JPH0653072B2 - プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードするポリデオキシリボヌクレオチド、それを含むベクター及びそれを含む形質転換体 - Google Patents
プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードするポリデオキシリボヌクレオチド、それを含むベクター及びそれを含む形質転換体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は人間のプラスミノーゲンアクチベーター遺伝子
に関するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）セグメントを提供
するものである。このＤＮＡ部分をプラスミドベクター
に組入れるとこのベクターは次いでバクテリアまたは他
の微生物にとり込ませることができる。次いでこのバク
テリアを培養して人間のウロキナーゼの性質を有するプ
ラスミノーゲンアクチベーター蛋白質を製造することが
できる。
に関するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）セグメントを提供
するものである。このＤＮＡ部分をプラスミドベクター
に組入れるとこのベクターは次いでバクテリアまたは他
の微生物にとり込ませることができる。次いでこのバク
テリアを培養して人間のウロキナーゼの性質を有するプ
ラスミノーゲンアクチベーター蛋白質を製造することが
できる。
静脈および動脈の凝血、肺塞栓、心臓内の血栓および組
織塞栓などの急性血栓症候群は処理の困難なものであ
る。閉塞自体のための現在の医学的治療には抗血液凝固
が含まれる。現在の医学的アプローチはその基本的過程
を停止させ、そして血液の流れを回復して血管の閉塞ま
たは組織の破壊の程度を限定するための通常の生理学機
構に依存している。血栓溶解作用または血栓溶解の治療
は不快な血栓を溶解させるための手段としてかなり興味
あるものといえる。抗血液凝固と血栓溶解治療との双方
を使用することによつて、医学的実施は血栓を迅速に溶
解してその再発を防ぐ手段をもつことになるであろう。
最近、血栓溶解治療への数種のアプローチが観察されて
おり、その一つは天然に産する線維素分解酵素系（fibr
inolytic enzyme system）の活性剤の組織内注入による
ものである。広範な研究の行われたこのような試剤はウ
ロキナーゼである。ウロキナーゼはプラスミノーゲンか
らプラスミンへの転化を通して活性な血栓溶解剤であ
る。プラスミノーゲンは天然に産するプラズマ前駆体で
あり、このものは活性剤の存在下、線維素（fibrin）を
加水分解しうる蛋白分解酵素たるプラスミンに転化す
る。ウロキナーゼは構造未知の複雑な蛋白質であり、人
尿中に痕跡量見出される。ウロキナーゼは有力な血栓溶
解剤であり、血液中に自然に依存する量よりも遥かに多
量を注射すると血栓溶解を促進する。ウロキナーゼは１
９５１年にはじめて記載され、その後人尿からのウロキ
ナーゼの分離および精製のための方法が開発された。ウ
ロキナーゼの分離および精製法は多くの刊行物、たとえ
ば米国特許第2,９８3,６４７号；同第3,２５6,１５８
号；同第3,４７7,９１０号〜第3,４７7,９１３号および
第3,５４4,４２７号、に記載されている。然しながら、
尿の収集と処理の業務はウロキナーゼのこの資源を非実
用的なものにしている。４００万ＣＴＡ単位（ＣＴＡは
Committee on Thrombolytic Agentsの略語）のウロキナ
ーゼは約1,５００リツトルの尿の処理を必要とするから
である。後に人間の腎臓細胞の培養中に線維素分解活性
が発表され、そしてこの活性は尿のウロキナーゼと免疫
学的に区別がつかないことが見出された。組織培養法を
使用してさえ、生産コストが高くつき、その結果、ウロ
キナーゼの製造のための他の方法が望まれている。
織塞栓などの急性血栓症候群は処理の困難なものであ
る。閉塞自体のための現在の医学的治療には抗血液凝固
が含まれる。現在の医学的アプローチはその基本的過程
を停止させ、そして血液の流れを回復して血管の閉塞ま
たは組織の破壊の程度を限定するための通常の生理学機
構に依存している。血栓溶解作用または血栓溶解の治療
は不快な血栓を溶解させるための手段としてかなり興味
あるものといえる。抗血液凝固と血栓溶解治療との双方
を使用することによつて、医学的実施は血栓を迅速に溶
解してその再発を防ぐ手段をもつことになるであろう。
最近、血栓溶解治療への数種のアプローチが観察されて
おり、その一つは天然に産する線維素分解酵素系（fibr
inolytic enzyme system）の活性剤の組織内注入による
ものである。広範な研究の行われたこのような試剤はウ
ロキナーゼである。ウロキナーゼはプラスミノーゲンか
らプラスミンへの転化を通して活性な血栓溶解剤であ
る。プラスミノーゲンは天然に産するプラズマ前駆体で
あり、このものは活性剤の存在下、線維素（fibrin）を
加水分解しうる蛋白分解酵素たるプラスミンに転化す
る。ウロキナーゼは構造未知の複雑な蛋白質であり、人
尿中に痕跡量見出される。ウロキナーゼは有力な血栓溶
解剤であり、血液中に自然に依存する量よりも遥かに多
量を注射すると血栓溶解を促進する。ウロキナーゼは１
９５１年にはじめて記載され、その後人尿からのウロキ
ナーゼの分離および精製のための方法が開発された。ウ
ロキナーゼの分離および精製法は多くの刊行物、たとえ
ば米国特許第2,９８3,６４７号；同第3,２５6,１５８
号；同第3,４７7,９１０号〜第3,４７7,９１３号および
第3,５４4,４２７号、に記載されている。然しながら、
尿の収集と処理の業務はウロキナーゼのこの資源を非実
用的なものにしている。４００万ＣＴＡ単位（ＣＴＡは
Committee on Thrombolytic Agentsの略語）のウロキナ
ーゼは約1,５００リツトルの尿の処理を必要とするから
である。後に人間の腎臓細胞の培養中に線維素分解活性
が発表され、そしてこの活性は尿のウロキナーゼと免疫
学的に区別がつかないことが見出された。組織培養法を
使用してさえ、生産コストが高くつき、その結果、ウロ
キナーゼの製造のための他の方法が望まれている。
本発明は、人間のウロキナーゼに関するプラスミノーゲ
ンアクチベーターをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）を組入れた修飾プラスミドを提供するものである。
この修飾プラスミドはバクテリアまたは他の微生物に導
入することができ、次いでこのものを培養して抗生物質
化合物の製造と同じようにしてウロキナーゼ様物質を製
造することができる。この修飾プラスミドはプラスミド
中のヌクレオチド配列の直接操作によつてえられる。記
述のために、本発明をバクテリウムＥ．Coli Ｋ−１２
菌株Ｘ１７７６ならびにプラスミドおよびそこからのベ
クターｐＢＲ３２２を参照して以下に述べる。前者はRa
ven Press(NewYork)発行、Beers.R.F.およびBassett.E.
G.共著「Recombinant Molecules,Impact on Science an
d Society」（１９７７年）第４５頁に記載されてお
り、後者はBolivarら（Ｇｅｎｅ，２、第９５頁、１９
７７年）によつて記述されている。本発明者は人間のプ
ラスミノーゲンアクチベーターであるウロキナーゼをコ
ードするＤＮＡセグメントをバクテリアに組入れた。こ
のようにしてこの微生物は人間の胎生腎臓細胞の組織培
養から分離したウロキナーゼと類似の免疫学的なおよび
プラスミノーゲン活性剤の性質を有するプラスミノーゲ
ンアクチベーターを製造する新しい能力を獲得する。こ
の遺伝子工学の方法は簡単にいうと、(1)人間の胎生腎
臓細胞からのメツセンジヤーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の分
離、(2)分離したｍＲＮＡの存在の実証、(3)組換えＤＮ
Ａ合成に適するｍＲＮＡからの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
の実験的合成、(4)上記(3)で合成したＤＮＡとベクター
またはプラスミドＤＮＡとを含む組換えＤＮＡの合成、
(5)この組換えＤＮＡによるバクテリアの形質転換なら
びにプラスミノーゲンアクチベーター生産のため形質転
換細胞の検出および選択、および(6)形質転換細胞から
のプラスミノーゲンアクチベーターの分離と化学的およ
び生物学的性質の特性の記述からなる。
ンアクチベーターをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）を組入れた修飾プラスミドを提供するものである。
この修飾プラスミドはバクテリアまたは他の微生物に導
入することができ、次いでこのものを培養して抗生物質
化合物の製造と同じようにしてウロキナーゼ様物質を製
造することができる。この修飾プラスミドはプラスミド
中のヌクレオチド配列の直接操作によつてえられる。記
述のために、本発明をバクテリウムＥ．Coli Ｋ−１２
菌株Ｘ１７７６ならびにプラスミドおよびそこからのベ
クターｐＢＲ３２２を参照して以下に述べる。前者はRa
ven Press(NewYork)発行、Beers.R.F.およびBassett.E.
