및 제1 버퍼 혼합

시료로 망고, 딸기, 포도, 토마토, 복숭아, 바나나, 배의 잎을 준비하였다. 그리고 비드 비팅 튜브(2ml)에 대상 시료 100mg와 제1 버퍼 400㎕, 및 99% β-메르캅토에탄올 50㎕를 넣고 5m/s 조건으로 60초 동안 파쇄하였다. 이후 강하게 볼텍싱(vortexing)한 후 스핀 다운(spin-down)하였다.

실시예 2-2. 제2 버퍼 혼합

실시예 2-1의 결과물에 제2 버퍼 450㎕을 넣고 강하게 볼텍싱 한 후 60℃에서 5분간 배양하였다.

실시예 2-3. 제3 버퍼 혼합

실시예 2-2의 결과물에 제3 버퍼 300㎕을 넣고 강하게 볼텍싱 한 후 실온에서 1분간 배양하였다. 그리고 배양물을 4℃에서 13,000rpm으로 5분간 원심 분리하였다.

실시예 2-4. 제4 버퍼 혼합

실시예 2-3의 결과물의 상층액 전량을 2ml 튜브에 옮겨 담았다. 그 다음 제4 버퍼 400㎕을 넣고 강하게 볼텍싱 한 후 실온에서 1분간 배양하였다. 그리고 배양물을 4℃에서 13,000rpm으로 5분간 원심 분리하였다.

실시예 2-5. 이소프로판올 혼합물 로딩 및 제5 버퍼 세척

실시예 2-4의 결과물의 상층액 900㎕를 2ml 튜브에 옮겨 담았다. 그 다음 이소프로판올 450㎕을 넣고 강하게 볼텍싱하였다.

그리고 스핀 컬럼에 600㎕씩 로딩하여 원심 분리하였다. 그리고 제5 버퍼 700㎕ 투입 후 4℃에서 13,000rpm으로 30초 간 원심 분리하여 1회 세척하였다.

실시예 2-6. DNase 처리 및 제6 버퍼 세척

이어서 제 5버퍼가 통과한 스핀 컬럼 멤브레인에 DNAse 용액 (DNase 5 내지 10 unit, DNase buffer) 50uL를 투입 후 실온에서 15분간 반응한다. 반응 종료 후 제6 버퍼 600㎕ 투입 후 60초간 대기하고 다음으로 4℃에서 13,000rpm으로 30초 간 원심 분리하여 1회 세척하였다.

실시예 2-7. 제7 버퍼 세척

이어서 제7 버퍼 600㎕ 투입 후 4℃에서 13,000rpm으로 30초 간 원심 분리하여 세척하였다. 이를 한번 더 반복하여 총 2회 세척하였다.

실시예 2-8. 핵산 회수 및 전기 영동

이어서 4℃에서 13,000rpm으로 2분 간 원심 분리하고, RNAse free water 50㎕를 투입하여 4℃에서 13,000rpm으로 30초 동안 원심 분리하였다. 회수된 RNA를 Agarose 2%, 0.5X TBE로 구성된 Bleach gel에 200ng을 정량하여 전기 영동하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 버퍼들 및 추출 방법을 이용할 경우 대상 시료 7가지에서 모두 우수한 품질의 핵산을 추출하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 3. 고추로부터 RNA 추출

실시예 3-1. 시료 준비 및 제4 버퍼 혼합

시료로 고추의 잎을 준비하였다. 그리고 비드 비팅 튜브(2ml)에 대상 시료 100mg와 제4 버퍼 400㎕, 및 99% β-메르캅토에탄올 50㎕를 넣고 5m/s 조건으로 60초 동안 파쇄하였다. 이후 강하게 볼텍싱(vortexing)한 후 스핀 다운(spin-down)하였다.

실시예 3-2. 제3 버퍼 혼합

실시예 3-1의 결과물에 제3 버퍼 450㎕을 넣고 강하게 볼텍싱 한 후 60℃에서 5분간 배양하였다.

