KR860001515B1 - 사람의 전(前) 성장(pre-growth)호르몬의 아미노산 배열을 함유하는 단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

사람의 전(前) 성장(pre-growth)호르몬의 아미노산 배열을 함유하는 단백질의 제조방법

제1도는 실시예 1의 처리를 한 6개 뇌하수체의 전령 RNA의 생물학적 활성도 측정 결과를 도시한 것임.

제2도는 이중가닥 cDNA 표본을 제한엔도뉴클레아제를 써서 분열시켜 폴리아크릴아미드(4.5%) 겔 전기영동으로 분석한 결과를 도시한 것임.

제3도는 겔 전기영동으로 분별한 풀려진 cDNA와 제한 소(小)부분을 브롬화에티듐으로 형광염색, DNA를 탐지한 결과를 도시한 것임.

제4도는 실시예 4의 단백질을 가용성으로 만들어 소디움 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시켜 분별한 결과를 도시한 것이다.

본 발명은 사람의 전(前) 성장(pre-growth)호르몬의 아미노산 배열을 함유하는 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 성장호르몬의 전(前)-배열부분을 가지며, 성장 호르몬의 유전암호가 되는 사람유전자를 분리 및 정제[이후로 "클로닝된(cloned)"]하는 방법과 그 유전자를 미생물내로 전달 및 복제(replicating)하는 방법을 제공한다. 클로닝된 유전자는 숙주(宿主)라 할 수 있는 원핵(原核) 유전자와 융합되었을 때 숙주 미생물에 의해 발현된다. 이 유전자는 치료상의 목적으로 사람의 성장호르몬을 만드는데 유용하다.

성장 호르몬은 주로 뇌하수체선(adenohypophysis)이라고도 칭하는 뇌하수체 전엽에서 만들어진다. 호르몬은 보통 전 생애에 걸쳐 분비되며 어릴 때에 가장 많은 양이 분비된다. 비록 호르몬의 작용기구(機構)는 상세히 알려져 있지 않지만, 성장 호르몬은 글루코오즈 및 지방의 대사에 영향을 주며 단백질 합성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

성장 호르몬의 결핍을 초래하는 여러가지 임상학적인 장애물이 알려져 있다. 뇌하수체 왜성(矮性)이 심한 경우에는 일반적으로 시체에서 분리해 낸 사람의 성장 호르몬으로 치료하게 된다. 비(非)영장류의 성장 호르몬 대부분이 사람에게는 효과가 없기 때문에 달리 대체할만한 적당한 급원이 없는 것이다. 공급하게 되는 물질의 양은 매우 적지만, 호르몬의 분리 및 정제과정이 복잡하며 비용이 많이 든다. 환자 1인당 1년동안 치료하는데 드는 비용이 $5000.00이다. 일반적으로 성장 호르몬 결핍의 치료는 아주 심한 경우에는 한정되고 있다. 매년 1000명이 넘는 새로운 환자들이 치료받기를 요구한다. 만약 적당한 가격으로 호르몬을 적절히 공급할 수 있다면, 10000명 정도로 추정되는 호르몬 결핍상태가 덜하거나 혹은 다른 성장의 문제점이 있는 환자들도 치료할 수 있을 것이다. 또한 성장 호르몬은 위장출혈, 굴절치료, 골격의 변형 및 상처 치료에도 유용하다는 것이 경험적으로 증명되고 있다.

성장 호르몬은 단백질이다. 종래의 방법에 의해 결정된 인간의 성장 호르몬의 아미노산 배열을 표 1에 실었다.

[표 1]

종래의 방법으로는 이들 191개의 아미노산 배열의 화학적 합성은 불가능하다. 뇌하수체내에서 초기에 생합성되어 만들어지는 것이 전(前) 성장 호르몬이며, 이는 신호(signal) 펩티드가 되는 26개의 아미노산 배열이 표 1의 배열에 덧붙여져 아미노 말단에 부착된 것이다. 신호 펩티드 배열은 다음과 같다. NH₂-26) Met-Ala-Thr-Gly-Ser-Arg-20)Thr-Ser-Leu-Leu-Leu-Ala-Phe-Gly-Leu-Leu-10) Cys-Leu-Pro-Trp-Leu-5) Gln-Glu-Ala-Val-1) Pro.

26개의 아미노산 신호 펩티드는 세포막으로 삽입되어 통과할 수 있게 해주며 단백질이 자신이 합성된 세포로부터 배출될 수 있도록 하는 기능을 갖고 있는 것으로 여겨진다[Blobel, G. 등의 J. Cell. Biol. 67,835(1975) 참조].

막으로 된 장벽을 가로질러 운반되는 진핵단백질에 대한 몇몇의 신호 펩티드의 예가 알려져 있다. 무세포계(cell-free system) 내에서 특정분해효소가 관찰되었는데, 이 효소는 세포막을 통과하면서 신호 펩티드와 활성 단백질 사이의 펩티드 결합을 가수분해 한다[Biolel, G. 등의 Proc. Nat. Acad.Sci USA 75, 361(1978)].

최근에, 생화학 및 DNA 재결합(recombinant DNA) 기술의 진보로 해서, 단백질이 정상적으로 분리되는 고등 생물에 관계없이 조절된 조건하에서 특징 단백질을 합성하는 것이 가능하게 되었다. 시험관 내의 무세포 계에서나 혹은 생체내, 즉 미생물속에서든지 간에, 이런 생화학적 합성 방법은 효소를 사용하고 살아있는 세포의 단백질 합성 기구의 하위(下位) 세포 성분(Sub-cellular Component)을 사용한다. 어느 경우건, 원하는 아미노산 배열을 지정하는데 필요한 정보를 갖고 있는 특정 배열의 디옥시리보핵산(DNA)을 준비하는 것이 가장 중요한 일이다. 이러한 특수 DNA를 여기서는 유전자라 칭한다. 디옥시뉴클레오티드 배열을 써서 단백질의 아미노산 배열을 특징짓게 되는 유전암호와 관계를 아래에 간단히 기술하였는데, 이 암호관계는 살아있는 유기체의 알려진 부문 전체에 걸쳐 얻어지는 기본적인 원리들에 따라 작용한다.

클로닝된 유전자는 시험관내에서 합성할려는 단백질의 특정 아미노산 배열을 만드는데 사용될 수 있다. DNA의 지휘에 따르는 단백질 합성체계가 이 분야에선 잘 알려져 있다[Zubay, G., Ann. Rev. Genetics 7, 267(1973) 참조]. 그 밖에 단일 가닥(single-stranded) DNA 시험관내에서 전령 RNA(messenger RNA)로써 작용하도록 하여 DNA배열을 가장 적합하게 번역한다[Salas, J. 등의 J. Biol. Chem. 243, 1012(1968) 참조] 이 분야에서 잘 알려진 다른 기술을 앞서의 과정과 함께 사용하므로 산출량을 높일 수 있다.

DNA 재결합 기술의 발달로 인해, 고등생물 즉, 사람 및 다른 포유동물로부터 특정 유전자나 이들의 일부분을 분리해 내고, 이것을 박테리아나 이스트같은 미생물에게로 전달(transfer)할 수 있게 되었다. 전달된 유전자는 복제되고 형질전환된 미생물 복제물로서 유전되어진다. 그 결과, 형질전환된 미생물은, 유전자나 단편이 유전암호화 되는 단백질이 효소, 호르몬, 항원, 항체 또는 이들의 일부분이건간에 이러한 단백질을 만들어내는 능력을 부여받게 된다. 미생물의 이러한 능력은 자손에게 전해므므로, 사실상 전달로 인해서 기술된 바와 같은 능력을 갖는 새로운 군주가 만들어진다. 실예로, Ullrich, A. 등의 Science 196, 1313(1977)과 Seeburg, P.H. 등의 Nature 270, 486(1977)을 참조하라. 실제 목적을 위해서 이러한 기술을 적용하는데 근거가 되는 기본 사실은, 미생물로부터 사람에 이르기까지 모든 살아있는 유기체의 DNA가 화학적으로 유사하고 동일한 4개의 뉴클레오티드로 이루어진다는 것이다. 중요한 차이점은 중합체의 DNA 분자내에서 이들 뉴클레오티드의 배열에 있다. 이 뉴클레오티드의 배열로써, 유기체를 구성하는 단백질의 아미노산 배열을 특징짓게 된다. 비록 상이한 유기체들의 단백질이 대부분 서로 다르지만, 뉴클레오티드 배열과 아미노산 배열간의 유전암호화 관계는 근본적으로 모든 유기체내에서 동일하다. 예를들어, 사람의 뇌하수체 세포내의 HGH의 아미노산 배열에 대한 유전암호가 되는 뉴클레오티드 배열과 동일한 것이 미생물내로 운반되면 이것은 여기서도 동일한 아미노산 배열에 대한 유전암호가 될 것이다.