G.共著「Recombinant Molecules,Impact on Science an
d Society」（１９７７年）第４５頁に記載されてお
り、後者はBolivarら（Ｇｅｎｅ，２、第９５頁、１９
７７年）によつて記述されている。本発明者は人間のプ
ラスミノーゲンアクチベーターであるウロキナーゼをコ
ードするＤＮＡセグメントをバクテリアに組入れた。こ
のようにしてこの微生物は人間の胎生腎臓細胞の組織培
養から分離したウロキナーゼと類似の免疫学的なおよび
プラスミノーゲン活性剤の性質を有するプラスミノーゲ
ンアクチベーターを製造する新しい能力を獲得する。こ
の遺伝子工学の方法は簡単にいうと、(1)人間の胎生腎
臓細胞からのメツセンジヤーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の分
離、(2)分離したｍＲＮＡの存在の実証、(3)組換えＤＮ
Ａ合成に適するｍＲＮＡからの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
の実験的合成、(4)上記(3)で合成したＤＮＡとベクター
またはプラスミドＤＮＡとを含む組換えＤＮＡの合成、
(5)この組換えＤＮＡによるバクテリアの形質転換なら
びにプラスミノーゲンアクチベーター生産のため形質転
換細胞の検出および選択、および(6)形質転換細胞から
のプラスミノーゲンアクチベーターの分離と化学的およ
び生物学的性質の特性の記述からなる。
ヌクレオチド配列のこの新しい操作技術は、一菌株もし
くは種からの周知のもしくは同定されたヌクレオチド配
列を別のものへ導入しこれによつて所望の性質を付与す
ることを可能にする。ＤＮＡの二重らせん構造に関し
て、ＤＮＡ分子のからみ合つた相補性のストランドはホ
スフエート基を通して結合する４つのデオキシリボヌク
レオチド即ちデオキシ−リボアデノシン−５′−ホスフ
エート（ｄＡＭＰ）、チミジン−５′−ホスフエート
（ＴＭＰ）、デオキシ−リボグアノシン−５′−ホスフ
エート（ｄＧＭＰ）およびデオキシ−リボシチジン−
５′−ホスフエート（ｄＣＭＰ）から作られている。そ
れぞれのストランドの遺伝子情報はデオキシリボヌクレ
オチドの特定の配列において具体化される。あるＤＮＡ
分子中のヌクレオチドの配列はある特定の蛋白質の配列
を決定し、そしてアミノ酸の配列または蛋白質の構造と
機能とを確立する。それ故、ＤＮＡのヌクレオチド配列
は有機体の性質を作る蛋白質を正確に規定する。
くは種からの周知のもしくは同定されたヌクレオチド配
列を別のものへ導入しこれによつて所望の性質を付与す
ることを可能にする。ＤＮＡの二重らせん構造に関し
て、ＤＮＡ分子のからみ合つた相補性のストランドはホ
スフエート基を通して結合する４つのデオキシリボヌク
レオチド即ちデオキシ−リボアデノシン−５′−ホスフ
エート（ｄＡＭＰ）、チミジン−５′−ホスフエート
（ＴＭＰ）、デオキシ−リボグアノシン−５′−ホスフ
エート（ｄＧＭＰ）およびデオキシ−リボシチジン−
５′−ホスフエート（ｄＣＭＰ）から作られている。そ
れぞれのストランドの遺伝子情報はデオキシリボヌクレ
オチドの特定の配列において具体化される。あるＤＮＡ
分子中のヌクレオチドの配列はある特定の蛋白質の配列
を決定し、そしてアミノ酸の配列または蛋白質の構造と
機能とを確立する。それ故、ＤＮＡのヌクレオチド配列
は有機体の性質を作る蛋白質を正確に規定する。
組換えＤＮＡの操作はバクテリアから分離される制限エ
ンドヌクレアーゼ酵素として知られる蛋白質によるＤＮ
Ａのストランドの開裂により始まる。その酵素はＤＮＡ
鎖を特定の配列部位で切断する。その切断は必ずしも二
つのストランドの同じ位置で起きるとはいえないので、
その分けられたストランドは相補性の末端を持ちそのた
め適当な条件下で一緒に結合して端部対端部でそれらが
結合しうる。２種の異なつた資源からのＤＮＡ（その両
者は適切な標識配列をもつ）について同一の制限酵素を
使用するならば、結合性の端部を有する配列がその結果
生ずるであろう。それ故、任意の資源からの２つの配列
を組換えて単一のＤＮＡ分子にすることができる。組換
え用ＤＮＡを取得する別の方法は、メツセンジヤーＲＮ
Ａを二重ストランド相補ＤＮＡに逆転写することであ
る。合成されたＤＮＡは次いでこれを以下に述べるよう
にしてプラスミド中に組入れることができる。ＤＮＡ取
得のこの方法は好ましいものである。それは、哺乳動物
染色体のＤＮＡの遺伝子が蛋白質を伝達しない配列を多
くの場合含み、そのためＤＮＡから蛋白質への遺伝子情
報伝達の直線性が中断されるからである。Ｅ．Coliのよ
うなバクテリアの場合、その単純な円形染色体に加え
て、それは細胞の染色体から物理的に分離している遺伝
子単位であるプラスミドもしくは余分の染色体要素とし
て知られる一個またはそれ以上の独立に複製されるサー
クル状物をもつこともできる。これらのプラスミドもし
くはベクターはバクテリアから分離することができ、制
限酵素によつて開口もしくは開裂することができ、そし
て組換えの一成分として使用することができる。組入れ
るべきＤＮＡをプラスミドＤＮＡに接合した後、この円
形プラスミドはこれを閉じることができ、そしてプラス
ミドは細胞にもどされうる。そこでそれはそれ自身の自
然のヌクレオチド配列のみならず加えたものをも転写し
つつ複製を再び始めるであろう。それ故、えられるバク
テリアの菌株はバクテリアの繁殖の際に、組入れたヌク
レオチド配列のコピーを維持するであろう。
ンドヌクレアーゼ酵素として知られる蛋白質によるＤＮ
Ａのストランドの開裂により始まる。その酵素はＤＮＡ
鎖を特定の配列部位で切断する。その切断は必ずしも二
つのストランドの同じ位置で起きるとはいえないので、
その分けられたストランドは相補性の末端を持ちそのた
め適当な条件下で一緒に結合して端部対端部でそれらが
結合しうる。２種の異なつた資源からのＤＮＡ（その両
者は適切な標識配列をもつ）について同一の制限酵素を
使用するならば、結合性の端部を有する配列がその結果
生ずるであろう。それ故、任意の資源からの２つの配列
を組換えて単一のＤＮＡ分子にすることができる。組換
え用ＤＮＡを取得する別の方法は、メツセンジヤーＲＮ
Ａを二重ストランド相補ＤＮＡに逆転写することであ
る。合成されたＤＮＡは次いでこれを以下に述べるよう
にしてプラスミド中に組入れることができる。ＤＮＡ取
得のこの方法は好ましいものである。それは、哺乳動物
染色体のＤＮＡの遺伝子が蛋白質を伝達しない配列を多
くの場合含み、そのためＤＮＡから蛋白質への遺伝子情
報伝達の直線性が中断されるからである。Ｅ．Coliのよ
うなバクテリアの場合、その単純な円形染色体に加え
て、それは細胞の染色体から物理的に分離している遺伝
子単位であるプラスミドもしくは余分の染色体要素とし
て知られる一個またはそれ以上の独立に複製されるサー
クル状物をもつこともできる。これらのプラスミドもし
くはベクターはバクテリアから分離することができ、制
限酵素によつて開口もしくは開裂することができ、そし
て組換えの一成分として使用することができる。組入れ
るべきＤＮＡをプラスミドＤＮＡに接合した後、この円
形プラスミドはこれを閉じることができ、そしてプラス
ミドは細胞にもどされうる。そこでそれはそれ自身の自
然のヌクレオチド配列のみならず加えたものをも転写し
つつ複製を再び始めるであろう。それ故、えられるバク
テリアの菌株はバクテリアの繁殖の際に、組入れたヌク
レオチド配列のコピーを維持するであろう。
本発明は添付の図面を参照して更によく理解されるであ
ろう。
ろう。
第１図はウロキナーゼに関連したプラスミノーゲンアク
チベーター蛋白質を伝達するプラスミド含有ＤＮＡの制
限地図を図式的に説明するものである。
チベーター蛋白質を伝達するプラスミド含有ＤＮＡの制
限地図を図式的に説明するものである。
第２図は形質転換細胞からのウロキナーゼ様物質の親和
クロマトグラフからえられたデータを説明するグラフで
ある。
クロマトグラフからえられたデータを説明するグラフで
ある。
プラスミドは二重ストランドＤＮＡからなり少なくとも
１つの転写位置を含むものと信じられている。添付の第
１図を参照して、そこにはウロキナーゼに関連したプラ
スミノーゲンアクチベーターをコードするＤＮＡセグメ
ントを組入れたＥ．ColiプラスミドｐＢＲ３２２を図式
的に示してある。このプラスミドもしくはベクターｐＢ
Ｒ３２２はBolivarらによつて記述されている（Gene，
２、第９５頁、１９７７年）。第１図に示すように、こ
のｐＢＲ３２２プラスミドはPst Ｉの位置として以後
に述べる位置において制限酵素によつて開裂されてお
り、プラスミノーゲンアクチベーターをコードするＤＮ
Ａセグメントがそこに組入れられている。一つのストラ
ンド上の配列が相補的に直接向き合つて存在するため結
合が起こる。その相補性はそれぞれヌクレオチド類シト
シンおよびグアニンまたはアデニンおよびチミンの間の
化学的親和性に依存する。ストランドの長さにそつてく
りかえされるこれらの結合の合計はストランド同志を保
持する。２つのＤＮＡ断片を結合する別法はリガーゼを
使用するブラント末端の連結（blunt end ligation）に
よる方法である。第１図に示す数値はそこに示す位置の
間の塩基ペアの数（実際には近似値）である。たとえ
ば、ｐＢＲ３２２プラスミドのもとのPst Ｉ位置の間
に組入れられた塩基ペアの数は約4,２００である。第１
図の直径にそつた場所もしくは位置は特定配列のヌクレ
オチドが生じ且つ特定の制限エンドヌクレアーゼ酵素に
よつて開裂しうる場所を示す。第１図中の記号はそれぞ
れの位置の大体の場所ならびにヌクレオチドの特定配列
においてＤＮＡストランドを切断する特定の制限酵素を
示す。
１つの転写位置を含むものと信じられている。添付の第
１図を参照して、そこにはウロキナーゼに関連したプラ
スミノーゲンアクチベーターをコードするＤＮＡセグメ
ントを組入れたＥ．ColiプラスミドｐＢＲ３２２を図式
的に示してある。このプラスミドもしくはベクターｐＢ
Ｒ３２２はBolivarらによつて記述されている（Gene，