실시예 3-3. 제1 버퍼 혼합

실시예 3-2의 결과물에 제1 버퍼 300㎕을 넣고 강하게 볼텍싱 한 후 배양물을 4℃에서 13,000rpm으로 5분간 원심 분리하였다.

실시예 3-4. 제2 버퍼 혼합

실시예 3-3의 결과물에 제2 버퍼 450㎕을 넣고 강하게 볼텍싱 한 후 실온에서 1분간 배양하였다. 그리고 배양물을 4℃에서 13,000rpm으로 3분간 원심 분리하였다.

실시예 3-5. 이소프로판올 혼합물 로딩 및 제5 버퍼 세척

실시예 3-4의 결과물의 상층액 800㎕를 2ml 튜브에 옮겨 담았다. 그 다음 이소프로판올 400㎕을 넣고 강하게 볼텍싱하였다.

실시예 3-6. DNase 처리 및 제6 버퍼 세척

이어서 제5 버퍼가 통과한 스핀 컬럼 멤브레인에 DNAse 용액 (DNase 5 내지 10 unit, DNase buffer) 50uL를 투입 후 실온에서 15분간 반응한다. 반응 종료 후 제6 버퍼 600㎕ 투입 후 60초간 대기하고 다음으로 4℃에서 13,000rpm으로 30초 간 원심 분리하여 1회 세척하였다.

실시예 3-7. 제7 버퍼 세척

실시예 3-8. 핵산 회수 및 전기 영동

이어서 4℃에서 13,000rpm으로 2분 간 원심 분리하고, RNAse free water 50㎕를 투입하여 4℃에서 13,000rpm으로 30초 동안 원심 분리하였다. 회수된 RNA를 Agarose 2%, 0.5X TBE로 구성된 Bleach gel에 400ng을 정량하여 전기 영동하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 본 발명에 따른 버퍼들 및 추출 방법을 이용할 경우 고추 시료에서 우수한 품질의 핵산을 추출하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 제4 버퍼의 2차 사용

실시예 3-3과 실시예 3-4 사이에 제4 버퍼를 2차로 혼합한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. 2차 제4 버퍼는 400㎕ 혼합하였다.

도 7을 참조하면, 2차로 제4 버퍼를 혼합한 경우에도 우수한 품질의 핵산을 추출하는 것을 확인할 수 있었다.

비교예 1. 타사 제품을 이용한 핵산 회수

비교예 1-1. QIAGEN N.V.사

QIAGEN N.V. (hilden, Germany)사의 RNeasy plant mini kit을 사용하여 망고(MG), 딸기(SB), 포도(GV), 토마토(TM), 복숭아(PC), 바나나(BN), 배나무(PA), 고추(PP)에서 핵산을 추출하였고 추출한 핵산을 전기 영동한 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8을 참조하면, 토마토(TM)와 복숭아(PC)를 제외한 다른 시료에서는 추출된 RNA의 품질 및 수율이 낮았고 분해된 양상을 보였다.

즉, 퀴아젠 사에서 시판 중인 RNeasy 플랜트 미니 키트(RNeasy plant mini kit) 및 그것의 프로토콜에 의해서는 다양한 식물에 범용적으로 적용할 수 없었다.

참고로 퀴아젠 사의 플랜트 미니 키트는 식물의 종류에 따라 프로토콜을 다르게 제시하고 있지 않다.

비교예 1-2. Norgen Biotek Corp.사

Norgen Biotek Corp. (Thorold, Canada)사의 Plant RNA/DNA Purification Kit (Cat. 24400)을 사용하여 망고(MG), 딸기(SB), 포도(GV), 토마토(TM), 복숭아(PC), 바나나(BN), 배나무(PA), 고추(PP)에서 핵산을 추출하였고 추출한 핵산을 전기 영동한 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9를 참조하면, 망고(MG)에서는 핵산이 분해된 양상으로 나타났고. 배나무(PA)에선 핵산 이외의 산물이 함께 추출되어 band가 끌리는 현상을 나타내고 있으며 고추(PP)의 경우 28S rRNA 같은 보다 큰 분자의 RNA는 완전히 분해된 양상을 나타내었다.

