HU196237B - Process for producing human growth prehormone - Google Patents
Process for producing human growth prehormone Download PDFInfo
- Publication number
- HU196237B HU196237B HU801371A HU137180A HU196237B HU 196237 B HU196237 B HU 196237B HU 801371 A HU801371 A HU 801371A HU 137180 A HU137180 A HU 137180A HU 196237 B HU196237 B HU 196237B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dna
- growth hormone
- gaj
- caj
- acl
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 40
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 title description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 125
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 41
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 21
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 36
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 27
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 241000726103 Atta Species 0.000 claims 1
- OOFLZRMKTMLSMH-UHFFFAOYSA-N H4atta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC1=CC=CC(C=2N=C(C=C(C=2)C=2C3=CC=CC=C3C=C3C=CC=CC3=2)C=2N=C(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)C=CC=2)=N1 OOFLZRMKTMLSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims 1
- 125000002480 thymidyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 79
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 6
- 108010057578 pregrowth hormone Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 76
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 50
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 50
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 42
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 34
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 31
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 31
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 22
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 11
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 7
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 7
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 6
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 101150100816 trpD gene Proteins 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 108010049589 leucyl-leucyl-leucine Proteins 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 208000010916 pituitary tumor Diseases 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 101150079930 trpGD gene Proteins 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Chemical compound OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052670 arginyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000005466 cherenkov radiation Effects 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 150000002597 lactoses Chemical class 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical class [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXOUIMVOMIGLHO-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-indol-2-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C=CC(=O)O)=CC2=C1 SXOUIMVOMIGLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- GCTANJIJJROSLH-GVARAGBVSA-N Ala-Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](C)N GCTANJIJJROSLH-GVARAGBVSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N Arginine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDMIFVIWCNLDCT-CIUDSAMLSA-N Asn-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BDMIFVIWCNLDCT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NAPNAGZWHQHZLG-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NAPNAGZWHQHZLG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WWOYXVBGHAHQBG-FXQIFTODSA-N Asp-Met-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WWOYXVBGHAHQBG-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- GEEXORWTBTUOHC-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)CN=C(N)N GEEXORWTBTUOHC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UWVGGRQHSA-N Cys-Phe Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 1
- IVXJIMGDOYRLQU-XUXIUFHCSA-N Ile-Pro-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IVXJIMGDOYRLQU-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N Ile-Ser-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- HSQGMTRYSIHDAC-BQBZGAKWSA-N Leu-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSQGMTRYSIHDAC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- TZSUCEBCSBUMDP-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O TZSUCEBCSBUMDP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FAELBUXXFQLUAX-AJNGGQMLSA-N Leu-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C FAELBUXXFQLUAX-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JLYUZRKPDKHUTC-WDSOQIARSA-N Leu-Pro-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O JLYUZRKPDKHUTC-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- SXOFUVGLPHCPRQ-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Cys Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O SXOFUVGLPHCPRQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N Lys-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GHKXHCMRAUYLBS-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GHKXHCMRAUYLBS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SQRLLZAQNOQCEG-KKUMJFAQSA-N Lys-Tyr-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SQRLLZAQNOQCEG-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N Met-Ala-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- YYRCPTVAPLQRNC-ULQDDVLXSA-N Phe-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YYRCPTVAPLQRNC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- SWZKMTDPQXLQRD-XVSYOHENSA-N Phe-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SWZKMTDPQXLQRD-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- KYYMILWEGJYPQZ-IHRRRGAJSA-N Phe-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KYYMILWEGJYPQZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- XMQSOOJRRVEHRO-ULQDDVLXSA-N Phe-Leu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 XMQSOOJRRVEHRO-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- XOHJOMKCRLHGCY-UNQGMJICSA-N Phe-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XOHJOMKCRLHGCY-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N Pro-Lys-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101000687509 Rattus norvegicus Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 101000868151 Rattus norvegicus Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MMAPOBOTRUVNKJ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asp-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O MMAPOBOTRUVNKJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- RJHJPZQOMKCSTP-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJHJPZQOMKCSTP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MOINZPRHJGTCHZ-MMWGEVLESA-N Ser-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N MOINZPRHJGTCHZ-MMWGEVLESA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FVFUOQIYDPAIJR-XIRDDKMYSA-N Ser-Trp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CO)N FVFUOQIYDPAIJR-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N Ser-Val-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- RCLOWEZASFJFEX-KKUMJFAQSA-N Tyr-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 RCLOWEZASFJFEX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N Tyr-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Substances ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 chloroform saturated phenol Chemical class 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002079 cooperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 208000030304 gastrointestinal bleeding Diseases 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 108010071185 leucyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- GXDPEHGCHUDUFE-UHFFFAOYSA-N sulfanylmethanol Chemical compound OCS GXDPEHGCHUDUFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010015666 tryptophyl-leucyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás elószekvenciát tartalmazó embert növekedési hormont meghatározó ι gént tartalmazó mikroorganizmussal a hormon előállítására. A klónozott gént a gazda mikroorganizmus kifejezi abban az esetben, ha általa kifejez- 5 hető prokariota génnel fuzionáljuk. A gént terápiás célokra felhasználható humán növekedési hormon előállítására használjuk.
A növekedési hormont az agyalapi mirigy anterioláris lebenye termeli, adenohipofízisnek is ne- 10 vezik. A hormont normális körülmények között egész életen át termeli a mirigy, bár gyermekkor'· bán nagyobb mennyiségben. Bár hatásmechanizmusa részleteiben nem ismert, tudjuk, hogy a növekedési hormon befolyásolja a glükóz és a 15 lípidek metabolizmusát és elősegíti a protein szintézist.
A növekedési hormon hiányára visszavezethető különböző betegségek ismeretesek. Az agyalapi mirigy elváltozásánál alapuló törpenövekedés síi- 20. lyosabb eseteit halottakból izolált emberi növekedési hormonnal kezelik. Mivel a nem főemlősökből származó növekedési hormonok emberben nem hatásosak, nincs megtelő forrása. Az anyaggal való ellátottság igen szegényes, a hormon 25 izolálása és tisztítása bonyolult és drága. Egy beteg egy évi kezelése, becslések szerint 5000 ezer dollárba kerül. így jelenleg a növekedési hormon . hiánya miatt fellépő betegségek kezelése a legsúlyosabb esetekre korlátozódik. Minden évben több mint ezer új beteg igényelne kezelést. Abban az esetben, ha elfogadható áron megfelelő mennyiségű hormon állna rendelkezésünkre, úgy becslések szerint további 10 000 kevésbé súlyos elváltozásokban vagy más növekedési problémákkal küszködő beteg kezelése lenne megoldható. Ezen kívül bizonyítékok vannak arra vonatkozóan, hogy a humán növekedési hormont előnyösen használhatjuk fel a gasztrointesztinális vérzések, a törések, a metabolikus eredetű csontbetegségek, sebek gyógyítására.
A növekedési hormon egy protein. Az ismert módszerekkel meghatározott emberi növekedési hormon aminosav-sörrendjét az 1. táblázatban adjuk meg.
1. Táblázat
NH2 - Phe - Pro - Thr -1 le - Pro - Len - Ser - Arg 10
- Leu - Phe - Asp - Asn - Alá - Met - Lcu - Arg - Alá 20
- His - Arg - Leu - His - Gin - Leu - Alá - Phe - Asp 30
- Thr - Tyr - Glu - Glu - Phe - Glu - Gin - Alá - Tyr 40
- He - Pro - Lys - Glu - Gin - Lys - Tyr - Ser - Phe 50
- Leu - Gin - Asn - Pro - Gin - Thr - Ser - Leu - Cys 60
- Phe - Ser - Ght - Ser - He - Pro - Thr - Pro - Ser 70
- Asn - Arg - Glu - Glu - Thr - Gin - Gin - Lys- Ser80
-Asn-Leu-Gln-Leu-Leu-Arg -Ile-Ser-Leu- Len 90 •Leu - Ile - Gin - Ser - Tyr - Leu - Glu - Pro - Val - Glu - Phe - Leu - Arg - Ser - Val - Phe - Alá - Asn 100
- Ser - Leu - Val - Tyr - Gly - Alá - Ser - Asn - Ser 110
- Asp - Val - Tyr - Asp - Leu - Leu - Lys - Asp - Leu 120
- Glu - Glu - Gly - Ile - Gin - Thr - Leu - Met - Gly 130
- Arg r Leu - Glu - Asp - Gly - Ser - Pro - Arg - Thr - Gly - Gin - Ile - Phe - Lys - Gin - Thr - Tyr - Ser 150
- Lys - Plie - Asp - Thr - Asn - Ser - His - Asn - Asp 160
- Asp - Alá - Leu - Leu - Lys - Asn - Tvr - Gly - Leu 170
- Leu - Tyr - Cis - Phe - Arg - Lys - Asp - Met - Asp 180
Lys - Val - Glu - Thr - Phe - Leu - Arg - Ile - Val Gin - Cys - Arg - Ser - Val - Glu - Gly - Ser - Cys 190 191
Gly-Phe-COOH.
Az ismert módszerekkel ennek a 191 aminosavból álló fehérjének kémiai szintézise nem megoldható. Az agyalapi mirigyben az eredeti bioszintetikus termék az úgynevezett pre-növekedési hormon és ez az 1. táblázatban megadott aminosava35 kon kívül 26 amtnosavból álló további, szignálpeptidnek nevezett és az amino-terminális véghez I apcsolódó szekvenciát tartalmaz. A szignálpeptid aminosav szekvenciája a következő:
40 -26 -20
NH) - Met - Alá - Thr - Gly - Ser - Arg - Thr - Ser -15 -10
- Leu - Leu - Leu - Alá - Phe - Gly - Lcu - Leu - Cys -5 -l 4^ - Leu - Pro - Trp - Leu - Gin - Glu - Alá - Val - Pro
A 26 aminosavból álló szignálpeptid funkciójára vonatkozóan az az álláspont, hogy ez lehetővé teszi a sejtmembránba való belépést és áthaladást, ezzel lehetségessé válik a protein kiválasztása abból a sejtből, amelyben szintézise történik (lásd: Blobel és munkatársai, J. Cell. Bioi., 67. 835. 1975.)
Az eukarióta fehérjék kapcsán több példa isme55 retes szignálpeptidekre vonatkozóan, ezek a membránon való áthaladást segítik elő. Sejtmentes rendszerben specifikusan működő hasító enzimet figyeltek meg, amely hidrolizálja az aktív protein és a szignálpeptid közötti peptidkötést, miközben az áthalad a sejtmembránon (lásd: Blobel és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 75, 361. 1078.)
A biokémiában és a rekombináns dezoxiribonukfeinsav technológiában napjainban tapasztalt fejlődés lehetővé teszi különleges proteinek szintézisét olyan szabályozott körülmények között, amelyek függetlenek attól a magasabbrendű szervezet-21 töl, amelyből ezek a fehérjék közönséges körülmények között izolálhatok. Ezek a biokémiai szintet!ι kus módszerek enzimek és élő sejtek fehérjeszintetizáló rendszerének szubcelluláris komponenseinek használatát igénylik mind in vitro, sejtmentes rendszerben, mind pedig in vivő, a mikroorganizmusokban. Mindkét esetben az alapkérdés olyan különleges bázis sorrendű dezoxiribonukleinsav molekula (DNS) előállítása, amely tartalmazza az előállítani kívánt fehérje aminosav-szekvenciájára vonatkozó genetikai információt. Ezt a különleges DNS darabot génnek nevezzük. Azt a módot, ahogyan a dezoxiribonukleinsavban lévő bázissorrend meghatározza egy fehérje aminosav-sorrendjét, az alábbiakban röviden ismertetjük, ez azonos azzal, amely az élővilág minden sejtjében bekövetkezik.
Klónozott gént használhatunk in vitro rendszerekben létrejövő fehérjeszintézis során keletkező fehérjék aminosav-szekvenciájának meghatározására. A szakemberek körében jól ismert a dezoxiribonukleinsav által meghatározott fehérjeszintetizáló rendszer (lásd. például Zubay Ann. Rév. Genetics, 7, 267, 1973). ín vitro messenger (hírvivő) ribonukleinsavként működő egyszálú dezoxirijbonukleinsavat is előállíthatunk, ily módon a dezoxiribonukleinsav szekvencia nagypontosságú átírását érhetjük el (Salas és munkatársai J. Biok jChem., 243, 1012, 1968). A szakemberek körében más módszerek is ismeretesek, ezek a hozam növelése érdekében a fenti eljárásokkal kombinálva használhatók.
