JPS62289199A - ヒトプロテインｓ - Google Patents
ヒトプロテインｓInfo
- Publication number
- JPS62289199A JPS62289199A JP62131049A JP13104987A JPS62289199A JP S62289199 A JPS62289199 A JP S62289199A JP 62131049 A JP62131049 A JP 62131049A JP 13104987 A JP13104987 A JP 13104987A JP S62289199 A JPS62289199 A JP S62289199A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- protein
- buffer
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 101000577630 Homo sapiens Vitamin K-dependent protein S Proteins 0.000 title claims description 40
- 102000052932 human PROS1 Human genes 0.000 title claims description 38
- 229940099815 human protein s Drugs 0.000 title claims description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 306
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 219
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 claims description 60
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims description 58
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 57
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000002480 thymidyl group Chemical group 0.000 claims 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 146
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 88
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 80
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 69
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 67
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 59
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 58
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 58
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 37
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 27
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 25
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 21
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 21
- 241000829111 Human polyomavirus 1 Species 0.000 description 20
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 20
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 20
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 19
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 18
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 18
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 18
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 16
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 12
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 11
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 11
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 11
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 10
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 102000006912 Complement C4b-Binding Protein Human genes 0.000 description 8
- 108010047548 Complement C4b-Binding Protein Proteins 0.000 description 8
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 8
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 8
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 8
- OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;ethanol Chemical compound CCO.O=C=O OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 7
- 206010051292 Protein S Deficiency Diseases 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 6
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 6
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 6
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 4
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 4
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 4
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 4
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 4
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 4
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 3
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 description 3
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 3
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 108010002730 protein S precursor Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- YYLQUHNPNCGKJQ-NHYDCYSISA-N (3R)-3-hydroxy-L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)[C@@H](O)C(O)=O YYLQUHNPNCGKJQ-NHYDCYSISA-N 0.000 description 2
- UHBYWPGGCSDKFX-GSVOUGTGSA-N (3r)-3-aminopropane-1,1,3-tricarboxylic acid Chemical group OC(=O)[C@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- 206010068370 Acquired protein S deficiency Diseases 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- RATOMFTUDRYMKX-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N RATOMFTUDRYMKX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000658545 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Type I restriction enyme HindI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QBEPTBMRQALPEV-MNXVOIDGSA-N Lys-Ile-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QBEPTBMRQALPEV-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- 101000799321 Lytechinus pictus Actin, cytoskeletal 4 Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 description 2
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N Ser-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- YQNQNVDNTFHQSW-UHFFFAOYSA-N acetic acid [2-[[(5-nitro-2-thiazolyl)amino]-oxomethyl]phenyl] ester Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(=O)NC1=NC=C([N+]([O-])=O)S1 YQNQNVDNTFHQSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N haloperidol Chemical compound C1CC(O)(C=2C=CC(Cl)=CC=2)CCN1CCCC(=O)C1=CC=C(F)C=C1 LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHKVCYCWBUNNQH-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-1-(1,4,5,7-tetrahydropyrazolo[3,4-c]pyridin-6-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)C=NN2 DHKVCYCWBUNNQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKPGFKQVRITNFM-KBPBESRZSA-N 2-[[2-[[(2s)-1-[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 UKPGFKQVRITNFM-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-UHFFFAOYSA-N 6,18-dimethoxy-17-[oxo-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methoxy]-1,3,11,12,14,15,16,17,18,19,20,21-dodecahydroyohimban-19-carboxylic acid methyl ester Chemical compound C1C2CN3CCC(C4=CC=C(OC)C=C4N4)=C4C3CC2C(C(=O)OC)C(OC)C1OC(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- QDRGPQWIVZNJQD-CIUDSAMLSA-N Ala-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QDRGPQWIVZNJQD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BGNLUHXLSAQYRQ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O BGNLUHXLSAQYRQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- QHASENCZLDHBGX-ONGXEEELSA-N Ala-Gly-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QHASENCZLDHBGX-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N Ala-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MDNAVFBZPROEHO-DCAQKATOSA-N Ala-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MDNAVFBZPROEHO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Val Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(C)N)CCCCN MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GKAZXNDATBWNBI-DCAQKATOSA-N Ala-Met-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N GKAZXNDATBWNBI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BOKLLPVAQDSLHC-FXQIFTODSA-N Ala-Val-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N BOKLLPVAQDSLHC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XKHLBBQNPSOGPI-GUBZILKMSA-N Ala-Val-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)N XKHLBBQNPSOGPI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100031936 Anterior gradient protein 2 homolog Human genes 0.000 description 1
- WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N Arg-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YUGFLWBWAJFGKY-BQBZGAKWSA-N Arg-Cys-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O YUGFLWBWAJFGKY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N Arg-Gly-Gly Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FBXMCPLCVYUWBO-BPUTZDHNSA-N Arg-Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N FBXMCPLCVYUWBO-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- JWCCFNZJIRZUCL-AVGNSLFASA-N Arg-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JWCCFNZJIRZUCL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- MECFLTFREHAZLH-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N MECFLTFREHAZLH-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N Asn-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RZNAMKZJPBQWDJ-SRVKXCTJSA-N Asn-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RZNAMKZJPBQWDJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QXOPPIDJKPEKCW-GUBZILKMSA-N Asn-Pro-Arg Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O QXOPPIDJKPEKCW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- XOQYDFCQPWAMSA-KKHAAJSZSA-N Asn-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XOQYDFCQPWAMSA-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- VAWNQIGQPUOPQW-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VAWNQIGQPUOPQW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Asp-Ile Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100034330 Chromaffin granule amine transporter Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- BUXAPSQPMALTOY-WHFBIAKZSA-N Cys-Glu Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BUXAPSQPMALTOY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VIRYODQIWJNWNU-NRPADANISA-N Cys-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N VIRYODQIWJNWNU-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- OXOQBEVULIBOSH-ZDLURKLDSA-N Cys-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OXOQBEVULIBOSH-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- BCWIFCLVCRAIQK-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O BCWIFCLVCRAIQK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- ZGERHCJBLPQPGV-ACZMJKKPSA-N Cys-Ser-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)N ZGERHCJBLPQPGV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101710148289 DNA ligase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010031746 Dam methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100533283 Dictyostelium discoideum serp gene Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- LPYPANUXJGFMGV-FXQIFTODSA-N Gln-Gln-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LPYPANUXJGFMGV-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HHQCBFGKQDMWSP-GUBZILKMSA-N Gln-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N HHQCBFGKQDMWSP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KVQOVQVGVKDZNW-GUBZILKMSA-N Gln-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N KVQOVQVGVKDZNW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YKLNMGJYMNPBCP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Asp Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N YKLNMGJYMNPBCP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N Glu-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O IESFZVCAVACGPH-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OHWJUIXZHVIXJJ-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N OHWJUIXZHVIXJJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UJMNFCAHLYKWOZ-DCAQKATOSA-N Glu-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O UJMNFCAHLYKWOZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UZWUBBRJWFTHTD-LAEOZQHASA-N Glu-Val-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UZWUBBRJWFTHTD-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- IANBSEOVTQNGBZ-BQBZGAKWSA-N Gly-Cys-Met Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O IANBSEOVTQNGBZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JPAACTMBBBGAAR-HOTGVXAUSA-N Gly-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 JPAACTMBBBGAAR-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTZYMXGGXOFBMX-DJFWLOJKSA-N His-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VTZYMXGGXOFBMX-DJFWLOJKSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000775021 Homo sapiens Anterior gradient protein 2 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000641221 Homo sapiens Chromaffin granule amine transporter Proteins 0.000 description 1
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JSZMKEYEVLDPDO-ACZMJKKPSA-N Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O JSZMKEYEVLDPDO-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZDNORQNHCJUVOV-KBIXCLLPSA-N Ile-Gln-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZDNORQNHCJUVOV-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OWSWUWDMSNXTNE-GMOBBJLQSA-N Ile-Pro-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N OWSWUWDMSNXTNE-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DLCOFDAHNMMQPP-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DLCOFDAHNMMQPP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N Leu-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- JDBQSGMJBMPNFT-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JDBQSGMJBMPNFT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N Lys-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LPAJOCKCPRZEAG-MNXVOIDGSA-N Lys-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN LPAJOCKCPRZEAG-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- QBHGXFQJFPWJIH-XUXIUFHCSA-N Lys-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN QBHGXFQJFPWJIH-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- AFFKUNVPPLQUGA-DCAQKATOSA-N Met-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O AFFKUNVPPLQUGA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N N-L-leucyl-L-valine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(O)=O MDSUKZSLOATHMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 208000035871 PIK3CA-related overgrowth syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GNZCMRRSXOBHLC-JYJNAYRXSA-N Phe-Val-Met Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N GNZCMRRSXOBHLC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 244000082204 Phyllostachys viridis Species 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N Pro-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- WVOXLKUUVCCCSU-ZPFDUUQYSA-N Pro-Glu-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WVOXLKUUVCCCSU-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- PRKWBYCXBBSLSK-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PRKWBYCXBBSLSK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 241001313284 Proreus Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 201000005660 Protein C Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 101710132631 Protein C1 Proteins 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 101710179016 Protein gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 241001672981 Purpura Species 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 101710203837 Replication-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N Ser-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- SQBLRDDJTUJDMV-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQBLRDDJTUJDMV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HMRAQFJFTOLDKW-GUBZILKMSA-N Ser-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HMRAQFJFTOLDKW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- IAORETPTUDBBGV-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N IAORETPTUDBBGV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfisoxazole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091012456 T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 1
- CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N Thr-Cys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- JKGGPMOUIAAJAA-YEPSODPASA-N Thr-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JKGGPMOUIAAJAA-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- CJXURNZYNHCYFD-WDCWCFNPSA-N Thr-Lys-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N)O CJXURNZYNHCYFD-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- MXDOAJQRJBMGMO-FJXKBIBVSA-N Thr-Pro-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O MXDOAJQRJBMGMO-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 206010043595 Thrombophlebitis superficial Diseases 0.000 description 1
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- WPSYJHFHZYJXMW-JSGCOSHPSA-N Trp-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O WPSYJHFHZYJXMW-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- DZHDVYLBNKMLMB-ZFWWWQNUSA-N Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 DZHDVYLBNKMLMB-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- IELISNUVHBKYBX-XDTLVQLUSA-N Tyr-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 IELISNUVHBKYBX-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N Tyr-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- XJPXTYLVMUZGNW-IHRRRGAJSA-N Tyr-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XJPXTYLVMUZGNW-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QFHRUCJIRVILCK-YJRXYDGGSA-N Tyr-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O QFHRUCJIRVILCK-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- XCTHZFGSVQBHBW-IUCAKERBSA-N Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])C(C)C XCTHZFGSVQBHBW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KANQPJDDXIYZJS-AVGNSLFASA-N Val-Leu-Val Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N KANQPJDDXIYZJS-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QIVPZSWBBHRNBA-JYJNAYRXSA-N Val-Pro-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O QIVPZSWBBHRNBA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- UGFMVXRXULGLNO-XPUUQOCRSA-N Val-Ser-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O UGFMVXRXULGLNO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N Val-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 102100028885 Vitamin K-dependent protein S Human genes 0.000 description 1
- -1 Vllall Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 101150117300 ctrC gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150052580 dam gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010037389 glutamyl-cysteinyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N glycylvaline Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000013746 hereditary thrombophilia due to congenital protein C deficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical class CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical class CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010089198 phenylalanyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 108010057210 telomerase RNA Proteins 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000000772 tip-enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 108010035534 tyrosyl-leucyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010037335 tyrosyl-prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 108010036320 valylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010021889 valylvaline Proteins 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヘマトスタシス（凝血）制御因子である血ｔ
ｉ白貫、ヒトプロティンＳに関するものである。
ｉ白貫、ヒトプロティンＳに関するものである。
従来技術
トロンビンの形成、即ちプロトロンビンのトロンビンへ
の変換は、セリンプロテアーゼ類によって触媒される一
連の反応、即ち、コアギュレーション（凝結）カスケー
ドとして知られる反応によって制御される。これらのプ
ロテアーゼの最大活性は、トロンボモジュリン、Ｖａ因
子、Ｖｌｌｌａｌｌｌ上びプロティンＳに依存している
。プロティンＳは最近発見された、凝結および血管内血
栓症のダウンレギュレーションにおいて最も重要なプロ
ティンＣ−７”ロチインＳ−トロンボモジュリン系にお
ける主要成分である。この特殊なビタミンに依存性血漿
タンパク質は、燐脂質小胞体および血小板表面における
Ｖａ因子に対する適切に活性化されたプロティンＣ（Ａ
ＰＣ）媒介性の不活化に必要なコファクターである。
の変換は、セリンプロテアーゼ類によって触媒される一
連の反応、即ち、コアギュレーション（凝結）カスケー
ドとして知られる反応によって制御される。これらのプ
ロテアーゼの最大活性は、トロンボモジュリン、Ｖａ因
子、Ｖｌｌｌａｌｌｌ上びプロティンＳに依存している
。プロティンＳは最近発見された、凝結および血管内血
栓症のダウンレギュレーションにおいて最も重要なプロ
ティンＣ−７”ロチインＳ−トロンボモジュリン系にお
ける主要成分である。この特殊なビタミンに依存性血漿
タンパク質は、燐脂質小胞体および血小板表面における
Ｖａ因子に対する適切に活性化されたプロティンＣ（Ａ
ＰＣ）媒介性の不活化に必要なコファクターである。
プロティンＳはその生合成をビタミンＫに依存している
血漿タンパク質である。このヒトタンパク質の見かけの
分子量（Ｍ ｒ ）は６９−８５キロダルトン（ｋｄ）
であり、該タンパク質は、生物学的機能を発揮するため
にビタミンＫを必要とする他の蛋白質と同様、アミノ末
端方向に集まっている１１個のグルタミン酸残基のガン