즉, 노르겐 바이오텍 사에서 시판 중인 플랜트 핵산 정제 키트(Plant RNA/DNA Purification Kit)를 이용해서는 다양한 식물에 범용적으로 적용할 수 없었다.

참고로 노르겐 사의 플랜트 키트는 식물의 종류에 따라 프로토콜을 다르게 제시하고 있지 않다.

비교예 2. 다른 시료를 대상으로 한 핵산 회수

비교예 2-1. 실시예 2의 프로토콜을 이용한 고추 핵산 회수

시료로 고추잎을 이용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산을 추출하고 전기 영동을 수행하였다. 그리고 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10을 참조하면, 실시예 2와 동일한 버퍼들을 이용하여 동일한 방법으로 핵산 추출을 시도하였음에도 추출된 RNA의 품질 및 수율이 낮았고 분해된 양상을 보였다.

즉, 동일한 버퍼 시약을 이용하더라도, 대상 시료에 따라 실시예 2 또는 실시예 3 등과 같은 적절한 프로토콜을 제시해야 하는 것을 확인할 수 있다.

비교예 2-2. 실시예 3의 프로토콜을 이용한 바나나 등 핵산 회수

시료로 망고, 딸기, 포도, 토마토, 복숭아, 바나나, 배의 잎을 이용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 핵산을 추출하고 전기 영동을 수행하였다. 그리고 그 결과를 도 11에 나타내었다.

비교예 3. 실시예 2의 프로토콜을 이용한 재실험

실시예 2를 다시 한번 수행하되, 그 시료로 망고, 딸기, 포도, 토마토, 복숭아, 바나나, 배 및 고추의 잎을 준비하였다. 그리고 그 결과를 도 12에 나타내었다.

비교예 4. 일부 버퍼 농도 및 순서를 조정하여 수행

비교예 4-1. 실시예 2-2를 생략(샘플 1)

바나나 시료를 이용하여, 제2 버퍼를 혼합하지 않고 바로 실시예 2-3을 수행한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 13의 샘플 1에 나타내었다.

비교예 4-2. 실시예 2-2와 실시예 2-3의 순서 변경(샘플 2)

바나나 시료를 이용하여, 실시예 2-2와 실시예 2-3의 순서를 변경한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 13의 샘플 2에 나타내었다.

비교예 4-3. 제3 버퍼의 조성 변경(샘플 3)

바나나 시료를 이용하여, 실시예 2-3을 4.5M의 염화소듐 대신에, 3M의 NaOAc를 이용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 13의 샘플 3에 나타내었다.

비교예 4-4. 실시예 3-2를 변경(샘플 4)

고추잎 시료를 이용하여, 실시예 3-2에서 4.5M의 염화소듐 대신에, 3M의 NaOAc를 이용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 13의 샘플 4에 나타내었다.

비교예 4-5. 제3 버퍼를 이용한 균질화(샘플 5)

바나나 시료를 이용하여, 실시예 2-1에서 제1 버퍼 대신에 제3 버퍼를 이용하고, 실시예 2-3에서 제3 버퍼 대신에 제1 버퍼를 이용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 13의 샘플 5에 나타내었다.

비교예 4-6. 실시예 3-1을 변경(샘플 6)

고추 시료를 이용하여, 실시예 3-1에서 제4 버퍼의 구아니딘 염산의 농도를 4M이 아닌 1M을 적용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 13의 샘플 6에 나타내었다.

도 13을 참조하면, 모든 샘플들에서 RNA가 완전히 분해된 양상을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

비교예 5. 버퍼의 조성을 조정하여 수행 (바나나 등)

실시예 2-4의 제4 버퍼에서, 구아니딘염산 대신에 구아니딘티오시안을 이용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14를 참조하면, 모든 시료에서 RNA가 분해된 양상을 나타내었고 RNA 수율이 낮은 것으로 확인되었다.