A rekombináns dezoxiribonukleinsav technológiában létrejött fejlődés lehetővé tette magasabbrendű szervezetek specifikus génjeinek vagy ezek részeinek izolálását, például emberből vagy másemlősből, továbbá lehetségessé vált ezeknek a géneknek vagy géndaraboknak mikroorganizmusokba, például baktériumokba vagy élesztőkbe való juttatása. A bejuttatott gén replikálódik és sokszorozódik a transzformált mikroorganizmusban. Ennek eredményeképpen a transzformált mikroorganizmus képessé válik annak a fehérjének az előállítására, amelyet a gén vagy a géndarab meghatároz, attól függetlenül, hogy az egy enzim, hormon, antigén vagy antitest, vagy ezek egy része. A mikroorganizmus örökíti ezt a képesseget utódaiba, ily módon az átvitellel új törzset állítunk eló, amely a fenti képességekkel rendelkezik. (Lásd: például Ulirich és munkatársai, Science, 196, 1313, 1977; továbbá Seeburg és munkatársai, Natúré, 270, 486, 1977).
A fenti technika gyakorlati célokra való felhasználásának alapja az a tény, hogy a dezoxiribonukleinsav az összes élő szervezetben, a mikroorganizmusoktól kezdve az emberig kémiailag hasonló, ugyanabból a négy nukleotidbói épül fel. A legjelentősebb különbség a különböző szervezetek polimer dezoxiribonukleinsav molekulái között az, hogy ezeknek a nukleotidoknak a sorrendje más. A nukleotid sorrend meghatározza a mikroorganizmust felépítő fehérjék aminosavainak sorrend jét. Bár a legtöbb szervezet fehérjéi különböznek egymástól, minden szervezetben azonos a nukleotidek sorrendje és az aminosavak sorrendje közötti meghatározó vagy kódoló kapcsolat. így például, ha a humán növekedési hormon aminosav sorrendje’ meghatározó nukleotid sorrendű molekulát az ember agyalapi mirigyéből mikroorganizmusba juttatjuk, úgy ez a nukleotid sorrend ott felismerhető és hasonló aminosav sorrendet fog meghatározni. A leírás során használt rövidítéseket a 2. táblázatban adjuk meg.
2. Táblázat
DNS: dezoxi-ribonukleinsav
RNS: ribo-nuklcinsav cDNS: komplementer (kiegészítő) dezoxi-ribonukleinsav (mRNS-ről enzimatikusan szintetizált) mRNS: messenger (hírvivő) RNS dATP: dezoxi-adenozin-trifoszfát < 1 GTP: dezoxi -gu a π ozi n -tri foszfá t dCTP: dezoxin-citidin-trífoszfát
A: adenin
T: timin
G:guamín
C: citozin
U: uracil
ATP: adenozin-trifoszfát
TTP: timidin-trifoszfát
SDTA: etilén-diamin-tetra-ecetsav
A dezoxi-ribonukleinsavban lévő nukleotidok és a fehérjékben lévő aminosavak sorrendje közötti összefüggést genetikai kódnak hívjuk és a 3. táblázatban ismertetjük.
3. Táblázat A genetikai kód
Fenilalanin (Phe) TTK
Leucin (Leu) XTY lzoícucin (Ile) ATM
Metionin (Met) ATG
Valin (Val) GTL
Szerin (Ser) QRS
Prolin (Pro) CCL
Trconin (Thr) ACL
Alanin (Alá) GCL
Tirozin (Tyr) TAK
Befejező jel TÁJ
Befejező jel TGA
Hisztidin (His) CAK
Glutamin (Gin) CAJ
Aszparagín (Asn) AAK
Lizip. (Lys) A AJ
Aszparaginsav (Asp) GAK
Giuíaminsav (Glu) GAJ
Cisztein (Cys) TGK
Triptofán (Try) TGG
Arginin (Arg) WGZ
Glicin (Gly) GGL
Mintegy három betűből álló dezoxi-nukleotid triplct megfelel egy trinuklcotidnakaz mRNS-ben, amelynek baloldali vége 5'-, jobboldali vége pedig 3/-végződésű. A leírás során megadott összes DNS szekvencia annak a szálnak a szekvenciája, amely megfelel az mRNS molekulában lévő szekvenciának, azzal a különbséggel, hogy az utóbbiban timin helyeit uracil van. A táblázatban megadott betűk a dezoxi-nukleotid szekvenciát alkotó purin vagy tiinidin bázisok helyett állnak. Ezek az alábi biak:
A=adenin
G=guanin
C=citozin
T=timin
X=T vagy C, ha Y=A vagy G X=C, ha Y=C vagy T Y=A vagy G, ha X=T W=C vagy A, ha Z=A vagy G W=C, vagy Z=C vagy T Z=A, G, C vagy T, ha W=C Z=A vagy G, ha W=A QR=TC, ha S=A, G, C vagy T QR=AG, ha S=T vagv C S=A, G, C vagy T, ha QR=TC S=T vagy C, ha QR=AG J=A vagy G K=T vagy C L=A,T, CvagyG M=A, Cvagy T
A jelen leírásban ismertetett célok szempontjá1 ból fontos tulajdonsága a kódnak az, hogy mindegyik aminosavat egyetlen trinukleotid darab, nukleotid triplctnek is nevezett szakasz határoz , meg. A szomszédos tripletcket összekapcsoló foszfo-diészler-kötés kémiailag megkülönböztethetetlen az összes többi dezoxiribonukleinsavban szereplő internukleotid kötéstől. Ily módon a nukleotid-szekvenciát a leolvasási sémát meghatározó további információk nélkük nem lehet egyetlen aminosav-szekvenciára vonatkoztatni. A leolvasási sémán értjük a sejt által felismert tripletek azok csoportját, amely a dekódolás során a genetikai üzenetet képviseli.
A legtöbb rekombináns dezoxiribonukleinsav technika kétféle vegyületet használ fel, transzfer vektorokat és restrikciós enzimeket. Ezeket az alábbiakban ismertetjük. Transzfer vektornak nevezzük azt a dezoxiribonukleinsav molekulát, amely egy gazdasejtbe, mikroorganizmus törzsbe juttatva saját replikációj: t is biztosító genetikai információt tartalmaz. A bakteriális genetikában általánosan használt transzfer vektor például a különböző plazmidok és bizonyos baktérium fágok dezoxiribonuklein-sava. Bár a jelen szabadalmi leírás szerint plazmidokat használunk transzfer vektorként, érthető módon más transzfer vektorokat is használhatunk. Plazmidnak nevezzük azt az autonóm replikáció dezoxiribonukleinsav molekulát, amely mikroorganizmus sejtekben található és amely különbözik a gazdasejt genomjától. A plazmid genetikailag kapcsolódik a gazdasejt kromoszómájához. A plazmid dezoxiribonukleinsav általában kettős szálú gyűrűs szerkezetű, molekulasúlya néhány millió dalton, bár egyesek molekulasúlya nagyobb, mint 10B dalton. Általában a sejt teljes dezoxiribonukleinsav tartalmának csak kis részét képviselik. A transzfer vektor dezoxiribonukleinsav a gazdasejt dezoxiribonuklcinsavától a kettő közötti nagyságban mutatkozó különbség alapján különíthető cl. A transzfer vektorok gazdasejten belüli rcplikációjukat biztosító genetikai információt hordoznak, ez a replikáció a legtöbb esetben független a gazdasejt osztódásától. Egyes plazmidok repiikációjának mértéke a kísérletező ; Ital biztosított növekedési körülményekkel befolyásolható. A plazmid dezoxiribonukleinsav zárt gyűrűként létezik. Megfelelő módszerekkel felnyithatjuk a gyűrűt, más forrásból származó dezo>iribonukleinsaval építhetünk be, majd a gyűrű bezárása után a beépített dezoxiribonukleinsavat tartalmazó megnagyobbodott molekulát kapunk. Λ baktérium fágok dczoxiribonukleinsavak más forrásból származó dezoxiribonukleinsav szegmenseket tartalmazhat, bizonyos nem létfontosságú fág gének helyett. A transzfer vektor tehát külső forrásból származó dezoxiribonukleinsav darabot hordoz.
Az átvitelt transzformációnak ismert eljárással végezzük. A transzformáció során a baktérium sejteket a plazmád dezoxiribonukleinsavval keverjük, amikor a teljes plazmid molekula belép a sejtekbe. Bár a belépés mechanizmusa nem ismert, lehelséges a lehető legmagasabbra emelni azon baktériumsejtek számát, amelyek képesek a plazmid dezoxiribonukleinsavat felvenni, így transzformálódni. Ezeket a módszereket kísérleti úton határozzuk meg. Amikor egy sejt beépítette a plazmidot, ez utóbbi replikálődik a sejten belül és az utód molekulák osztódáskor eloszlatlak a leánysejtek között. A plazmid dezoxiribonukleinsavában lévő nukleotid-szekvencia által meghatározott bármely genetikai információ a gazdasejt számára kifejezhető. Például a transzformált gazdasejt a plazmidon kódolt tulajdonságokat, például bizonyos antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát felismer. A különböző plazmidokat felismerhetjük a különböző tulajdonságok vagy tulajdonságok kombinációja révén, amelyek a plazmidot tartalmazó gazdasejtben megnyilvánulnak. Bármely adott plazmidot nagy mennyiségben előállíthatunk oly módon, hogy a plazmidot tartalmazó tiszta tenyészetet növesztjük, majd a sejtekből izoláljuk a plazmid dezoxiribonukleinsavat.
A restrikciós endonukleázok hidrolitikus enzimek, a dezoxiribonukleinsav molekulák specifikus helyein hasítanak. A restrikciós endonukleáz által hasított helyet specifikus nukleotid-szekvenciák határozzák meg. Ezt a szekvenciát a restrikciós endonukleáz által felismerhető helynek nevezzük. Különböző forrásokból izoláltak restrikciós endonukleázokat, ezeket az általuk felismerhető dezoxiribonukleinsav szakasz nukleotid-szekvenciája szerint jellemezték. Egyes restrikciós endonukleázok mindkét szál azonos pontján hasítják a fosztodiészter-kötést, amikor úgynevezett „blunt” végek jönnek létre. Mások egymástól néhány nukleotiddal elválasztott kötések hidrolízisét katalizálják, ily módon szabatl egyszálú végek jönnek létre a hasított molekula mindkét végén. Ezek az egyszálú végek önmagukra nézve kiegészítőek, mert kohézívek, ily módon felhasználhatók a hidrolizált dezoxiribonukleinsav molekula új kötésére. Mivel egy adott enzim hasítására érzékeny dezoxiribonukleinsav molekula ugyanazt az enzim által felismerhető helyet kell, hogy tartalmazza, a hidrolízis során ugyanazok a kohézív végek jönnek létre, ily módon lehetségessé válik különböző dezoxiribonukleinsav molekulák összekapcsolása, ha ugyanazon restrikciós endonukleázzal kezeltük őket (lásd: Roberts. Crit. Rév. Biochem., 4, 123,1976). A restrikciós helyek viszonylag ritkák, ugyanakkor 3 restrikciós endonukleázok általános felhasználását nagyban elősegítik restrikciós helynek megfelelő szekvenciájú kettős szálú oligonukleotidok kémiai szintézise. Ily módon gyakorlatilag bármely .dezoxiribonuklcinsav szakasz hozzákapcsolható más dezoxiribonuklcinsav szegmenshez, egyszerűen oly módon, hogy a molekula végéhez hozzákapcsoljuk a megfelelő restrikciós ohginuklcotidot, majd ezt követően a kapott molekulát a megfelelő restrikciós endonukleázzal hidrolizáljuk, ily módon megkapjuk a megfelelő kohézív végeket (lásd. Heyneker és munkatársai, Natúré, 263, 748, 1976 és Schellerés munkatársai, Science, 196, 177, 1977). A restrikciós endonukleázok által felismerhető helyek eloszlásának fontos tulajdonsága az a tény, hogy nem szabályosan helyezkednek cl. Ily módon a restrikciós endonukleázzal végzett hasítás történhet szomszédos kodonok között, vagy egy adott kodonon belül.