여기서 사용되는 약자들을 표 2에 실었다.

[표 2]

DNA 내의 뉴클레오티드 배열과 단백질내의 아미노산 배열 사이의 유전암호화 관계는 표 3에서 보여지듯이 집합적으로 유전암호로서 알려져 있다.

[표 3]

요지 : 각각 3개의 문자로 된 디옥시뉴클레오티드 삼중자(triplet)는 mRNA의 트리뉴클레오티드에 대응하여서 왼쪽에 5'-말단과 오른쪽에 3'-말단을 갖는다. 여기서 주어지는 DNA 배열은 모두 가닥(Strand)으로 되어있으며, 이 배열은 우라실대신 티민을 가지면서 mRNA 배열에 대응된다. 문자들은 디옥시뉴클레오티드 배열을 형성하는 퓨린이나 피리미딘 염기들을 나타낸다.

A=아데닌 J=A 또는 G

G=구아닌 K=T 또는 C

C=시토신 L=A,T,C 또는 G

T=티민 M=A,C 또는 T

X=Y가 A 또는 G이면 T 또는 C

X=Y가 C 또는 T이면 C

Y=X가 C이면 A,G,C 또는 T

Y=X가 T이면 A 또는 G

W=Z가 A 또는 C이면 C 또는 A

W=Z가 C 또는 T이면 C

Z=W가 C이면 A,G,C 또는 T

Z=W가 A이면 A 또는 C

QR=S가 A,G,C 또는 T이면 T C

QR=S가 T 또는 C이면 A G

S=QR이 T C이면 A,G,C 또는 T

S=QR이 A G이면 T 또는 C

본 발명의 목적에 있어서 이들 유전암호의 중요한 특징은, 뉴클레오티드 삼중자로서 공지된 트리뉴클레오티드 배열에 의해 각 아미노산이 특정지워진다는 사실이다. 인접한 삼중자를 연결하는 포스포디에스테르 결합은 DNA내의 다른 모든 뉴클레오티드간의 결합과 화학적으로 구별되지 않는다. 따라서 리딩 프레임(reading frame)을 결정하는데 있어서 추가적인 정보가 없이는 뉴클레오티드 배열을 읽어서 단일 아미노산 배열에 대한 유전암호를 알 수가 없는데, 여기서 리딩 프레임(reading frame)이란 유전적 메시지를 해독하는데 있어서, 세포에 의해 사용되는 삼중자 집단을 나타낼 때 사용하는 용어이다.

많은 DNA 재결합 기술들은 다음에 논의되는 두 부류의 화합물, 즉 전달 벡터(transfer vector)와 제한효소(restriction enzyme)을 사용한다. 전달벡터는 유전 정보를 함유하는 DNA분자로서 숙주 미생물로 옮겨졌을 때 그 자신의 복제가 틀림없이 이루어지는 것이다. 보통 세균 유전학에 쓰이는 전달벡터의 예로는 플라스미드(plasmids)와 몇몇 박테리오파아지(bacteriophages)의 DNA 등이 있다. 본 방법에서는 플라스미드를 사용하고 있지만 다른 형태의 전달벡터들도 쓰일 수 있음을 알게 될 것이다. 플라스미드란 자율적으로 복제하는 DNA단위를 말하며, 이것은 숙주 세포 자신의 제놈(genome)과는 다른 미생물 세포에서 발견된다. 플라스미드는 유전학적으로 숙주세포의 염색체에 연결되어 있지 않다. 플라스미드 DNA는 이중 가닥의 고리 구조로 존재하며 일부는 분자량이 10⁸달톤(dal tons)을 넘지만 보통은 수백만 달톤 정도이다. 일반적으로 이들은 세포내 총 DNA의 적은 양의 %만을 나타낸다. 전달벡터 DNA는 숙주세포 DNA와는 크기에 있어서 크게 차이가 나므로 쉽게 분리해 낼 수 있다. 전달벡터는 숙주세포 안에서 그들을 복제될 수 있게 하는 유전 정보를 운반하며, 대개의 경우 숙주세포의 분열 속도와는 무관하게 행해진다. 몇몇 플라스미드는 연구자가 성장조건을 변화시키는데 따라 그 복제 속도가 조절되는 성질을 갖고 있다. 플라스미드 DNA는 닫힌 고리로 존재하나 적절한 기술을 사용하여 고리를 열고 거기에 이종(異種) 구조(heterologous)의 DNA 단편들을 삽입하여 다시 고리를 닫아주므로써 삽입된 DNA 단편을 함유하는 거대 분자를 형성시킬 수 있다. 박테리오파아지 DNA는 몇몇 비필수적 파아지 유전자를 대신에 삽입된 이종구조의 DNA 단편을 운반할 수 있다. 어느 경우건, 전달벡터는 삽입된 이종구조의 DNA 단편에 대해 운반자 또는 벡터(vector)로써 작용한다.

전달은 형질전환(transformation)이라 알려져 있는 과정으로 이루어진다. 형질정환되는 동안 플라스미드 DNA와 혼합된 세균 세포는 전체 플라스미드 분자를 세포안으로 편입시킨다. 비록 이러한 과정의 기구는 잘 알려져 있지 않지만, 실험으로 정하여진 몇몇 처리법을 써서 플라스미드 DNA를 취할 수 있는 세균 세포의 양을 최대로 하고 형질 전환되어지는 양을 증가시킬 수 있다. 세포가 일단 플라스미드를 끌어들이면 플라스미드는 세포내에서 복제되고 이 복제된 플라스미드가 세포 분열시에 딸 세포에게 분배된다. 플라스미드 DNA의 뉴클레오리드 배열이 갖는 유전 정보는 대체로 숙주 세포내에 발현된다. 전형적으로, 형질 전환된 숙주 세포는 몇몇 항생 물질에 대한 저항과 같은 플라스미드위에 운반된 특성을 취득함에 의해 인지되어진다. 상이한 플라스미드는 그들 자신을 함유하는 숙주 세포에게 주게 되는 상이한 능력이나 상이한 능력의 결합에 의해 인지될 수 있다. 플라스미드를 함유하는 세포를 순수하게 배양하고 그로부터 플라스미드 DNA를 분리해내므로써, 주어진 플라스미드를 일정량만큼 만들 수 있다.

제한엔도뉴클레아제(Restriction endonuclease)는 DNA분자의 특정부위 분열에 촉매작용의 능력이 있는 가수분해 효소이다. 제한엔도뉴클레아제가 작용하는 유전자좌(locus)는 특정한 뉴클레오티드 배열이 존재함에 의해 결정된다. 이러한 배열은 제한엔도뉴클레아제에 대한 인식부위(recognition site)로 명명된다. 여러 원천들로부터 제한엔도뉴클레아제가 분리되었고 이들 인식 부위의 뉴클레오티드 배열에 의하여 특징지어졌다. 어떤 제한엔도뉴클레아제는 동일한 위치에서 양쪽 가닥위에 있는 포스포디에스테르 결합을 가수분해해서 둔단(blunt ends)을 생성한다. 다른 제한엔도뉴클레아제는 몇 개의 뉴클레오티드에 의해 서로로 부터 분리된 결합이 가수분해되는 것을 촉매하여, 분열된 분자의 각 말단에 유리된 단일 가닥 부분을 생성한다. 이러한 단일 가닥 말단들은 자체 상보적으로 결합성이 있으므로 가수분해된 DNA의 재결합에 사용될 수 있다. 이러한 효소에 의해 분열되는 DNA는 동일한 인식 부위를 가져야 하기 때문에 동일한 결합력이 있는 말단들을 갖게 되며 따라서 제한엔도뉴클레아제로 처리한 이종구조의 DNA배열을 이와 유사하게 처리한 다른 배열과 결합시키는 것이 가능하다. Roverts, R.J., Crit. Rev. Biochem. 4, 123(1976)을 참조한다. 제한부위가 비교적 드물기는 하지만 제한엔도뉴클레아제의 일반적인 유용성은 이중가닥을 이루며 제한 부위배열을 갖는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)를 화학적으로 합성함으로써 크게 확대되었다. 그러므로, 적당히 제한된 올리고뉴클레오티드를 분자의 말단에 부착시키고 그 생성물을 적당한 제한엔도뉴클레아제의 가수분해 작용에 지배를 받게함에 의해 실제적으로 DNA의 어떤 부분을 간단하게 다른 부분에다 결합시킬 수 있게 되어 필요로 하는 결합력 있는 말단을 만들게 된다. Heyneker, R.H. 등의 Nature 263, 748(1976)과 Scheller, R.H., 등의 Science 196, 177(1977)을 참조한다. 제한엔도뉴클레아재 인식부위가 분포되는데 있어서 중요한 특징은 이들이 리딩 프레임(reading frame)에 관하여 임의적으로 분포된다는 점이다. 그 결과로, 제한엔도뉴클레아제에 의한 분열은 인접한 코돈(codon)간에 일어날 수도 있고 코든내에서 일어날 수도 있다.