비교예 6. 가열 과정을 생략하여 수행 (바나나 등)

실시예 2-2에서, 60℃ 가열을 생략한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15를 참조하면, 딸기(SB), 포도(GV)에서 확연히 RNA 추출양이 감소한 것을 확인할 수 있다.

비교예 7. 버퍼의 조성을 조정하여 수행 (고추)

실시예 3-1의 제4 버퍼에서, 구아니딘염산 대신에 구아니딘티오시안을 이용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16을 참조하면, 시료에서 RNA가 분해된 양상을 나타내었고 RNA 수율이 낮은 것으로 확인되었다.

비교예 8. 가열 과정을 생략하여 수행 (고추)

실시예 3-2에서, 60℃ 가열을 생략한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 핵산 회수 및 전기 영동하여 그 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17을 참조하면, 고추 시료에서 확연히 RNA 추출양이 감소한 것을 확인할 수 있다.

비교예 9. 버퍼의 순서를 변경(2)

비교예 9-1. 제1 버퍼의 생략(1)

고추잎을 제3 버퍼로 균질하고 제2 버퍼를 혼합하여 1차 원심 분리 후 상층액에 제4 버퍼를 추가하고 원심 분리하여 핵산을 추출하고 전기 영동하여, 그 결과를 도 18의 샘플 1에 나타내었다.

비교예 9-2. 제1 버퍼의 생략(1)

고추잎을 제3 버퍼로 균질하고 제2 버퍼를 혼합하여 1차 원심 분리 후 상층액에 제3 버퍼를 추가하고 원심 분리하여 핵산을 추출하고 전기 영동하여, 그 결과를 도 18의 샘플 2에 나타내었다.

도 18을 참조하면, 제1 버퍼 없이 균질한 경우 RNA의 품질이 불량하였다.

구체적으로, 샘플 1을 참조하면 제3 버퍼로 균질하고 제1 버퍼 없이 제4 버퍼로 2차 침전한 경우, 고추잎의 RNA 분해를 효과적으로 억제하지 못한 것을 확인할 수 있다.

또 샘플 2를 참조하면, 제4 버퍼로 균질하고 제1 버퍼 없이 제3 버퍼로 2차 침전한 경우, RNA가 소폭 분해한 양상을 나타내었다.

즉, 이러한 결과를 보았을 때, RNase가 과발현되는 특정 식물, 예컨대 고추잎 또는 동등한 특성을 갖는 조직의 경우 제4 버퍼로 우선 균질 후 이후 과정을 진행하는 것이 온전한 RNA를 추출하는데 최선일 것으로 확인되었다.

실험예 1. RNA 순도 및 추출량 측정

전술한 실시예 2(MG~PA)와 실시예 3(PP), 비교예 1-1 및 비교예 1-2의 방법에 따라 핵산을 추출한 순도와 추출량을 측정하였다. 그리고 그 결과를 각각 도 19 내지 도 21에 나타내었다.

RNA와 DNA는 자외선 파장대인 260nm를 강하게 흡수하고, 단백질과 페놀류는 280nm 파장을, 염(salt), 탄수화물 및 페놀류는 230nm 파장을 강하게 흡수한다. 추출한 RNA는 UV spectrometer 장비로 순수한 물을 기준으로 흡광도를 측정할 수 있다. 260nm 흡광도를 230 또는 280로 나눈 값을 각각 A260/A230, 또는 A260/A280이라 정의한다.

260의 흡광도 값이 230 또는 280보다 약 2배 이상 높은 경우 순수한 RNA로 볼 수 있으며, 시료가 오염될수록 해당 값이 낮아진다. 예를 들어, 구아니딘염 또는 페놀에 오염될 경우 230nm 흡광도가 증가하고, 특히 페놀 오염이 증가할 경우 260nm 흡광도가 증가하여 실제 추출된 RNA 양에 비해 overestimate 될 수 있다. 즉, 고순도의 RNA가 추출된 경우 A260/A230, 또는 A260/A280의 값은 2.0 내지 2.2 사이이다.