Rendelkezésünkre állnak általánosabb módszerek is a dezoxiribonuklcinsav hasítására vagy a molekula végein lévő bázis sorrend módosítására. Több nem specifikusan ható endonukleázt használhatunk a dezoxiribonuklcinsav molekula nem szabályosan ismétlődő helyeken való hasítására, ahogy azt a későbbiekben ismertetjük. A molekula ivégein lévő bázisok sorrendjét oly módon módosíthatjuk, hogy az egyik végen adeninből álló oligonukleotid „farkat” és a másik végen tirninbőí álló „farkat” hozunk létre, vagy guaninból, illetve citozinból álló végeket állítunk elő, amivel anélkül kaphatunk restrikciós szakaszokat, hogy e molekulában specifikus szekvenciák léteznének. A végeket természetesen összekötjük.
A „kifejeződés” fogalmat annak a ténynek felismerése kapcsán használjuk, hogy egy sejt ritkán, vágj' soha nem használja fel egy adott időben az összes genetikai információját. Még a viszonylag egyszerű szervezetek, mint például a baktériumok sem szintetizálják az összes szintézisre képes fehérjéjüket, bár megfelelő környezeti feltételek mellett ezek szintézise megtörténhet. Ha egy adott gén információja szerinti fehérjét a sejt szintetizál, úgy ez a gén kifejeződik. Ha az adott proteint a sej! nem készíti el, úgy a kifejeződés nem történik meg. Közönséges körülmények között az E. coli génjeinek kifejeződése, ahogy azt általánosságban az alábbiakban ismertetjük, oly módon történik meg, hogy az adott környezeti feltételek mellett nem szükséges proteinek nem szintetizálódnak és az anyagcsere által felszabadult energia konzerválódik.
Jól ismert az E. coli génkifcjcződcscnek szabályozása , mivel ezt az utóbbi húsz évben kiterjedten tanulmányozták. Erre vonatkozóan lásd. Hayes, The Genctics of Bacteria and Their Viruses, 2. Kiadás, John Wiley és Sons, Inc., New York, 1968; továbbá Watson, The Molecular Biology of the Gcne, 3. Kiadás. Benjámin, Mentő Park, California, 1976.
A vizsgálatok szerint több gén, általában a sejtben kapcsolt funkciókat ellátó fehérjéket kó doló gének egy helyen helyezkednek el folyamatos sorrendben. A gének ezen cgyhelyű elhelyezkedését operonnak hívjuk. Az operonban lévő összes gén hasonló irányban íródik le, a leírás az első fehérje N-terminális aminosavát meghatározó kodon nal kezdődik és folytatódik az operon által meghatározott utolsó fehérje C-terminális aminosaváig. Az operon elején az N-termináüs aminosavat meghatározó kodon előtt szabályozó szakasznak nevezett dezoxiribonuklcinsav szakasz létezik, ez több szabályozó elemet tartalmaz, köztük az operátort, a promotert és a riboszomális kötőhelyek bázisait. Ezen szakaszok funkciója az, hogy a szabályozásuk alatt álló gének kifejeződését lehetővé tegyék oly módon, ahogy erre a sejtnek szüksége van. így például a laktóz felhasználását 'ehetővé tevő enzimek génjei kimutathatóan áltahíban nincsenek kifejezve laktóz hiányában, vágj' ι laktóz analóg vegyületének jelenléte nélkül. A szabályozó szakasznak jelen kell lennie ahhoz, hogy a kifejeződés megtörténjen, elkezdődjön a transzkripció (átírás) és a transzláció (átfordítás). Λ sorrendben első gén kifejeződése az operon által meghatározott első protein N-terminális amiuosavának transzkripciójával és transzlációjával kezdődik. Ezután az ettől a ponttól következő összes gén kifejeződése megkezdődik, és ez tart mindaddig, míg egy terminációs (stop) jel vagy egy másik operon következik, amelynek saját szabályozó szakasza van. Mindezt a környezeti feltételek befolyásolják. Bár számtalan variáció ismeretes, a fenti általános séma részleteiben, a legfontosabb tény az, hogy egy prokariota (például az E. coli) génjeinek kifejeződésére a géneknek a transz!· ripciót és a transzlációt elindító szabályozó szakaszhoz képest megfelelően kell elhelyezkedniük.
Bizonyították, hogy egy adott operonban közönséges körülmények között nem szereplő géneket beépíthetünk az operonba, a beépült gén az operon szabályozás alá fog kerülni. A klasszikus bizonyítékot Jacob és munkatársai írták le (J. Mól. Bioi., 13, 704, 1965). Ebben a kísérletben a purin bioszintézisben résztvevő enzimeket meghatározó géneket a laktóz operon által szabályozott szakaszba építették be. A pufin bioszintézis enzimjeinek kifejeződését laktóz vagy laktóz-analőg hiányában ezután rcpresszálni tudták, az enzimek kifejeződése függetlenné vált az addig őket szabályozó környezeti tényezőktől.
A gének transzkripcióját szabályozó operátor szakaszon kívül ismeretesek stop jelet reprezentáló kodonok, ezek egy adott protein C-terminális végét jelzik. Erre vonatkozóan lásd a 2. táblázatot. Ezeket a kodonokaí terminációs szignálként vagy nonszensz ködönként ismerjük, mivel általában nem határoznak meg aminosavakat. Egy operonun belüli struktúrgénck terminációs szignáljának kiesése fuzionált gént hoz létre, ilyenkor két szomszédos gén által meghatározott két különböző amínosav-szekvcnciából álló úgynevezett kimer fehérje szintézise következik be, a két különböző protein pcptidkötéssel van összekötve. Gének fúziójakor szintetizálódó kimer proteint ír le Benzer cs Champc, (Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 48, 114, 1962).
Amikor egy adott gént izoláltunk, tisztítottunk cs beépítettünk egy transzfer vektorba, azaz létrehoztuk a gén klónozását, el kell érnünk jelentős mennyiségben való előállítását. A klónozott gént megfelelő mikroorganizmusba transzferáljuk, ahol a gén a mikroorganizmus szaporodásakor replikálódik és amely mikroorganizmusból ezután ismert ι módszerekkel újra izolálható. Ily módon további kísérletekre, módosításra és más vektorokba vagy ugyanazon vektorokon belül más lokuszokba való beépítéshez folyamatosan rendelkezésünkre áll a gén.
A gén kifejezésére a klónozott gént megfelelő orientációban és leolvasási fázisban oly módon építjük be egy szabályozó szakaszba, hogy az a prokarióta gén leolvasása során olyan kimer protein szintézisét eredményezze, amely tartalmazza a klónozott génben kódolt aminosav-sorrendet. A kimer protein megfelelő helyen való hasítására, azaz az aminosav-soirend felszabadítására különböző specifikus protein hasítási technikát használhatunk, a hasított fehérjét ezután ismert módszerekkel tisztítjuk. A szabályozó szakaszhoz képest megfelelő helyzetben lévő klónozott gént tartalmazó és kifejeződő transzfer vektor előállítására vonatkozóan lásd. Polisky és munkatársai (Proc. Nac. Acad. Sci, USA, 73, 3900, 1976), Itakura és munkatársai (Science, 198, 1056, 1977), továbbá Villa—Komaroff és munkatársai (Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 75, 3727,1978), Mercercau—Pu; ijalon és munkatársai (Natúré, 275, 505, 1978), és Chang és munkatársa (Natúré, 275, 617, 1978) közleményeit cs a 933035 számú, Ruttcr és mun, katársai által leírt egyesült államokbeli leírást.
A fenti irodalomban ismertetettek a jelen leírás részét képezik.
A Science 198 1056 (1977) cikke szerint a 14 aminosavból álló szomatosztatin génjét szintetizálták, ésagént pBR322 plazmidon É. coli (3-galaktozidáz génjével fuzionálták. Az E. colinak a kimer plazmid DNS-sel végzett transzformálásával olyan polipeptid szintetizálódott, mely magában foglalta a szomatosztatinnak megfelelő pepiidet is. A gént úgy alakították ki, hogy az N-termináüs végen Met fejeződjön ki, később specifikus hasítás miatt.
A 868853 sz. belga szabadalmi leírás baktériumokban kifejeződésre alkalmas inRNS tisztítását ismerteti. Klónozást végeztek humán korion szomatomammatropin (pHCS— 1) és humán növekedési hormon esetén (pHGH —1): a klónozást pMB—9 és Eco Rí, illetve pBR322 és Hindii! alkalmazásával végezve. A cikk nem tesz említést növekedési előhormonról.
A Nucleic Acid Research 6 915 (1978) cikke patkány prolaktin gént tartalmazó rekombináns DNS előállítását és analízisét ismerteti. A klónozást pBR322-vel (PstI) végzik, de kifejezésről nem tesznek említést. Az előállítás során kis valószínűséggel keletkeznek ugyan növekedési hormont termelő transzformánsok. növekedési előhormon termelésről azonban nincs ismertetés.
A 867424 sz. belga szabadalmi leírás patkány preproinzuíin és részben patkány növekedési előhormon és humán növekedési hormon gén tisztítására, klónozására és jellemzésére vonatkozik, kifejeződést azonban nem végeznek.
Egy emlős fehérjét, például a humán pre-növekedési hormont, ha rekombináns dezoxiribonukleinsav technikával kívánunk előállítani, úgy először az emlős gén izolálására oly módon, hogy a kiónozott gént hibridizációs próbaként használjuk fel. Ezen felül felhasználhatjuk a klónozott gént hibri6 ílizációvaJ azonos vagy rokon gének függetlenül izolátumainak azonosítására vagy homológiájuk megállapítására. A genetikai kód természetéből adódóan klónozott gén megfelelő leolvasási fázisban transzlatálva (átfordítva) kizárólag annak az adott aminosav-sorrendú fehérjének a termelését fogja irányítani, amelynek a genetikai kódja ennem megfelel és sohasem másét.
A humán pre-novekedési hormont meghatározó kiónozott gént többféle úton használhatjuk fel. Ha kifejeződő transzfer vektorba építjük be, úgy a slónozott gént hordozó vektorral transzformált gazda mikroorganizmus a humán pre-növekedési hormont fogja szintetizálni. A transzformált gazJasejt növekedésekor növekedési előhormon szintézise kimer protein alakjában történik meg. Ha a kimer protein prokarióta szakasza egy kiválasztott vagy más módon megvalósuló gazdasejt fehérjének úgynevezett szignál szakasza, úgy a kiválasztás vagy a más módon való megvalósulás bekövetkezik, a növekedési előhormont tartalmazó kimer fehérje tisztíthatósága és stabilitása pedig nagymértékben növekszik. Abban az esetben, ha a prokarióta rész rövid, úgy a prokarióta sejtből való kiválasztást maga az előszekvencia segítheti elő, abban az esetben, ha ez az előszekvencia a prokarióta sejtben az curkarióta sejtben meglévő funkcióhoz hasonló szerepet tölt be. A klónozott gént felhasználhatjuk továbbá részleges homológ szekvenciákat tartalmazó genetikai anyag izolálására, hibridizációs módszerekkel. Ily módon izolálhatok más emlős fajok növekedési hormonjainak génjei, mivel élettani szempontból vizsgált hasonlóságuk hiánya ellenére a hatásos hibridizációhoz elegendő mennyiségű hasonló szekvenciák szerepelnek bennük. A különböző állatfajok növekedési hormonjai mezőgazdasági és állatorvosi célokra használhatók. Egyetlen ember növekedési hormonját meghatározó gén hibridizációs technikával izolálható abból a célból, hogy analizálhassuk, és kezelhessük az adott specifikus növekedési zavart.
A klónozott és a humán növekedési előhormont meghatározó gént különböző módszerekkel felhasználjuk a növekedési előhormon előállítására. A növekedési előhormon használható, mivel ismert enzimatikus és kémiai módszerekkel növekedési hormonná alakítható. Például oldható enzimkcszítménnyel lehasíthatjuk az elószekveniát, ahogy azt Biobel és munkatársai (lásd fent) leírják a szignálpeptidek specifikus eltávolítása kapcsán.
A találmány szerinti eljárás értelmében klónozunk egy humán növekedési előhormont meghatározó bázis-szekvenciát tartalmazó cDNS molekulát. A klónozott cDNS szerkezetét nukleotid-szekvencia analízissel bizonyítjuk.
A genetikai anyag eredeti forrása az emberi agyalapi mirigy daganatos szövete, amelyet műtéti úton kapunk. A genetikai anyagot előnyösen egyetlen ember sejtjeiből izoláljuk és az emberi tumorból származó gén klónozására speciális technikát használunk.