マ（ｒ）−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ ）への変
換、３個のアスパラギン酸残基（本明細書中ではアミノ
酸残基９５．１３５、および１８２と仮定）のβ−ヒド
ロキシアスパラギン酸への変換、グリコジル化（８％重
量）およびジスルフィド結合の形成を含む広範な翻訳後
のプロセッシングを必要とする。
血漿タンパク質である。このヒトタンパク質の見かけの
分子量（Ｍ ｒ ）は６９−８５キロダルトン（ｋｄ）
であり、該タンパク質は、生物学的機能を発揮するため
にビタミンＫを必要とする他の蛋白質と同様、アミノ末
端方向に集まっている１１個のグルタミン酸残基のガン
マ（ｒ）−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ ）への変
換、３個のアスパラギン酸残基（本明細書中ではアミノ
酸残基９５．１３５、および１８２と仮定）のβ−ヒド
ロキシアスパラギン酸への変換、グリコジル化（８％重
量）およびジスルフィド結合の形成を含む広範な翻訳後
のプロセッシングを必要とする。
ｒ−カルボキシグルタミン酸残基の機能は、カルシウム
と結合し、次の脂質二重層膜への分子の結合を容易なら
しめることに有ると言われている。
と結合し、次の脂質二重層膜への分子の結合を容易なら
しめることに有ると言われている。
β−ヒドロキシアスパラギン酸の機能は未知である。還
元条件下でドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）にかけると、７
５ Ｋ ｄの重鎖と１６Ｋｄの軽鎖とが現われる。トロ
ンビンと一緒にインキュベートすると、分子から８Ｋｄ
のフラグメントが開裂され、その結果、活性が失われる
。
元条件下でドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）にかけると、７
５ Ｋ ｄの重鎖と１６Ｋｄの軽鎖とが現われる。トロ
ンビンと一緒にインキュベートすると、分子から８Ｋｄ
のフラグメントが開裂され、その結果、活性が失われる
。
プロティンＳの役割を明らかにするために、この抗凝結
系の概要を簡単に示す。プロティンＳと同様、プロティ
ンＣはその生合成をビタミンＫに依存しており、翻訳後
のＧｌｕ−＝ＧｌａおよびＡｓｐ−β−ヒドロキシアス
パラギン酸修飾が行なわれる。正常な血漿タンパク質で
あるプロティンＣはセリンプロテアーゼの酵素原として
循環している。
系の概要を簡単に示す。プロティンＳと同様、プロティ
ンＣはその生合成をビタミンＫに依存しており、翻訳後
のＧｌｕ−＝ＧｌａおよびＡｓｐ−β−ヒドロキシアス
パラギン酸修飾が行なわれる。正常な血漿タンパク質で
あるプロティンＣはセリンプロテアーゼの酵素原として
循環している。
プロティンＣの生理学的活性化剤は内皮細胞膜の糖タン
パク質、トロンボモジュリンと複合体を形成しているト
ロンビンである。遊離のトロンビンプ は主要な凝固タンパク質である。それはフイ△リノゲン
をフィブリンに変換し、血小板と凝血カスケードにおけ
る主たるコファクターである、ＶａおよびＶＩ［［ａ
因子を活性化することにより、凝結反応を強力に増幅す
る重要な正のフィードバックループを与える。これと対
照的に遊離のトロンビンはプロティンＣの活性化剤とし
ては愚鈍で効果を有していない。トロンビンがトロンボ
モジュリンと複合体（コンプレックス）を形成すると、
ソノ酵素活性スペクトルに衝撃的な変化がみられる。
パク質、トロンボモジュリンと複合体を形成しているト
ロンビンである。遊離のトロンビンプ は主要な凝固タンパク質である。それはフイ△リノゲン
をフィブリンに変換し、血小板と凝血カスケードにおけ
る主たるコファクターである、ＶａおよびＶＩ［［ａ
因子を活性化することにより、凝結反応を強力に増幅す
る重要な正のフィードバックループを与える。これと対
照的に遊離のトロンビンはプロティンＣの活性化剤とし
ては愚鈍で効果を有していない。トロンビンがトロンボ
モジュリンと複合体（コンプレックス）を形成すると、
ソノ酵素活性スペクトルに衝撃的な変化がみられる。
トロンボモジュリンと複合体を形成すると、トロンビン
はもはやフィブリノゲンをフィブリンに変換せず、血小
板を活性化せず、凝血因子ＶａおよヒＶ］ＩＩａを活性
化しない。むしろ、トロンボモジュリン−トロンビンは
プロティンＣの極めて有効な賦活剤となる。活性化され
たプロティンＣは２箇所の攻撃ポイントを有する。それ
はタンパク分解的に減成（分解）して活性型のコファク
ターＶａおよびＶＩ［［ａを不活化するが、前駆体形の
ＶａおよびＶＵａ は、活性型プロティンＣの基質には
殆どならない。プロティンＳは活性化されたプロティン
Ｃの重要なコファクターである。プロティンＳが存在し
ないと活性型プロティンＣは最小限の減成と、コファク
ターＶａおよびＶＮｌの賦活化を行なう。
はもはやフィブリノゲンをフィブリンに変換せず、血小
板を活性化せず、凝血因子ＶａおよヒＶ］ＩＩａを活性
化しない。むしろ、トロンボモジュリン−トロンビンは
プロティンＣの極めて有効な賦活剤となる。活性化され
たプロティンＣは２箇所の攻撃ポイントを有する。それ
はタンパク分解的に減成（分解）して活性型のコファク
ターＶａおよびＶＩ［［ａを不活化するが、前駆体形の
ＶａおよびＶＵａ は、活性型プロティンＣの基質には
殆どならない。プロティンＳは活性化されたプロティン
Ｃの重要なコファクターである。プロティンＳが存在し
ないと活性型プロティンＣは最小限の減成と、コファク
ターＶａおよびＶＮｌの賦活化を行なう。
最初インビトロで確立されたこれらの複雑な反応は臨床
上重要な意義を有して。、る。ホや接合性のプロティン
Ｃ欠損によって、乳児期または幼児期に起きる致死的な
形の汎発性血管向凝固症である急奔性紫班病が発現する
。深部静脈血栓症および再発性肺動脈塞栓症に関連した
ヘテロ接合性のプロティンＣ１および、とりわけプロテ
ィンＳ欠損の症例数が急速に増加しており、予備的な見
積りによると、再発性の深部静脈血栓症−肺動脈塞栓症
の全症例中１０％がへテロ接合性プロティンＳ欠損を示
すといわれている。
上重要な意義を有して。、る。ホや接合性のプロティン
Ｃ欠損によって、乳児期または幼児期に起きる致死的な
形の汎発性血管向凝固症である急奔性紫班病が発現する
。深部静脈血栓症および再発性肺動脈塞栓症に関連した
ヘテロ接合性のプロティンＣ１および、とりわけプロテ
ィンＳ欠損の症例数が急速に増加しており、予備的な見
積りによると、再発性の深部静脈血栓症−肺動脈塞栓症
の全症例中１０％がへテロ接合性プロティンＳ欠損を示
すといわれている。
更に、最近得られた証拠は、獲得性プロティンＳ欠損症
が日常的な異常であることを強く示唆している。プロテ
ィンＳは循環中で２つの型、即ち、遊離のタンパク質と
Ｃ４ｂ結合タンパク質との１＝１コンプレツクスの型で
存在している。Ｃ４ｂ結合タンパク質は分子量５７０Ｋ
ｄであって、液相および細胞表面の補体系のダウンレギ
ュレーションに重要な機能を有する。Ｃ４ｂ結合タンパ
ク質とコンプレックスを形成しているプロティンＳの生
物学的活性は未知である。妊娠中および出産直後におい
ては、プロティンＳが遊離形から結合形にシフトし機能
的プロティンＳ活性の鋭敏な減少が起きる。不フローゼ
症候群ではＣ４ｂ結合タンパク質とコンプレックスを形
成しているプロティンＳの割合が高くなっており遊離の
プロティンＳが著しく減少している。その上、今日では
まだ完全に解明されていない理由により、不フローゼ症
候群における遊離プロティンＳの比活性は実質上減少し
ている。補体の活性化が存在している全身性エリテマト
ーデス（ＳＬＥ）におイテモフロテインＳの遊離形から
結合形へのシフトがみられる。これらの疾患状態のいず
れにおいても、血栓塞栓症が高頻度で発現する。従って
、プロティンＳの遊離形から結合形へのシフトは、炎症
または他の生理学的変化が凝血バランスに直接影響を及
ぼし得るコントロールポイントをあられしているのかも
しれない。汎発性の静脈内凝固面および肝疾患の場合に
も、激しさは劣るがなお生理学上活性な遊離形プロティ
ンＳの顕著な減少が見られる。
が日常的な異常であることを強く示唆している。プロテ
ィンＳは循環中で２つの型、即ち、遊離のタンパク質と
Ｃ４ｂ結合タンパク質との１＝１コンプレツクスの型で
存在している。Ｃ４ｂ結合タンパク質は分子量５７０Ｋ
ｄであって、液相および細胞表面の補体系のダウンレギ
ュレーションに重要な機能を有する。Ｃ４ｂ結合タンパ
ク質とコンプレックスを形成しているプロティンＳの生
物学的活性は未知である。妊娠中および出産直後におい
ては、プロティンＳが遊離形から結合形にシフトし機能
的プロティンＳ活性の鋭敏な減少が起きる。不フローゼ
症候群ではＣ４ｂ結合タンパク質とコンプレックスを形
成しているプロティンＳの割合が高くなっており遊離の
プロティンＳが著しく減少している。その上、今日では
まだ完全に解明されていない理由により、不フローゼ症
候群における遊離プロティンＳの比活性は実質上減少し
ている。補体の活性化が存在している全身性エリテマト
ーデス（ＳＬＥ）におイテモフロテインＳの遊離形から
結合形へのシフトがみられる。これらの疾患状態のいず
れにおいても、血栓塞栓症が高頻度で発現する。従って
、プロティンＳの遊離形から結合形へのシフトは、炎症
または他の生理学的変化が凝血バランスに直接影響を及
ぼし得るコントロールポイントをあられしているのかも
しれない。汎発性の静脈内凝固面および肝疾患の場合に
も、激しさは劣るがなお生理学上活性な遊離形プロティ
ンＳの顕著な減少が見られる。
プロティンＳとＣ４ｂ結合タンパク質との結合によって
プロティンＳの活性は失われるが、このコンプレックス
の、Ｃ４ｂ結合タンパク賞の活性は失なわれないようで
ある。しかしながら、プロティンＳタンパク質を燐脂二
重層細胞膜に埋め込む部分（アンカー）であるとされて
いるｒ−カルボキシグルタミン酸残基を有するプロティ
ンＳがＣ４ｂ結合タンパク質を補体ダウンレギュレーシ
ョンに係る膜部位への輸送作用を行なうということは疑
かわしい。
プロティンＳの活性は失われるが、このコンプレックス
の、Ｃ４ｂ結合タンパク賞の活性は失なわれないようで
ある。しかしながら、プロティンＳタンパク質を燐脂二
重層細胞膜に埋め込む部分（アンカー）であるとされて
いるｒ−カルボキシグルタミン酸残基を有するプロティ
ンＳがＣ４ｂ結合タンパク質を補体ダウンレギュレーシ
ョンに係る膜部位への輸送作用を行なうということは疑
かわしい。
プロティンＳはヒトおよびウシ両方の血漿から単離され
た。ウシプロティンＳは報告された分子量が６４Ｋｄで
ある一本鎖ポリペプチドである。
た。ウシプロティンＳは報告された分子量が６４Ｋｄで
ある一本鎖ポリペプチドである。
これに対してヒトプロティンＳの見掛は上の分子量は６
９−８５Ｋｄであると報告されている。
９−８５Ｋｄであると報告されている。
本発明以前は、血漿からプロティンＳを得る方法はあっ
たが、プロティンＳの一次および二次構造は極僅かしか
知られていなかった。プロティンＳに関する情報は不足
しているにもかかわらすプロテ・ｆンＳの生物学的並び
に潜在的な治療上の重要性は臨床面での所見から推測さ
れる。今日得られる情報は、遺伝的なプロティンＳ欠損
は日常的な異常であるらしいことを示唆している。プロ
ティンＳ欠損症患者は比較的若年期に静脈血栓症にがが
る素因を有している。ヘテロ接合体は、表面的な血栓性
静脈炎、深部静脈血栓症および肺動脈塞栓症を発現させ
るおそれがある。プロティンＳ欠損の重大な結果が得ら
れたことから、抗血栓療法における価値ある補助物質と
して用いるためにヒトプロティンＳの遺伝子をクローン
し発現させることは極めて有益であると言える。
たが、プロティンＳの一次および二次構造は極僅かしか
知られていなかった。プロティンＳに関する情報は不足
しているにもかかわらすプロテ・ｆンＳの生物学的並び
に潜在的な治療上の重要性は臨床面での所見から推測さ
れる。今日得られる情報は、遺伝的なプロティンＳ欠損
は日常的な異常であるらしいことを示唆している。プロ
ティンＳ欠損症患者は比較的若年期に静脈血栓症にがが
る素因を有している。ヘテロ接合体は、表面的な血栓性
静脈炎、深部静脈血栓症および肺動脈塞栓症を発現させ
るおそれがある。プロティンＳ欠損の重大な結果が得ら
れたことから、抗血栓療法における価値ある補助物質と
して用いるためにヒトプロティンＳの遺伝子をクローン
し発現させることは極めて有益であると言える。
定義
ＡｐＲ：アンビシリン耐性表現型またはそれを付与する
遺伝子。
遺伝子。
ｅｐ：Ｔ抗原（Ａ）遺伝子のＳＶ４０初期プロモーター
、Ｔ抗原結合部位、およびＳＶ４０複製起源を含有する
ＤＮＡセグメント。
、Ｔ抗原結合部位、およびＳＶ４０複製起源を含有する
ＤＮＡセグメント。
発現ベクター：プロ曾−が挿入されており、しかもそれ
が、所望の遺伝子の転写を制御する位置にある、組換え
ＤＮＡクローニングベクター。
が、所望の遺伝子の転写を制御する位置にある、組換え
ＤＮＡクローニングベクター。
ヒトプロ斗インＳ：前駆体ポリペプチドであって、ブロ
ープロティンＳ、デスーカルボキシプロティンＳ、非カ
ルボキシル化プロテ１ノＳ、および成熟プロティン等の
中間体をも含み、プロティンＳ活性を有するあらゆる型
のタンパク質ヲ包含する。
ープロティンＳ、デスーカルボキシプロティンＳ、非カ
ルボキシル化プロテ１ノＳ、および成熟プロティン等の
中間体をも含み、プロティンＳ活性を有するあらゆる型
のタンパク質ヲ包含する。
ＨｍＲ：ハイグロマイシン耐性表現型またはそれを付与
する遺伝子。
する遺伝子。
ＩＶＳ：介在配列とも称するイントロンをコードしてい
るＤＮＡ０ ＮｅｏＲ：不才マイシン耐性表現型、またはそれを付与
する遺伝子。
るＤＮＡ０ ＮｅｏＲ：不才マイシン耐性表現型、またはそれを付与
する遺伝子。
○ｒｉニブラスミドの複製起源。
ｐＡ：ポリアデニル化シグナルをコードしているＤＮＡ
配列。
配列。
プロモーター： ＤＮＡのＲＮＡへの転写を指令するＤ
ＮＡ配列。
ＮＡ配列。
プロティンＳ活性：ヒトプロティンＳの生物学的機能ま
たは抗−ヒドブロチインＳ抗体との結合活性に関わる性
質。
たは抗−ヒドブロチインＳ抗体との結合活性に関わる性
質。
レプリコン：プラスミドまたは他のベクターの自律的な
複製をコントロールし、許容するＤＮＡ配列。
複製をコントロールし、許容するＤＮＡ配列。
構造遺伝子：機能的なポリペプチドをコードしているＤ
ＮＡ配列であって、翻訳開始シグナルおよび停止シグナ
ルを含む。
ＮＡ配列であって、翻訳開始シグナルおよび停止シグナ
ルを含む。
ＴｃＲ：テトラサイタリン耐性表現型またはそれを付与
する遺伝子。
する遺伝子。
翻訳活性代配タ１ドｍＲＮＡ転写物のペプチドまたはポ
リペプチドへの翻訳を与えるＤＮＡ配列であって、リポ
ソーム結合部位および５’−ＡＴＧ−３′の如き翻訳開
始コドンを含む。
リペプチドへの翻訳を与えるＤＮＡ配列であって、リポ
ソーム結合部位および５’−ＡＴＧ−３′の如き翻訳開
始コドンを含む。
本発明は、ヒトプロティンＳ活性をコードしている新規
なりＮＡ化合物および組換えＤＮＡ発現ベクターに関す
るものである。このベクターは新規なりＮＡ化合物を真
核性宿主細胞内で発現させる。本発明は又、これらのベ
クターで形質転換された宿主細胞にも関する。プロティ
ンＳをコードしているヒト肝ｃＤＮＡをクローンし配列
決定を行なった。そのｃＤＮＡ配列は５′および３′非
翻訳領域と境界を接する、６７６アミノ酸前駆体の暗号
領域からなる。この暗号領域はリーダーペプチドの４１
アミノ酸、および成熟タンパク質と終止コドンに相当す
る６３５アミノ酸とをコードしている。従って本発明は
ヒトプロティンＳおよびその前駆体をコードしているＤ
ＮＡ配列を提供することを目的とするものである。
なりＮＡ化合物および組換えＤＮＡ発現ベクターに関す
るものである。このベクターは新規なりＮＡ化合物を真
核性宿主細胞内で発現させる。本発明は又、これらのベ
クターで形質転換された宿主細胞にも関する。プロティ
ンＳをコードしているヒト肝ｃＤＮＡをクローンし配列
決定を行なった。そのｃＤＮＡ配列は５′および３′非
翻訳領域と境界を接する、６７６アミノ酸前駆体の暗号
領域からなる。この暗号領域はリーダーペプチドの４１
アミノ酸、および成熟タンパク質と終止コドンに相当す
る６３５アミノ酸とをコードしている。従って本発明は
ヒトプロティンＳおよびその前駆体をコードしているＤ
ＮＡ配列を提供することを目的とするものである。
また、本発明の目的は、ヒトプロティンＳ活性を有する
タンパク質の一次構造を提供することにある。
タンパク質の一次構造を提供することにある。
さらにまた、本発明の目的はヒトプロティンＳ前駆体を
コードしている遺伝子を含有するプラスミドを提供する
ことにある。
コードしている遺伝子を含有するプラスミドを提供する
ことにある。
図面の簡単な記述
第１図はプラスミドｐＳｈｄ（１１，５Ｋｂ）の制限サ
イトおよび機能地図である。
イトおよび機能地図である。
第２図はプラスミドｐ ＨＨｓ −ＩＩａ （７，７Ｋ
ｂ）の制限サイトおよび機能地図である。括弧で囲んだ
ＰｓｔＩ制限部位は再構成されていない。
ｂ）の制限サイトおよび機能地図である。括弧で囲んだ
ＰｓｔＩ制限部位は再構成されていない。
第３図はプラスミドＩ） ＢＫＥ １ （７，９＋＜ｂ
）の制限サイトおよび機能地図である。
）の制限サイトおよび機能地図である。
第４図はプラスミドｐＢＫｎｅｏｌ（１１，５Ｋｂ）
の制限サイトおよび機能地図である。
の制限サイトおよび機能地図である。
第５図はプラスミドｐｓＶ２ｃａｔ（５，０１５Ｋｂ）
の制限サイトおよび機能地図である。
の制限サイトおよび機能地図である。
第６図はプラスミドｐＬＰｃａｔ（４，８３Ｋｂ）の制
限サイトおよび機能地図である。
限サイトおよび機能地図である。
第７図はプラスミドｐＢＬｃａｔ（６，０９Ｋｂ）の制
限サイトおよび機能地図である。
限サイトおよび機能地図である。
第８図はプラスミドｐＬ１３３の組み立てを図示したフ
ローチャートである。
ローチャートである。
第９図はプラスミドｐＬＰＣ（６，５Ｋｂ）の制限サイ
トおよび機能地図である。
トおよび機能地図である。
第１０図はプラスミドｐＬＰＣ４（１１，７Ｋｂ）の制
限サイトおよび機能地図である。
限サイトおよび機能地図である。
第１１図はプラスミドｐＳＶ２ｈｙｇ（５，２４Ｋｂ）
の制限サイトおよび機能地図である。
の制限サイトおよび機能地図である。
第１２図はプラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌ（８，３Ｋｂ）
の制限サイトおよび機能地図である。
の制限サイトおよび機能地図である。
第１３図はプラスミドｐＬＰｃｈｄｌ（１０，２３Ｋｂ
）の制限サイトおよび機能地図である。
）の制限サイトおよび機能地図である。
第１４図はプラスミドｐ ｈ ｄ （８，５５Ｋ ｂ
）の制限サイトおよび機能地図である。
）の制限サイトおよび機能地図である。
本発明はヒトプロティンＳ活性ｆ４４するポリペプチド
をコードしている二本鎖デオキシリボ核酸を用いて生産
された組換えヒトプロティンＳに関するものである。ヒ
トプロティンＳ活性を有するポリペプチドをコードして
いるＤＮＡの暗号銀と共に、ヒトプロティンＳ前駆体の
全アミノ酸配列を以下に示す。
をコードしている二本鎖デオキシリボ核酸を用いて生産
された組換えヒトプロティンＳに関するものである。ヒ
トプロティンＳ活性を有するポリペプチドをコードして
いるＤＮＡの暗号銀と共に、ヒトプロティンＳ前駆体の
全アミノ酸配列を以下に示す。
ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＣＣＴりＧＧＴ ＧＧＧ ＣＣ；
ＣＴＧＣＧＧＧ ＧＣＧ ＣＣＣ； ＣＴＧ ＧＣＧ
ＴＧＴＭＥＴ ＡＲＧ ＶＡＬ ＬＥＵ ＧＬＹ Ｇ
ＬＹ ＡＲＧ ＣＹＳ ＧＬＹ ＡｒＡ ＰＲＯＬＥ
Ｕ ＡＬＡ ＣＹＳＣＴＣＣＴＣＣＴＡ ＧＴＧ Ｃ
ＴＴ ＣＣＣＧＴＣＴＣＡ ＧＡＧ ＧＣＡ ＡＡＣＣ
ＴＴ ＣＴＧ ＴＣＡＬＥＵ ＬＥＵ ＬＥＵ ＶＡ
Ｌ ＬＥＵ ＰＲＯＶＡＬ ＳＥＲＧＬＵ’ ＡＬ
Ａ ＡＳＮ ＬＥＵ ＬＥＵ ５ＥＲＡＡＧ Ｃ
ＡＡ ＣＡＧ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＧＴＣＣＴＧ
ＧＴＴ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＧＴ ＣＧＴ ＧＣ
ＡＬＹＳ ＧＬＮ ＧＬＮ ＡＬＡ ＳＥＲＧＩＪ
ＶＡＬ ＬＥＵ ＶＡＬ ＡＲＧ ＬＹＳ ＡＲＧ
ＡＲＧ ＡＬＡＡＡＴ ＴｃＴ ＴＴＡ ＣＴｒ
ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＣＣＡＡＡ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＡ
Ｔ ＣＴＴ ＧＡＡ ＡＧＡＡＳＮ ＳＥＲＬＥＵ Ｌ
ＥｔＪ ＧＬＵ ＧＬＵ ＴＨＲＬＹＳ ＧＬＮ ＧＬ
Ｙ ＡＳＮ ＬＥＵ ＧＬＵ ＡＲＧＧＴＣＴＴＴ Ｇ
ＡＡ ＡＡＴ ＧＡＣＣＣＧ ＧＡＡ ＡＣに ＧＡＴ
ＴＡＴ ＴＴｒ ＴＡＴ ＣＣＡ ＡＡＡＶＡＬ Ｅ
’ＨＥ ＧＬＵ ＡＳＮ ＡＳＰ ＰＲＯＧＬＵ ＴＨ
ＲＡＳＰ ＴＹＲＰＨＥ ＴＹＲＰＲＯＬＹＳＴＡＣＴ
ＴＡ ＧＴＴ ＴＧＴＣＴＴ ＣＧＣＴＣＴ ＴＩＴ
ＣＡＡ ＡＣＴ ＧＧＧ ＴｒＡ ＴＴＣＡＣＴＴＹＲ
ＬＥＵ ＶＡＬ ＣＹＳ ＬＥｔＪ ＡＲＧ ＳＥＲＰ
ＲＥ ＧＬＮ ＴＨＲＣ；ＬＹ ｒ、ＥｔＪ ＰＥＥ
ＴＨＲＧＣＴ ＧＣＡ ＣＧＴ ＣＡＧ ＴＣＡ ＡＣ
Ｔ ＡＡＴ ＧＣＴ ＴＡＴ ＣＣＴ ＧＡＣＣＴＡ
ＡＧＡ ＡＧＣＡＬＡ ＡＬＡ ＡＲＧ ＧＬＮ ＳＥ
ＲＴ）ＩＲＡＳＮ ＡＬＡ ＴＹＲＰＲＯＡＳＰ ＬＥ
Ｕ ＡＲＧ ５ＥＲＴＧＴ ＧＴＣＡＡＴ ＧＣＣＡＴ
Ｔ ＣＣＡ ＧＡＣＣＡＧ ＴＧＴ ＡＧＴ ＣＣＴ
ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＧＣＣＹＳ ＶＡＬ ＡＳＮ ＡＬ
Ａ ＩＬＥ ＰＲＯＡＳＰ ＧＬ’Ｊ ＣＹＳ ＳＥＲ
ＰＲＯＬＥＵ ＰＲＯＣＹＳＡＡＴ ＧＡＡ ＧＡＴ
ＧＧＡ ＴＡＴ ＡＴＧ ＡＧＣＴＧＣＡＡＡ ＧＡＴ
ＧＧＡ ＡＡＡ ＧＣＴ ＴＣＴＡＳＮ ＧＬＵ Ａ
ＳＰ ＧＥ、Ｙ−ス述：Ｔ ＳＥＲσ超ＬＹ！ｌｉ Ａ
ＳＰ Ｇｒｌ、Ｙ ＬＹＳ Ａ詰５ＥＲＴ′ｒＴＡＣＴ
ＴＧＣＡＣＴ ＴＧＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＧｒ Ｔ
ＧＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＡＧ ＴＧＴＰＦＥ
ＴＨＲＣＹＳ ＴＦＲＣ’（Ｓ ＬＹＳ ＰＲＯＧＬ
Ｙ ＴＲＰ ＧＬＮ ＧＬＹ ＧＬＵ ＬＹＳ ＣＹＳ
ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＡＣＡＴＡ ＡＡＴ ＧＡＡＴＧＣ
ＡＡＡ ＧＡＴ ＣＣＣＴＣＡ ＡＡＴ’ ＡＴＡ Ａ
ＡＴＧＬＵ ＰＨＥ ＡＳＰ 工ＬＥ ＡＳＮ
ＧＬＵ ＣＹＳ ＬＹＳ ＡＳＰ ＰＲＯＳ
ＥＲＡＳＮ 工ＬＥ ＡＳＮＧＧＡ ＧＧＴ ＴＧ
ＣＡＧＴ ＣＡＡ ＡＴＴ ＴＧＴ ＧＡＴ ＡＡＴ
ＡＣＡ ＣＣＴ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＡＣＧＬＹ Ｇ
ｒ、Ｙ ＣＹＳ ＳＥＲＧＬＮ ＩＬＥ ＣＹＳ
ＡＳＦ’ ＡＳＮ ＴＨＲＰＲＯＧＬＹ ＳＥＲＴＹＲ
ＣＡＣＴＧＴ ＴＣＣＴＧＴ ＡＡＡ ＡＡＴ ＧＯＴ
ＴＴＴ ＧＴＴ ＡＴＣ； ＣＴｒ ＴＣＡ ＡＡＴ
ＭＧＨＩＳ ＣＹＳ ＳＥＲＣＹＳ ＬＹＳ ＡＳＮ
ＧＬＹ ＰＨＥ ＶＡＬ ＭＥＴ ＬＥＵ ＳＥＲＡ
ＳＮ ＬＹＳ５ｇ０ ６００
６１０ ６２０ ６３０
ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＧＴ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＴＣＧＡ
Ｔ ＧＡＡ ＴＧＣＴＣＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ＣＣＡ
ＡＧＣＬＹＳ ＡＳＰ ＣＹＳ Ｉ、ＹＳ ＡＳＰ Ｖ
ＡＬ ＡＳＰ ＧＬＵ ＣＹＳ ＳＥＲＬＥＵ ＬＹ
Ｓ ＰＲＯ５ＥＲＡＴＴ ＴＧＴ ＧＧＣＡＣＡ ＧＣ
Ｔ ＧＴＧ ＴＧＣＡＡＧ ＡＡＣＡＴＣＣＣＡ ＧＧ
Ａ ＧＡＴ ’ＩＴＴ工ＬＥ ＣＹＳ ＧＬＹ ＴＨＲ
ＡＬＡ ＶＡＬ ＣＹＳ ＬＹＳ ＡＳＮ ＪＬＥ Ｐ
ＲＯＧＬＹ ＡＳＰ ＰＨＥＧＭ ＴＧＴ ＧＡＡＴＧ
ＣＣＣＣＧＡＡ ＧＧＣＴＡＣＡＧＡ ＴＡＴ ＡＡＴ
ＣＴＣＡＡＡ ＴＣＡＧＬＵ ＣＹＳ ＧＬＵ Ｃ
ＹＳ ＰＲＯＧＬＵ ＧＬＹ ＴＹＲＡＲＧ ＴＹＲＡ
ＳＮ ＬＥＩＪ ＬＹＳ ５ＥＲＡＡＧ ＴＣＴ Ｔ
ＧＴ ＧＡＡ ＣＨＡＴ ＡＴＡ ＧＡＴ ＧＡＡ Ｔ
ＧＣＴＣＴ ＧＡＧ ＭＣＡＴＧ ＴＣＴＬＹＳ Ｓ
ＥＲＣＹＳ ＧＬＵ ＡＳＰ ＩＬＥ ＡＳＰ
ＧＬＵ ＣＹＳ ＳＥＲＧＬＵ ＡＳＮ ＭＥＴ
ＣＹＳＧＣＴ ＣＡＧ ＣＴＩ’ ＴＧＴ ＧＴＣ
ＡＡＴ ＴＡＣＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＡＣＡＣＴ
ＴＧＣＴＡＴＡＬＡ ＧＬＮ ＬＥＵＣＹＳ ＶＡＬ
ＡＳＮ ＴＹＲＰＲＯＧＬＹ ＧＬＹ ＴＹＲＴＨＲ
ＣＹＳ ＴＹＲＴＧＴ ＣＡＴ ＧＣＪ：； ＡＡＧ
ＡＡＡ ＧＧＡ ＴＴＣＡＡＡ ＣＴｒ ＧＣＣＣＡ
Ａ ＧＡＴ、ＣＡＧ ＡＡＧＣＹＳ ＡＳＰ ＧＬＹ
ＬＹＳ ＬＹＳ Ｇｒ、、Ｙ Ｐｔ（Ｅ ＬＹＳ ＬＥ
Ｕ Ａ詰ＧＬＩＮ ＡＳＰ ＣひＪ ＬＹＳＡＧＴ Ｔ
Ｇｒ ＧＡＧ ＧＴＴ ＧＴＴ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＧ
ｃＣＴＴ ＣＣＣＴＴＧ ＡＡＣＣＴＴ ＧＡＣ５ＥＲ
ＣＹＳ ＧＬＵ ＶＡＬ ＶＡＬ ＳＥＲＶＡＬ ＣＹ
Ｓ ＬＥＵ ＰＲＯＬＥＵ ＡＳＮ ＬＥＵ ＡＳＰＡ
ＣＡ ＡＡＧ ＴＡＴ ＣＭ ＴＴＡ ＣＴＴ ＴＡＣ
Ｔ１’Ｇ ＧＣに ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＩＴ ＧＣＡ
にＧＧＴＨＲＬＹＳ ＴＹＲＧＬＵ ＬＥＬＴ ＬＥＵ
ＴＹＲＬＥＵ ＡＬＡ ＧＬＵＧＬＮ ＰＨＥ ＡＬ
Ａ ＧＬＹにＴＴ ＧｒＴ ＴＴＡ ＴＡＴ買Ａ黒＝Ｃ
の−Ｇα譜Ｇ晶ＡＴｃ ＡＧＣＡＧＡＶＡＬ ＶＡＬ
ＬＥＵ ＴＹＲＬＥＵ ＬＹＳ ＰＨＥ ＡＲＧ ＬＥ
Ｕ ＰＲＯＧＬＵ ＩＬＥ ＳＥＲＡＲＧＴＴＴ ＴＣ
Ａ （１；ＧＡ ＧＭ ＴｒＴ ＧＡ、Ｔ ＴＴＣＣＧ
Ｇ ＡＣＡ ＴＡＴＧＡＴ ＴＣＡ ＧＡＡ ＧＧＣＰ
ＨＥ ＳＥＲＡＬＡ ＧＬＵ ＰＨＥ ＡＳＰ Ｅ’ｌ
（Ｅ訊Ｇ芯Ｔ爪ＡＳＰ ＳＥＲＧＬＵＧＬＹＣ；ＴＧ
ＡＴＡ ＣＴＧ ＴＡＣＧＣＡ ＧＡＡ ＴＣＴ ＡＴ
ＣＧＡＴ ＣＡＣＴＣＡ ＧＣＧ ＴＧＧ ＣＴＣＶＡ
Ｌ ＩＬＥ ＬＥＵ ＴＹＲＡＬＡ ＧＬＵ ＳＥＲ］
：ＬＥ ＡＳＰ ＥＩＳ ＳＥＲＡＬＡ ＴＲＥ’ Ｌ
ＥＵ３４０ ３４５
、 ３５０１０６０
１０７０ １０８０ １０
９ＯＣＴＧ ＡＴＴ ＧＣＡ ＣＴｒＣのＧＧＴ ＧＧ
Ａ ＡＡＧ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＴＴ
ｋＡＧＬＥＵ ＩＬＥ ＡＬＡ ＬＥ’Ｕ ＡＲＧ
ＧＬＹ−ＧＬＹ ＬＹＳ ＩＬＥ ＧＬＵ ＶＡＬ Ｇ
ＬＮ ＬＥＵ ＬＹＳＡＡＴ ＧＡＡ ＣＡ’Ｉ’ Ａ
ＣＡ ＴＣＣＡＡＡ ＡＴＣＡＣＡ ＡＣＴ■ＡにＧＡ
Ｔ ＧＴｒ ＡＴＴＡＳＷ ＧＬＵ ＥＩＳ ＴＥＲＳ
ＥＲＬＹＳ ＩＬＥ ＴＨＲＴＥＲＧＬＹ ＧＬＹ
ＡＳＰ ＶＡＬ ＩＬＥＡＡＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＣＴ
Ａ、ＴＧＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＣ’ｒ ＧＴ
Ｇ ＧＭ ＧＭ ＴＴＡ ＧＡＪＩ。
ＣＴＧＣＧＧＧ ＧＣＧ ＣＣＣ； ＣＴＧ ＧＣＧ
ＴＧＴＭＥＴ ＡＲＧ ＶＡＬ ＬＥＵ ＧＬＹ Ｇ
ＬＹ ＡＲＧ ＣＹＳ ＧＬＹ ＡｒＡ ＰＲＯＬＥ
Ｕ ＡＬＡ ＣＹＳＣＴＣＣＴＣＣＴＡ ＧＴＧ Ｃ
ＴＴ ＣＣＣＧＴＣＴＣＡ ＧＡＧ ＧＣＡ ＡＡＣＣ
ＴＴ ＣＴＧ ＴＣＡＬＥＵ ＬＥＵ ＬＥＵ ＶＡ
Ｌ ＬＥＵ ＰＲＯＶＡＬ ＳＥＲＧＬＵ’ ＡＬ
Ａ ＡＳＮ ＬＥＵ ＬＥＵ ５ＥＲＡＡＧ Ｃ
ＡＡ ＣＡＧ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＧＴＣＣＴＧ
ＧＴＴ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＧＴ ＣＧＴ ＧＣ
ＡＬＹＳ ＧＬＮ ＧＬＮ ＡＬＡ ＳＥＲＧＩＪ
ＶＡＬ ＬＥＵ ＶＡＬ ＡＲＧ ＬＹＳ ＡＲＧ
ＡＲＧ ＡＬＡＡＡＴ ＴｃＴ ＴＴＡ ＣＴｒ
ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＣＣＡＡＡ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＡ
Ｔ ＣＴＴ ＧＡＡ ＡＧＡＡＳＮ ＳＥＲＬＥＵ Ｌ
ＥｔＪ ＧＬＵ ＧＬＵ ＴＨＲＬＹＳ ＧＬＮ ＧＬ
Ｙ ＡＳＮ ＬＥＵ ＧＬＵ ＡＲＧＧＴＣＴＴＴ Ｇ
ＡＡ ＡＡＴ ＧＡＣＣＣＧ ＧＡＡ ＡＣに ＧＡＴ
ＴＡＴ ＴＴｒ ＴＡＴ ＣＣＡ ＡＡＡＶＡＬ Ｅ
’ＨＥ ＧＬＵ ＡＳＮ ＡＳＰ ＰＲＯＧＬＵ ＴＨ
ＲＡＳＰ ＴＹＲＰＨＥ ＴＹＲＰＲＯＬＹＳＴＡＣＴ
ＴＡ ＧＴＴ ＴＧＴＣＴＴ ＣＧＣＴＣＴ ＴＩＴ
ＣＡＡ ＡＣＴ ＧＧＧ ＴｒＡ ＴＴＣＡＣＴＴＹＲ
ＬＥＵ ＶＡＬ ＣＹＳ ＬＥｔＪ ＡＲＧ ＳＥＲＰ
ＲＥ ＧＬＮ ＴＨＲＣ；ＬＹ ｒ、ＥｔＪ ＰＥＥ
ＴＨＲＧＣＴ ＧＣＡ ＣＧＴ ＣＡＧ ＴＣＡ ＡＣ
Ｔ ＡＡＴ ＧＣＴ ＴＡＴ ＣＣＴ ＧＡＣＣＴＡ
ＡＧＡ ＡＧＣＡＬＡ ＡＬＡ ＡＲＧ ＧＬＮ ＳＥ
ＲＴ）ＩＲＡＳＮ ＡＬＡ ＴＹＲＰＲＯＡＳＰ ＬＥ
Ｕ ＡＲＧ ５ＥＲＴＧＴ ＧＴＣＡＡＴ ＧＣＣＡＴ
Ｔ ＣＣＡ ＧＡＣＣＡＧ ＴＧＴ ＡＧＴ ＣＣＴ
ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＧＣＣＹＳ ＶＡＬ ＡＳＮ ＡＬ
Ａ ＩＬＥ ＰＲＯＡＳＰ ＧＬ’Ｊ ＣＹＳ ＳＥＲ
ＰＲＯＬＥＵ ＰＲＯＣＹＳＡＡＴ ＧＡＡ ＧＡＴ
ＧＧＡ ＴＡＴ ＡＴＧ ＡＧＣＴＧＣＡＡＡ ＧＡＴ
ＧＧＡ ＡＡＡ ＧＣＴ ＴＣＴＡＳＮ ＧＬＵ Ａ
ＳＰ ＧＥ、Ｙ−ス述：Ｔ ＳＥＲσ超ＬＹ！ｌｉ Ａ
ＳＰ Ｇｒｌ、Ｙ ＬＹＳ Ａ詰５ＥＲＴ′ｒＴＡＣＴ
ＴＧＣＡＣＴ ＴＧＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＧｒ Ｔ
ＧＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＡＧ ＴＧＴＰＦＥ
ＴＨＲＣＹＳ ＴＦＲＣ’（Ｓ ＬＹＳ ＰＲＯＧＬ
Ｙ ＴＲＰ ＧＬＮ ＧＬＹ ＧＬＵ ＬＹＳ ＣＹＳ
ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＡＣＡＴＡ ＡＡＴ ＧＡＡＴＧＣ
ＡＡＡ ＧＡＴ ＣＣＣＴＣＡ ＡＡＴ’ ＡＴＡ Ａ
ＡＴＧＬＵ ＰＨＥ ＡＳＰ 工ＬＥ ＡＳＮ
ＧＬＵ ＣＹＳ ＬＹＳ ＡＳＰ ＰＲＯＳ
ＥＲＡＳＮ 工ＬＥ ＡＳＮＧＧＡ ＧＧＴ ＴＧ
ＣＡＧＴ ＣＡＡ ＡＴＴ ＴＧＴ ＧＡＴ ＡＡＴ
ＡＣＡ ＣＣＴ ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＡＣＧＬＹ Ｇ
ｒ、Ｙ ＣＹＳ ＳＥＲＧＬＮ ＩＬＥ ＣＹＳ
ＡＳＦ’ ＡＳＮ ＴＨＲＰＲＯＧＬＹ ＳＥＲＴＹＲ
ＣＡＣＴＧＴ ＴＣＣＴＧＴ ＡＡＡ ＡＡＴ ＧＯＴ
ＴＴＴ ＧＴＴ ＡＴＣ； ＣＴｒ ＴＣＡ ＡＡＴ
ＭＧＨＩＳ ＣＹＳ ＳＥＲＣＹＳ ＬＹＳ ＡＳＮ
ＧＬＹ ＰＨＥ ＶＡＬ ＭＥＴ ＬＥＵ ＳＥＲＡ
ＳＮ ＬＹＳ５ｇ０ ６００
６１０ ６２０ ６３０
ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＧＴ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＴＣＧＡ
Ｔ ＧＡＡ ＴＧＣＴＣＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ＣＣＡ
ＡＧＣＬＹＳ ＡＳＰ ＣＹＳ Ｉ、ＹＳ ＡＳＰ Ｖ
ＡＬ ＡＳＰ ＧＬＵ ＣＹＳ ＳＥＲＬＥＵ ＬＹ
Ｓ ＰＲＯ５ＥＲＡＴＴ ＴＧＴ ＧＧＣＡＣＡ ＧＣ
Ｔ ＧＴＧ ＴＧＣＡＡＧ ＡＡＣＡＴＣＣＣＡ ＧＧ
Ａ ＧＡＴ ’ＩＴＴ工ＬＥ ＣＹＳ ＧＬＹ ＴＨＲ
ＡＬＡ ＶＡＬ ＣＹＳ ＬＹＳ ＡＳＮ ＪＬＥ Ｐ
ＲＯＧＬＹ ＡＳＰ ＰＨＥＧＭ ＴＧＴ ＧＡＡＴＧ
ＣＣＣＣＧＡＡ ＧＧＣＴＡＣＡＧＡ ＴＡＴ ＡＡＴ
ＣＴＣＡＡＡ ＴＣＡＧＬＵ ＣＹＳ ＧＬＵ Ｃ
ＹＳ ＰＲＯＧＬＵ ＧＬＹ ＴＹＲＡＲＧ ＴＹＲＡ
ＳＮ ＬＥＩＪ ＬＹＳ ５ＥＲＡＡＧ ＴＣＴ Ｔ
ＧＴ ＧＡＡ ＣＨＡＴ ＡＴＡ ＧＡＴ ＧＡＡ Ｔ
ＧＣＴＣＴ ＧＡＧ ＭＣＡＴＧ ＴＣＴＬＹＳ Ｓ
ＥＲＣＹＳ ＧＬＵ ＡＳＰ ＩＬＥ ＡＳＰ
ＧＬＵ ＣＹＳ ＳＥＲＧＬＵ ＡＳＮ ＭＥＴ
ＣＹＳＧＣＴ ＣＡＧ ＣＴＩ’ ＴＧＴ ＧＴＣ
ＡＡＴ ＴＡＣＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＡＣＡＣＴ
ＴＧＣＴＡＴＡＬＡ ＧＬＮ ＬＥＵＣＹＳ ＶＡＬ
ＡＳＮ ＴＹＲＰＲＯＧＬＹ ＧＬＹ ＴＹＲＴＨＲ
ＣＹＳ ＴＹＲＴＧＴ ＣＡＴ ＧＣＪ：； ＡＡＧ
ＡＡＡ ＧＧＡ ＴＴＣＡＡＡ ＣＴｒ ＧＣＣＣＡ
Ａ ＧＡＴ、ＣＡＧ ＡＡＧＣＹＳ ＡＳＰ ＧＬＹ
ＬＹＳ ＬＹＳ Ｇｒ、、Ｙ Ｐｔ（Ｅ ＬＹＳ ＬＥ
Ｕ Ａ詰ＧＬＩＮ ＡＳＰ ＣひＪ ＬＹＳＡＧＴ Ｔ
Ｇｒ ＧＡＧ ＧＴＴ ＧＴＴ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＧ
ｃＣＴＴ ＣＣＣＴＴＧ ＡＡＣＣＴＴ ＧＡＣ５ＥＲ
ＣＹＳ ＧＬＵ ＶＡＬ ＶＡＬ ＳＥＲＶＡＬ ＣＹ
Ｓ ＬＥＵ ＰＲＯＬＥＵ ＡＳＮ ＬＥＵ ＡＳＰＡ
ＣＡ ＡＡＧ ＴＡＴ ＣＭ ＴＴＡ ＣＴＴ ＴＡＣ
Ｔ１’Ｇ ＧＣに ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＩＴ ＧＣＡ
にＧＧＴＨＲＬＹＳ ＴＹＲＧＬＵ ＬＥＬＴ ＬＥＵ
ＴＹＲＬＥＵ ＡＬＡ ＧＬＵＧＬＮ ＰＨＥ ＡＬ
Ａ ＧＬＹにＴＴ ＧｒＴ ＴＴＡ ＴＡＴ買Ａ黒＝Ｃ
の−Ｇα譜Ｇ晶ＡＴｃ ＡＧＣＡＧＡＶＡＬ ＶＡＬ
ＬＥＵ ＴＹＲＬＥＵ ＬＹＳ ＰＨＥ ＡＲＧ ＬＥ
Ｕ ＰＲＯＧＬＵ ＩＬＥ ＳＥＲＡＲＧＴＴＴ ＴＣ
Ａ （１；ＧＡ ＧＭ ＴｒＴ ＧＡ、Ｔ ＴＴＣＣＧ
Ｇ ＡＣＡ ＴＡＴＧＡＴ ＴＣＡ ＧＡＡ ＧＧＣＰ
ＨＥ ＳＥＲＡＬＡ ＧＬＵ ＰＨＥ ＡＳＰ Ｅ’ｌ
（Ｅ訊Ｇ芯Ｔ爪ＡＳＰ ＳＥＲＧＬＵＧＬＹＣ；ＴＧ
ＡＴＡ ＣＴＧ ＴＡＣＧＣＡ ＧＡＡ ＴＣＴ ＡＴ
ＣＧＡＴ ＣＡＣＴＣＡ ＧＣＧ ＴＧＧ ＣＴＣＶＡ
Ｌ ＩＬＥ ＬＥＵ ＴＹＲＡＬＡ ＧＬＵ ＳＥＲ］
：ＬＥ ＡＳＰ ＥＩＳ ＳＥＲＡＬＡ ＴＲＥ’ Ｌ
ＥＵ３４０ ３４５
、 ３５０１０６０
１０７０ １０８０ １０
９ＯＣＴＧ ＡＴＴ ＧＣＡ ＣＴｒＣのＧＧＴ ＧＧ
Ａ ＡＡＧ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＴＴ
ｋＡＧＬＥＵ ＩＬＥ ＡＬＡ ＬＥ’Ｕ ＡＲＧ
ＧＬＹ−ＧＬＹ ＬＹＳ ＩＬＥ ＧＬＵ ＶＡＬ Ｇ
ＬＮ ＬＥＵ ＬＹＳＡＡＴ ＧＡＡ ＣＡ’Ｉ’ Ａ
ＣＡ ＴＣＣＡＡＡ ＡＴＣＡＣＡ ＡＣＴ■ＡにＧＡ
Ｔ ＧＴｒ ＡＴＴＡＳＷ ＧＬＵ ＥＩＳ ＴＥＲＳ
ＥＲＬＹＳ ＩＬＥ ＴＨＲＴＥＲＧＬＹ ＧＬＹ
ＡＳＰ ＶＡＬ ＩＬＥＡＡＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＣＴ
Ａ、ＴＧＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＣ’ｒ ＧＴ
Ｇ ＧＭ ＧＭ ＴＴＡ ＧＡＪＩ。
ＡＳＮ ＡＳＮ ＧＬＹ ＬＥＵ ＴＲＰ ＡＳＮ Ｍ
ＥＴ ＶＡｒ、ＳＥＲＶＡＬ ＧＬＵ ＧＬＵ ＬＥＵ
Ｇｒ、ＵＣＡＴ ＡＧＴ ＡＴＴ ＡＧＣＡＴＴ Ａ
ＡＡ ＡＴＡ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＣＴ ＣＴ
Ｇ ＡＴＧ ＣＡＴ日ＸＳ ＳＥＲＩＬＥ Ｓｌ：ＲＩ
ＬＥ ＬＹＳ Ｉｔ、Ｅ ＡＬＡ ＬＹＳ ＧＬＵ
ＡＬＡ ＶＡＬ ＭＥＴ ＡＳＰＡＴＡ ＡＡＴ ＡＡ
Ａ ＣＣＴ ＧＧＡ ＣＣＣＣＴＴ ＴＴＩ’ ＡＡＧ
ＣＣＧ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＧＡ ＴｒＧｒＬＥ ＡＳ
Ｎ Ｉ、ＹＳ ＰＲＯＧＬＹ ＰＲＯｒＥＵ ＰＨＥ
ＬＹＳ ＰＲＯＧＩ、Ｕ ＡＳＮ ＧＬＹ ＬＥＵＣＴ
Ｇ ＧＡＡ Ａｃｅ ＭＡ ＧＴＡ ＴＡＣＴｒＴ Ｇ
ＣＡ ＧＧＡ ＴｒＣＣＣＴ ＣＣＩｃＡＡＡ ＧＴＧ
ＬＫＵ ＧＬＵ ＴＩＥＲＬＹＳ ＶＡＬ ＴＹＲＰＨ
Ｅ ＡＬＡ ＧＬＹ ＰＨＥ ＰＲＯＡＲＧ ｒ、ＹＳ
ＶＡＬＧＡＡ ＡＧＴ ＧＡＡ ＣＴＣＡＴＴ ＡＡ
Ａ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＡＣＣＣＴ ＣＧＴ ＣＴＡ
ＧＡＴ ＧＧＡＧＬＵ ＳＥＲＧＬＵ ｒ、ＥＵ ＩＴ
、Ｅ、 ＬＹＳ ＰＲＯＩＬＥ ＡＳＮ ＰＲＯＡＲＧ
１．ＥＵ ＡＳＰ ＧＬＹＴＧＴ ＡＴＡ ＣＧＡ
ＡＧＣＴＧＧ ＡＡＴ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＡ
Ａ ＧＣ；Ａ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＡＣＹＳ ＩＬＥ
ＡＲＧ ＳＥＲＴＲＰ ＡＳＮ ＬＥＵ ＭＥＴ Ｌ
ＹＳ ＧＬＮ Ｃ；ＬＹ ＡＬＡ ＳＥＲＧｒ、ＹＡＴ
Ａ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＧＡＡ
ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＡＣ； ＣＡＴ ＴＧＣ
ＣＴＧＩＬＥ ＬＹＳ ＧＬＵ ＩＬＥ ＩＬＥ ＧＬ
Ｎ ＧＬＵ ＬＹＳ ＧＬＮ ＡＳＮ ＬＹＳ ＨＩＳ
ＣＹＳ ［、ＥＵにＴＴ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＡＧ
ＡＡＧ ＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴ ＣＣＴ ＧＧＴ
ＴＣＴ ＧＧＡ ＡＴＬ’ＶＡＬ ＴＨＲＶＡＬ ＧＬ
Ｕ ＬＹＳ ＧＬＹ ＳＥＲＴＹＲＴＹＲＰＲＯＧＬＹ
ＳＥＲＧＬＹ ＩＬＥ４Ｂ０ ４
８５ ４９０ＧＣＴ ＣＡＡ Ｔ
ＴＴ ＣＡＣＡＴＡ ＣＡＴ ＴＡＴ ＡＡＴ ＡＡＴ
ＧＴＡ ＴＣＣＡＧＴ ＧＣＴ ＧＡＧＡＬＡ Ｇ
ＬＮ ＰＲＥ ＨＩＳ ＩＬＥ ＡＳＰ Ｔ
ＹＲＡＳＮ ＡＳＮ Ｖ／’Ｌ ＳＥＲＳＥＲＡ
ＬＡ ＧＬＵＧＣ；Ｔ ＴＧＧ ＣＡＴ ＧＴＡ Ａ
Ｐ、Ｔ ＧＴＧ ＡＣＣＴＴＧ ＡＡＴ ＡＴＴ ＣＧ
Ｔ ＣＣＡ ＴＣＣＡＣにＧＬＹ ＴＲＰ ＨｒＳ Ｖ
ＡＬ ＡＳＮ ＶＡＬ ＴＨＲ′ＬＥＵ ＡＳＮ ｒ
ＬＥ ＡＲＣＰＲＯＳＥＲＴＨＲＧＧＣＡＣＴ ＧＧＴ
ＧＴｒ ＡＴＧ ＣＴＴ ＧＣＣＴｒＧ ＧＴｒ
ＴＣＴ ＧＧＴ ＡＡＣＡＡＣＡＣＡＣ，ＬＹ ＴＨＲ
ＧＬＹ ＶＡＬ ＭＥＴ ＬＥＵ ＡＬＡ ＬＥＵ
ＶＡＬ ＳＥＲＧＬＹ ＡＳＮ ＡＳＮ ＴＨＲＧ
ＴＧ ＣＣＣＴＴＴ ＧＣＴ ＧＴＧ ＴＣＣＴＴＧ
ＧＴＧ ＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＣＴ ＧＡＡ ＡＡＡ
４ＶＡＬ ＰＲＯＰＨＥ ＡＩ、Ａ ＶＡＬ
ＳＥＲＬＥＵ ＶＡＬ ＡＳＰ ＳＥＲＴｌ
ｍ ＳＥＲＧＬＵ ＬＹＳ ＠ ） ＴＣＡ ＣＡＣ； ＣＡＴ ＡＴＴ ＣＴＧ ＴＴＡ
ＴＣＴ ＧＴｒ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＣＴ ＧＴＡ Ａ
ＴＡ ＴＡＴ ４ＳＥＲＧＬＮ ＡＳＰ ＩＬＥ
ＩＩ、ＥＵ ＩＪｔＪ ＳＥＲＶＡＬ ＧＬＵ ＡＳ
Ｎ ’ｎＩＲＶＡｒ、ＩＬＥ ＴＹＲ−。
ＥＴ ＶＡｒ、ＳＥＲＶＡＬ ＧＬＵ ＧＬＵ ＬＥＵ
Ｇｒ、ＵＣＡＴ ＡＧＴ ＡＴＴ ＡＧＣＡＴＴ Ａ
ＡＡ ＡＴＡ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＣＴ ＣＴ
Ｇ ＡＴＧ ＣＡＴ日ＸＳ ＳＥＲＩＬＥ Ｓｌ：ＲＩ
ＬＥ ＬＹＳ Ｉｔ、Ｅ ＡＬＡ ＬＹＳ ＧＬＵ
ＡＬＡ ＶＡＬ ＭＥＴ ＡＳＰＡＴＡ ＡＡＴ ＡＡ
Ａ ＣＣＴ ＧＧＡ ＣＣＣＣＴＴ ＴＴＩ’ ＡＡＧ
ＣＣＧ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＧＡ ＴｒＧｒＬＥ ＡＳ
Ｎ Ｉ、ＹＳ ＰＲＯＧＬＹ ＰＲＯｒＥＵ ＰＨＥ
ＬＹＳ ＰＲＯＧＩ、Ｕ ＡＳＮ ＧＬＹ ＬＥＵＣＴ
Ｇ ＧＡＡ Ａｃｅ ＭＡ ＧＴＡ ＴＡＣＴｒＴ Ｇ
ＣＡ ＧＧＡ ＴｒＣＣＣＴ ＣＣＩｃＡＡＡ ＧＴＧ
ＬＫＵ ＧＬＵ ＴＩＥＲＬＹＳ ＶＡＬ ＴＹＲＰＨ
Ｅ ＡＬＡ ＧＬＹ ＰＨＥ ＰＲＯＡＲＧ ｒ、ＹＳ
ＶＡＬＧＡＡ ＡＧＴ ＧＡＡ ＣＴＣＡＴＴ ＡＡ
Ａ ＣＣＧ ＡＴＴ ＡＡＣＣＣＴ ＣＧＴ ＣＴＡ
ＧＡＴ ＧＧＡＧＬＵ ＳＥＲＧＬＵ ｒ、ＥＵ ＩＴ
、Ｅ、 ＬＹＳ ＰＲＯＩＬＥ ＡＳＮ ＰＲＯＡＲＧ
１．ＥＵ ＡＳＰ ＧＬＹＴＧＴ ＡＴＡ ＣＧＡ
ＡＧＣＴＧＧ ＡＡＴ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＡ
Ａ ＧＣ；Ａ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＡＣＹＳ ＩＬＥ
ＡＲＧ ＳＥＲＴＲＰ ＡＳＮ ＬＥＵ ＭＥＴ Ｌ
ＹＳ ＧＬＮ Ｃ；ＬＹ ＡＬＡ ＳＥＲＧｒ、ＹＡＴ
Ａ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＧＡＡ
ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＡＣ； ＣＡＴ ＴＧＣ
ＣＴＧＩＬＥ ＬＹＳ ＧＬＵ ＩＬＥ ＩＬＥ ＧＬ
Ｎ ＧＬＵ ＬＹＳ ＧＬＮ ＡＳＮ ＬＹＳ ＨＩＳ
ＣＹＳ ［、ＥＵにＴＴ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＡＧ
ＡＡＧ ＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴ ＣＣＴ ＧＧＴ
ＴＣＴ ＧＧＡ ＡＴＬ’ＶＡＬ ＴＨＲＶＡＬ ＧＬ
Ｕ ＬＹＳ ＧＬＹ ＳＥＲＴＹＲＴＹＲＰＲＯＧＬＹ
ＳＥＲＧＬＹ ＩＬＥ４Ｂ０ ４
８５ ４９０ＧＣＴ ＣＡＡ Ｔ
ＴＴ ＣＡＣＡＴＡ ＣＡＴ ＴＡＴ ＡＡＴ ＡＡＴ
ＧＴＡ ＴＣＣＡＧＴ ＧＣＴ ＧＡＧＡＬＡ Ｇ
ＬＮ ＰＲＥ ＨＩＳ ＩＬＥ ＡＳＰ Ｔ
ＹＲＡＳＮ ＡＳＮ Ｖ／’Ｌ ＳＥＲＳＥＲＡ
ＬＡ ＧＬＵＧＣ；Ｔ ＴＧＧ ＣＡＴ ＧＴＡ Ａ
Ｐ、Ｔ ＧＴＧ ＡＣＣＴＴＧ ＡＡＴ ＡＴＴ ＣＧ
Ｔ ＣＣＡ ＴＣＣＡＣにＧＬＹ ＴＲＰ ＨｒＳ Ｖ
ＡＬ ＡＳＮ ＶＡＬ ＴＨＲ′ＬＥＵ ＡＳＮ ｒ
ＬＥ ＡＲＣＰＲＯＳＥＲＴＨＲＧＧＣＡＣＴ ＧＧＴ
ＧＴｒ ＡＴＧ ＣＴＴ ＧＣＣＴｒＧ ＧＴｒ
ＴＣＴ ＧＧＴ ＡＡＣＡＡＣＡＣＡＣ，ＬＹ ＴＨＲ
ＧＬＹ ＶＡＬ ＭＥＴ ＬＥＵ ＡＬＡ ＬＥＵ
ＶＡＬ ＳＥＲＧＬＹ ＡＳＮ ＡＳＮ ＴＨＲＧ
ＴＧ ＣＣＣＴＴＴ ＧＣＴ ＧＴＧ ＴＣＣＴＴＧ
ＧＴＧ ＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＣＴ ＧＡＡ ＡＡＡ
４ＶＡＬ ＰＲＯＰＨＥ ＡＩ、Ａ ＶＡＬ
ＳＥＲＬＥＵ ＶＡＬ ＡＳＰ ＳＥＲＴｌ
ｍ ＳＥＲＧＬＵ ＬＹＳ ＠ ） ＴＣＡ ＣＡＣ； ＣＡＴ ＡＴＴ ＣＴＧ ＴＴＡ
ＴＣＴ ＧＴｒ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＣＴ ＧＴＡ Ａ
ＴＡ ＴＡＴ ４ＳＥＲＧＬＮ ＡＳＰ ＩＬＥ
ＩＩ、ＥＵ ＩＪｔＪ ＳＥＲＶＡＬ ＧＬＵ ＡＳ
Ｎ ’ｎＩＲＶＡｒ、ＩＬＥ ＴＹＲ−。
αｌ；Ｇ ＡＴＡ ＣＡＧ ＧＣＣＣＴＡ ＡＧＴ Ｃ
ＴＡ ＴＣＴ ＴＣＣＧＡＴ ＣＭ ＣＭ ＴＣＴ Ｃ
ＡＴ ７ＡＲＧ ＩＬＥ ＧＬＮ ＡＬＡ ＬＥ