도 19 내지 도 21을 참조하면, 실시예 2(MG~PA의 경우) 및 실시예 3(PP의 경우) 따를 경우 비교군인 상용 키트 보다 높거나, 적어도 동등 수준의 품질과 회수율을 나타내었다. 특히 전체 시료들에서 흡광도 비율이 2.0 이상인 것으로 확인되어 고품질의 핵산을 추출할 수 있음을 의미한다.

반면 도 20 및 도 21을 참조하면, 퀴아젠 사의 키트는 토마토, 복숭아, 딸기에서는 RNA를 추출하는데 성공하였으나, 망고, 포도, 바나나, 배에서는 낮은 품질과 회수율을 나타내었다. 또, 노르겐 사의 키트는 망고와 고추에서 낮은 품질과 회수율을 나타내었다.

실험예 2. RNA 증폭 곡선 및 융해 곡선

전술한 실시예 2 및 실시예 3를 통해 추출한 RNA가 qPCR 같은 downstream analysis에 적합한지 평가하기 위해 total RNA 1ug을 reverse transcription하여 cDNA 만든 뒤 각 시료의 house-keeping gene을 PCR 증폭하였다.

cDNA 합성은 AccuPower® CycleScript™ RT PreMix (dN6) (Bioneer, Daejeon, South Korea)를 사용하여 total RNA 1μg을 첨가하여 제조사 protocol에 따라 합성하였다. 합성된 cDNA는 10배 희석하여 template으로 사용했다.

그리고 문헌 조사를 통해 낮은 발현량을 가진 유전자를 선별하였다. realtime PCR 분석에 사용된 유전자와 그 프라이머 서열은 하기 표 1에 정리하였다.

식물명	Forward 프라이머	Reverse 프라이머	참고문헌
Mango	>ACT7CGTTCTGTCCCTCTATGCCA >GAPDH GTGGCTGTTAACGATCCCTT	>ACT7 AGATCACGGCCAGCAAGATC >GAPDH GTGACTGGCTTCTCATCGAA	(Islas-Osuna et al., 2019)
Strawberry	>18STGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAA >GAPDH GAGTCTACTGGAGTGTTCA >ACTIN2 GCTAATCGTGAGAAGATGAC	>18S GAAGTCGGGATTTGTTGCACGTATT >GAPDH CTTGTATTCGTGCTCATTCA >ACTIN2 AGCACAATACCAGTAGTACG	(Zhang et al., 2018)
Grapevine	>VvCYPACAGCCAAGACCTCGTG >VvACT GACTACCTACAACTCCATCAT	>VvCYP GCCTTCACTGACCACAAC >VvACT TCATTCTGTCAGCAATACCA	(Borges et al., 2014)
Tomato	>EF1aGGTGGTTTTGAAGCTGGTATCTCC >GAPDH CTGCTCTCTCAGTAGCCAACAC >CAC CCTCCGTTGTGATGTAACTGG	>EF1a CCAGTAGGGCCAAAGGTCACA >GAPDH CTTCCTCCAATAGCAGAGGTTT >CAC ATTGGTGGAAAGTAACATCATCG	(Muller et al., 2015)
Peach	>Got1GTTGGCAGTTGGAAGCACAGC >GAPDH TTTGAAGGGTGGAGCGAAGAAGG	>Got1 AAATAAGGGCGCAGACCTCACAT >GAPDH ATGGAGTGAACGGTGGTCATCAG	(Bastias et al., 2020)
Banana	>ACT1pp2GAGCGGAAGTACAGTGTCTGG >EF1a CGGAGCGTGAAAGAGGAAT >GAPDH CATCAAGCAAGGACTGGAGAG	>ACT1pp2 AGAAGCACTTCCTGTGGACAA >EF1a ACCAGCTTCAAAACCACCAG >GAPDH AAGCAGGGAGAACTTTTCCAA	(Podevin et al., 2012, Rego et al., 2019)
Pear	>ACTIN2CTCCCAGGGCTGTGTTTCCTA >Histone H3 GTCAAGAAGCCCCACAGATAC	>ACTIN2 CTCCATGTCATCCCAGTTGCT >Histone H3 CTGGAAACGCAGATCAGTCTTG	(Liu et al., 2018)
Pepper	>ACTTGTTATGGTAGGGATGGGTC >Histone H3 GACTGATCTGCGTTTCCAGA	>ACT TTCTCTCTATTTGCCTTGGG >Histone H3 TTGAATGTCCTTGGGCATAA	(Cheng et al., 2017, Muller et al., 2015)