A sejtekből hírvivő ribonukleinsavat izolálunk és kromatográfíával és ülepítéssel részlegesen tisztítjuk. Az aktív frakciókat oly módon azonosítjuk, hogy vizsgáljuk sejtmentes fehérjeszintézist végző rendszerijén a frakciók körülbelül 200 aminosav-61
196297 ból álló fehérje-szintézis képességét. A fehérjét gélelektroforézissel mutatjuk ki. ι Az izolált hírvivő ribonukleinsavval komplementer dezoxiribonukleinsavat (cDNS) reverz transzkriptáz enzimmel szintetizáljuk két reakcióciklusban, kétszálú cDNS molekula előállítására. A módszer részleteit az alábbiakban adjuk meg. A heterogén, reverz transzkriptázzal előállított kétszálú dezoxiribonukleinsavat a molekulák hosszúsága szerint gélelektroforézissel frakcionáljuk. A körülbelül 800 bázispárnyi hosszúságú ponthoz vándorló dezoxiribonukleinsavat tovább vizsgáljuk. A 800 bázispárból álló cDNS termék nagy része a növekedési hormont kódolja, ezt elkülönítjük és Pvull és BglII restrikciós endonukleázokkal kezeljük. Ά Pvull enzim a cDNS növekedési hormont meghatározó molekulákat oly módon hasítja, hogy 495 bázispárból álló fragmensct kapunk. A BblII enzim az első fragmensen belül egy helyen hasít. A hasítás és a frakcionálás után megkapjuk a humán növekedési hormont meghatározó cDNS-t tartalmazó csíkot.
A nem hasított, heterogén, körülbelül 800 bázispárnyi hosszúságú kétszálú cDNS-t mindkét végén specifikus kötő oligonukleotid szekvenciák előállítására kezeljük, amiután lehetségessé válik hasonló restrikciós specificitási transzfer vektorba való beépítése.
j Klónozásra kiválasztunk egy jó szelekciós lehetőséget biztosító és stabil replikációs tulajdonságú transzfer vektrot. A kezelt, 800 bázispárból áló cDNS-t rekombináns transzfer vektor előállítására, rendelkezésünkre álló módszerekkel, előre meghatározott helyen beépítjük a transzfer vektor dezoxiribonukléiósavba, amikor rekombináns transzfer vektort kapunk. Mikroorganizmus sejteket transzformálunk a rekombináns vektorral. A transzformásokat az előre meghatározott helybe :való beépítés szerint adott kritériumok szerint szelektáljuk. Izolált telepeket, mindegyik egyetlen transzformált mikroorganizmus sejtből származókat, kiemelünk és a rekombináns transzfer vektor dezoxiribonukleinsav kiónok replikációjái a különálló tenyészetekben növesztjük. Ezután izoláljuk a transzfer vektor dezoxiribonukelinsavat és gélelektroforézissel vizsgáljuk a transzfer vektor nagyságát esetleges hibák kiküszöbölésére, például deléció kimutatására. Rekombináns transzfer vektor dezoxiribonukleinsavat tartalmazó telepeket, amelyeket megfelelő nagyságú molekulát tartalmaznak, kiválasztjuk és transzfer vektor dezoxiribonukleinsav izolálására nagyobb mennyiségben tenyésztjük. A dezoxiribonukleinsavat restrikciós enzim-analízisnek vetjük alá. A transzfer vektorba beépített dezoxiribonukleinsavat minden egyes klón esetén azonosítjuk, oly módon, hogy a beépítés helyén restrikciós enzimekkel hasítunk, enzimként Pvull és BglII enzimeket használunk, amelyek jellemző nagyságú fragmenseket hasítanak ki, így a növekedési hormon cDNS framgensét. Az. összes igényeknek eleget tevő kiónt kiválasztjuk és vizsgáljuk a klónozott növekedési előhormon génjének nukleotid-sorrendjét és felhasználjuk a terméket megfelelő kifejeződő plazmidba való beépítésre.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárást.
A növekedési hormont az agyalapi mirigy lebenye termeli. Alapjában véve a növekedési hormon génjét bármely szövetből izolálhatjuk. Ugyanakkor a humán növekedési hormon génjében köztes szekvenciák vannak, amelyek a normális eukarióta környezeti viszonyok között átíródnak és ezután köztes szekvenciák nélküli úgynevezett „érett” liírvivő-riponukleinsav jön létre. Prokarióta sejtbe, például baktériumba transzferált dezoxiribonukleinsav szekvenciák ilyen köztes szekvenciákat nem tartalmazhatnak, mivel a prokarióta sejt képes lehet átfordítani ezeket és ily módon nem a kívánt protein termék keletkezik. Az adott dezoxinukleotid-szekvenciát ezért, gyakorlati okoból, a növekedési hormont aktívan szintetizáló sejtekből izolált hírvivő ribonukleinsavról kell lemásolni.
Egy adott protein genetikai információját hordozó cDNS eukarióta hírvivő ribonukleinsavból kiinduló klónozását általánosságban Ullrich, továbbá Seeburg és munkatársai közlik (lásd előbb!). Röviden összefoglalva az eljárás az alábbi lépésekből áll;
í) Izoláljuk a gyakorlatilag teljes poliadenilezett ribonukleinsavat a differenciált sejtekből vagy abból a szövetből, amely az adott proteint kiválasztja.
2) Az izolált ribonukleinsavval a bázis-sorrend szempontjából komplementer dezoxiribonukleinsav szálat szintetizáljuk, a szintéziskor reverz iranszkiptáz enzimet használunk és ribonukleinsav-dezoxi-ribonukleinsav hibridet kapunk.
A hibrid ribonukleinsav részét szelektive hasítjuk, ezután egyszálú CDNS molekulát kapunk.
4) Az egyszálú cDNS molekulával komplementer dezoxiribonukleinsavat szintetizálunk, ily módon kétszálú cDNS molekulát kapunk.
5) A megfelelő nagyságú molekulákban gazdag készítmény előállítására frakcionáljuk a kétszálú cDNS készítményt.
6) A cDNS beépítésére kiválasztjuk és előállítjuk a megfelelő transzfer vektort.
7) A cDNS mulekulát és a transzfer vektort dezoxiribonukleinsav-ligáz segítségével kovalensen kapcsoljuk, amiután rekombináns transzfer vektrot kapunk.
8) Transzformálást követően replikáljuk az adott rekombináns transzfer vektort, szelektáljuk és megfelelő mikroorganizmus törzsön növesztjük.
Az agyalapi mirigy anterioláris sejtjeit vagy rranszfenohidális hipofízis műtétet követően ember agyalapi mirigyből vagy bizonyos emberi agyalapi mirigy tumorsejtekbői nyerjük növesztést követően. Vagy az egyik, vagy a másik forrásból származó ribonukleinsavat a hozam növelésére részlegesen tisztítjuk és templátként használjuk a cDNS molekula leírására. A részleges tisztítás történhet szedimentációval, szacharóz grádiensen, amikor eltávolítjuk a túl kiesi vagy túl nagy riboíukleinsav molekulákat. A poliadenilezett ribonukleinsav izolálására oligo-dT-cellulózon kromatografálva tovább tisztítjuk a terméket, a poliade’iilezett ribonukleinsav ugyanis az eukarióta sejtekben a hírvivő ribonukleinsav alapformája.
A részlegesen tisztított hírvivő, ribonukleinsav templátként használhatjuk fel az enzimes, nevezetesen reverz transzkriptázzal kivitelezett cDNS előállításához. A kétszálú cDNS molekula előállí7
196 237 tására a reverz transzkriptázt Sl-nukleázzal kombinálva használjuk és bizonyos, korábban már leírt elkülönítési módszereket használunk (Ullrich és munkatársai, Science,/96, 1313,1966 és Seeburg és munkatársai, Natúré, 270, 486, 1977). A kapott cDNS különböző hosszúságú molekulákból áll. Abban az esetben, ha az előállított és klónozandó cDNS nukleotid-sorrendje ismert vagy elfogadható valószínűségen belül jósolható, továbbá, ha a klónozott gén kezdeténél és végénél, viszonylag közel restrikciós helyek vannak, úgy megfelelő restrikciós enzimekkel hosszúság szempontjából homogén és a különböző szekvenciáktól elválasztható cDNS terméket tudunk előállítani. Érthető, hogy olyan gének, mint a korábban soha nem izolált és tisztított humán növekedési előhormon génjének nukleotid-sorrendjére vonatkozóan nem áll rendelkezésre információ, kivéve bizonyos kivételes eseteket. Ily módon az összes további lépést általában heterogén cDNS termékkel kell végeznünk.
Előző adatokból megfelelő információ áll rendelkezésünkre a humán növekedési hormon cDNS molekula nukleotid-sorrendjéről (lásd. a 897710 számú, Goodman és munkatársai által megadott leírást), ami lehetővé teszi a növekedési előhormon gén szubfragmenseinek azonosítását (iásd előbb). A humán növekedési előhormon aminosavai számának ismertében a megfelelő cDNS molekula körülbelüli hosszúságát 800 bázispárra becsüljük. A Pvu II és Bgl II jelű restrikciós enzimekkel való hasítást követően gélelektroforézissel kétszálú cDNS molekulákat különítünk el, ezek elsősorban a növekedési hormont meghatározó szekvenciákat tartalmaz.
A cDNS molekula dezoxiribonukleinsav transzfer vektorba való beépítése bárhol történhet a vektoron, ahol endonukleázzal hasíthatunk, a beépítést dezoxiribonukleinsav-ligázzal katalizált úgynevezett „blunf’-végligációval végezzük (Sgarameila és munkatársai Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 67, 1468,1970). A szelekciót egyszerűsítjük és a transzfer vektoron ismert helyekre való specifikus beépítéssel növel ük a hozamot a cDNS beépülési specifitásának különböző kezelésekkel való módosításával. Az előnyös kivitelezési változat szerint a plazmid transzfer vektornak egy restrikciós helye van, amely a használt marker génen belül helyezkedik el. A körkörös plazmid dezoxiribonukleinsavat megfelelő restrikciós endonukleázza! kezeljük. A cDNS molekula végeit hozzákötjük a nyitott plazmid dezoxiribonukleinsavhoz, amikor körkörös rekombináns plazmidot kapunk, amely a restrikciós helyre beépült cDNS molekulát tartalmazza oly módon, hogy a marker génbe van beépítve és ezzei ennek a génnek a funkciója elveszik. így például a pBR322 jetű plazmid egyétlen HindlU restrikciós helyet tartalmaz, ez a tetraciklin rezisztenciát okozó gén promoter szakaszában helyezkedik el. A pBR322-vel transzformált E. coli sejtek képesek növekedni és osztódni 20 μ/ml tetraciklint tartalmazó táptalajon. Ezzel szemben a nem transzformált sejtek hasonló körülmények között elpusztulnak. A HindllI helyen beépített dezoxiribonukleinsavat tartalmazó rekombináns pBR322 plazmidot tartalmazó transzformált sejtek 20p/ml tetraciklin jelenlétében nem képesek növekedni és osztódni. A pBR322 plazmid ampicillin rezisztenciát okozó gént is tartalmaz. Ezeknek a genetikai markereknek a kombinációi lehetővé teszik a transzformált sejtek elvá5 lasztását a nem transzformált sejtektől oly módon, hogy az ampicillin jelenlétében csak az előzőek növekszenek, ezen felül lehetségessé válik a nem rekombináns pBR322 plazmidot tartalmazó transzformált sejtek elválasztása a rekombináns pBR322 plazmidot tartalmazóktól oly módon, hogy tetraciklin jelenlétében csak az előző növeks/.ik.
A beépítési speeifitást és a hozamot a HindlU enzimmel hasított pBR322 esetén növelhetjük oly módon, hogy a heterogé n cDNS végeihez HindlIIkötó oligonukleotidokat kapcsolunk (lásd Scheller és munkatársai, előbb). Ezen felül a mellékreakciókat a rekombináns transzfer vektor képzésnél, például a cDNS molekula beépülése nélkül is bekövetkező gyűrűzárást vagy dimerizációt lényegesen csökkenthetjük oly módon, hogy a restrikciós enzimekkel hasított transzfer vektor dezoxiribonukleinsavat a 5'-terminális foszfátcsoportok eltávolítására a végein előkezeljük, ahogy azt
Shine a 898887 számú leírásban megadja. A fenti nódszereket kombinálva lényegesen növekszik az előállítani kívánt rekombináns transzfer vektor abszolút és relatív hozama.