２、第９５頁、１９７７年）。第１図に示すように、こ
のｐＢＲ３２２プラスミドはPst Ｉの位置として以後
に述べる位置において制限酵素によつて開裂されてお
り、プラスミノーゲンアクチベーターをコードするＤＮ
Ａセグメントがそこに組入れられている。一つのストラ
ンド上の配列が相補的に直接向き合つて存在するため結
合が起こる。その相補性はそれぞれヌクレオチド類シト
シンおよびグアニンまたはアデニンおよびチミンの間の
化学的親和性に依存する。ストランドの長さにそつてく
りかえされるこれらの結合の合計はストランド同志を保
持する。２つのＤＮＡ断片を結合する別法はリガーゼを
使用するブラント末端の連結（blunt end ligation）に
よる方法である。第１図に示す数値はそこに示す位置の
間の塩基ペアの数（実際には近似値）である。たとえ
ば、ｐＢＲ３２２プラスミドのもとのPst Ｉ位置の間
に組入れられた塩基ペアの数は約4,２００である。第１
図の直径にそつた場所もしくは位置は特定配列のヌクレ
オチドが生じ且つ特定の制限エンドヌクレアーゼ酵素に
よつて開裂しうる場所を示す。第１図中の記号はそれぞ
れの位置の大体の場所ならびにヌクレオチドの特定配列
においてＤＮＡストランドを切断する特定の制限酵素を
示す。
第１図は本発明の一態様を示すものであり、ウロキナー
ゼ様物質をコードするＤＮＡを組入れたＥ．Coliプラス
ミドを例示するものである。組換えＤＮＡ、すなわちウ
ロキナーゼ様物質をコードするＤＮＡを含む再構成され
たプラスミドはＥ．Coli Ｋ−１２菌株Ｘ１７７６とし
て例示されているような適当な宿主有機体すなわち単一
細胞宿主にもどされる。そこではその有機体はそれ自身
の自然の配列のみならず組入れた配列をも転写しつつ複
製を始める。
ゼ様物質をコードするＤＮＡを組入れたＥ．Coliプラス
ミドを例示するものである。組換えＤＮＡ、すなわちウ
ロキナーゼ様物質をコードするＤＮＡを含む再構成され
たプラスミドはＥ．Coli Ｋ−１２菌株Ｘ１７７６とし
て例示されているような適当な宿主有機体すなわち単一
細胞宿主にもどされる。そこではその有機体はそれ自身
の自然の配列のみならず組入れた配列をも転写しつつ複
製を始める。
他の適当な有機体はエシエリシア属、サツカロマイセス
属、バチルス属、ニユーロスポラ属またはストレプトマ
イセス属からえらぶことができる。このように単一細胞
宿主を使うことができる。適当な微生物の種を例示すれ
ば、エシエリシアコリイ（Ｅ．Coli）、サツカロマイセ
スセレビシアエ、バチルスサブチリスおよびニユーロス
ポラクラサである。
属、バチルス属、ニユーロスポラ属またはストレプトマ
イセス属からえらぶことができる。このように単一細胞
宿主を使うことができる。適当な微生物の種を例示すれ
ば、エシエリシアコリイ（Ｅ．Coli）、サツカロマイセ
スセレビシアエ、バチルスサブチリスおよびニユーロス
ポラクラサである。
本発明は、免疫学的および化学的性質においてウロキナ
ーゼに関連するプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質
を生産する適当なプラスミドを含有させたエシエリシア
属からのバクテリアを特に提供するものである。Ｅ．Co
li Ｘ１７７６ｐＡＢＢ２６の培養物は米国イリノイ州
ペオリアの米国農務省のＡＲＳカルチユアーコレクシヨ
ンに寄託され、寄託番号Ｂ １２１２２が付せられた。
ーゼに関連するプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質
を生産する適当なプラスミドを含有させたエシエリシア
属からのバクテリアを特に提供するものである。Ｅ．Co
li Ｘ１７７６ｐＡＢＢ２６の培養物は米国イリノイ州
ペオリアの米国農務省のＡＲＳカルチユアーコレクシヨ
ンに寄託され、寄託番号Ｂ １２１２２が付せられた。
実施例１． 人間の胎生腎臓細胞からのｍＲＮＡの分離 ウロキナーゼ生産細胞から全ｍＲＮＡを次のとおり分離
した。１０％の胎生子牛血清を含むイーグル媒質（Ｅ１
９９）中で人間の胎生腎臓（ＨＥＫ）細胞を合計７〜１
０日間組織培養により生成させた。収集前に更に７日間
この細胞を血清なしで蛋白質加水分解物質中に保持し
た。ＨＥＫ細胞をローラボトルからこすり取り、ヘパリ
ン（１０単位／ml）含有塩水中で洗い、グアニジン塩に
よる抽出をリン酸塩で緩衝した水（ＰＢＳ）緩衝液中で
pH7.0で行なつた以外はウルリツヒらのグアニジンチオ
シアネート法（Science,１９６、第１３１３頁、１９７
７年）により全ＲＮＡを分離した。このＲＮＡをエタノ
ールにより沈澱させ、３３mMのＮ−２−ヒドロキシ−エ
チルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰ
ＥＳ）緩衝液に溶解した。デーレイらの（Ｊ．Biol.Che
m.２５２、第８３１０頁、１９７７年）記述のようにポ
リウリジル酸（Poly Ｕ）セフアデツクスＧ−１０カラ
ム上の親和クロマトグラフにより全ＲＮＡからｍＲＮＡ
を含有するポリアデニル酸（Poly Ａ）を分離した。カ
ラム物質はコフインらの方法（Ｊ．Mol.Biol.８６、第
３７３頁、１９７４年）に従い合成した。ＲＮＡをカラ
ム中に２回通して全ｍＲＮＡをえた（全ＲＮＡ３９mgか
ら1.1mg）。ウロキナーゼｍＲＮＡを更に濃縮し、シユ
クロース密度傾斜遠心分離により全ｍＲＮＡから分離し
た。全ＲＮＡをＴＥＳ−２緩衝液（１０mM Tris-HCl、p
H7.4；２０mM NaCl；0.5mM ＥＤＴＡ；0.4％のナトリ
ウムドデシルサルフエート）に約１０Ａ260／mlの濃度
でとかした。このＲＮＡを６５℃で１５分間加熱し、ベ
ツクマンＬ５−６５超遠心分離器中で２5,０００rmpに
おいて２０℃で１２時間ＳＷ２７ロータ中で線状（１０
〜３０％）シユクロース傾斜および遠心分離に付した。
次いで傾斜物を各フラクシヨン（0.5ml／フラクシヨ
ン）に分け、Ａ260の読みを決定した。２８Ｓより大き
いＲＮＡをプールし、エタノールで沈澱させ、７０％エ
タノール中の３３mM ＮａＣｌで洗い、次いで９５％エ
タノールで洗つた。これを乾燥し、pH7.0の３３ｍＭの
ＨＥＰＥＳにとかした。傾斜に付したＲＮＡの１ｇか
ら、２８Ｓより大きいＲＮＡ７３wgをえた。このＲＮＡ
を使用して無細胞蛋白質合成でウロキナーゼｍＲＮＡの
存在を実証しそしてｃＤＮＡの合成を行なつた。
した。１０％の胎生子牛血清を含むイーグル媒質（Ｅ１
９９）中で人間の胎生腎臓（ＨＥＫ）細胞を合計７〜１
０日間組織培養により生成させた。収集前に更に７日間
この細胞を血清なしで蛋白質加水分解物質中に保持し
た。ＨＥＫ細胞をローラボトルからこすり取り、ヘパリ
ン（１０単位／ml）含有塩水中で洗い、グアニジン塩に
よる抽出をリン酸塩で緩衝した水（ＰＢＳ）緩衝液中で
pH7.0で行なつた以外はウルリツヒらのグアニジンチオ
シアネート法（Science,１９６、第１３１３頁、１９７
７年）により全ＲＮＡを分離した。このＲＮＡをエタノ
ールにより沈澱させ、３３mMのＮ−２−ヒドロキシ−エ
チルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰ
ＥＳ）緩衝液に溶解した。デーレイらの（Ｊ．Biol.Che
m.２５２、第８３１０頁、１９７７年）記述のようにポ
リウリジル酸（Poly Ｕ）セフアデツクスＧ−１０カラ
ム上の親和クロマトグラフにより全ＲＮＡからｍＲＮＡ
を含有するポリアデニル酸（Poly Ａ）を分離した。カ
ラム物質はコフインらの方法（Ｊ．Mol.Biol.８６、第
３７３頁、１９７４年）に従い合成した。ＲＮＡをカラ
ム中に２回通して全ｍＲＮＡをえた（全ＲＮＡ３９mgか
ら1.1mg）。ウロキナーゼｍＲＮＡを更に濃縮し、シユ
クロース密度傾斜遠心分離により全ｍＲＮＡから分離し
た。全ＲＮＡをＴＥＳ−２緩衝液（１０mM Tris-HCl、p
H7.4；２０mM NaCl；0.5mM ＥＤＴＡ；0.4％のナトリ
ウムドデシルサルフエート）に約１０Ａ260／mlの濃度
でとかした。このＲＮＡを６５℃で１５分間加熱し、ベ
ツクマンＬ５−６５超遠心分離器中で２5,０００rmpに
おいて２０℃で１２時間ＳＷ２７ロータ中で線状（１０
〜３０％）シユクロース傾斜および遠心分離に付した。
次いで傾斜物を各フラクシヨン（0.5ml／フラクシヨ
ン）に分け、Ａ260の読みを決定した。２８Ｓより大き
いＲＮＡをプールし、エタノールで沈澱させ、７０％エ
タノール中の３３mM ＮａＣｌで洗い、次いで９５％エ
タノールで洗つた。これを乾燥し、pH7.0の３３ｍＭの
ＨＥＰＥＳにとかした。傾斜に付したＲＮＡの１ｇか
ら、２８Ｓより大きいＲＮＡ７３wgをえた。このＲＮＡ
を使用して無細胞蛋白質合成でウロキナーゼｍＲＮＡの
存在を実証しそしてｃＤＮＡの合成を行なつた。
実施例２． 無細胞蛋白質合成による分離ＲＮＡ調製物中のウロキナ
ーゼｍＲＮＡの存在の実証 ウサギの網内皮細胞からの無構胞蛋白質合成系をペルヘ
ムおよびジヤクソンの方法（Eur.J.Biochem.,６７、第
２４７頁、１９７６年）によりヌクレアーゼ処理して内
生のｍＲＮＡを消化処理した。無細胞での蛋白質の合成
および免疫沈澱をローデスらの方法（Ｊ．Biol.Chem.,
２４８、第２０３１頁、１９７３年）に従い実施した。
２０％（Vol/Vol）の網内皮細胞溶解物、２ｍＭのアデ
ノシントリホスフエート（ＡＴＰ）、0.2Ｍのグアニジ
ントリホスフエート（ＧＴＰ）、１０mMのクレアチンホ
スフエート、２ugのクレアチンキナーゼ、３mMのジチオ
スレイトール、７５mMのＫＣｌ、３mMのMgCl2、３０mM
のＨＥＰＥＳ、pH7.6、２０ｕＭのアミノ酸混合物（メ
チオニンなし）、５ｕＣｉ35Ｓ−メチオニンおよび１ug
の精製メツセンジヤーＲＮＡを含む最終容量４５ul中で
培養を行なつた。混合物を２５℃で１時間培養し、次い
で冷却および0.1Ｍメチオニン、１０％トリトンＸ−１
００および１０％ナトリウムデオキシコレートからなる
液２５ulの添加により停止した。５ulづつの分別量を0.