DNA 분열이나 말단배열 변형에 쓰이는 보다 일반적인 방법들도 가능하다. 여러가지 비특이성 엔도뉴클레아제가 다음에 논의되듯이 DNA를 임의적으로 분열시키는데 쓰일 수 있다. 말단 배열은 한쪽 말단 위에 dA, 다른 한쪽엔 dT의 올리고뉴클레이드 말든을 만들거나 혹은 dG와 dC의 올리고뉴클레이드 말단을 만들므로서 변형될 수 있고, 말단들이 결합할 때 특정한 결합 배열이 없이도 제한부위를 만들 수 있게 한다.

"발현(expression)"이란, 유기체가 어떤 주어진 시간에서 유전적으로 물러받은 능력을 매우 드물게 완전히 사용한다고 인식되었을 때 쓰이는 용어이다. 박테리아와 같이 비교적 간단한 유기체라도, 세포가 합성할 수 있는 많은 단백질이 다 합성되지는 않지만, 적절한 환경하에서라면 합성될 수 있다. 주어진 유전자의 암호화로써 단백질이 유기체에 의해 합성되어 만들어질때 유전자가 발현되었다고 하고 만약 단백질이 만들어지지 않으면 유전자는 발현되지 못했다고 한다. 일반적으로 대장균내 유전자의 발현은 다음에서 기술되는 바와 같이, 주어진 환경에서 그 기능이 유용치 않은 단백질은 합성되지 않으며 또한 물질대사 에너지는 보존된다는 등의 방식으로 규제된다.

지난 20여년에 걸친 광범위한 연구의 결과 대장균내 유전자 발현의 방법이 잘 알려지게 되었다. Hayes, W., The Genetics of Bacteria And Their Vuruses, 2d edition, John Wiley & Sons, Inc., New York(1968)과 Watson, J.D., The Molecular Biology of Gene, 3d edition, Benjamin, Menlo Park, California(1976)을 참조하라. 이런 연구로, 세포내에서 연관된 기능을 갖는 단백질을 유전암호화하는 몇몇 유전자들이 연속된 배열내에서 함께 무리지어 있다는 것이 알려지게 되었다. 이런 무리들 오페론(operon)이라 한다. 오페론내의 모든 유전자는, 배열내 첫번째 단백질의 N-말단 아미노산을 유전암호화하는 코든으로 시작하여 오페론내 마지막 단백질의 C-말단을 거치면서 계속되는등 모두 한 방향으로 전사(transcription)된다. 오페론의 첫 부분에, N-말단 아미노산 코돈에 가까운 곳에 조절 구역(control region)이라 일컫는 DNA 부분이 있는데 이 조절 구역은 오퍼레이터(operator), 프로모우터(promoter) 등 여러가지 조절 인자와 리보조말 결속부위(ribosomal binding site)에 대한 배열을 갖고 있다. 이들 부위의 기능은, 이들의 조절하에서 유기체의 요구에 응하여 이들 유전자들의 발현이 이루어지게끔 하는 것이다. 예를들어, 오직 유당의 이용에만 요구되는 효소에 대해 유전암호화 하는 유전자는, 매체내에 실제적으로 유당이나 그에 유사한 물질이 없으면 정상적으로 감지할 수 있을 정도로 발현되지 않는다. 발현이 일어나기 위해서 꼭 필요한 조절 구역의 기능은 전사의 개시 및 번역(translation)의 개시이다. 배열에서 첫번째 유전자의 발현은, 오페론의 첫번째 단백질의 N-말단 아미노산을 유전암호화하는 위치에서 전사 및 번역을 개시하는 것으로써 시작된다. 이 점에서부터 아래쪽으로 흐르는 각 유전자의 발현 역시, 자체 조절 구역이 최소한 종결신호나 다른 오페론과 마주칠 때까지 차례로 개시되고 상이한 환경적인 계기에 응해 끝나게 된다. 이런 일반적인 체계의 세부에 걸쳐서는 많은 변이들이 있게 되지만, 중요한 사실은 대장균과 같은 원핵체 내에서 유전자가 발현되려면 유전자가 전사의 개시자(initiator) 및 번역 개시자의 기능을 갖는 조절 구역과 관련하여 적절히 배치되어야 한다는 것이다.

주어진 오페론의 일부가 아닌 유전자가 오페론내에 삽입되고 그에 의해 조절될 수 있음이 알려졌다. 이것은 Jacob. F., 등의 J. Mol. Biol, 13, 704(1965)에서 알려졌다. 이 실험에서는, 퓨린 생합성 경로에 수반되는 효소를 유전 암호화하는 유전자가 유당 오페론에 의해 조절되는 구역으로 운반되었다. 퓨린 생합성 효소의 발현은 그 후 유당이나 그와 유사한 물질이 존재치 않았을 때 억제된 것으로 관찰되었고, 그것의 발현을 정상적으로 조절하는 환경적인 계기에 반응하지도 않게 되었다.

아래쪽으로 흐르는 유전자의 전사 개시를 조절하는 오페레이터구역에 부가해서, 주어진 단백질의 C-말단을 나타내면서 종단신호로써 작용하는 코돈이 존재함이 알려졌다. 표 2를 참조하라. 이러한 코돈은 종결신호로 알려져 있고 또한 넌센스(nonsense) 코돈으로도 알려져 있는데 이는 이들이 어떠한 아미노산에 대해서도 정상적으로 유전암호화 하지 않기 때문이다. 오페론의 구조를 이루는 유전자들간에 종결신호가 결실되면, 인접한 유전자에 의해 유전암호화 된 2개의 아미노산 배열이 펩티드 결합으로 결합되어진 키메라적(Chimeric) 단백질의 합성을 초래하는 융합된 유전자가 만들어진다. 유전자가 융합될 때 합성되는 이러한 키메라적 단백질은 Benzer, S.,와 Champe, S.P., Proc.Nat.Acad.Sci USA 48, 114(1962)에서 알려졌다.

일단 주어진 유전자가 분리 및 정제되어져 전달벡터내로 삽입되면 그 전체적인 결과를 유전자의 클로닝(cloning)이라 정하게 되며, 실질적인 양에 있어서 이것의 유용성은 확인된 바 있다. 클로닝된 유전자는 적절한 미생물로 운반되어 거기서 유전자는 미생물관생체(貫生體)로서 복제되며 또한 일반적인 방식에 의해 그로부터 유전자간 재분리 된다. 따라서 더 많은 조정(manipulations), 변형 및 동일 벡터(Vector)내의 다른 위치로 혹은 다른 벡터에게로의 전달을 하기 위해서 유전자의 재생 가능한 급원이 계속 제공되는 것이다.

적당한 방향 및 리딩프레임에서, 원핵 유전자를 해석하는 등의 일을 하는 조절 구역내로 클로닝된 유전자를 전달시키므로써 이 클로닝된 유전자에 의해 유전암호화된 아미노산 배열로 구성되는 키메라적 단백질을 합성시키게 되고 이로써 발현도 이루어진다. 여러가지 특징 단백질 분열 기술을 써서 키메라적 단백질을 원하는 곳에서 분열시켜 원하는 아미노산 배열로 풀어주게 되며, 그 다음에 이 아미노산 배열을 일반적인 방법으로 정제시킨다. 적절한 위치에서 조절 구역과 나란히 있는 클로닝된 유전자를 갖는 발현전달벡터의 조립기술이, Polisky, B., 등의 Proc.Nat.Acad.Sci USA 73, 3900(1976) ; Itakura, K., 등의 Science 198; 1056(1977); Villa-Komaroff, L., 등의 Proc.Nat.Acad. Sci USA 75, 3727(1978); Mercereau-Puijalon, O., 등의 Nature 275, 505(1978); Chamg, A.C.Y., 등의 Natru 275, 617(1978) 및 Rutter 등의 미국 특허 출원번호 제933,035호 등에 기술되어 있는데, 여기서 상기 출원은 이후로 인용될 참조문헌과도 긴밀한 관계를 갖는다.