ＴＪ ＳＥＲＬＥＵ ＣＹＳ ＳＥＲＡＳＩ’ Ｇｒ、
Ｎ ＧＬＮ ＳＥＲＨＩＳ ７ＣＴＧ ＧＡＡ
ＴｒＴ ＡＧＡ ＣＴＣＭＣＡＧＡ ＡＡＣＡＡＴ Ｃ
ＴＧ ＧＡＧ ＴＴＧ ＴＣＧ ＡＣＡｒＸＵ Ｇｎ、
Ｕ ＰＲＥ ＡＲＧ ＶＡＬ ＡＳＮ ＡＲＧ ＡＳＮ
ＡＳＮ ＬＥＵ ＧＬＵ ＬＥｔＪ ＳＥＲＴＨＲＣ
ＣＡ ＣＴＴ ＡＡＡ ＡＴＡ に７Ｍ ＡＣＣＡＴＣ
ＴＣＣＣＡＴ ＧＡＡ ＣＡＣＣＴＴ ＣＡＡ ＡＧＡ
ＰＲＯＬＥｔＪ ＬＹＳ ＩＬＥ ＧＬＵ ＴＨＲＩ
ＬＥ ＳＥＲＨＩＳ ＧＬＵ ＡＳＰ ＬＥＵ ＧＬ
Ｎ ＡＲＧＣＡＡ ＣＴｒ ＧＣＣＧＴＣＴＴＧ ＧＡ
ＣＡＡＡ ＧＣＡ ＡＴ（１； ＡＡＡ ＧＣＡ ＡＡ
Ａ ＧＴＧ にＣＣＧＬＮ ＩＩ、ＥＵ ＡＬＡ ＶＡ
Ｌ ＬＥＵ ＡＳＰ ＬＹＳ ＡＬＡ ＭＥＴ ＬＹＳ
ＡＬＡ ＬＹＳ ＶＡＬ ＡＬＡＡＣＡ ＴＡＣＣＴ
Ｇ ＧＣ；Ｔ ＧＧＣＣＴｒ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＴＴ
ＣＣＡ ＴＴＣＡＧＴ Ｃ；ＣＣＡＣＡＴＨＲＴＹＲ
ＬＥＵ Ｇｒ、Ｙ ＧＬＹ ［、＋ｌ：ｔＪ ＰＲＯＡ
ＳＰ ＶＡＬ ＰＲＯＰＨＥ ＳＥＲＡＬＡ ＴＥＲＣ
ＣＡ ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＣＣＴＴＴ ＴＡＴ ＡＡＴ
ＧＧＣＴＧＣＡＴＧ ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＡＴ ＡＴ
ｒＰＲＯＶＡＬ ＡＳＮ ＡＬＡ ＰＥＥ Ｔ
ＹＲＡＳＮ ＧＬＹ ＣＹＳ ＭＥＴ ＧＬＵ
ＶＡＬ ＡＳＮ ＩＬｄ １ＡＴ ＧＧＴ ＧＴＡ ＣＡＧ ’ｒｒＧ ＧＡＴ
ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＣＣＡＴＴ ＴＣＴ ＡＡ
Ａ ＣＡＴＩＳＮ ＧＬＹ ＶＡＬ ＧＩＪ ＬＥＵ
ＡＳＰ ＬＥＵ ＡＳＰ ＧＬＵ ＡＬＡ ＩＬＥ Ｓ
ＥＲＬＹＳ ＨＩＳｉ４５
６５０ ６５５ハＴ Ｇ
ＡＴ ＡＴＴ ＡＧＡ ＧＣＴ ＣＡＣＴＣＡ ＴＧＴ
ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＴＴ ＴＧＧ ＡＡＡ ＡＡＧｋ
ｓＮ ＡＳＰ ＩＩＥ ＡＲＧ ＡＬＡ ＥＩＳ ＳＥ
ＲＣＹＳ ＰＲＯＳＥＲＶＡＬ ＴＲＰ ＬＹＳ ＬＹ
ＳＩＣＡ ＡＡＧ ＡＡＴ ＴＣＴ コＲｒ、ＹＳ ＡＳＮ ＳＥＲ プロティンＳ前駆体のアミノ酸配列はｃＤＮＡ配列に基
づいている。前駆体は模式的に、７つの明確な領域と一
つの未知の領域からなる。これらの領域は概ね、以下の
アミノ酸（ａａ）領域にしたがってグルレープ分けされ
るニリーダーペプチド（ａ ａ −４１〜−１）；γ−
カルボキシグルタメート（Ｇｌａ）セグメント（ａａｌ
−３７）ニリンカー領域（ａａ３８〜７３）；４つの上
皮性成長因子領域（ａａ７４〜１２１，１２２〜１６５
゜１６６〜２０７．２０８〜２４８）；並びに未知の領
域（ａａ２４９〜６３５）。本明細書中、アミノ酸残基
の番号は成熟タンパク質のアミノ末端残基（上記の前駆
体タンパク質配列における残基番号４２）を１に帰属し
、これに基づいている。
ＴＡ ＴＣＴ ＴＣＣＧＡＴ ＣＭ ＣＭ ＴＣＴ Ｃ
ＡＴ ７ＡＲＧ ＩＬＥ ＧＬＮ ＡＬＡ ＬＥ
ＴＪ ＳＥＲＬＥＵ ＣＹＳ ＳＥＲＡＳＩ’ Ｇｒ、
Ｎ ＧＬＮ ＳＥＲＨＩＳ ７ＣＴＧ ＧＡＡ
ＴｒＴ ＡＧＡ ＣＴＣＭＣＡＧＡ ＡＡＣＡＡＴ Ｃ
ＴＧ ＧＡＧ ＴＴＧ ＴＣＧ ＡＣＡｒＸＵ Ｇｎ、
Ｕ ＰＲＥ ＡＲＧ ＶＡＬ ＡＳＮ ＡＲＧ ＡＳＮ
ＡＳＮ ＬＥＵ ＧＬＵ ＬＥｔＪ ＳＥＲＴＨＲＣ
ＣＡ ＣＴＴ ＡＡＡ ＡＴＡ に７Ｍ ＡＣＣＡＴＣ
ＴＣＣＣＡＴ ＧＡＡ ＣＡＣＣＴＴ ＣＡＡ ＡＧＡ
ＰＲＯＬＥｔＪ ＬＹＳ ＩＬＥ ＧＬＵ ＴＨＲＩ
ＬＥ ＳＥＲＨＩＳ ＧＬＵ ＡＳＰ ＬＥＵ ＧＬ
Ｎ ＡＲＧＣＡＡ ＣＴｒ ＧＣＣＧＴＣＴＴＧ ＧＡ
ＣＡＡＡ ＧＣＡ ＡＴ（１； ＡＡＡ ＧＣＡ ＡＡ
Ａ ＧＴＧ にＣＣＧＬＮ ＩＩ、ＥＵ ＡＬＡ ＶＡ
Ｌ ＬＥＵ ＡＳＰ ＬＹＳ ＡＬＡ ＭＥＴ ＬＹＳ
ＡＬＡ ＬＹＳ ＶＡＬ ＡＬＡＡＣＡ ＴＡＣＣＴ
Ｇ ＧＣ；Ｔ ＧＧＣＣＴｒ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＴＴ
ＣＣＡ ＴＴＣＡＧＴ Ｃ；ＣＣＡＣＡＴＨＲＴＹＲ
ＬＥＵ Ｇｒ、Ｙ ＧＬＹ ［、＋ｌ：ｔＪ ＰＲＯＡ
ＳＰ ＶＡＬ ＰＲＯＰＨＥ ＳＥＲＡＬＡ ＴＥＲＣ
ＣＡ ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＣＣＴＴＴ ＴＡＴ ＡＡＴ
ＧＧＣＴＧＣＡＴＧ ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＡＴ ＡＴ
ｒＰＲＯＶＡＬ ＡＳＮ ＡＬＡ ＰＥＥ Ｔ
ＹＲＡＳＮ ＧＬＹ ＣＹＳ ＭＥＴ ＧＬＵ
ＶＡＬ ＡＳＮ ＩＬｄ １ＡＴ ＧＧＴ ＧＴＡ ＣＡＧ ’ｒｒＧ ＧＡＴ
ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＣＣＡＴＴ ＴＣＴ ＡＡ
Ａ ＣＡＴＩＳＮ ＧＬＹ ＶＡＬ ＧＩＪ ＬＥＵ
ＡＳＰ ＬＥＵ ＡＳＰ ＧＬＵ ＡＬＡ ＩＬＥ Ｓ
ＥＲＬＹＳ ＨＩＳｉ４５
６５０ ６５５ハＴ Ｇ
ＡＴ ＡＴＴ ＡＧＡ ＧＣＴ ＣＡＣＴＣＡ ＴＧＴ
ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＴＴ ＴＧＧ ＡＡＡ ＡＡＧｋ
ｓＮ ＡＳＰ ＩＩＥ ＡＲＧ ＡＬＡ ＥＩＳ ＳＥ
ＲＣＹＳ ＰＲＯＳＥＲＶＡＬ ＴＲＰ ＬＹＳ ＬＹ
ＳＩＣＡ ＡＡＧ ＡＡＴ ＴＣＴ コＲｒ、ＹＳ ＡＳＮ ＳＥＲ プロティンＳ前駆体のアミノ酸配列はｃＤＮＡ配列に基
づいている。前駆体は模式的に、７つの明確な領域と一
つの未知の領域からなる。これらの領域は概ね、以下の
アミノ酸（ａａ）領域にしたがってグルレープ分けされ
るニリーダーペプチド（ａ ａ −４１〜−１）；γ−
カルボキシグルタメート（Ｇｌａ）セグメント（ａａｌ
−３７）ニリンカー領域（ａａ３８〜７３）；４つの上
皮性成長因子領域（ａａ７４〜１２１，１２２〜１６５
゜１６６〜２０７．２０８〜２４８）；並びに未知の領
域（ａａ２４９〜６３５）。本明細書中、アミノ酸残基
の番号は成熟タンパク質のアミノ末端残基（上記の前駆
体タンパク質配列における残基番号４２）を１に帰属し
、これに基づいている。
本発明はまたヒトプロティンＳをコードしている遺伝子
を含有する組換えＤＮＡプラスミド、並びにこのプラス
ミドで形質転換された微生物またはセルラインを提供す
るものである。
を含有する組換えＤＮＡプラスミド、並びにこのプラス
ミドで形質転換された微生物またはセルラインを提供す
るものである。
本発明のＤＮＡ化合物は、５′および３′両側の非暗号
配列をも含む、ヒトプロティンＳ前駆体の全遺伝子をコ
ードしているヒト肝ｍ ＲＮ Ａから調製された一本鎖
ｃＤＮＡクローンから導かれる。
配列をも含む、ヒトプロティンＳ前駆体の全遺伝子をコ
ードしているヒト肝ｍ ＲＮ Ａから調製された一本鎖
ｃＤＮＡクローンから導かれる。
まず、ヤング（Ｙｏｕｎｇ ） およびディビス（Ｄ
ａｖｉＳ）の記載した方法（プロシーデインダス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスイズ
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）Ｔ
Ｊ Ｓ Ａ ８０：１１９４−１１９８））に従゛つて
ラムダ（λ）ｇｔ１１発現ベクター（１ａｃ５ ｎ１ｎ
５ｃＩ８５７ｓ１００）内で、組換えヒト肝ｃＤＮＡラ
イブラリーを調製した。
ａｖｉＳ）の記載した方法（プロシーデインダス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスイズ
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）Ｔ
Ｊ Ｓ Ａ ８０：１１９４−１１９８））に従゛つて
ラムダ（λ）ｇｔ１１発現ベクター（１ａｃ５ ｎ１ｎ
５ｃＩ８５７ｓ１００）内で、組換えヒト肝ｃＤＮＡラ
イブラリーを調製した。
λｇｔｌｌ内で組み立てられた組換えヒト肝ｃＤＮＡラ
イブラリーはクロンチク・ラボラトリイズ（Ｃ１ｏｎｔ
ｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） Ｉｎｃ、、 ９
２２ インダストリアルアベニュー（Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ Ａｖｅｎｕｅ）パロ アルド（Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ）カリフォルニア９４８０３から得られた。このライ
ブラリーを通常の方法を用い、ヤギ内で惹起させたヒト
プロティンＳに対するポリクローナル抗体でスクリーニ
ングした。約２×１０６個の組換え体が大腸菌（ニジ轟 エリヒア・コリ）Ｙ１０９０の一書のファージプラーク
の形でスクリーニングされた。大腸菌Ｙ１０９０は寄託
番号３７１９７の下、ＡＴＣＣがら入手可能である。
イブラリーはクロンチク・ラボラトリイズ（Ｃ１ｏｎｔ
ｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） Ｉｎｃ、、 ９
２２ インダストリアルアベニュー（Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ Ａｖｅｎｕｅ）パロ アルド（Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ）カリフォルニア９４８０３から得られた。このライ
ブラリーを通常の方法を用い、ヤギ内で惹起させたヒト
プロティンＳに対するポリクローナル抗体でスクリーニ
ングした。約２×１０６個の組換え体が大腸菌（ニジ轟 エリヒア・コリ）Ｙ１０９０の一書のファージプラーク
の形でスクリーニングされた。大腸菌Ｙ１０９０は寄託
番号３７１９７の下、ＡＴＣＣがら入手可能である。
融合タンパク質の宿主に対する有害作用の危険性から宿
主を守るために、プラークの形成はプレートを４２℃で
インキュベーションすることにより、１ａｃＺ ブロモ
ターからの発現なしに開始された。プラーク周囲の感染
細胞数が増えたら、イソプロピルチオ−β−ガラクトジ
ッド（ＩＰＴＧ）を加えて１ａ（Ｚ指令下の遺伝子発現
を誘導する。このこさは、ＩＰＴＧを含浸したニトロセ
ルロースフィルター・ディスクを菌叢の上に置くことに
よって行なわれた。インキュベーション期間の後、タン
パク質が結合したニトロセルロースフィルターを洗浄し
、−次抗体、次いでビオチニル化した２次抗体で処理し
た後、アビジン−ペルオキシダーゼ・コンジュゲートで
処理した。過酸化水素に暴露した際の呈色反応に基いて
陽性コロニーを同定した。
主を守るために、プラークの形成はプレートを４２℃で
インキュベーションすることにより、１ａｃＺ ブロモ
ターからの発現なしに開始された。プラーク周囲の感染
細胞数が増えたら、イソプロピルチオ−β−ガラクトジ
ッド（ＩＰＴＧ）を加えて１ａ（Ｚ指令下の遺伝子発現
を誘導する。このこさは、ＩＰＴＧを含浸したニトロセ
ルロースフィルター・ディスクを菌叢の上に置くことに
よって行なわれた。インキュベーション期間の後、タン
パク質が結合したニトロセルロースフィルターを洗浄し
、−次抗体、次いでビオチニル化した２次抗体で処理し
た後、アビジン−ペルオキシダーゼ・コンジュゲートで
処理した。過酸化水素に暴露した際の呈色反応に基いて
陽性コロニーを同定した。
同定された陽性コロニーをとり、プレートあたり約５０
００プラークの濃度で再試験した。いくつかの陽性プラ
ークを取り、プレートあたり約４００゛プラークの濃度
で再スクリーニングした。
００プラークの濃度で再試験した。いくつかの陽性プラ
ークを取り、プレートあたり約４００゛プラークの濃度
で再スクリーニングした。
後のスクリーニングで単離したプラークを用い、大量の
精製ファージを単離した。
精製ファージを単離した。
ファージクローン中のｃＤＮＡＤＮＡ化合物ピングの第
一段階としてＥｃｏＲＩフラグメント（類）のサイズ決
定を行なった。ライブラリーの組み立てにあたってはｃ
ＤＮＡフラグメンＨ−合成Ｅｃ。
一段階としてＥｃｏＲＩフラグメント（類）のサイズ決
定を行なった。ライブラリーの組み立てにあたってはｃ
ＤＮＡフラグメンＨ−合成Ｅｃ。
ＲＩ リンカ−とライゲートさせ、λｇｔ１１分子の
単一のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。組換えファージＤＮ
Ａ分子をＥｃｏＲＩで消化すると２個のλ“アーム“（
１９，６及び２４．Ｉ Ｋｂ）が生成し得る。これに
よって生成されるその他のフラグメントは全て挿入され
たＤＮＡに対応する。挿入されたＤＮＡ配列が内在性の
Ｅｃ ｏＲＩ部位を有しない場合にはただ一個のＥｃｏ
ＲＩフラグメントのみが生じる。
単一のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。組換えファージＤＮ
Ａ分子をＥｃｏＲＩで消化すると２個のλ“アーム“（
１９，６及び２４．Ｉ Ｋｂ）が生成し得る。これに
よって生成されるその他のフラグメントは全て挿入され
たＤＮＡに対応する。挿入されたＤＮＡ配列が内在性の
Ｅｃ ｏＲＩ部位を有しない場合にはただ一個のＥｃｏ
ＲＩフラグメントのみが生じる。
これに対応し、１又はそれ以上の内在性ＥｃｏＲ１部位
があれば２またはそれ以上の付加的なＥｃ。
があれば２またはそれ以上の付加的なＥｃ。
ＲＩ フラグメントが生じるであろう。従って、精装フ
ァージＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化に付した後、３゜５％ポ
リアクリルアミドゲルまたは１．０％アガロースゲル電
気泳働にかけて分離した。最大クローンの１つ（１−１
と命名）は、１．８Ｋｂと０．８ Ｋ ｂの２つのＥｃ
ｏＲＩフラグメントを含有していた。
ァージＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化に付した後、３゜５％ポ
リアクリルアミドゲルまたは１．０％アガロースゲル電
気泳働にかけて分離した。最大クローンの１つ（１−１
と命名）は、１．８Ｋｂと０．８ Ｋ ｂの２つのＥｃ
ｏＲＩフラグメントを含有していた。
次いで、このクローンから単離したＥｃｏＲＩフラグメ
ントをプラスミドｐＢＲ３２２にサブクローンし、大腸
菌ＲＲＩ細胞の形質転換に用いた。
ントをプラスミドｐＢＲ３２２にサブクローンし、大腸
菌ＲＲＩ細胞の形質転換に用いた。
形質転換及びプラスミドの同定の後、ＤＮＡ配列決定に
備えて、このプラスミドＤＮＡを増幅し、精製した。ｐ
ＬＨ３−２１およびｐＬＨ５−２２と称するクローンか
らサブクローニングされたＤＮＡフラグメントをマキサ
ム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）
の方法〔メソツズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６１ ：４９７
）’］に従って配列決定した。
備えて、このプラスミドＤＮＡを増幅し、精製した。ｐ
ＬＨ３−２１およびｐＬＨ５−２２と称するクローンか
らサブクローニングされたＤＮＡフラグメントをマキサ
ム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）
の方法〔メソツズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６１ ：４９７
）’］に従って配列決定した。
Ｅｃ ｏＲＩ処理で生成した制限フラグメント内の特定
のＤＮＡ配列の位置決定はサザーン・トランスファー・
アナリシスによって行なわれた。ハイブリダイゼーショ
ンには下記の表１に示した、２個の独立した混合プロー
ブを用いた。これらのプローブはシスチック（ＳｙＳｔ
ｅＣ）１４５０Ａ ＤＮＡ合成装置（シンセサイザー）
〔シスチック（Ｓｙｓｔｅｃ）Ｉｎｃ、、３８１６チヤ
ンドラー・ドライブ（ＣｈａｎｄｌａｒＤｒｉｖｅ）、
ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏ １ ｉ ｓ ）
、 Ｍ Ｎ５５４２１）またはＡＢ５ ３８０Ａ
ＤＮＡ合成装置〔アプライド・バイオシステムス（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉ −ｏｓｙｓ ｔｅｍｓ ） 、 Ｉ
ｎｃ、 リンカーンセンター・ドライブ（Ｌｉｎｃｏ
ｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ）フォスターシティ（
Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ） ＣＡ ９４４０４）のいず
れかを用いて化学合成された。当業者には多くのＤＮＡ
合成装置が知られておりこれらをフラグメントの製造に
利用することができる。また、フラグメントはイタクラ
ら（Ｉｔａｋｕｒａ） Ｃサイエンス（Ｓｉｅｎｃｅ
）１９８コ１０５６］ 、およびフレアらＣ（Ｃｒｅａ
） １９７８ 。
のＤＮＡ配列の位置決定はサザーン・トランスファー・
アナリシスによって行なわれた。ハイブリダイゼーショ
ンには下記の表１に示した、２個の独立した混合プロー
ブを用いた。これらのプローブはシスチック（ＳｙＳｔ
ｅＣ）１４５０Ａ ＤＮＡ合成装置（シンセサイザー）
〔シスチック（Ｓｙｓｔｅｃ）Ｉｎｃ、、３８１６チヤ
ンドラー・ドライブ（ＣｈａｎｄｌａｒＤｒｉｖｅ）、
ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏ １ ｉ ｓ ）
、 Ｍ Ｎ５５４２１）またはＡＢ５ ３８０Ａ
ＤＮＡ合成装置〔アプライド・バイオシステムス（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉ −ｏｓｙｓ ｔｅｍｓ ） 、 Ｉ
ｎｃ、 リンカーンセンター・ドライブ（Ｌｉｎｃｏ
ｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ）フォスターシティ（
Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ） ＣＡ ９４４０４）のいず
れかを用いて化学合成された。当業者には多くのＤＮＡ
合成装置が知られておりこれらをフラグメントの製造に
利用することができる。また、フラグメントはイタクラ
ら（Ｉｔａｋｕｒａ） Ｃサイエンス（Ｓｉｅｎｃｅ
）１９８コ１０５６］ 、およびフレアらＣ（Ｃｒｅａ
） １９７８ 。
プロシーディンゲス・サブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・サブ・サイエンスイズ（Ｐｒｏｃ 、Ｎａ ｔ ｌ
。
−・サブ・サイエンスイズ（Ｐｒｏｃ 、Ｎａ ｔ ｌ
。
Ａｃａｄ、 Ａｃｉ、） ＵＳ Ａ ７５ ：５７６
５］ の方法に実質上従って常法通り調製することも
できる。
５］ の方法に実質上従って常法通り調製することも
できる。
表 １
プローブ８０：２３マー／１２８の組み合わせプローブ
８１：２０マー／６４の組み合わせプローブ８０はステ
ンフ０ （Ｊ −５ｔｅｎｆｌｏ）〔第１０回血栓症と
凝血に関する国際コンブレス（Ｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂ
−ｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍａｔｏｓｔａｓｉｓ）、
サンディエコ′（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ） 、カリフォル
ニア、１９８５年７月〕りよって示された、ウシ−アミ
ノ酸配列中の１つのＥＧＦ領域（アミノ酸残基８３−９
０）に対応する。プローブ８１もウシの配列に基づいて
おり。
８１：２０マー／６４の組み合わせプローブ８０はステ
ンフ０ （Ｊ −５ｔｅｎｆｌｏ）〔第１０回血栓症と
凝血に関する国際コンブレス（Ｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂ
−ｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍａｔｏｓｔａｓｉｓ）、
サンディエコ′（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ） 、カリフォル
ニア、１９８５年７月〕りよって示された、ウシ−アミ
ノ酸配列中の１つのＥＧＦ領域（アミノ酸残基８３−９
０）に対応する。プローブ８１もウシの配列に基づいて
おり。
カルボキシ末端アミノ酸残基６２８−６３４に対応する
。これら２つのプローブは〜１．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩサ
ブクローン・フラグメントと強くノ）イブリダイスした
。
。これら２つのプローブは〜１．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩサ
ブクローン・フラグメントと強くノ）イブリダイスした
。
配列決定のデータが得られると、プロティンＳの完全な
暗号配例（特に分子の５′末端）がχｇｔ１１ライブラ
リーから生成したクローン中に現われているわけではな
いことが明らかになった。そこで、足りない配例を得る
ために、第２のライブラリーを用いた。配例決定された
ＤＮＡに基づき、同定されたχｇｔｌｌクローンから下
記の表２に示した２つのプローブ（２１および２２と命
名）を導いた。
暗号配例（特に分子の５′末端）がχｇｔ１１ライブラ
リーから生成したクローン中に現われているわけではな
いことが明らかになった。そこで、足りない配例を得る
ために、第２のライブラリーを用いた。配例決定された
ＤＮＡに基づき、同定されたχｇｔｌｌクローンから下
記の表２に示した２つのプローブ（２１および２２と命
名）を導いた。
表２
プローブ２２
１ｎｆｌ
プローブ２１
ＨｉｎｃＩ Ｔ
ＧＴＣＡ７’ｋＣＴＡＡＴ ＧＣＴｒＡＴＣＣＴＧ Ａ
ＣＣＴＡＡＧＡＡＧ ＣＴＧＴＧＴＣＡＡＴＧＣＣＡＴ
ｒＣＣＡＧ ＡＣＣＡＧＴＧＴＡＧ ＴＣＣＴＣＴＧＣ
ＣＡ ＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧプローブ２２は分子の３′
非翻訳領域に相当しｃＤＮＡの３′悟域を位置付けする
のに用いられた。
ＣＣＴＡＡＧＡＡＧ ＣＴＧＴＧＴＣＡＡＴＧＣＣＡＴ
ｒＣＣＡＧ ＡＣＣＡＧＴＧＴＡＧ ＴＣＣＴＣＴＧＣ
ＣＡ ＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧプローブ２２は分子の３′
非翻訳領域に相当しｃＤＮＡの３′悟域を位置付けする
のに用いられた。
対照的に、プローブ２１は、分子の５′末端領域に相当
し、分子の５′暗号領域を位置付けするのに用いられた
。これらのプローブを放射活性に標識し、ｃＤＮＡライ
ブラリーのプローブに用いた。ハイブリダイゼーション
した後、制限酵素マツピング、サザーン・ハイブリダイ
ゼーション及びＤＮＡ配例決定法を用い、いくつかの陽
性クローンを同定した、１つのクローン（ｐＨＨ３Ｉ］
’ａと命名）は５°及び３′非暗号セグメント並びに完
全なプロティンＳ前駆体に対応する配例を含有していた
。
し、分子の５′暗号領域を位置付けするのに用いられた
。これらのプローブを放射活性に標識し、ｃＤＮＡライ
ブラリーのプローブに用いた。ハイブリダイゼーション
した後、制限酵素マツピング、サザーン・ハイブリダイ
ゼーション及びＤＮＡ配例決定法を用い、いくつかの陽
性クローンを同定した、１つのクローン（ｐＨＨ３Ｉ］
’ａと命名）は５°及び３′非暗号セグメント並びに完
全なプロティンＳ前駆体に対応する配例を含有していた
。
プラスミドｐＨＨＳ−Ｋａは、ステンフロ（Ｓｔｅｎｆ
ｌｏ）（１９８５） によって報告されたサイズ（〜
２．５ Ｋ ｂ ） よりも著しく大きいメツセンジ
ャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）に対応するｃ Ｄ Ｎ Ａ
（〜３．３Ｋｂ）を含有していた。ウシおよびヒト両者
の肝ｍＲＮＡをヒトｃＤＮＡプローブでノーザン分析す
るとＣＤＮＡのサイズに一致してＲＮＡ種が変化するこ
とが分かった。
ｌｏ）（１９８５） によって報告されたサイズ（〜
２．５ Ｋ ｂ ） よりも著しく大きいメツセンジ
ャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）に対応するｃ Ｄ Ｎ Ａ
（〜３．３Ｋｂ）を含有していた。ウシおよびヒト両者
の肝ｍＲＮＡをヒトｃＤＮＡプローブでノーザン分析す
るとＣＤＮＡのサイズに一致してＲＮＡ種が変化するこ
とが分かった。
プラスミド ｐＨＨ３−ＩＩａはノーヂン・り一ジョナ
ル・リサーチラボラトリ−（ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
（ＮＲＲＬ）ペオリア、イリノイス（Ｐｅｏｒｉａ、
ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）に寄託され、そのパーマネント・ス
トック・カルチャー・コレクションの一部を構成してい
る菌株、大腸菌Ｋｌ ２ＲＲ１／ｐ ＨＨ３ＩＩ ａか
ら常法通り単離される。大腸菌Ｋｌ ２ＲＲ１／ｐ Ｈ
ＨＳ ＩＩ ａ の培養物はＮＲＲＬから寄託番号Ｂ
−１８０７１の下、入手可能である。プラスミドｐＨＨ
３−ＬＩａ の制限サイト及び機能地図を添付の第２
図に示す。
ル・リサーチラボラトリ−（ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
（ＮＲＲＬ）ペオリア、イリノイス（Ｐｅｏｒｉａ、
ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）に寄託され、そのパーマネント・ス
トック・カルチャー・コレクションの一部を構成してい
る菌株、大腸菌Ｋｌ ２ＲＲ１／ｐ ＨＨ３ＩＩ ａか
ら常法通り単離される。大腸菌Ｋｌ ２ＲＲ１／ｐ Ｈ
ＨＳ ＩＩ ａ の培養物はＮＲＲＬから寄託番号Ｂ
−１８０７１の下、入手可能である。プラスミドｐＨＨ
３−ＬＩａ の制限サイト及び機能地図を添付の第２
図に示す。
別法として、本発明の特定のＤＮＡ配列は前記の様なり
ＮＡ合成装置を用いて化学的に合成することもできる。
ＮＡ合成装置を用いて化学的に合成することもできる。
プロティンＳ遺伝子のサイズはやや大きいが、今日では
これらの“遺伝子機械（ｇｅｎｅ ｍａｃｈｉｎｅｓ）
’を用いて１０００デオキシヌクレオチド以上を含有す
る２本鎖ＤＮＡ）グメントが極めて容易に生成される〔
カルサーズら（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、 Ｍ、 Ｈ，）
１９８５ サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３０
： ２８１参照〕。
これらの“遺伝子機械（ｇｅｎｅ ｍａｃｈｉｎｅｓ）
’を用いて１０００デオキシヌクレオチド以上を含有す
る２本鎖ＤＮＡ）グメントが極めて容易に生成される〔
カルサーズら（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、 Ｍ、 Ｈ，）
１９８５ サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３０
： ２８１参照〕。
プロティンＳ活性をコードしているＤＮＡを含有する様
々な組換えＤＮＡ発現ベクターを組み立てることができ
る。補元類細胞の多くが、ヒトプロティンＳのアミノ末
端に存在するリーダーペプチドの認識と、適切なプロセ
ッシングに必要な細胞機構を備えている。また、ある哺
乳類宿主は、血景中に存在するヒトプロティンＳにみら
れる様な、グリコジル化、γ−カルボキシル化およびβ
−ヒドロキシル化等の翻訳後の修飾をも与える。
々な組換えＤＮＡ発現ベクターを組み立てることができ
る。補元類細胞の多くが、ヒトプロティンＳのアミノ末
端に存在するリーダーペプチドの認識と、適切なプロセ
ッシングに必要な細胞機構を備えている。また、ある哺
乳類宿主は、血景中に存在するヒトプロティンＳにみら
れる様な、グリコジル化、γ−カルボキシル化およびβ
−ヒドロキシル化等の翻訳後の修飾をも与える。
真核性宿主細胞の形質転換のための広範囲に及ぶベクタ
ーが存在しており、以下に例示する特殊なベクターは、
本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
ーが存在しており、以下に例示する特殊なベクターは、
本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
真核性発現ベクターの組立て出発物質として、本発明の
２つの実施態様では、ｐＳＶ２型のベクターを用いる。
２つの実施態様では、ｐＳＶ２型のベクターを用いる。
ｐＳＶ２型ベクターは明らかにされた、真核性の転写ユ
ニット・プロモーター（ｅｐ）、介在配列（ｒｖＳ）お
よびポリアデニル化（ｐＡ）部位を含有するＳＶ４０ゲ
ノムのセグメントヲ包含している。ＳＶ４０ Ｔ−抗
原が存在しないと、プラスミドｐＳＶ２型ベクターは、
宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みによって哺乳類およ
び他の真核性宿主細胞を形質転換する。当業者には種々
のプラスミドｐ ＳＶ２型ベクターが知られており〔真
核性のウィルス性ベクター（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｕ
ｉｒａｌＶｅｃｔａｒｓ）グルラマン（Ｇ １ ｕｚｍ
ａ ｎ ）編、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラｌ−ＩＪイズ発行、コールドスプリングハーバ−、ニ
ューヨーク、１９８２参照〕、例えば、プラスミドｐＳ
Ｖ２−ｇｐｔ ％ｐＳＶ２− ｎｅｏ 、 ｐＳＶ２
− ｄｈｆｒおよびｐｓｖｓ−β−グロビンがあり、こ
れらベクターでは、ＳＶ４０プロモーターが挿入された
遺伝子の転写を司る。これらのベクターは、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
Ａ Ｔ ＣＣ）ロックビレ、メアリーランド、あるいは
前記のＮＲＲＬから入手可能である。
ニット・プロモーター（ｅｐ）、介在配列（ｒｖＳ）お
よびポリアデニル化（ｐＡ）部位を含有するＳＶ４０ゲ
ノムのセグメントヲ包含している。ＳＶ４０ Ｔ−抗
原が存在しないと、プラスミドｐＳＶ２型ベクターは、
宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みによって哺乳類およ
び他の真核性宿主細胞を形質転換する。当業者には種々
のプラスミドｐ ＳＶ２型ベクターが知られており〔真
核性のウィルス性ベクター（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｕ
ｉｒａｌＶｅｃｔａｒｓ）グルラマン（Ｇ １ ｕｚｍ
ａ ｎ ）編、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラｌ−ＩＪイズ発行、コールドスプリングハーバ−、ニ
ューヨーク、１９８２参照〕、例えば、プラスミドｐＳ
Ｖ２−ｇｐｔ ％ｐＳＶ２− ｎｅｏ 、 ｐＳＶ２
− ｄｈｆｒおよびｐｓｖｓ−β−グロビンがあり、こ
れらベクターでは、ＳＶ４０プロモーターが挿入された
遺伝子の転写を司る。これらのベクターは、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
Ａ Ｔ ＣＣ）ロックビレ、メアリーランド、あるいは
前記のＮＲＲＬから入手可能である。
ヒトプロティンＳのアミ／末端における−４１〜−１８
アミノ酸残基は、肝臓から血流へのプロティンＳの分泌
を指令するシグナルペプチドとして作用すると思われる
。これらの残基は成熟プロティンＳ中には存在しない。
アミノ酸残基は、肝臓から血流へのプロティンＳの分泌
を指令するシグナルペプチドとして作用すると思われる
。これらの残基は成熟プロティンＳ中には存在しない。
ヒトプロティンＳ前駆体の残基−１７−−１は、ヒトプ
ロティンＳのプロペプチドを構成しているらしく、これ
もタンパク貢のプロセッシングおよび賦活化の間に除去
されるものであり、分子の正確な折りたたみおよび修飾
に係っていると考えられている。本明細書には特に詳し
く例示していないが、本発明には「プロプロチインＳ」
の如きプロティンＳ誘導体も含まれる。本発明のＤＮＡ
化合物は、ヒトプロティンＳ前駆体のアミノ残基および
−４１〜−１８残基をコードしている部分を欠失させて
生成する誘導体を発現させるよう、容易に修飾され得る
。
ロティンＳのプロペプチドを構成しているらしく、これ
もタンパク貢のプロセッシングおよび賦活化の間に除去
されるものであり、分子の正確な折りたたみおよび修飾
に係っていると考えられている。本明細書には特に詳し
く例示していないが、本発明には「プロプロチインＳ」
の如きプロティンＳ誘導体も含まれる。本発明のＤＮＡ
化合物は、ヒトプロティンＳ前駆体のアミノ残基および
−４１〜−１８残基をコードしている部分を欠失させて
生成する誘導体を発現させるよう、容易に修飾され得る
。
当該技術者ならば、本発明が、真核宿主内での特定のプ
ロティンＳの発現に限定されないことを認めるであろう
。一般的な規則として、原核生物は真核性のシグナルペ
プチドを有効にプロセッシングすることができないので
、ヒトプロティンＳ前駆体遺伝子のシグナルペプチドを
コードしている部分の原核生物内での発現は幾分、非効
率的になるかもしれない。本明細書中には詳しく例示さ
れていないが、本発明はまた、プロティンＳ活性を原核
生物内で発現、分泌させるための、原核性シグナルペプ
チドをコードしているＤＮＡと本発明の、プロティンＳ
活性をコードしているＤＮＡとの融合物をも含むもので
ある。
ロティンＳの発現に限定されないことを認めるであろう
。一般的な規則として、原核生物は真核性のシグナルペ
プチドを有効にプロセッシングすることができないので
、ヒトプロティンＳ前駆体遺伝子のシグナルペプチドを
コードしている部分の原核生物内での発現は幾分、非効
率的になるかもしれない。本明細書中には詳しく例示さ
れていないが、本発明はまた、プロティンＳ活性を原核
生物内で発現、分泌させるための、原核性シグナルペプ
チドをコードしているＤＮＡと本発明の、プロティンＳ
活性をコードしているＤＮＡとの融合物をも含むもので
ある。
本発明の発現ベクターを調製する上で有用な出発物質に
は、真核性宿主細胞内での組換え遺伝子の転写を増大す
るために、大きいＤＮＡウィルスの即初期遺伝子（ｉｍ
ｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ）産物の存在下
でＢＫクイルスエンハンサー（Ｅｎｈ）を利用する発現
ベクター・が含まれる。即ち、その様なベクターは本発
明のプロティンＳをコードしている遺伝子を発現させる
のに有用である。これらのベクターの組立ては、実施例
８〜１７に詳しく示されている。それらの組立てを、以
下に簡単に概説する。
は、真核性宿主細胞内での組換え遺伝子の転写を増大す
るために、大きいＤＮＡウィルスの即初期遺伝子（ｉｍ
ｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ）産物の存在下
でＢＫクイルスエンハンサー（Ｅｎｈ）を利用する発現
ベクター・が含まれる。即ち、その様なベクターは本発
明のプロティンＳをコードしている遺伝子を発現させる
のに有用である。これらのベクターの組立ては、実施例
８〜１７に詳しく示されている。それらの組立てを、以
下に簡単に概説する。
ＢＫウィルス（ＡＴＣＣＶＲ−８３７）は購入するか、
あるし・は、実施例８の記載の如くにして容易に大量を
単離することができる。別法として、ＢＫクイルスＤＮ
Ａをプラスミド・クローニングベクターにクローンし、
この組換えベクターｉＢＫウィルスＤＮＡ配列の供給源
として用いてもよい。結果的に、ＢＫワイルスＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲ，Ｉで消化し、ＢＫゲノムにはＥｃｏ
ＲＩ部位が誰１個しか存在しないことに基づいて線状Ｂ
Ｋ ＤＮＡを形成した。プラスミドｐ ＬＩ Ｃ８［−
＜セスタ電リサーチ・ラボラトリイズ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、Ｂ
ＲＬ ）、Ｐ、○、Ｂｏｘ６００９、ガイザースバー
グ、ＭＤ２０８７７から人手可能〕を同様に制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩて消化し、得られたＥＣ０Ｒ１切断プラスミド
ｐＴＪｃ８ ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ切断ＢＫワイルス
ＤＮＡにライゲートさせ、ＢＫウィルスＤＮＡの方向性
に関してのみ異るプラスミド、ｐＢＫＥ’ｌおよびｐＢ
ＫＥ２を形成させた。プラスミドｐＢＫＥ１の制限サイ
トおよび機能地図を添付の第３図に示す。プラスミドｐ
ＢＫＥ１およびｐＢＫＥ２の、ｍ立ては実施例９に記載
されている。
あるし・は、実施例８の記載の如くにして容易に大量を
単離することができる。別法として、ＢＫクイルスＤＮ
Ａをプラスミド・クローニングベクターにクローンし、
この組換えベクターｉＢＫウィルスＤＮＡ配列の供給源
として用いてもよい。結果的に、ＢＫワイルスＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲ，Ｉで消化し、ＢＫゲノムにはＥｃｏ
ＲＩ部位が誰１個しか存在しないことに基づいて線状Ｂ
Ｋ ＤＮＡを形成した。プラスミドｐ ＬＩ Ｃ８［−
＜セスタ電リサーチ・ラボラトリイズ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、Ｂ
ＲＬ ）、Ｐ、○、Ｂｏｘ６００９、ガイザースバー
グ、ＭＤ２０８７７から人手可能〕を同様に制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩて消化し、得られたＥＣ０Ｒ１切断プラスミド
ｐＴＪｃ８ ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ切断ＢＫワイルス
ＤＮＡにライゲートさせ、ＢＫウィルスＤＮＡの方向性
に関してのみ異るプラスミド、ｐＢＫＥ’ｌおよびｐＢ
ＫＥ２を形成させた。プラスミドｐＢＫＥ１の制限サイ
トおよび機能地図を添付の第３図に示す。プラスミドｐ
ＢＫＥ１およびｐＢＫＥ２の、ｍ立ては実施例９に記載
されている。
また、ＢＫウィルス性ゲノムとプラスミドｐｄＢ Ｐ
Ｖ −ＭＭ Ｔｎｅｏの一部とを組合わせてプラスミド
ｐＢＫｎｅｏ１およびｐＢＫｎｅｏ２を組立てる。
Ｖ −ＭＭ Ｔｎｅｏの一部とを組合わせてプラスミド
ｐＢＫｎｅｏ１およびｐＢＫｎｅｏ２を組立てる。
プラスミドｐｄ Ｂ Ｐ Ｖ −ＭＭＴｎｅ ｏ は
サイズ約１５Ｋｂであり、寄託番号ＡＴＣＣ３７２２４
の下、ＡＴＣＣから入手可能である。このものは、プラ
スミドｐＢＲ３２２由来のレプリコンとβ−ラクタマー
ゼ遺伝子、ネオマイシン耐性付与に係る酵素を」−ドし
ている構造遺伝子を発現させる位置にマウスメタロチオ
ナインプロモーター（ｌｖｉＭＴｐｒｏ）、並びに約８
Ｋｂのウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）ＤＮＡとを含有し
ている。プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏを制限酵
素ＢａｍＨｒで消化すると、上記のＢＰＶ ＤＮＡを
含有する〜８Ｋｂフラグメントと、他の配列を含有する
〜７ Ｋｂフラグメンの２フラグメントが生成される。
サイズ約１５Ｋｂであり、寄託番号ＡＴＣＣ３７２２４
の下、ＡＴＣＣから入手可能である。このものは、プラ
スミドｐＢＲ３２２由来のレプリコンとβ−ラクタマー
ゼ遺伝子、ネオマイシン耐性付与に係る酵素を」−ドし
ている構造遺伝子を発現させる位置にマウスメタロチオ
ナインプロモーター（ｌｖｉＭＴｐｒｏ）、並びに約８
Ｋｂのウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）ＤＮＡとを含有し
ている。プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏを制限酵
素ＢａｍＨｒで消化すると、上記のＢＰＶ ＤＮＡを
含有する〜８Ｋｂフラグメントと、他の配列を含有する
〜７ Ｋｂフラグメンの２フラグメントが生成される。
ＢＫウィルスは唯１個しかＢａｍＨＩ沈を有さす、Ｂａ
ｍＨＩで線状化したＢ ＫウィルスＤＮＡに、プラスミ
ドｐ ｄ Ｂ Ｐ Ｖ−ＭＭＴ ｎｅｏ の〜７Ｋｂ
ＢａｍＨＩ制限フラグメントをライゲートすることによ
りプラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２を組
立てた。ＢＫウィルスＤＮＡの方向性に関してのみ異る
プラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２の組立
てを実施例１０に、また、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの
制限サイトおよび機能地図を添付の第４図に示す。
ｍＨＩで線状化したＢ ＫウィルスＤＮＡに、プラスミ
ドｐ ｄ Ｂ Ｐ Ｖ−ＭＭＴ ｎｅｏ の〜７Ｋｂ
ＢａｍＨＩ制限フラグメントをライゲートすることによ
りプラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２を組
立てた。ＢＫウィルスＤＮＡの方向性に関してのみ異る
プラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２の組立
てを実施例１０に、また、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの
制限サイトおよび機能地図を添付の第４図に示す。
本発明の発現ベクターの組立て出発物質として有用な別
のベクターはプラスミドｐＢＬｃａｔと呼称される。こ
のプラスミドはタンデム（直列）に並んだＢＫエンハン
サ−配列と、クロラムフェニコール・アセチルトランス
フエラーセ酵ｉ （ＣＡＴ）を発現させるよう位置して
いるヒトアデノウィルス２型の後期プロモーター（Ａｄ
２ＬＰ）とを含有している。プラスミドｐＳＶ２ｃａｔ
はＣＡＴ遺伝子の簡便な供給源であり、寄託番号ＡＴＣ
Ｃ３７１５５の下、ＡＴＣＣから入手可能である。
のベクターはプラスミドｐＢＬｃａｔと呼称される。こ
のプラスミドはタンデム（直列）に並んだＢＫエンハン
サ−配列と、クロラムフェニコール・アセチルトランス
フエラーセ酵ｉ （ＣＡＴ）を発現させるよう位置して
いるヒトアデノウィルス２型の後期プロモーター（Ａｄ
２ＬＰ）とを含有している。プラスミドｐＳＶ２ｃａｔ
はＣＡＴ遺伝子の簡便な供給源であり、寄託番号ＡＴＣ
Ｃ３７１５５の下、ＡＴＣＣから入手可能である。
プラスミドｐＳＶ２ｃａｔの制限サイトおよび機能地図
を・添付の第５図に示す。ヒトアデノウィルス２型のＤ
ＮＡは市販されており、また、寄託番号ＡＴＣＣＶＲ−
２の下、ＡＴＣＣから得ることもできる。
を・添付の第５図に示す。ヒトアデノウィルス２型のＤ
ＮＡは市販されており、また、寄託番号ＡＴＣＣＶＲ−
２の下、ＡＴＣＣから得ることもできる。
簡単に述べると、プラスミドｐＢＬｃａｔは、ヒトアデ
ノウィルス２型ＤＮＡの一〇、３２Ｋｂ後期フロモータ
ー含有ＡｃｃＩ −Ｐｖｕ ＩＩ制限フラグメントを、
このＡｃｃｌ−Ｐｖｕ ＩＩ制限フラグメントのＰｖｕ
ＩＩ末端のみと結合する、平滑末端化Ｂｃｌ■リンカ−
にライゲートさせることにより組立てられた。次いで、
得られたフラグメントをプラスミドｐＳＶ２ｃａｔの−
４，５１Ｋ ｂＡｃｃ Ｉ −３ｔｕ Ｉ制限フラグメ
ントとライゲートさせて中間体プラスミドｐＬＰｃａｔ
を得た。このプラスミドの制限サイトおよび機能地図
を添付の第６図に示す。所望のプラスミドｐＢＬｃａｔ
は、複製起源とエンハンサ−を含有しているＢＫウ