3ＭＭフイルターペーパーデイスク上にピペツトで移
し、0.2％のＤ，Ｌ−メチオニンを含むトリクロル酢酸
（ＴＣＡ）中で洗うことにより、とり込まれたもの全体
のトリクロル酢酸不溶解カウントをえた。次いでこのペ
ーパーデイスクを同じＴＣＡ−メチオニン溶液中で９０
℃で１５分間加熱し、シンチレーシヨンカウンターでカ
ウントする前に乾燥した。
ーゼｍＲＮＡの存在の実証 ウサギの網内皮細胞からの無構胞蛋白質合成系をペルヘ
ムおよびジヤクソンの方法（Eur.J.Biochem.,６７、第
２４７頁、１９７６年）によりヌクレアーゼ処理して内
生のｍＲＮＡを消化処理した。無細胞での蛋白質の合成
および免疫沈澱をローデスらの方法（Ｊ．Biol.Chem.,
２４８、第２０３１頁、１９７３年）に従い実施した。
２０％（Vol/Vol）の網内皮細胞溶解物、２ｍＭのアデ
ノシントリホスフエート（ＡＴＰ）、0.2Ｍのグアニジ
ントリホスフエート（ＧＴＰ）、１０mMのクレアチンホ
スフエート、２ugのクレアチンキナーゼ、３mMのジチオ
スレイトール、７５mMのＫＣｌ、３mMのMgCl2、３０mM
のＨＥＰＥＳ、pH7.6、２０ｕＭのアミノ酸混合物（メ
チオニンなし）、５ｕＣｉ35Ｓ−メチオニンおよび１ug
の精製メツセンジヤーＲＮＡを含む最終容量４５ul中で
培養を行なつた。混合物を２５℃で１時間培養し、次い
で冷却および0.1Ｍメチオニン、１０％トリトンＸ−１
００および１０％ナトリウムデオキシコレートからなる
液２５ulの添加により停止した。５ulづつの分別量を0.
3ＭＭフイルターペーパーデイスク上にピペツトで移
し、0.2％のＤ，Ｌ−メチオニンを含むトリクロル酢酸
（ＴＣＡ）中で洗うことにより、とり込まれたもの全体
のトリクロル酢酸不溶解カウントをえた。次いでこのペ
ーパーデイスクを同じＴＣＡ−メチオニン溶液中で９０
℃で１５分間加熱し、シンチレーシヨンカウンターでカ
ウントする前に乾燥した。
合成した35Ｓ−ペプチドの免疫沈澱をローデスらの方法
（上記文献参照）により行なつた。ただし、それぞれの
抗原−抗体沈澱物を0.5Ｍシユクロース、１％トリトン
Ｘ−１００、１％ナトリウムデオキシコレートおよび0.
2ＭのＤＬ−メチオニンからなる液２００ulからなるシ
ユクロースクツシヨン中を沈降させるという変形を用い
た。精製ウロキナーゼ（0.5ug）をキヤリヤーとして反
応混合物に加え、ウサギの抗ウロキナーゼ（ＩｇＧフラ
クシヨン）の５〜１０ugを加えることによつて免疫沈澱
を行なつた。第二抗体（ヤギの抗ウサギＩｇＧ、１００
〜２００ug）を加え、反応混合物を更に４℃で１８時間
培養した。最終の沈澱物を洗い、１０Ｍの尿素、５％Ｓ
ＤＳおよび５％メルカプトエタノール中で再懸濁させて
６０℃で３０分間加熱した。分別量をシンチレーシヨン
カウンター中でカウントして35Ｓとり込み量を求めた。
ウロキナーゼ特異ｍＲＮＡのカウントをＴＣＡにより沈
澱された全カウント分の免疫沈澱カウントのパーセント
として表示した。この反応条件において、精製ウサギの
グロビンのメツセンジヤーＲＮＡの１ugを反応混合物中
に使用するときに反応混合物１ul当り１×１０５cpmが
ＴＣＡにより沈澱しうる。１％以下の放射能がウサギの
ヘモグロビンｍＲＮＡコントロール中でウロキナーゼ抗
体によつて免疫沈澱された。一方、人間の胎生腎臓（Ｈ
ＥＫ）細胞からのPoly Ａを含むｍＲＮＡは免疫沈澱し
うるカウントとして１０％のＴＣＡ不溶性放射能を与え
た。シユクロース密度傾斜遠心分離による２８Ｓより大
きいメツセンジヤーＲＮＡはウロキナーゼ抗体により４
０〜６０％のＴＣＡ不溶性放射能が免疫沈澱したことを
示した。
（上記文献参照）により行なつた。ただし、それぞれの
抗原−抗体沈澱物を0.5Ｍシユクロース、１％トリトン
Ｘ−１００、１％ナトリウムデオキシコレートおよび0.
2ＭのＤＬ−メチオニンからなる液２００ulからなるシ
ユクロースクツシヨン中を沈降させるという変形を用い
た。精製ウロキナーゼ（0.5ug）をキヤリヤーとして反
応混合物に加え、ウサギの抗ウロキナーゼ（ＩｇＧフラ
クシヨン）の５〜１０ugを加えることによつて免疫沈澱
を行なつた。第二抗体（ヤギの抗ウサギＩｇＧ、１００
〜２００ug）を加え、反応混合物を更に４℃で１８時間
培養した。最終の沈澱物を洗い、１０Ｍの尿素、５％Ｓ
ＤＳおよび５％メルカプトエタノール中で再懸濁させて
６０℃で３０分間加熱した。分別量をシンチレーシヨン
カウンター中でカウントして35Ｓとり込み量を求めた。
ウロキナーゼ特異ｍＲＮＡのカウントをＴＣＡにより沈
澱された全カウント分の免疫沈澱カウントのパーセント
として表示した。この反応条件において、精製ウサギの
グロビンのメツセンジヤーＲＮＡの１ugを反応混合物中
に使用するときに反応混合物１ul当り１×１０５cpmが
ＴＣＡにより沈澱しうる。１％以下の放射能がウサギの
ヘモグロビンｍＲＮＡコントロール中でウロキナーゼ抗
体によつて免疫沈澱された。一方、人間の胎生腎臓（Ｈ
ＥＫ）細胞からのPoly Ａを含むｍＲＮＡは免疫沈澱し
うるカウントとして１０％のＴＣＡ不溶性放射能を与え
た。シユクロース密度傾斜遠心分離による２８Ｓより大
きいメツセンジヤーＲＮＡはウロキナーゼ抗体により４
０〜６０％のＴＣＡ不溶性放射能が免疫沈澱したことを
示した。
加えたｍＲＮＡに依存する無細胞での蛋白質の合成はま
たロバーツおよびピーターソン（ＰＮＡＳ、７０、第２
３３０頁、１９７３年）によつて述べられている小麦発
芽系中で行なつた。ウサギの網内皮細胞系中で上述の如
く免疫沈澱を行なつた。シユクロース密度傾斜からの２
８Ｓより大きいメツセンジヤーＲＮＡは免疫沈澱しうる
カウントとしてＴＣＡ不溶性カウントの９０％をも与え
た。
たロバーツおよびピーターソン（ＰＮＡＳ、７０、第２
３３０頁、１９７３年）によつて述べられている小麦発
芽系中で行なつた。ウサギの網内皮細胞系中で上述の如
く免疫沈澱を行なつた。シユクロース密度傾斜からの２
８Ｓより大きいメツセンジヤーＲＮＡは免疫沈澱しうる
カウントとしてＴＣＡ不溶性カウントの９０％をも与え
た。
実施例３． ｍＲＮＡから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成 フリードマンおよびロスバツシユの方法（Nucleic Acid
s Res.,４、第３４５５頁、１９７７年）に従いｍＲＮ
Ａの逆転写によつて単一ストランドｃＤＮＡを合成し
た。ただし次の変形を用いた。ｍＲＮＡでオリゴｄＴプ
ライマーをアニール化するための反応混合物（５００u
l）は２０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH8.5、２０mMのＫＣ
ｌ、４mMのMgCl2、２０ugのPoly Ａ含有のｍＲＮＡお
よび1.5ugのｄＴ30を含んでいた。ｃＤＮＡ合成のため
の最終反応混合物（１ml）は５０mMのTris−ＨＣｌ、pH
8.5、５０mMのＫＣｌ、１０mMのMgCl2、１０mMのジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）、１０ugのアクチノマイシン
Ｄ、各１mMのデオキシアデノシントリホスフエート（ｄ
ＡＴＰ）、デオキシグアニジントリホスフエート（ｄＧ
ＴＰ）、チミジントリホスフエート（ＴＴＰ）、８００
uM〔α−３２ｐ〕ｄＣＴＰおよび３２５単位のＡＭＶ逆
転写酵素を含んでいた。４２℃で３０分間培養後、酵素