Az előző klónozási kísérletek során a cDNS terméket több egyénből gyűjtött sejtkivonatból származó hírvivő ribonukleinsavból szintetizálták. A jelen szabadalmi leírás értelmében a klónozott gént egyetlen személyből kapjuk. A találmány szerinti módszer lehetővé teszi a reakció méreté35 nek és a reakciótérfogatnak a csökkentését oly módon, hogy ez a terméket nem befolyásolja, továbbá nincs jelen a hordozó dezoxiribonukleinsav. Ez utóbbi meglepő módon növeli az általános kitermelést és a folyamat során használt enzimek által katalizált reakciók hatékonyságát. A hírvivő * ribonukleinsavat egyetlen agyalapi mirigy tumorból izoláljuk Seeburg és munkatársai (lásd előbb) szerint. Az oszlopkromatográfiás lépést kis üvegcsőben végezzük, például Pasteur-pipettában.
A fehérje eltávolítására használható tisztítási lépéseket ismert módszerekkel végezhetjük, például fenolos extrakcióval, előnyösen kloroformmal telített fenollal. A nukleinsavak töményítését alacsony hőmérsékleten alkoholos kicsapással végez50 ziik, előnyösen etanoilal -70°C hőmérsékleten. Mind a reakciósort, mind pedig a kicsapást egyetlen csőben végezzük, előnyösen alul szűkülő, műanyag, 1 —2 ml össztérfogatú centrifugacsöben.
Az enzimreakciókat, például a reverz transz55 kriptázzal való reakciót szintén kistérfogatú reakciócsőben végezzük. Az egyszálú és a kétszálú cDNS molekulák szintézisének sebességét és mértékét általában a naszccnsz cDNS izotóppal való jelölődésével követjük. A jelölést előnyösen P3260 jelzett foszfáttal végezzük, ez a nukleotid-trifoszfát prekurzorok egyikébe α-helyzetbe épül be. Előnyösen például α-P32—dCTP-t használunk. A rádióaktív jelzéssel lehetségessé válik a cDNS termék kromatografáló oszlopon és elektroforetikus gélen való elmozdulásának követése is. Ahol több oszlopkromatográfiás frakciót kell vizsgálnunk a kísérletek során, például kromatográfiát követően
196237 2 a reverz transzkriptáz reakció során nem reagált prekurzorok eltávolításakor igen előnyös a reakci'óterméket nem befolyásoló izotóppal jelzett termék mérése. A jeíen leírás szerinti módszer értelmében a frakciókat kisméretű műanyag csövekbe gyűjtjük (lásd alább), amelyeket szorosan zárunk. A csöveket közvetlenül a szcintillációs edényekbe helyezzük szciuíillációs folyadék nélkül. A Cerenkov-sugárzást megfelelő műszerrel elfogadható hatékonysággal mérhetjük.
Kismennyiségű dezoxiribonukleinsavakkal végzett eljárásokat általában oly módon végzünk, hogy az elegyhez hordozó dezoxiribonukleinsavat adunk. Ennek értelme az előállítani kívánt dezoxiribonukleinsav kinyerési hatékonyságának növelése, amely egyébként az edény falához való nem specifikus kötődés miatt alacsony lehet, de csökkentheti a kitermelést többek között dezoxiribonukleinsav kicsapás esetén a kooperatív hatás hiánya is. A jelen leírás szerint eljárva adagolt hordozó dezoxiribonukleinsav nélkül is megfelelő dezoxiribonukleinsav kitermelést érünk cl, még ng mennyiségű dezoxiribonukleinsav esetén is. A hordozó rezoxirihonukleinsav nélküli eljárás két egyértelmű előnnyel rendelkezik; először, az enzimek által katalizált reakciók során nem specifikus dezoxiribonukleinsav jelenlétének hiányában nem keletkeznek nem specifikus reakciótermékek; másodszor nem specifikus nem rekombináns transzfer vektorok nem keletkezhetnek a szennyező dezoxiribonukleinsav hiányában.
A fentiekben megadott módszerek kombinációjával lehetségessé válik a humán növekedési előhormont meghatározó dezoxi-nukleotid-szekvencia klónozása egyetlen beteg agyalapi mirigyéből kiindulva. Az alábbi példákban részletesen ismertetjük az izolálást és tisztítási lépéseket és nukleotid-sorrend analízissel bizonyítjuk a klónozott gén azonosságát.
A találmány szerinti eljárás során a különböző alkalmazható DNS szekvencia variánsok a következőképpen jellemezhetők:
5'-GGATCCTGTGGACAGCTCACCTAG CTGCAÁT C_2(, 0 C L_25 A C L_24 G G L_23 - Q R_22 - S_22 W_2, GZ_21 - A C L Q R_i9 s_w X-is T Y_i« X-π t Y_,7 - x_IA T Y_16 - G C L_„ - TT K_l4 - G C L_„ C_r X_„ T Y_„ - T G KJ,,, X_9 - C CL_, - T G G_', X_(, C A J_, - G A J_4 - G C L_3 G T L_, - C C L_, TTK,CCL,ACL,ATM4CCLsX6TY6QR7S-GZ,X,TYJTK1,,GAK1. AAKnGCL,·,A T G14 X„ Wl6 G Z16 G C L17 C A K18 W„ G Zw X2n T Ya, C A K21 C A J22 X23 TY23 G C U4 Τ T K25 G A Ktj A C L27 T A K28 C A J29 G A Τ T K3| GAJ,GAJ;5ACLJAK,ATM36CCL,A A J38 G A J39 C A J^) A A J4| Τ A K4i Q R43 S43 Τ T K44 X4, C A J46 A A K47 C C C A J39 A C L50Q R,t S5l X5, T Yp T G K53 Τ T K54 QR55 S,5 G A Q R57 S58 A T MSÍ C C L59 A C L«, C C La1 Q Ra2 S62 A A K63 Ww GZM G A J65 G A Jw AC LA7 CÁJmC A Jw A A J70 Q R7I S71A A K72 X73 T Y73 G A J74 X75 T Y7j X76 T Y„ W77 G Z77 A T M78 Q R79 S79 X8a Τ YA y y»i Χβ2 Y y«2 a τ m83 c a j84 q s85 T G G Χβ7 T Yg7 G A1«, C C Lg, G T U C A J„ Τ Τ K„, X,, T Y,3 W94 G Z,4 Q R95 s9, G T U ΤT K97'G CU.Á A K« A A Klflü T Y,(11 G T L1()2 T A K103 GGTímGC L|,)5 Q Rjoft S,,^ G A K|H7 10
ŐO
Q Β,,,χ S1()8 A A K1IWG T L[ j0T A Km G A K1)2X113T Y113 X114 TY1I4 A A J115 G A K116 Xll7 T Yll7 G A JmG A JH9G G LP(, ATMP, G A Jl22 ACLP3XI24TY124ATGGGL126W127X128TY128GAJ,;9G A KI3OG GL13lQ R132S132CCL133W134 ACL135G G L, v, C A J137 A TMIWTT Kl19 A A J14fl C A J]4) A C L|42 T A K143 Q R|44 S|44 A A Jl45 Τ T K146 G A K,47 A C L14x A A K149 Q R|5o S140 C A K151 A A K1J2 C A K)53 G A K154 G C LI55 X156 X157 A A Ji58 A AK|59T AK160GCL161X|62TY162X163TY,„ Τ A K1M T G K165 Τ T K166 W,67 G Z167 A A J|WG AK)68ATG G A Kl7| ÁAJ]72GTLÍ73G A J174 A C L,75 Τ T K|76 X)77 T Y177 W)78 G Z178 A Τ Μ,,, G T Lm,, C A J18l T G K|82 W183 G Z183 Q Rím Sím G T L185 G A J18A G G L187 Q R188 S188 TGK189CGL19()TTKI91TAGGTCCCCGGGTCCCATCCCTCTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAATTAAGTTG C AT Cpoli-3', ahol
A-dezoxi-adenil-csoport,
G— dczoxi-güanil-csoport,
C=dezoxi-citozil-csoport,
T-limidilcsopört,
J = A vagy G,
K=T vagy C,
L=A,TCvagyG,
M=A, C vagyT,
X„=T vagy C, ha Y, ,=A vagy G, és C, ha Yn=C vagy T,
Y„=A, G, C vagy T, ha Xn=C, és A vagy G, ha X =T,
Wn=C vagy A, ha Z„=G vagy A, és C, ha Zn=C vagyT,
Z„=A, G, C vagy T, ha Wn=C, és A vagy G, ha W,=A,
QR„=TC, ha S,,=A, G, C vagyT, és AG, ha S„=T vagy C,
S„=A, G, C vagy T, ha QR„=TC, és T vagy C, ha
QR„=AG, továbbá, ahol az n szám jelzi a humán növekedési hormon aminosav-szckvcnciájában a helyzetet, amelynek a genetikai kód értelmében a nukleolid-szekvenciában a triplet megfelel, és ahol az aminosav helyét a fehérje amino-terminális végétől számozva számozzuk.
/. példa , Egyetlen személytől vett szövetből származó humán növekedési előhormon génjének klónozása.
Trnnszfenoidális agyalapi mirigy műtéttel hat, agyalapi mirigy tumorban szenvedő beteg agyalapi mirigyét eltávolítjuk, gyorsan lefagyasztjuk és folyékony nitrogénben tároljuk. A következőkben megadott eljárás során mindegyik agyalapi mirigyet külön-külön kezeljük, bár mind a hatot azonos időben dolgozzuk fel. Felvágjuk a mirigyeket és négy mólos, 1 mól merkapto-metanolt tartalmazó, 5,0 pH-ra pufferezett guanidium-tio-cianátban homogenizáljuk 4°C hőmérsékleten. A homogenizátumokat 1,2 ml 5,7 mólos, 10 mM EDTA-t tar9 talmazó cézium-kloridra rétegezziik és 18 órán át 37000 percenkénti fordulattal 15 °C hőmérséklei ten centrifugáljuk Beckman ultracentrifugában
SW 50. 1 rotorban (Beckman Instrument Co.,
Fullerton, Californía). A ribonukleinsav a cenlrifugacsó aljára kerül. A hírvivő ribonukleinsav további tisztítását oligo-dT-cellulóz oszlopon végezzük lényegében Ullrich és munkatársai (lásd előbb!) és Secburg és munkatársai (lásd előbb!) módszere szerint.
A részlegesen tisztított hírvivő ribonukleinsav biológiai aktivitását sejtmentes fehérje-szintézis rendszerben vizsgáljuk búzacsírában, oly módon, hogy meghatározzuk az S35-metinonon beépülést a növekedési hormonba. A vizsgálat kísérleti körülményeit Martial és munkatársai (Prod. Nat. Acad. Sci, USA, 74, 1816—1977) írják le. Az 1. ábrán bemutatjuk egy ilyen vizsgálat eredményét. A radioaktívan jelzett fehérjét génelcktroforézisscl frakcionáljuk, az elektroforézist 12,5% poliakril-amid gélen végezzük, amely 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmaz. Az elcktroforézis 4 órán 20 mA áramerősség mellett folyik. A radioaktívan jelzett fehérjeesíkot autoradiográfiával mutatjuk ki. Az a csík a T4 bakteriofágból származó Cu-jelzett marker-fehérjéí jelzi. Az 1 -6 számú csíkok az egyedi tumorokból izolált hírvivő ribonukleinsav oligo-dT-celíulózos tisztítást követő transzlációs termékeit jelzik. Látható, hogy az 1—5 tumorok esetén a sejtmentes körülmények között kapott szintetikus termék nagy része a növekedési előhormon.