ィルスＤＮＡの〜１゜２８Ｋｂ ＡｃｃＩ −Ｐｖｕｌ
ｌ 制限フラグメントを、プラスミドｐＬＰＣａｔの−
４，８１Ｋｂ ＡｃｃＩ −３ｔｕＩ制限フラグメント
にライゲートさせることにより、プラスミドｐＬＰｅａ
ｔ から組立てられた。
ノウィルス２型ＤＮＡの一〇、３２Ｋｂ後期フロモータ
ー含有ＡｃｃＩ −Ｐｖｕ ＩＩ制限フラグメントを、
このＡｃｃｌ−Ｐｖｕ ＩＩ制限フラグメントのＰｖｕ
ＩＩ末端のみと結合する、平滑末端化Ｂｃｌ■リンカ−
にライゲートさせることにより組立てられた。次いで、
得られたフラグメントをプラスミドｐＳＶ２ｃａｔの−
４，５１Ｋ ｂＡｃｃ Ｉ −３ｔｕ Ｉ制限フラグメ
ントとライゲートさせて中間体プラスミドｐＬＰｃａｔ
を得た。このプラスミドの制限サイトおよび機能地図
を添付の第６図に示す。所望のプラスミドｐＢＬｃａｔ
は、複製起源とエンハンサ−を含有しているＢＫウ
ィルスＤＮＡの〜１゜２８Ｋｂ ＡｃｃＩ −Ｐｖｕｌ
ｌ 制限フラグメントを、プラスミドｐＬＰＣａｔの−
４，８１Ｋｂ ＡｃｃＩ −３ｔｕＩ制限フラグメント
にライゲートさせることにより、プラスミドｐＬＰｅａ
ｔ から組立てられた。
得られたプラスミドｐＢＬｃａｔ の制限サイトおよび
機能地図を添付の第７図に示す。プラスミドｐＢＬｅａ
ｔ の組立ては、実施例１１に詳しく記載されている。
機能地図を添付の第７図に示す。プラスミドｐＢＬｅａ
ｔ の組立ては、実施例１１に詳しく記載されている。
プラスミドｐＢＬｃａｔ は、ＢＫエンハンサ−アデノ
ウィルス後期プロモーター「カセット」、即ち、−８７
０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントであって、真
核性発現ベクターにコードされている物質の発現を増加
させるために該ベクターに簡便に挿入することができる
ものの便利な供給源である。
ウィルス後期プロモーター「カセット」、即ち、−８７
０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントであって、真
核性発現ベクターにコードされている物質の発現を増加
させるために該ベクターに簡便に挿入することができる
ものの便利な供給源である。
例えば、このＢ Ｋエンハンサー−アデノウィルス後期
プロモーターカセットをプラスミドｐＬ１３３にライゲ
ートすることにより、該カセットを用いてヒトプロティ
ンＣの発現を改良することができる。プラスミドｐＬ１
３３の制限部位および機能地図を添付の第８図に示す。
プロモーターカセットをプラスミドｐＬ１３３にライゲ
ートすることにより、該カセットを用いてヒトプロティ
ンＣの発現を改良することができる。プラスミドｐＬ１
３３の制限部位および機能地図を添付の第８図に示す。
プラスミドｐＬ１３３は、プロティンＳを発現させるた
めの発現ベクターとしても好都合に用いられる。このプ
ラスミドを制限酵素Ｂｃｇ Ｉ で消化（プロティン
Ｃを含有するフラグメントを欠失させるため）し、フレ
ノウ処理することにより線状の、平滑末端フラグメント
ラ得ることができる。
めの発現ベクターとしても好都合に用いられる。このプ
ラスミドを制限酵素Ｂｃｇ Ｉ で消化（プロティン
Ｃを含有するフラグメントを欠失させるため）し、フレ
ノウ処理することにより線状の、平滑末端フラグメント
ラ得ることができる。
次いで、〜２．７Ｋｂ ＦｎｕＤ ＩＩ−ＥｃｏＲＶ制
限フラグメントに含まれている全プロティンＳ遺伝子を
フレノウ処理したＢｃ／ Ｉ ベクターフラグメントと
ライゲートさせると、プロティンＳ発現ベクターが得ら
れる。実施例１２にその組立てを示したプラスミドｐＬ
１３３は、さらに別の発現ベクターの組立てのための中
間体プラスミドとしても用いられる。即ち、このプラス
ミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、プラスミ
ドｐＢＬｃａｔ の〜０．８７ Ｋｂ ＨｉｎｄｌＩＬ
制限フラグメントにライゲートさせることによりプラ
スミドｐｔ、ｐｃを得た。プラスミドｐ ＬＰＣの制限
サイトおよび機能地図を添付の第９図に示し、このプラ
スミドｐＬＰＣの組立てを実施例１３に示す。
限フラグメントに含まれている全プロティンＳ遺伝子を
フレノウ処理したＢｃ／ Ｉ ベクターフラグメントと
ライゲートさせると、プロティンＳ発現ベクターが得ら
れる。実施例１２にその組立てを示したプラスミドｐＬ
１３３は、さらに別の発現ベクターの組立てのための中
間体プラスミドとしても用いられる。即ち、このプラス
ミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、プラスミ
ドｐＢＬｃａｔ の〜０．８７ Ｋｂ ＨｉｎｄｌＩＬ
制限フラグメントにライゲートさせることによりプラ
スミドｐｔ、ｐｃを得た。プラスミドｐ ＬＰＣの制限
サイトおよび機能地図を添付の第９図に示し、このプラ
スミドｐＬＰＣの組立てを実施例１３に示す。
プラスミドｐＬＰＣは、プラスミドｐＬ１３３と同様、
エンハンサ−１初期および後期プロモーター、Ｔ−抗原
結合部位、および５Ｖ４０の複製起源を含有している。
エンハンサ−１初期および後期プロモーター、Ｔ−抗原
結合部位、および５Ｖ４０の複製起源を含有している。
これらの要素（エレメント）はＳＶ４０ ＤＮＡ上に接
近して一緒に存在しており、その輪郭を示すことは困難
である。ＳＶ４０の複製に必要な、Ｔ抗原のＴ抗原結合
部位への結合によりＳＶ４０後期プロモーターからの転
写が促進されることが知られているが、驚ろくべきこと
に、これは、ＢＫの初期および後期プロモーターに対し
ても同様の効果を有していた。ＳＶ４０複裂起源を含有
しているプラスミドにおいて、Ｔ抗原誘導性の複製が高
レベルで起きることは一般に宿主細胞にとって致死的で
あるので、５Ｖ４０Ｔ抗原の存在下では、プラスミドｐ
ＬＰＣ，プラスミドｐＩ、１３３の両者はエピソーマル
（染色体外性）要素として安定に維持されない。むしろ
、これら２プラスミドが安定に維持されるためには、こ
れらが宿主細胞の染色体ＤＮＡに組込まれなければなら
ない。
近して一緒に存在しており、その輪郭を示すことは困難
である。ＳＶ４０の複製に必要な、Ｔ抗原のＴ抗原結合
部位への結合によりＳＶ４０後期プロモーターからの転
写が促進されることが知られているが、驚ろくべきこと
に、これは、ＢＫの初期および後期プロモーターに対し
ても同様の効果を有していた。ＳＶ４０複裂起源を含有
しているプラスミドにおいて、Ｔ抗原誘導性の複製が高
レベルで起きることは一般に宿主細胞にとって致死的で
あるので、５Ｖ４０Ｔ抗原の存在下では、プラスミドｐ
ＬＰＣ，プラスミドｐＩ、１３３の両者はエピソーマル
（染色体外性）要素として安定に維持されない。むしろ
、これら２プラスミドが安定に維持されるためには、こ
れらが宿主細胞の染色体ＤＮＡに組込まれなければなら
ない。
形質転換された真核細胞内で安定に維持される要素とし
て存在し得る、プラスミドｐＬＰＣの誘導体を組立てる
ために、全ＢＫゲノムを、ＥｃｏＲＩで線状化された制
限フラグメントとしてプラスミドｐＬＰＣの単１のＥｃ
ｏＲＩ部位に挿入した。この挿入によって、ＢＫのＥｃ
ｏＲＩフラグメントの方向性に関してのみ異る２つのプ
ラスミド、ｐＬＰＣ４およびｐＬＰＣ５が生産された。
て存在し得る、プラスミドｐＬＰＣの誘導体を組立てる
ために、全ＢＫゲノムを、ＥｃｏＲＩで線状化された制
限フラグメントとしてプラスミドｐＬＰＣの単１のＥｃ
ｏＲＩ部位に挿入した。この挿入によって、ＢＫのＥｃ
ｏＲＩフラグメントの方向性に関してのみ異る２つのプ
ラスミド、ｐＬＰＣ４およびｐＬＰＣ５が生産された。
プラスミドｐＬＰＣ４の制限サイトおよび機能地図を添
付の第１０図に、また、プラスミドｐＬＰＣ４およびｐ
ＬＰＣ５の組立てを実施例１４に示す。
付の第１０図に、また、プラスミドｐＬＰＣ４およびｐ
ＬＰＣ５の組立てを実施例１４に示す。
組換えＤＮＡ発現ベクターの染色体外での維持が宿主細
胞の染色体への組込みよりも常に好ましいとは限らない
。しかしながら、プラスミドｐＬＰＣには真核細胞内で
機能的な選択マーカーが存在しないので、選択マーカー
を含有している他のプラスミドと同時形質転換しなけれ
ば、プラスミドｐＬＰＣの安定な真核性形質転換体を同
定することは困難である。そこで、プラスミドｐＬＰＣ
を修飾し、真核性宿主細胞内で選択可能なプラスミド誘
導体を生産した。
胞の染色体への組込みよりも常に好ましいとは限らない
。しかしながら、プラスミドｐＬＰＣには真核細胞内で
機能的な選択マーカーが存在しないので、選択マーカー
を含有している他のプラスミドと同時形質転換しなけれ
ば、プラスミドｐＬＰＣの安定な真核性形質転換体を同
定することは困難である。そこで、プラスミドｐＬＰＣ
を修飾し、真核性宿主細胞内で選択可能なプラスミド誘
導体を生産した。
このことは、プラスミドｐＬＰＣを、ハイグロマイシン
耐性付与遺伝子を含有しているプラスミドである。プラ
スミドｐｓｖ２ｈｙｇの一部とライゲートさせることで
行われた。プラスミドｐＳＮＲＲから入手可能であり、
その制限サイトおよび機能地図を添付の第１１図に示す
。プラスミドｐｓｖ２ｈｙｇを制限酵素ＢａｍＨＩで消
化し、全ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有してい
る〜２゜５ ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントを単離し
、フレノウ酵素（大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩをサブ
チリシン開裂に付した際に生成される大きいフラグメン
ト）で処理した後、フレノウ処理した、プラスミドｐ
Ｌ Ｐ Ｃｏ、、ｓ、ｓ ２ Ｋｂ ＮｄｅＩ −５ｔ
ｕＩ制限フラグメントにライゲートさせてプラスミドｐ
ＬＰＣｈｙｇｌおよびｐＬＰｃｈｙｇ２を得た。プラス
ミドｐＬＰＣｈｙｇｌとｐｒ、ｐｃ ｈｙｇ２ とはハ
イグロマイシン耐性付与フラグメントの方向ヰに関して
のみ異っている。プラスミドｐＬＰＣｈｙｇｉ の制
限サイトおよび機能地図を添付の第１２図に示し、プラ
スミドｐＬＰｃｈｙｇｌおよびｐＬＰＣｈｙｇ７’ ５
７． ミドｐＬＰＣｈＹｇ’を修飾し、ジヒドロ葉酸還
元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を導入した。ｄｈｆｒ遺伝子
はｄｈｆｒ陰性細胞中で選択可能なマーカーであり、こ
れを用いると宿主細胞を濃度を次第に増加させたメトト
レキセートに暴露することによりＤＮＡセグメントのコ
ピー数を増加させることができる。ｄｈｆｒ遺伝子はプ
ラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ （ＡＴＣＣ３７１４６
）から得られた。特定のｄｈｆｒ遺伝子を用いることは
、本発明のベクターの組立てにとって重要なことではな
い。
耐性付与遺伝子を含有しているプラスミドである。プラ
スミドｐｓｖ２ｈｙｇの一部とライゲートさせることで
行われた。プラスミドｐＳＮＲＲから入手可能であり、
その制限サイトおよび機能地図を添付の第１１図に示す
。プラスミドｐｓｖ２ｈｙｇを制限酵素ＢａｍＨＩで消
化し、全ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有してい
る〜２゜５ ＫｂＢａｍＨＩ制限フラグメントを単離し
、フレノウ酵素（大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩをサブ
チリシン開裂に付した際に生成される大きいフラグメン
ト）で処理した後、フレノウ処理した、プラスミドｐ
Ｌ Ｐ Ｃｏ、、ｓ、ｓ ２ Ｋｂ ＮｄｅＩ −５ｔ
ｕＩ制限フラグメントにライゲートさせてプラスミドｐ
ＬＰＣｈｙｇｌおよびｐＬＰｃｈｙｇ２を得た。プラス
ミドｐＬＰＣｈｙｇｌとｐｒ、ｐｃ ｈｙｇ２ とはハ
イグロマイシン耐性付与フラグメントの方向ヰに関して
のみ異っている。プラスミドｐＬＰＣｈｙｇｉ の制
限サイトおよび機能地図を添付の第１２図に示し、プラ
スミドｐＬＰｃｈｙｇｌおよびｐＬＰＣｈｙｇ７’ ５
７． ミドｐＬＰＣｈＹｇ’を修飾し、ジヒドロ葉酸還
元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を導入した。ｄｈｆｒ遺伝子
はｄｈｆｒ陰性細胞中で選択可能なマーカーであり、こ
れを用いると宿主細胞を濃度を次第に増加させたメトト
レキセートに暴露することによりＤＮＡセグメントのコ
ピー数を増加させることができる。ｄｈｆｒ遺伝子はプ
ラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ （ＡＴＣＣ３７１４６
）から得られた。特定のｄｈｆｒ遺伝子を用いることは
、本発明のベクターの組立てにとって重要なことではな
い。
単離した後、ｄｈｆｒ遺伝子を含んだ〜１．９ＫｂＢａ
ｍＨＩ制限フラグメントをフレノウ酵素で処理し、ＥＣ
ｏＲＩ部分消化プラスミドｐＬＰＣｈｙｇｌに挿入し、
プラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２を得た
。プラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌは２つのＥｃ。
ｍＨＩ制限フラグメントをフレノウ酵素で処理し、ＥＣ
ｏＲＩ部分消化プラスミドｐＬＰＣｈｙｇｌに挿入し、
プラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２を得た
。プラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌは２つのＥｃ。
ＲＩ制限酵素認識部位、１つはハ・ｆゾロマイシン１１
ｉｉｔイ付与遺伝子の中にあり、もう１つはプラスミド
ｐＢＲ３２２から導かれた配列の中にある、を含有シテ
いる。ｄｈｆｒ遺伝子を含んだフラグメン配列中に存在
するＥｃｏＲＩ部位に挿入してプラスミドｐＬＰｃｈｄ
ｌとｐＬＰＣｈｄ２ とを得た。プラスミドｐＬＰｃ
ｈｄｌの制限サイトおよび機能地図を添付の第１３図に
示す。ｄｈｆｒ遺伝子含有ＤＮＡセグメントの方向性に
関してのみ異るプラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬＰ
Ｃｈｄ２の組立てを実施例１６に示す。
ｉｉｔイ付与遺伝子の中にあり、もう１つはプラスミド
ｐＢＲ３２２から導かれた配列の中にある、を含有シテ
いる。ｄｈｆｒ遺伝子を含んだフラグメン配列中に存在
するＥｃｏＲＩ部位に挿入してプラスミドｐＬＰｃｈｄ
ｌとｐＬＰＣｈｄ２ とを得た。プラスミドｐＬＰｃ
ｈｄｌの制限サイトおよび機能地図を添付の第１３図に
示す。ｄｈｆｒ遺伝子含有ＤＮＡセグメントの方向性に
関してのみ異るプラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬＰ
Ｃｈｄ２の組立てを実施例１６に示す。
プラスミドｐＬＰＣｈｄ１％修飾し、ＢＫエンハンサー
−アブ／ウィルス後期プロモーターカセット、並びにハ
イグロマイシン耐性付与およびｄｈｆｒ遺伝子の両者を
含有するプラスミドｐｈｄを組立てた。プラスミドｐｈ
ｄを組立てるために、プラスミドｐＬＰｃｈｄｌをｄａ
ｍ−大腸菌宿主細胞から調製し、制限酵素ＢこＪｌで消
化した後、再環化することによりヒトプロティンＣをコ
ードしているＤＮＡを欠失させた。プラスミドｐｈｄは
単１のＢｃｌ Ｉ制限酵素認識部位を含有しており、こ
れは、本発明のＢＫエンハンサー−アデノウィルス後期
プロモーターから発現させることが望まれる配列を挿入
する上で好都合な位置にある。プラスミドｐｈｄの制限
サイトおよび機能地図を添付の第１４図に、また、プラ
スミドｐｈｄの組立て手順を実施例１７に示す。
−アブ／ウィルス後期プロモーターカセット、並びにハ
イグロマイシン耐性付与およびｄｈｆｒ遺伝子の両者を
含有するプラスミドｐｈｄを組立てた。プラスミドｐｈ
ｄを組立てるために、プラスミドｐＬＰｃｈｄｌをｄａ
ｍ−大腸菌宿主細胞から調製し、制限酵素ＢこＪｌで消
化した後、再環化することによりヒトプロティンＣをコ
ードしているＤＮＡを欠失させた。プラスミドｐｈｄは
単１のＢｃｌ Ｉ制限酵素認識部位を含有しており、こ
れは、本発明のＢＫエンハンサー−アデノウィルス後期
プロモーターから発現させることが望まれる配列を挿入
する上で好都合な位置にある。プラスミドｐｈｄの制限
サイトおよび機能地図を添付の第１４図に、また、プラ
スミドｐｈｄの組立て手順を実施例１７に示す。
最後に、プラスミドＰＨＨ３−ＩＩａから得た〜２．７
ＫｂのプロティンＳ含有ＦｎｕＤ ＩＩ −ＥｃｏＲＶ
制限フラグメントを、ＢｃｅＴ消化し、フレノウ処理し
たプラスミドｐｈｄにライゲートさせることにより本発
明のプラスミドｐＳｈｄを組立てた。得られたプラスミ
ドは、ＢＫエンハンサー−アブ／ウィルス後期プロモー
ターカセットを用いてヒトプロティンＳを発現させる。
ＫｂのプロティンＳ含有ＦｎｕＤ ＩＩ −ＥｃｏＲＶ
制限フラグメントを、ＢｃｅＴ消化し、フレノウ処理し
たプラスミドｐｈｄにライゲートさせることにより本発
明のプラスミドｐＳｈｄを組立てた。得られたプラスミ
ドは、ＢＫエンハンサー−アブ／ウィルス後期プロモー
ターカセットを用いてヒトプロティンＳを発現させる。
本発明の他の実施態様では、単に、プラスミドｐＬ１３
３中のＢｄＪ Ｉ制限部位（これらは次いでフレノウ処
理される）によって囲まれているプロティンＣ遺伝子を
、プラスミドｐＨＨＳ−ＩＩａから単離された−２．７
Ｋｂ ＦｎｕＤＩＩ−ＥｃｏＲＶ制限フラグメントで
置き換え、上記の方法に従って組み立てを行う。得られ
た発現ベクターは、ＳＶ４０初期プロモーターを用いて
ヒトプロティンＳを発現させる。これらのプロティンＳ
発現ベクターはいずれもヒトプロティンＳの生産に有用
である。
３中のＢｄＪ Ｉ制限部位（これらは次いでフレノウ処
理される）によって囲まれているプロティンＣ遺伝子を
、プラスミドｐＨＨＳ−ＩＩａから単離された−２．７
Ｋｂ ＦｎｕＤＩＩ−ＥｃｏＲＶ制限フラグメントで
置き換え、上記の方法に従って組み立てを行う。得られ
た発現ベクターは、ＳＶ４０初期プロモーターを用いて
ヒトプロティンＳを発現させる。これらのプロティンＳ
発現ベクターはいずれもヒトプロティンＳの生産に有用
である。
プロティンＳが幾つかの領域における抗血栓症治療の価
値ある補助剤となり得ることが予測される。既に述べた
ように、最も明らかなのは、ヘテロ接合体性プロティン
Ｓ欠損症が、かなりの数の再発性深部静脈血栓症−肺動
脈塞栓症患者と関係しているという点である。その様な
患者の急性血栓症発症時には、プロティンＳを静脈内注
入で投与することが考えられる。また、プロティンＳは
、これまでに同定された、妊娠中や、ＳＬＥ、不フロー
ゼ症候群の如き、後天（獲得）性のプロティンＳ欠損症
の治療にも有用であることが予測される。後天性プロテ
ィンＳ欠損に関連する疾患状態のリストが、自己免疫疾
患やがん等と同様、多くの急性および慢性の炎症状態を
も含む（カバーする）までに拡張されるとの予測は決し
て不当ではない。必要とされる投与量は、臨床前および
臨床中の試行においてのみ確実に定めることができるの
であって、以下に示す計算値は仮定の値と考えられねば
ならない。血東中の総プロティンＳの正常値は３０μｇ
／ｍｅ であり、遊離プロティンＳの正常値は１０〜
１５μｇ／ｒｕｔ！ である。患者の循環液中のプロ
ティンＳレベルＥ５−１０μｇ／ａｔ増加させたい場合
には、プロティンＳの拡散容量がＩＸ因子のそれと同一
であると仮定して、３０−６０１りの静脈内投与が必要
となろう。プロティンＳの生物学的半減期は、人間にお
いて、４０〜４８時間であると、確立されている。従っ
て、疾患の急性期における患者には、３６〜４８時間毎
に注入すれば充分であると思われる。
値ある補助剤となり得ることが予測される。既に述べた
ように、最も明らかなのは、ヘテロ接合体性プロティン
Ｓ欠損症が、かなりの数の再発性深部静脈血栓症−肺動
脈塞栓症患者と関係しているという点である。その様な
患者の急性血栓症発症時には、プロティンＳを静脈内注
入で投与することが考えられる。また、プロティンＳは
、これまでに同定された、妊娠中や、ＳＬＥ、不フロー
ゼ症候群の如き、後天（獲得）性のプロティンＳ欠損症
の治療にも有用であることが予測される。後天性プロテ
ィンＳ欠損に関連する疾患状態のリストが、自己免疫疾
患やがん等と同様、多くの急性および慢性の炎症状態を
も含む（カバーする）までに拡張されるとの予測は決し
て不当ではない。必要とされる投与量は、臨床前および
臨床中の試行においてのみ確実に定めることができるの
であって、以下に示す計算値は仮定の値と考えられねば
ならない。血東中の総プロティンＳの正常値は３０μｇ
／ｍｅ であり、遊離プロティンＳの正常値は１０〜
１５μｇ／ｒｕｔ！ である。患者の循環液中のプロ
ティンＳレベルＥ５−１０μｇ／ａｔ増加させたい場合
には、プロティンＳの拡散容量がＩＸ因子のそれと同一
であると仮定して、３０−６０１りの静脈内投与が必要
となろう。プロティンＳの生物学的半減期は、人間にお
いて、４０〜４８時間であると、確立されている。従っ
て、疾患の急性期における患者には、３６〜４８時間毎
に注入すれば充分であると思われる。
プロティンＳは、補体の活性化が起きている膜表面上の
部位へのＣ４ｂ結合タンパク質の結合に際して有用な作
用を果し得る可能性がある。この仮説が立証されたなら
ば、プロティンＳの治療上の役割は、広範な一連の自己
免疫疾患や感染性疾患を含めて、補体の活性化が重要な
病理学的因子となっている数多くの疾病状態にまで拡張
されるであろう。
部位へのＣ４ｂ結合タンパク質の結合に際して有用な作
用を果し得る可能性がある。この仮説が立証されたなら
ば、プロティンＳの治療上の役割は、広範な一連の自己
免疫疾患や感染性疾患を含めて、補体の活性化が重要な
病理学的因子となっている数多くの疾病状態にまで拡張
されるであろう。
以下に実施例を挙げ、本明細書中に開示した発明をさら
に詳しく説明する。これらの実施例では、ヒトプロティ
ンＳをコードしている遺伝子物質の単離および同定にお
ける手法、並びにヒトプロティンＳ活性をコードしてい
る遺伝子の化学合成に印 の組立てに用いた方法をも示す。方法の説明は、適宜記
載した。
に詳しく説明する。これらの実施例では、ヒトプロティ
ンＳをコードしている遺伝子物質の単離および同定にお
ける手法、並びにヒトプロティンＳ活性をコードしてい
る遺伝子の化学合成に印 の組立てに用いた方法をも示す。方法の説明は、適宜記
載した。
実施例１ ヒトプロティンＳに対するポリクローナル抗
体と反応するタンパク質を発現するλｇｔ１１ファージ
のスクリーニングおよび同定本発明で用いた特定のλｇ
ｔｌｌライブラリーはクロンテクラボラトリイズ、Ｉｎ
ｃ、 ９２２ インダストリアルアベニュー、７２口・
アルド、カルフォルニア９４３０３から購入し得る、こ
のＩｇｔ １１ライブラリーはヒト肝ｃＤＮＡから生成
し、５×１０５プラークという複合性を示していた。こ
のライブラリーを希釈し、約２００，０００フアージを
、ＴＹ寒天（トリプトンＬｏｙ、ＮａＣ１１Ｏｙ、酵母
エキス５ｙおよび寒天１５ｙを１１中に含有する）を含
んだ１５０ｍの培養皿１０個の各々にプレートした（平
板培養した）。下記のスクリーニング法は、実質上、供
給者の指示に従った。ファージをプレートした後、直ち
に皿を４２°Ｃで３時間半インキュベートした。各プレ
ー１１こ１０ｍＭＩＰＴＧ飽和ニトロセルロースフィル
ターヲ重層し、３７°Ｃに移して約１６時間処理した。
体と反応するタンパク質を発現するλｇｔ１１ファージ
のスクリーニングおよび同定本発明で用いた特定のλｇ
ｔｌｌライブラリーはクロンテクラボラトリイズ、Ｉｎ
ｃ、 ９２２ インダストリアルアベニュー、７２口・
アルド、カルフォルニア９４３０３から購入し得る、こ
のＩｇｔ １１ライブラリーはヒト肝ｃＤＮＡから生成
し、５×１０５プラークという複合性を示していた。こ
のライブラリーを希釈し、約２００，０００フアージを
、ＴＹ寒天（トリプトンＬｏｙ、ＮａＣ１１Ｏｙ、酵母
エキス５ｙおよび寒天１５ｙを１１中に含有する）を含
んだ１５０ｍの培養皿１０個の各々にプレートした（平
板培養した）。下記のスクリーニング法は、実質上、供
給者の指示に従った。ファージをプレートした後、直ち
に皿を４２°Ｃで３時間半インキュベートした。各プレ
ー１１こ１０ｍＭＩＰＴＧ飽和ニトロセルロースフィル
ターヲ重層し、３７°Ｃに移して約１６時間処理した。
少くとも１５分間、プレートを４°Ｃに冷却した後、フ
ィルターをインシア（Ｉｎｄｉａ ）インキでマークし
、洗浄バッファーＴ Ｂ Ｓ Ｔ （５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｔ、ｐＨ＝７．９．１５０ ｍＭ ＮａＣｚ、
０．０５％Ｔｗｅ ｅ ｎ２０）に移した。フィルター
をこのバッファー２０ Ｏｎｒｔ中、１回の洗浄時間５
分で、３回洗浄した。洗浄および反応は全て室温で行わ
れた。次いで、ニトロセルロースに対する、抗体の非特
異的な結合を減するために、ＴＢＳＴ中２０中２０胎ウ
シ胎でフィルターを３０分間処理し、前記の如くに洗浄
した。第１番目の抗体反応には、ヒトプロティンＳに対
してヤギ内で惹起されたポリクローナル抗体を用いた。
ィルターをインシア（Ｉｎｄｉａ ）インキでマークし
、洗浄バッファーＴ Ｂ Ｓ Ｔ （５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｔ、ｐＨ＝７．９．１５０ ｍＭ ＮａＣｚ、
０．０５％Ｔｗｅ ｅ ｎ２０）に移した。フィルター
をこのバッファー２０ Ｏｎｒｔ中、１回の洗浄時間５
分で、３回洗浄した。洗浄および反応は全て室温で行わ
れた。次いで、ニトロセルロースに対する、抗体の非特
異的な結合を減するために、ＴＢＳＴ中２０中２０胎ウ
シ胎でフィルターを３０分間処理し、前記の如くに洗浄
した。第１番目の抗体反応には、ヒトプロティンＳに対
してヤギ内で惹起されたポリクローナル抗体を用いた。
これらの抗体は、［メソツズ・イン・エンザイモロジイ
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１０４
：３８１−３８７ Ｊに記載の多くの常套手段のいず
れかを用いて単離され得る。
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１０４
：３８１−３８７ Ｊに記載の多くの常套手段のいず
れかを用いて単離され得る。
−次抗体と１時間インキュベートした後、再びフィルタ
ーを洗浄し、次いで、ビオチニル化した二次抗体〔ベク
ターラボラトリイーズ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ ） Ｉｎｃ、バーリンガム（Ｂｕｒｌ ｉｎ
ｇａｍｅ）、ＣＡ９４０１０）で３０分間処理した。フ
ィルターを再度洗浄し、アビディンとコンシュケートし
た西洋ワサビのペルオキシダーゼコンプレックスを含ん
だＴＢＳＴ内に３０分間移した。最終的な洗浄ｌこはＴ
Ｂ Ｓ （Ｔｗｅｅｎ ２０を含有しナイ）ノみを用い
る。ペルオキシダーゼ基質溶液は３ｍｇ／ｍｅのメタノ
ール中、４−クロロナフトールを、ＴＢＳ＋０．０１Ｍ
イミダゾールと混合するこみにより調製された。３％過
酸化水素を１／２５０容量まで加え、得られた溶液を直
ちにフィルターに加えた。呈色反応（“陽性プラーク”
は紫色に変化）は、３０分以内に完了した。
ーを洗浄し、次いで、ビオチニル化した二次抗体〔ベク
ターラボラトリイーズ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ ） Ｉｎｃ、バーリンガム（Ｂｕｒｌ ｉｎ
ｇａｍｅ）、ＣＡ９４０１０）で３０分間処理した。フ
ィルターを再度洗浄し、アビディンとコンシュケートし
た西洋ワサビのペルオキシダーゼコンプレックスを含ん
だＴＢＳＴ内に３０分間移した。最終的な洗浄ｌこはＴ
Ｂ Ｓ （Ｔｗｅｅｎ ２０を含有しナイ）ノみを用い
る。ペルオキシダーゼ基質溶液は３ｍｇ／ｍｅのメタノ
ール中、４−クロロナフトールを、ＴＢＳ＋０．０１Ｍ
イミダゾールと混合するこみにより調製された。３％過
酸化水素を１／２５０容量まで加え、得られた溶液を直
ちにフィルターに加えた。呈色反応（“陽性プラーク”
は紫色に変化）は、３０分以内に完了した。
陽性プラークを同定した後、元のプレートの対応する領
域を除き、滅菌したラムダ希釈バッファー（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＣｚ、 ｐＨ＝ ７．５．１０ｍＭＭｇ
５○４）に加え、クロロホルム数滴と一緒に４°Ｃで保
存した。後に、これらのファージを１００ｎの皿当り、
約５０００プラークの密度に平板培養し、同じ方法でス
クリーニングした。陽性のプラークを、１００１皿当り
、１００プラークの密度で第３ラウンドのスクリーニン
グに付し、単離したプラークを収穫し、前と同様に保存
した。
域を除き、滅菌したラムダ希釈バッファー（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＣｚ、 ｐＨ＝ ７．５．１０ｍＭＭｇ
５○４）に加え、クロロホルム数滴と一緒に４°Ｃで保
存した。後に、これらのファージを１００ｎの皿当り、
約５０００プラークの密度に平板培養し、同じ方法でス
クリーニングした。陽性のプラークを、１００１皿当り
、１００プラークの密度で第３ラウンドのスクリーニン
グに付し、単離したプラークを収穫し、前と同様に保存
した。
実施例２ 精製ファージのｃ Ｄ Ｎ Ａ 領域ノ７ッ
ピングおよびサブクローニング プレートリゼイト法〔ディビス（Ｄａｖｉｓ ） 、ボ
ッティン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ）およびロス（Ｒｏｔｈ
） １９８０、アドバンスト・バクチリアル・ジエネ
テイックス（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）コールド・スプリングハーバ−・
ラボラトリイズ（Ｃｏｌｄ３ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） ’１により、下記の
如く、大量の精製ファージＤＮＡを得た。１０枚の１５
Ｏｎの皿各々に、約１０６プラーク精製フアージに感染
させた大腸菌をプレートした。４２℃で４時間後、略全
面的な溶解が達成された。この時点で、４℃において１
時間プレートを冷却し、０℃のラムダ希釈バッファー１
０ｄを流し、４℃で一夜保存した。翌朝、バッファーを
注意深く除去し、クロロホルム数滴で処理して残存する
細胞を溶解した。１８℃において、２０，０００ ｒｐ
ｍで３時間遠心するこ吉により上清からファージ粒子を
除き、ペレットをラムダ希釈バッファー１−に再懸濁し
た。塩化セシウム・グラディエンドでファージ粒子をさ
らに精製した；ファージ標本１ゴに溶液Ｉ （５Ｍ Ｃ
３Ｃ／、１０ ｍＭ Ｍｇ ＳＯ４，０，１ｍＭＮａ２
ＥＤＴＡ、 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ＝８．０ ）
１−１および溶液ＩＩ （３Ｍ ＣｓＣ／、１０ ｍ
Ｍ Ｍｇ ＳＯ４，０，１ｍＭ Ｎａ２ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａ ） ３ ｄの段階グラジェントを重層した。３０
．００Ｏｒｐｍ（１８℃）で６０分間処理した後、ファ
ージ粒子に対応する、かすかな青色バンドが境界面に認
められた。注射筒と針を用い、界面の溶液０．５ｄを除
いた。所望により、この時点で第２回目のグラディエン
ドを行ってもよい０ コートタンパク質からファージＤＮＡを放出させるため
に、各標本に等容量の脱イオンホルムアミドを混合し、
室温で更に３０分間放置した。この溶液を水０．５−で
希釈し、室温のエタノール２容量を加えてＤＮＡを析出
させた。１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心することに
よりＤＮＡを集め、ペレットを６８％エタノール（’
−２０℃）５ｄですすぎ、乾燥し、Ｔ Ｅ （１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ／、ｐＨ＝８．０および１囮ＥＤＴＡ
）５００μｌに再懸濁した。全ファージＤＮＡを計２０
０〜１０００μノ回収することができた。
ピングおよびサブクローニング プレートリゼイト法〔ディビス（Ｄａｖｉｓ ） 、ボ
ッティン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ）およびロス（Ｒｏｔｈ
） １９８０、アドバンスト・バクチリアル・ジエネ
テイックス（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）コールド・スプリングハーバ−・
ラボラトリイズ（Ｃｏｌｄ３ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） ’１により、下記の
如く、大量の精製ファージＤＮＡを得た。１０枚の１５
Ｏｎの皿各々に、約１０６プラーク精製フアージに感染
させた大腸菌をプレートした。４２℃で４時間後、略全
面的な溶解が達成された。この時点で、４℃において１
時間プレートを冷却し、０℃のラムダ希釈バッファー１
０ｄを流し、４℃で一夜保存した。翌朝、バッファーを
注意深く除去し、クロロホルム数滴で処理して残存する
細胞を溶解した。１８℃において、２０，０００ ｒｐ
ｍで３時間遠心するこ吉により上清からファージ粒子を
除き、ペレットをラムダ希釈バッファー１−に再懸濁し
た。塩化セシウム・グラディエンドでファージ粒子をさ
らに精製した；ファージ標本１ゴに溶液Ｉ （５Ｍ Ｃ
３Ｃ／、１０ ｍＭ Ｍｇ ＳＯ４，０，１ｍＭＮａ２
ＥＤＴＡ、 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ｐＨ＝８．０ ）
１−１および溶液ＩＩ （３Ｍ ＣｓＣ／、１０ ｍ
Ｍ Ｍｇ ＳＯ４，０，１ｍＭ Ｎａ２ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａ ） ３ ｄの段階グラジェントを重層した。３０
．００Ｏｒｐｍ（１８℃）で６０分間処理した後、ファ
ージ粒子に対応する、かすかな青色バンドが境界面に認
められた。注射筒と針を用い、界面の溶液０．５ｄを除
いた。所望により、この時点で第２回目のグラディエン
ドを行ってもよい０ コートタンパク質からファージＤＮＡを放出させるため
に、各標本に等容量の脱イオンホルムアミドを混合し、
室温で更に３０分間放置した。この溶液を水０．５−で
希釈し、室温のエタノール２容量を加えてＤＮＡを析出
させた。１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心することに
よりＤＮＡを集め、ペレットを６８％エタノール（’
−２０℃）５ｄですすぎ、乾燥し、Ｔ Ｅ （１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ／、ｐＨ＝８．０および１囮ＥＤＴＡ
）５００μｌに再懸濁した。全ファージＤＮＡを計２０
０〜１０００μノ回収することができた。
６つの陽性クローンそれぞれから得たファージＤＮＡを
、ｃＤＮＡ挿人体から生成したＥｃｏ ＲＩフラグメン
ト（類）のサイズを決定するための試験に付した。精製
ＤＮＡ約５０μＶをＥｃｏ ＲＩバッファ −（１００
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｔ、 ｐＨ＝７．５．１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２．５０ｍＭ ＮａＣｔ ） ２０ μｔと
ＥｃｏＲＩ５０単位とを含有する容量２００μｌ中で９
０分間、３７°Ｃにおいて消化した。本明細書中で引用
した酵素単位は、酵素の供給源は異なっていても、全て
ニューイングランドバイオラボス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ ）、３２トザーロード（Ｔｏｚａ
ｒ Ｒｏａｄ ）、ベバーリイ） Ｂｅｖｅｒｌｙ ）
、ＭＡＯｌ、９１５の単位に関する定義に従うものとす
る。試料をエタノール沈殿に付し、適切な、市販品から
入手可能なサイズマーカーと一緒に３．５％ポリアクリ
ルアミドゲル（アクリルアミド：ビス−アクリルアミド
、２９：１）または１．０％アガロースゲルを用いた電
気泳動に付した。臭化エチジウムを用いてＤＮＡを観察
し、ゲル中ての移動度に基づいて各バンドのサイズを計
算した。Ｘｍｎ工、５ｓｔＩおよびＫｐｎ Ｉを用いて
同様に消化し、挿入体のサイズとフラグメントの方向性
を確かめた。最大クローンの１つ（１−１と命名）は１
．８および０．８ｋｂのＥｃｏ ＲＩフラグメントを含
有しており、全挿入体のサイズは２．６ｋｂであった。
、ｃＤＮＡ挿人体から生成したＥｃｏ ＲＩフラグメン
ト（類）のサイズを決定するための試験に付した。精製
ＤＮＡ約５０μＶをＥｃｏ ＲＩバッファ −（１００
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｔ、 ｐＨ＝７．５．１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２．５０ｍＭ ＮａＣｔ ） ２０ μｔと
ＥｃｏＲＩ５０単位とを含有する容量２００μｌ中で９
０分間、３７°Ｃにおいて消化した。本明細書中で引用
した酵素単位は、酵素の供給源は異なっていても、全て
ニューイングランドバイオラボス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ ）、３２トザーロード（Ｔｏｚａ
ｒ Ｒｏａｄ ）、ベバーリイ） Ｂｅｖｅｒｌｙ ）
、ＭＡＯｌ、９１５の単位に関する定義に従うものとす
る。試料をエタノール沈殿に付し、適切な、市販品から
入手可能なサイズマーカーと一緒に３．５％ポリアクリ
ルアミドゲル（アクリルアミド：ビス−アクリルアミド
、２９：１）または１．０％アガロースゲルを用いた電
気泳動に付した。臭化エチジウムを用いてＤＮＡを観察
し、ゲル中ての移動度に基づいて各バンドのサイズを計
算した。Ｘｍｎ工、５ｓｔＩおよびＫｐｎ Ｉを用いて
同様に消化し、挿入体のサイズとフラグメントの方向性
を確かめた。最大クローンの１つ（１−１と命名）は１
．８および０．８ｋｂのＥｃｏ ＲＩフラグメントを含
有しており、全挿入体のサイズは２．６ｋｂであった。
最初のサブクローンはクローン１−１（７）ＥｃｏＲＩ
消化物から生成された。ファージＤＮＡ約５０μ２を上
記の如（ＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＥｃｏＲ工消化
、脱りん酸化ｐＢＲ３２２約１００ ｎｙとライゲート
させた。
消化物から生成された。ファージＤＮＡ約５０μ２を上
記の如（ＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＥｃｏＲ工消化
、脱りん酸化ｐＢＲ３２２約１００ ｎｙとライゲート
させた。
ライゲーションは、１×リガーゼバツフアー（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．８．１０ ｍ Ｍ Ｍｇ
Ｃ／ ２．２０ｍＭ ＤＤＴ、１ｍＭ ＡＴＰ）２０
ｐｉとリガーゼ４００単位の全容量中、１，５°Ｃで一
夜行われた。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．８．１０ ｍ Ｍ Ｍｇ
Ｃ／ ２．２０ｍＭ ＤＤＴ、１ｍＭ ＡＴＰ）２０
ｐｉとリガーゼ４００単位の全容量中、１，５°Ｃで一
夜行われた。
大腸菌ＲＲＩ細胞〔ベセスダ・リサーチ・ラボラド リ
イ ズ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）Ｉｎｃ、ガイザース
バーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ） Ｍ Ｄ２０８
７７から入手可〕を用い、ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリイズによって示された手順に従って形質転換し、形
質転換された細胞をアンピシリン５０μｆ／ｄを含んだ
ＴＹプレート上で選択した。プレートを３７℃で一夜イ
ンキユベートした。
イ ズ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）Ｉｎｃ、ガイザース
バーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ） Ｍ Ｄ２０８
７７から入手可〕を用い、ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリイズによって示された手順に従って形質転換し、形
質転換された細胞をアンピシリン５０μｆ／ｄを含んだ
ＴＹプレート上で選択した。プレートを３７℃で一夜イ
ンキユベートした。
無作為に選択した１２のクローンからプラスミドＤＮＡ
を単離し、ＥｃｏＲＩで消化し、サブクローンされたフ
ラグメントのサイズを求めた。予測される１、８ｋｂお
よび０．８ｋｂフラグメントを個別にｐＢＲ３２２にサ
ブクローンし、得られたプラスミドをそれぞれｐＬＨＳ
−２２およびｐＬＨＳ−２１と命名した。大量のプラス
ミドＤＮＡを、最小培地中でクロラムフェニコール増幅
に付した後、アルカリ溶解することによりマニアテイス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、フリッブ（Ｆｒ１ｔｓｃｈ ）
およびサムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ） Ｃ１９ｇ
２、モレキュラークローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ）、コールドスプリングハーバーラ
ボラトリイズ〕の記載の如く、ＤＮＡ配列決定に備えて
精製した。
を単離し、ＥｃｏＲＩで消化し、サブクローンされたフ
ラグメントのサイズを求めた。予測される１、８ｋｂお
よび０．８ｋｂフラグメントを個別にｐＢＲ３２２にサ
ブクローンし、得られたプラスミドをそれぞれｐＬＨＳ
−２２およびｐＬＨＳ−２１と命名した。大量のプラス
ミドＤＮＡを、最小培地中でクロラムフェニコール増幅
に付した後、アルカリ溶解することによりマニアテイス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、フリッブ（Ｆｒ１ｔｓｃｈ ）
およびサムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ） Ｃ１９ｇ
２、モレキュラークローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ）、コールドスプリングハーバーラ
ボラトリイズ〕の記載の如く、ＤＮＡ配列決定に備えて
精製した。
実施例３ プ之スミドｐＬＨＳ−２２の〜１．８ｋｂＥ
ｃｏ ＲＩ制限フラグメントの単離 水５０７１１中のプラスミドｐＬＨＳ−２２５０ｔｔｙ
を、１０ＸＥｃｏＲＩ制限バツフアー２Ｑ７１／および
水１２０μｌと混合した。この混合物を３７°Ｃにおい
て、ＥｃｏＲＩ で消化が完了するまで消化した。
ｃｏ ＲＩ制限フラグメントの単離 水５０７１１中のプラスミドｐＬＨＳ−２２５０ｔｔｙ
を、１０ＸＥｃｏＲＩ制限バツフアー２Ｑ７１／および
水１２０μｌと混合した。この混合物を３７°Ｃにおい
て、ＥｃｏＲＩ で消化が完了するまで消化した。
このＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを３．５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけ、他の消化産物から〜１．８ｋｂ
のバンドが分離するまで分離処理した。次いで、臭化エ
チジウムの希釈液中でゲルを洗浄し、紫外線照射下でバ
ンドを観察した。
ドゲル電気泳動にかけ、他の消化産物から〜１．８ｋｂ
のバンドが分離するまで分離処理した。次いで、臭化エ
チジウムの希釈液中でゲルを洗浄し、紫外線照射下でバ
ンドを観察した。
〜１．８ ｋｂ ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを含有す