３２５単位を別に加えた。２時間の培養後、0.5Ｍのエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の５０ulを加えるこ
とによつて反応を停止した。この溶液に１０ＭのＮａＯ
Ｈの４０ulを加え、次いで室温で１８〜２０時間培養し
た。次いで、ゆつくりかきまぜながらＨＥＰＥＳを加え
ることによつて溶液をpH8.5に中和した。次いでこの溶
液をフエノール抽出、セフアクリルＳ−３００ゲル過
および高分子量のｃＤＮＡを含有する排除フラクシヨン
をメタノール沈澱に付した。収率は１５〜２５％であつ
た。ｃＤＮＡ生成物を７Ｍ尿素中の3.5％ポリアクリル
アミド−スラブゲル（２０×４０×0.3cm）中の電気泳
動に付した。長さのマーカーとしてラムダＤＮＡのHind
IIIエンドヌクレアーゼ消化を使用した。ゲルの放射線
写真後、主たる種として3.０００〜6.０００のヌクレオ
チド残基を有する単一ストランドｃＤＮＡを検出した。
s Res.,４、第３４５５頁、１９７７年）に従いｍＲＮ
Ａの逆転写によつて単一ストランドｃＤＮＡを合成し
た。ただし次の変形を用いた。ｍＲＮＡでオリゴｄＴプ
ライマーをアニール化するための反応混合物（５００u
l）は２０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH8.5、２０mMのＫＣ
ｌ、４mMのMgCl2、２０ugのPoly Ａ含有のｍＲＮＡお
よび1.5ugのｄＴ30を含んでいた。ｃＤＮＡ合成のため
の最終反応混合物（１ml）は５０mMのTris−ＨＣｌ、pH
8.5、５０mMのＫＣｌ、１０mMのMgCl2、１０mMのジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）、１０ugのアクチノマイシン
Ｄ、各１mMのデオキシアデノシントリホスフエート（ｄ
ＡＴＰ）、デオキシグアニジントリホスフエート（ｄＧ
ＴＰ）、チミジントリホスフエート（ＴＴＰ）、８００
uM〔α−３２ｐ〕ｄＣＴＰおよび３２５単位のＡＭＶ逆
転写酵素を含んでいた。４２℃で３０分間培養後、酵素
３２５単位を別に加えた。２時間の培養後、0.5Ｍのエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の５０ulを加えるこ
とによつて反応を停止した。この溶液に１０ＭのＮａＯ
Ｈの４０ulを加え、次いで室温で１８〜２０時間培養し
た。次いで、ゆつくりかきまぜながらＨＥＰＥＳを加え
ることによつて溶液をpH8.5に中和した。次いでこの溶
液をフエノール抽出、セフアクリルＳ−３００ゲル過
および高分子量のｃＤＮＡを含有する排除フラクシヨン
をメタノール沈澱に付した。収率は１５〜２５％であつ
た。ｃＤＮＡ生成物を７Ｍ尿素中の3.5％ポリアクリル
アミド−スラブゲル（２０×４０×0.3cm）中の電気泳
動に付した。長さのマーカーとしてラムダＤＮＡのHind
IIIエンドヌクレアーゼ消化を使用した。ゲルの放射線
写真後、主たる種として3.０００〜6.０００のヌクレオ
チド残基を有する単一ストランドｃＤＮＡを検出した。
ジヤコブセンらによつて述べられた反応条件（Eur.J.Bi
ochem.,４５、第６２３頁、１９７４年）に類似して、
イーコリイからのＤＮＡポリメラーゼの大きな断片を使
用することによつて、ｃＤＮＡの第二のストランドを合
成した。反応は反応容量２００ul中に1.4ｎモルのｃＤ
ＮＡ、0.1ＭのＨＥＰＥＳ、pH7.0、それぞれ４００uMの
ｄＡＴＰ、デオキシシトシントリホスフエート（ｄＣＴ
Ｐ）、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ、１０mMのMgCl2、１０mM
のジチオスレイトールならびに７０mMのＫＣｌを含んで
いた。１５℃で1.5時間培養を行なつた。次いで0.5Ｍの
ＥＤＴＡの２０ulを加え、そしてＤＮＡをフエノール抽
出およびエタノール沈澱によつて精製した。
ochem.,４５、第６２３頁、１９７４年）に類似して、
イーコリイからのＤＮＡポリメラーゼの大きな断片を使
用することによつて、ｃＤＮＡの第二のストランドを合
成した。反応は反応容量２００ul中に1.4ｎモルのｃＤ
ＮＡ、0.1ＭのＨＥＰＥＳ、pH7.0、それぞれ４００uMの
ｄＡＴＰ、デオキシシトシントリホスフエート（ｄＣＴ
Ｐ）、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ、１０mMのMgCl2、１０mM
のジチオスレイトールならびに７０mMのＫＣｌを含んで
いた。１５℃で1.5時間培養を行なつた。次いで0.5Ｍの
ＥＤＴＡの２０ulを加え、そしてＤＮＡをフエノール抽
出およびエタノール沈澱によつて精製した。
次いで上述の二重ストランドｃＤＮＡを、３０mMの酢酸
ナトリウム、pH4.6、１mMのＺｎＳＯ４、２５０mMのＮ
ａＣｌおよび１００ug／mlのイーコリイｔＲＮＡの存在
下において、１５℃で３時間Ｓ１ヌクレアーゼ（１２５
０単位）により処理した。ＤＮＡの約５８％（ほぼ0.5u
g）が処理後に回収された。ベツクマンＬ５−７５超遠
心分離器中の４０，０００rpm揺動バケツＳＷ４０ロー
タ中の線状シユクロース密度傾斜〔１０mMのＮａＣｌ１
０mMのＴｒｉｓ pH8.0、１mMのＥＤＴＡからなる塩水
−Ｔｒｉｓ−ＥＤ ＴＡ（ＳＴＥ）中１５〜３０％〕中
で２０℃で１６時間ＤＮＡを遠心分離した。2,０００個
の塩基ペアより大きいＤＮＡをプールし、エタノール沈
澱して、組換えＤＮＡ合成のためＰｏｌｙ Ｃ束をつけ
るのに使用した。
ナトリウム、pH4.6、１mMのＺｎＳＯ４、２５０mMのＮ
ａＣｌおよび１００ug／mlのイーコリイｔＲＮＡの存在
下において、１５℃で３時間Ｓ１ヌクレアーゼ（１２５
０単位）により処理した。ＤＮＡの約５８％（ほぼ0.5u
g）が処理後に回収された。ベツクマンＬ５−７５超遠
心分離器中の４０，０００rpm揺動バケツＳＷ４０ロー
タ中の線状シユクロース密度傾斜〔１０mMのＮａＣｌ１
０mMのＴｒｉｓ pH8.0、１mMのＥＤＴＡからなる塩水
−Ｔｒｉｓ−ＥＤ ＴＡ（ＳＴＥ）中１５〜３０％〕中
で２０℃で１６時間ＤＮＡを遠心分離した。2,０００個
の塩基ペアより大きいＤＮＡをプールし、エタノール沈
澱して、組換えＤＮＡ合成のためＰｏｌｙ Ｃ束をつけ
るのに使用した。
実施例４． 組換えＤＮＡの合成 二重ストランドｃＤＮＡへのホモポリマー束の添加をロ
イコウドハリイら（Nucleic Acid Res.,３、第８６３
頁、１９７６年）によつて述べられているようにエキソ
ヌクレアーゼを使用することなしに行なつた。反応混合
物（３００ul）は１００mMのカリウムカコジレートpH6.
9、３０mMのＴｒｉｓ塩基、１mMのＣｏＣｌ２、２００u
MのＤＴＴ、６ｎモルの二重ｃＤＮＡ（全ヌクレオチド
残基中）、１００uMの〔α−３２ｐ〕ｄＣＴＰおよび２
４０単位のターミナルトランスフエラーゼを含んでい
た。２０分後に0.5ＭのＥＤＴＡの３０ulおよび中和し
たフエノール３００ulを添加して反応を停止した。十分
に混合した後、内容物を１５００ｘｇで１０分間遠心分
離して水性層を除いた。１００mMのＮａＣｌ（pH8.0）
の１０ulによりフエノール層を二回抽出し、また集めた
水性層をエーテル抽出し、エタノール沈澱した。
イコウドハリイら（Nucleic Acid Res.,３、第８６３
頁、１９７６年）によつて述べられているようにエキソ
ヌクレアーゼを使用することなしに行なつた。反応混合
物（３００ul）は１００mMのカリウムカコジレートpH6.