간단히 말하면, DNA 재결합 기술의 도움으로 사람의 전(前) 성장 호르몬같은 포유동물의 단백질이 생성되는 과정에 있어서 첫번째로 필요한 것은 포유동물의 유전자를 클로닝하는 것이다. 일단 클로닝된 유전자는 일정량으로 만들어지고, 나아가 화학적으로나 효소적 방법으로 변형시켜서 발현 플라스미드로 운반되어질 수 있다. 클로닝된 유전자는 또한 그 자신이 혼성 프로브(hybridization probe)로서 사용되어, 연관된 유전자, 혹은 클로닝된 소(小)부분이 있는 관련 유전자나 전체 유전자를 분리하는데에 유용하다. 더 나아가, 클로닝된 유전자는 동일하거나 서로 연관된 유전자들의 독립된 분리물에 대한 동일성(identity)과 상동성(homology)을 혼성에 의하여 증명하는데도 유용하다. 유전자학적 암호의 성질때문에, 클로닝된 유전자가 적절한 리딩 프레임에서 번역될 때에는 오직 자신이 유전암호화 하는 아미노산 배열만 생산되도록 지시할 것이다.

인간의 전(前) 성장 호르몬을 위해 클로닝된 유전자는 여러가지 방법으로 사용될 수 있다. 발현전달벡터로의 전위는 클로닝된 유전자를 운반하는 벡터(vector)로 형질 전환된 숙주 미생물에 의해서 전(前) 성장 호르몬이 합성될 수 있게 한다. 만약 키메라적 단백질의 원핵체적 부분이, 배설되거나 혹은 다른식으로 구획구분된 숙주 단백질의 신호 부분일 때는 안정도와 전 성장 호르몬 정제의 용이도를 크게 증가시키면서 배설 또는 구획구분이 일어날 수 있다. 또한 원핵체적 부분이 짧을 경우는, 만약 전(前)-배열(pre-sequence) 자신에 의해 용이하게 될 것이다. 크로닝된 유전자는 부분적으로 상동 배열을 갖는 유전적 물질을 분리하기 위한 혼성기술에도 또한 유용하다. 다른 포유동물의 성장 호르몬 유전자를 이러한 방법으로 분리해 낼 수 있는데, 이는 이들의 생리적인 상호 반응성의 부족에도 불구하고 효과적인 혼성을 위해 충분한 정도의 배열이 유사하게 존재하기 때문이다. 여러가지 동물류의 성장 호르몬은 농학 및 수의학적 목적에 쓰인다. 개개 환자들의 성장 호르몬 유전자를 특수한 성장 결함을 분석하고 치료하기 위한 목적으로 혼성기술에 의해 분리할 수도 있다.

클로닝된 전-성장 호르몬 유전자는, 전 성장 호르몬을 생산하기 위한 여러가지 기술에서 사용될 수 있다. 전 성장 호르몬은 공지된 효소적 및 화학적 기술로써 성장 호르몬으로 전환될 수 있으므로 그 자체로 유용하다. 예를들어, 앞서의 Blobel, G.에 의해 기술된 바와 같이 전(前)-배열은 특수하게 신호 펩티드만 제거하는 가용성 효소를 제조함에 의해 제거될 수 있다.

여기서 발표되었듯이 사람의 전 성장호르몬에 대해 유전암호화하는 염기배열을 갖는 cDNA가 클로닝되었다. 클로닝된 cDNA의 구조는 뉴클레오티드 배열분석에 의해 증명되었다.

유전물질의 원(原) 출처는 수술로써 얻은 사람의 뇌하수체 종양 조직이다. 주로 유전물질은 개개인의 세포로부터 분리되어지며, 개개인 종양으로 부터의 유전자 클로닝을 위한 특수 기술이 발표되고 있다.

세포로부터 전령 RNA를 분리해내고 이를 부분적으로 크로마토그라피 및 침전에 의해 정제하였다. 활성부분들은 무세포 단백질 합성계내에서 200여개의 아미노산의 단백질 합성을 지지하게 되는 능력을 이용하여 식별되며, 겔(gel) 전기영등에 의한 확인으로써도 식별된다.

분리된 전령 RNA에 상보되는 DNA(cDNA)는 이중 가닥의 cDNA는 형성하기 위해서 아래서 상세히 기술하는 바와 같이 두개의 반응 회로안에서 역 전사효소를 사용하여 합성되었다. 역 전사효소 이중 가닥 DNA 반응에 의한 이(異)종구조의 생성물은 겔 전기영동에 의해 길이에 따라 분리되었다. 길이에 따라 약 800여개의 염기쌍의 대응구역으로 이동하는 DNA를 이후의 연구를 위해 선별하였다. 800개 염기쌍의 cDNA에서 주된 부분을 제한엔도뉴클레아제 PvuⅡ와 BglⅡ로 개별적으로 처리하므로써 이들이 성장 호르몬을 유전암호화하는 것으로 나타났다. PvuⅡ는 성장호르몬 cDNA를 분열시켜 약 495개 염기쌍 단편을 만드는 것으로 알려져 있다. BglⅡ는 이 단편안에서 한개의 분열부위를 갖는 것으로 알려져 있다. 분열 및 분별후, 예상되었던 성장호르몬 cDNA 특유의 띠(bands)가 얻어졌다.

약 800개 염기쌍 길이의 분열되지 않고 이종구조인 이중가닥 cDNA는, 각 말단에 특수한 연결 올리고뉴클레오티드 배열을 만들고 전달 벡터위의 동일한 제한 특수성을 갖는 위치에다 용이하게 삽입하게 하게끔 처리되었다.

클로닝하는데 있어서는, 우수한 선택과 안정된 복제성을 제공하는 전달 벡터가 선택되어진다. 처리된 800개 염기쌍 cDNA는 일반적으로 사용되는 기술을 써서 벡터 DNA 위의 예정된 위치에서 전달 벡터내로 삽입되므로써 재결합 전달벡터를 형성하였다. 숙주 미생물 세포는 재결합 벡터로 형질 전환시켰다. 예정된 위치에 삽입하기 위해 설정된 기준에 따라 형질 전환체(Transformants)는 선택되어진다. 형질 전환된 단일 미생물로부터 뽑아낸 단일 군체들(colonies)을 취하여 개별적으로 배양하므로써 재결합 전달벡터 DNA클론들의 복제가 가능케 된다. 그 다음, 전달벡터 DNA를 분리하고 슬랩(slab)겔 전기영등을 사용하여 전달벡터에서 적절한 크기를 가려내고 또 결실 등의 결합을 제거하도록 하였고, 적당한 크기의 재결합 전달벡터 DNA를 산출하는 군체를 개별적으로 보다 다량 배양하여 전달벡터 DNA를 분리하고 이 DNA를 제한 효소분석에 사용하도록 하였다. 각 클론에 있어서, 전달벡터내로 삽입된 DNA는 삽입부위에서 분열시키는 데에 쓰여진 제한 효소로 처리하고 또 성장 호르몬 DNA가 특정크기의 단편을 만들게 하는 PvuⅡ와 BglⅡ 효소에 의해서 식별될 수 있다. 모든 조건을 만족하는 클론을 선택하여서, 클로닝된 전 성장 호르몬의 뉴클레오티드 배열을 결정확인하고 적당한 발현 플라스미드로 운반하도록 하였다.

정상인에 있어 성장 호르몬은 뇌하수체 전염에서 독점적으로 합성된다. 원칙적으로 성장 호르몬의 유전자는 다른 어떠한 조직으로 부터도 분리할 수 있다. 그러나 사람의 성장 호르몬 유전자내에는 간섭하는 배열이 있어서, 이 배열은 일반적인 원핵체적 환경내에서 전사되고 다음 복사되어서 간섭하는 배열을 갖지 않는 "성숙한(mature)" mRNA를 산출하게 한다. 박테리아 등의 원핵 세포내에서 번역 가능한 디옥시뉴클레오티드 배열은 이런 간섭하는 배열을 거의 함유치 않는다. 왜냐하면 이는 원핵세포가 이러한 간섭하는 배열을 번역하면 바람직하지 못한 단백질을 만들게 되는 것으로 여겨지기 때문이다. 그러므로 실제적인 작업시에는, 활발하게 성장 호르몬을 합성하는 세포에서 분리된 전령 RNA로부터 디옥시뉴클레오티드 배열이 유도되어야만 한다.

원핵체적 전령 RNA로부터 출발하여, 주어진 단백질에 대해 유전암호화하는 cDNA의 클로닝에 대한 일반적인 개요가 앞서 Ullrich, A. 와 Seeburg, P.H. 등에 의해 기술되었다. 여기서 간단히 요약하면 이 과정은 다음의 단계를 포함한다 ;

1) 실질적으로 퇴화되지 않은 폴리아데닐레이티드 RNA를 원하는 단백질을 생산하는 분화된 세포나 조직으로 부터 분리,

2) 역 잔사 효소를 사용하여, 분리된 RNA에 DNA 가닥을 염기 배열에서 상보적으로 합성하여 RNA-DNA의 혼성을 얻는다.