るゲル上の領域をゲルから切り取り、試験管内に入れ、
小フラグメントに破壊した。フラグメントを入れた試験
管に抽出バッファ （５００ｍＭ ＮＨ４０Ａｃ、１
０ ｍＭ ＭｇＯＡｃ 、 １ ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ
および１％５ＤＳ）１４を加えた。この試験管を３７°
Ｃで一夜インキユベートした。遠心してアクリルアミド
を除き、上清を新らしい試験管に入れた。アクリルアミ
ドを抽出バッファー２００μｌで１回洗浄し、再度遠心
した後、上清を集め、グラスウール製のプラグを通過さ
せて残存する汚染物質を除去した。２容量のエタノール
でＤＮＡを析出させ、良く混合し、ドライアイス−エタ
ノール浴中に、１０〜３０分間保持した。遠心してＤＮ
Ａを回収した。
るゲル上の領域をゲルから切り取り、試験管内に入れ、
小フラグメントに破壊した。フラグメントを入れた試験
管に抽出バッファ （５００ｍＭ ＮＨ４０Ａｃ、１
０ ｍＭ ＭｇＯＡｃ 、 １ ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ
および１％５ＤＳ）１４を加えた。この試験管を３７°
Ｃで一夜インキユベートした。遠心してアクリルアミド
を除き、上清を新らしい試験管に入れた。アクリルアミ
ドを抽出バッファー２００μｌで１回洗浄し、再度遠心
した後、上清を集め、グラスウール製のプラグを通過さ
せて残存する汚染物質を除去した。２容量のエタノール
でＤＮＡを析出させ、良く混合し、ドライアイス−エタ
ノール浴中に、１０〜３０分間保持した。遠心してＤＮ
Ａを回収した。
この方法で約１５μノの〜１．８ ｋｂ ＥｃｏＲＩ制
限フラグメントを回収した。この精製フラグメントをＴ
Ｅバッファー１０μｌに再懸濁し、４°Ｃで保存した。
限フラグメントを回収した。この精製フラグメントをＴ
Ｅバッファー１０μｌに再懸濁し、４°Ｃで保存した。
実施例４ ヒトプロティンＳをコードしているｃＤＮＡ
の配列決定 ヒトプロティンＳをコードしているｃＤＮＡのＤＮＡ配
列を、実質上、マキサム（Ｍａｘａｍ ）およびギルバ
ート（Ｇ１１ｂｅｒｔ ）法（メソツズ・イン・エンザ
イモロジイ、１９８０）に従って決定した。
の配列決定 ヒトプロティンＳをコードしているｃＤＮＡのＤＮＡ配
列を、実質上、マキサム（Ｍａｘａｍ ）およびギルバ
ート（Ｇ１１ｂｅｒｔ ）法（メソツズ・イン・エンザ
イモロジイ、１９８０）に従って決定した。
実施例５ プロティンＳサブクローンのサザーン分析
ファージ１−１から得た１、８および０．８ｋｂ フラ
グメントを含めて、ｐＢＲ３２２にサブクローンされた
幾つかのプロティンＳのＥｃｏＲＩフラグメント（実施
例３に記載）からプラスミドＤＮＡを調製したＯこのＤ
ＮＡを実施例２の教示の如くにしてＥｃｏ ＲＩで消化
し、１．０％アガロースゲル電気泳動にかけて分離した
。ゲルの調製条件、実際の移動、およびハイブリダイゼ
ーション法は実質上、スミス（Ｓｍ１ｔｈ ）およびサ
マース（’ Ｓｕｍｍｅｒｓ ）〔１９８０、アナル・
バイオケム（Ａｎａｌ 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）１０
９ ：１２３〜１２９〕の教示に従って行われた。
グメントを含めて、ｐＢＲ３２２にサブクローンされた
幾つかのプロティンＳのＥｃｏＲＩフラグメント（実施
例３に記載）からプラスミドＤＮＡを調製したＯこのＤ
ＮＡを実施例２の教示の如くにしてＥｃｏ ＲＩで消化
し、１．０％アガロースゲル電気泳動にかけて分離した
。ゲルの調製条件、実際の移動、およびハイブリダイゼ
ーション法は実質上、スミス（Ｓｍ１ｔｈ ）およびサ
マース（’ Ｓｕｍｍｅｒｓ ）〔１９８０、アナル・
バイオケム（Ａｎａｌ 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）１０
９ ：１２３〜１２９〕の教示に従って行われた。
ハイブリダイゼーションには、表１に示した２つの独立
した、混合プローブを用いた。既述の如く、第１プロー
ブ、＃８０は、ステンフロ（Ｊ、 ５ｔｅｎｆｌｏ）（
１９８５）から供給されたウシのアミノ酸配列から導か
れた。このプローブは、ウシ分子のＥＧＦ領域の１つで
あるアミノ酸、＃８３−９０に対応する。プローブ８１
もウシの配列に基ついており、これは、カルボキシ末端
のアミノ酸、＃６２８〜６３４に対応する。ファージ１
−１由来の１．８ ｋｂＥｃｏ ＲＩ フラグメントは
これらの両プローブと強くハイブリダイズした。
した、混合プローブを用いた。既述の如く、第１プロー
ブ、＃８０は、ステンフロ（Ｊ、 ５ｔｅｎｆｌｏ）（
１９８５）から供給されたウシのアミノ酸配列から導か
れた。このプローブは、ウシ分子のＥＧＦ領域の１つで
あるアミノ酸、＃８３−９０に対応する。プローブ８１
もウシの配列に基ついており、これは、カルボキシ末端
のアミノ酸、＃６２８〜６３４に対応する。ファージ１
−１由来の１．８ ｋｂＥｃｏ ＲＩ フラグメントは
これらの両プローブと強くハイブリダイズした。
実施例６ 大腸菌に１２ ＲＲＩ／ｐＨＨ３−ＩＩａ
の培界およびプラスミドｐＨＨ３−ＩＩａの単離Ａ、大
腸菌に１２ ＲＲＩ／ｐＨＨ６−４ａの培養Ｌ−ブロス
（ペプトン１０ｙ、ＮａＣ／１０ｙおよび酵母エキス５
ｙ）５ｄに大腸菌に１２ ＲＲＩ／ｐＨＨ３−ＩＩａ
（ＮＲＲＬＢ−１８０７１）の培養物を接種し、空気
振とう器内で３７℃において１６時間インキュベートし
た。この培養物少量を、テトラサイクリン１５μｙ／−
を含んだし一ブロス寒天プレート上で画線培養し、３７
°Ｃで約１６時間増殖させた。単離したコロニーをテト
ラサイクリン１５μｆ１ｍｌｋ含んだし一ブロス５ｄに
接種シ、振とう下、３７℃で約１６時間増殖させた。
の培界およびプラスミドｐＨＨ３−ＩＩａの単離Ａ、大
腸菌に１２ ＲＲＩ／ｐＨＨ６−４ａの培養Ｌ−ブロス
（ペプトン１０ｙ、ＮａＣ／１０ｙおよび酵母エキス５
ｙ）５ｄに大腸菌に１２ ＲＲＩ／ｐＨＨ３−ＩＩａ
（ＮＲＲＬＢ−１８０７１）の培養物を接種し、空気
振とう器内で３７℃において１６時間インキュベートし
た。この培養物少量を、テトラサイクリン１５μｙ／−
を含んだし一ブロス寒天プレート上で画線培養し、３７
°Ｃで約１６時間増殖させた。単離したコロニーをテト
ラサイクリン１５μｆ１ｍｌｋ含んだし一ブロス５ｄに
接種シ、振とう下、３７℃で約１６時間増殖させた。
次いで、この培養物を用いてテトラサイクリン］、 ２
／ｌｙ／−を含んだＬ−ブロス１ｂこ接種し、空無振
とう４中、３７℃において、５９０ ｎｍにおける光学
密度（０，Ｄ、 ）が〜・０．６吸収単位になるまでイ
ンキュベートし、この時点で培養物にクロラムフェニコ
ール２５０〜を加えた。約１６時間、インキュベーショ
ンを続けた：クロラムフエニコールの添加によりタンパ
ク質の合成が阻害され、その結果、以後の細胞分裂が阻
害されるが、プラスミＩ’の複製は継続される。
／ｌｙ／−を含んだＬ−ブロス１ｂこ接種し、空無振
とう４中、３７℃において、５９０ ｎｍにおける光学
密度（０，Ｄ、 ）が〜・０．６吸収単位になるまでイ
ンキュベートし、この時点で培養物にクロラムフェニコ
ール２５０〜を加えた。約１６時間、インキュベーショ
ンを続けた：クロラムフエニコールの添加によりタンパ
ク質の合成が阻害され、その結果、以後の細胞分裂が阻
害されるが、プラスミＩ’の複製は継続される。
Ｂ、プラスミ）’ｐＨＨ３−ＩＩａの単離実施例６Ａで
調製した培養物をソーバール（Ｓｏｒｖａｌｌ ） Ｇ
Ｓ Ａローター〔デュポン（Ｄｕ ＰｏｎｔＣｏ、）
、インスツルメンツ・プロダクツ（７ｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ）、バイオメディカル−ディ
ビジョン、ニュータウン、ＣＮ０６４７０〕中、４℃で
５分間、６０００ ｒｐｍで遠心し、上清を捨てた。得
られた細胞ペレットを−２０”Ｃで最少２時間凍結し、
次いて解凍した。解凍した細胞ペレットを２５％スクロ
ース／ ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ、ｐＨ＝８溶
液６，２５．／に再懸濁した。１０■／ ｍｅ リゾ
チーム溶液１．５ｄ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．
０）１．２５−を加えて混合した後、得られた溶液を氷
上で１０分間インキュベートした。このリゾチーム処理
細胞に、溶解溶液（０，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０，０，１２５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．５０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８ ） １０−ｔを加え、混合し、得
られた溶液を氷上でさらに１０分間インキュベートシタ
。
調製した培養物をソーバール（Ｓｏｒｖａｌｌ ） Ｇ
Ｓ Ａローター〔デュポン（Ｄｕ ＰｏｎｔＣｏ、）
、インスツルメンツ・プロダクツ（７ｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ）、バイオメディカル−ディ
ビジョン、ニュータウン、ＣＮ０６４７０〕中、４℃で
５分間、６０００ ｒｐｍで遠心し、上清を捨てた。得
られた細胞ペレットを−２０”Ｃで最少２時間凍結し、
次いて解凍した。解凍した細胞ペレットを２５％スクロ
ース／ ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ、ｐＨ＝８溶
液６，２５．／に再懸濁した。１０■／ ｍｅ リゾ
チーム溶液１．５ｄ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．
０）１．２５−を加えて混合した後、得られた溶液を氷
上で１０分間インキュベートした。このリゾチーム処理
細胞に、溶解溶液（０，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０，０，１２５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．５０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８ ） １０−ｔを加え、混合し、得
られた溶液を氷上でさらに１０分間インキュベートシタ
。
５Ｓ３４０−４−（７−バール）中、１９，０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心することにより溶液から細胞破片を除
去した。ＴＥで溶液の容量を３０．／に調節し、次いで
Ｃ５Ｃ１２８，９１および１０ｑ／Ｉ＋１／臭化エチジ
ウム３．７５．ｌ＋／を加え、得られた溶液をＶｔ１５
０超遠心管〔ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ ）、リンカ
ーンウッド、ＩＬ６０６４６’）内にデカントした。管
をシールした後、Ｖｔ１５０ローター中、４９．０００
ｒｐｍで約１６時間、溶液を遠心した。
ｍで３０分間遠心することにより溶液から細胞破片を除
去した。ＴＥで溶液の容量を３０．／に調節し、次いで
Ｃ５Ｃ１２８，９１および１０ｑ／Ｉ＋１／臭化エチジ
ウム３．７５．ｌ＋／を加え、得られた溶液をＶｔ１５
０超遠心管〔ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ ）、リンカ
ーンウッド、ＩＬ６０６４６’）内にデカントした。管
をシールした後、Ｖｔ１５０ローター中、４９．０００
ｒｐｍで約１６時間、溶液を遠心した。
紫外線の下で観察されたプラスミドのバンドを単離した
。臭化エチジウムをＴＥ−飽和イソブタノールで抽出し
、溶液を３容量の水で希釈した。次いで、この溶液ζこ
１／４０容量の２．０ Ｍ Ｎａ ＯＡｃ 。
。臭化エチジウムをＴＥ−飽和イソブタノールで抽出し
、溶液を３容量の水で希釈した。次いで、この溶液ζこ
１／４０容量の２．０ Ｍ Ｎａ ＯＡｃ 。
ｐＨ＝５および２容量のエタノールを加え、２０°Ｃで
一夜インキユベートした。５Ｓ３４０−ター（ソーバー
ル）中、１０，０００ ｒｐｍで３０分間、溶液を遠心
してプラスミドＤＮＡをペレット化した。このＤＮＡを
０．３Ｍ Ｎａ０Ａｃ ５−に再懸濁した。これに、エ
タノール１０ ｍｌを加え、得られた溶液を一２０℃で
一夜インキユベートした。直前に記載した如くにしてプ
ラスミドＤ Ｎ 、Ａ ヲベレント化した。
一夜インキユベートした。５Ｓ３４０−ター（ソーバー
ル）中、１０，０００ ｒｐｍで３０分間、溶液を遠心
してプラスミドＤＮＡをペレット化した。このＤＮＡを
０．３Ｍ Ｎａ０Ａｃ ５−に再懸濁した。これに、エ
タノール１０ ｍｌを加え、得られた溶液を一２０℃で
一夜インキユベートした。直前に記載した如くにしてプ
ラスミドＤ Ｎ 、Ａ ヲベレント化した。
この方法で得られたプラスミドｐＨＨ３−［ａ ＤＮＡ
−１■をＴＥバッファー１ｄに懸濁し、４℃で保存した
。プラスミドＩ）ＨＨ３−ＩＩａの制限サイトおよび機
能地図を添付の第２図に示す。
−１■をＴＥバッファー１ｄに懸濁し、４℃で保存した
。プラスミドＩ）ＨＨ３−ＩＩａの制限サイトおよび機
能地図を添付の第２図に示す。
実施例７ ヒト肝ｃＤＮＡライブラリーのブロービング
ファージクローン１−１は分子の５′末端および３′末
端の両方を欠如していたので、付加的な配列を含有する
クローンを再スクリーニングする必要があった。この工
程のために様々なヒト肝ｃ ＤＮＡライブラリーを用い
た。ｐＢＲ３２２ベクターを用いるライブラリーが文献
に記載されている〔ベックマンら（Ｒ，Ｊ 、 Ｂｅｃ
ｋｍａｎｍ ）、ヌクレイツクアシツズ・リサーチ、１
３ ： ５２３３．１９８５〕。既知のＤＮＡ配列を基
に、２つのプローブを単離し、２１および２２と命名し
た。これら各々の配列を表２に示す。５′末端領域とホ
モローガスなプローブ２１は、ＨｉｎｃＩＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩの認識配列によって境界を隔てられた、１１
０ ｂｐフラグメントで構成されている。プローブ２２
は分子の３′非翻訳領域に対応し、Ｈｉｎｆ Ｉおよび
Ｅｃｏ ＲＩの認識配列によって境界を隔てられている
。これらのプローブを放射活性に標識し、棟部的な手法
（マニアテイスら、１９８２）に従ってｃＤＮＡライブ
ラリーをプローブするために用いた。プローブをハイブ
リダイズし、これらを６８℃で洗浄した。全ての濾過操
作を２回繰り返した。この方法で数個の陽性クローンが
同定された。制限酵素マツピ≠φング、サザーンハイプ
リダイゼーションおよびＤＮＡ配列決定によりｐＨＨＳ
−ＩＩａと命名された１つのクローンがプロティンＳ前
駆体の完全な暗号領域を含有しているものと同定された
。
端の両方を欠如していたので、付加的な配列を含有する
クローンを再スクリーニングする必要があった。この工
程のために様々なヒト肝ｃ ＤＮＡライブラリーを用い
た。ｐＢＲ３２２ベクターを用いるライブラリーが文献
に記載されている〔ベックマンら（Ｒ，Ｊ 、 Ｂｅｃ
ｋｍａｎｍ ）、ヌクレイツクアシツズ・リサーチ、１
３ ： ５２３３．１９８５〕。既知のＤＮＡ配列を基
に、２つのプローブを単離し、２１および２２と命名し
た。これら各々の配列を表２に示す。５′末端領域とホ
モローガスなプローブ２１は、ＨｉｎｃＩＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩの認識配列によって境界を隔てられた、１１
０ ｂｐフラグメントで構成されている。プローブ２２
は分子の３′非翻訳領域に対応し、Ｈｉｎｆ Ｉおよび
Ｅｃｏ ＲＩの認識配列によって境界を隔てられている
。これらのプローブを放射活性に標識し、棟部的な手法
（マニアテイスら、１９８２）に従ってｃＤＮＡライブ
ラリーをプローブするために用いた。プローブをハイブ
リダイズし、これらを６８℃で洗浄した。全ての濾過操
作を２回繰り返した。この方法で数個の陽性クローンが
同定された。制限酵素マツピ≠φング、サザーンハイプ
リダイゼーションおよびＤＮＡ配列決定によりｐＨＨＳ
−ＩＩａと命名された１つのクローンがプロティンＳ前
駆体の完全な暗号領域を含有しているものと同定された
。
実施例８ ８にウィルスＤＮＡの調製
ＢＫウィルスは、アメリカン・タイプ・カルチ−・コレ
クションから寄託番号Ａ〜ＴＣＣＶＲ−８３７の下で得
られる。このウィルスは凍結乾燥形で得られ、これをバ
ンクの（Ｈａｎｋ’ｓ ）平衡（バランス）塩類（ギブ
コ、３１７５ スタレー・ロード、グランドアイランド
、ＮＹ１４０７２）に再懸濁し、力価を１０５プラーク
形成単位（ｐｆｕ）／−とする。
クションから寄託番号Ａ〜ＴＣＣＶＲ−８３７の下で得
られる。このウィルスは凍結乾燥形で得られ、これをバ
ンクの（Ｈａｎｋ’ｓ ）平衡（バランス）塩類（ギブ
コ、３１７５ スタレー・ロード、グランドアイランド
、ＮＹ１４０７２）に再懸濁し、力価を１０５プラーク
形成単位（ｐｆｕ）／−とする。
Ｂ ＫウィルスＤＮＡを調製するために最適な宿主とさ
れるのは一次ヒト胚性腎（ＰＨＥＫ）細胞であり、これ
は、フローラボラトリイズ（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ ） Ｉｎｃ、、 ７６５５オールド・スプリ
ングハウス−ａ−ド（Ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ
Ｒｏａｄ ）マクレーン（Ｍｃ １ｅａｎ ）、ＶＡ
２２１０１ から、カタログ番号０−１００の下、ある
いはバイオプログクツ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ）か
ら、カタログ番号７〇−１５１の下で得ることができる
。
れるのは一次ヒト胚性腎（ＰＨＥＫ）細胞であり、これ
は、フローラボラトリイズ（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ ） Ｉｎｃ、、 ７６５５オールド・スプリ
ングハウス−ａ−ド（Ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ
Ｒｏａｄ ）マクレーン（Ｍｃ １ｅａｎ ）、ＶＡ
２２１０１ から、カタログ番号０−１００の下、ある
いはバイオプログクツ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ）か
ら、カタログ番号７〇−１５１の下で得ることができる
。
約１０６のＰＨＥＫ細胞が全面成長した単一層を含む約
５個の７５＋ｍ ポリスチレンフラスコをウィルスの調
製に用いる。各フラスコに力価１０ｐｆｕ／ ｍｅのＢ
Ｋウィルス約１−を入れ、３７℃で１時間インキュベー
トした後、新鮮な培養培地（デルベツコの改良イーグル
培地（Ｄｅ １ｂｅｃｃｏ’ｓＭのｄｉｆｉｅｄ Ｅａ
ｇｌ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ ）、ギブコ、１０％ウシ胎児
血清を補充〕を加え、感染した細胞を３７℃で１０〜１
４日間、あるいはウィルスの細胞変性効果が完全に認め
られるまでインキュベートする。この細胞変性効果はセ
ルラインとセルライン、ウィルスとウィルスの間で異な
るが、一般に細胞の集合、密集および培養皿からの脱落
からなる。
５個の７５＋ｍ ポリスチレンフラスコをウィルスの調
製に用いる。各フラスコに力価１０ｐｆｕ／ ｍｅのＢ
Ｋウィルス約１−を入れ、３７℃で１時間インキュベー
トした後、新鮮な培養培地（デルベツコの改良イーグル
培地（Ｄｅ １ｂｅｃｃｏ’ｓＭのｄｉｆｉｅｄ Ｅａ
ｇｌ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ ）、ギブコ、１０％ウシ胎児
血清を補充〕を加え、感染した細胞を３７℃で１０〜１
４日間、あるいはウィルスの細胞変性効果が完全に認め
られるまでインキュベートする。この細胞変性効果はセ
ルラインとセルライン、ウィルスとウィルスの間で異な
るが、一般に細胞の集合、密集および培養皿からの脱落
からなる。
細胞を３回の凍結−解凍サイクルに付すことによりウィ
ルスを放出させ、５０００ｘｒで遠心することによって
細胞破片を除く。上清液１１にＰＥＧ−６０００を１０
０ｙ加え、得られた溶液を４°Ｃて２４時間インキュベ
ートし、５０００Ｘｒで２０分間遠心することにより、
上清１１中のウィルスを沈殿させ、収穫する。ペレット
を元の容積の１／１００になる様、０．１ＸＳＳＣバツ
フアー（１ｘＳｓｃ＝ｏ、ｉ ５ＭＮａＣ１，５ｍＭ
ＥＤＴＡ、および５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｔ、
ｐＨ＝７．８ ）に溶解する。このウィルス懸濁液を、
管内の飽和ＫＢｒ溶液１５．／上（こ重層し、７５，０
００ｘ）で３時間遠心する。ＫＢｒ溶液中に２つのバン
ドが示される。完全なピリオンを含有している下側のバ
ンドを集め、セファデックスＧ−５０カラムに適用し、
ＴＥを溶離バッファーとして用いて脱塩処理する。
ルスを放出させ、５０００ｘｒで遠心することによって
細胞破片を除く。上清液１１にＰＥＧ−６０００を１０
０ｙ加え、得られた溶液を４°Ｃて２４時間インキュベ
ートし、５０００Ｘｒで２０分間遠心することにより、
上清１１中のウィルスを沈殿させ、収穫する。ペレット
を元の容積の１／１００になる様、０．１ＸＳＳＣバツ
フアー（１ｘＳｓｃ＝ｏ、ｉ ５ＭＮａＣ１，５ｍＭ
ＥＤＴＡ、および５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｔ、
ｐＨ＝７．８ ）に溶解する。このウィルス懸濁液を、
管内の飽和ＫＢｒ溶液１５．／上（こ重層し、７５，０
００ｘ）で３時間遠心する。ＫＢｒ溶液中に２つのバン
ドが示される。完全なピリオンを含有している下側のバ
ンドを集め、セファデックスＧ−５０カラムに適用し、
ＴＥを溶離バッファーとして用いて脱塩処理する。
カラムから得た精製ピリオンにドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ ”）を濃度１％となるように加え、さらに、
プロナーゼを濃度ｉ ０ （ｌ ＩＮ！７ｍｌとなるよ
うに加えて得られた溶液を３７°Ｃて２時間インキュベ
ートする。次いで、この溶液に塩化セシウムを濃度１．
５６９７ｍｅで加え、さらに臭化エチジウムを終濃度が
１００μｙ／？Ｉ／となる様に加える。この溶液を５ｏ
ｒｖａｌ ８６５０−ターまたは類似の垂直ローターを
用い、２６０，０ＯＯＸｒで２４時間遠心する。遠心後
、ウィルスＤＮＡのバンドを単離し、１００ ｍＭ Ｔ
ｒｊｓ −ＨＣｔ 、 ｐＨ＝ ７．８を飽和したイソ
アミルアルコールで５回抽出する。次いで、ＢＫウィル
スＤＮＡの溶液を、Ｄ Ｎ Ａの２６０ｎｍ／２８０
ｎｍ吸収比が１．７５から１．９０の間になるまで、Ｔ
Ｅバッファーに対して透析する。ＮａＣｌａ度を０．１
５Ｍに調節し、２容量のエタノールを加え、得られた溶
液を一７０℃で少くとも２時間インキュベートした後、
１２．０００ｘ）で１０分間遠心するこ舌によりＤＮＡ
を沈殿させる。生成したＢＫウィルスＤＮＡのペレット
を、ＴＥバッファーに濃度１ ｙ４ ／ ｍｅとなる様
、懸濁する。
（ＳＤＳ ”）を濃度１％となるように加え、さらに、
プロナーゼを濃度ｉ ０ （ｌ ＩＮ！７ｍｌとなるよ
うに加えて得られた溶液を３７°Ｃて２時間インキュベ
ートする。次いで、この溶液に塩化セシウムを濃度１．
５６９７ｍｅで加え、さらに臭化エチジウムを終濃度が
１００μｙ／？Ｉ／となる様に加える。この溶液を５ｏ
ｒｖａｌ ８６５０−ターまたは類似の垂直ローターを
用い、２６０，０ＯＯＸｒで２４時間遠心する。遠心後
、ウィルスＤＮＡのバンドを単離し、１００ ｍＭ Ｔ
ｒｊｓ −ＨＣｔ 、 ｐＨ＝ ７．８を飽和したイソ
アミルアルコールで５回抽出する。次いで、ＢＫウィル
スＤＮＡの溶液を、Ｄ Ｎ Ａの２６０ｎｍ／２８０
ｎｍ吸収比が１．７５から１．９０の間になるまで、Ｔ
Ｅバッファーに対して透析する。ＮａＣｌａ度を０．１
５Ｍに調節し、２容量のエタノールを加え、得られた溶
液を一７０℃で少くとも２時間インキュベートした後、
１２．０００ｘ）で１０分間遠心するこ舌によりＤＮＡ
を沈殿させる。生成したＢＫウィルスＤＮＡのペレット
を、ＴＥバッファーに濃度１ ｙ４ ／ ｍｅとなる様
、懸濁する。
実施例９ プラスミドｐＢＫＥ １およびｐＢＫＥ２の
組立て 実施例８て調製したＴＥバッファー１μｌ中約１１１ｙ
のＢＫウィルスＤＮＡを１０ＸＥｃｏＲＩ バッファ
ー（１，０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ％ｐＨ＝７．５．０．
５ＭＮａ、Ｃｔ、５０ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃｌ ２、およ
び１−ｑ／−ｔ ＢＳＡ ）２μｌと水１５μｌとに溶
かした。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ約２μ
ｌ（〜ｌＯ単位）を加え、得られた反応混合物を３７℃
で２時間インキユベートシた。
組立て 実施例８て調製したＴＥバッファー１μｌ中約１１１ｙ
のＢＫウィルスＤＮＡを１０ＸＥｃｏＲＩ バッファ
ー（１，０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ％ｐＨ＝７．５．０．
５ＭＮａ、Ｃｔ、５０ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃｌ ２、およ
び１−ｑ／−ｔ ＢＳＡ ）２μｌと水１５μｌとに溶
かした。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ約２μ
ｌ（〜ｌＯ単位）を加え、得られた反応混合物を３７℃
で２時間インキユベートシた。
ＴＥバッファー１μ！中のプラスミドｐＵＣ８Ｃファ／
Ｌ／７シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） Ｐ −Ｌバイオ
ケミカルス（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ） ８００セ
ンテニアルアベニユー、ビスカッタウェイ、ＮＪＯ８８
５４）約１μノを、実質上、ＥｃｏＲＩ消化ＢＫウィル
スＤＮＡの調製に用いた方法に従い、Ｅｃｏ ＲＩで消
化した。
Ｌ／７シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） Ｐ −Ｌバイオ
ケミカルス（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ） ８００セ
ンテニアルアベニユー、ビスカッタウェイ、ＮＪＯ８８
５４）約１μノを、実質上、ＥｃｏＲＩ消化ＢＫウィル
スＤＮＡの調製に用いた方法に従い、Ｅｃｏ ＲＩで消
化した。
このＥＣ０ＲＩ消化プラスミドｐＵＣ８ＤＮＡをＴＥバ
ッファーで１００μｌに希釈し、該溶液にウシ腸由来の
アルカリホスファターゼ−０，０６単位を加え、得られ
た溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。この溶
液をＩ Ｘ ＳＥＴ （５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｚ、ｐ
Ｈ＝７．８．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｔ ）、０．３ Ｍ Ｎａ０Ａｃ 、および０．５
％ＳＤＳを含有する様調節した後、６５°Ｃで４５分間
インキュベートした。このホスファターゼ処理は、ｐＵ
Ｃ８の自己ライゲーションを防止する。
ッファーで１００μｌに希釈し、該溶液にウシ腸由来の
アルカリホスファターゼ−０，０６単位を加え、得られ
た溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。この溶
液をＩ Ｘ ＳＥＴ （５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｚ、ｐ
Ｈ＝７．８．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｔ ）、０．３ Ｍ Ｎａ０Ａｃ 、および０．５
％ＳＤＳを含有する様調節した後、６５°Ｃで４５分間
インキュベートした。このホスファターゼ処理は、ｐＵ
Ｃ８の自己ライゲーションを防止する。
このＥｃｏＲＩ消化ＢＫウィルスとプラスミドｐＵＣ８
ＤＮＡとを、まず、緩衝化フェノール、次いで、クロロ
ホルムで抽出した。各ＤＮＡ溶液のＮａＣｔｇ度を０．
２５Ｍに調節し、２容量のエタノールを加え、得られた
混合物をドライアイス−エタノール浴中で５分間インキ
ュベートし、遠心してＤＮＡをペレット化することによ
りＤＮＡを収獲した。上清を捨て、ペレットを７０％エ
タノールで洗浄し、乾燥した後、ＢＫ標本およびプラス
ミドｐＵＣ８標本を調製するために、それぞれ、ＴＥバ
ッファー１ｏｌｌｌおよび３ｏμｌに再懸濁した。
ＤＮＡとを、まず、緩衝化フェノール、次いで、クロロ
ホルムで抽出した。各ＤＮＡ溶液のＮａＣｔｇ度を０．
２５Ｍに調節し、２容量のエタノールを加え、得られた
混合物をドライアイス−エタノール浴中で５分間インキ
ュベートし、遠心してＤＮＡをペレット化することによ
りＤＮＡを収獲した。上清を捨て、ペレットを７０％エ
タノールで洗浄し、乾燥した後、ＢＫ標本およびプラス
ミドｐＵＣ８標本を調製するために、それぞれ、ＴＥバ
ッファー１ｏｌｌｌおよび３ｏμｌに再懸濁した。
Ｅｃｏ ＲＩ消化ＢＫウィルス２１ｔｔとＥｃｏＲＩ消
化プラスミドｐＵＣ８ＤＮＡ １μｌの混合物に１１］
×リガーゼバツフアー１ｔｘｔと水約３μｌを加えた。
化プラスミドｐＵＣ８ＤＮＡ １μｌの混合物に１１］
×リガーゼバツフアー１ｔｘｔと水約３μｌを加えた。
このＤＮＡ溶液にＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌ（〜１０
００単位）を加え、得られた反応混合物を１６’ｃで一
部インキユベートした。ライゲートしたＤＮＡは挿入さ
れたＢＫウィルスＤＮＡの方向性のみが異る所望のプラ
スミドｐＢＫＥ１およびｐ ＢＫＥ２を構成していた。
００単位）を加え、得られた反応混合物を１６’ｃで一
部インキユベートした。ライゲートしたＤＮＡは挿入さ
れたＢＫウィルスＤＮＡの方向性のみが異る所望のプラ
スミドｐＢＫＥ１およびｐ ＢＫＥ２を構成していた。
プラスミドｐＢＫＥ１の制限サイトおよび機能地図を添
付の第３図に示す。
付の第３図に示す。
Ｌブロス中の大腸菌に１２ ＪＭ１０３ （ファルマ
シアＰ−Ｌバイオケミカルスから入手可）培養物５０
ｍｅを、６５０ ｎｍにおける光学密度（０，Ｄ。
シアＰ−Ｌバイオケミカルスから入手可）培養物５０
ｍｅを、６５０ ｎｍにおける光学密度（０，Ｄ。
６５０）が約０．４吸収単位になるまで増殖させた。
この培養物を氷上で１０分間冷却し、遠心して細胞を集
めた。この細胞ペレットを１００ｍＭの冷ＭｇＣｚ２
２５−ｔに再懸濁し、氷上で２５分間インキュベートし
た。遠心して細胞を再度ペレット化し、得られたペレッ
トを１００ ｍＭ ノ冷ＣａＣｌ２２．５ｄに再懸濁し
て氷上で３０分間インキュベートした。このインキュベ
ーションの後、細胞は形質転換用ＤＮＡの取込みに受容
能力のある細胞（コンピテント細胞）となる。この方法
は、以後の実施例においても、コンピテント細胞を用い
る必要のある場合に採用される。
めた。この細胞ペレットを１００ｍＭの冷ＭｇＣｚ２
２５−ｔに再懸濁し、氷上で２５分間インキュベートし
た。遠心して細胞を再度ペレット化し、得られたペレッ
トを１００ ｍＭ ノ冷ＣａＣｌ２２．５ｄに再懸濁し
て氷上で３０分間インキュベートした。このインキュベ
ーションの後、細胞は形質転換用ＤＮＡの取込みに受容
能力のある細胞（コンピテント細胞）となる。この方法
は、以後の実施例においても、コンピテント細胞を用い
る必要のある場合に採用される。
この細胞浮遊液２００μｌを上で調製した、ライゲート
したＤＮＡと混合し、氷上で３０分間インキュベートし
た。この期間の終了時に、細胞を４２℃の温水浴中に２
分間、次いで、氷上に戻してさらに１０分間、放置した
。遠心して細胞を収獲し、Ｌブロス１−に再懸濁して３
７°Ｃにおいて１時間インキュベートした。
したＤＮＡと混合し、氷上で３０分間インキュベートし
た。この期間の終了時に、細胞を４２℃の温水浴中に２
分間、次いで、氷上に戻してさらに１０分間、放置した
。遠心して細胞を収獲し、Ｌブロス１−に再懸濁して３
７°Ｃにおいて１時間インキュベートした。
この細胞混合物の一部を、アンピシリン１００１ｔｆ／
ｍｌ、 Ｘ −ｇａｌ ４０μｙ／−およびＩＰＴＧ
４０μｙ ／ ｍｅを含んだＬ−寒天（１／あたり寒
天１５ｙを含有するしグロス）プレート上においた。こ
のプレートを３７°Ｃで一部インキユベートシタ。挿入
体を含まないプラスミドを含有するコロニー（例、大腸
菌に１２ ＪＭ１０３／ｐＵｃ８）は、これらのプレー
ト上で青色を呈する。挿入体を含んだプラスミドを含有
するコロニー（例、大腸菌に１２ＪＭ１０３／ｐＢＫＥ
１ ）は白色を呈する。数個の白色コロニーを選択し
、そのプラスミドＤＮＡ１、ＢＫウィルスの〜５．２
ｋｂ ＥｃｏＲＩ制限フラグメントの存在に関して制限
酵素分析法てスクリーニングした。大腸菌に１２ ＪＭ
１０３／ｐＢＫＥ１および大腸菌に１２ ＪＭ１０３／
ｐＢＫＥ２細胞からのプラスミドＤＮ’Ａの取得は、実
質上、後述の実施例に記載されているプラスミドＤＮＡ
単離法に従って行われた。ただし、方法は小規模に行わ
れ、また、単に制限酵素分析のためにプラスミドＤＮＡ
を単離する場合にはＣｓ Ｃｌグラデイエント工程を省
略した。
ｍｌ、 Ｘ −ｇａｌ ４０μｙ／−およびＩＰＴＧ
４０μｙ ／ ｍｅを含んだＬ−寒天（１／あたり寒
天１５ｙを含有するしグロス）プレート上においた。こ
のプレートを３７°Ｃで一部インキユベートシタ。挿入
体を含まないプラスミドを含有するコロニー（例、大腸
菌に１２ ＪＭ１０３／ｐＵｃ８）は、これらのプレー
ト上で青色を呈する。挿入体を含んだプラスミドを含有
するコロニー（例、大腸菌に１２ＪＭ１０３／ｐＢＫＥ
１ ）は白色を呈する。数個の白色コロニーを選択し
、そのプラスミドＤＮＡ１、ＢＫウィルスの〜５．２
ｋｂ ＥｃｏＲＩ制限フラグメントの存在に関して制限
酵素分析法てスクリーニングした。大腸菌に１２ ＪＭ
１０３／ｐＢＫＥ１および大腸菌に１２ ＪＭ１０３／
ｐＢＫＥ２細胞からのプラスミドＤＮ’Ａの取得は、実
質上、後述の実施例に記載されているプラスミドＤＮＡ
単離法に従って行われた。ただし、方法は小規模に行わ
れ、また、単に制限酵素分析のためにプラスミドＤＮＡ
を単離する場合にはＣｓ Ｃｌグラデイエント工程を省
略した。
実施例１０ プラスミドｐＢＫ ｎｅｏ １および１）
ＢＫ ｎｅｏ ２の組立て 大腸菌Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅ。
ＢＫ ｎｅｏ ２の組立て 大腸菌Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅ。
細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンから、寄託番号ＡＴＣＣ３７２２４の下、凍結乾燥品
の形で得すことができる。この凍結乾燥細胞をアンピシ
リン１００μｙ／ｉ含有り一寒天プレート上におき、３
７℃でインキュベートして単一のコロニー単離体を得る
。
ンから、寄託番号ＡＴＣＣ３７２２４の下、凍結乾燥品
の形で得すことができる。この凍結乾燥細胞をアンピシ
リン１００μｙ／ｉ含有り一寒天プレート上におき、３
７℃でインキュベートして単一のコロニー単離体を得る
。
アンピシリン５０μｙ／ｍｔを含んだＬブロス１１に、
大腸菌に１２ＨＢ１０１／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅ。
大腸菌に１２ＨＢ１０１／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅ。
のコロニーを接種し、空気振とう４中、３７°Ｃにおい
て、Ｏ，Ｄ、５９０が〜１吸収単位になるまでインキュ
ベートシタ後、クロラムフェニコール１５０■を培養に
加えた。約１６時間インキュベーションを続けた；クロ
ラムフェニコールの添加にヨリタンパク竹の合成が阻害
され、その結果、以後の細胞分裂が阻害されるが、プラ
スミドの複製は継続される。
て、Ｏ，Ｄ、５９０が〜１吸収単位になるまでインキュ
ベートシタ後、クロラムフェニコール１５０■を培養に
加えた。約１６時間インキュベーションを続けた；クロ
ラムフェニコールの添加にヨリタンパク竹の合成が阻害
され、その結果、以後の細胞分裂が阻害されるが、プラ
スミドの複製は継続される。
培養を、５ｏｒｖａｌ Ｉ Ｇ Ｓ Ａローター（デ
ュポンＣｏ。
ュポンＣｏ。
インスッルメンツ・プロダクツ、バイオメディカル・デ
ィビジョン、ニュータウン、ＣＮ０６４７０）中、４℃
において、６０００ ｒｐｍで５分間遠心した。上清を
捨て、細胞ペレットをＴＢＳバッファ（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ −ＨＣｌ、 Ｉ）Ｈニア、５、１０ｍＭＮａＣ１
および１ｍＭ ＥＤＴＡ ）４０−て洗浄した後、再度
ペレット化した。上清を捨て、ドライアイス−エタノー
ル浴中で細胞ペレットを凍結した後、解凍した。解凍し
た細胞を２５％スクロースと５゜ｍＭＥＤＴＡの溶液１
０−に再懸濁した。５＃Ｉｆ／＋ｉリゾチーム溶液約１
ｍｅ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８、Ｑ）３ｙ、
および１０ ｑ／ｍｌ ＲＮＡ５ｅＡ １００μｔをこ
の溶液ζこ加えた後、氷上で１５分間インキュベートし
た。溶解溶液（１０％Ｔｒｉｔｏｎ −Ｘ １００３１
、Ｉ／、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ＝８．０．７５
ｍｌ、１Ｍ水 Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ、 ｐＨ−＝８．０、ｌ ５ ｔｒ
ｉおよびＮｍｅを混合して調製）３ｆｆＩ／をリゾチー
ム処理細胞に加えて混合し、得られた溶液を氷上でさら
に１５分間インキュベートした。溶解した細胞をドライ
アイス−エタノール浴中で凍結した後、解凍した。
ィビジョン、ニュータウン、ＣＮ０６４７０）中、４℃
において、６０００ ｒｐｍで５分間遠心した。上清を
捨て、細胞ペレットをＴＢＳバッファ（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ −ＨＣｌ、 Ｉ）Ｈニア、５、１０ｍＭＮａＣ１
および１ｍＭ ＥＤＴＡ ）４０−て洗浄した後、再度
ペレット化した。上清を捨て、ドライアイス−エタノー
ル浴中で細胞ペレットを凍結した後、解凍した。解凍し
た細胞を２５％スクロースと５゜ｍＭＥＤＴＡの溶液１
０−に再懸濁した。５＃Ｉｆ／＋ｉリゾチーム溶液約１
ｍｅ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８、Ｑ）３ｙ、
および１０ ｑ／ｍｌ ＲＮＡ５ｅＡ １００μｔをこ
の溶液ζこ加えた後、氷上で１５分間インキュベートし
た。溶解溶液（１０％Ｔｒｉｔｏｎ −Ｘ １００３１
、Ｉ／、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ＝８．０．７５
ｍｌ、１Ｍ水 Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ、 ｐＨ−＝８．０、ｌ ５ ｔｒ
ｉおよびＮｍｅを混合して調製）３ｆｆＩ／をリゾチー
ム処理細胞に加えて混合し、得られた溶液を氷上でさら
に１５分間インキュベートした。溶解した細胞をドライ
アイス−エタノール浴中で凍結した後、解凍した。
５Ｗ２７０−ター（ベックマン、７３６ＯＮ、リンカー
ンアベニュー、リンカーンウッド、ＩＬ６０６４６）中
、２５．ＯＯＯｒｐｍで４０分間遠心し、緩衝化フェノ
ールで抽出することにより、溶液中の細胞破片を除去し
た。この細胞抽出物にＣｓ Ｃ／約３０．４４ｙと５〜
／ｍｅ臭化エチジウム溶液〜１ｍｌを加え、溶液の容量
をＴＢＳバッファーで４０ｄに調節した。この溶液をＶ
Ｔｉ ５０超遠心管（ベックマン）にデカントした後、
シールし、ｖＴ１５０−ター中、４２．００ Ｏｒｐｍ
て〜１６時間遠心し離した後、Ｔｉ７５管およびロー
ター（ベックマン）内に入れ、５０．００Ｏｒｐｍで１
６時間遠心した。
ンアベニュー、リンカーンウッド、ＩＬ６０６４６）中
、２５．ＯＯＯｒｐｍで４０分間遠心し、緩衝化フェノ
ールで抽出することにより、溶液中の細胞破片を除去し
た。この細胞抽出物にＣｓ Ｃ／約３０．４４ｙと５〜
／ｍｅ臭化エチジウム溶液〜１ｍｌを加え、溶液の容量
をＴＢＳバッファーで４０ｄに調節した。この溶液をＶ
Ｔｉ ５０超遠心管（ベックマン）にデカントした後、
シールし、ｖＴ１５０−ター中、４２．００ Ｏｒｐｍ
て〜１６時間遠心し離した後、Ｔｉ７５管およびロー
ター（ベックマン）内に入れ、５０．００Ｏｒｐｍで１
６時間遠心した。
容量の調節が必要とされる場合には、常に、０７６１ｙ
／ ｍｅのＣｓ Ｃｌを含有するＴＥを用いて行った
。
／ ｍｅのＣｓ Ｃｌを含有するＴＥを用いて行った
。
再びプラスミドバンドを単離し、塩−飽和インプロパノ
ールで抽出して臭化エチジウムを除去し、ＴＥＳバッフ
ァーで１＝３に希釈した。次いで、この溶液に２容量の
エタノールを加えた後、−２０℃で一部インキユベート
した。溶液を、５Ｓ３４０−ター（５ｏｒｖａｌｌ ）
内で１０，０００ ｒｐｍにおいて１５分間遠心するこ
とによりプラスミドＤＮＡをペレット化した。
ールで抽出して臭化エチジウムを除去し、ＴＥＳバッフ
ァーで１＝３に希釈した。次いで、この溶液に２容量の
エタノールを加えた後、−２０℃で一部インキユベート
した。溶液を、５Ｓ３４０−ター（５ｏｒｖａｌｌ ）
内で１０，０００ ｒｐｍにおいて１５分間遠心するこ
とによりプラスミドＤＮＡをペレット化した。
この方法で得たプラスミドｐｄＢＰＶ−ＦｖＩＭＴｎｅ
。
。
ＤＮＡ−１■をＴＥバッファー１ ｄに懸濁し、−２０
°Ｃで保存した。上記のプラスミド単離法は、以後の実
施例を通じて、大量の、非常に純度の高いプラスミドを
必要きする場合に一般的に用いられる。この方法は、形
質転換体を特定のプラスミドの存在に関してスクリーニ
ングする場合の如く、より純度の低いＤＮＡを少量、迅
速に必要とするときには、培養細胞を５−程度だけ用い
、この細胞を適宜スケールダウンした量の溶解バッファ
ーに溶解し、さらに、遠心工程をフェノールおよびクロ
ロホルム抽出で置きかえることによって改良してもよい
。
°Ｃで保存した。上記のプラスミド単離法は、以後の実
施例を通じて、大量の、非常に純度の高いプラスミドを
必要きする場合に一般的に用いられる。この方法は、形
質転換体を特定のプラスミドの存在に関してスクリーニ
ングする場合の如く、より純度の低いＤＮＡを少量、迅
速に必要とするときには、培養細胞を５−程度だけ用い
、この細胞を適宜スケールダウンした量の溶解バッファ
ーに溶解し、さらに、遠心工程をフェノールおよびクロ
ロホルム抽出で置きかえることによって改良してもよい
。
上で調製したプラスミドｐｄ Ｂ Ｐ Ｖ −ＭＭＴ
ｎｅ。
ｎｅ。
ＤＮＡ約５μｙ（５μｌ）と実施例８で調製したＢＫウ
ィルスＤＮＡ５μｙ（５μｌ）を、それぞれ、ＩＯＸＢ
ａｍＨＩバッファー（１，５Ｍ ＮａＣ１，６０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ＝７．９．６０ ｍ、Ｍ Ｍｇ
Ｃｌ２、および１■／ｍｅ ＢＳＡ ） ２ ｔｔｐ、
制限酵素ＢａｍＨ１１μｌ、および水７μｌを含んだ溶
液中、３７℃において２時間、消化した。等容量のフェ
ノールで抽出した後、クロロホルムで２回抽出すること
により反応を停止させた。各ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡが沈
殿するので、これを遠心して集め、水５μｌに再懸濁し
た。
ィルスＤＮＡ５μｙ（５μｌ）を、それぞれ、ＩＯＸＢ
ａｍＨＩバッファー（１，５Ｍ ＮａＣ１，６０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ＝７．９．６０ ｍ、Ｍ Ｍｇ