9、３０mMのＴｒｉｓ塩基、１mMのＣｏＣｌ２、２００u
MのＤＴＴ、６ｎモルの二重ｃＤＮＡ（全ヌクレオチド
残基中）、１００uMの〔α−３２ｐ〕ｄＣＴＰおよび２
４０単位のターミナルトランスフエラーゼを含んでい
た。２０分後に0.5ＭのＥＤＴＡの３０ulおよび中和し
たフエノール３００ulを添加して反応を停止した。十分
に混合した後、内容物を１５００ｘｇで１０分間遠心分
離して水性層を除いた。１００mMのＮａＣｌ（pH8.0）
の１０ulによりフエノール層を二回抽出し、また集めた
水性層をエーテル抽出し、エタノール沈澱した。
二重ストランドｃＤＮＡ中に３′−ＯＨ端部のほぼ２０
ｐモルから、１４００ｐモルまでの〔３２ｐ〕ｄＣＭＰ
がとり込まれた。これはＤＮＡストランド当り７０個の
ｄＣＭＰ残基が添加されることを示すものであつた。線
状プラスミドを次の如くしてえた。反応混合物（１００
ul）は１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH7.8、１０mMのＭ
ｇＣｌ２、１０mMのＤＴＴ、５０mMのＮａＣｌ、１０ug
のＰＢＲ３２２ ＤＮＡおよび５単位のPst Ｉを含ん
でいた。反応混合物の一分別量（５ul）をアガロースゲ
ル電気泳動により分析して消化の完全なことを調べた。
次いで線状ＤＮＡをフエノール抽出し、エタノール沈澱
により分離した。
ｐモルから、１４００ｐモルまでの〔３２ｐ〕ｄＣＭＰ
がとり込まれた。これはＤＮＡストランド当り７０個の
ｄＣＭＰ残基が添加されることを示すものであつた。線
状プラスミドを次の如くしてえた。反応混合物（１００
ul）は１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH7.8、１０mMのＭ
ｇＣｌ２、１０mMのＤＴＴ、５０mMのＮａＣｌ、１０ug
のＰＢＲ３２２ ＤＮＡおよび５単位のPst Ｉを含ん
でいた。反応混合物の一分別量（５ul）をアガロースゲ
ル電気泳動により分析して消化の完全なことを調べた。
次いで線状ＤＮＡをフエノール抽出し、エタノール沈澱
により分離した。
このＤＮＡを１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH0.8および
0.5mMのＥＤＴＡからなる液の１００ul中に懸濁させ、
１００uMの〔３Ｈ〕ｄＴＴＰおよび２４０単位のターミ
ナルトランスフエラーゼを含む上述のターミナルトラン
スフエラーゼ緩衝液中で培養した。４２℃で０分、１
分、２分、３分、４分および５分の間隔で分別物（各５
ul）を酸不溶性放射能についてモニターした。培養５分
後の残りの溶液をフエノール抽出しそしてエタノール沈
澱した。この期間中、全１３０ｐモルのｄＧＭＰ残基が
とり込まれた。３′−ＯＨ末端の5.4ｐモルを含むこの
ＤＮＡサンプルに、ｐＢＲ３２２ＤＮＡのストランド当
り平均２４個の残基を付加した。
0.5mMのＥＤＴＡからなる液の１００ul中に懸濁させ、
１００uMの〔３Ｈ〕ｄＴＴＰおよび２４０単位のターミ
ナルトランスフエラーゼを含む上述のターミナルトラン
スフエラーゼ緩衝液中で培養した。４２℃で０分、１
分、２分、３分、４分および５分の間隔で分別物（各５
ul）を酸不溶性放射能についてモニターした。培養５分
後の残りの溶液をフエノール抽出しそしてエタノール沈
澱した。この期間中、全１３０ｐモルのｄＧＭＰ残基が
とり込まれた。３′−ＯＨ末端の5.4ｐモルを含むこの
ＤＮＡサンプルに、ｐＢＲ３２２ＤＮＡのストランド当
り平均２４個の残基を付加した。
ポリデオキシシチジル酸（ｐｏｌｙ ｄＣ）（約0.１５
ｐモル）をつけた大きな二重ストランドｃＤＮＡを容量
１００ulの0.1ＭのＮａＣｌ中で当量のポリデオキシグ
アニリジン酸（ｐｏｌｙ ｄＧ）をテイル付加したｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡにアニール化した。混合物を６５℃で３
時間加熱して４２℃で１６時間放置してこのＤＮＡ調製
物をアニール化した。
ｐモル）をつけた大きな二重ストランドｃＤＮＡを容量
１００ulの0.1ＭのＮａＣｌ中で当量のポリデオキシグ
アニリジン酸（ｐｏｌｙ ｄＧ）をテイル付加したｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡにアニール化した。混合物を６５℃で３
時間加熱して４２℃で１６時間放置してこのＤＮＡ調製
物をアニール化した。
実施例５． イーコリイの形質転換 カーチスらの方法（ＣＲＣプレス発行、１９７８年、Ch
arkrabarty，Ａ．Ｍ．編集の「Genetic Engineering」
のＷ．Salserによる第３章、第３頁に記載の方法）を使
用してアニール化したＤＮＡ混合物によりＸ１７７６
（Ｆ−ton Ａ５３ dap Ｄ８min Ａ１ min Ｂ２
Sup Ｅ４２ gal△４０− rfb−２ nal Ａ２５ om
s−２ thy Ａ５７ met Ｃ６５ oms−１〔bioＨ−a
sd〕△２９ cyc Ｂ２ cyc Ａ１ hsd Ｒ２）を形
質転換した。補充Ｌ液（ジアミノピメリン酸１００ug／
ml、ナリジキシン酸２５ug／mlおよびチミン４０ug／m
l）中で細胞を３７℃で0.３Ａ600にまで生育し、室温で
１０分間１７００ｘｇで遠心分離してペレツトを集め
た。
arkrabarty，Ａ．Ｍ．編集の「Genetic Engineering」
のＷ．Salserによる第３章、第３頁に記載の方法）を使
用してアニール化したＤＮＡ混合物によりＸ１７７６
（Ｆ−ton Ａ５３ dap Ｄ８min Ａ１ min Ｂ２
Sup Ｅ４２ gal△４０− rfb−２ nal Ａ２５ om
s−２ thy Ａ５７ met Ｃ６５ oms−１〔bioＨ−a
sd〕△２９ cyc Ｂ２ cyc Ａ１ hsd Ｒ２）を形
質転換した。補充Ｌ液（ジアミノピメリン酸１００ug／
ml、ナリジキシン酸２５ug／mlおよびチミン４０ug／m
l）中で細胞を３７℃で0.３Ａ600にまで生育し、室温で
１０分間１７００ｘｇで遠心分離してペレツトを集め
た。
細胞を１０mMのＮａＣｌ（1/2容量）中に懸濁させ、遠
心分離し、再び1/2容量のＣａ緩衝液（７５mMのＣａＣ
ｌ２、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのＴｒｉｓ ＨＣ
ｌ、pH7.０）中に懸濁させた。室温で３０分後、細胞を
遠心分離し、再び１／10容量のＣａ緩衝液に懸濁し、そ
して０℃に冷却した。２容量の細胞を１容量のＤＮＡと
混合し、０℃で３０分間保ち、４２℃で１分間加熱し、
そして室温で十分間放置し、１０容量の補充Ｌ液と混合
し、そして３７℃で１００分間培養した。培養物を少し
づつピペツトにより２mlのソフトＬ−カンテン（0.６
％）中に移しそのプレート上に敷くことによつて、細胞
を１2.５ugのテトラサイクリンを含有する補充Ｌ−カン
テン上にプレート状においた。このプレートを３７℃で
２日間培養した。全３２種類のテトラサイクリン耐性形
質転換体をえた。これらのうち、４種類はアンピシリン
感受性（ＡＭＰＳ）であり、そのプラスミド中に組換え
体をもつていた。３種類は約4.２キロの塩基ペアの類似
組換え体をもつていた。これらのプラスミドの一つの制
限地図を第１図に示す。
心分離し、再び1/2容量のＣａ緩衝液（７５mMのＣａＣ
ｌ２、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのＴｒｉｓ ＨＣ
ｌ、pH7.０）中に懸濁させた。室温で３０分後、細胞を
遠心分離し、再び１／10容量のＣａ緩衝液に懸濁し、そ
して０℃に冷却した。２容量の細胞を１容量のＤＮＡと
混合し、０℃で３０分間保ち、４２℃で１分間加熱し、
そして室温で十分間放置し、１０容量の補充Ｌ液と混合
し、そして３７℃で１００分間培養した。培養物を少し
づつピペツトにより２mlのソフトＬ−カンテン（0.６
％）中に移しそのプレート上に敷くことによつて、細胞
を１2.５ugのテトラサイクリンを含有する補充Ｌ−カン
テン上にプレート状においた。このプレートを３７℃で
２日間培養した。全３２種類のテトラサイクリン耐性形
質転換体をえた。これらのうち、４種類はアンピシリン
感受性（ＡＭＰＳ）であり、そのプラスミド中に組換え
体をもつていた。３種類は約4.２キロの塩基ペアの類似
組換え体をもつていた。これらのプラスミドの一つの制
限地図を第１図に示す。