3) 혼성의 DNA 부분을 단일가닥 cDNA를 남겨놓고 선택적으로 분해,

4) 단일 가닥 cDNA에 상보적으로 DNA를 합성하여 이중가닥 DNA를 형성,

5) 이중 가닥 cDNA를 분별하여 원하는 크기 범위에서 분자들을 풍부히 마련하도록 한다.

6) 선택적 전달벡터가 cDNA에 삽입될 수 있도록 마련한다.

7) DNA 연결효소(ligase)를 사용하여 cDNA와 전달벡터를 공유 결합시켜 재 결합 전달벡터를 만든다,

8) 전달, 선택 및 적절한 숙주 미생물 종류의 성숙에 의해 원하는 재결합 전달벡터를 복제한다.

뇌하수체 전(前)면 세포는, 트란스페노이달(transphenoidal) 하수체 절제에 의해 제기된 인간의 뇌하수체로부터 얻을 수도 있고 또는 배양기에서 배양한 사람의 뇌하수체 조직세포 계통으로 부터 얻을 수도 있다. 이들 출처로부터 분리된 RNA는 부분적으로 정제하여 궁극적인 산출량을 높이도록 하며, cDNA로의 전사를 위한 주형(鑄型 : template)으로 사용한다. 부분적인 정제에서는, 지나치게 적은 양이나 많은 양의 RNA를 점차로 제거시키는 자당(sucrose)내에서의 침전이 포함될 수도 있다. 올리고(oligo)dT 셀룰로오즈위에서의 크로마토그래피에 의한 추가 정제는, 진핵 세포내의 전령 RNA의 중요한 형태인 폴리아데닐레이티드 RNA를 분리하는 데에도 사용될 수 있다.

역 전사효소를 사용하여 cDNA를 구성하는 주형으로서, 부분적으로 정제된 전령 RNA는 사용될 수 있다.

S1 뉴클레아제 및 일정 분리 기술과 함께 역 전사 효소를 사용하여 이중 가닥의 cDNA를 형성하는 것이 앞서 기술되었다. (Ullrich, A. 등의 Science 196, 1313(1977)과 Seeburg, P.H. 등의 Nature 270, 486(1977) 참조) 결과적으로 만들어지는 cDNA는 길이에 있어 상이한 분포를 갖는다. 만약 클로닝하려는 cDNA의 뉴클레오티드의 배열이 알려져 있거나 혹은 합리적인 가능성의 한계내에서 예언되어지고, 클로닝하려는 유전자의 시작부분 및 말단에 합리적으로 제한 부위가 인접할 수 있다면, 적절한 제한 효소를 써서 크기에 있어서 원하는 동질의 cDNA 산물을 얻을 수 있고 또 상이한 배열을 함유하는 물질로 부터 분리시킬 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 배열의 정보는 사람의 전 성장 호르몬 같은 유전자에는 쓸모가 없음을 알 수 있는데, 사람의 전 성장 호르몬은 몇몇 예외적이고 우연발생적인 환경하에서 가능할 수 있는 정도를 제외하고는 지금까지 분리 및 정제된 적이없다. 따라서 모든 연속되는 단계들은 일반적으로 이중 구조의 cDNA 산물을 가지고 수행해야만 한다.

사람의 성장 호르몬 cDNA의 뉴클레오티드 배열부분에 대한 충분한 정보가 Goodman등의 연속 출원 제 897,710에 발표된 상기 자료에서 주어지므로써, 앞서 기술된 바와 같이 전 성장호르몬 유전자의 세분된 단편을 식별할 수 있게 되었다. 사람의 전 성장호르몬 내의 알려진 아미노산 수로부터, 원하는 cDNA의 대략 길이는 800개 염기쌍들로 이루어진다고 추정된다. 약 800개 염기쌍들에 대용되는 겔전기 영동의 유동성을 갖는 이중 가닥 cDNA를 제한 효소 Pvu Ⅱ와 Bgl Ⅱ로 분열시켰을 때, 이것이 주로 성장호르몬 유전암호화 배열을 함유한다는 것이 밝혀졌다.

DNA 연결 효소의 촉매 작용으로 둔단 결합(blunt-end ligation)하므로써 단일 엔도뉴클레아제가 cDNA에 적중해 쌍을 이루고, 이렇게 만들어지는 벡터상의 임의의 위치에서 cDNA의 DNA 전달벡터로의 전달이 형성되도록 할 수 있다. [Sgaramella, V. 등의 Proc. Nat. Acad. SciUSA 67, 1468(1970)]. 그러나, 전달벡터 내에서의 위치가 알려져 있는 특정 삽입부위를 이용하고, 삽입의 특이성을 높이도록 cDNA를 처리하므로써 선택(selection)은 한결간단해지고 산출량은 증가되었다. 보다 나은 실시형으로는, 단일 제한 부위가 있는 부호지시 유전자(marker gene)를 가지는 플라스미드 전달벡터가 사용된다.

고리모양의 플라스미드 DNA는 적절한 제한엔도뉴클레아제로써 전달된다. cDNA의 말단을 열린 플라스미드 DNA의 말단에 연결시키면 cDNA가 제한 부위에 삽입되어진 고리모양의 재결합 플리스미드가 형성되고, 이것은 부호지시 유전자를 효과적으로 방해하므로써 부호지시 유전자의 기능을 상실하게끔 한다. 예를들어, 플라스미드 pBR 322는 단일 Hind Ⅲ 제한 부위를 함유하는데, 이 제한 부위는 유전자에 대한 프로모우터 내에 위치하여 테트라사이클린에 대한 방해 작용을 한다. pBR 322에 의해 형질전환된 대장균 세포는 성장 매체내에서 20㎍/ml 정도의 테트라사이클린의 존재로 성장 및 분열할 수 있었으며, 반대로 형질전환되지 않은 세포는 동일 조건하에서 죽었다.

Hind Ⅲ 부위에 삽입부위를 갖는 재결합 pBR 322에 의해 형질전환된 세포는 테트라사이클린이 20㎍/ml 존재하게 되면 성장 및 분열할 수 없다. 플라스미드 pBR 322는 또한 암피실린(ampicillin)에 대해 방해 작용을 하는 유전자도 갖는다. 이러한 유전적 부호 지시자들을 배합시키므로써, 암피실린 존재시에 변형된 세포만을 성장시키므로써 이것을 형질전환되지 않은 세포로부터 선택해 낼수 있으며 또한, 테트라사이클린의 존재시에 비(非) 재결합 pBR 322만을 성장시키므로써 재결합 pBR 322로 부터 비재결합 pBR 322에 의해 형질전환된 세포를 선택해내는 것이 가능하게 된다.

Hind Ⅲ에서 절단된 pBR 322의 삽입 특이성 및 산출량은 Hind Ⅲ 연결부의 올리고뉴클레오티드를 이종구조의 cDNA 말단에 결합시키므로써 증가되었다. 상기한 Scheller, R.H.등의 것을 참조한다. 더 나아가, cDNA의 삽입이 되지 않은체 고리가 폐쇄되거나, 이량(二量) 중합되는 등의 재결합 전달벡터 형성시의 부수 반응들은 제한 절단된 전달벡터 DNA의 말단을 미리 처리하여 5' 종결부의 인산기를 제거하므로써 현저히 감소되었는데, 이는 함께 출원중인 연속출원 제898,887호에 기술된 바와 같다.

배합(combination)시에 사용되는 상기의 기술을 사용하므로써, 필요로 하는 재결합 전달벡터의 절대적및 상대적인 산출량이 크게 증가되었다.

앞서의 클로닝에 관한 연구에서는, 몇몇 개체들의 연합된 세포 추출물로부터 전령 RNA를 뽑아내어 이로써 cDNA를 합성하였다. 본 발명은 하나의 개체로부터 유도되어진 클로닝된 유전자를 얻는데에 필요한 기술을 제공한다.

이 기술로 규모 및 반응의 부피가 축소되었고, 또한 생성물이 소모되지 않으며 운반자 DNA(carrier DNA)가 제거되지 않는다. 이 나중의 특색으로 전체 산출량과 과정도중의 여러가지 효소촉매 작용에 의한 반응의 효과가 놀라울 정도로 개선되었다. 개인의 뇌하수체 조직으로 부터의 전령 RNA의 분리는 공지된 과정(Seeburg, 등의)을 적당한 규모로써 사용하여 이루어졌다.