Ｃｌ２、および１■／ｍｅ ＢＳＡ ） ２ ｔｔｐ、
制限酵素ＢａｍＨ１１μｌ、および水７μｌを含んだ溶
液中、３７℃において２時間、消化した。等容量のフェ
ノールで抽出した後、クロロホルムで２回抽出すること
により反応を停止させた。各ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡが沈
殿するので、これを遠心して集め、水５μｌに再懸濁し
た。
ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐ ｄ Ｂ Ｐ Ｖ −ＭＭ
Ｔ ｎｅｏ １１ｉｔおよびＢａｍＨＩ消化ＢＫウィル
スＤＮＡ］μｚの混合物にＩ Ｑ Ｘ ＩＪガーゼバッ
ファー約１μｌを加えた。このＤＮＡの混合物にＴ４Ｄ
Ｎ八リガーゼ１１ｔｔＣ〜１０００単位）と水６μｌと
を加えた後、得られた反応混合物を１６°Ｃで一部イン
キユヘートした。ライゲートしたＤＮＡは、ＢＫウィル
スＤＮＡの方向性のみが異っている、所望のプラスミド
ｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２を構成していた。
Ｔ ｎｅｏ １１ｉｔおよびＢａｍＨＩ消化ＢＫウィル
スＤＮＡ］μｚの混合物にＩ Ｑ Ｘ ＩＪガーゼバッ
ファー約１μｌを加えた。このＤＮＡの混合物にＴ４Ｄ
Ｎ八リガーゼ１１ｔｔＣ〜１０００単位）と水６μｌと
を加えた後、得られた反応混合物を１６°Ｃで一部イン
キユヘートした。ライゲートしたＤＮＡは、ＢＫウィル
スＤＮＡの方向性のみが異っている、所望のプラスミド
ｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２を構成していた。
プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの制限サイトおよび機能地図
を添付の第４図に示す。
を添付の第４図に示す。
大腸菌に１２ＨＢ１０１細胞は、ＮＲＲＬから、寄託番
号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２６の下、凍結乾燥品の形で入
手可能である。大腸菌に１２ＨＢ１０１細胞を培養して
形質転換受容能を与え、上で調製した、ライゲートした
ＤＮＡで形質転換した。形質転換した細胞をアンピシリ
ン１００μｇ／ｘ＋ｌを含んだし一寒天プレート上で平
板培養した。大腸菌に１２ＨＢＩＯＩ／ｐＢＫｎｅｏ
１および大腸菌に１２／ｐＢＫｎｅｏ ２形質転換体を
、そのアンピシリン耐性表現型とプラスミドＤＮＡの制
限酵素分析によって同定した。
号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２６の下、凍結乾燥品の形で入
手可能である。大腸菌に１２ＨＢ１０１細胞を培養して
形質転換受容能を与え、上で調製した、ライゲートした
ＤＮＡで形質転換した。形質転換した細胞をアンピシリ
ン１００μｇ／ｘ＋ｌを含んだし一寒天プレート上で平
板培養した。大腸菌に１２ＨＢＩＯＩ／ｐＢＫｎｅｏ
１および大腸菌に１２／ｐＢＫｎｅｏ ２形質転換体を
、そのアンピシリン耐性表現型とプラスミドＤＮＡの制
限酵素分析によって同定した。
実施例１１ プラスミドｐＢＬｃａｔの組立てイズ約３
５．９４ｋｂ の三木鎖線状分子である。
５．９４ｋｂ の三木鎖線状分子である。
Ａｄ２後期プロモーターは、Ａｄ２ゲノムの〜０．３１
６ｋｂ Ａｃｃ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ 制限フラグメン
ト上に単離される。この〜０．３２ ｋｂ制限フラグメ
ントはＡｄ２ゲノムのヌクレオチド５７５５〜６０７１
位の間の配列に対応している。所望の〜０．３２ ｋｂ
Ａｃｃ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ制限フラグメントを単離
するために、Ａｄ２ＤＮＡをまず、制限酵素Ｂａ１Ｉで
消化して〜０，３２ｋｂ Ａｃｃ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ
制限フラグメントの全配列を含有している〜２．４ ｋ
ｂ Ｂａｌ Ｉ制限フラグメントを単離する。次に、こ
の〜２．４ ｋｂ Ｂａｌ Ｉ制限フラグメントをＡｃ
ｃＩとＰｖｕ ＩＩで消化することにより、所望のフラ
グメントを得る。
６ｋｂ Ａｃｃ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ 制限フラグメン
ト上に単離される。この〜０．３２ ｋｂ制限フラグメ
ントはＡｄ２ゲノムのヌクレオチド５７５５〜６０７１
位の間の配列に対応している。所望の〜０．３２ ｋｂ
Ａｃｃ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ制限フラグメントを単離
するために、Ａｄ２ＤＮＡをまず、制限酵素Ｂａ１Ｉで
消化して〜０，３２ｋｂ Ａｃｃ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ
制限フラグメントの全配列を含有している〜２．４ ｋ
ｂ Ｂａｌ Ｉ制限フラグメントを単離する。次に、こ
の〜２．４ ｋｂ Ｂａｌ Ｉ制限フラグメントをＡｃ
ｃＩとＰｖｕ ＩＩで消化することにより、所望のフラ
グメントを得る。
Ａｄ２ＤＮＡ（ＢＲＬから入手可）約５０μ７を水８０
ｔｔｔｒおよび１０ＸＢａｌＩバツフアー（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ、ｐＨ＝７．６．１２０ ｍＭ
ＭｇＣｌ２．１００ｍＭＤＤＴ、および１ ｍｑ／ｍｔ
ＢＳＡ ） １０ｔｔｌＩコ溶かす。このＡｄ２
ＤＮＡ溶液に制限酵素Ｂａｌ■約１０μｍ！（約２０単
位）を加え、得られた反応混合物ヲ、３７°Ｃで４時間
インキュベートする０ＢａｌＩ消化ＤＮＡをアゴ０−ス
ゲル上に充填し・制限フラグメントが充分に分離するま
で電気泳動する。ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液（０
，５μ７／ｍ／）で染色し、染色されたゲルに長波長の
紫外（ＵＶ）線を照射することにより電気泳動されたＤ
ＮＡの観察を行う。アガロースからのＤＮＡ単ＭＩ法の
１つを以下に示す。所望のフラグメントの前方に細いス
リットを設け、ＮＡ−４５ＤＥＡＥメンプラン〔シライ
ヒヤー（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ）およびシュエル（５
ｃｈｕｅｌｌ ）、ケーン（Ｋｅｅｎ） ＮＨＯ３４３
１〕の小片ヲ各スリット内におく。さらに電気泳動する
と、ＤＮＡは、ＤＥＡＥメンプランと非共有結合的に結
合する。ＤＥＡＥメンプランに所望のフラグメントが結
合した後、該メンプラン車を除イテ低塩ｔ＜ツ”）アー
（１００ｍＭ ＫＣｚ、０．１ｍＭＥＤＴＡおよび２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ ％ｐ Ｈ＝８）で洗浄す
る。次いで、このメンプランを小さい管ニ入れ、高塩バ
ッファ （ＩＭＮａＣｌ、０，１ｍＭ ＥＤＴＡ、お
よび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ＝８）に浸
漬した後、６５℃で１時間インキユベートシ、ＤＥＡＥ
紙からＤＮＡを除去する。６５℃でのインキュベーショ
ンの後、インキュベーションバッファーを集め、高塩バ
ッファーでメンプランを洗浄する。この高塩洗浄液を高
塩インキコ。
ｔｔｔｒおよび１０ＸＢａｌＩバツフアー（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ、ｐＨ＝７．６．１２０ ｍＭ
ＭｇＣｌ２．１００ｍＭＤＤＴ、および１ ｍｑ／ｍｔ
ＢＳＡ ） １０ｔｔｌＩコ溶かす。このＡｄ２
ＤＮＡ溶液に制限酵素Ｂａｌ■約１０μｍ！（約２０単
位）を加え、得られた反応混合物ヲ、３７°Ｃで４時間
インキュベートする０ＢａｌＩ消化ＤＮＡをアゴ０−ス
ゲル上に充填し・制限フラグメントが充分に分離するま
で電気泳動する。ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液（０
，５μ７／ｍ／）で染色し、染色されたゲルに長波長の
紫外（ＵＶ）線を照射することにより電気泳動されたＤ
ＮＡの観察を行う。アガロースからのＤＮＡ単ＭＩ法の
１つを以下に示す。所望のフラグメントの前方に細いス
リットを設け、ＮＡ−４５ＤＥＡＥメンプラン〔シライ
ヒヤー（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ）およびシュエル（５
ｃｈｕｅｌｌ ）、ケーン（Ｋｅｅｎ） ＮＨＯ３４３
１〕の小片ヲ各スリット内におく。さらに電気泳動する
と、ＤＮＡは、ＤＥＡＥメンプランと非共有結合的に結
合する。ＤＥＡＥメンプランに所望のフラグメントが結
合した後、該メンプラン車を除イテ低塩ｔ＜ツ”）アー
（１００ｍＭ ＫＣｚ、０．１ｍＭＥＤＴＡおよび２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ ％ｐ Ｈ＝８）で洗浄す
る。次いで、このメンプランを小さい管ニ入れ、高塩バ
ッファ （ＩＭＮａＣｌ、０，１ｍＭ ＥＤＴＡ、お
よび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ＝８）に浸
漬した後、６５℃で１時間インキユベートシ、ＤＥＡＥ
紙からＤＮＡを除去する。６５℃でのインキュベーショ
ンの後、インキュベーションバッファーを集め、高塩バ
ッファーでメンプランを洗浄する。この高塩洗浄液を高
塩インキコ。
ベーション液と一緒にプールする。
この高塩ＤＮＡ溶液の容量を、ＮａＣｔ濃度が０．２５
Ｍになる様、調節した後、冷たい無水エタノール３容量
をこの溶液に加える。得られた溶液を混合した後、−７
０℃で１０〜２０分間放置する。次いて、この溶液を１
５．００ Ｏｒｐｍで１５分間遠心する。もう一度沈殿
させて残存する塩を除き、ＤＮＡペレットをエタノール
で洗浄した後、乾燥し、ＴＥバッファー２０μｌに再懸
濁すると、これは、所望のＡｄ２の制限フラグメント約
３μノで構成されている。得られた精製フラグメントを
ＴＥバッファー１０μｌに溶かす。
Ｍになる様、調節した後、冷たい無水エタノール３容量
をこの溶液に加える。得られた溶液を混合した後、−７
０℃で１０〜２０分間放置する。次いて、この溶液を１
５．００ Ｏｒｐｍで１５分間遠心する。もう一度沈殿
させて残存する塩を除き、ＤＮＡペレットをエタノール
で洗浄した後、乾燥し、ＴＥバッファー２０μｌに再懸
濁すると、これは、所望のＡｄ２の制限フラグメント約
３μノで構成されている。得られた精製フラグメントを
ＴＥバッファー１０μｌに溶かす。
Ａｄ２の〜２．４ ｋｂ Ｂａｌ ｎ制限フラグメント
の溶液に水約６μｊおよび１０ＸＡｃｃＩバツフアー（
６０ｍＭＮａＣ／、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐＨ
＝７．５．６０ ｍＭ ＭｇＣｌ２．５０ｍＭＤＤＴ、
および１町−ＢＳＡ）２μｌを加える。このＤＮＡ溶液
に制限酵素Ａｃｃｌ約２ ＩＩ／ （〜１０単位）を加
えた後、反応混合物を３７℃で２時間インキュベートす
る。
の溶液に水約６μｊおよび１０ＸＡｃｃＩバツフアー（
６０ｍＭＮａＣ／、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐＨ
＝７．５．６０ ｍＭ ＭｇＣｌ２．５０ｍＭＤＤＴ、
および１町−ＢＳＡ）２μｌを加える。このＤＮＡ溶液
に制限酵素Ａｃｃｌ約２ ＩＩ／ （〜１０単位）を加
えた後、反応混合物を３７℃で２時間インキュベートす
る。
ＡｃｃＩ消化の後、エタノール沈殿によりＤＮＡを集め
、水１６ ｔｔｉおよび１０ＸＰｖｕＩＩバツフアー（
６００ｍＭ ＮａＣｚ、 ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１
％ｐＨ＝７．５．６０ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃ／ ２．６０
ｍＭＤＤＴおよび１ ！ ／ ｄＢＳＡ）２μｌに再懸
濁する。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｐｖｕ ＩＩ約２μ
ｌ（約１０単位）を加えた後、反応混合物を３７℃で２
時間インキュベートする。
、水１６ ｔｔｉおよび１０ＸＰｖｕＩＩバツフアー（
６００ｍＭ ＮａＣｚ、 ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１
％ｐＨ＝７．５．６０ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃ／ ２．６０
ｍＭＤＤＴおよび１ ！ ／ ｄＢＳＡ）２μｌに再懸
濁する。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｐｖｕ ＩＩ約２μ
ｌ（約１０単位）を加えた後、反応混合物を３７℃で２
時間インキュベートする。
Ａｃｅ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ消化した、Ａｄ２の〜２．
４ｋｂＢａｌＩ制限フラグメントを〜６％ポリアクリル
アミドゲルに充填し、Ａｄ２後期プロモーターを含有す
る〜０．３２ｋｂ Ａｃｃ Ｉ−ＰｖｕＩ［制限フラグ
メントが他の消化産物から分離されるまで電気泳動する
。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光を用いて観察
し、〜０．３２ ｋｂ Ａｃｅ Ｉ−ＰｖｕｌＩ制限フ
ラグメントを含有するゲルのセグメントをゲルから切り
取り、破砕し、抽出バッフアール２５０μ！中に、−夜
室温で浸漬する。翌朝、混合物を遠心し、ペレットを捨
てる。上清中のＤＮＡをエタノールで沈殿させ、約２μ
）のｔＲＮＡを加えて所望のフラグメントを確実に沈殿
させる。〜０．３２ ｋｂ Ａｃｃｌ −Ｐｖｕ Ｉｎ
制限フラグメント約０．２μノを得、水７μｌに懸濁す
る。
４ｋｂＢａｌＩ制限フラグメントを〜６％ポリアクリル
アミドゲルに充填し、Ａｄ２後期プロモーターを含有す
る〜０．３２ｋｂ Ａｃｃ Ｉ−ＰｖｕＩ［制限フラグ
メントが他の消化産物から分離されるまで電気泳動する
。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光を用いて観察
し、〜０．３２ ｋｂ Ａｃｅ Ｉ−ＰｖｕｌＩ制限フ
ラグメントを含有するゲルのセグメントをゲルから切り
取り、破砕し、抽出バッフアール２５０μ！中に、−夜
室温で浸漬する。翌朝、混合物を遠心し、ペレットを捨
てる。上清中のＤＮＡをエタノールで沈殿させ、約２μ
）のｔＲＮＡを加えて所望のフラグメントを確実に沈殿
させる。〜０．３２ ｋｂ Ａｃｃｌ −Ｐｖｕ Ｉｎ
制限フラグメント約０．２μノを得、水７μｌに懸濁す
る。
約０．２５μｙ（ｏ、ｓμｌ中）のＢｃｌＩリンカ−（
５−ＣＴＧＡＴＣＡＧ−３、ニューイングランドバイオ
ラボから入手可）をキナーゼ処理し、下記の方法でライ
ゲーションのために調製した。リンカ−４ｔｔｔｃ〜２
μｙ）を水２０．１５１１ｒ と１０×キナーゼバツフ
アー（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｚ、 ｐＨ＝７．６
および１００ ｍＭ ＭｇＣ／２ ） ５ ｔｉｐに溶
かし、９０℃で２分間インキュベートした後、室温に冷
却した。
５−ＣＴＧＡＴＣＡＧ−３、ニューイングランドバイオ
ラボから入手可）をキナーゼ処理し、下記の方法でライ
ゲーションのために調製した。リンカ−４ｔｔｔｃ〜２
μｙ）を水２０．１５１１ｒ と１０×キナーゼバツフ
アー（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｚ、 ｐＨ＝７．６
および１００ ｍＭ ＭｇＣ／２ ） ５ ｔｉｐに溶
かし、９０℃で２分間インキュベートした後、室温に冷
却した。
この混合物に〔γ−３２Ｐ ］ −ＡＴＰ （〜２０μ
ＣＩ）５μｌ、ＩＭＤＴＴ２．５μｌ およびポリヌク
レオチドキナーゼ（〜１０単位）５μｌを加え、３７℃
で３０分間インキュベートした。次いで、０．０１ＭＡ
ＴＰ３．３５μｌとキナーゼ５μｌとを加え、３７℃に
おいてさらに３０分間、反応を続けた。リンカ−が標的
ＤＮＡにライゲートしたか否かを決定するためには放射
活性なＡＴＰが役立つ。
ＣＩ）５μｌ、ＩＭＤＴＴ２．５μｌ およびポリヌク
レオチドキナーゼ（〜１０単位）５μｌを加え、３７℃
で３０分間インキュベートした。次いで、０．０１ＭＡ
ＴＰ３．３５μｌとキナーゼ５μｌとを加え、３７℃に
おいてさらに３０分間、反応を続けた。リンカ−が標的
ＤＮＡにライゲートしたか否かを決定するためには放射
活性なＡＴＰが役立つ。
このキナーゼ処理したリンカ−を〜Ｑ、３２ｋｂＡｃｅ
Ｉ −Ｐｖｕ Ｉ［制限フラグメントの溶液に加えた
後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌ（〜１０００単位）お
よび１０×リガーゼバツフアーｌｌ１ｌをこのＤＮＡ溶
液に加えた。得られた反応混合物を１６°Ｃで一部イン
キユベートした。ＢｃｌＩリンカ−は、Ａｃｃ Ｉ −
Ｐｖｕ ｎ制限フラグメントのＰｖｕ ＩＩ末端とのみ
ライゲートし得た。後のＤＮＡ配列決定により、Ａｃｃ
Ｉ −Ｐｖｕ Ｉｎ制限フラグメントのＰｖｕ ＩＩ
末端に４個のＢｃｌＩＩＪンカーが結合していることが
分った。これらの余分のＢｃｌＩ’Ｊンカーは、Ｂｃｌ
Ｉ消化した後、再ライゲーションすることで除去し得る
が、これらのリンカ−はベクターの適切な機能を干渉し
ないので、余分なりｃｌＩ’Ｊンカーの除去は行わなか
った。
Ｉ −Ｐｖｕ Ｉ［制限フラグメントの溶液に加えた
後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌ（〜１０００単位）お
よび１０×リガーゼバツフアーｌｌ１ｌをこのＤＮＡ溶
液に加えた。得られた反応混合物を１６°Ｃで一部イン
キユベートした。ＢｃｌＩリンカ−は、Ａｃｃ Ｉ −
Ｐｖｕ ｎ制限フラグメントのＰｖｕ ＩＩ末端とのみ
ライゲートし得た。後のＤＮＡ配列決定により、Ａｃｃ
Ｉ −Ｐｖｕ Ｉｎ制限フラグメントのＰｖｕ ＩＩ
末端に４個のＢｃｌＩＩＪンカーが結合していることが
分った。これらの余分のＢｃｌＩ’Ｊンカーは、Ｂｃｌ
Ｉ消化した後、再ライゲーションすることで除去し得る
が、これらのリンカ−はベクターの適切な機能を干渉し
ないので、余分なりｃｌＩ’Ｊンカーの除去は行わなか
った。
大腸菌に１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＳＶ２ｃａｔ細胞を、寄
託番号ＡＴＣＣ３７１５５の下、ＡＴＣＣから凍結乾燥
品の形で入手し、該細胞からプラスミドｐＳＶ２ｃａｔ
ＤＮＡを単離した。プラスミドｐＳＶ２ｃａｔの制限サ
イトおよび機能地図を添付の第５図に示す。プラスミド
ｐＳＶ２Ｃａｔ ＤＮＡ約１■を得、ＴＥバッファー１
ｄに溶かした。プラスミドｐＳＶ２ｃａｔＤＮＡ約３
μｙ （３μｔ ）を１０ ｘ Ａｃｃ Ｉバッファー
２μｌおよび水１６μｌに加え、次いで、このｐＳＶ２
ｃａｔＤＮＡの溶液に制限酵素Ａｃｃ Ｉ ３ ／ｉｔ
（約９単位）を加え、得られた反応混合物を３７℃で２
時間インキュベートした。次いで、ＡｃｃＩ消化プラス
ミドｐＳＶ２ｃａｔＤＮＡに１０ＸＳｔｕｌバツフアー
（１，０Ｍ ＮａＣ！、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｚ、ｐＨ＝８．０．１００ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃｒ２．６
０ｍＭＤＴＴおよび１＝ｖ／Ｉｎ１ＢＳＡ）３μｌ、水
５μｌ および制限酵素、Ｓｔｕ Ｉ約２μ！（約１０
単位）を加えて制限酵素Ｓｔｕ Ｉで消化した。得られ
た反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。
託番号ＡＴＣＣ３７１５５の下、ＡＴＣＣから凍結乾燥
品の形で入手し、該細胞からプラスミドｐＳＶ２ｃａｔ
ＤＮＡを単離した。プラスミドｐＳＶ２ｃａｔの制限サ
イトおよび機能地図を添付の第５図に示す。プラスミド
ｐＳＶ２Ｃａｔ ＤＮＡ約１■を得、ＴＥバッファー１
ｄに溶かした。プラスミドｐＳＶ２ｃａｔＤＮＡ約３
μｙ （３μｔ ）を１０ ｘ Ａｃｃ Ｉバッファー
２μｌおよび水１６μｌに加え、次いで、このｐＳＶ２
ｃａｔＤＮＡの溶液に制限酵素Ａｃｃ Ｉ ３ ／ｉｔ
（約９単位）を加え、得られた反応混合物を３７℃で２
時間インキュベートした。次いで、ＡｃｃＩ消化プラス
ミドｐＳＶ２ｃａｔＤＮＡに１０ＸＳｔｕｌバツフアー
（１，０Ｍ ＮａＣ！、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｚ、ｐＨ＝８．０．１００ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃｒ２．６
０ｍＭＤＴＴおよび１＝ｖ／Ｉｎ１ＢＳＡ）３μｌ、水
５μｌ および制限酵素、Ｓｔｕ Ｉ約２μ！（約１０
単位）を加えて制限酵素Ｓｔｕ Ｉで消化した。得られ
た反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。
反応混合物をフェノールで１回、次いでクロロホルムで
２回抽出することにより反応を終了させた。所望のフラ
グメント約０．５μノを得、これをＴＥバッファー２０
μｌに溶かした。
２回抽出することにより反応を終了させた。所望のフラ
グメント約０．５μノを得、これをＴＥバッファー２０
μｌに溶かした。
Ａｃｃ Ｉ −Ｓｔｕ Ｉ消化プラスミドｐＳＶ２ｃａ
ｔＤＮＡ約４ μｔとＡｄ２の〜０．３２ ｋｂ Ａｃ
ｃ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ （’ Ｂｃｌ Ｉ ’Ｊンカ
ーが結合したもの）制限フラグメントとを混合した後、
１０×リガーゼバツフアー３μｌ、水１５μｌおよびＴ
４ＤＮＡリガーゼ２μｌ（約１０００単位）を加え、こ
のライゲーション反応混合物を１６°Ｃで一部インキユ
ベートした。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミド
ｐＬＰｃａｔ、即ち、Ａｄ２後期プロモータを、クロラ
ムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子転
写させ、さらに発現させる位置に含有しているプラスミ
ドを構成していた。プラスミドｐＬＰｃａｔ の制限
サイトおよび機能地図を添付の第６図に示す。
ｔＤＮＡ約４ μｔとＡｄ２の〜０．３２ ｋｂ Ａｃ
ｃ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ （’ Ｂｃｌ Ｉ ’Ｊンカ
ーが結合したもの）制限フラグメントとを混合した後、
１０×リガーゼバツフアー３μｌ、水１５μｌおよびＴ
４ＤＮＡリガーゼ２μｌ（約１０００単位）を加え、こ
のライゲーション反応混合物を１６°Ｃで一部インキユ
ベートした。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミド
ｐＬＰｃａｔ、即ち、Ａｄ２後期プロモータを、クロラ
ムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子転
写させ、さらに発現させる位置に含有しているプラスミ
ドを構成していた。プラスミドｐＬＰｃａｔ の制限
サイトおよび機能地図を添付の第６図に示す。
ライゲートしたＤＮＡを用いて大腸菌に１２ＨＢ１０１
細胞を形質転換し、形質転換された細胞をアンピシリン
５０μｙ／ｍｅを含んだし寒天上で平板培養した。大腸
菌に１２ＨＢｉＯ１／ｐＬＰｃａｔ形質転換体を同定す
るのにプラスミドＤＮＡの制限酵素分析を利用した。次
いで、形質転換体からプラスミドｐＬＰｃａｔＤＮＡを
単離し、以後のベクターの組立てに供した。
細胞を形質転換し、形質転換された細胞をアンピシリン
５０μｙ／ｍｅを含んだし寒天上で平板培養した。大腸
菌に１２ＨＢｉＯ１／ｐＬＰｃａｔ形質転換体を同定す
るのにプラスミドＤＮＡの制限酵素分析を利用した。次
いで、形質転換体からプラスミドｐＬＰｃａｔＤＮＡを
単離し、以後のベクターの組立てに供した。
Ｂ、プラスミドｐＢＬｃａｔの最終組立てＴＥバッファ
ー５０μｌ中のプラスミドｐＢＫｎｅｏｌＤＮＡ約８８
μノを１０ＸＡｃｃＩバツフアー７、５ μｌ、水３０
＃、および制限酵素Ａｃｃ１１５μｌ（約７５単位）
に加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間、イン
キュベートした。このＡｃｃ Ｉ消化ＢＫウィルスＤＮ
Ａをアガロースゲル上に充填し、ＢＫエンハンサ−を含
有する〜１．４ｋｂフラグメントを他の消化産物から分
離した。次いで、実質上、実施例９に記載の方法に従い
、〜１．４ ｋｂ Ａｃｃ Ｉ制限フラグメントを単離
した。このフラグメント約５Ｉｌｙを１０ＸＰｖｕｌＩ
バツフアー５μｌ、水４５μｌ。
ー５０μｌ中のプラスミドｐＢＫｎｅｏｌＤＮＡ約８８
μノを１０ＸＡｃｃＩバツフアー７、５ μｌ、水３０
＃、および制限酵素Ａｃｃ１１５μｌ（約７５単位）
に加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間、イン
キュベートした。このＡｃｃ Ｉ消化ＢＫウィルスＤＮ
Ａをアガロースゲル上に充填し、ＢＫエンハンサ−を含
有する〜１．４ｋｂフラグメントを他の消化産物から分
離した。次いで、実質上、実施例９に記載の方法に従い
、〜１．４ ｋｂ Ａｃｃ Ｉ制限フラグメントを単離
した。このフラグメント約５Ｉｌｙを１０ＸＰｖｕｌＩ
バツフアー５μｌ、水４５μｌ。
および制限酵素ＰｖｕＩＩ５μｌ（約２５単位）中に再
懸濁し、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキュ
ベートした。次いて、実質上、実施例９の方法に従い、
Ｐｖｕ ＩＩ消化ＤＮＡを単離し、ライゲーションのた
めに調製した。所望の〜１．２８ ｋｂＡｃｃ Ｉ −
Ｐｖｕ ＩＩフラグメント約２μ２を得、ＴＥバッファ
ー５μｌに溶がした。
懸濁し、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキュ
ベートした。次いて、実質上、実施例９の方法に従い、
Ｐｖｕ ＩＩ消化ＤＮＡを単離し、ライゲーションのた
めに調製した。所望の〜１．２８ ｋｂＡｃｃ Ｉ −
Ｐｖｕ ＩＩフラグメント約２μ２を得、ＴＥバッファ
ー５μｌに溶がした。
プラスミドｐＬＰｃａｔＤＮＡ約１１１ｙを１０ＸＡｃ
ｃＩバツフアー５１１１および水４０μｌに溶かした。
ｃＩバツフアー５１１１および水４０μｌに溶かした。
このプラスミドｐＬＰｃａｔ ＤＮＡ溶液に制限酵素Ａ
ｃｃＩ約５ｔｘｔ（〜２５単位）を加え、得られた反応
混合物を３７°Ｃてインキュベートした。ＡｃｃＩ消化
プラスミドｐ Ｌ Ｐ ｃａｔ Ｄ Ｎ Ａをエタノー
ル沈殿に付し、１０ Ｘ Ｓｔｕ Ｉバッファー５μｌ
、水４０μｌおよび制限酵素Ｓｔｕ Ｉ ５μｌ（約２
５単位）に再懸濁し、得られた反応混合物を３７°Ｃで
２時間インキュベートした。Ａｃｃ Ｉ −Ｓｔｕ Ｉ
消化プラスミドｐＬＰｃａｔ ＤＮＡをエタノールで数
回沈殿させ、大腸菌の複製起源、およびサイズ約１６
ｂｐの制限フラグメントである、他の消化産物を除去さ
れたＡｄ２ の後期プロモーターを含有している〜４．
８１ｋｂ Ａｃｃ Ｉ −３ｔｕ Ｉ制限フラグメント
を精製した。
ｃｃＩ約５ｔｘｔ（〜２５単位）を加え、得られた反応
混合物を３７°Ｃてインキュベートした。ＡｃｃＩ消化
プラスミドｐ Ｌ Ｐ ｃａｔ Ｄ Ｎ Ａをエタノー
ル沈殿に付し、１０ Ｘ Ｓｔｕ Ｉバッファー５μｌ
、水４０μｌおよび制限酵素Ｓｔｕ Ｉ ５μｌ（約２
５単位）に再懸濁し、得られた反応混合物を３７°Ｃで
２時間インキュベートした。Ａｃｃ Ｉ −Ｓｔｕ Ｉ
消化プラスミドｐＬＰｃａｔ ＤＮＡをエタノールで数
回沈殿させ、大腸菌の複製起源、およびサイズ約１６
ｂｐの制限フラグメントである、他の消化産物を除去さ
れたＡｄ２ の後期プロモーターを含有している〜４．
８１ｋｂ Ａｃｃ Ｉ −３ｔｕ Ｉ制限フラグメント
を精製した。
所望の〜４．８１ｋｂ制限フラグメント約１μりを得、
ＴＥバッファー２０ Ｈに溶かした。
ＴＥバッファー２０ Ｈに溶かした。
プラスミドｐＬＰｃａｔの〜４．８１ ｋｂ ＡｃｃＩ
−５ｔｕＩ制限フラグメント５１１ｔをＢＫウィルスの
〜１．２８ｋｂＡｃｃ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ制限フラグ
メント５μｌに加えた。
−５ｔｕＩ制限フラグメント５１１ｔをＢＫウィルスの
〜１．２８ｋｂＡｃｃ Ｉ −Ｐｖｕ ＩＩ制限フラグ
メント５μｌに加えた。
１０×リガーゼバツフアー３ｔｔｚ、水１５μｌおよび
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２μｌ（約１０００単位）をＤＮＡ
混合物に加えた後、得られたライゲーション反応混合物
を１６°Ｃて一夜インキユベートした。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２μｌ（約１０００単位）をＤＮＡ
混合物に加えた後、得られたライゲーション反応混合物
を１６°Ｃて一夜インキユベートした。
ライゲート［７たＤＮＡは、所望のプラスミドｐＢＬＣ
ａｔを構成していた。プラスミドｐ Ｂ Ｌ ｃａｔ
の制限サイトおよび機能地図を添付の第７図に示す。
ａｔを構成していた。プラスミドｐ Ｂ Ｌ ｃａｔ
の制限サイトおよび機能地図を添付の第７図に示す。
ライゲートしたＤＮＡを用い、大腸菌に１２ＨＢ１０１
細胞を形質転換し、大腸菌に１２ＨＢ１０１／ｐＢＬｃ
ａｔ形質転換体を、そのプラスミドＤＮＡの配列決定に
よって同定した。次いで、以後のベクターの組立てに用
いるためにプラスミドｐＢＬｃａｔＤＮＡを調型した。
細胞を形質転換し、大腸菌に１２ＨＢ１０１／ｐＢＬｃ
ａｔ形質転換体を、そのプラスミドＤＮＡの配列決定に
よって同定した。次いで、以後のベクターの組立てに用
いるためにプラスミドｐＢＬｃａｔＤＮＡを調型した。
実施例１２ プラスミドｐＬ１３３の組立てＡ、中間体
プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の組立て プラスミドｐＨＣ７はヒトプロティンＣをコードしてい
るＤＮＡを含有している。テトラサイクリン１５μｙ／
ｍｔを含んだＬ−ブロス１１に大腸菌に１２ＲＲ１／ｐ
ＨＣ７（’ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２６）を接種し、実質
上、実施例１０の方法に従ってプラスミドｐＨＣ７ＤＮ
Ａを単離し、精製した。この方法で約１ｓｙのプラスミ
ドｐＨＣ７ＤＮＡを得、これをＴＥバッファー１−に懸
濁し一２０°Ｃで保存した。プラスミドｐＨＣ７の制限
サイトおよび機能地図を添付の第８図に示す。
プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の組立て プラスミドｐＨＣ７はヒトプロティンＣをコードしてい
るＤＮＡを含有している。テトラサイクリン１５μｙ／
ｍｔを含んだＬ−ブロス１１に大腸菌に１２ＲＲ１／ｐ
ＨＣ７（’ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２６）を接種し、実質
上、実施例１０の方法に従ってプラスミドｐＨＣ７ＤＮ
Ａを単離し、精製した。この方法で約１ｓｙのプラスミ
ドｐＨＣ７ＤＮＡを得、これをＴＥバッファー１−に懸
濁し一２０°Ｃで保存した。プラスミドｐＨＣ７の制限
サイトおよび機能地図を添付の第８図に示す。
プラスミドｐ ＨＣ７Ｄ Ｎ Ａ ５０１１１を制限酵
素Ｂａｎ工５μ！（〜５０単位）、１０ＸＢａｎＩ反応
バッファー（１，５Ｍ ＮａＣｔ、５０ ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ −ＨＣｔ、 ｐＨ＝７．９．６０ ｍＭ Ｍｇ Ｃ
／２、およびｌｑ／＃Ｉ／ＢｓＡ）１０７１１、および
水３５μｌ と混合し、消化が完了するまでインキュベ
ートした。次いで、Ｂａｎ Ｉ消化プラスミドｐＨＣ７
ＤＮＡを、〜１．２５ｋｂ ＢａｎＩ反応フラグメント
が他の消化産物から分離するまで３．５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけた。〜１．２５ ｋｂ Ｂａ
ｎ Ｉ制限フラグメントを含んだゲルの領域を実施例３
の教示に従って単離した。
素Ｂａｎ工５μ！（〜５０単位）、１０ＸＢａｎＩ反応
バッファー（１，５Ｍ ＮａＣｔ、５０ ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ −ＨＣｔ、 ｐＨ＝７．９．６０ ｍＭ Ｍｇ Ｃ
／２、およびｌｑ／＃Ｉ／ＢｓＡ）１０７１１、および
水３５μｌ と混合し、消化が完了するまでインキュベ
ートした。次いで、Ｂａｎ Ｉ消化プラスミドｐＨＣ７
ＤＮＡを、〜１．２５ｋｂ ＢａｎＩ反応フラグメント
が他の消化産物から分離するまで３．５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけた。〜１．２５ ｋｂ Ｂａ
ｎ Ｉ制限フラグメントを含んだゲルの領域を実施例３
の教示に従って単離した。
この方法で〜１．２５ ｋｂ Ｂａｎ Ｉ反応フラグメ
ント約８μ２が得られた。この精製フラグメントをＴＥ
バッファー１０μｌに懸濁し、−２０°Ｃで保存した。
ント約８μ２が得られた。この精製フラグメントをＴＥ
バッファー１０μｌに懸濁し、−２０°Ｃで保存した。
プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８を組立てるため（こ、こ
のＢａｎ Ｉ制限フラグメントにリンカ−を゛付加して
修飾する必要があった。このリンカ−の組立てに用いら
れたＤＮＡフラグメントは、５ｙＳｔｅＣ１４５ＯＡ
ＤＮＡ合成装置またはＡＢ３３８０ＡＤＮＡ合成装置の
いずれかを用いて合成された。
のＢａｎ Ｉ制限フラグメントにリンカ−を゛付加して
修飾する必要があった。このリンカ−の組立てに用いら
れたＤＮＡフラグメントは、５ｙＳｔｅＣ１４５ＯＡ
ＤＮＡ合成装置またはＡＢ３３８０ＡＤＮＡ合成装置の
いずれかを用いて合成された。
各１本鎖リンカ−５００ピコモルを、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ１５単位（〜０．５μｌ）、１０×リガー
ゼバッファー２μｔ、５００μＭＡＴＰＩＯμｌ、およ
び水７．５μｌを含んだ反応バッファー２゜ｐｌ 中で
キナーゼ処理した。キナーゼ反応混合物を３７°Ｃで３
０分間インキュベートした後、１００°Ｃで１０分間イ
ンキュベートして反応を止めた。
チドキナーゼ１５単位（〜０．５μｌ）、１０×リガー
ゼバッファー２μｔ、５００μＭＡＴＰＩＯμｌ、およ
び水７．５μｌを含んだ反応バッファー２゜ｐｌ 中で
キナーゼ処理した。キナーゼ反応混合物を３７°Ｃで３
０分間インキュベートした後、１００°Ｃで１０分間イ
ンキュベートして反応を止めた。
キネ−ジョン（ｋｉｎａｔｉｏｎ ）を確実に完了させ
るために、氷上で反応混合物を冷却し、該反応混合物（
こ０．２Ｍジチオトレイトール２１１１．５ｍＭ ＡＴ
Ｐ２．５ｔｘｔ、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
１５単位を加えて混合し、反応混合物を３７℃でさらに
３０分間インキュベートした。１００°Ｃでさらに１０
分間インキュベートした後、氷上で冷却することにより
反応を止めた。
るために、氷上で反応混合物を冷却し、該反応混合物（
こ０．２Ｍジチオトレイトール２１１１．５ｍＭ ＡＴ
Ｐ２．５ｔｘｔ、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
１５単位を加えて混合し、反応混合物を３７℃でさらに
３０分間インキュベートした。１００°Ｃでさらに１０
分間インキュベートした後、氷上で冷却することにより
反応を止めた。
キナーゼ処理は別個に行ない、２個の１末鎖ＤＮＡＩＪ
ンカーを、キナーゼ反応後に一緒にした。
ンカーを、キナーゼ反応後に一緒にした。
これらの鎖をアニーリングするために、水約１５０−の
入った水浴（１００°Ｃ）中で１０分間、キナーゼ反応
混合物をインキュベートした。このインキュベーション
の後、水浴を閉じ、室温まで放冷した（この工程には約
３時間を要した）。キナーゼ処理したＤＮＡの管を入れ
たまま、水浴を４°Ｃで一夜インキユベートした。この
方法で一本鎖かアニーリングされた。組立てられたリン
カ−は、以下の式： て示される構造を有する。このリンカ−を、使用まで一
２０℃で保存した。
入った水浴（１００°Ｃ）中で１０分間、キナーゼ反応
混合物をインキュベートした。このインキュベーション
の後、水浴を閉じ、室温まで放冷した（この工程には約
３時間を要した）。キナーゼ処理したＤＮＡの管を入れ
たまま、水浴を４°Ｃで一夜インキユベートした。この
方法で一本鎖かアニーリングされた。組立てられたリン
カ−は、以下の式： て示される構造を有する。このリンカ−を、使用まで一
２０℃で保存した。
リンカ−約５０μ／（約５００ピコモル）、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ１μｌ（約５００単位）、１０×リガーゼバツ
フアー１０μｌ、および水２９μｌに〜１．２５ｋｂＢ
ａｎＩフラグメント約８μｌを加えて混合し、得られた
ライゲーション反応混合物を４℃で一部インキユベート
した。６５°Ｃで１０分間インキュベートしてライゲー
ション反応を止めた。Ｎａ０Ａｃを終濃度０．３Ｍまで
加え、エタノール２容量を加えてドライアイス−エタノ
ール浴中で冷却した後、該溶液を遠心することによりＤ
ＮＡをペレット化した。
リガーゼ１μｌ（約５００単位）、１０×リガーゼバツ
フアー１０μｌ、および水２９μｌに〜１．２５ｋｂＢ
ａｎＩフラグメント約８μｌを加えて混合し、得られた
ライゲーション反応混合物を４℃で一部インキユベート
した。６５°Ｃで１０分間インキュベートしてライゲー
ション反応を止めた。Ｎａ０Ａｃを終濃度０．３Ｍまで
加え、エタノール２容量を加えてドライアイス−エタノ
ール浴中で冷却した後、該溶液を遠心することによりＤ
ＮＡをペレット化した。
このＤＮＡペレットをｌ ＯＸ Ａｐａ Ｉ反応バッフ
ァー（６０ｍＭ ＮａＣｔ、 ６０ｍＭ Ｔｒｊｓ −
ＨＣｔ、 ｐＨ＝７．４．６０ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃｔ
２および６０ｍＭ２−メルカプトエタノール）１０μｌ
、制限酵素Ａｐａ Ｉ ５μｌ（〜５０単位）および水
８５μｌに溶かし、反応混合物を３７℃で２時間放置し
また。次いで、反応を止め、上記の如＜ ＤＮＡをペレ
ット化した。このＤＮＡペレットを１０ＸＨｉｎｄＩＩ
Ｉ反応バッファー１０μｌ、制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩ
５ ｌｉｔ （〜５０単位）および水８５μｌに溶かし
、反応混合物を３７℃で２時間放置した。ＨｉｎｄｌＩ
Ｉ消化の後、反応混合物を３，５％ポリアクリルアミド
ゲルで処理し、所望の１．２３ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
−Ａｐａ Ｉ制限フラグメントを単離した。
ァー（６０ｍＭ ＮａＣｔ、 ６０ｍＭ Ｔｒｊｓ −
ＨＣｔ、 ｐＨ＝７．４．６０ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃｔ
２および６０ｍＭ２−メルカプトエタノール）１０μｌ
、制限酵素Ａｐａ Ｉ ５μｌ（〜５０単位）および水
８５μｌに溶かし、反応混合物を３７℃で２時間放置し
また。次いで、反応を止め、上記の如＜ ＤＮＡをペレ
ット化した。このＤＮＡペレットを１０ＸＨｉｎｄＩＩ
Ｉ反応バッファー１０μｌ、制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩ
５ ｌｉｔ （〜５０単位）および水８５μｌに溶かし
、反応混合物を３７℃で２時間放置した。ＨｉｎｄｌＩ
Ｉ消化の後、反応混合物を３，５％ポリアクリルアミド
ゲルで処理し、所望の１．２３ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
−Ａｐａ Ｉ制限フラグメントを単離した。
所望のフラグメント約５μｌを得、これをＴＥバッファ
ーＩ Ｑ ｌｉｔに懸濁し、−２０℃に保存した。
ーＩ Ｑ ｌｉｔに懸濁し、−２０℃に保存した。
プラスミドｐＨＣ７ＤＮＡ ５０μｌを、制限酵素ＰＳ
ＴＩ ５ｔｔｔ （〜５０単位）、１ＱＸＰｓｔＩ反応
バッファー（１，ＯＭ ＮａＣｔ、 １００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｚ、ｐＨ＝７．５．１００ ｍ Ｍ Ｍｇ
Ｃｔ ２、および１ ｍｙ／ｓ／ ＢＳＡ）１０μｌ、
および水３５μｌに溶かし、３７℃で２時間インキュベ
ートした。次いで、ＰｓｔＩ消化プラスミドｐＨＣ７Ｄ
ＮＡを３６５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
、所望の〜０．８８ｋｂ フラグメントを実質上、上記
の方法に従って精製した。所望のフラグメント約５μ２
を得、ＴＥバッファー１０μｌに懸濁し、−２０℃で保
存した。
ＴＩ ５ｔｔｔ （〜５０単位）、１ＱＸＰｓｔＩ反応
バッファー（１，ＯＭ ＮａＣｔ、 １００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｚ、ｐＨ＝７．５．１００ ｍ Ｍ Ｍｇ
Ｃｔ ２、および１ ｍｙ／ｓ／ ＢＳＡ）１０μｌ、
および水３５μｌに溶かし、３７℃で２時間インキュベ
ートした。次いで、ＰｓｔＩ消化プラスミドｐＨＣ７Ｄ
ＮＡを３６５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
、所望の〜０．８８ｋｂ フラグメントを実質上、上記
の方法に従って精製した。所望のフラグメント約５μ２
を得、ＴＥバッファー１０μｌに懸濁し、−２０℃で保
存した。
〜０．８８ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉフラグメント約５μノを
、自動ＤＮＡ合成装置を用いて組立てられた、式：て示
されるリンカ−約５０μｌに加えて混合した。
、自動ＤＮＡ合成装置を用いて組立てられた、式：て示
されるリンカ−約５０μｌに加えて混合した。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ約１μｌ、１０×リガーゼバツフア
ー１０μ！、および水２９μｌをＤＮＡ混合物、 に加
え、得られたライゲーション反応混合物を４°Ｃで一部
インキユベートした。
ー１０μ！、および水２９μｌをＤＮＡ混合物、 に加
え、得られたライゲーション反応混合物を４°Ｃで一部
インキユベートした。
６５℃で１０分間インキュベートすることによりライゲ
ーション反応を止めた。ライゲートしたＤＮＡを沈降さ
せた後、ＤＮＡペレットを１０×ＡｐａＩ反応バッファ
ー１０ｉｔｔ、反応酵素ＡｐａＩ５μｌ（〜５０単位）
および水８５μｌに溶かし、反応混合物を３７°Ｃで２
時間放置した。次いで、反応を止め再びＤＮＡをペレッ
ト化した。このＤＮＡペレットを１０ＸＢｇｌｌＴ反応
バッファー（ＩＭＮａＣ，ｉ、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｔ 、 ｐＨ＝ ７．４．１００ｍ Ｍ Ｍｇ
Ｃ１２，１００ｍＭ２−メルカプトエタノール、およ
びＩＭｙ／ｌＩｉ ＢＳＡ、）１０μｌ、制限酵素Ｂｇ
ｌｌＩ５１１ｚ（〜５０単位）、および水８５ ／ｌ／
に溶かし、反応混合物を３７°Ｃで２時間放置した。
ーション反応を止めた。ライゲートしたＤＮＡを沈降さ
せた後、ＤＮＡペレットを１０×ＡｐａＩ反応バッファ
ー１０ｉｔｔ、反応酵素ＡｐａＩ５μｌ（〜５０単位）
および水８５μｌに溶かし、反応混合物を３７°Ｃで２