A sejtmentes rendszerben mért növekedési előhormon transzlációs aktivitásban gazdag RNS készítményeket (a 2, 4 és 5 csíkokat értjük ez alatt), összegyűjtjük és templátként használjuk a kétszálú cDNS szintéziséhez. Az összes reakciólépést 1,5 ml térfogatú műanyag centrifugacsőben végezzük. Az első reverz transzkriptáz enzim által ! katalizált reakció után RNS—DNS hibridet kapunk, a reakciót az alábbi összetételű reakcióelegyben végezzük: 68 μΐ, közelítőleg 13 pg RNS-t tartalmazó ribonukleinsav készítmény, madár mieloblasztózist okozó vírus reverz transzkriptázzal, ezt 4 μΐ nem hígított készítményként adagoljuk (a készítményt az alábbi fonásból szereztük be: Office of Program Resources and Logistics, Viral Cancer Program, Viral Oncology, Division of Cancer Cause and Prevention, National Cancer Insttitute, Bethesda, Maryland), 32 μΐ reakcióelegy 10 μΐ reverz transzkriptáz-puffert tartalmaz (ennek összetétele, 0,5 mól trísz-hidrogén-klorid, Ph 8,3; 1 mM EDTA, 70 mM magnézium-klorid, 200 mM kálium-klorid), 1 μΐ 1 mólos 2-merkaptoetanol, 5μ1 1 pg/ml oligo-dT-t tartalmazó oldat, 5 μΐ, egyenként 20 mM-os oldatból adagolt dATP, dGTP és TTP, 1 μΐ 20 mM-os dCTP és körülbelül 2x 106 cpm «-(P-’-’)-dCTP, amit közvetlenül a reakcióelegyben oldunk.
A reakciót lényegében Seeburg és munkatársai (lásd előbb) szerint végezzük. Az indukált reakcióelegyet kloroformmal telített fenollal extraháljuk ugyanabban a centrifugacsőben, etanollal kicsapjuk a terméket és legalább 15 percen át — 70°C hőmérsékleten tároljuk a csövet, amiután centrifugáljuk.
A kicsapott RNS—DNS hibridet 0,1 n nátrium10 hidroxid, 125 μΐ 5 mM-os EDTA elegyében oldjuk és 68°C hőmérsékleten 30 percen át inkubáljuk az RNS szelektív alkalikus hidrolízisére. Ezután Pástén r-pipettába töltött Sephadex G—50 (kereskedelmi név Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey) gyantából készült kis oszlopra töltjük, a terméket 10 mM-os, 7,5 pH-jú, 0,5 mM EDTA-t tartalmazó, trisz-puferall eluáljuk. A raiokatív jelzett egyszálú dezoxiribonukleinsavat Eppendorf-csőben felfogott két cseppből álló frakció taítalmazza. Lezárjuk a frakciószedő csöveket, szt indikációs tokokba helyezzük és folyadék szcintibációs számlálóba helyezzük a Cerenkov-sugárzás mérésére.
A fenti reakciólépésből származó egyszálú cDNS termékből kiinduló kétszálú cDNS molekula szintézisét reverz transzkriptáz enzimmel katalizált reakcióval végezzük. A reakciót 51 μΐ összterfogatú alábbi összetételű reakcióelegyben végezzük: 30 μΐ egyszálú dezoxiribonukleinsav óidat,
3,5 μΐ enzimoldat; 17,5 μΐ reakcióelegy az alábbi összetevőkből áll: víz 96 μΙ; reverz transzkriptáz puffer 60 μΙ; 1 mólos 2-merkapto-etanol oldat 6 μΐ; 20 mM-os dATP oldat 15 μΐ; 20 mM-os dGTP oldat 15 μΐ; 20 mM-os TTP oldat 15 μΐ; 20 mM-os dCTP oldat 3 μΐ; továbbá közelítőleg 6x löa percenkénti beütést adó a-(P32)-dCTP oldat, amit közvetlenül a reakcióelegyben oldunk. 50 percen át 47 C hőmérsékleten folyik a reakció. Ezután leállítjuk és a fehérjét extrakcióval elkülönítjük és az oldatot Sephadex G—50 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk az előzőekben megadott módon. Ezt követően az előzőekben megadott módon etanolos kicsapást végzünk.
Annak bizonyítására, hogy a növekedési hormont meghatározó cDNS-ben a készítmény gazdag, restrikciós endonukleázokkal hasítjuk a két, szálú cDNS készítmény egy részét és 4,5% poliak,il-amid gélelektroforézissel analizáljuk (lásd a 2. ábrát). A 2. ábra c és k betűvel jelzett csíkjai a adioaktívan jelzett bakteriofágból származó fd Jezoxiribonuklcinsavból származnak, amelyek a c esetén Hpaíí enzimmel és a k esetén Haellí enzimmel hasítottunk. Az a és h csíkok a nem hasított kétszálú cDNS csíkjának felelnek meg. A d-j csíkok az alábbi enzimekkel hasított dezoxiribonukleinsav fragmenseknek felelnek meg: d: Pstl+BglII; e:PvuII; f:PvuII+BglII; g:Hinflí+Smal, h'.Haelll; kPvuIl végül j: Haellí. A megfigyelt csíkok megfelelnek a humán növekedési hormon hírvivő ribonukleinsavával komplementer cDNS molekulának, mivel megfelelnek az előzőleg klónozott humán növekedési hormont meghatározó 550 bázispárból álló fragmensnek (lásd: 897 710 számú leírást). Ezek az adatok alátámasztják azt a tényt, hogy a túlsúlyban jelenlévő cDNS valóban komplementer a humán növekedési hormont meghatározó hírvivő ribonukleinsavra.
A fentiek szerint előállított kétszálú cDNS molekulát lényegében Ullrich és munkatársai (lásd előbb), módszere szerint eljárva SÍ nukleázzal kezeljük abból a célból, hogy a megfelelő bázisokkal nem páros úgynevezett „hairpin” fragmensszakaszokat hasítsuk. Az enzimes kezelést, ahogy az előzőekben is, extrakció, kromatográfia és kicsapás követi. A megfelelő páros szálat nem tartalmazó végeket dezoxiribonukleinsav-polimeráz 1 enzimmel katalizált reakcióval teljessé tesszük.
-101
A reakcióelegy az alábbi komponensekből áll: össztérfogat 20 μΐ; 60 mM trisz-hidrogén-klorid, pH 7,5; 8 mM magnézium-klorid; 10 mM 2-merkapto-etanol, 1 mM ATP, 200 μΜ dATP, dTTP, dGTP, illetve dCTP. A reakcióelegyet egy egység E. coli dezoxiribonukleinsav-polimeráz l enzimeméi kezeljük (Boehringer— Mannhcim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) 10°C hőmérsékleten 10 percen át, amikor az exonukleáz lehasítja a 3'-hibás végeket és az 5'-megfelelő végeket pedig komplementer szekvenciákkal tölti fel. A reakció célja olyan cDNS molekulák ellőállítása, amelyek végei úgynevezett „blunt” végek.
A „blunt” végligációval a cDNS molekula végeihez HindlII restrikciós enzim által felismerhető szekvenciákat adunk, a reakciót Seeburg és munkatársai (lásd előbb) módszere szerint dezoxiribonukleinsav-ligáz enzimmel végezzük. Vektorként a pBR322 plazmidot választjuk (lásd: Bolivár és munkatársai, Gene, 2, 95, 1977), az előzőekben megadottak miatt. A beépítést és a szűrési technikákat Ullrich és munkatársai (lásd előbb) szerint végezzük, HindlII, majd DNS ligáz enzimeket alkalmazva. Az ampicillin rezisztens telepeket kiválasztjuk és ampicillint és tetraciklint tartalmazó lemezekre replikázzuk. Azampicillinre rezisztens, de a tetraciklinre érzékeny telepeket további tanulmányozásra kiválasztjuk.
j A fentiek szerint kiválasztott transzformált sejtekből álló egyes telepekből izoláljuk a plazmid dezoxiribonukleinsavat, ezt HindlII enzimmel kezeljük és elektroforézissel vizsgáljuk a defektív beépüléseket, köztük a deléciókat és a dupükációkat. A hibás beépüléseket könnyen kimutathatjuk a HindlII fragmensek nagyságának vizsgálatával.
A transzfer vektort HindlII enzimmel emésztjük, majd PvuII és BglIII restrikciós enzimekkel kezeljük, és vizsgáljuk a felszabaduló fragmenseket abból a célból, hogy megállapítsuk, hogy a kiónozott dezoxiribonukleinsav meghatározza-e a humán előnövekedési hormont, A kiszabadított cDNS-t a restrikciós fragmenseket gélelektroforézissel frakcionáljuk a dezoxiribonukleinsavat etidium-bromidos fluoreszencia festéssel mutatjuk ki. Az eredményeket a 3. ábrán adjuk meg, az ábrán a nagyobb dezoxiribonukleinsav fragmensek a felső részen helyezkednek el. Az a csík az előzőleg klónozott 550 bázispárból álló humán növekedési hormon dezoxiribonukleinsav (lásd 897710 számú leírást). A b csík a 800 bázispárból álló humán növekedési előhormon teljes dezoxiribonukleinsava. A c és e csíkok sorrendben a PvuII és BglII restrikciós enzimekkel hasított 500 bázispárból álló fragmens mintái. A d és f csíkok mutatják a 800 bázispárból álló teljes előnövekedési hormon dezoxiribonukleinsavát sorrendben PvuII és BglII enzimekkel való kezelést követően. A PvuII enzimmel való hasítás mindkét esetben azonos nagyságú fragmenseket eredményez, ami adódik abból, hogy a PvuII hely az 500 bázispárból álló fragmens egyik vegéhez közel helyezkedik el. A BglII enzimmel való hasítás után nagyobb fragmenseket kapunk a 800 bázispárból dezoxiribonukleinsav esetén, mint az 550 bázispárból álló' fragmens esetén, ahogy az várható is. Ezek az eredmények megegyeznek a humán növekedési hormon génjének megfelelő klónozott 800 bázispárból álló hormon génjének megfelelő klónozott 800 bázispárból álló fragmessel. A cHGH800 jellel jelzett klónozott dezoxiribonukleinsavat választottuk ki a szekvencia analízishez.
2. példa
A cHGHSOO nukleotid sorrendjének analízise.
A cHGH800 nukleotid sorrendjét Maxam és Gilbért módszerével (Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74, 560, 1977) és Sangcr és munkatársai módszerével (Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74, 5463, 1977) határoztuk meg. Az eredményt a 4. táblázatban adjuk meg. A klónozott gén a humán pre-növekedési hormont kódoló teljes szekvenciát tartalmazza a feltételezhetően nem átírt és az 5'-végen clhelyezkedő 29 bázispárbó! álló szakasszal együtt, továbbá a nem átírt és a 3'-végen elhelyezkedő 108 bázispárt (kivéve a poli —A szakaszt). (Az 5'- és a 3'-végckct a cDNS azonos szálára vonatkoztatjuk, amely megfelel a növekedési hormon hírvivő ribonukleinsaván lévő szekvenciának).
Bizonyos bizonytalanságok fennállnak a növekedési hormon szekvenciájának kezdetéhez közel eső elöszekvenciában. Megjegyezzük, hogy a 4. táblázatban megadott nukleotid-szekvencia a növekedési hormon közölt szekvenciájától kismértékben különböző aminosav-szekvenciát határoz meg. Úgy véljük, hogy a nukleotid-szekvencia analízisből következő aminosav-szekvencia valószínűleg a helyes sorrend. Az eltérések olyan kitüntetett aminosavpárok között mutatkozik, mint a glutamin és a glutaminsav, amelyek közvetlen aminosav-szekvencia analízissel kevésbé különböztethetők meg, mint nukleotid-szekvencia analízissel. Ezen felül a nukleotid-szekvencia analízissel előzőleg ismeretlen információkat kapunk, például a növekedési hormon preszekvenciájának valószínű aminosav-szekveneiáját.
Az alábbiakban ismertetjük a cHGHSOO transzlációját.