実施例６． 形質転換細胞中のプラスミノーゲンアクチベーター蛋白
質生産の検出、分離および特性表示 組換えＤＮＡを含有するアンピシリン感受性、テトラサ
イクリン耐性イーコリイ形質転換体をえらんで免疫学的
検知方法を使用してウロキナーゼ様物質の可能な発現を
スクリーニングした。プラスチツクミクロタイタープレ
ートを使用する固相放射性免疫試験（ＲＩＡ）をヒツツ
エマンらの方法（Methods in Enzymology：Recombinant
ＤＮＡ、１９７９年）に従い、ただしやゝ変形して行な
つた。シアノーゲンブロマイドにより活性化したペーパ
ーを使用する直接ＲＩＡ法において、ウロキナーゼもし
くはウロキナーゼ様物質をシアノーゲンブロマイドによ
り活性化したペーパーと直接反応させ、次いで125Ｉで
標識した抗ウロキナーゼ抗体の結合によつて検出した。
質生産の検出、分離および特性表示 組換えＤＮＡを含有するアンピシリン感受性、テトラサ
イクリン耐性イーコリイ形質転換体をえらんで免疫学的
検知方法を使用してウロキナーゼ様物質の可能な発現を
スクリーニングした。プラスチツクミクロタイタープレ
ートを使用する固相放射性免疫試験（ＲＩＡ）をヒツツ
エマンらの方法（Methods in Enzymology：Recombinant
ＤＮＡ、１９７９年）に従い、ただしやゝ変形して行な
つた。シアノーゲンブロマイドにより活性化したペーパ
ーを使用する直接ＲＩＡ法において、ウロキナーゼもし
くはウロキナーゼ様物質をシアノーゲンブロマイドによ
り活性化したペーパーと直接反応させ、次いで125Ｉで
標識した抗ウロキナーゼ抗体の結合によつて検出した。
細胞溶解物はスイーバーグらの方法（Nature，２７６、
第７９５頁、１９７８年）により調製した。イーコリイ
形質転換体の５００mlを一夜生育し、１0,０００ｘｇで
１０分間遠心分離することにより細胞を集めた。細胞を
１０mMのＴｒｉｓ（pH8.0）および１mMのＥＤＴＡで洗
い、同じ緩衝液5.0ml中に再び懸濁させた。リゾチーム
（５mg／ml）の0.5mlを添加した後、混合物を氷上に３
０分間保つた。ＭｇＣｌ２を加えて最縮濃度１０mM〔そ
れぞれ0.1mlのＤＮアーゼ（１mg／ml）、ＲＮアーゼ
（５mg／ml）およびＭＰ−４０（５％）〕にした。培養
を４℃で１時間進行させ、混合物を遠心分離（１0,００
０ｘｇ、２０分、０℃）により清澄にした。上澄み液を
使用してウロキナーゼ様物質のスクリーニングを行なつ
た。
第７９５頁、１９７８年）により調製した。イーコリイ
形質転換体の５００mlを一夜生育し、１0,０００ｘｇで
１０分間遠心分離することにより細胞を集めた。細胞を
１０mMのＴｒｉｓ（pH8.0）および１mMのＥＤＴＡで洗
い、同じ緩衝液5.0ml中に再び懸濁させた。リゾチーム
（５mg／ml）の0.5mlを添加した後、混合物を氷上に３
０分間保つた。ＭｇＣｌ２を加えて最縮濃度１０mM〔そ
れぞれ0.1mlのＤＮアーゼ（１mg／ml）、ＲＮアーゼ
（５mg／ml）およびＭＰ−４０（５％）〕にした。培養
を４℃で１時間進行させ、混合物を遠心分離（１0,００
０ｘｇ、２０分、０℃）により清澄にした。上澄み液を
使用してウロキナーゼ様物質のスクリーニングを行なつ
た。
(a)溶解物の分別物をシアノーゲンブロマイドペーパー
（直接ＲＩＡ法）上に滴下してヒツツエマンらの方法
（上記参照）により前述の如く125Ｉ−ウロキナーゼと
反応させた。既知量のウロキナーゼも陽性のコントロー
ルとして滴下した。組換えＤＮＡ、ｐＡＢＢ ２６を内
蔵している一種の形質転換体は強い陽性反応を示した。
（直接ＲＩＡ法）上に滴下してヒツツエマンらの方法
（上記参照）により前述の如く125Ｉ−ウロキナーゼと
反応させた。既知量のウロキナーゼも陽性のコントロー
ルとして滴下した。組換えＤＮＡ、ｐＡＢＢ ２６を内
蔵している一種の形質転換体は強い陽性反応を示した。
(b)溶解物の分別物を緩衝液（0.１Ｍのカリウムホスフ
エート、pH7.0および0.４ＭのＮａＣｌ）で１０倍にう
すめ、１×５mlのベンツアミジン親和カラム（ホルムバ
ークら、ＢＢＡ ４４５、第２１５頁、１９７６年）上
に充てんした。このかラムをＡ280の読みがバツクグラ
ウンドに達するまで緩衝液で十分に洗つた。このカラム
を溶出緩衝液（0.１Ｍの酢酸ナトリウム、pH4.0、およ
び0.４ＭのＮａＣｌ）で溶出してフラクシヨンを集め
た。それぞれのフラクシヨンからの分別物を固相ＲＩＡ
で分析した。
エート、pH7.0および0.４ＭのＮａＣｌ）で１０倍にう
すめ、１×５mlのベンツアミジン親和カラム（ホルムバ
ークら、ＢＢＡ ４４５、第２１５頁、１９７６年）上
に充てんした。このかラムをＡ280の読みがバツクグラ
ウンドに達するまで緩衝液で十分に洗つた。このカラム
を溶出緩衝液（0.１Ｍの酢酸ナトリウム、pH4.0、およ
び0.４ＭのＮａＣｌ）で溶出してフラクシヨンを集め
た。それぞれのフラクシヨンからの分別物を固相ＲＩＡ
で分析した。
形質転換体Ｘ１７７６（ｐＡＢＢ ２６）からの細胞溶
解物がベンツアミジン親和カラム中を通過するとき、溶
解物からの若干のＡ280物質がカラム中に保持され、低
いpHおよび高度の塩によつてのみ溶出された。これらの
保持物質はウロキナーゼの固相ＲＩＡにおいて陽性反応
を示したが、形質転換体Ｘ１７７６（ｐＢＲ ３２２）
からのコントロール溶解物は陰性であつた（第２図）。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびそれにつ
づくシアノーゲンブロマイド活性化ペーパー上へのフイ
ルター親和性移動（Ｊ．Biol.Chem,２５４、第１２２４
０頁、１９７９年）により、生成物をその分子の大きさ
について更に特徴づけた。125Ｉ−標識のウロキナーゼ
−特異抗体はおおよその分子量３2,０００、５2,００
０、８7,０００、１２4,０００および１５4,０００の５
種の別々の大きさのプラスミノーゲンアクチベーター蛋
白質を示した。
解物がベンツアミジン親和カラム中を通過するとき、溶
解物からの若干のＡ280物質がカラム中に保持され、低
いpHおよび高度の塩によつてのみ溶出された。これらの
保持物質はウロキナーゼの固相ＲＩＡにおいて陽性反応
を示したが、形質転換体Ｘ１７７６（ｐＢＲ ３２２）
からのコントロール溶解物は陰性であつた（第２図）。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびそれにつ
づくシアノーゲンブロマイド活性化ペーパー上へのフイ
ルター親和性移動（Ｊ．Biol.Chem,２５４、第１２２４
０頁、１９７９年）により、生成物をその分子の大きさ
について更に特徴づけた。125Ｉ−標識のウロキナーゼ
−特異抗体はおおよその分子量３2,０００、５2,００
０、８7,０００、１２4,０００および１５4,０００の５
種の別々の大きさのプラスミノーゲンアクチベーター蛋
白質を示した。
プラスミノーゲンアクチベーターの活性は、アンケレス
らの方法（Ｊ．Exp.Med.,１３７、第８５〜１１１頁、
１９７３年）から変形した敏感な125Ｉフイブリノリシ
ス分析を使用して測定した。硬質ミクロタイタープレー
トを125Ｉフイブリノーゲン（２ug、１０５cpm／well）
で被覆し、このフイブリノーゲンをプラスミノーゲンの
ないトロンビン（0.1単位／well）を使用してフイブリ
ンクロツトに転化した。0.１ＭのTris ＨＣｌ、pH8.
1、0.０２５％の人間の血清のアルブミン、およびリジ
ンセフアロース上の親和クロマトグラフによつて調製し
た2.5ug／mlのプラスミンのないプラスミノーゲンを含
む全容量７０ul中で分析を行なつた。分析の範囲は0.０
５プロウグ（Ploug）単位／mlから１０単位／mlであつ
たが、0.００２単位まで検出することはできた。イーコ
リイの粗溶解物はこの分析で阻害されているので、形質
転換体調製物はイオン交換クロマトグラフまたはベンツ
アミジン−セフアロース上の親和クロマトグラフによつ
て、分析前に部分的に精製した（第１表）。
らの方法（Ｊ．Exp.Med.,１３７、第８５〜１１１頁、
１９７３年）から変形した敏感な125Ｉフイブリノリシ
ス分析を使用して測定した。硬質ミクロタイタープレー
トを125Ｉフイブリノーゲン（２ug、１０５cpm／well）
で被覆し、このフイブリノーゲンをプラスミノーゲンの
ないトロンビン（0.1単位／well）を使用してフイブリ
ンクロツトに転化した。0.１ＭのTris ＨＣｌ、pH8.