컬럼 크로마토그래피 단계는, 파스퇴트 피펫에서와 같은 끝이 길게 늘여진 작은 유리관(glass tube) 내에서 시행한다. 단백질 제거를 위한 정제는, 페놀추출 또는 가급적 클로로포름-포화페놀 추출등 몇몇 적당한 상(相)분리 기술로써 수행될 수 있다. 낮은 온도에서 알코올로 침전시키므로써 핵산(nucleic acid)을 농축시키는 것은 전체에 걸쳐행해질 수 있는데 특히 -70℃에서 에탄올 침전에의해 행하게 된다. 추출 과정과 침전 과정은 둘다 한개의 관(tube) 내에서 행해질 수 있는데, 가급적이면 총부피 1ml-2ml의 원추형 플라스틱 원심분리기관에서 행해진다.

역 전사 효소를 사용하는 것과 같은 효소반응도 또한 동일하게 작은 관들내에서 진행될 수 있다. 전형적으로, 단일 가닥 및 이중가닥 cDNA의 합성속도와 합성되는 정도는, 발생되는 cDNA 내에서 표지된 방사성 동위원소의 결합에 의해 진행된다. 적절한 표지는 3인산 뉴클레오티드 전구체중 하나의 알파 위치에서 결합되는 [32p]이고, 이러한 예로는 α-32p-dCTP가 있다.

방사성 표지를 이용하여, 컬럼을 통과하는 동안 및 전기 영동 겔위치에서의 cDNA 생성물을 계속해서 검사할 수도 있다. 일련의 컬럼 크로마토그래피에 의한 분별 물질을 검사할 필요가 있을 때, 예를들어 역 전사 효소 반응시 반응하지 않은 전구체를 크로마토그래피 후에 제거하고자 할 경우에, 반응 생성물을 소모시키지 않는 방사분석을 하는 것이 매우 바람직하다. 본 방법에서는 앞서 기술된 작은 플라스틱 관내에 모여진 소(小) 부분들을 빈틈없이 봉하였다.

다음에 이 관들을 곧장 섬광 유체가 없는 섬광 유리병내로 옮겼다. 발생되는 세렌코프(Cerenkov) 방사를 적절한 기구장치를 사용하여 합리적인 효율로써 계산할 수 있다.

작은 양의 DNA를 쓰는 과정이 특히 혼합물에 운반자 DNA를 첨가하므로써 수행되었다. 운반자 DNA를 사용하는 이론적 근거는 원하는 DNA의 회수를 개선하자는 것으로서 운반자 DNA를 사용하지 않는 경우, 이들을 함유한 벽돌(Cantainer walls)에 비특이성 흡착이 일어나거나 또는, DNA 침전 및 이와 유사한 작용에 협력하는 효과가 있는 작용이 부족하게 되어 원하는 DNA의 회수가 저조해 질 수 있다. 운반자 DNA를 가하지 않고 심지어 사용 DNA의 양을 10^-9그램으로 하여도 적당량의 DNA가 산출되었다. 본 방법에서 운반자 DNA를 사용하지 않으므로써 두가지 명백한 잇점이 나타났다 ; 첫째, 효소 촉매 반응시 비 특이성 반응산물을 산출시키는 비특이성 DNA가 존재하지 않는다. 둘째, 비특이성 재결합 전달벡터를 산출시키는 오염물 DNA가 존재하지 않는다.

설명되었던 기술들을 함께 사용하므로써, 사람의 전 성장호르몬에 대해 이를 유전암호화하는 디옥시뉴클레오티드 배열을 개개 환자의 뇌하수체로 부터 클로닝할 수 있게 되었다. 다음의 실시예에서 분리및 정제과정을 상세히 기술하였고, 클로닝된 유전자의 동일성을 뉴클레오티드 배열 분석에 의해 증명하였다.

[실시예 1]

사람의 전 성장 호르몬을 유전암호화하는 유전자를 단일개체의 조직으로 부터 클로닝하는 방법

뇌하수체 종양이 있는 6명의 환자의 뇌하수체를 트란스페노이달 하수체절제로써 제거해내어 급히 냉동시키고 액체 질소내에 보관한다. 다음의 과정에서는 6개 뇌하수체에 대해 동시에 실시하되 서로 각각 분리하여 처리하게 된다. 4℃에서 pH 5.0으로 완충시킨 1M 메르캅토에탄올을 함유하는 4M 구이니디늄 티오시아네이트속에 뇌하수체를 녹여 균질화시켰다. 이 균질액에 10mM EDTA를 함유하고 있는5.7m Cscl 1.2ml를 부은 다음, 섭씨 15도에서 벡크만 초원심 분리기의 SW 50.1회전기 내에서 37,000 rpm으로 18시간 동안 원심분리 하였다(Beckmann Instrument Co., Fullerton, California). RNA는 시험관 바닥으로 이동하였다. 그 다음의 올리고-dT 셀룰로오즈컬럼을 이용한 전령 RNA의 정제는 상기 Ullrich, A.등과 상기 Seebug, P.H.등에 의해 기술된 바에 따라 수행하였다.

부분적으로 전제된 전령 RNA의 생물학적 활성도는, 밀의 배아에서 뽑아낸 무 세포 단백질 합성계내에서 [35 S]-메티오닌이 성장 호르몬내로 결합하도록 지시하는 능력에 의해 측정되었다. 이 실험에서의 실험 조건은 Martial, J.H. 등의 Proc. Nat. Acad. SciUSA 74, 1816(1977)에 기술된 바와 같다. 이 실험의 결과가 제1도에 도식되었다. 0.1% 소디움 도데실설페이트가 함유된 12.5% 폴리아크릴 아미드 겔위에서 20mA로 4시간 동안 겔전기영동시키므로써 방사성 단백질 생성물을 분별하였다. 방사성 단배질의 떠돌이 방사성 자동 사진법에 의해 탐지되었다. 띠(a)는 크기부호지시자(size Markers)로 사용한 박테리오파지 T4로 부터 [¹⁴C]로 표지된 부호지시자 단백질을 보여준다. 띠 1-6은 올리고-dT셀룰로오즈-정제시킨 개개 종양등의 전령 RNA의 번역된 생성물을 나타낸다. 1-5의 종양들로써, 무세포 합성 생성물의 대부분이 전성장호르몬으로 구성됨을 알수 있다.

전 성장 호르몬의 무세포 번역 활성도 (예로써 띠 2,4 및 5)를 최대로 높여준 RNA 표본을 모아서 이중 가닥의 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용하였다. 모든 반응 단계들은 1.5ml 용량의 플라스틱 원심분리기 관내에서 진행되었다. RNA-DNA 혼성을일으키는 첫번째 역 전사효소 촉매 반응은, 약 13㎍의 RNA를 함유하는 상기 RNA 표본 68㎕, 조류의 골수아구종중 비루스 역 전사 효소 및 the Office of Program Resources와 Logistics, Viral Cancer Program, Viral Oncology, Division of Cancer Cause, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland에서 얻을 수 있는 희석되지 않은 표본 4㎕ 등, 이들을 함유하는 반응 혼합물 내에서 진행시키고 또 "역 전사 효소 완충물(reverse transcriptase buffer)" (pH8.3의 Tris-HCl, 1mM EDTA, 70mM MgCl₂, 200mM KCl)10㎕, 1㎕의 2-메르캅토에탄올 1M,5㎕의 올리고 -dT 1㎕/ml, dATP dGTP 및 TTP를 각각 5㎕(20mM의 저장용액), 1㎕ dCTP 20mM 저장용액, 및 반응혼합물내에 직접 용해시킨 약 2×10⁶cpm의 α-[32p]-dCTP 등, 이들을 함유하는 반응 혼합물 32㎕ 내에서 진행시켰다.

상기 Seebug, P.H.등에 의해 기술된 바와 같은 조건하에서 반응을 진행시켰다. 동일 반응 관내에서 클로로포름-포화페놀을 써서 배양 혼합물을 추출한 다음 에탄올을 써서 침전시키고, 이 관을 최소한 15분간 -70℃에서 보관한 후 원심분리 시켰다.

침전된 RNA-DNA 혼성 물질은 0.1N NaOH, 5mM EDTA 125㎕ 내에 용해시키고 68℃에서 30분간 배양하므로써 RNA를 선택적으로 알칼리 가수분해 시킨다. 반응 혼합물을 파스퇴르 피펫내 세파덱스(Sephadex: 상품명, phamacia Inc, piscataway, New Jersey) G-50의 작은 관위에 적재해 넣고, 10mM Tris (pH 7.5)와 0.5mM EDTA를 함유하는 완충물을 써서 이를 용출시킨다. 방사성 단일 가닥 DNA가 에펜도르프(Eppendorf) 관속에 모아진 2 방울의 단일 부(部)내에서 회수되었다.