時間放置した。次いで、反応を止め再びＤＮＡをペレッ
ト化した。このＤＮＡペレットを１０ＸＢｇｌｌＴ反応
バッファー（ＩＭＮａＣ，ｉ、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｔ 、 ｐＨ＝ ７．４．１００ｍ Ｍ Ｍｇ
Ｃ１２，１００ｍＭ２−メルカプトエタノール、およ
びＩＭｙ／ｌＩｉ ＢＳＡ、）１０μｌ、制限酵素Ｂｇ
ｌｌＩ５１１ｚ（〜５０単位）、および水８５ ／ｌ／
に溶かし、反応混合物を３７°Ｃで２時間放置した。
ＢｇｌＩＩ消化の後、反応混合物を３．５％ポリアクリ
ルアミドゲル処理し、所望の〜０．１９ ｋｂＡｐａ
Ｉ −１３ｇ１ｌＴ制限フラグメントを単離した。所望
のフラグメント約１μｍを得、ＴＥバッファー１０μｌ
に懸濁して一２０°Ｃて保存した。
ルアミドゲル処理し、所望の〜０．１９ ｋｂＡｐａ
Ｉ −１３ｇ１ｌＴ制限フラグメントを単離した。所望
のフラグメント約１μｍを得、ＴＥバッファー１０μｌ
に懸濁して一２０°Ｃて保存した。
プラスミｔ’ｐＳＶ２ｇｐｔ ＤＮＡ（ＡＴＣＣ３７１
４５）約１０μＶを１０ＸＨｉｎｄｆｆ１反応バッファ
ー１０ ｕｐ、制限酵素Ｈｉｎｄ１１１５μｌ（〜５０
単位）および水８５μｌに溶かし、反応混合物を３７℃
で２時間放置した。次いで、反応混合物をＮａ０Ａｃ
０．２５Ｍに調節し、エタノール２容量を加えてドライ
アイス−エタノール中でインキュベートした後、遠心し
てＤＮＡをペレット化した。このＤＮＡペレットを１０
ｘＢｇｌＩＩバッファー、制限酵素ＢｇｌＩＩ５μｌ（
〜５０単位）および水８５μｌに溶かし、この反応混合
物を３７℃で２時間放置した。８ｇ１ｍ消化の後、反応
混合物を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、フラグメ
ントを分離した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外
線照射下で観察して所望の〜５．１ ｋｂ Ｈｉｎｄ
ｍ −Ｂｇｌ ＩＩフラグメントを含んだバンドをゲル
から切り、透析チューブの中に入れ、ＤＮＡがアガロー
スから放出されるまで電気泳動を続けた。透析チューブ
から得た、ＤＮＡを含んだバッファーをフェノールおよ
びＣＨＣ／３ で抽出した後、ＤＮＡを沈降させた。
４５）約１０μＶを１０ＸＨｉｎｄｆｆ１反応バッファ
ー１０ ｕｐ、制限酵素Ｈｉｎｄ１１１５μｌ（〜５０
単位）および水８５μｌに溶かし、反応混合物を３７℃
で２時間放置した。次いで、反応混合物をＮａ０Ａｃ
０．２５Ｍに調節し、エタノール２容量を加えてドライ
アイス−エタノール中でインキュベートした後、遠心し
てＤＮＡをペレット化した。このＤＮＡペレットを１０
ｘＢｇｌＩＩバッファー、制限酵素ＢｇｌＩＩ５μｌ（
〜５０単位）および水８５μｌに溶かし、この反応混合
物を３７℃で２時間放置した。８ｇ１ｍ消化の後、反応
混合物を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、フラグメ
ントを分離した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外
線照射下で観察して所望の〜５．１ ｋｂ Ｈｉｎｄ
ｍ −Ｂｇｌ ＩＩフラグメントを含んだバンドをゲル
から切り、透析チューブの中に入れ、ＤＮＡがアガロー
スから放出されるまで電気泳動を続けた。透析チューブ
から得た、ＤＮＡを含んだバッファーをフェノールおよ
びＣＨＣ／３ で抽出した後、ＤＮＡを沈降させた。
このペレットをＴＥバッファー１０ Ｉｌｌに再懸濁す
ると、これは、所望の、プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔの〜
５．１ ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ −Ｂｇｌ ＩＩ制限フ
ラグメント〜５μノからなっていた。
ると、これは、所望の、プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔの〜
５．１ ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ −Ｂｇｌ ＩＩ制限フ
ラグメント〜５μノからなっていた。
〜１．２３ ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩ［−Ａｐａ Ｉ制限
フラグメント２ μｔ、 〜０．１９ ｋｂ Ａｐａ
Ｉ −Ｂｇｌ ＩＩフラグメント３Ｉｌｌ、および〜５
．１ ｋｂ Ｈｉｎｄ Ｉ［−Ｂｇｌ ＩＩフラグメン
ト２μｌを混合した後、１０×リガーゼバツフアー１０
μｔ、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ１μｌ（〜５ｏｏ単位）お
よび水８２μｌと一緒ｌこ１６℃で一部インキユベート
シた。ライゲートしたＤＮＡは、所望のプラスミｔ’ｐ
ＳＶ２−ＨＰＣ８を構成していた。このプラスミドの制
限サイトおよび機能地図を添付の第８図に示す。
フラグメント２ μｔ、 〜０．１９ ｋｂ Ａｐａ
Ｉ −Ｂｇｌ ＩＩフラグメント３Ｉｌｌ、および〜５
．１ ｋｂ Ｈｉｎｄ Ｉ［−Ｂｇｌ ＩＩフラグメン
ト２μｌを混合した後、１０×リガーゼバツフアー１０
μｔ、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ１μｌ（〜５ｏｏ単位）お
よび水８２μｌと一緒ｌこ１６℃で一部インキユベート
シた。ライゲートしたＤＮＡは、所望のプラスミｔ’ｐ
ＳＶ２−ＨＰＣ８を構成していた。このプラスミドの制
限サイトおよび機能地図を添付の第８図に示す。
大腸菌に１２ ＲＲＩ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１０）
細胞を形質転換受容細胞とし、これを、上で調製した、
ライゲートしたＤＮＡを用いて形質転換した。
細胞を形質転換受容細胞とし、これを、上で調製した、
ライゲートしたＤＮＡを用いて形質転換した。
形質転換混合物の一部をとり、１００μｖ／ＩＩ＋／ア
ンピシリンを含んだし一寒天プレートにのせた。このフ
レートを３７°Ｃでインキュベートシタ。大腸菌に１２
ＲＲＩ／ｐＳＶ２−ＨＰＣ８形質転換体を、そのプラ
スミドＤＮＡの制限酵素分析に基ついて確認した。
ンピシリンを含んだし一寒天プレートにのせた。このフ
レートを３７°Ｃでインキュベートシタ。大腸菌に１２
ＲＲＩ／ｐＳＶ２−ＨＰＣ８形質転換体を、そのプラ
スミドＤＮＡの制限酵素分析に基ついて確認した。
Ｂ、プラスミドｐＬ１３３の最終組立てプラスミドｌ）
ＳＶ２−ＨＰＣ８５０１１ｙを１０×Ｈｉｎｄｌ［反
応バッファー１０μｌ、制限酵素Ｈｉｎｄ ｌｌｌ５μ
ｌ（〜５０単位）および水８５μｌに溶かし、反応混合
物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。
ＳＶ２−ＨＰＣ８５０１１ｙを１０×Ｈｉｎｄｌ［反
応バッファー１０μｌ、制限酵素Ｈｉｎｄ ｌｌｌ５μ
ｌ（〜５０単位）および水８５μｌに溶かし、反応混合
物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。
Ｈｉｎｄｆｆｌ 消化の後、ＤＮＡを沈殿させ、このＤ
ＮＡペレットを１０ＸＳａｌｌ：反応バッファー（’１
．５ＭＮａＣｌ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝
＝７．９．６０ｍＭＭｇＣ１２，６０ｍＭ２−メルカプ
トエタノールおよび１ ｎｙ ／ ｍｅ ＢＳＡ ）
１０ ｌｌｉ 、制限酵素５ａｌＩ５μｇ（〜５０単位
）、および水８５μｌに溶かした。得られたＳａｌＩ反
応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。この
Ｈｉｎｄ Ｉ［−３ａｌ Ｉ消化プラスミドｐＳＶ２−
ＨＰＣ８を３．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動ｌ
こかけ、所望の〜０．２９ ｋｂ ＨｉｎｄＮ−５ａｌ
Ｉ制限フラグメントが他の反応産物から分離するまで泳
動させた。ゲルから所望のフラグメントを単離し、得ら
れた約２μ２のフラグメントをＴＥバッファー１０μｌ
に懸濁した。
ＮＡペレットを１０ＸＳａｌｌ：反応バッファー（’１
．５ＭＮａＣｌ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝
＝７．９．６０ｍＭＭｇＣ１２，６０ｍＭ２−メルカプ
トエタノールおよび１ ｎｙ ／ ｍｅ ＢＳＡ ）
１０ ｌｌｉ 、制限酵素５ａｌＩ５μｇ（〜５０単位
）、および水８５μｌに溶かした。得られたＳａｌＩ反
応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。この
Ｈｉｎｄ Ｉ［−３ａｌ Ｉ消化プラスミドｐＳＶ２−
ＨＰＣ８を３．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動ｌ
こかけ、所望の〜０．２９ ｋｂ ＨｉｎｄＮ−５ａｌ
Ｉ制限フラグメントが他の反応産物から分離するまで泳
動させた。ゲルから所望のフラグメントを単離し、得ら
れた約２μ２のフラグメントをＴＥバッファー１０μｌ
に懸濁した。
プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８５０μ２．１０×ＢｇＩ
Ｉ［反応バッファー１０μｌ、制限酵素ＢｇｌＩＩ５μ
ｚ（５０単位）および水８５ ｔｌｔに溶かし、この反
応混合物を３７°Ｃて２時間インキュベートした。
Ｉ［反応バッファー１０μｌ、制限酵素ＢｇｌＩＩ５μ
ｚ（５０単位）および水８５ ｔｌｔに溶かし、この反
応混合物を３７°Ｃて２時間インキュベートした。
ＢｇｌＩＩ消化の後、ＤＮＡを沈殿させ、得られたＤＮ
Ａペレットを１０ＸＳａｌｌ反応バッファー１０ＩＩ／
、制限酵素５ａｌＩ５ノｌ＋？（〜５０単位）および水
８５μｌに溶かした。得られたＳａｌＩ反応混合物を３
７°Ｃで２時間インキュベートした。このＳａｌＩ−Ｂ
ｇｌＩＩ消化プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８を３．５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、所望の〜１．
１５ ｋｂ Ｓａ ｌ Ｉ−Ｂｇｌ ＩＩ制限フラグメ
ントが他の反応産物から分離するまで泳動させた。ゲル
から〜１．１５ ｋｂＳａｌ Ｉ −Ｂｇｌ ＩＩ制限
フラグメントを単離し、フラグメント約８μノを得てＴ
Ｅバッファー１０１１１に懸濁した。
Ａペレットを１０ＸＳａｌｌ反応バッファー１０ＩＩ／
、制限酵素５ａｌＩ５ノｌ＋？（〜５０単位）および水
８５μｌに溶かした。得られたＳａｌＩ反応混合物を３
７°Ｃで２時間インキュベートした。このＳａｌＩ−Ｂ
ｇｌＩＩ消化プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８を３．５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、所望の〜１．
１５ ｋｂ Ｓａ ｌ Ｉ−Ｂｇｌ ＩＩ制限フラグメ
ントが他の反応産物から分離するまで泳動させた。ゲル
から〜１．１５ ｋｂＳａｌ Ｉ −Ｂｇｌ ＩＩ制限
フラグメントを単離し、フラグメント約８μノを得てＴ
Ｅバッファー１０１１１に懸濁した。
プラスミ）’ｐＳＶ２−β−グロヒ：／ ＤＮＡ （Ｎ
ＲＲＬＩ３−１５９２８ ）約１０μりを１０ Ｘ Ｈ
４ｎｄｌＩ反応バッファー１０ μ！、制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌＩＩ５μｌ（〜５０単位）、および水８５μｌに溶
かし、得られた反応混合物を３７°Ｃて２時間放置した
。次いで、この反応混合物をＮａ０Ａｃ ０．２５
Ｍとし、２容量のエタノールを加え、ドライアイス−エ
タノール浴中でインキュベートシた後、遠心してＤＮＡ
をペレット化した。ＨｉｎｄＩ［Ｉ消化プラスミドｐＳ
Ｖ２−β−グロビンを１０ＸＢｇｌｌＩバッファー１０
ｔｉｐ、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ ５ Ｉｌｌ （〜５
０単位）および水８５ ｐｉに溶かし、反応混合物を３
７℃で２時間置いた。８ｇ１ｍ消化の後、反応混合物を
１％アガロースゲル電気泳動にかけてフラグメントを分
離した。所望の〜４、２ ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ −
Ｂｇｌ ＩＩ制限フラグメントをゲルから単離し、得ら
れた約５μノの所望のフラグメン１４−ＴＥバッファー
１０μｌに懸澗シた。
ＲＲＬＩ３−１５９２８ ）約１０μりを１０ Ｘ Ｈ
４ｎｄｌＩ反応バッファー１０ μ！、制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌＩＩ５μｌ（〜５０単位）、および水８５μｌに溶
かし、得られた反応混合物を３７°Ｃて２時間放置した
。次いで、この反応混合物をＮａ０Ａｃ ０．２５
Ｍとし、２容量のエタノールを加え、ドライアイス−エ
タノール浴中でインキュベートシた後、遠心してＤＮＡ
をペレット化した。ＨｉｎｄＩ［Ｉ消化プラスミドｐＳ
Ｖ２−β−グロビンを１０ＸＢｇｌｌＩバッファー１０
ｔｉｐ、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ ５ Ｉｌｌ （〜５
０単位）および水８５ ｐｉに溶かし、反応混合物を３
７℃で２時間置いた。８ｇ１ｍ消化の後、反応混合物を
１％アガロースゲル電気泳動にかけてフラグメントを分
離した。所望の〜４、２ ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ −
Ｂｇｌ ＩＩ制限フラグメントをゲルから単離し、得ら
れた約５μノの所望のフラグメン１４−ＴＥバッファー
１０μｌに懸澗シた。
プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の〜０．２９ ｋｂ Ｈ
ｉｎｄｍ−３ａｌＩフラグメント２μｔ、プラスミドｐ
ＳＶ２−ＨＰＣ８の〜１．１５ ｋｂ Ｓａｌ Ｉ −
Ｂｇｌ ＩＩ フラグメント２μｊ、およびプラスミ
ドｐＳＶ２−β−グロビンの〜４．２ ｋｂ Ｈｉｎｄ
ｍ −Ｂｇｌ ＩＩフラグメント２／Ｈを一緒に混合
し、実質上、実施例１２Ａの方法に従ってライゲートさ
せた。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐ Ｌ
１３３を構成していた。第８図はこの実施例に記載し
た種々の出発物質からのプラスミドｐＬ１３３の組立て
を、模式的に示したフローチャートである。所望の大腸
菌に１２ＲＲ’１／ｐＬ１３３形質転換体を組立て、プ
ラスミドｐＬＰＣの組立てに用いるためにプラスミドＤ
ＮＡを単離した。
ｉｎｄｍ−３ａｌＩフラグメント２μｔ、プラスミドｐ
ＳＶ２−ＨＰＣ８の〜１．１５ ｋｂ Ｓａｌ Ｉ −
Ｂｇｌ ＩＩ フラグメント２μｊ、およびプラスミ
ドｐＳＶ２−β−グロビンの〜４．２ ｋｂ Ｈｉｎｄ
ｍ −Ｂｇｌ ＩＩフラグメント２／Ｈを一緒に混合
し、実質上、実施例１２Ａの方法に従ってライゲートさ
せた。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐ Ｌ
１３３を構成していた。第８図はこの実施例に記載し
た種々の出発物質からのプラスミドｐＬ１３３の組立て
を、模式的に示したフローチャートである。所望の大腸
菌に１２ＲＲ’１／ｐＬ１３３形質転換体を組立て、プ
ラスミドｐＬＰＣの組立てに用いるためにプラスミドＤ
ＮＡを単離した。
実施例１３ プラスミドｐＬＰＣの組立てプラスミドｐ
ＢＬｃａｔＤＮＡ約２０μノを、１０×Ｈｉｎｄｆｆｉ
バツフアー１０μｌおよび水８０μｌに溶かした。制限
酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ約１０μｌ（〜１００単位）を、プ
ラスミドｐＢＬｃａｔＤＮＡの溶液に加え、得られた反
応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。このＨ
ｉｎｄ ｆｆｌ消化プラスミドｐ Ｂ Ｌ ｃａｔＤＮ
Ａをアガロースゲル電気泳動にかけ、ＢＫエンハンサ−
とＡｄ２後期プロモーターとを含有する〜０．８７ ｋ
ｂ Ｈｉｎｄ ｆｆｌ制限フラグメントが他の消化産物
から分離されるまで泳動させた後、〜０．８７ｋｂ フ
ラグメントを単離し、実質上、実施例９の方法に従って
ライゲーションのために調製した。
ＢＬｃａｔＤＮＡ約２０μノを、１０×Ｈｉｎｄｆｆｉ
バツフアー１０μｌおよび水８０μｌに溶かした。制限
酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ約１０μｌ（〜１００単位）を、プ
ラスミドｐＢＬｃａｔＤＮＡの溶液に加え、得られた反
応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。このＨ
ｉｎｄ ｆｆｌ消化プラスミドｐ Ｂ Ｌ ｃａｔＤＮ
Ａをアガロースゲル電気泳動にかけ、ＢＫエンハンサ−
とＡｄ２後期プロモーターとを含有する〜０．８７ ｋ
ｂ Ｈｉｎｄ ｆｆｌ制限フラグメントが他の消化産物
から分離されるまで泳動させた後、〜０．８７ｋｂ フ
ラグメントを単離し、実質上、実施例９の方法に従って
ライゲーションのために調製した。
所望のフラグメント約２μノを得、これをＴＥバッフ了
−５１１１に溶かした。
−５１１１に溶かした。
プラスミドｐＬ１３３ ＤＮＡ約１．５μ２を、１０×
ＨｉｎｄｌｌＩバツフアー２μｌおよび水１６ Ｉｌｌ
に溶かした。このＤＮＡ溶液（乙制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ約１μｌ（〜１０単位）を加え、得られた反応混合物
を３７℃で２時間インキュベートした。次いで、このＤ
ＮＡをＴＥバッファー１００μｌで希釈し、実質上、実
施例９の方法に従い、ウシ腸のアルカリホスファターゼ
処理した。このＨｉｎｄｕ消化プラスミドｐＬ１３３
ＤＮＡをフェノールで２回、さらにクロロホルムで１回
抽出し、エタノール沈殿に付した後、ＴＥバッファー１
０μｊに再懸濁した。
ＨｉｎｄｌｌＩバツフアー２μｌおよび水１６ Ｉｌｌ
に溶かした。このＤＮＡ溶液（乙制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ約１μｌ（〜１０単位）を加え、得られた反応混合物
を３７℃で２時間インキュベートした。次いで、このＤ
ＮＡをＴＥバッファー１００μｌで希釈し、実質上、実
施例９の方法に従い、ウシ腸のアルカリホスファターゼ
処理した。このＨｉｎｄｕ消化プラスミドｐＬ１３３
ＤＮＡをフェノールで２回、さらにクロロホルムで１回
抽出し、エタノール沈殿に付した後、ＴＥバッファー１
０μｊに再懸濁した。
１．５ｐｔのＨｉｎｄ ＩＩＩ消化プラスミドｐＬ１３
３に〜０．８７ ｋｂ Ｈｉｎｄ Ｉ［制限フラグメン
ト約５ｔｕｋ加え、次いで、１０×リガーゼバッファー
１μｚ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＥ（〜１０００単位）
および水１、５ ＩｌｌをこのＤＮＡ溶液に加え、得ら
れた反応混合物を１６°Ｃて一部インキユベートした。
３に〜０．８７ ｋｂ Ｈｉｎｄ Ｉ［制限フラグメン
ト約５ｔｕｋ加え、次いで、１０×リガーゼバッファー
１μｚ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＥ（〜１０００単位）
および水１、５ ＩｌｌをこのＤＮＡ溶液に加え、得ら
れた反応混合物を１６°Ｃて一部インキユベートした。
ライゲートしたＤ Ｎ Ａは所望のプラスミドｐＬＰＣ
を構成していた。
を構成していた。
ライゲートしたＤＮＡを用い、大腸菌に１２ＨＢ１０１
を形質転換した。形質転換された細胞をアンピシリンを
含んだＬ寒天上で平板培養し、アンピシリン耐性形質転
換体のプラスミドＤＮＡを制限酵素分析で調べ、大腸菌
Ｋｌ ２ ＨＢＩ ０１／ｐＬＰＣ形質転換体を同定し
た。Ｂ ｉ（エンハンサ−とＡｄ２０゜ 後期プロモーターとをコードしている二、ｐ ７ ｋｂ
Ｈｉｎｄｌｆｆ制限フラグメントはＨｉｎｄｌＩ消化プ
ラスミドｐＳＢＬｃａｔ ζこ、１または２方向性で
挿入され得るが、その内１方のみがプラスミドｐＬＰＣ
を与える。プラスミドｐＬＰＣの制限サイトおよび機能
地図を添付の第９図に示す。
を形質転換した。形質転換された細胞をアンピシリンを
含んだＬ寒天上で平板培養し、アンピシリン耐性形質転
換体のプラスミドＤＮＡを制限酵素分析で調べ、大腸菌
Ｋｌ ２ ＨＢＩ ０１／ｐＬＰＣ形質転換体を同定し
た。Ｂ ｉ（エンハンサ−とＡｄ２０゜ 後期プロモーターとをコードしている二、ｐ ７ ｋｂ
Ｈｉｎｄｌｆｆ制限フラグメントはＨｉｎｄｌＩ消化プ
ラスミドｐＳＢＬｃａｔ ζこ、１または２方向性で
挿入され得るが、その内１方のみがプラスミドｐＬＰＣ
を与える。プラスミドｐＬＰＣの制限サイトおよび機能
地図を添付の第９図に示す。
実施例１４ プラスミドＩ）ＬＰＣ４およびｐＬＰＣ５
の組立て 実施例８て調製したＢＫウィルスＤＮＡ約１１１ｙ（１
ｔｔｚ ）およびプラスミドｐＬＰｃ１μｙ（１μｔ）
を１０ＸＥｃｏＲＩバツフアーおよび水１４μｌに溶か
した。制限酵素ＥｃｏＲＩ約２ ｔｉｐ （〜１０単位
）をＤＮＡ溶液に加え、得られた反応混合物を３７°Ｃ
で２時間インキュベートした。ＢＫウイルストフラスミ
ドｐＬＰＣＤＮＡとのＥｃｏ ＲＩ消化混合物を、緩衝
化フェノールで１回、クロロホルムｚムで１回抽出した
。次いで、ＮａＣ１農度を０．２５Ｍに調節し、エタノ
ール２容量を加え、該溶液をドライアイス−エタノール
洛中で２分間インキュベートし、溶液を遠心してＤＮＡ
をペレット化することにより、ＤＮＡを集めた。上清を
捨て、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾
燥してＴＥバッファー１２μｌに再懸濁した。
の組立て 実施例８て調製したＢＫウィルスＤＮＡ約１１１ｙ（１
ｔｔｚ ）およびプラスミドｐＬＰｃ１μｙ（１μｔ）
を１０ＸＥｃｏＲＩバツフアーおよび水１４μｌに溶か
した。制限酵素ＥｃｏＲＩ約２ ｔｉｐ （〜１０単位
）をＤＮＡ溶液に加え、得られた反応混合物を３７°Ｃ
で２時間インキュベートした。ＢＫウイルストフラスミ
ドｐＬＰＣＤＮＡとのＥｃｏ ＲＩ消化混合物を、緩衝
化フェノールで１回、クロロホルムｚムで１回抽出した
。次いで、ＮａＣ１農度を０．２５Ｍに調節し、エタノ
ール２容量を加え、該溶液をドライアイス−エタノール
洛中で２分間インキュベートし、溶液を遠心してＤＮＡ
をペレット化することにより、ＤＮＡを集めた。上清を
捨て、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾
燥してＴＥバッファー１２μｌに再懸濁した。
ＢＫウィルスとプラスミドｐＬＰＣＤＮＡのＥｃｏ Ｒ
Ｉ消化混合物に、水約１３μｌと１０×リガーゼバツフ
アー３μｊとを加えた。このＤ Ｎ Ａ 溶液にＴ４
ＤＮＡリガーゼ２ ｌｌｔ （〜１０００単位）を加え
、得られた反応混合物を１６°Ｃて２時間インキュベー
トした。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＬ
ＰＣ４およびｐＬＰＣ５（これらは挿入されたＢＫウィ
ルスの方向性に関してのみ異る）を構成しており、これ
らを用いて大腸菌に１２ＨＢＩＯＩコンピテント細胞を
形質転換した。形質転換された細胞をＩ Ｑ Ｏｐｇ、
／−アンピシリンを含んだし寒天上にプレートした。大
腸菌に１２ＨＢ１０１／Ｉ）ＬＰＣ４および大腸菌に１
２ＨＢＩＯＩ／ｐＬＰＣ５形質転換体をそれらのアンピ
ンリン耐性表現型とプラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
より同定した。
Ｉ消化混合物に、水約１３μｌと１０×リガーゼバツフ
アー３μｊとを加えた。このＤ Ｎ Ａ 溶液にＴ４
ＤＮＡリガーゼ２ ｌｌｔ （〜１０００単位）を加え
、得られた反応混合物を１６°Ｃて２時間インキュベー
トした。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＬ
ＰＣ４およびｐＬＰＣ５（これらは挿入されたＢＫウィ
ルスの方向性に関してのみ異る）を構成しており、これ
らを用いて大腸菌に１２ＨＢＩＯＩコンピテント細胞を
形質転換した。形質転換された細胞をＩ Ｑ Ｏｐｇ、
／−アンピシリンを含んだし寒天上にプレートした。大
腸菌に１２ＨＢ１０１／Ｉ）ＬＰＣ４および大腸菌に１
２ＨＢＩＯＩ／ｐＬＰＣ５形質転換体をそれらのアンピ
ンリン耐性表現型とプラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
より同定した。
プラスミドｐＬＰＣの制限サイトおよび機能地図を添付
の第１０図に示す。
の第１０図に示す。
実施例１５ プラスミドｐＬｐｃｈｙｇｉおよびｐＬＰ
ｃｈｙｇ２の組立て 大腸菌に１２ＲＲＩ／ｐＳＶ２ ｈｙｇ細胞は、ＮＲＲ
Ｌから、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８０３９の下、入手
される。プラスミドｐＳＶ２ ｈ３’ｇ ＤＮＡは、こ
の細胞から、実質上、実施例１０の方法に従って得られ
る。プラスミドｐＳＶ２ｈｙｇ の制限サイトおよび機
能地図を添付の第１１図に示す。
ｃｈｙｇ２の組立て 大腸菌に１２ＲＲＩ／ｐＳＶ２ ｈｙｇ細胞は、ＮＲＲ
Ｌから、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８０３９の下、入手
される。プラスミドｐＳＶ２ ｈ３’ｇ ＤＮＡは、こ
の細胞から、実質上、実施例１０の方法に従って得られ
る。プラスミドｐＳＶ２ｈｙｇ の制限サイトおよび機
能地図を添付の第１１図に示す。
プラスミドｐｓＶ２ｈｙｇ約１０１１ｙ（ＴＥバッファ
ー１０μｌ中）を１０Ｘ１０ＸＢａバツフアー２Ｉｌｌ
と水６μｌとに加えた。このＤ Ｎ Ａ溶液に制限酵素
ＢａｍＨＩ約２μｌ（約２０単位）に加え、得られた反
応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。
ー１０μｌ中）を１０Ｘ１０ＸＢａバツフアー２Ｉｌｌ
と水６μｌとに加えた。このＤ Ｎ Ａ溶液に制限酵素
ＢａｍＨＩ約２μｌ（約２０単位）に加え、得られた反
応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。
得られた反応混合物をまずフェノール、次いでクロロホ
ルムで２回、抽出した。このＢａｍＨＩ消化プラスミド
ｐＳＶ２ ｈｙｇＤＮＡをアガロースゲルに適用し、ハ
イグロマイシン耐性遺伝子を含んだ〜２．５ｋｂ制限フ
ラグメントを単離した。
ルムで２回、抽出した。このＢａｍＨＩ消化プラスミド
ｐＳＶ２ ｈｙｇＤＮＡをアガロースゲルに適用し、ハ
イグロマイシン耐性遺伝子を含んだ〜２．５ｋｂ制限フ
ラグメントを単離した。
ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＳＶ２ ｈ！／ｇＤＮＡの
溶液に、１０×クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ ）バッファー
（４種類のｄＮＴＰ各０．２ ｍＭ、 ０．５ Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ＝７．８．５０ｍＭＭｇＣ１２，
０，１Ｍ２−メルカプトエタノール、および１００μｙ
／−＋／ＢＳＡ）約５μｌおよび水３５／Ｈを加えた後
、このＤＮＡ混合物にフレノウ酵素約２５単位（ＢＲＬ
供給の品、約５μｌ）を加え、得られた反応混合物を１
６°Ｃで３０分間インキュベートした。この、フレノウ
処理した、ＢａｍＨＩ消化プラスミドＩ）ＳＶ２ ｈｙ
ｇ ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで各１回抽
出した後、エタノール沈殿に付した。所望のフラグメン
ト約２μＶを得、ＴＥバッファー５μｌに懸濁した。
溶液に、１０×クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ ）バッファー
（４種類のｄＮＴＰ各０．２ ｍＭ、 ０．５ Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ＝７．８．５０ｍＭＭｇＣ１２，
０，１Ｍ２−メルカプトエタノール、および１００μｙ
／−＋／ＢＳＡ）約５μｌおよび水３５／Ｈを加えた後
、このＤＮＡ混合物にフレノウ酵素約２５単位（ＢＲＬ
供給の品、約５μｌ）を加え、得られた反応混合物を１
６°Ｃで３０分間インキュベートした。この、フレノウ
処理した、ＢａｍＨＩ消化プラスミドＩ）ＳＶ２ ｈｙ
ｇ ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで各１回抽
出した後、エタノール沈殿に付した。所望のフラグメン
ト約２μＶを得、ＴＥバッファー５μｌに懸濁した。
プラスミドｐＬＰＣＤＮＡ約１０ ）ｔ９ （’ １０
μｌ）を、１０ Ｘ Ｓｔｕ Ｉバッファー２μ！およ
び水６μｌに加えた。制限酵素Ｓｔｕ Ｉ約２μｌ（〜
１０単位）をこのＤＮＡ溶液に加え、得られた反応混合
物を３７°Ｃて２時間インキュベートした。このＳｔｕ
Ｉ消化プラスミドｐＬＰＣＤＮＡをエタノール沈殿に
付した後、遠心して集め、１０ Ｘ Ｎｄｅ Ｉバッフ
ァー（１，５Ｍ ＮａＣｔ、 ０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩＳｐＨ＝７．８．７０ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃｌ ２
．６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ ｔ４／ｍｅ
Ｂ Ｓ Ａ ） ２ ｔｉｅと水１６ ｔｉｅに再懸
濁した。この５ｔｕＩ消化ＤＮＡの溶液をエタノール沈
殿に付し、遠心して集め、１０ＸＮｄｅＩバツフアー（
１，５Ｍ ＮａＣ１、０，１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐ
Ｈニア、８．７０ ｍＭ Ｍｇ（Ｊ２．６０ｍＭ ２
−メルカプトエタノールおよび１〜／ｎｌ Ｂ Ｓ Ａ
） ２１１１および水１６μｌに再懸濁した。この５
ｔｕＩ消化ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＮｄｅＩ約２１Ｉ
ｌ（〜１０単位）を加え、得られた反応混合物を３７°
Ｃで２時間インキュベートした。
μｌ）を、１０ Ｘ Ｓｔｕ Ｉバッファー２μ！およ
び水６μｌに加えた。制限酵素Ｓｔｕ Ｉ約２μｌ（〜
１０単位）をこのＤＮＡ溶液に加え、得られた反応混合
物を３７°Ｃて２時間インキュベートした。このＳｔｕ
Ｉ消化プラスミドｐＬＰＣＤＮＡをエタノール沈殿に
付した後、遠心して集め、１０ Ｘ Ｎｄｅ Ｉバッフ
ァー（１，５Ｍ ＮａＣｔ、 ０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩＳｐＨ＝７．８．７０ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃｌ ２
．６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ ｔ４／ｍｅ
Ｂ Ｓ Ａ ） ２ ｔｉｅと水１６ ｔｉｅに再懸
濁した。この５ｔｕＩ消化ＤＮＡの溶液をエタノール沈
殿に付し、遠心して集め、１０ＸＮｄｅＩバツフアー（
１，５Ｍ ＮａＣ１、０，１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐ
Ｈニア、８．７０ ｍＭ Ｍｇ（Ｊ２．６０ｍＭ ２
−メルカプトエタノールおよび１〜／ｎｌ Ｂ Ｓ Ａ
） ２１１１および水１６μｌに再懸濁した。この５
ｔｕＩ消化ＤＮＡの溶液に、制限酵素ＮｄｅＩ約２１Ｉ
ｌ（〜１０単位）を加え、得られた反応混合物を３７°
Ｃで２時間インキュベートした。
Ｎｄｅ Ｉ −３Ｌｕ Ｉ消化プラスミドｐＬＰＣＤＮ
Ａをエタノール沈殿に付し、遠心して集め、１０×クレ
ノウバツファ−５μｌおよび水４０μｌに再懸濁した。
Ａをエタノール沈殿に付し、遠心して集め、１０×クレ
ノウバツファ−５μｌおよび水４０μｌに再懸濁した。
フレノウ酵素約５Ｉｌｌ（〜２５単位）をこのＤＮＡ溶
液溶液前え、得られた反応混合物を１６°Ｃて３０分間
インキュベートした。フレノウ反応の後、反応混合物を
アガロースゲルに適用し、ゲルから〜５．８２ ｋｂ
Ｎｄｅ Ｉ −５ｔｕ Ｉ制限フラグメントを単離した
。所望のフラグメント約５ｔｔ９を得、これをＴＥバッ
ファー５１１ｔに懸濁した。
液溶液前え、得られた反応混合物を１６°Ｃて３０分間
インキュベートした。フレノウ反応の後、反応混合物を
アガロースゲルに適用し、ゲルから〜５．８２ ｋｂ
Ｎｄｅ Ｉ −５ｔｕ Ｉ制限フラグメントを単離した
。所望のフラグメント約５ｔｔ９を得、これをＴＥバッ
ファー５１１ｔに懸濁した。
プラスミドｐＳＶ２ｈｙｇの〜２．５ｋｂクレノウ処理
したＢａｍＨＩ制限フラグメント約２μｌを、プラスミ
ドｐＬＰＣの〜５．８２ｋｂ フレノウ処理したＮｃｌ
ｅ Ｉ −３ｔｕ Ｉ制限フラグメント約１μｌと混合
１−１このＤＮＡ溶液溶液前１０×リガーゼバツフアー
約３ ｌｌｅ、 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２１１１（〜
１０００単位）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１ ｐｉｒ （〜
１１単）、および水１４μｌを加えた。得られた反応混
合物を１６°Ｃで一部インキユベートした。ライゲート
したＤＮＡは、フレノウ処理した、プラスミドｐＳＶ２
ｈｙｇの〜２．５ ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラグメント
の方向性に関してのみ異る、所望のプラスミド、ｐＬＰ
ｃｈｙｇｌおよびｐＬ Ｐ Ｃｈｙｇ ２を構成してい
た。プラスミドりＬＰＣｈｙｇｌの制限サイトおよび機
能地図を添付の第１２図に示す。ライゲートされたＤＮ
Ａを用いて大腸菌に１２ＨＢ１０１ を形質転換し、所
望の大腸菌Ｋ１２ＨＢＩＯ１／ｐＬＰｃｈｙｇ１および
大腸菌Ｋ１２ＨＢＩＯ１／ｐＬＰＣｈｙｇ２形質転換体
を、アンピシリンを含んだし寒天上にプレートし、それ
らのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した
。
したＢａｍＨＩ制限フラグメント約２μｌを、プラスミ
ドｐＬＰＣの〜５．８２ｋｂ フレノウ処理したＮｃｌ
ｅ Ｉ −３ｔｕ Ｉ制限フラグメント約１μｌと混合
１−１このＤＮＡ溶液溶液前１０×リガーゼバツフアー
約３ ｌｌｅ、 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２１１１（〜
１０００単位）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１ ｐｉｒ （〜
１１単）、および水１４μｌを加えた。得られた反応混
合物を１６°Ｃで一部インキユベートした。ライゲート
したＤＮＡは、フレノウ処理した、プラスミドｐＳＶ２
ｈｙｇの〜２．５ ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラグメント
の方向性に関してのみ異る、所望のプラスミド、ｐＬＰ
ｃｈｙｇｌおよびｐＬ Ｐ Ｃｈｙｇ ２を構成してい
た。プラスミドりＬＰＣｈｙｇｌの制限サイトおよび機
能地図を添付の第１２図に示す。ライゲートされたＤＮ
Ａを用いて大腸菌に１２ＨＢ１０１ を形質転換し、所
望の大腸菌Ｋ１２ＨＢＩＯ１／ｐＬＰｃｈｙｇ１および
大腸菌Ｋ１２ＨＢＩＯ１／ｐＬＰＣｈｙｇ２形質転換体
を、アンピシリンを含んだし寒天上にプレートし、それ
らのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した
。
実施例１６ プラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬｐＣ
ｈｄ２の組立て ＴＥバッファー２０μｌ中、約２０μ２のプラスミドｐ
ＳＶ２−ｄｈｆｒ （ＡＴＣＣ３７１４６）を１０ Ｘ
ＢａｍＨＩバッファーおよび水６０ ｐｔに加える。
ｈｄ２の組立て ＴＥバッファー２０μｌ中、約２０μ２のプラスミドｐ
ＳＶ２−ｄｈｆｒ （ＡＴＣＣ３７１４６）を１０ Ｘ
ＢａｍＨＩバッファーおよび水６０ ｐｔに加える。
制限酵素ＢａｍＨＩ約１０μ！（〜５０単位）を加え、
得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベート
する。次いて、ＢａｍＨＩ消化プラスミドＤＮＡをエタ
ノール沈殿に付し、遠心して集め、ＩＯＸタレノウバッ
ファー５μｌ、水４５μｌ、およびフレノウ酵素２μ！
（〜１００単位）に再懸濁する。反応混合物を１６°Ｃ
で３０分間インキュベートした後、反応混合物をアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、消化産物が明瞭に分離するま
で泳動させる。ｄｈｆｒ遺伝子を含有する、フレノウ処
理された、〜１．９ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラグメント
を、実質上、実施例９の方法に従ってゲルから単離し、
ライゲーションのためζこ調製する。所望のフラグメン
ト約４μｙを得、ＴＥバッファー５μｌに懸濁する。
得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベート
する。次いて、ＢａｍＨＩ消化プラスミドＤＮＡをエタ
ノール沈殿に付し、遠心して集め、ＩＯＸタレノウバッ
ファー５μｌ、水４５μｌ、およびフレノウ酵素２μ！
（〜１００単位）に再懸濁する。反応混合物を１６°Ｃ
で３０分間インキュベートした後、反応混合物をアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、消化産物が明瞭に分離するま
で泳動させる。ｄｈｆｒ遺伝子を含有する、フレノウ処
理された、〜１．９ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラグメント
を、実質上、実施例９の方法に従ってゲルから単離し、
ライゲーションのためζこ調製する。所望のフラグメン
ト約４μｙを得、ＴＥバッファー５μｌに懸濁する。
ＴＥバッファー１００μｌ中、プラスミドｐＬＰＣｈＹ
ｇ １約２００μノを１０ＸＥｃｏＲＩバツフアー１５
μｌおよび水３０μｌに加えた。このプラスミドｐＬＰ
Ｃｈｙｇｌ ＤＮＡの溶液に制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ約５
μｌ（〜５０単位）を加え、得られた反応混合物を３７
℃で約１０分間インキュベートした。反応時間が短かい
のはＥｃｏ ＲＩ部分消化のためである。
ｇ １約２００μノを１０ＸＥｃｏＲＩバツフアー１５
μｌおよび水３０μｌに加えた。このプラスミドｐＬＰ
Ｃｈｙｇｌ ＤＮＡの溶液に制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ約５
μｌ（〜５０単位）を加え、得られた反応混合物を３７
℃で約１０分間インキュベートした。反応時間が短かい
のはＥｃｏ ＲＩ部分消化のためである。
プラスミドｐ Ｌ Ｐ Ｃｈｙｇは２個のＥｃｏ ＲＩ
制限部位、１つはハイグロマイシン耐性付与（ＨｍＲ）
遺伝子の暗号配列内（こあるが、ｄｈｆｒ遺伝子含有制
限フラグメントは、プラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌの、こ
のＨｍＲ遺伝遺伝区内るＥｃｏＲＩ部位と異なるＥｃ。
制限部位、１つはハイグロマイシン耐性付与（ＨｍＲ）
遺伝子の暗号配列内（こあるが、ｄｈｆｒ遺伝子含有制
限フラグメントは、プラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌの、こ
のＨｍＲ遺伝遺伝区内るＥｃｏＲＩ部位と異なるＥｃ。
ＲＩ部位に挿入されるのが望ましい。部分的なＥｃｏＲ
Ｉ消化プラスミドｐＬｐｃｈｙｇＩＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動にかけ、１箇所を切断されたｐＬｐｃｈｙ
ｇ ＤＮＡが、非切断プラスミドＤＮＡおよび他の消化
産物から分離するまで泳動させた。
Ｉ消化プラスミドｐＬｐｃｈｙｇＩＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動にかけ、１箇所を切断されたｐＬｐｃｈｙ
ｇ ＤＮＡが、非切断プラスミドＤＮＡおよび他の消化
産物から分離するまで泳動させた。
実質上、実施例９の方法に従い、１箇所切断ＤＮＡをゲ
ルから単離し、ライゲーションのために調製した。単１
のＥｃｏＲＩ切断プラスミドｐＬＰＣｈｙｇ １約２μ
りを得、ＴＥバッファー２５μｌ中に懸約 濁した。この試料に、フレノウ酵へ５μｌ（〜２５単位
）、１０×タレノウバツフアー５ｔｉｉ、および水４０
μｉを加え、得られた反応混合物を１６°Ｃて６０分間
インキュベートした。次いて、フレノウ処理した、Ｅｃ
ｏ ＲＩ部分消化ＤＮＡをフェノールで２回、さらに、
クロロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿に付し、Ｔ
Ｅバッファー２５ ｔｔｔ： ｌこ再（開局した。
ルから単離し、ライゲーションのために調製した。単１
のＥｃｏＲＩ切断プラスミドｐＬＰＣｈｙｇ １約２μ
りを得、ＴＥバッファー２５μｌ中に懸約 濁した。この試料に、フレノウ酵へ５μｌ（〜２５単位
）、１０×タレノウバツフアー５ｔｉｉ、および水４０
μｉを加え、得られた反応混合物を１６°Ｃて６０分間
インキュベートした。次いて、フレノウ処理した、Ｅｃ
ｏ ＲＩ部分消化ＤＮＡをフェノールで２回、さらに、
クロロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿に付し、Ｔ
Ｅバッファー２５ ｔｔｔ： ｌこ再（開局した。
ｄｈｆｒ遺伝子を含有する〜１．９ｋｂ のフレノウ処
理したＢａｍＨＩ制限フラグメントと単１のＥｃ。
理したＢａｍＨＩ制限フラグメントと単１のＥｃ。
ＲＩ切断プラスミドｐＬｐｃｈｙｇｉ ＤＮＡとを一緒
に混合し、１０×リガーゼバツフアーｌｌ１ｌ、水５ｔ
ｔｉ、 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１ ／１１ （〜５００
５００単およびＴ４ ＲＮＡリガーゼ１μｌ（〜２単位
）をＤＮＡ混合物に加え、得られた反応混合物を１６°
Ｃで一部インキユベートした。ライゲートしたＤＮＡは
、ｄｈｆｒ遺伝子を含んだ〜１．９ｋｂ フラグメント
の方向性に関してのみ異る所望のプラスミドｐＬＰｃｈ
ｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２を構成していた。
に混合し、１０×リガーゼバツフアーｌｌ１ｌ、水５ｔ
ｔｉ、 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１ ／１１ （〜５００
５００単およびＴ４ ＲＮＡリガーゼ１μｌ（〜２単位
）をＤＮＡ混合物に加え、得られた反応混合物を１６°
Ｃで一部インキユベートした。ライゲートしたＤＮＡは
、ｄｈｆｒ遺伝子を含んだ〜１．９ｋｂ フラグメント
の方向性に関してのみ異る所望のプラスミドｐＬＰｃｈ
ｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２を構成していた。
ライゲートしたＤＮＡを用い、コンピテントな大腸菌に
１２ＨＢ１０１細胞を形質転換した。形質転換された細
胞をアンピシリン１００μｙ ／ ｍｅを含んだＬ寒天
上にプレートし、アンピシリン耐性の形質転換体をその
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって分析し、大腸
菌に１２ＨＢ１０１／ｐＬＰＣｈｄｌ および大腸菌
に１２ＨＢ１０１．／ｐＬＰＣｈｄ ２形質転換体を同