-111
4. Táhláza1 met ala thr gly ser arg GG A:C CUG UGG ACA GCU CAC CUA GCU GCA AUC. GCU ACA GGC UCC CGG
| -20 thr | ser | leu | leu | leu | ala | phe | gly | leu | leu | - Ki CVS | leu | pro | trp | ||
| ACG | UCC | CUG | CUC | CUG | GCU | UUU | GGC | CUG | CUC | UGC | CUG | CCC | UGG | ||
| leu | gin | glu | ala | val | pro | 1 phe | pro | thr | ile | pro | leu | ser | arg | leu | phe |
| cuu | CAA | GAG | GCA | GUG | CCU | UUC | CCA | ACC | AUU | CCC UUA UCC AGG CUU | UUU | ||||
| asp | asn | ala | met | leu | arg | ala | his | arg | 20 leu | his | gin | leu | ala | ||
| GAC | AAC | CGU | AUG | CUC | GCG | GCC | CAU | CGU | CUG | CAC | CAG | CUG | GCC | ||
| phe | asp | thr | tyr | gin | sí gin | phe | glu | glu | ala | tyr | ile | pro | lys | glu | Ki gin |
UUU GAC ACC UAC CAG GAG UUU GAA GAA GCC UAU AIJC CCA AAG GAA CAG .ill
| lys | tyr | ser phe leu gin asn | pro | gin | thr | ser | len | cys | phe |
| AAG | UAU | UCA UUC CUG CAG AAC | CCC | CAG | ACC | UCC | CUC | UGU | UUC |
| ser | glu | rt) ser ile pro thr pro se | r asn | arg | glu | glu | thr | gin | gin |
UCA GAG UCU AUU CCG ACA CCC UCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG xo
| lys | ser | asn | leu | glu | leu | leu | arg ile | ser | leu | leu leu ile | gin |
| AAA | UCC | AAC CUA | GAG | CUG | CUC CGC AUC | UCC | CUG | CUG CUC AUC | CAG | ||
| ser | trp | leu | glu | pro | w val | gin | phe leu | a;g | ser | val phe ala | asn |
| UCG | UGG CUG | GAG | CCC GUG | CAG | UUC CUC | AGG | ACU | GUC UUC GCC AAC | |||
| ni» ser | leu | val | tyr | giy | ala | ser | asp ser | asn | no val | tyr asp leu | le |
| AGC CUG | GUG | UAC GGC GCC | UCU | GAC AGC AAC GUC | UAU GAC CUC CUA | ||||||
| lys | asp | leu | glu | glu | 120 gly | ile | gin thr | leu | met | gly arg leu | glu |
AAG GAC CUA GAG GAA GGC AUC CAA ACG CUG AUG GGG AGG CUG GAA
| I.W asp GAU | gly GGC | ser AGC | pro CCC | arg CGG | thr ACU | giy GGC. | ílln CAG | ile AUC | 140 phe lys UUC AAG | gin CAG | thr ACC | tyr UAC | ser AGC | |
| lys | phe | asp | thr | asn | 150 ser | his | asn | asp | asp | ala | leu | leu | lys | asn |
| AAG | UUC | GAC | ACA | AAC | UCA | CAC | AAC | GAU | GAC GCA | CUA CUC | AAG | AAC | ||
| irti tyr | giy | leu | leu | tyr | cys | phe | arg | lys | 17» asp met | asp | lys | val | glu | |
| UAC GGG CUG CUC UAC UGC UUC AGG | AAG | GAC AUG | GAC AAG | C.UC C.AG | ||||||||||
| thr | phe | leu | arg | ile | ΙΗΠ val | gin | cys | arg | ser | va! | glu | giy | ser | cys |
| ACA | UUC CUG CGC | AUC GUG CAG UGC | CGC | UCU GUC. | GAC. GC.C AGC | UGU |
l>« 191 glv phe AM
GGC UUC UAG CUG CCC GGG UGG CAU CCU GUG ACC CCU CCC CAG UGC
CUC UCC UGG CCC UGG AAG UUG CCA CUC CAC. UGC CCA CCA GCC UUG UCC UAA UAA AAU UAA GUU GCA UCA ΑΛΑ AAA AAA
3. példa
A ptrpED50—HGH plazmid előállítása. 55
A ptrpED5—1 jelű plazmidot (a Serale Research Laboratories, High Wycombe Biicks, Anglia, intézettől kaptuk), módosítottuk oly módon, hogy beépíthessük és kifejezhessük vele a klónozott növekedési előhormon DNS-t. A ptrpEDS—l 50 plazmid az E. coli triptiíán (trp) operonjának HindlII fragmenséből származik, a λ trpE bakteriofágból transzferálták, ahogy azt Hopkins és munkatársai (J. Moh Bioi., 107, 549,1976)leírják, majd Bolivár és munkatársai szerint (Gene, 2, 95, 65
1977) beépült a pBR322 HindlII helyére.
A ptrpED5 —1 plazmidot HindlII enzimmel hár ítjuk és a dezoxiribonukleinsav-polimeráz I Klenow fraginensével kezeljük az egyszálú 5'-végek párosítására (lásd. Seeburg és munkatársai, mint előbb). A plazmid dezoxiribonukleinsavhoz dekanukleotid Hindii! szakaszt (CCAAGCTTGG) kötünk. Ezután HindlII enzimmel inkubálva kohézív végeket állítunk elő és Sephadex (kereskedelmi név, Pharmacia Inc., Uppsala, Svédország) G —100 gyantán végzett kromatográfiásai izoláljuk. A körkörös plazmidot T4-dezoxiribonukleinsav-ligázzal regeneráljuk és felhasználjuk az E. coli RR—I törzsének transzformálására. A tprpED50 plazmidot tartalmazó kiónokat ampicillin rezisztencia alapján szelektálva izoláljuk.
Az 1. cs 2. példában megadott módon kapott
-121 cHGHSOO kiónozott humán növekedési előhormon dezoxíribonukleinsavat beépítjük DNS Iigázzal a ptrpRDSO Hindin helyére. A rekombináns transzfer vektort felhasználjuk az E. coli XI776 törzs transzformálásra. A transzformánsokat ampicillint tartalmazó lemezeken szelektáljuk. Több klónból izolált plazmid dezoxíribonukleinsavat a beépülés orientációjának vizsgálatára BainHI és PstI enzimekkel hasítunk. Az orientáció helyes olyan esetben, ha a növekedési előhormon kodonjai a triptofán opcronnal atomos fázisban kerülnek leolvasásra; ez együtt jár a PstI hely aszimmetrikus elhelyezkedésével, amikor 700 bázispárból álló fragroens keletkezik. A nem helyes orientáció esetén 290 bázispárból álió fragmens jön létre. A korrekt orientációjú plazmidokat ptrpED50—HGH jellel jelöljük és E. coli trpOE— 1 sejtekbe transzformáljuk.
4. példa
A humán előnövekedesi hormon kifejezése.
A ptrpED—50—HGH plazmidban a trpE és a trpD gének kifejeződése a triptofán szabályozása alatt áll, ily módon a fehérje termék mennyisége növekszik egy indukálószer jelenlétekor, például β-indolil-akrilsav adagolásakor. Az E. coli trpOE— l ptrpED50—HGH indukciójakor várhatóan növekszik a trpE gén termékének és a trpD- növekedési előhormon fúziós fehérjéjének mennyisége.
Az utóbbi az amino-terminális részt tartalmazza és a trpD gén terméke kapcsolódik a humán növekedési előhormonhoz.
E coli trpOE—l/ptrpED50—HGH tenyészete β-indolil-akrilsavval indukálunk és a 3 ml-es mintákat 2 pCi Cl4-jelzett aminosavakkal jelölünk állandó időpontokban az indukciót követően. A 0 és 4 órás indukált tenyészet mintáit formaldehiddel kezelt Staphylococcus aureus sejtekkel immunokicsapjuk az antigén-antitest komplex összegyűjtésére, ahogy azt Martial és munkatárai leírják (Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74, 1816, 1977). A proteint oldjuk és nátrium-dodecil-szulfát-poliakril-amid gélen elektroforézisnek vetjük alá, így frakcionáljuk. Az eredményeket a 4. ábrán adjuk meg.
Az a csík jelzi a T4-bakteriofággal fetőzött E. coli sejtekből származó C,4-jelzett fehérjét, amit a nagyság jelzésére használunk. A b-g jelek az indukciót követő 1, 0, 5, 1, 2, 3 és 4. órában vett jelzett minták proteinjeit mutatják. A h csík az indukált tenyészet 4. órájának immunreakcióval kicsapott fehérjét jelzi, a kicsapást a humán növekedési hormon antiszérumával végeztük. Az i jel az indukált tenyészet 4. órájában nem immunszénimmal kicsapott jelzett proteinek helyzetét mutatja. A j csík a nem indukált jelzett protein immuncsapadékát adja meg. A felső és az alsó nyilak sorrendben a trpE és a várt trpD —HGH fúziós fehérje elhelyezkedését jelzik. A baloldali számok a molekulasúlyt jelzik (xl0 \
Az eredmények szerint az indukciót követően megjelenő trpD—HGH fehérje specifikusan kicsapódik a humán növekedési hormon szérumával. Bizonyos mennyiségű immunkicsapható trpE protein is jelen van. Mivel a trpE és trpD fehérjék szokásosan komplexben asszociáltak, valószínűnek tűnik, hogy a fúziós protein trpD részének jelenléte miatt asszociáció következik be a trpE fehérje és a típD —HGH fúziós protein között. Azonban mindenképpen bizonyítékok támasztják alá a klónozott humán előnövekedési hormon génjének kifejeződését E. coliban.
Bár a találmány szerinti eljárás specifikus megvalósítások alapján íródott, az eljárás alkalmas módosításokra, variációkra, más felhasználásokra vagy adaptációkra, általában és a találmány alapgondolataiban és ismert vagy szokásos gyakorlattá váló eljárások megszületése esetén mindez a következő igénypontok által meghatározott oltalmi körbe tartozik.
Claims (3)
1. Eljárás humán növekedési előhormont kódoló gént tartalmazó transzfer vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi DNS-szekvenciát:
5'-GG ATCCTGTGG ACAGCTCACCT A G CTG C A AT G_,6 G C L_,5 A C U,4 G G L_,3 Q R_„ - S_-„ W_„ GZ_„ - A C L O R_,, §; X_18 T Y_lx X_17 Τ Y_17 - X_16 - T Y_16 GCL_l,-TTK_ll-GCL_nC_pX_ll-TY_11T G K 10 X_„ - C C - T G G_7 X_6 C A J_5 G A J_4-GCL_3GTL_,-CCL_,TTK,CCCL,A C L, ATM4CCLsX„T YóQ R7S7 WxG Z„ Χ,Τ Υ,/ΓΤΚ,,,Ο A Kh A A K,,,G CLh ATG,4X1sWlh G Zl6 G c l17 c a k18 w19 g z19 X20 T Ya) CAK.CAk X3TY„GCL,4TTK,SGAKV A C L,, T A K,x C A i,, G A JJ(,TT K„ G A J12G A J ‘ A C L,4 T A K3, AT M36 C C L37 A A J38 G A J39 C A J4Ü A A1J AK4,Q R43 S43ΤT K44X45C A J4(, A A K4,CC L,x C A J39 ACLSfl Q R51S51 X v T Y„ T G K53 Τ T KM QR„ S„ G A j56 Q R57 S58 A T mS8 c C u A c l(„ c c l61 q r67 sk A A Κ,,’ WM G ZM G A Jft5 G A J66 A C L67 C Á Jll8 C A Jw A A J7„ Q R71 S71A A K72 X73T Y„ G A J74 X7s r Y7, X7fl1 Y76 W77 G Z77 A I M7S Q R79 S79 XB|) T Ys„ Xx, T YXI Xx, T Y„ A T M83 C A Jxt Q R85 S85 T G G Xs7 Τ Yx7 T Yx7 G A Jss C CU G TL,,C A J9I Τ T K,„ X93 T Y93 G Zw Q R95 S9, G T L9ft Τ T K97 G C Us Á A Kw A A K1(W X101 τ Ύ,,,, g τ lki2 t a kI()3 g g t1ih g c l,!)S q r!06 Sun, g a k,„7Q Rh)X S|üx a a k,w gtliiotak,„g ak,,,x113ty„,xll4t y!14 a aj115g a k116X„,T Yil7 G A J„, G a Jll9 G G Lp„ A Τ M,„ G A A C LP, Xp4 Τ Yp4 A Τ G G G L,,6 Wl27 GZp, X17xT YPX G Á Jp„ G A K130 G G Ll31 Q R132 S,P C C Ln, W,',4 G Zi34 A C L135 G G Ll36C A J137 atmi3xttk139 a aj14(,caj14, ACL142TAK,43Q U-w S|44 A A J,45 Τ T KI46 G A K147 A C L148 A A Kl4„ O R|5o S,5n C A K151 A A K152 C A K,53 G A K154 G C ύ,,; Χρ,,Τ Y 15ft X1}7 A A J|5X A A K)59 Τ A Κ,,,, G C L„,| X16, Τ Y,62 X,„Τ Y163 T A K464 T G Klh} Τ Τ Κ1(Λ Wlw G Z167 A A JI6X G A K168 A T G G A K17l A A ί,72 G T L,73 G A J,74 A C L,75 1 Τ K|7|, X,77 T Y|77 W|7X G Z,7X A T M,79 G T L1X() C A J,x, T G K,x, W|X3O Z)83 Q R-is-i $ιμ θ T ^185 G A JU G G L,x7 Q R,ss S|XX T G K1X9 C G L19(| TTKp.TAGGTCCCCGGGTCCCATCCCTCTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTC13
-131
CTA ΑΤΑ ATTA AGTTGC ATCpoli 3', ahol ι A=dezoxi-adenil-csoport,
G=dezoxi-guanil-csoport,
C=dezoxi-citozil-csoport, 5
T=timidilcsoport,
J=A vagy G,
K=--TvagyC,
L=A,TC vagyG,
M=A,C vagyT, 10
Xn=T vagy C, ha Y„=A vagy G, és C, ha Yn==C vagy T,
Yn=A, G, C vagy T, ha X„=C, cs A vagy G, ha X =T
W„=C vagy A, ha Z„=G vagy A, és C, ha Z„:=C 15 vagyT,
Z„--A, G, C vagy T, ha W„=C, és A vagy G, ha W„=A,
QR, =TC, ha S,~ A, G, C vagy T, és AG, ha Sn=T vagy C, 20
S„=A, G, C vagy T, ha QRn=TC, és T vagy C, ha QR„=AG, továbbá, ahol az n szám jelzi a humán növekedési hormon aminosav-szekvenciájában a helyzetet, amelynek a genetikai kód értelmében a nukleotidszckvenciában a triplet megfelel, és ahol az aminosav helyét a fehérje amino-terminális végétől számítva számozzuk, megfelelő hordozó vektorba építjük be.