이 단일부가 있는 관(fraction tube)을 밀봉하여 섬광유리병내에 넣고, 이것을 액체 섬광계수기 장치내에서 계수측정하여 세렌코프 방사를 탐지하였다.

앞서의 반응단계에서 생성된 단일 가닥의 cDNA로 부터 이중 가닥 cDNA를 합성하는 것은, 역전사 효소 촉매 반응에 의해 수행되었다. 반응은 단일가닥 cDNA 용액 30㎕, 효소 용액 3.5㎕ 및 반응 혼합물 1.75㎕를 함유하는 총부피 51㎕의 용액내에서 진행시켰으며, 이때 반응 혼합물은 다음과 같이 구성된다 : 물 96㎕; 역전사 효소 완충물 60㎕; 2-메르캅토에탄올 1M, 6㎕, dATP 20mM, 15㎕; dGTP 20mM, 15㎕; TTP 20mM, 15㎕; dCTP 20mM, 3㎕; 반응 혼합물내로 직접 용해시킨 α-[32P] dCTP 약 6×10⁸cpm. 반응은 47℃에서 90분 동안 진행되었다.

반응이 종결되고, 단백질은 앞서말한 세파덱스 G-50 크로마토그래피 단계 및 추출과 그 다음 상기의 에탄올 침전에 의해서 제거되었다.

성장 호르몬을 유전암호화 하는 cDNA가 제조시 여러종류 있었음을 확인하기 위해서, 이중가닥 cDNA 표본의 일부를 제한 엔도뉴클아제를 써서 분열시키고 폴리아크릴아미드(4.5%) 겔전기영동에 의해 분석하였다(제2도). 제2도의 노선(Lanse) (C) 및 (k)는 방사표지된 박테리오파아지 fd DNA를 분열시켜 얻은 띠들로서, 엔도뉴클레아제 Hpa Ⅱ로써 분열시킨 것은 노선(C)이고, Hae Ⅲ로서 분열시킨 것은 노선(k)로 나타났다. 노선(a) 및 (b)는 분열되지 않은 이중가닥 cDNA를 나타내고 있다.

노선(d)에서 (j)까지는 다음것에 의해 cDNA가 분열된 것을 나타낸다 : 노선(d)는 Pst Ⅰ와 Bgl Ⅱ를 더한것 ; 노선(e)는 Pvu Ⅱ; 노선(f)는 Pvu Ⅱ와 Bgl Ⅱ를 더한 것 ; 노선(g)는 Hin f와 Sma Ⅰ을 더한 것 ; 노선(h)는 Hae Ⅲ; 노선(i) 는 Pvu Ⅱ 및, 노선(j)는 Hae Ⅲ. 관찰된 띠의 무늬는, 사람의 성장 호르몬 mRNA에 상보적인 cDNA로 부터 예상된 바와 같은 것이었는데, 여기서 상기 mRNA는 본 출원에서 참조문헌으로 인용한 연속출원 제897,710호에 기술된 바와 같이, 미리 클로닝한 550개 염기쌍으로된 사람의 성장 호르몬의 소부분(Fragment)의 구조에 근거한 것이다. 이들 자료로, 주된(predominent) cDNA가 실제로 사람의 성장 호르몬 전령 RNA에 상보적이라는 사실이 확인되었다.

이렇게 해서 만들어진 2중 가닥의 cDNA를 상기 Ullrich, A. 등에 의해 기술된 바와같이 S1 뉴클레아제도 처리하므로써, 쌍을 이루지 않은 루우프(loop) 구역내에서 "헤어핀(hairpin)" 구조를 분열시켰다. 앞서의 단계에서와 마찬가지로, 효소 처리후 이를 추출해 크로마토그라피 및 침전시켰다. 쌍을 이루지 않은 말단은 DNA 중합효소 Ⅰ의 촉매 반응을 써서 완결시켰다. 반응 혼합물은, 60mM 트리스-HCl, pH 7.5, 8mM MgCl₂, 10mM 2-메르캅토에탄올, 1mM ATP 및 dATP, dTTP, dGTP, dCTP를 각각 200μM 등, 이들을 함유시켜 총부피 20㎕로 만들었다. 1단위의 대장균 중합효소 Ⅰ(Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana)를 써서 10℃에서 10분간 혼합물을 배양시키므로써, 엑소뉴클레오적으로(exonucleolytically) 분해시켜 3'를 만드는 말단을 제거하고 5'를 만드는 말단을 상보적인 배열을 써서 채워주도록 한다. 반응은 무딘 말단을 갖는 cDNA 분자의 집단이 산출되도록 구상되었다.

Hind Ⅲ 제한 부위 매열에 대해 특이성을 갖는 연결 올리고 뉴클레오티드 들을 DNA 연결효소를 사용한 둔단 결합에 의해 cDNA 말단에 연결시켰는데, 이는 상기 Seebug, P.H. 등에 의해 기술된 바와 같다. 상기 이유들로 해서 플라스미드 pBR 322, Bolivar, F. 등의 Gene 2, 95(1977)을 전달벡터로 선택하였다. 삽입 및 차폐(Screening) 기술은 상기 Ullrich, A. 등에 의해 기술되었다.

암피실린 저항 균체들(resistant colonies)을 취하여 암피실린과 테트라실린을 함유하는 판으로 운반시켰다. 암피필린 저항작용이 있고 테트라실린에 대해 민감한 것으로 알려진 상기 군체를 이후의 연구에 쓰기위해 뽑아 놓았다.

결실 및 중복(duplication)등을 포함한 불완전한 삽입은, 기술된 바와 같이 선택된 형질전환된 세포의 단일 군체를 배양시켜서, 여기서 분리해낸 플라스미드 DNA 를 HindⅢ로 처리하여 슬랩 겔 전기영동에 의해 시험하므로써 탐지되었다. 이러한 결함은 HindⅢ 소 부분의 크기에 의해 쉽사리 탐지할 수 있었다.

클로닝된 DNA가 HindⅢ의 소화작용에 의해 전달벡터로 부터풀려진후 제한 효소PvuⅡ와 HglⅡ를 써서 더 처리해 주면, 이것이 사람의 전 성장 호르몬에 대해 유전암호화 시킨다는 것이 확인되었다. 풀려진 cDNA와 제한된 소부분들을 겔 전기영동에 의해 분별해내고, 여기서 브롬화 에테디움(ethidium)을 써서 형광염색시켜 DNA를 탐지하였다. 제3도에 그 결과를 도시하였는데, 여기서는 보다 큰 DNA 부분이 그림의 상부쪽에 위치한다. 노선(a)는 미리 클로닝된 550개 염기쌍으로 사람의 성장 호르몬 DNA의 소 부분으로, 이는 연속출원 제897,710호에 기술된 바와 같다, 노선(b)는 본 실시예의 800개 염기쌍으로된 사람의 전 성장 호르몬 DNA이다.

노선(c)와 (e)는 각각 PvuⅡ 및 BglⅡ를 써서 분열시킨 500개 염기쌍 소 부분들의 표본이다. 노선(d)와 (f)는 각각 PvuⅡ 및 BglⅡ를 써서 분열시킨 800개 염기쌍 전성장 호르몬 DNA의 표본들이다. PvuⅡ를 써서 분열시키면, 500개 염기쌍 소 부분의 말단 가까이에 위치해 있다고 알려진 PvuⅡ 부위로 부터 기대되듯이, 각 경우에서 유사한 크기의 소부분을 산출시키게 된다. BglⅡ의 분열은 예상되는 바와같이 500개 염기쌍 소 부분이 사람의 성장 호르몬 유전자 배열을 함유하는 것으로 증명된 것과 일치하는 것이다. cHGH 800으로 표시되는 클로닝된 DNA를 배열 분석에 쓰기 위해 뽑아 놓았다.

[실시예 2]

cHGH 800의 뉴클레오티드 배열 분석

Maxam과 Gillbert의 Proc. Nat.Acad. Sci. USA74, 560(1677)과 Sanger, F. 등의 Proc. Nat. Acad. Sci. USA74, 5463(1977)의 방법에 의해 CHGH 800의 뉴클레오티드 배열이 결정되었다. 그 결과는 표 4에 나타나 있다. 클로닝된 유전자는 3-말단에 있는 108개 염기쌍의 번역되지 않은 구역(폴리-A부분은 제외)과 마찬가지로 번역되지 않은 것으로 생각되는 5'-말단의 29개 염기쌍 구역과 함께, 사람의 전 성장 호르몬에 대해 유전 암호화하는 전체 배열을 함유한다. (5'-말단 및 3'-말단은 성장 호르몬 전령 RNA와 배열이 일치하는 cDNA가닥의 참조로써 표시하였다.)

성장 호르몬 배열의 시작 부분 근처의 전(前)배열에서는 몇몇 불확실한 점이 남아있다. 표 4의 뉴클레오티드 배열은 또한, 공지된 배열과 약간 차이가 있는 성장 호르몬에 대한 아미노산 배열을 산출시키는 것으로 나타난다. 뉴클레오티드 배열 분석으로 부터 추정되는 아미노산 배열이 보다 정확한 것으로 여겨진다. 글루타민(Gln)이나 글루탐산(Glu)과 같은 아미노산 쌍을 구별할때 불일치가 일어나는데, 뉴클레오티드 배열에 의하는 것보다 직접 아미노산 배열에 의하는 것이 이들을 구별하기가 더 어렵다. 나아가 뉴클레오티드 배열 분석은, 성장 호르몬 전 배열의 가능한 아미노산 배열과 같은 전에 얻지 못했던 정보도 제공된다.

cHGH800의 번역

met-메티오닌 gln-글루타민

ala-알라닌 glu-글루탐산

thr-트레오닌 val-발린

gly-글리신 ile-이소로이신

ser-세린 asp-아스파르틴산

arg-아르기닌 asn-아스파라진

leu-루신 his-히스티딘

phe-페닐알라닌 lys-리신

cys-시스테인 tyr-티로신

pro-프롤린

[실시예 3]

플라스미드 ptrpED50-HGH의 구성

ptrpED5-1 (Searle Research Laboratories, High Wycombe, Bucks, Englad에서 얻음)로 표시되는 플라스미드를 변형시켜서, 클로닝된 전성장 호르몬 cDNA가 삽입 및 발현될 수 있게끔 한다. 대장균 트립토판(trp) 오페론의 Hind Ⅲ 부분으로부터 유도된 플라스미드 ptrp ED5-1를 Hopkins, A.S. 등의 J. Mol. Bio1. 107,549(1976)에 기술된 바와 같이 박테리오파아지 λtrpE로 부터 전달하여, Bolivar, F. 등의 Gene 2, 95(1977)에서의 pBR 322의 Hind Ⅲ 부분에 삽입시킨다.

플라스미드 ptrpED 5-1을 Hind Ⅲ에서 분열시키고, DNA 중합효소 Ⅰ의 케나우(kenow)소부분으로 처리하여 단일 가닥의5'-말단의 쌍을 이루도록 하였다(상기 Seeburg, P.H 등) 데카뉴클레오티드 Hind Ⅲ 연결부를 플라스미드 DNA에 부착시켰다. Hind Ⅲ에 의해 결합력 있는 말단이 만들어지며 플라스미드 DNA는 세파덱스(상품명, Pharmacia Inc. Uppsala. Sweden.) G-100 크로마토그라피에 의해 분리하였다. T4-DNA 연결효소를 써서 고리모양의 플라스미드를 재생시켜서 RR-I 종의 대장균을 형질전환시키는데 사용하였다. 클론들을함유한 플라스미드 ptrp ED50을 암피실린 저지작용에 알맞도록 선택 분리하였다.

클로닝된 사람의 전성장 호르몬 DNA(실시예 1과 2에 기술된 바와같은 cHGH 800)를 ptrp ED50의 Hind Ⅲ 부위에 삽입시켰다. 대장균 X1776을 형질전환시키기 위해 재결합 전달벡터를 사용하였다. 형질전환체(Transformants)를 암피실린을 함유하는데 엷은 판위에서 선택하였다. 몇몇 클론들로부터 분리한 플라스미드를 Bam HI 및 Pst I로 분열시키므로써 올바른 삽입 배향에 대한 시험을 하였다. 전성장 호르몬의 코든들이 trp 오페론에서와 같은 상(Phase)에서 읽혀지는 등, 이런 올바른 배향은 Pst I 부위의 비 대칭적 배치로부터 추정되었는데, 이때 700개 염기쌍으로 된 소부분이 산출되었다. 잘못된 배향의 경우 290개 염기쌍의 소부분이 산출된다. ptrp ED50-HGH로 표시되는 올바른 배향의 플라스미드가 대장균 trp OE ▽ 1로 형질 전환되었다.

[실시예 4]

사람의 전 성장 호르몬의 발현

플라스미드 ptrp ED 50-HGH에 있어서 trp E와 trp D 유전자의 발현은 트립토판 조절하에서 이루어지는데, 이를테면 이러한 유전자에 의해 유전암호화되는 단백질의 수준은 β-인돌릴(indolyl) 아크릴산과 같은 유도물질(inducer)의 존재에 의해 그 기초 수준으로 부터 증가하게 된다.

대장균 trp ▽ OE 1/p trp ED50-HGH를 유도(induction) 시키게되면 trp E 유전자 생성물질 및 trp D-전 성장 호르몬 단백질 연합체(fusion protein)의 생성이 증가될 것으로 예상된다. trp D-전 성장 호르몬 단백질 연합체는 NH₂-종결 부분을 포함하고 있으며, trp D 유전자 생성물은 사람의 전성장 호르몬에 결합되었다.

대장균 trp OE ▽ 1/p trp ED50-HGH 배양물을 β-인돌릴 아크릴산을 써서 유도시키고, 3ml 시료들에 대해 유도후의 시간 간격을 여러가지로 하면서 14C-표지된 아미노산 2μCi를 써서 일정시간 동안 파동 표지시켰다(pulse labeled). 0내지 4시간 동안 유도시킨 배양물에서 취한 시료들을 Martial, J.A.등의 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 1816(1977)에 기술된 바와 같이, 포름 알데히드 처리한 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)를 써서 면역침전(immunoprecipitate) 시키므로써 항원-항체의 복합체를 수집하였다. 단백질을 가용성으로 만들고 소디움 도데실설페이트-폴리아크릴아미드겔내에서 전기영동시켜 분별하였다. 제4도에 그 결과가 도시되었다.

노선(a)는 박테리오파아지 T4-감염시킨 대장균의 세포내에서¹⁴C-표지된 단백질을 취하여 크기부호 지시자로 사용한 것이다. 흔적(b)에서 (g)까지는 유도후 각각 0, 0.5, 1,2,3 및 4시간 되었을 때 파동표지시킨 단백질을 나타낸다. 흔적(h)는 4시간 유도시킨 배양물에서 사람의 성장 호르몬에 대한 항혈청을 써서 면역침전시킨 단백질을 타타낸다. 흔적(i)는 4시간 유도시키고 파동표지시킨 단백질을 비(非) 면역혈청(non-immune serum)을 써사 면역침전시킨 것을 나타낸다. 흔적(j)는 유도시키지 않고 파동표지된 단백질의 면역침전물을 나타낸다. 윗쪽의 화살표는 trp E의 위치를 나타내고 아래쪽의 화살표는 예상되는 trp-HGH 단백질 연합체를 나타낸다. 왼쪽의 숫자는 부호 지시자 단백질의 분자량×10^-3한 것을 나타낸다.

이러한 결과들은 유도후의 trp D-HGH 단백질에 대한 상황과, 사람의 성장호르몬에 대한 항혈청을 썼을때 나타나는 그들 특유의 침전을 보여준다. 거기에는 면역침전시킨 trp E 단백질도 다소량 있다. 보통은 trp E와 trp D 단백질은 복합체 내에서 연합되는데, 단백질연합체에는 trp D 부분이 있으므로 trp E 단백질과 trp D-HGH 단백질연합체 간에는 어느 정도 연합이 일어날 것으로 보인다.

어느 경우건, 클로닝된 사람의 전성장 호르몬 유전자가 대장균내에서 발현된다는 것이 증명된다.

본 출원에서는 특정 실시형에 결부시키면서 발명을 기술하고 있지만 여기서 더 수정하여 사용할 수도 있으며, 일반적으로 본 발명의 원리를 다르는 본 발명의 어떠한 변화, 사용, 적용도 포함하고자하며, 현재 밝힌 것으로부터의 이탈, 즉 공지된거나 본 발명도 당연히 속해 있는 이 분야안에서 전통적으로 행해진 것에서부터 파생된 것과 상기에 설명한 본질적인 특징에 적용되어질 수 있는 것 및 덧붙인 청구범위 따르는 것등도 포함하고자 하였음을 알 수 있을 것이다.

Claims (1)

1. 사람의 전-성장 호르몬을 유전자암호화하는 디옥시뉴클레오리드 배열을 함유하는 발현벡터에 의해 형질전환시킨 미생물을 사람의 전-성장 배열이 발형되기에 적합한 조건하에서 배양하고, 이 미생물의 배지나 혹은 리세이트(lysate)로 부터 생성된 단백질을 정제함을 특징으로 하는 사람의 전-성장 호르몬의 아미노산 배열을 함유하는 단백질의 제조방법.

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