定した。プラスミドｐＬＰＣｈｄ １の制限サイトおよ
び機能地図を添付の第１３図に示す。次いで、適切な形
質転換体からプラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびプラスミ
ドｐＬＰＣｈｄ２を単離した。
１２ＨＢ１０１細胞を形質転換した。形質転換された細
胞をアンピシリン１００μｙ ／ ｍｅを含んだＬ寒天
上にプレートし、アンピシリン耐性の形質転換体をその
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって分析し、大腸
菌に１２ＨＢ１０１／ｐＬＰＣｈｄｌ および大腸菌
に１２ＨＢ１０１．／ｐＬＰＣｈｄ ２形質転換体を同
定した。プラスミドｐＬＰＣｈｄ １の制限サイトおよ
び機能地図を添付の第１３図に示す。次いで、適切な形
質転換体からプラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびプラスミ
ドｐＬＰＣｈｄ２を単離した。
実施例１７ プラスミドｐｈｄの組立てプラスミドｐｈ
ｄを組立てるには、ｄａｍ遺伝子等にコードされており
、その産物が配列： ５’−ＧＡＴＣ−３′中のアデニ
ン残基をメチル化する、アデニンメチラーゼを欠いてい
る大腸菌宿主細胞からプラスミドｐｈｄの組立て出発物
質であるプラスミドｐＬＰｃｈｄｌ ＤＮＡを調製す
る必要があった。大腸菌に１２ＧＭ４８ （ＮＲＲＬ
Ｂ−１５７２５）は機能的なｄａｍメチラーゼを欠いて
おり、従って、プラスミドｐｈｄの出発物として用いら
れるプラスミドｐＬＰｃｈｄＩ ＤＮＡを調製するため
の宿主として適する。
ｄを組立てるには、ｄａｍ遺伝子等にコードされており
、その産物が配列： ５’−ＧＡＴＣ−３′中のアデニ
ン残基をメチル化する、アデニンメチラーゼを欠いてい
る大腸菌宿主細胞からプラスミドｐｈｄの組立て出発物
質であるプラスミドｐＬＰｃｈｄｌ ＤＮＡを調製す
る必要があった。大腸菌に１２ＧＭ４８ （ＮＲＲＬ
Ｂ−１５７２５）は機能的なｄａｍメチラーゼを欠いて
おり、従って、プラスミドｐｈｄの出発物として用いら
れるプラスミドｐＬＰｃｈｄＩ ＤＮＡを調製するため
の宿主として適する。
大腸菌に１２ＧＭ４８細胞を培養し、形質転換受容能を
有する細胞を調製し、プラスミドｐＬＰＣｈｙｇ １を
用いてこの大腸菌に１２ＧＭ４８細胞を形質転換した。
有する細胞を調製し、プラスミドｐＬＰＣｈｙｇ １を
用いてこの大腸菌に１２ＧＭ４８細胞を形質転換した。
形質転換された細胞を、アンピシリンを含んだＬ寒天上
にプレートし、アンピシリン耐性ノ、大腸菌に１２ＧＭ
４８／ｐＬＰＣｈｄ１形質転換体がコロニーを形成した
後、その様なコロニーの１つを用いてプラスミドｐＬＰ
ｃｈｄｌ ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＬＰｃｈｄ
ｌ ＤＮＡ約１＝ｙを得、これをＴＥバッファー約１ｆ
ｆ＋／に懸濁した。
にプレートし、アンピシリン耐性ノ、大腸菌に１２ＧＭ
４８／ｐＬＰＣｈｄ１形質転換体がコロニーを形成した
後、その様なコロニーの１つを用いてプラスミドｐＬＰ
ｃｈｄｌ ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＬＰｃｈｄ
ｌ ＤＮＡ約１＝ｙを得、これをＴＥバッファー約１ｆ
ｆ＋／に懸濁した。
ＴＥバッファー２μｌ中のプラスミドｐＬＰｃｈｄｌＤ
ＮＡ約２μノを、１０ＸＢｃｌＩバツフアー（７５０ｍ
Ｍ ＫＣＩ、 ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ＝
７．４．１００ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃ／ ２．１０ｍＭＤＴ
Ｔおよび１＝ｖ／−ｚＢｓＡ）２μｌおよび水１４μｌ
に加えた。このプラスミドｐＬＰＣｈｄＩ ＤＮＡの溶
液に制限酵素ＢｃｌＩ約２μｌ（〜１０単位）を加え、
得られた反応混合物を５０°Ｃで２時間インキュベート
した。混合物をフェノールで１回、クロロホルムで２回
抽出することにより反応を止めた。
ＮＡ約２μノを、１０ＸＢｃｌＩバツフアー（７５０ｍ
Ｍ ＫＣＩ、 ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ＝
７．４．１００ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃ／ ２．１０ｍＭＤＴ
Ｔおよび１＝ｖ／−ｚＢｓＡ）２μｌおよび水１４μｌ
に加えた。このプラスミドｐＬＰＣｈｄＩ ＤＮＡの溶
液に制限酵素ＢｃｌＩ約２μｌ（〜１０単位）を加え、
得られた反応混合物を５０°Ｃで２時間インキュベート
した。混合物をフェノールで１回、クロロホルムで２回
抽出することにより反応を止めた。
ＢｃｌＩ消化プラスミドｐＬＰｃｈｄｌ ＤＮＡをｌＯ
×リガーゼバッファー１μｌ、水８μｌおよびＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ１μ！（〜５００単位）ｌこ加えた。
×リガーゼバッファー１μｌ、水８μｌおよびＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ１μ！（〜５００単位）ｌこ加えた。
このライゲーション反応混合物を１６℃で一部インキユ
ベートすると、ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミ
ドｐｈｄを構成していた。プラスミドｐｈｄは、プラス
ミドｐＬＰｃｈｄｌ からの、プラスミドｐＬＰｃａｔ
の組立て中に付加された余分のＢｃｌｌｌＪンカー
の欠失、並びに、２個の隣り合った、合計サイズ１．４
５ｋｂのＢｃｌ Ｉ制限フラグメントの欠失により得ら
れた。プラスミドｐｈｄの制限サイトおよび機能地図を
添付の第１４図に示す。
ベートすると、ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミ
ドｐｈｄを構成していた。プラスミドｐｈｄは、プラス
ミドｐＬＰｃｈｄｌ からの、プラスミドｐＬＰｃａｔ
の組立て中に付加された余分のＢｃｌｌｌＪンカー
の欠失、並びに、２個の隣り合った、合計サイズ１．４
５ｋｂのＢｃｌ Ｉ制限フラグメントの欠失により得ら
れた。プラスミドｐｈｄの制限サイトおよび機能地図を
添付の第１４図に示す。
プラスミドｐｈｄは、ヒトプロティンＳの如く、発現さ
せるべきＤＮＡを、発現にとって適正な位置であるプラ
スミドｐｈｄの単１のＢｃｌＩ部位に容易に挿入するこ
七ができ乙ので、本発明のＢＫウィルスエンハンサー−
アデノウイルスｌプロモーターカらのＤＮＡの発現を促
進する。
せるべきＤＮＡを、発現にとって適正な位置であるプラ
スミドｐｈｄの単１のＢｃｌＩ部位に容易に挿入するこ
七ができ乙ので、本発明のＢＫウィルスエンハンサー−
アデノウイルスｌプロモーターカらのＤＮＡの発現を促
進する。
ライゲートしたＤＮＡを用いて大腸菌に１２ＧＭ４８を
形質転換し、形質転換された細胞をアンピシリンを含ん
だし一寒天上にプレートした。アンピシリン尉性大腸［
項Ｋ １２ ＧＭ４８／ｐｈｄ形質転換体をそのプラス
ミドＤ Ｎ Ａの制限酵素分析により同定した。
形質転換し、形質転換された細胞をアンピシリンを含ん
だし一寒天上にプレートした。アンピシリン尉性大腸［
項Ｋ １２ ＧＭ４８／ｐｈｄ形質転換体をそのプラス
ミドＤ Ｎ Ａの制限酵素分析により同定した。
実施例１８ ヒトプロティンＳ発現ベクターの組立て
Ａ、プラスミドｐＳｈｃ＋の組立て
ＴＥバッファー２μ！中のプラスミドｐｈｄＤＮＡ約２
μ）を、実質上、実施例１７の教示に従ってＢｃｌＩ制
限酵素で消化した。ＢｃｌＩ消化プラスミドＤＮＡをエ
タノール沈殿に付し、遠心して集め、１０×タレノウバ
ツフアー５μｌおよび水４０μｌに再忍濁した。このＤ
ＮＡ溶液にフレノウ酵素約５μｌ（約２５単位）を加え
、得られた反応混合物を１６°Ｃで３０分間インキュベ
ートした。フレノウ反応の後、反応混合物をアガロース
ゲルに適用し、ゲルからベクターフラグメントを単離し
た。
μ）を、実質上、実施例１７の教示に従ってＢｃｌＩ制
限酵素で消化した。ＢｃｌＩ消化プラスミドＤＮＡをエ
タノール沈殿に付し、遠心して集め、１０×タレノウバ
ツフアー５μｌおよび水４０μｌに再忍濁した。このＤ
ＮＡ溶液にフレノウ酵素約５μｌ（約２５単位）を加え
、得られた反応混合物を１６°Ｃで３０分間インキュベ
ートした。フレノウ反応の後、反応混合物をアガロース
ゲルに適用し、ゲルからベクターフラグメントを単離し
た。
所望のフラグメント約０．５ ｍを得、ＴＥバッファー
１０μｌに懸濁した。
１０μｌに懸濁した。
プラスミドｐＨＨＳ−ＩＩａ ＤＮＡ約２０１１ｙを１
０Ｘ Ｆｎｕ Ｄ ＩＩ反応バッファー１０１ｔｔ、制
限酵素ＦｎｕＤ■１０１１１（〜２０単位）および水８
０ ｔｔｔに溶かし、この反応？昆合物を３７℃で２時
間放置した。
０Ｘ Ｆｎｕ Ｄ ＩＩ反応バッファー１０１ｔｔ、制
限酵素ＦｎｕＤ■１０１１１（〜２０単位）および水８
０ ｔｔｔに溶かし、この反応？昆合物を３７℃で２時
間放置した。
この反応混合物にＮａＣｔを加えて５０ｍＭとし、反応
酵素ＥｃｏＲＶ ５１１１ （〜５０単位）を加えて調
節ｉ−だ。得られた反応混合物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。ＥＣ０ＲＶ消化の後、反応混合物を１，
０％アガロースゲルに適用し、所望の〜２．７ｋｂ Ｆ
ｎｕＤＩＩ−ＥｃｏＲＶ制限フラグメントを単離した。
酵素ＥｃｏＲＶ ５１１１ （〜５０単位）を加えて調
節ｉ−だ。得られた反応混合物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。ＥＣ０ＲＶ消化の後、反応混合物を１，
０％アガロースゲルに適用し、所望の〜２．７ｋｂ Ｆ
ｎｕＤＩＩ−ＥｃｏＲＶ制限フラグメントを単離した。
フラグメント約１０μノを得、ＴＥバッファー５０μｌ
に懸溺した。
に懸溺した。
ＢｃｌＩ消化プラスミドｐｈｄ約５μ／と〜２．７ｋｂ
ＦｎｕＤＩ−ＥｃｏＲＶ制限フラグメント約２μｌとを
、ライゲーション反応混合物にＲＮ Ａ ＩＪガーゼ（
ＢＲＬ）〜０．４単位を加えること以外は、実質上、前
出の各実施例に記載した方法に従い、ライゲートさせた
。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＳｈｄを
構成していた。このプラスミドの制限サイトおよび機能
地図を添付の第１図に示す。
ＦｎｕＤＩ−ＥｃｏＲＶ制限フラグメント約２μｌとを
、ライゲーション反応混合物にＲＮ Ａ ＩＪガーゼ（
ＢＲＬ）〜０．４単位を加えること以外は、実質上、前
出の各実施例に記載した方法に従い、ライゲートさせた
。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＳｈｄを
構成していた。このプラスミドの制限サイトおよび機能
地図を添付の第１図に示す。
大腸菌に１２ＨＢ１０１ 細胞に形質転換受容能を与え
、上で調製した、ライゲートしたＤＮＡを用いて形質転
換した。形質転換混合物の一部をアンピシリンを含んだ
し一寒天上にプレートした。制限酵素分析によりアンピ
シリン耐性大腸菌に１２ＨＢＩ Ｏ１，／ｐＳ ｈｄ形
質転換体を同定した。
、上で調製した、ライゲートしたＤＮＡを用いて形質転
換した。形質転換混合物の一部をアンピシリンを含んだ
し一寒天上にプレートした。制限酵素分析によりアンピ
シリン耐性大腸菌に１２ＨＢＩ Ｏ１，／ｐＳ ｈｄ形
質転換体を同定した。
別法として、プロティンＳの暗号配列のみを含んだフラ
グメントを単離したい場合には、分子の５′末端から余
分の塩基対を除去し１．Ａ Ｔ Ｇ開始コドンから始ま
る分子を生成させることができる。
グメントを単離したい場合には、分子の５′末端から余
分の塩基対を除去し１．Ａ Ｔ Ｇ開始コドンから始ま
る分子を生成させることができる。
即ち、線状ＤＮＡ分子を両末端から攻撃し、予測可能な
速度で分子を漸次短かくする、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ
と呼ばれるエキソヌクレアーゼで、線状ＤＮＡを消化す
る。ｐＨＨＳ−ＩＩａ ５μｙを、６ｍＭＮａＣｔ、６
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ 、 ｐＨ＝ ７．４．６
μＭＭｇ ＣＪ ２、および６μＭ２−メルカプトエタ
ノール１００μｌ中でＦｎｕＤ］Ｉ５単位により消化す
る。エタノール沈殿の後、３．５％アクリルアミドゲル
電気泳動にかけてＤＮＡフラグメントを分離し、実施例
３の記載の如くにして２．７ｋｂ フラグメントを単離
する。かくして、ＢＡＬ３１による消化のためのフラグ
メントが調製された。反応条件を次に示す：ＤＮＡ５μ
ｐを０．５ Ｍ ＮａＣｔ、１２．５ｍＭＣａＣ！２．
１２．５ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃｌ ２．２０ ｍ Ｍ Ｔ
ｒ ｉ ５−ＨＣＩ、ｐｒ−ｒ＝ｓ、ｏオよび１ｍＭ
ＥＤＴ、Ａ、ｐＨ＝８．０．５゜Ｉｌｌ に溶かす。Ｂ
ａ１３１を１単位加え、３０″Ｃで３０秒間反応を続け
る。エタノール沈殿の後、Ｔ４ＤＮ Ａポリメラーゼで
処理してＢＡＬ３１の作用によって残っているかもしれ
ない粘着末端を充填する。
速度で分子を漸次短かくする、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ
と呼ばれるエキソヌクレアーゼで、線状ＤＮＡを消化す
る。ｐＨＨＳ−ＩＩａ ５μｙを、６ｍＭＮａＣｔ、６
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ 、 ｐＨ＝ ７．４．６
μＭＭｇ ＣＪ ２、および６μＭ２−メルカプトエタ
ノール１００μｌ中でＦｎｕＤ］Ｉ５単位により消化す
る。エタノール沈殿の後、３．５％アクリルアミドゲル
電気泳動にかけてＤＮＡフラグメントを分離し、実施例
３の記載の如くにして２．７ｋｂ フラグメントを単離
する。かくして、ＢＡＬ３１による消化のためのフラグ
メントが調製された。反応条件を次に示す：ＤＮＡ５μ
ｐを０．５ Ｍ ＮａＣｔ、１２．５ｍＭＣａＣ！２．
１２．５ ｍ Ｍ Ｍｇ Ｃｌ ２．２０ ｍ Ｍ Ｔ
ｒ ｉ ５−ＨＣＩ、ｐｒ−ｒ＝ｓ、ｏオよび１ｍＭ
ＥＤＴ、Ａ、ｐＨ＝８．０．５゜Ｉｌｌ に溶かす。Ｂ
ａ１３１を１単位加え、３０″Ｃで３０秒間反応を続け
る。エタノール沈殿の後、Ｔ４ＤＮ Ａポリメラーゼで
処理してＢＡＬ３１の作用によって残っているかもしれ
ない粘着末端を充填する。
このＤＮＡを反応バッファーＣＩ ６．６ ｍＭ （Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４，０，６７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐＨ
＝８．８．０．６７ ｍＭＭｇＣｚ２．１Ｍ２−メルカ
プトエタノール、および６．７μＭＥＤＴＡ）１９μＩ
に再懸澗する。これに、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｉ、ｐ
Ｈ＝７．５．１００ ｍＭ （ＮＨ４）２Ｓ○４、］、
］ｙｎｑ、１−１ｔＢ ＳＡおよび１０ｍＭ２−メル
カプトエタノール中で】／１０に希釈したＴ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼ１１ｉ１ （０，５単位）を加える。この
反応混合物を３７°Ｃで１０分間インキュベートした後
、各ｄ Ｎ Ｔ Ｐ ２ ｍＭを含んだｄＮＴＰミック
ス１ μｍを加える。３７°Ｃでさらに１０分間反応を
行った後、エタノール沈殿に付す。このフラグメントハ
あらゆる平滑末端ベクターとのライゲーションに用い得
る。これらの条件下で、ＢＡＬ３１は、約２５塩基対′
分７′末端の割合で除去する。ライゲーションし、大腸
菌宿主を形質転換し、さらに独立のクローンからＤＮＡ
を単離した後、このＤＮＡを用いて配列決定を行い、ど
のクローンが所望の正確な配列を含有しているかを決定
することができる。
Ｈ４）２ＳＯ４，０，６７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐＨ
＝８．８．０．６７ ｍＭＭｇＣｚ２．１Ｍ２−メルカ
プトエタノール、および６．７μＭＥＤＴＡ）１９μＩ
に再懸澗する。これに、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｉ、ｐ
Ｈ＝７．５．１００ ｍＭ （ＮＨ４）２Ｓ○４、］、
］ｙｎｑ、１−１ｔＢ ＳＡおよび１０ｍＭ２−メル
カプトエタノール中で】／１０に希釈したＴ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼ１１ｉ１ （０，５単位）を加える。この
反応混合物を３７°Ｃで１０分間インキュベートした後
、各ｄ Ｎ Ｔ Ｐ ２ ｍＭを含んだｄＮＴＰミック
ス１ μｍを加える。３７°Ｃでさらに１０分間反応を
行った後、エタノール沈殿に付す。このフラグメントハ
あらゆる平滑末端ベクターとのライゲーションに用い得
る。これらの条件下で、ＢＡＬ３１は、約２５塩基対′
分７′末端の割合で除去する。ライゲーションし、大腸
菌宿主を形質転換し、さらに独立のクローンからＤＮＡ
を単離した後、このＤＮＡを用いて配列決定を行い、ど
のクローンが所望の正確な配列を含有しているかを決定
することができる。
また、プラスミドｐＨＨ３：［ａは、その３′末端に、
暗号配列最後のトリプレットの直ぐ下流にある天然のＴ
ＡＡ終止コドンをも含めて、余分の非暗号化配列を含有
している。これらの配列は次の様にして除去される：無
傷のプラスミド５μ）をＦｎｕｄ■５単位を含んだＦｎ
ｕ Ｄ ：［反応バッファー１００μｌ中で完全に消化
する。ＤＮＡをエタノール沈殿に付し、遠心して回収す
る。ペレットを乾燥し、ＥｃｏＲＩ５単位を含んだＩＸ
ＥｃｏＲＩバッファー１００μｅに再懸眉する。３７°
Ｃで９０分間経過した後、再度ＤＮＡをエタノール沈殿
に付し、３．５％ポリアクリルアミドゲルに適用する。
暗号配列最後のトリプレットの直ぐ下流にある天然のＴ
ＡＡ終止コドンをも含めて、余分の非暗号化配列を含有
している。これらの配列は次の様にして除去される：無
傷のプラスミド５μ）をＦｎｕｄ■５単位を含んだＦｎ
ｕ Ｄ ：［反応バッファー１００μｌ中で完全に消化
する。ＤＮＡをエタノール沈殿に付し、遠心して回収す
る。ペレットを乾燥し、ＥｃｏＲＩ５単位を含んだＩＸ
ＥｃｏＲＩバッファー１００μｅに再懸眉する。３７°
Ｃで９０分間経過した後、再度ＤＮＡをエタノール沈殿
に付し、３．５％ポリアクリルアミドゲルに適用する。
電気泳動により生産物を分け、実施例３の記載に従い〜
２０３０塩基対のバンドを抽出する。ＥｃｏＲＩ部位は
天然の終止コドンから１塩基だけ離れて位置するのでＥ
ｃｏＲＩ消化では最初のＧ残基のみが残ることとなり、
従って、残りのＥｃｏ ＲＩ部位の塩基、Ｔ残基および
終止コドンを置き換える必要がある。この目的のために
、式： で示されるリンカ−を考案した。これは、任意の標準的
な手法で合成し得る。このリンカ−は天然の配列と、そ
の位置で確実に停止させるためにリーディングフレーム
内にある終止コドンを付加的ζこ挿入したものである。
２０３０塩基対のバンドを抽出する。ＥｃｏＲＩ部位は
天然の終止コドンから１塩基だけ離れて位置するのでＥ
ｃｏＲＩ消化では最初のＧ残基のみが残ることとなり、
従って、残りのＥｃｏ ＲＩ部位の塩基、Ｔ残基および
終止コドンを置き換える必要がある。この目的のために
、式： で示されるリンカ−を考案した。これは、任意の標準的
な手法で合成し得る。このリンカ−は天然の配列と、そ
の位置で確実に停止させるためにリーディングフレーム
内にある終止コドンを付加的ζこ挿入したものである。
さらに、このリンカ−は、ＢａｍＨＩ、Ｂｇｌｍまたは
ＢｃｌＩ末端と適合し得るＣＴＡＧ突出を含有している
。三片（ｔｈｒｅｅ ｐｉｅｃｅ）ライゲーション反応
において、これらのフラグメントはＢａｍＨＩ、Ｂｇｌ
ＩＩまたはＢｃｌＩ末端と共？こ１個の平滑末端（プラ
ントエンド）含有するベクターとライゲートし得る。
ＢｃｌＩ末端と適合し得るＣＴＡＧ突出を含有している
。三片（ｔｈｒｅｅ ｐｉｅｃｅ）ライゲーション反応
において、これらのフラグメントはＢａｍＨＩ、Ｂｇｌ
ＩＩまたはＢｃｌＩ末端と共？こ１個の平滑末端（プラ
ントエンド）含有するベクターとライゲートし得る。
Ｂ、形質転換
以下に述べる形質転換法は宿主セルラインとして２９３
細胞に関するものであるが、この方法は大多数の真核性
セルラインに適用可能である。
細胞に関するものであるが、この方法は大多数の真核性
セルラインに適用可能である。
２９３細胞は、ＡＴＣＣから寄託番号ＣＲＬ１５７３の
下、２５ａ＋フラスコ内に入れた１０％熱不活化ウマ血
清を含んだイーグルの最少必須培地中に全面成長した、
単層の約５．５ Ｘ １０６細胞として得られた。フラ
スコを３７℃でインキュベートし、週に２回培地を変え
た。培地を除き、バンクの平衡塩類溶液（ギブコ）で洗
浄し、１〜２分間、０．２５％トリプシンを加え、新鮮
な培地で洗浄し、吸引し、継代培養比１：５または１：
１０で細胞を継代培養した。
下、２５ａ＋フラスコ内に入れた１０％熱不活化ウマ血
清を含んだイーグルの最少必須培地中に全面成長した、
単層の約５．５ Ｘ １０６細胞として得られた。フラ
スコを３７℃でインキュベートし、週に２回培地を変え
た。培地を除き、バンクの平衡塩類溶液（ギブコ）で洗
浄し、１〜２分間、０．２５％トリプシンを加え、新鮮
な培地で洗浄し、吸引し、継代培養比１：５または１：
１０で細胞を継代培養した。
形質転換の１日前に、培養皿１枚につき、０．７×１０
個の細胞を播いた。形質転換の４時間前に培地を交換し
た。滅菌し、エタノール沈殿させたプラスミドＤＮＡを
ＴＥバッファーに溶かし、これを用いて、ＤＮＡ４０ｔ
ｉｙ／ｗ、および２５０ｍＭＣａＣｚ２を含有する２ｘ
ＤＮＡ−ＣａＣ１２溶液を調製した。２ＸＨＢＳは、２
８０ ｍＭ ＮａＣ／、 ５０ ｍＭＨｅｐｅｓ、およ
び１．５ ｍＭりん酸ナトリウムを含有させ、ｐＨ７，
０５〜７，１５に調節して調製された。
個の細胞を播いた。形質転換の４時間前に培地を交換し
た。滅菌し、エタノール沈殿させたプラスミドＤＮＡを
ＴＥバッファーに溶かし、これを用いて、ＤＮＡ４０ｔ
ｉｙ／ｗ、および２５０ｍＭＣａＣｚ２を含有する２ｘ
ＤＮＡ−ＣａＣ１２溶液を調製した。２ＸＨＢＳは、２
８０ ｍＭ ＮａＣ／、 ５０ ｍＭＨｅｐｅｓ、およ
び１．５ ｍＭりん酸ナトリウムを含有させ、ｐＨ７，
０５〜７，１５に調節して調製された。
等容量の滅菌した２ＸＨＢＳに２ ｘ Ｄ Ｎ Ａ −
ＣａＣ１２溶液を滴下して加えた。綿栓を付けた１ｆｆ
Ｉｔ！の滅菌したプラスチック製ピペットを２ＸＨＢＳ
の入った混合用試験管に挿入し、ＤＮＡの添加期間中、
通気して気泡を導入した。攪拌せず、室温で３０〜４５
分間おいてりん酸カルシウムーＤＮＡ沈殿を形成させた
。
ＣａＣ１２溶液を滴下して加えた。綿栓を付けた１ｆｆ
Ｉｔ！の滅菌したプラスチック製ピペットを２ＸＨＢＳ
の入った混合用試験管に挿入し、ＤＮＡの添加期間中、
通気して気泡を導入した。攪拌せず、室温で３０〜４５
分間おいてりん酸カルシウムーＤＮＡ沈殿を形成させた
。
次いて、プラスチックピペットで静かにピペッティング
することにより沈殿を混合し、沈殿１ｄ（プレートあた
り）を、受容細胞を覆っている増殖培地ＩＱｍｅに直接
加えた。３７°Ｃて４時間インキュベートした後、１０
％ウシ胎児血清を含んだＤ Ｍ Ｅ Ｍ培地で培地を置
き換え、細胞ｌこ選択圧を与えるまでさらに７２時間イ
ンキュベートした。
することにより沈殿を混合し、沈殿１ｄ（プレートあた
り）を、受容細胞を覆っている増殖培地ＩＱｍｅに直接
加えた。３７°Ｃて４時間インキュベートした後、１０
％ウシ胎児血清を含んだＤ Ｍ Ｅ Ｍ培地で培地を置
き換え、細胞ｌこ選択圧を与えるまでさらに７２時間イ
ンキュベートした。
組換えヒトプロティンＳを発現する形質転換体のために
、増殖培地中に、タンパク質のγカルボキシル化に必要
なコファクターであるビタミンＫを１０μ９ ／ ｍｅ
金含有せる。
、増殖培地中に、タンパク質のγカルボキシル化に必要
なコファクターであるビタミンＫを１０μ９ ／ ｍｅ
金含有せる。
増殖培地にハイグロマイノンを材製１ｆｆｉ約２ｏ。
７１９、−’＋ｒ、、２になるように加える。次いて、
細胞を３７”Ｃ１こおいて、３〜４日おきに培地を交換
しながら、２〜４週間インキュベートする。得られたハ
イグロマイシン耐性コロニーを特性化のために別々の培
養フラスコに移す。２９３細胞はｄｈｆｒ陽性であるた
め、ヒポキサンチンおよびチミンを欠く培地中での増殖
能力として示されるｄｈｆｒ陽性表現型のみによってｄ
ｈｆｒ遺伝子を含有するプラスミドを持つ形質転換体を
選択するこさはできない。
細胞を３７”Ｃ１こおいて、３〜４日おきに培地を交換
しながら、２〜４週間インキュベートする。得られたハ
イグロマイシン耐性コロニーを特性化のために別々の培
養フラスコに移す。２９３細胞はｄｈｆｒ陽性であるた
め、ヒポキサンチンおよびチミンを欠く培地中での増殖
能力として示されるｄｈｆｒ陽性表現型のみによってｄ
ｈｆｒ遺伝子を含有するプラスミドを持つ形質転換体を
選択するこさはできない。
機能的なｄｈｆｒ遺伝子を含まないセルラ％ｂ’ ｄｈ
ｆ ｒ含有プラスミドで形質転換された場合、ｄｈｆ
ｒ＋表現型に基づいて選択され得る。
ｆ ｒ含有プラスミドで形質転換された場合、ｄｈｆ
ｒ＋表現型に基づいて選択され得る。
文献では、遺伝子またはプラスミドをａｈｆｒ欠損セル
ラインｌこ導入するための選択マーカーとしてジヒドロ
葉酸還元酵素を用い、続いて、プラスミドノコピー数を
増加するためにメトトレキセートを用いる方法が既に確
立されている。ｄｈｆｒ産生細胞における選択可能かつ
増殖可能なマーカーとしてのｄｈｆｒの使用はまだ充分
に確立されていないが、文献中の証拠から、ｄｈｆｒを
ｄｈｆｒ産生細胞（こおける選択マーカー、並び（（＝
遺伝子の増幅のために用い得ることが示唆されている。
ラインｌこ導入するための選択マーカーとしてジヒドロ
葉酸還元酵素を用い、続いて、プラスミドノコピー数を
増加するためにメトトレキセートを用いる方法が既に確
立されている。ｄｈｆｒ産生細胞における選択可能かつ
増殖可能なマーカーとしてのｄｈｆｒの使用はまだ充分
に確立されていないが、文献中の証拠から、ｄｈｆｒを
ｄｈｆｒ産生細胞（こおける選択マーカー、並び（（＝
遺伝子の増幅のために用い得ることが示唆されている。
本発明の用途は用いられる選択マーカーによって限定さ
れることはない。メタロチオナイン遺伝子、アデノンン
デアミナーゼ遺伝子、あるいはＰ−グリコプロティンで
代表される多重遺伝子耐性族のメンバーの如き増幅可能
なマーカーを利用することもできる。
れることはない。メタロチオナイン遺伝子、アデノンン
デアミナーゼ遺伝子、あるいはＰ−グリコプロティンで
代表される多重遺伝子耐性族のメンバーの如き増幅可能
なマーカーを利用することもできる。
以上、本発明をより明確にし、理解されることを目的と
して代表例と実施例によりやや詳細に説明したが、本明
細書の特許請求の囲の範囲内で、ある種の変更または改
良を行い得ることは明らかである。
して代表例と実施例によりやや詳細に説明したが、本明
細書の特許請求の囲の範囲内で、ある種の変更または改
良を行い得ることは明らかである。
第１図はプラスミドｐＳｈｄ （１１，５ｋｂ ）の制
限サイトおよび機能地図、第２図はプラスミドｐＨＨｓ
−ＩＩａ （７，７ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地
図、第３図はプラスミドｐＢＫＥ １ （７，９ｋｂ
）の制限サイトおよび機能地図、第４図はプラスミドｐ
ＢＫｎｅｏ １ （１１，５ｋｂ ）の制限サイトおよ
び機能地図、第５図はプラスミドｐＳＶ ２ ｃａｔ
（５，０１５ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地図、第
６図はプラスミドｐＬＰｃａｔ （４，８３ｋｂ ）の
制限サイトおよび機能地図、第７図はプラスミドｐＢＬ
ｃａｔ （６，０９ｋｂ）の制限サイトおよび機能地図
を示す模式図、第８図はプラスミドｐＬ１３３の組み立
てを示すフローチャート、第９図はプラスミドｐＬＰＣ
（６，５ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地図、第１０
図はプラスミドｐＬＰＣ４（１１，７ｋｂ）の制限サイ
トおよび機能地図、第１１図はプラスミドｐ ＳＶ２ｂ
ｙｇ （５，２４ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地図
、第１２図はプラスミドｐＬｐｃｈｙｇ １ （８，３
ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地図、第１３図はプラ
スミドｐＬＰｃｈｄｌ （１０，２３ｋｂ）の制限サイ
トおよび機能地図、第１４図はプラスミドｐｈｄ（８，
５５ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地図を示す模式図
である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンノｆニ
ー 代 理 人 弁理士青白 葆（外１名）８９目１ ＥｃｏＲＶ （Ｐｅｔす ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、ｌｏ Ｅｅ）４）べ１ ＦＩＧ、＋２ 日ｇｌｌｌ ｅｓ
ｏｍ門１ＦＩＧ、＋３
限サイトおよび機能地図、第２図はプラスミドｐＨＨｓ
−ＩＩａ （７，７ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地
図、第３図はプラスミドｐＢＫＥ １ （７，９ｋｂ
）の制限サイトおよび機能地図、第４図はプラスミドｐ
ＢＫｎｅｏ １ （１１，５ｋｂ ）の制限サイトおよ
び機能地図、第５図はプラスミドｐＳＶ ２ ｃａｔ
（５，０１５ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地図、第
６図はプラスミドｐＬＰｃａｔ （４，８３ｋｂ ）の
制限サイトおよび機能地図、第７図はプラスミドｐＢＬ
ｃａｔ （６，０９ｋｂ）の制限サイトおよび機能地図
を示す模式図、第８図はプラスミドｐＬ１３３の組み立
てを示すフローチャート、第９図はプラスミドｐＬＰＣ
（６，５ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地図、第１０
図はプラスミドｐＬＰＣ４（１１，７ｋｂ）の制限サイ
トおよび機能地図、第１１図はプラスミドｐ ＳＶ２ｂ
ｙｇ （５，２４ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地図
、第１２図はプラスミドｐＬｐｃｈｙｇ １ （８，３
ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地図、第１３図はプラ
スミドｐＬＰｃｈｄｌ （１０，２３ｋｂ）の制限サイ
トおよび機能地図、第１４図はプラスミドｐｈｄ（８，
５５ｋｂ ）の制限サイトおよび機能地図を示す模式図
である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンノｆニ
ー 代 理 人 弁理士青白 葆（外１名）８９目１ ＥｃｏＲＶ （Ｐｅｔす ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、ｌｏ Ｅｅ）４）べ１ ＦＩＧ、＋２ 日ｇｌｌｌ ｅｓ
ｏｍ門１ＦＩＧ、＋３
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、式： 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｒは、式： 【アミノ酸配列があります】 を表わす） で示されるアミノ酸配列を有する組換えヒトプロテイン
Ｓ。 ２、第１項記載のタンパク質をコードしている二本鎖デ
オキシリボ核酸であって、暗号鎖が、式： 【遺伝子配列があります】 （式中、Ｒ′は、式： 【遺伝子配列があります】 を表わし、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、そしてＴはチミジルを表わ
す） で示される二本鎖デオキシリボ核酸。 ３、ヒトプロテインＳ活性を有するポリペプチドをコー
ドしている二本鎖デオキシリボ核酸であって、暗号鎖が
、式： 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシチジル、そしてＴはチミジルを表わす
） で示される二本鎖デオキシリボ核酸。 ４、第２項または第３項記載のデオキシリボ核酸を含有
している組替えＤＮＡベクター。 ５、プラスミドｐＳｈｄである第４項記載のベクター。 ６、プラスミドｐＨＨＳ−IIａである第項記載のベクタ
ー。 ７、第４、５または６項記載のベクターで形質転換され
た大腸菌細胞。 ８、第４項または第５項記載のベクターで形質転換され
た細胞の培養物。 ９、細胞が、ヒト腎２９３細胞である第８項記載の培養
物。 １０、第８項または第９項記載の培養物を、ヒトプロテ
インＳを発現させる条件下で培養し、発現したタンパク
質を回収することからなるヒトプロテインＳの生産方法
。 １１、第１０項記載の方法で生産されたヒトプロテイン
Ｓ。 １２、治療有効量の、第１０項記載の方法で生産された
プロテインＳと医薬上許容し得る担体とを含有する医薬
組成物。 １３、非経口投与に適した第１２項記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US86666286A | 1986-05-27 | 1986-05-27 | |
| US866662 | 1986-05-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62289199A true JPS62289199A (ja) | 1987-12-16 |
| JP2557385B2 JP2557385B2 (ja) | 1996-11-27 |
Family
ID=25348099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62131049A Expired - Lifetime JP2557385B2 (ja) | 1986-05-27 | 1987-05-27 | ヒトプロテインｓ |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0247843B1 (ja) |
| JP (1) | JP2557385B2 (ja) |
| AU (1) | AU600944B2 (ja) |
| CA (1) | CA1338260C (ja) |
| DE (1) | DE3787315T2 (ja) |
| DK (1) | DK171825B1 (ja) |
| IE (1) | IE60641B1 (ja) |
| IL (1) | IL82648A0 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0380508A4 (en) * | 1987-05-18 | 1991-04-03 | Integrated Genetics, Inc. | Improved protein c molecules and method for making and activating same |
| EP2311864A4 (en) | 2008-08-13 | 2013-07-31 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | RECOMBINANT PROTEIN-S COMPOSITION |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3504172A1 (de) * | 1985-02-07 | 1986-08-07 | Henkel KGaA, 4000 Düsseldorf | Wirkstoffkonzentrate fuer alkalische zweikomponentenreiniger, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| GR860984B (en) * | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
| US5258288A (en) * | 1986-07-25 | 1993-11-02 | Genzyme Corporation | Vector containing DNA encoding mature human protein S |
-
1987
- 1987-05-25 IL IL82648A patent/IL82648A0/xx unknown
- 1987-05-26 AU AU73404/87A patent/AU600944B2/en not_active Ceased
- 1987-05-26 CA CA000537967A patent/CA1338260C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-05-26 IE IE136987A patent/IE60641B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-05-26 DK DK266187A patent/DK171825B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-05-27 JP JP62131049A patent/JP2557385B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-27 DE DE87304676T patent/DE3787315T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-05-27 EP EP87304676A patent/EP0247843B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIOCHEMISTRY=1979 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2557385B2 (ja) | 1996-11-27 |
| IE871369L (en) | 1987-11-27 |
| EP0247843A3 (en) | 1989-02-01 |
| DE3787315D1 (de) | 1993-10-14 |
| EP0247843B1 (en) | 1993-09-08 |
| EP0247843A2 (en) | 1987-12-02 |
| CA1338260C (en) | 1996-04-23 |
| AU7340487A (en) | 1987-12-03 |
| DK171825B1 (da) | 1997-06-23 |
| IE60641B1 (en) | 1994-07-27 |
| AU600944B2 (en) | 1990-08-30 |
| IL82648A0 (en) | 1987-11-30 |
| DE3787315T2 (de) | 1994-02-03 |
| DK266187A (da) | 1987-11-28 |
| DK266187D0 (da) | 1987-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3316297C2 (ja) | ||
| FI89723C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av vaevnadsplasminogenaktivator, kodande rekombinant-dna daerav och en transformanscell | |
| DE3885419T2 (de) | Für die direkte Expression von aktiviertem menschlichen Protein-C verwendbare Vektoren und Zusammensetzungen. | |
| KR0148575B1 (ko) | 효소원 또는 피브린 특이성을 갖는 조직 플라스미노겐 활성제 | |
| JPS63503275A (ja) | ファクター８：ｃの製造方法 | |
| JPS6069029A (ja) | 組換えｄｎａ技術によるヒトｉｇｆおよびｅｇｆの製造 | |
| SK278576B6 (en) | Expression vectors for increased production polypeptides, plasmides containing these vectors, host cells containing these plasmides, gained products, connecting methods and use | |
| JPH02442A (ja) | エリトロポエチンを発現するヒトｃＤＮＡのクローニング方法 | |
| CA2162271A1 (en) | Fusion proteins containing adeno-associated virus rep protein and bacterial protein | |
| JP2664804B2 (ja) | 尿酸オキシダーゼ活性蛋白質、それをコードした組換え遺伝子、発現ベクター、微生物および形質転換細胞 | |
| DE69009068T2 (de) | Methoden und materialien zur expression von varianten von menschlichem plasminogen. | |
| JPH0576374A (ja) | 組織プラスミノーゲンアクチベーターの翻訳後プロセツシングを改変するための方法 | |
| JPH09117292A (ja) | ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータをコードする遺伝子 | |
| DE3787112T2 (de) | Menschliche Pankreaselastase I. | |
| JPH05504051A (ja) | （前駆体）タンパクのエンドタンパク分解的プロセシングのための方法 | |
| JPH05194264A (ja) | 血栓塞栓障害治療剤 | |
| DE3852625T2 (de) | Vektoren und Verbindungen zur Expression von Zymogen-Formen von menschlichem Protein C. | |
| EP0198645A1 (en) | Human pancreatic elastase | |
| JP2730904B2 (ja) | スーパーオキシドジスムターゼポリマー | |
| JPS62289199A (ja) | ヒトプロテインｓ | |
| DE68923613T2 (de) | Superoxid-dismutaseanaloge mit neuen bindeeigenschaften. | |
| JP3366596B2 (ja) | 組換えヒト胎盤性リボヌクレアーゼインヒビターおよびその製造方法 | |
| US5527691A (en) | Expression vectors containing lambdapl promoter and T1 T2 rRNA termination sequence, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods | |
| JP2706260B2 (ja) | ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の発現 | |
| JPH06169770A (ja) | 新規なポリペプチド、これに関する暗号を有するプラスミド及びこれを製造する方法及びこれを使用する方法 |