기준 유전자에 특이적인 프라이머를 이용해 준비된 cDNA로부터 realtime PCR을 수행하였다. Realtime PCR은 qTower3 (Analytik jena, Jena, Germany) 장비를 사용하였다. PCR mix는 2X SFC green qPCR master mix (SFC Co., Ltd., Chungbuk, South Korea) 10 μl, template 5 μl, primer mix (forward and reverse each 10uM) 2 μl, RNase free water 3 μl를 1 reaction으로 triplicate하였으며 heat activation 및 pre-denuature를 위해 95℃ 5min 간 가열 후 95℃ 15초, 58℃ 15초, 72℃(FAM 형광 검출) 20초로 45 cycle 반복하였다.

순서대로 망고는 ACT7과 GAPDH를 (Islas-Osuna et al., 2019) 딸기에선 18S rRNA, GAPDH 그리고 Actin2를 (Zhang et al., 2018) 포도에선 VvCYP와 VvACT를 (Borges et al., 2014) 토마토에선 GAPDH, CAC, EF1a를 (Muller et al., 2015) 복숭아에선 GAPDH와 Got1을 (Bastias et al., 2020) 바나나에선 ACT1pp2, GAPDH와 EF1a를 (Podevin et al., 2012, Rego et al., 2019) 배에선 Histone H3와 Actin2를 (Liu et al., 2018) 선택하였다. (Cheng et al., 2017, M

ller et al., 2015) 고추에서 Histone H3와 ACT 같은 housekeeping 유전자를 선택하였다. (Cheng et al., 2017, Muller et al., 2015)

그리고 그 결과를 도 22 내지 도 29에 나타내었다. 도 22 내지 도 29를 참조하면, 각각의 유전자가 모두 증폭되어 baseline threshold 이상으로 형광값이 측정되었으며, 정상적인 Realtime PCR 증폭과정에서 관찰되는 전형적인 패턴, initiation phase, exponential phase 그리고 linear phase가 관찰되었다.

PCR 단계 종료 후 융해곡선 분석을 위해 95℃ 1분 가열 후 65℃~95℃까지 0.5℃씩 15초간 hold하며 FAM 형광을 검출하였다. (Ririe et al., 1997) genomic DNA의 오염 또는 비특이적인 PCR 산물 형성을 확인하기 위해 융해곡선 분석을 실시한 결과, 각 PCR 산물의 융해온도는 최저 78.62℃에서 최고 85.48℃ 인 것으로 확인되었으며, 융해곡선의 양상 또한 gDNA의 오염 또는 비특이적인 산물의 형성이 의심되는 peak 없이 모두 단일 peak를 형성하였다.

이상에서 본 발명의 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다.

따라서 본 발명의 범위는 이상에서 예시된 기술 사상의 변경물, 균등물 내지는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성요소는 변형하여 실시할 수 있다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

4.2M 내지 4.8M의 염화소듐;
80mM 내지 120mM의 염화칼륨, 염화칼슘, 염화 제2 철, 염화 제1 철, 알루미늄암모늄 또는 황산암모늄; 및
1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v)의 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐폴리피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 시약 조성물.