1、0.０２５％の人間の血清のアルブミン、およびリジ
ンセフアロース上の親和クロマトグラフによつて調製し
た2.5ug／mlのプラスミンのないプラスミノーゲンを含
む全容量７０ul中で分析を行なつた。分析の範囲は0.０
５プロウグ（Ploug）単位／mlから１０単位／mlであつ
たが、0.００２単位まで検出することはできた。イーコ
リイの粗溶解物はこの分析で阻害されているので、形質
転換体調製物はイオン交換クロマトグラフまたはベンツ
アミジン−セフアロース上の親和クロマトグラフによつ
て、分析前に部分的に精製した（第１表）。
形質転換細胞Ｘ１７７６（ｐＡＢＢ ２６）のウロキナ
ーゼ親和カラム溶出物をこの分析を使用して試験したと
き、かなりの線維素溶解活性が検出されたがｐＢＲ３２
２により形質転換したＸ１７７６からの試料はこのよう
な活性を示たなかつた。更に、人間のウロキナーゼに特
有な抗血清による免疫沈澱はこの活性を溶液から除くこ
とができた。これは形質転換細胞Ｘ１７７６（ｐＡＢＢ
２６）からのプラスミノーゲンアクチベーター活性と
人間のウロキナーゼとの間の免疫化学的関連の確認を与
えるものである（第１表参照）。
ーゼ親和カラム溶出物をこの分析を使用して試験したと
き、かなりの線維素溶解活性が検出されたがｐＢＲ３２
２により形質転換したＸ１７７６からの試料はこのよう
な活性を示たなかつた。更に、人間のウロキナーゼに特
有な抗血清による免疫沈澱はこの活性を溶液から除くこ
とができた。これは形質転換細胞Ｘ１７７６（ｐＡＢＢ
２６）からのプラスミノーゲンアクチベーター活性と
人間のウロキナーゼとの間の免疫化学的関連の確認を与
えるものである（第１表参照）。
実施例７． イーコリイ菌株Ｘ１７７６（ｐＡＢＢ ２６）の生育 イーコリイ形質転換体Ｘ１７７６（ｐＡＢＢ ２６）の
細胞を１2.５ｗｇ／mlのテトラサイクリン塩酸塩を含む
Ｌ−液（Ｊ．Ｈ．Miller,Experiments in Molecular Ge
netics,Cold Spring Harbor Laboratory,１９７２年）
中で生育した。更に、0.５％カザミノ酸、0.５％グルコ
ース、0.5ugのＤ−ビオチン、１００ugのＬ−ジアミノ
ピメリン酸、４０ugのナルジキシン酸および１2.５ugの
テトラサイクリン塩酸塩（すべてml当り）を含むＭ９媒
質（Ｊ．Ｈ．Miller,Experiments in Molecular Geneti
cs,Cold Spring Harbor Laboratory, １９７２年）も
生育および上記菌株からのプラスミノーゲンアクチベー
ターの製造のために使用した。振とうしながら細胞を３
７℃で生育し、十分な生育達成後に、プラスミノーゲン
アクチベーター生産を検出する目的で回収した。
細胞を１2.５ｗｇ／mlのテトラサイクリン塩酸塩を含む
Ｌ−液（Ｊ．Ｈ．Miller,Experiments in Molecular Ge
netics,Cold Spring Harbor Laboratory,１９７２年）
中で生育した。更に、0.５％カザミノ酸、0.５％グルコ
ース、0.5ugのＤ−ビオチン、１００ugのＬ−ジアミノ
ピメリン酸、４０ugのナルジキシン酸および１2.５ugの
テトラサイクリン塩酸塩（すべてml当り）を含むＭ９媒
質（Ｊ．Ｈ．Miller,Experiments in Molecular Geneti
cs,Cold Spring Harbor Laboratory, １９７２年）も
生育および上記菌株からのプラスミノーゲンアクチベー
ターの製造のために使用した。振とうしながら細胞を３
７℃で生育し、十分な生育達成後に、プラスミノーゲン
アクチベーター生産を検出する目的で回収した。
第１図はウロキナーゼに関連したプラスミノーゲンアク
チベーター蛋白質をコードするプラスミド含有ＤＮＡの
制限地図を図式的に説明するものであり、円内の数値は
そこに示す位置の間の塩基ペアの数を示し、円外の記号
はそれぞれの位置においてＤＮＡを切断する特定の制限
酵素を示し、Ｐｓｔなる記号で示す太い円周部分はプラ
スミノーゲンアクチベーターをコードするＤＮＡ部分の
組入れられる場所である。 第２図は変態菌からのウロキナーゼ様物質の親和クロマ
トグラフからえられたデータを示すグラフであり、横軸
はフラクシヨン数を示し、縦軸は毎分のカウント数を示
す。実線のグラフは形質転換細胞からの溶解物のデータ
を示し、破線のグラフはコントロールからの溶解物のデ
ータを示す。
チベーター蛋白質をコードするプラスミド含有ＤＮＡの
制限地図を図式的に説明するものであり、円内の数値は
そこに示す位置の間の塩基ペアの数を示し、円外の記号
はそれぞれの位置においてＤＮＡを切断する特定の制限
酵素を示し、Ｐｓｔなる記号で示す太い円周部分はプラ
スミノーゲンアクチベーターをコードするＤＮＡ部分の
組入れられる場所である。 第２図は変態菌からのウロキナーゼ様物質の親和クロマ
トグラフからえられたデータを示すグラフであり、横軸
はフラクシヨン数を示し、縦軸は毎分のカウント数を示
す。実線のグラフは形質転換細胞からの溶解物のデータ
を示し、破線のグラフはコントロールからの溶解物のデ
ータを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラナジツト ロイコードハリー アメリカ合衆国イリノイ州 60083 ワー ズワース トウエンテイフアースト スト リート 15390 (72)発明者 マイケル チエング‐イエン チエン アメリカ合衆国ニユーヨーク州 14870 ペインテツド ポスト クノール ブロツ ク ウエスト 12 (72)発明者 シヤウ‐ガング リー アメリカ合衆国イリノイ州 60048 リバ テイビル ウエクフオード コート 907 (72)発明者 ベリー ジヨセフ ラズキン アメリカ合衆国テキサス州 77096 ハウ ストン クラリツジ 5711 (72)発明者 ウイリイ ユーゲン スコレンク ドイツ連邦共和国 デイ‐8120 ウエイル ヘイム キエフアンストラーセ ４
Claims (8)
- 【請求項１】ヒト由来のプラスミノーゲンアクチベータ
ー蛋白質をコードする下記の制限酵素地図で表されるポ
リデオキシリボヌクレオチドセグメントをその中に組み
入れたプラスミドベクターからなる、大腸菌の形質転換
に適合させた組換え体プラスミド。 - 【請求項２】ベクターがＥ．ｃｏｌｉプラスミドｐＢＲ
３２２からなる特許請求の範囲第１項記載の組換え体プ
ラスミド。 - 【請求項３】Ｐｓｔ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を
含む特許請求の範囲第１項記載の組換え体プラスミド。 - 【請求項４】大腸菌がＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株Ｘ１
７７６である特許請求の範囲第１項記載の組換え体プラ
スミド。 - 【請求項５】ヒト由来のプラスミノーゲンアクチベータ
ー蛋白質をコードする下記の制限酵素地図で表されるポ
リデオキシリボヌクレオチドセグメントをその中に組み
入れたプラスミドベクターからなる組換え体プラスミド
を含む大腸菌の形質転換体。 - 【請求項６】プラスミドベクターがＥ．ｃｏｌｉプラス
ミドｐＢＲ３２２からなる特許請求の範囲第５項記載の
形質転換体。 - 【請求項７】Ｐｓｔ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を
含む特許請求の範囲第５項記載の形質転換体。 - 【請求項８】大腸菌がＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株Ｘ１
７７６である特許請求の範囲第５項記載の形質転換体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US137032 | 1980-04-03 | ||
| US06/137,032 US4370417A (en) | 1980-04-03 | 1980-04-03 | Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56049492A Division JPH0653070B2 (ja) | 1980-04-03 | 1981-04-03 | 組換えプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質の製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6056525A Division JP2964439B2 (ja) | 1980-04-03 | 1994-02-17 | プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0284186A JPH0284186A (ja) | 1990-03-26 |
| JPH0653072B2 true JPH0653072B2 (ja) | 1994-07-20 |
Family
ID=22475512
Family Applications (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56049492A Expired - Lifetime JPH0653070B2 (ja) | 1980-04-03 | 1981-04-03 | 組換えプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質の製造法 |
| JP1132952A Expired - Lifetime JPH0653072B2 (ja) | 1980-04-03 | 1989-05-29 | プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードするポリデオキシリボヌクレオチド、それを含むベクター及びそれを含む形質転換体 |
| JP1132953A Pending JPH0276823A (ja) | 1980-04-03 | 1989-05-29 | 血栓溶解剤 |
| JP6056525A Expired - Lifetime JP2964439B2 (ja) | 1980-04-03 | 1994-02-17 | プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質 |
| JP6056526A Expired - Lifetime JP2873536B2 (ja) | 1980-04-03 | 1994-02-17 | プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質を製造する方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56049492A Expired - Lifetime JPH0653070B2 (ja) | 1980-04-03 | 1981-04-03 | 組換えプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質の製造法 |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1132953A Pending JPH0276823A (ja) | 1980-04-03 | 1989-05-29 | 血栓溶解剤 |
| JP6056525A Expired - Lifetime JP2964439B2 (ja) | 1980-04-03 | 1994-02-17 | プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質 |
| JP6056526A Expired - Lifetime JP2873536B2 (ja) | 1980-04-03 | 1994-02-17 | プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質を製造する方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4370417A (ja) |
| EP (1) | EP0037687B1 (ja) |
| JP (5) | JPH0653070B2 (ja) |
| DE (1) | DE3177260D1 (ja) |
| ES (1) | ES8205263A1 (ja) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4370417A (en) * | 1980-04-03 | 1983-01-25 | Abbott Laboratories | Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator |
| NL8003402A (nl) * | 1980-06-11 | 1982-01-04 | Leuven Res & Dev Vzw | Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking. |
| US5525484A (en) * | 1981-01-16 | 1996-06-11 | Genome Therapeutics Corp. | Recombinant DNA means and method for producing rennin, prorenin and pre-prorennin |
| JPS58148899A (ja) * | 1982-02-27 | 1983-09-05 | Green Cross Corp:The | ウロキナ−ゼ様蛋白質をコ−ドするｍＲＮＡ及びその製造法 |
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| US5112755A (en) * | 1982-04-15 | 1992-05-12 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human urokinase proteins |
| GR78180B (ja) * | 1982-04-15 | 1984-09-26 | Genentech Inc | |
| IL68561A (en) * | 1982-05-05 | 1991-01-31 | Genentech Inc | Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof |
| GT198302091A (es) * | 1982-05-05 | 1984-10-25 | Activador de plasminogeno de tejido humano a),b),c). | |
| FI831484L (fi) * | 1982-05-05 | 1983-11-06 | Genentech Inc | Plasminogen aktivator foer maenskovaevnad |
| DE3348289C2 (de) * | 1982-05-05 | 1994-05-05 | Genentech Inc | Verfahren zur Herstellung von Human-Gewebe-Plasminogen-Aktivator |
| US4766075A (en) * | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| US5185259A (en) * | 1982-05-05 | 1993-02-09 | Genentech, Inc. | Truncated human tissue plasminogen activator |
| US4530904A (en) * | 1982-09-03 | 1985-07-23 | Eli Lilly And Company | Method for conferring bacteriophage resistance to bacteria |
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| US5011795A (en) * | 1983-01-19 | 1991-04-30 | Genentech, Inc. | Human tPA production using vectors coding for DHFR protein |
| AU572108B2 (en) * | 1983-01-19 | 1988-05-05 | Genentech Inc. | Human tpa production using vectors coding for dhfr protein |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
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| DE3585097D1 (de) * | 1984-02-27 | 1992-02-20 | Green Cross Corp | Herstellung menschlicher urokinase. |
| JPS60180591A (ja) * | 1984-02-27 | 1985-09-14 | Green Cross Corp:The | ヒトウロキナ−ゼのｄνａ配列，プラスミド，宿主 |
| US4753879A (en) * | 1984-08-27 | 1988-06-28 | Biogen N.V. | Modified tissue plasminogen activators |
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