2. Eljárás humán növekedési előhormont kódoló gént tartalmazó E. coli előállítására, azzal jellemezve, hogy az f. igénypont szerint előállított transzfer vektorral E. coli sejteket transzformálunk.
3. Eljárás humán növekedési előhormon előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 2. igénypont szerint előállított E. coli mikroorganizmust, célszerűen E. coli trpOVEl/ptrpED50—HGH törzset tenyésztünk, majd az 1. igénypont szerinti DNS kifejezésével nyert polipeptidet a mikroorganizmus lizátumából és/vagy tenyészlevéből kinyerjük.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4464779A | 1979-06-01 | 1979-06-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU196237B true HU196237B (en) | 1988-10-28 |
Family
ID=21933526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU801371A HU196237B (en) | 1979-06-01 | 1980-05-30 | Process for producing human growth prehormone |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0020147B2 (hu) |
| JP (1) | JPH0630582B2 (hu) |
| KR (1) | KR860001515B1 (hu) |
| AR (1) | AR248049A1 (hu) |
| AT (1) | ATE5978T1 (hu) |
| AU (1) | AU543917B2 (hu) |
| BG (1) | BG41134A3 (hu) |
| CA (1) | CA1194432A (hu) |
| DD (3) | DD202046A5 (hu) |
| DE (1) | DE3066256D1 (hu) |
| DK (1) | DK232980A (hu) |
| EG (1) | EG15156A (hu) |
| ES (3) | ES8105391A1 (hu) |
| FI (1) | FI801743A (hu) |
| GR (1) | GR68404B (hu) |
| HU (1) | HU196237B (hu) |
| IE (1) | IE50378B1 (hu) |
| IL (1) | IL60186A (hu) |
| NZ (1) | NZ193867A (hu) |
| PH (3) | PH21531A (hu) |
| PL (1) | PL224664A1 (hu) |
| PT (1) | PT71323A (hu) |
| RO (1) | RO79982A (hu) |
| YU (1) | YU145380A (hu) |
| ZA (1) | ZA802992B (hu) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU542264B2 (en) * | 1979-06-01 | 1985-02-14 | G.D. Searle & Co. | Plasmid vectors |
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| US6835557B1 (en) | 1980-01-08 | 2004-12-28 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides |
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| US4338397A (en) * | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
| GB2121048B (en) * | 1980-07-03 | 1984-06-06 | Genentech Inc | Microbial expression of quasi-synthetic genes |
| IE52755B1 (en) * | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| US4665160A (en) * | 1982-03-22 | 1987-05-12 | Genentech, Inc. | Novel human growth hormone like protein HGH-V encoded in the human genome |
| US4446235A (en) * | 1982-03-22 | 1984-05-01 | Genentech, Inc. | Method for cloning human growth hormone varient genes |
| US4460689A (en) * | 1982-04-15 | 1984-07-17 | Merck & Co., Inc. | DNA Cloning vector TG1, derivatives, and processes of making |
| US4508826A (en) * | 1982-04-15 | 1985-04-02 | Merck & Co., Inc. | Bacteriophage DNA cloning vector TG1 and microorganisms containing TG1 |
| EP0095361B1 (en) * | 1982-05-25 | 1989-07-26 | Eli Lilly And Company | Cloning vectors for expression of exogenous protein |
| CA1341012C (en) | 1982-09-27 | 2000-06-06 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swine growth hormone-like polypeptides |
| FR2534273B1 (fr) * | 1982-10-07 | 1985-09-13 | Pasteur Institut | Lignees cellulaires originaires de mammiferes superieurs, productrices d'hormone de croissance, de preference humaine, et vecteurs pour leur obtention |
| AU2092983A (en) * | 1982-11-08 | 1984-05-17 | Genentech Inc. | Porcine growth hormone produced by recombinant dna technology |
| JPS6011557A (ja) * | 1983-04-19 | 1985-01-21 | ジエネツクス・コ−ポレイシヨン | クロ−ンヒツジ成長ホルモン遺伝子 |
| US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
| US4859600A (en) * | 1983-04-25 | 1989-08-22 | Genentech, Inc. | Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone |
| ZA844380B (en) * | 1983-07-05 | 1985-01-30 | Salk Inst For Biological Studi | Dna encoding a grf precursor |
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| IL78775A (en) * | 1985-05-15 | 1992-06-21 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral vaccines |
| DE3526995A1 (de) * | 1985-07-27 | 1987-02-05 | Hoechst Ag | Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| JP2500312B2 (ja) * | 1986-01-13 | 1996-05-29 | 工業技術院長 | ヒト成長ホルモンの生産法 |
| FR2599753B1 (fr) * | 1986-06-05 | 1989-12-08 | Sanofi Sa | Sequence d'adn composite et son application pour la production de l'hormone de croissance |
| ES2301178T3 (es) | 1996-04-05 | 2008-06-16 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Vectores basados en alfavirus recombinantes con inhibicion reducida de la sintesis macromolecular celular. |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ187300A (en) * | 1977-05-27 | 1982-08-17 | Univ California | Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism |
| ZA782933B (en) * | 1977-09-23 | 1979-05-30 | Univ California | Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria |
| DK173092B1 (da) * | 1977-11-08 | 2000-01-10 | Genentech Inc | Rekombinant plasmid, fremgangsmåde til fremstilling af plasmidet, bakterie indeholdende plasmidet, samt fremgangsmåde til f |
| FI792481A (fi) * | 1978-08-11 | 1980-02-12 | Univ California | Syntes av enkaroytiskt protein genom anvaendning av mikro-organismer |
-
1980
- 1980-05-20 ZA ZA00802992A patent/ZA802992B/xx unknown
- 1980-05-20 GR GR62003A patent/GR68404B/el unknown
- 1980-05-28 NZ NZ193867A patent/NZ193867A/xx unknown
- 1980-05-28 PH PH24077A patent/PH21531A/en unknown
- 1980-05-29 FI FI801743A patent/FI801743A/fi not_active Application Discontinuation
- 1980-05-29 PT PT71323A patent/PT71323A/pt not_active IP Right Cessation
- 1980-05-29 IL IL60186A patent/IL60186A/xx unknown
- 1980-05-29 EP EP80301785A patent/EP0020147B2/en not_active Expired
- 1980-05-29 AR AR80281231A patent/AR248049A1/es active
- 1980-05-29 DE DE8080301785T patent/DE3066256D1/de not_active Expired
- 1980-05-29 AT AT80301785T patent/ATE5978T1/de active
- 1980-05-30 HU HU801371A patent/HU196237B/hu not_active IP Right Cessation
- 1980-05-30 ES ES492044A patent/ES8105391A1/es not_active Expired
- 1980-05-30 BG BG8047972A patent/BG41134A3/xx unknown
- 1980-05-30 AU AU58926/80A patent/AU543917B2/en not_active Expired
- 1980-05-30 IE IE1137/80A patent/IE50378B1/en not_active IP Right Cessation
- 1980-05-30 DK DK232980A patent/DK232980A/da not_active Application Discontinuation
- 1980-05-30 YU YU01453/80A patent/YU145380A/xx unknown
- 1980-05-30 CA CA000353090A patent/CA1194432A/en not_active Expired
- 1980-05-31 EG EG337/80A patent/EG15156A/xx active
- 1980-05-31 PL PL22466480A patent/PL224664A1/xx unknown
- 1980-05-31 RO RO80101293A patent/RO79982A/ro unknown
- 1980-05-31 KR KR1019800002178A patent/KR860001515B1/ko active
- 1980-06-02 DD DD80234739A patent/DD202046A5/de unknown
- 1980-06-02 DD DD80221521A patent/DD154022A5/de not_active IP Right Cessation
- 1980-06-02 JP JP55074122A patent/JPH0630582B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1980-06-02 DD DD80234741A patent/DD202045A5/de unknown
-
1981
- 1981-02-02 ES ES499046A patent/ES499046A0/es active Granted
- 1981-02-02 ES ES499045A patent/ES499045A0/es active Granted
-
1982
- 1982-11-05 PH PH28092A patent/PH21939A/en unknown
-
1985
- 1985-01-24 PH PH31764A patent/PH22089A/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU196237B (en) | Process for producing human growth prehormone | |
| CA1340872C (en) | Microbial expression of interleukin ii | |
| JP2687995B2 (ja) | Ｄｎａ配列、組替えｄｎａ分子およびヒト繊維芽細胞インターフェロン様ポリペプチドの製造方法 | |
| US4914027A (en) | Process for the microbiological preparation of human serum albumin | |
| FI64640C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en kombinations-dna-molekylsom innehaoller en foer insulin kodande nukleotidsekvens hocsom kan anvaendas vid framstaellning av en insulin produ rcende mikroorganism | |
| WO1985000831A1 (en) | Microbial expression of insulin-like growth factor | |
| JPS59501096A (ja) | 構造遺伝子の製造および発現 | |
| HU195535B (en) | Process for producing dna transfer vector comprising base sequence determining cattle growth hormone or prehormone | |
| CS273152B2 (en) | Method of mature human leucocytic interferon production | |
| EP0108132A1 (en) | The manufacture and expression of genes for urogastrone and polypeptide analogs thereof | |
| KR870000501B1 (ko) | 사람의 프로인슐린의 아미노산 배열을 함유하는 단백질의 제조방법 | |
| JPH08503376A (ja) | 細菌内の異種遺伝子の発現の間の内因性アミノペプチダーゼ媒介ｎ−末端アミノ酸開裂の防止 | |
| JPS61149089A (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| JPH02195888A (ja) | ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えｄｎａ体および該組換えｄｎａ体により形質転換された原核生物細胞 | |
| JPH03297388A (ja) | 新規なｔｎｆ変異体、その製造法及びそれを有効成分とする抗腫瘍剤 | |
| CN108794645A (zh) | 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| KR920002312B1 (ko) | 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자 | |
| JPS60502136A (ja) | 微生物によるインタ−ル−キン２の形質発現 | |
| KR860001922B1 (ko) | 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법 | |
| KR100232658B1 (ko) | 대장균에서 인간 혈소판 생성 촉진인자의 제조방법 | |
| JPH02447A (ja) | ヒトリンホトキシン合成遺伝子 | |
| KR910000457B1 (ko) | 인간성장호르몬 발현 벡터 ptrp322H-HGH | |
| JP3425620B2 (ja) | プロテアソーム分解に抵抗性を示す新規ｐ２７Ｋｉｐ１分子種の核酸及びアミノ酸配列と同蛋白質の発現ベクター及び発現細胞 | |
| JPH07501934A (ja) | Ｇｐａ神経栄養因子の製造 | |
| JPH06343470A (ja) | ヒト肝癌細胞由来増殖因子の遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |