JPH09117292A - ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータをコードする遺伝子 - Google Patents

ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータをコードする遺伝子

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JPH09117292A
JPH09117292A JP8260999A JP26099996A JPH09117292A JP H09117292 A JPH09117292 A JP H09117292A JP 8260999 A JP8260999 A JP 8260999A JP 26099996 A JP26099996 A JP 26099996A JP H09117292 A JPH09117292 A JP H09117292A
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    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な組織プラスミノーゲンアクチベータを
コードする遺伝子の提供。 【解決手段】 ａ）ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメイン
及びヒトｕ−ＰＡ触媒ドメイン；ｂ）ヒトｔ−ＰＡフィ
ンガードメイン、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメイン及
びヒトｕ−ＰＡ触媒ドメイン；又はｃ）ヒトｔ−ＰＡフ
ィンガードメイン、ヒトｔ−ＰＡ成長因子ドメイン、ヒ
トｔ−ＰＡクリングル２ドメイン及びヒトｕ−ＰＡ触媒
ドメイン；が連結配列により連結された単鎖ハイブリッ
ドプラスミノーゲンアクチベータをコードする遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はハイブリッドプラス
ミノーゲンアクチベータをコードするＤＮＡ、その様な
ＤＮＡを含有するハイブリッドベクター、その様なハイ
ブリッドベクターにより形質転換された宿主、その様な
ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ、ＤＮＡ、
ハイブリッドベクター及び宿主の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血餅は発展した世界におけるヒトの罹病
及び死亡の主たる原因である。血餅は酵素トロンビンの
作用によりその可溶性前駆体フィブリノーゲンから形成
されるフィブリンにより構成される。一連の酵素及びそ
の他の物質は血餅はそれらが血液の損失を防止する時に
必要とされる際及び場においてのみ正常に形成されるこ
とを確実にしている。哺乳動物の血漿は血餅を溶解する
ことのできる酵素系フィブリン分解系を含んでいる。フ
ィブリン分解系の一成分はプラスミノーゲン（プラスミ
ンの不活性プロ酵素形態）をタンパク質分解酵素プラス
ミンに転換するプラスミノーゲンアクチベータと称され
る一群の酵素である。プラスミンは次いで血餅のフィブ
リンネットワークを劣化させて可溶性生成物を形成す
る。体の血栓溶解能力が血管内血栓を除去するのに不十
分である場合、例えば血栓塞栓症或いは手術後合併症に
悩む患者において外因的に投与された血栓溶解剤を用い
ることが不可欠なことがある。
【０００３】二つのタイプのプラスミノーゲンアクチベ
ータ（以下“ＰＡ”と称する）をヒト体液或いは細胞か
ら単離することができる。即ち、例えばヒトの尿及び腎
臓細胞に存在するセリンプロテアーゼであるウロキナー
ゼ或いはウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベ
ータ（以下“ｕ−ＰＡ”と称する）及び内皮細胞により
産生され数多くの内分泌組織に見られる組織タイププラ
スミノーゲンアクチベータ（以下“ｔ−ＰＡ”と称す
る）である。
【０００４】ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡは共に二つの分子形
態即ち一本鎖形態（しばしばそれぞれ“ｓｃ−ｔ−Ｐ
Ａ”及び“ｓｃ−ｕ−ＰＡ”と命名される）及び二本鎖
（ｔｃ）形態で存在する。一本鎖即ちプロ酵素形態はポ
リペプチド配列の良く規定された位置におけるタンパク
質分解酵素の作用により二本鎖形態に転換される。加工
されたＰＡタンパク質の得られた二本の鎖はイオウ−イ
オウ架橋により相互に結合して残る。カルボキシ末端断
片即ちＢ−鎖はＰＡの酵素活性を媒介するのに対し、ア
ミノ末端Ａ−鎖はフィブリン結合部位などの制御単位を
含有する。不活性ｓｃ−ＰＡのフィブリンなどの血餅の
成分に対する特異的結合に引続きその部位に存在する触
媒量のタンパク質分解酵素による活性ｔｃ−ＰＡへの転
換の結果有効な部位−特異的物質が得られる。
【０００５】二つの異った遺伝子によりコード化される
ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡは免疫学的及び酵素的に区別さ
れ、阻害剤、刺戟剤及び賦活剤に対して異ったプロフィ
ールの応答を有する。この様に、ｔ−ＰＡのみがエリト
リナ・ラチシマ（Erytrina latissima）（ＤＥ−３）か
らのプロテアーゼ阻害剤により強く阻害される。ｔ−Ｐ
Ａ活性はフィブリン及びフィブリン断片により大きく刺
戟されるのに対し、ｕ−ＰＡ活性はフィブリン及びその
断片による刺戟に対して感心しない。これらの二つのＰ
Ａ酵素を区別するもう一つの性質はｔｃ−ｔ−ＰＡがフ
ィブリン及びフィブリン断片に対して高い親和性を有す
るのに対し、ｔｃ−ｕ−ＰＡは余りフィブリン親和性を
有しないことである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】注射されたｔ−ＰＡの
不満足な血清安定性、ｔｃ−ｕ−ＰＡのフィブリンに対
する低い親和性、及びｓｃ−ｕ−ＰＡのフィブリン親和
性が間接的であること、即ち、追加の血液因子を必要と
すると考えられている（D.J.Binnema et al. 8thInt.Co
ngress of Fibrinolysis, ウイーン，1986）を考慮す
ると、フィブリンに対する高い親和性、刺戟剤に対する
より好ましい応答、阻害剤による減少された不活性化、
及び血液循環におけるより長い有効な半減期を有する改
良されたプラスミノーゲンアクチベータの必要性が継続
している。従って、本発明の目的は親酵素の望ましくな
い特性を欠きながらｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡの好ましい性
質を保持する新規ハイブリッドプラスミノーゲンアクチ
ベータを提供することである。
【０００７】驚くべきことに、血栓症その他の状態の治
療のために、プラスミノーゲン活性化を介してフィブリ
ン分解をもたらしたい場合には一本鎖ハイブリッドＰＡ
タンパク質が一本鎖ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡと対比した場
合により優れた生物学的特性を示すことが発見された。
具体的には、生来のＰＡ類に対比して本発明による新規
ＰＡ分子の血餅をｉｎ ｖｉｖｏで溶解するのに必要と
される量がより少ないことである。本発明による一本鎖
ハイブリッドＰＡ分子は組換えＤＮＡ技術により多量に
製造することができ、患者に注射時に溶解されるべき血
餅の部位においてのみフィブリンの影響の下にそれらの
二本鎖形態に転換される。二本鎖ハイブリッドＰＡ分子
は文献に記載されているが（ヨーロッパ特許出願１５
５，３８７号明細書、K.C.Robbins, 8th International
Congress of Fibrinolysis, ウイーン，1986）、しか
し、ハイブリッドＰＡ分子のより好ましい一本鎖形態は
引用した文献に開示されるようにタンパク質レベルでは
製造されず、組換えＤＮＡ技術によってのみ多量に且つ
工業規模で製造することができる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の目的は
該一本鎖ｕ−ＰＡ／ｔ−ＰＡハイブリッドタンパク質の
製造手段を提供することである。その様な手段は該ｕ−
ＰＡ／ｔ−ＰＡハイブリッドタンパク質をコードするＤ
ＮＡ、該ＤＮＡを含有するハイブリッドベクター及び該
ハイブリッドベクターで形質転換された宿主を包含す
る。又、一本鎖ｕ−ＰＡ／ｔ−ＰＡハイブリッドタンパ
ク質、該ＤＮＡ、該ハイブリッドベクター及び該宿主を
製造するための方法も提供される。本発明は又、組換え
ＤＮＡの一本鎖生成物がｉｎ ｖｉｔｒｏで適当なタン
パク質分解酵素例えばプラスミンにより切断することが
できるので二本鎖ハイブリッドＰＡ分子のよりコスト有
効的製造方法も提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は特にアミノ酸の同一性及
び数においてヒトｔ−ＰＡ及びヒトｕ−ＰＡの部分配列
に対応する少なくとも２個の部分配列により構成される
アミノ酸配列を有する一本鎖ハイブリッドＰＡに関す
る。血液のフィブリン分解及び凝固系に含まれるその他
のセリンプロテアーゼ類と同様にｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ
は触媒作用ドメイン（鎖Ｂ）に結合して鎖Ａ内に大きな
非触媒作用セグメントを有する。このｔ−ＰＡの非−触
媒作用Ａ−鎖は個々のフィンガー即ち「フィンガー」ド
メイン、「成長因子」ドメイン及び二つの「クリング
ル」構造に部分分割することができるのに対し、ｕ−Ｐ
ＡのＡ−鎖は「成長因子」ドメイン及び１個の「クリン
グル」構造により構成される。〔例えば、L.Patthy, Ce
ll 41, 657-663 (1985) 参照〕。Ｂ−鎖の触媒作用部位
はそれぞれ３２２，３７１及び４７８（ｔ−ＰＡ）及び
２０４，２５５及び３５６（ｕ−ＰＡ）におけるHis, A
sp, Ser 残基により形成されており、フィブリン分解活
性に必須である。
【００１０】タンパク質ドメインは全タンパク質の全体
構造内における構造的及び／又は機能的存在である。例
えばｔ−ＰＡのＡ−鎖では四つのドメイン（フィンガ
ー、成長因子−及び二つのクリングルドメイン）が一続
きに配列されている。これらのドメインの境界は対応す
るＤＮＡ配列におけるエキソン−イントロン結合の位置
により最も良く規定される（上記、L.Patthy）。しかし
ながら、実用的理由のために各ドメインの最小の大きさ
はＳ−Ｓ架橋形成に関与するものと思われる各ドメイン
内の最初及び最後のシステイン残基間のアミノ酸配列に
より定義されてきた。隣接領域からのこれらのシステイ
ン残基の前及び後のアミノ酸は結合配列（Ｊ）と定義さ
れる。エキソン−イントロン結合（上記参照）の位置は
これらのＪ領域内にある。
【００１１】即ち一本鎖ｔ−ＰＡは次式により表わすこ
とができる。 Ｔ−Ｆ−Ｊ1 −Ｇ−Ｊ2 −Ｋ1 −Ｊ3 −Ｋ2 −Ｊ4 −Ｔ
ＰＡB 式中、Ｔはアミノ酸１〜５よりなるＮ−末端部分を表わ
し、Ｆはアミノ酸６〜４３よりなるフィンガードメイン
であり、Ｇはアミノ酸５１〜８４よりなる成長因子ドメ
インであり、Ｋ1 はアミノ酸９２〜１７３よりなるクリ
ングル１構造であり、Ｋ2 はアミノ酸１８０〜２６１よ
りなるクリングル２構造であり、ＴＰＡBはアミノ酸３
０７〜５２７よりなる触媒作用セリンプロテアーゼドメ
インであり、そしてＪ1 （アミノ酸４４〜５０）、Ｊ2
（アミノ酸８５〜９１）、Ｊ3 （アミノ酸１７４〜１７
９）及びＪ4 （アミノ酸２６２〜３０６）はドメインセ
グメントを結合する結合配列である。
【００１２】一本鎖ｕ−ＰＡは次式により表わすことが
できる。 Ｔ′−Ｕ−Ｊ5 −Ｋ−Ｊ6 −ＵＰＡB 式中、Ｔ′はアミノ酸１〜１２よりなるＮ−末端部分を
表わし、Ｕはアミノ酸１３〜４２よりなる成長因子ドメ
インであり、Ｋはアミノ酸５０〜１３１よりなるクリン
グル構造であり、ＵＰＡB はアミノ酸１８９〜４１１よ
りなる触媒作用セリンプロテアーゼドメインであり、そ
してＪ5 （アミノ酸４３〜４９）及びＪ6（アミノ酸１
３２〜１８８）はドメインセグメントを結合する結合配
列である。結合配列Ｊ4 及びＪ6 は各々活性化（プロセ
シング）部位、及びそれへのＮ−末端に、触媒作用（Ｂ
−鎖）領域へのイオウ−イオウ架橋に関与するシステイ
ン残基を包含する。
【００１３】驚くべきことに、一つのＰＡ（ＴＰＡB 或
いはＵＰＡB ）の触媒作用セリンプロテアーゼ領域を他
のＰＡの全ての又は個別のＡ−鎖ドメイン或いは両者の
ＰＡの個別のドメインを含有するアミノ酸配列に結合し
てなる一本鎖ハイブリッドＰＡが貴重な薬学的性質を示
すことが発見された。従って、本発明はヒトｕ−ＰＡの
全ての又は個別のＡ−鎖ドメイン或いはヒトｕ−ＰＡ及
びヒトｔ−ＰＡの個別のＡ−鎖ドメインを含有するアミ
ノ酸配列をヒトｔ−ＰＡ（ＴＰＡB ）の触媒作用ドメイ
ンに一続きに結合してなる一本鎖ハイブリッドＰＡ、及
びヒトｔ−ＰＡの全ての又は個別のＡ−鎖ドメイン或い
はヒトｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡの個別のＡ−鎖ドメインを
含有するアミノ酸配列をヒトｕ−ＰＡ（ＵＰＡB ）の触
媒作用ドメインに一続きに結合してなる一本鎖ハイブリ
ッドＰＡに関する。好ましい実施態様において、本発明
のハイブリッドＰＡはヒトｕ−ＰＡ（ＵＰＡB ）の触媒
作用ドメインを含む。
【００１４】特に、本発明はヒトｔ−ＰＡの全てのＡ−
鎖ドメインを含有するアミノ酸配列、ヒトｔ−ＰＡの個
別のＡ−鎖ドメイン例えばヒトｔ−ＰＡのフィンガード
メイン或いはクリングル特にクリングル２ドメインなど
を含有するアミノ酸配列、及びヒトｔ−ＰＡ及び／又は
ヒトｕ−ＰＡの２個、３個又は４個のＡ−鎖ドメイン特
にヒトｔ−ＰＡの２個又は３個のドメイン或いはヒトｕ
−ＰＡ及びヒトｔ−ＰＡの２個又は３個のドメイン例え
ばヒトｔ−ＰＡのフィンガー、成長因子、クリングル２
ドメイン、ヒトｔ−ＰＡのフィンガー及びクリングル２
ドメイン或いはｕ−ＰＡ成長因子及びｔ−ＰＡクリング
ル２ドメインなどを含有するアミノ酸配列から選ばれる
アミノ酸配列よりなり、そのアミノ酸配列が一続きにヒ
トｕ−ＰＡの触媒作用ドメインに結合している一本鎖Ｐ
Ａ、及びｕ−ＰＡ成長因子及びｔ−ＰＡクリングル２ド
メインを含有するアミノ酸配列を含有し、そのアミノ酸
配列が一続き的にヒトｔ−ＰＡの触媒作用ドメインに結
合している一本鎖ＰＡに関する。
【００１５】好ましくは、このハイブリッドＰＡアミノ
酸配列はｔ−ＰＡ（Ｔ、アミノ酸１〜５）或いはｕ−Ｐ
Ａ（Ｔ′、アミノ酸１〜１２）のＮ−末端配列よりスタ
ートし、或いはハイブリッドＰＡの第１ドメインに自然
にＮ−末端結合した任意の結合配列、或いはその断片が
少なくとも５個のアミノ酸残基を有するその様な結合配
列の断片でスタートするのがよい。本発明によるハイブ
リッドＰＡにおいてＡ−鎖ドメインは天然結合配列
（例、Ｊ1 ，Ｊ2 ，Ｊ3 及びＪ5 ）、融合結合配列、或
いはハイブリッド結合配列或いはその断片を介して連結
されている。即ち、第１ドメインは該第１ドメインのＣ
−末端に自然に存在する結合配列により、第２ドメイン
のＮ−末端に自然に存在する結合配列により、該結合配
列により構成される融合結合配列により、或いはそれら
の断片により、第２のドメインに結合されている。
【００１６】本発明のハイブリッドＰＡのＡ−鎖ドメイ
ンはＢ−鎖セリンプロテアーゼドメイン（ＴＰＡB 或い
はＵＰＡB ）に、ヒトｔ−ＰＡにおいてＡ−鎖をＢ−鎖
に結合する結合配列Ｊ4 、ヒトｕ−ＰＡにおいてＡ−鎖
をＢ−鎖に結合する結合配列Ｊ6 、及び該結合配列の部
分配列より構成されるハイブリッド配列よりなる群から
選ばれた結合配列により結合されており、該結合配列は
プラスミンにより切断されることのできるプロセシング
部位、及びそれに対してＮ−末端にある、触媒作用Ｂ−
鎖領域へのイオウ−イオウ架橋に参加することのできる
システイン残基を含み、この結合配列は好ましくは少な
くとも４０個〜６０個までのアミノ酸残基を有する。最
も好ましいのは、対応するＤＮＡ上のエキソン−イント
ロン結合により規定される位置におけるドメインの結合
である。Ａ−鎖対Ｂ−鎖の結合は、最も好ましくは活性
化部位にある。
【００１７】特に、本発明は、ｕＰＡのＡ−鎖又はｕＰ
Ａ成長因子ドメインとｔ−ＰＡクリングルドメイン２と
から本質的に成るＡ−鎖がｔ−ＰＡの触媒作用領域（Ｂ
−鎖）と一続きに結合したものを含んで成るハイブリッ
ドプラスミノーゲンアクチベータ；並びにｔ−ＰＡのＡ
−鎖、本質的にｔ−ＰＡのフィンガードメインよりなる
Ａ−鎖、本質的にｕ−ＰＡ成長因子ドメインとｔ−ＰＡ
クリングル２ドメインとからなるＡ−鎖、本質的にｔ−
ＰＡフィンガードメインとクリングル２ドメインとから
なるＡ−鎖、或いは本質的にｔ−ＰＡフィンガードメイ
ンと成長因子ドメインとクリングル２ドメインとからな
るＡ−鎖であって、該Ａ−鎖がｕ−ＰＡの触媒作用ドメ
イン（Ｂ−鎖）に一続きに結合されているものを含んで
なるプラスミノーゲンアクチベータよりなる群から選ば
れる一本鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ
であって、Ａ−鎖が、活性化部位及びＢ−鎖へのイオウ
−イオウ結合を形成することのできるシステイン残基を
含んでなる結合配列を介してＢ−鎖に結合しているもの
に関する。
【００１８】特に、本発明は同様に活性化部位において
ｕ−ＰＡの触媒作用領域（Ｂ−鎖）に結合した、ｔ−Ｐ
Ａクリングル２ドメインより本質的になるＡ−鎖を含ん
でなる一本鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベー
タに関する。特に好ましいのは、ｔ−ＰＡの触媒作用領
域（Ｂ−鎖）に一続きに結合した、ｕ−ＰＡ成長因子ド
メインとｔ−ＰＡクリングル２ドメインとから本質的に
なるＡ−鎖を含んでなるハイブリッドプラスミノーゲン
アクチベータ、並びにｕ−ＰＡの触媒作用領域（Ｂ−
鎖）に一続きに結合した、ｔ−ＰＡクリングル２ドメイ
ンから本質的になるＡ−鎖或いはｔ−ＰＡフィンガード
メインとクリングル２ドメインから本質的になるＡ−鎖
を含んでなるハイブリッドプラスミノーゲンアクチベー
タ、からなる群より選ばれた一本鎖ハイブリッドプラス
ミノーゲンアクチベータにおいて、Ａ−鎖領域及びＢ−
鎖間の結合が活性化部位にあるものである。
【００１９】本発明による好ましいハイブリッドＰＡは
UPAA TPA B (BC)＝〔uPA(1-158)-tPA(276-527) 〕、UPA
A TPA B (BR)＝〔uPA(1-131)-tPA(263-527) 〕、TPAA U
PA B (BC)＝〔tPA(1-275)-uPA(159-411) 〕、TPAA UPA
B (BR)＝〔tPA(1-262)-uPA(132-411) 〕、UK2UPA B (B
R)＝〔uPA(1-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411) 〕、FUPA
B (BC)＝〔tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411)
〕、FUPA B (BR)＝〔tPA(1-49)-uPA(134-411)〕、FK2U
PA B (BC)＝〔tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411)
〕、FK2UPA B (BR)＝〔tPA(1-49)-tPA(176-262)-uPA(1
32-411) 〕、UK2TPA(BC) ＝〔uPA(1-44)-tPA(176-52
7)〕、K2UPAB (BC)＝〔tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159
-411)〕、FGK2UPAB (BC)＝〔tPA(1-86)-tPA(176-275)-u
PA(159-411) 〕及びFGK2UPAB (BR)＝〔tPA(1-86)-tPA(1
76-262)-uPA(132-411) 〕。
【００２０】茲に、ＵＰＡA はｕ−ＰＡのＡ−鎖であ
り、ＴＰＡA はｔ−ＰＡのＡ−鎖であり、ＵＰＡB はｕ
−ＰＡのＢ−鎖であり、ＴＰＡB はｔ−ＰＡのＢ−鎖で
あり、Ｕはｕ−ＰＡの成長因子ドメインを示し、Ｋ2 は
ｔ−ＰＡのクリングル２ドメインを示し、Ｆはｔ−ＰＡ
のフィンガードメインを示し、Ｇはｔ−ＰＡの成長因子
ドメインを示し、（ＢＣ）はＡ−鎖ドメイン及びＢ−鎖
間の結合が活性化部位にあることを示し、そして（Ｂ
Ｒ）はＡ−鎖ドメインが、活性化部位及びそれに対して
Ｎ−末端にＢ−鎖へのイオウ−イオウ架橋に関与するシ
ステイン残基を含むＢ−鎖に自然に結合した連結配列を
介して、Ｂ−鎖に結合していることを示す。数字はそれ
ぞれｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡからとられたアミノ酸配列を
示す。例えばＵＫ2 ＵＰＡB （ＢＲ）＝〔ｕＰＡ（１−
４４）−ｔＰＡ（１７６−２６１）−ｕＰＡ（１３４−
４１１）〕はｕ−ＰＡのアミノ酸１−４４（成長因子ド
メイン、Ｕ）及びｔ−ＰＡのアミノ酸１７６−２６１
（クリングル２ドメイン、Ｋ2 ）がｕ−ＰＡのアミノ酸
１３４−４１１（Ｂ−鎖、ＵＰＡB ）に線状に結合して
なる一本鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ
を示す。
【００２１】特に好ましいのはハイブリッドプラスミノ
ーゲンアクチベータＴＰＡA ＵＰＡ B （ＢＣ），ＦＵＰ
ＡB （ＢＣ），ＦＧＫ2 ＵＰＡB （ＢＣ）、特にＵＫ2
ＴＰＡB （ＢＣ），ＦＫ2 ＵＰB （ＢＣ）及びＫ2 ＵＰ
ＡB （ＢＣ）である。本発明は更にＮ−グリコシル化部
位の少なくとも一つ好ましくは全てがグリコシル化がこ
の（これら）の部位において生ずることができないよう
に変形されている本発明によるハイブリッドＰＡの変異
体に関する。
【００２２】哺乳動物細胞におけるＮ−結合グリコシル
化の前提条件はトリペプチド配列−Asn-L-Ser （或いは
Ｔｈｒ）−（Ａｓｎはアクセプターであり、そしてＬ
は、グリコシル化を防止するプロリン或いはアスパラギ
ン酸を除く２０個の遺伝的にコード化されたアミノ酸の
任意のものであり得る）の存在であることが良く確立さ
れている。ｔ−ＰＡ分子内にはＮ−グリコシド結合のた
めの３個の部位がある（数字はｔ−ＰＡのアミノ酸配列
中のＡｓｎの位置を指す図１参照）。即ち、-Asn 117-Se
r-Ser-（クリングル１中に存在）、Asn184-Gly-Ser（ク
リングル２中に存在）、及び-Asn448-Arg-Thr （ｔ−Ｐ
Ａ Ｂ−鎖中に存在）である。ｕ−ＰＡのこの唯一のＮ
−結合グリコシル化部位はＢ−鎖中にある（Asn302-Ser
-Thr、図６参照）。ｔ−ＰＡクリングル１、ｔ−ＰＡク
リングル２、ｔ−ＰＡのＢ−鎖及び／又はｕ−ＰＡのＢ
−鎖を含んでなるハイブリッドＰＡが又それぞれのＮ−
結合グリコシル化部位を含むことは明らかである。
【００２３】個々の（１個以上の）Ｎ−グリコシル化部
位におけるグリコシル化を予防するためにＮ−グリコシ
ル化のためのシグナルとして認識されているトリペプチ
ド配列が変更されなければならない。上記トリペプチド
配列内のＡｓｎ及び／又はＳｅｒ（又はＴｈｒ）残基の
任意のその他のアミノ酸による置換はこれらの部位にお
けるグリコシド結合の形成を廃止する。便宜的には、Ｎ
−グリコシル化部位の変更はタンパク質レベルにおいて
はなされない。その代り、このハイブリッドＰＡをコー
ドする遺伝子を、該修飾遺伝子の宿主による発現の際に
１個以上のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化がこれ
らの部位において起こらないように変更されている突然
変異ハイブリッドＰＡが生成されるように変更するのが
有利である。本発明によれば、ハイブリッドＰＡ中に存
在する全てのＮ−グリコシル化部位を変更するのが好ま
しい。
【００２４】特に、アスパラギンがバリン、ロイシン、
イソロイシン、アラニン或いは特にグルタミンで置換さ
れ、及びセリン及びスレオニンがバリン、メチオニン或
いは特にアラニンで置換される。特に好ましいのは下記
の修飾されたハイブリッドＰＡである：FuPAB (Gln302)
(BC)＝〔tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301, Gln, 3
03-411)〕、FK2(Ala186)UPAB (Gln302)(BC)＝〔tPA(1-4
9)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gln, 30
3-411) 〕、UK2(Ala186)TPAB (Ala450)(BC)＝〔uPA(1-4
4)-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527)〕、K
2(Ala186)UPA B (Gln302)(BC)＝〔tPA(1-3)-tPA(176-18
5, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411)〕、FGK
2(Ala186)UPA B (Gln302)(BC)＝〔tPA(1-86)-tPA(176-1
85, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411) 〕、
【００２５】及び更にFK2UPAB (Gln302)(BC)＝〔tPA(1-
49)-tPA(176-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411) 〕、K2
UPA B (Gln302)(BC)＝〔tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(15
9-301, Gln, 303-411)〕、UK2TPAB (Ala450)(BC)＝〔uP
A(1-44)-tPA(176-449, Ala, 451-527)〕、及びFGK2UPA
B (Gln302)(BC)＝〔tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-3
01, Gln, 303-411) 〕。
【００２６】本発明のハイブリッドＰＡ及びその突然変
異体は、例えばハイブリッドＰＡタンパク質或いはその
突然変異体を発現する形質転換宿主をその発現を許す条
件下に培養し、そしてハイブリッドＰＡタンパク質及び
突然変異ハイブリッドＰＡタンパク質をそれぞれ単離す
ることよりなる組換えＤＮＡ技術により製造することが
できる。より具体的には、目的化合物は、 ａ）ハイブリッドＰＡタンパク質或いはその突然変異体
をコードするＤＮＡを用意し、或いはその様なＤＮＡを
化学的に合成し、 ｂ）このＤＮＡを適当な発現ベクター中に導入し、 ｃ）得られたハイブリッドベクターを受容宿主中に移
し、 ｄ）形質転換宿主を未形質転換宿主から例えば形質転換
された宿主のみが生残る条件下に培養することにより選
択し、 ｅ）形質転換宿主をハイブリッドＰＡタンパク質の発現
を許す条件下に培養し、そして ｆ）ハイブリッドＰＡタンパク質及びその突然変異体を
単離する、ことにより製造される。組換えＤＮＡ技術に
よるハイブリッドＰＡタンパク質の製造に含まれる工程
を以下により詳細に説明する。
【００２７】ハイブリッドＰＡタンパク質をコード化す
るＤＮＡ 本発明はアミノ酸の同一性及び数において、ヒトｕ−Ｐ
Ａ及びヒトｔ−ＰＡの部分配列に対応する少なくとも２
個の部分配列により構成されるハイブリッドＰＡをコー
ドする或いはその突然変異体をコード化する配列を有す
るＤＮＡに関する。特に、本発明は前記好ましいものと
して述べたハイブリッドＰＡタンパク質及びその突然変
異体の任意のものをコード化する配列を有するＤＮＡに
関する。好ましくは本発明によるＤＮＡはそれらの末端
に隣接配列（flanking sequence ）を有する。特に、こ
れらの隣接配列（flanking sequence ）には、ＤＮＡを
適当なベクター中に組みこむのに適当な制限部位が含ま
れる。
【００２８】更に、本発明のＤＮＡは成熟ハイブリッド
ＰＡコード配列の第１コドンに結合したｕ−ＰＡ或いは
ｔ−ＰＡのシグナル配列を含む。あるいは、酵母細胞内
で発現される場合に、本発明のこれらのＤＮＡは用いら
れる酵母プロモーターに自然に連結しているシグナル配
列特にＰＨＯ５或いはインベルターゼシグナル配列など
の酵母シグナル配列を含んでよい。好ましくは、ＤＮＡ
部分配列のヌクレオチド配列はそれぞれｕ−ＰＡ ｃＤ
ＮＡ及びｔ−ＰＡ ｃＤＮＡに見られるヌクレオチド配
列と同一であるのがよい。しかしながら、遺伝子コドン
の縮重により得られるアミノ酸部分配列が未変化で留ど
まるならばヌクレオチド配列が異なってよい。突然変異
体ハイブリッドＰＡをコードするＤＮＡにおいては、ハ
イブリッドＰＡタンパク質のＮ−グリコシル化に必須の
アミノ酸をコードする少なくとも１個のコドンがＮ−グ
リコシル化の認識部位を廃止する異ったアミノ酸をコー
ドする他のコドンにより置換される。
【００２９】ｕ−ＰＡ ｃＤＮＡ及びｔ−ＰＡ ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列は公知である〔W.E.Holmes et a
l., Biotechnology 3, 923-929 (1985)；D.Pennica et
al.,Nature 301, 214-221 (1983)参照〕。更に、全ての
イントロン及びエクソンを含むゲノムｕ−ＰＡ及びｔ−
ＰＡ遺伝子の完全なヌクレオチド配列が確立されている
〔A.Riccio et al., Nucl.Acids Res. 13, 2759-2771
(1985) ; S.J.Friezner-Degen et al., J.Biol.Chem. 2
61, 6972-6985 (1986) 参照〕。ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ
のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列を知っていれば、本発
明によるＤＮＡは公知の方法により作ることができる。
これらのＤＮＡの作製方法としては、これらのＤＮＡを
化学的に合成するか、或いはｕ−ＰＡ ｃＤＮＡ及びｔ
−ＰＡ ｃＤＮＡのポリヌクレオチド部分配列をコード
する断片を調製し、そしてそれらを所定順序で再連結
し、任意に１以上例えば２或いは３の突然変異工程を含
む方法が挙げられる。
【００３０】本発明の突然変異ハイブリッドＰＡをコー
ドするＤＮＡは公知の方法により製造することができ
る。これらのＤＮＡの製造方法は親ハイブリッドＰＡ遺
伝子から不所望のアミノ酸残基に対するコドンよりなる
ＤＮＡ部分を切出し、そしてそれを該コドンが所望アミ
ノ酸残基をコードするデオキシリボヌクレオチドトリプ
レットで置換されたＤＮＡセグメントと置換するか、或
いはデオキシリボヌクレオチド置換を部位−指向突然変
異誘発により達成することを含む。ＤＮＡの化学合成は
良く知られており、通常の技術を利用するものである。
適当な技術はS.A.Narang〔Tetrahedron 39, 3 (1983)〕
により編集されている。特に、ヨーロッパ特許出願１４
６，７８５号明細書に記載されている方法が用いられ、
茲に準用する。
【００３１】本発明によるＤＮＡの合成のもう一つの手
法はｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡのポリヌクレオチド部分配列
をコード化する適当な制限断片をｕ−ＰＡ ｃＤＮＡ及
びｔ−ＰＡ ｃＤＮＡ（或いはゲノムｕ−ＰＡ ＤＮＡ
或いはｔ−ＰＡ ＤＮＡ）から切出し、そしてこれらの
断片を全体ハイブリッドＰＡ構造遺伝子の製造に用いる
ことにある。二つのストラテジーを適用することができ
る。いづれのストラテジーを用いるにせよ、断片の融合
がドメインを無傷に保つためにドメイン間の部位におい
て行われるように注意が払われなければならない。第１
のストラテジーは適当な制限部位を利用するものであ
る。適当な制限部位がｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ ＤＮＡ両
者において利用可能である場合には、これらのＤＮＡを
対応する制限酵素で消化し、断片を平滑末端或いはジグ
ザグ末端（選ばれた制限酵素に応じて）連結により結合
する。
【００３２】或いは又、有用な制限部位は例えば、部位
−指向突然変異誘発〔M.J.Zoller et al., Methods Enz
ymol 100, 468 (1983)参照〕により突然変異されたＤＮ
Ａが変異されたアミノ酸配列を生じないように注意を払
いながら導入することができる。特に好ましい天然の或
いは人工的に導入される制限部位はＡ−及びＢ−鎖をコ
ードするＤＮＡ或いはＡ−鎖に含有される個別のドメイ
ンをコードするＤＮＡを分離するものである。この様に
して、Ａ−鎖ドメインと触媒作用セリンプロテアーゼ領
域間に所望の結合を有するハイブリッドＰＡをコードす
るハイブリッドＤＮＡを生成することができる。第２番
目のストラテジーは、ドメイン境界が、ゲノムＤＮＡに
おけるエキソン−イントロン結合部〔L.Patthy, Cell 4
1, 657-663 (1985) 参照〕の位置、即ちイントロンがそ
こでスプライスされるｃＤＮＡにおける位置により最良
に規定されるという仮定より発するものである。
【００３３】これらの位置は制限部位とは稀にしか一致
しないので、任意の新しい造成のために用いることので
きる方式が採用される。即ち、第一工程においては、特
定のドメインをコードするが、しかし、又予想される融
合点を越える追加のＤＮＡ配列（数百個の塩基対まで）
を含有する便利な制限断片がバクテリオファージｍ１３
に連結されその中サブクローン化される。第二工程にお
いては、過剰ＤＮＡ配列がｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異
誘発によりループアウトされる〔Zoller et al. 上
記〕。この操作は、任意の所定ヌクレオチド位置におけ
る正確なイン−フレーム融合を可能にするので好まし
い。
【００３４】突然変異体ハイブリッドＰＡの製造のため
には、成熟ハイブリッドＤＮＡの一部の切取りは制限酵
素を用いて行われる。この方法の前提条件は変更される
べきコドンの近傍の適当な制限部位が利用可能なことで
ある。不所望のアミノ酸のコドンを含有する小さい制限
断片がエンドヌクレアーゼ切断により除去される。対応
する二本鎖ＤＮＡ配列は例えば所望アミノ酸をコードす
るトリプレットが用いられる化学合成により調製され
る。ＤＮＡ断片は残存する大断片と適当な方向に連結さ
れて突然変異体ハイブリッドをコードする二本鎖ＤＮＡ
配列が得られる。便宜上及びハイブリッド遺伝子の取扱
いを容易にするために、後者はセグメントの挿入及びク
ローニングをクローニングベクター中で行うことを可能
にする適当なリンカーを有するより大きなＤＮＡセグメ
ント中に含まれるのが有利である。
【００３５】本発明の好ましい実施態様においては、突
然変異体ハイブリッドＰＡをコードするＤＮＡの調製は
部位−指向突然変異誘発により行われる。この方法は、
クローン化されたＤＮＡの領域内のある規定部位が変更
されることのできるｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発操
作である〔M.J.Zoller及びM.Smith の総説文献、Method
s Enzymol. 100, 468 (1983)；D.Botstein及びD.Shortl
e, Science 229, 1193(1985) 参照〕。突然変異誘発は
完全ハイブリッドＰＡ遺伝子或いは不所望アミノ酸のコ
ドンを含有するその機能的部分のいづれについても行う
ことができる。突然変異誘発後、突然変異された機能的
部分をハイブリッドＰＡのその他の部分と結合させて突
然変異体ハイブリッドＰＡを与える。
【００３６】ハイブリッドＰＡ遺伝子或いはその機能的
部分の突然変異方法は、一本鎖遺伝子或いはＰＡ遺伝子
又はその部分を含んでなる一本鎖ＤＮＡが、突然変異を
指令するミスマッチ以外は突然変異されるべきハイブリ
ッド遺伝子の領域に相補的であるオリゴデオキシリボヌ
クレオチドプライマーにハイブリダイズされ、このハイ
ブリダイズされたオリゴデオキシリボヌクレオチドをプ
ライマーとして用いて相補ＤＮＡ鎖の合成を開始し、得
られた（部分的）二本鎖ＤＮＡを受容体微生物菌株中に
形質転換し、この微生物菌株を培養し、そして変更され
たハイブリッドＰＡ遺伝子（変異体）を有するＤＮＡを
含有する形質転換体を選択することを特徴とする。
【００３７】ハイブリッドＰＡ ＤＮＡを含有するハイ
ブリッドベクター 本発明はアミノ酸の同一性及び数においてヒトｕ−ＰＡ
及びヒトｔ−ＰＡの部分配列に対応する少なくとも２個
の部分配列より構成されるハイブリッドＰＡをコードす
る或いはその突然変異体をコードするＤＮＡを含んでな
るハイブリッドベクター及びその製造方法に関する。ベ
クターは形質転換のために予定される宿主細胞に応じて
選択される。原理的には、本発明に従う所望ポリペプチ
ド遺伝子を選ばれた宿主内で複製し、そして発現する全
てのベクターが適当である。
【００３８】適当な宿主の具体例は制限酵素或いは修飾
酵素のない或いは乏しい真核生物例えば酵母、例えばサ
ッカロミセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisi
ae）、例えばＳ．セレビジアエＧＲＦ１８などがあり、
更に哺乳動物細胞特に確立されたヒト或いは動物細胞系
統、例えばミエローマ細胞、ヒト胚肺繊維芽細胞Ｌ−１
３２、ＣＯＳ細胞、ＬＴＫ細胞、ヒト悪性メラノーマＢ
ｏｗｅｓ細胞、ＨｅＬａ細胞、アフリカミドリ猿ＣＯＳ
−７のＳＶ−４０ウイルス形質転換腎臓細胞或いはチャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びそれらの変
種などがある。上記哺乳動物細胞及びサッカロミセス・
セレビジアエの菌株、例えばＳ．セレビジアエＧＲＦ１
８が宿主微生物として好ましい。
【００３９】ａ．酵母用ベクター 酵母中における複製及び発現のために適したベクターは
酵母複製開始点及び酵母用選択的遺伝子マーカーを含有
する。酵母複製開始点を含有するハイブリッドベクター
例えば染色体自己複製セグメント（ａｒｓ）は形質転換
後、酵母細胞内に染色外的に保持され、自己複製され
る。更に、酵母２μプラスミドＤＮＡに相同な配列を含
有するベクターを使用することができる。その様なハイ
ブリッドベクターは既に細胞内に存在する２μプラスミ
ド中に組換により一体化されるか、或いは、自己複製す
る。２μ配列は高形質転換頻度を有するプラスミドには
特に適しており、高コピー数を可能にする。
【００４０】酵母用に適当なマーカー遺伝子は特に宿主
に抗生物質耐性を付与するものであり、或いは、栄養素
要求性酵母突然変異体の場合には、宿主の欠陥を補完す
る遺伝子である。対応する遺伝子は、例えば抗生物質Ｇ
４１８に対する耐性を付与し、或いは栄養要求性酵母突
然変異体例えばＵＲＡ３，ＬＥＵ２，ＨＩＳ３或いはＴ
ＲＰ１遺伝子内に原栄養性を与えるものである。酵母ハ
イブリッドベクターは更に好ましくはハイブリッドベク
ター及びそれらの中間体の造成及びクローニングが細菌
宿主内で行われるように細菌宿主特にＥ． ｃｏｌｉの
ための複製開始点及びマーカー遺伝子を含有するのが好
ましい。
【００４１】酵母内で発現するのに適した発現制御配列
は例えば良く発現される酵素遺伝子のものである。即
ち、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩ或いはＡＤＨII遺伝子、
酸ホスファターゼ（ＰＨＯ３或いはＰＨＯ５）遺伝子、
イソ−チトクローム遺伝子のプロモーター、或いは解糖
系遺伝子のプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセル
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡ
ＰＤＨ）、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧ
Ｋ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメ
ラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、インベルター
ゼ及びグルコキナーゼ遺伝子のプロモーターを用いるこ
とができる。
【００４２】本発明の好ましいベクターは転写制御を有
するプロモーター例えば生育条件の変化によりオン或い
はオフにすることのできるＰＨＯ５及びＡＤＨII遺伝子
のプロモーターなどを含有する。例えば、ＰＨＯ５プロ
モーターは単に培地中の無機リン酸塩の濃度を増大或い
は減少することによって抑制或いは抑制解除することが
できる。好ましくは、本発明の酵母ハイブリッドベクタ
ーは又転写停止及びポリアデニル化に適した適当なシグ
ナルを含有する酵母遺伝子の３′隣接配列（flanking s
equence ）も又含んでなる。適当な３′隣接配列は例え
ば用いられるプロモーターに自然に結合した遺伝子のも
の、例えば酵素ＰＨＯ５遺伝子の３′隣接配列である。
【００４３】ｂ．哺乳動物細胞用ベクター 哺乳動物細胞において複製及び発現するためのベクター
はしばしばウイルス起源例えばシミアンウイルス４０
（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノ
ウイルス２、ウシパピロマウイルス（ＢＰＶ）、パポバ
ウイルスＢＫ突然変異体（ＢＫＶ）、或いはマウス或い
はヒトサイトメガロウイルス（それぞれＭＣＭＶ及びＨ
ＣＭＶ）からのＤＮＡを備えるものである。
【００４４】哺乳動物用に適した発現制御配列は特にＳ
Ｖ４０の初期及び後期プロモーター、アデノウイルスの
主要後期（major late）プロモーター、ネヅミメタロチ
オネイン遺伝子のプロモーター及びマウス或いはヒトサ
イトメガロウイルスの主要即時−初期（immediate-earl
y ）遺伝子のエンハンサー−プロモーター領域、ヒトイ
ムノグロブリンエンハンサー−プロモーター領域、任意
にＳＶ４０エンハンサーと組合わされたヒトα−グロビ
ンプロモーター及びヒートショック遺伝子から得られた
プロモーターなどが挙げられる。
【００４５】哺乳動物細胞に適したマーカー遺伝子は例
えば抗生物質Ｇ４１８及びブレオマイシン−タイプ抗生
物質に耐性を与えるトランスポリンＴｎ５からのそれぞ
れｎｅｏ及びｂｌｅ遺伝子、ハイグロマイシン−Ｂ耐性
のためのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子、ＤＨＦＲ- 細胞の表現型
をＤＨＦＲ+ 細胞に変化させるかそして／又はメトトレ
キセートに耐性を与える哺乳動物細胞或いはＥ．ｃｏｌ
ｉからのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）及び
ＴＫ- 細胞を表現型的にＴＫ+ 細胞にする単純ヘルペス
ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子などである。
【００４６】好ましくは、哺乳動物細胞のためのハイブ
リッドベクターは適当な転写停止及びポリアデニル化の
ためのシグナル例えばβ−グロビン遺伝子の３′隣接領
域（flanking sequence ）を含有する哺乳動物遺伝子の
３′非翻訳領域を含有する。ポリペプチドコード領域に
隣接する領域がそれらの末端において適当なスプライシ
ングシグナルを有する１個以上の生来のイントロンを含
むのが有利である。ｃＤＮＡ及び上記選択遺伝子の様な
原核生物ＤＮＡは一般的にその様な転写及びプロセッシ
ングシグナルに欠けるので、その様な付加が必要である
と認められる。好ましくは、その様なベクターはＥ．ｃ
ｏｌｉ中の増加のための複製開始点及び抗生物質耐性遺
伝子を含有する。哺乳動物の複製開始点はベクターの造
成中にＳＶ４０或いは他のウイルス源から得られた様な
真核生物開始点を含ませるか或いはベクターを宿主細胞
染色体中に一体化した際に宿主細胞染色体により与えら
れる。
【００４７】哺乳動物細胞用の好ましいハイブリッドベ
クターは、その上流側がネヅミサイトメガロウイルスの
主要即時−初期（major immediate-early ）遺伝子エン
ハンサー−プロモーターに、そして下流側がその適当な
スプライシングシグナル及びポリアデニル化配列を有す
る第二イントロンを含むウサギβ−グロビン遺伝子の
３′末端に作用可能に隣接されているハイブリッドＰＡ
或いは突然変異体ハイブリッドＰＡ ｃＤＮＡを含んで
なる。更に、それらはトランスポソンＴｎ５或いは場合
によってはＴｎ９からのネオマイシン耐性遺伝子をコー
ドする配列又はハイクロロマイシンホスホトランスフェ
ラーガをコードする配列を含有し、これらはその上流側
において逐次ＳＶ４０の複製開始点及びＴｎ５ｎｅｏ遺
伝子の天然プロモーターも含むＳＶ４０ウイルスからの
初期プロモーターにより隣接され、そしてその下流側に
おいて小ｔ−抗原スプライシング及びポリアデニル化シ
グナルを含むＳＶ４０初期遺伝子のセグメントにより隣
接されている。
【００４８】全体造成物は、プラスミド複製起源及びア
ンピシリン耐性遺伝子を含むが、しかし、哺乳動物細胞
におけるＳＶ４０−モードＤＮＡ複製を抑制する所謂毒
性配列に欠けるＥ． ｃｏｌｉプラスミドｐＢＲ３２２
の断片中にクローン化される。任意にジヒドロ葉酸還元
酵素（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子がベクター中に含
まれ、好ましくはR.J.Kaufman et al.〔Mol.Cell.Biol.
2, 1304-1319 (1982)〕により説明されたモジュールＤ
ＨＦＲ遺伝子が用いられる。このモジュールＤＨＦＲ遺
伝子は逐次アデノウイルスタイプ２の主要後期プロモー
ター、イムノグロブリン遺伝子の断片、ウサギＤＨＦＲ
ｃＤＮＡのコード部分及びＳＶ４０の初期アデニル化
部位により構成される。
【００４９】哺乳動物用の新規の好ましいハイブリッド
ベクターは当業界における進歩を構成するものである。
それらはマウスサイトメガロウイルス即時−初期プロモ
ーター／エンハンサー中及びベーターグロビンスプライ
シング／ポリアデニル化配列中に位置するクローン化さ
れたｃＤＮＡのための強い発現シグナルを極めて広範囲
の脊椎動物細胞タイプにおいて高レベルの発現を可能に
する環境内に含む点においてこれ迄知られたベクターに
比較してより優れたものである。
【００５０】より具体的には、これらのベクターは
（ａ）通常の、即ちＳＶ４０−形質転換されない組織培
養細胞系において、ｃＤＮＡを一時的に発現するため
に、（ｂ）しかし更に良好にはＳＶ４０ Ｔ−抗原を発
現する霊長類細胞中でより高いコピー数においてベクタ
ーをそのＳＶ４０複製開始点を介して複製させるため
に、しかし、又、（ｃ）ベクターが宿主細胞染色体中に
一体化することができる場合には通常の組織培養細胞系
において安定にその様なクローン化されたｃＤＮＡを発
現するために、及び（ｄ）ベクターがエピゾームとして
複製することができるＳＶ４０ Ｔ−抗原産生霊長類細
胞系にベクターを導入する場合には、より高いコピー数
のために更により良好に用いることができる。
【００５１】ＭＣＭＶのエンハンサー−プロモーター領
域は、例えば、ＭＣＭＶの主要即時−初期遺伝子のヌク
レオチド−８３５〜−４４３において開始し、そして
５′領域のヌクレオチド＋５０（ｍＲＮＡ開始からカウ
ント）において終了するＤＮＡを含んでなる。好ましい
ＭＣＭＶのエンハンサー−プロモーター領域はヌクレオ
チド−５４２〜＋５０を含んでなる。ウサギβ−グロビ
ン遺伝子の３′隣接領域は、第２エキソン中で、好まし
くはＢａｍＨＩ部位において開始し、従って、その隣接
配列においてスプライシングのためのシグナルを有する
第２イントロンを含み、そしてポリアデニル化シグナル
の背後で、好ましくは上記ＢａｍＨＩ部位の後１．２kb
に位置するＢｇｌII部位で終了する。ウサギβ−グロビ
ン遺伝子の２番目の半分よりなる〔P.Dierks et al., P
roc.Natl.Acad.Sci. USA 78, 1411 〜1415 (1981) ; A.
van Ooyen et al., Science 206, 337-344 (1979) 〕。
【００５２】ＳＶ４０の複製開始点は例えばウイルスＤ
ＮＡのＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ断片に含まれている〔ヌ
クレオチド５１７１〜１２８、開始点＝位置１；Tooze
J.（編者）DNA Tumor Viruses, Part2、第２版、Cold S
pring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor ，ニュ
ーヨーク，1982〕。しかしながら、好ましい実施態様は
複製開始点に加えて、さらにベクターの選択遺伝子の転
写を促進するのに有用なウイルスの初期エンハンサー／
プロモーターをも含有するＨｉｎｄIII −ＨｐａII断片
（ヌクレオチド５１７１〜３４６）である。
【００５３】ネオマイシン遺伝子は組織培養細胞におい
て活性なプロモーター、好ましくは上記ＨｐａII−Ｈｉ
ｎｄIII 断片上に位置するＳＶ４０の初期プロモーター
の後にクローニングされる。ネオマイシンのコード配列
は例えばトランスポソンＴｎ５からのＢｇｌII−Ｓｍａ
Ｉ断片上に含まれる〔E.Beck et al., Gene 19, 327-33
6 (1982)；P.Southern et al., J.Mol.Appl.Genet.
１, 327-341 (1982)；F.Colbere-Garapin et al., J.Mo
l.Biol. 150 , 1-14 (1981) 〕。ネオマイシン遺伝子は
Ｅ． ｃｏｌｉにおける転写も又可能にする第二プロモ
ーターを備えるのが好ましい。例えば、ＨｉｎｄIII −
ＢｇｌII断片上に好ましく含まれるＴｎ５ネオマイシン
遺伝子の天然プロモーターをｎｅｏコード配列の前で真
核生物プロモーターの後に置くことができ（Southern e
t al. 上記）、或いは更に上流で真核生物プロモーター
の前に置くことができる（Colbere-Garapin et al. 上
記）。
【００５４】組織培養細胞内で発現されるためには、細
菌ｎｅｏ遺伝子に続いてポリアデニル化シグナル、好ま
しくは、スプライシングシグナルをさらに含有するＳＶ
４０ｔ抗原遺伝子の部分が存在しなければならない。ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ、特に上記Ｔｎ５
断片のＢｇｌII−ＳｍａＩ部分は又、ハイグロマイシン
Ｂホスホトランスフェラーゼのコード配列により、好ま
しくはプラスミドｐＬＧ８９のＢａｍＨＩ断片の形態
〔L.Gritz et al. Gene 25, 179-188 (1983)〕で置換さ
れることもでき、このプラスミドは最も便利にはＢｇｌ
IIリンカーがベクターのＳｍａＩ部位に導入されている
ｐＳＶ２９１１ｎｅｏの誘導体であるｐＳＶｄ〔Luedin
et al., EMBO-J. 6, 109-144 (1987)〕中に便利に挿入
することのできる。
【００５５】もう一つの好ましい選択遺伝子は、ｐＳＶ
２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４５）におけるような酵
素ジヒドロ葉酸還元酵素のコード化配列を用い、これ
は、形質転換細胞の選択のみならず、プラスミド付随Ｄ
ＮＡ配列の増幅もしばしば本発明によるプラスミド−コ
ード化タンパク質の比例した産生の増大を伴って可能に
する。Ｅ． ｃｏｌｉプラスミドｐＢＲ３２２から得ら
れる断片はｐＢＲ３２２の複製開始点及びアンピシリン
耐性遺伝子を含む。この断片は好ましくはベクターのＳ
Ｖ４０ｔ抗原−駆動複製を阻害する所謂毒性配列が除去
されているｐＳＶＯｄ〔P.Mellon et al., Cell 27, 27
9-288 (1981)〕などのｐＢＲ３２２誘導体からとられる
のがよい。
【００５６】好ましい実施態様において、本発明はプロ
モーター及びハイブリッドＰＡ或いは突然変異体ハイブ
リッドＰＡをコード化するＤＮＡを含んでなる、真核生
物宿主菌株内において複製及び表現型選択を行うことの
できるハイブリッドベクターに関し、該ＤＮＡは、形質
転換された宿主内においてそれが発現されてタンパク質
が産生されるように、該プロモーターの制御下に転写開
始及び終了シグナル並びに翻訳開始及び停止シグナルと
共に該ハイブリッドベクター内に配置されている。本発
明のハイブリッドベクターは、例えばプロモーター、ハ
イブリッドＰＡ或いは突然変異体ハイブリッドＰＡコー
ド化領域、３′隣接配列、及びベクターＤＮＡを含有す
るＤＮＡセグメントを連結することにより公知の方法に
より調製される。
【００５７】ＤＮＡセグメントをｉｎ ｖｉｔｒｏで連
結するために、各種技術が使用される。ある種の制限酵
素により生成された平滑末端（完全に塩基対形成された
ＤＮＡ二本鎖）は直接にＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結さ
れてよい。より普通には、ＤＮＡセグメントはそれらの
一本鎖粘着末端により連結され、ＤＮＡリガーゼ、例え
ばＴ４ ＤＮＡリガーゼにより共有結合的に閉じられ
る。その様な一本鎖「粘着末端」は、ＤＮＡをジグザグ
末端（ＤＮＡ二本鎖の二本の鎖が幾つかのヌクレオチド
だけ離れた点で切断される）を生成するもう一つのクラ
スのエンドヌクレアーゼによりＤＮＡを切断することに
より形成される。
【００５８】一本鎖は又、末端トランスフェラーゼを用
いて平滑末端或いはジグザグ末端にヌクレオチドを付加
することによって（「ホモポリマーテーリング」）、或
いは単に平滑末端ＤＮＡセグメントの一本鎖を適当なエ
キソヌクレアーゼ例えばλエキソヌクレアーゼでチュー
バックすることによっても形成することができる。ジグ
ザグ末端の生成への更に一つの手法は、平滑末端ＤＮＡ
セグメントにジグザグ末端形成エンドヌクレアーゼの認
識部位を含有する化学的に合成されたリンカーＤＮＡを
連結し、そして得られたＤＮＡを対応するエンドヌクレ
アーゼで消化することにある。本発明によるハイブリッ
ドベクターの成分は適当な機能を確実にするために所定
順序で一緒に結合される。
【００５９】ハイブリッドＰＡ ＤＮＡを含有するハイ
ブリッドベクターで形質転換された宿主 本発明のもう一つの面はアミノ酸の同一性及び数におい
てヒトｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡの部分配列に対応する少な
くとも２個の部分配列により構成されるハイブリッドＰ
Ａをコードする或いはその突然変異体をコードするＤＮ
Ａを含んでなるハイブリッドベクターで形質転換された
真核生物宿主生物、及びその宿主の突然変異体、及びそ
れらの製法を含むものである。
【００６０】適当な真核生物宿主の具体例は上記のもの
であり、特に酵母及び哺乳動物細胞株である。形質転換
宿主生物体の突然変異体は特にハイブリッドＰＡ或いは
突然変異体ハイブリッドＰＡを分解するプロテアーゼに
乏しくそれぞれハイブリッドＰＡ及び突然変異体ハイブ
リッドＰＡのより高い収率を与える突然変異体が挙げら
れる。形質転換体真核生物宿主の製造方法は、発現制御
配列により制御される本発明のＤＮＡを含んでなる発現
ベクターで真核生物宿主を形質転換即ちトランスフェク
ションすることを特徴とする。
【００６１】真核生物宿主細胞の形質転換は公知の方法
により達成される。例えば、酵母の形質転換はHinnen e
t al. 〔Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75. 1919 (1978) 〕
により説明されている方法に従って達成される。この方
法は次の三工程に分けることができる： （１）酵母細胞壁或いはその部分の除去。 （２）「裸」の酵母細胞（スペロプラスト）のＰＥＧ
（ポリエチレングリコール）及びＣａ2+イオンの存在下
における形質転換ＤＮＡによる処理。 （３）寒天の固体層中における細胞壁の再生及び形質転
換細胞の選択。 好ましい方法：
【００６２】工程１：酵母細胞壁は、各種グルコシダー
ゼの調製物、例えばカタツムリ胃液（例．Ｇｌｕｓｕｌ
ａｓｅ（登録商標）或いはＨｅｌｉｃａｓｅ（登録商
標））或いは微生物から得られた酵素混合物（例．Ｚｙ
ｍｏｌｙａｓｅ（登録商標））により、浸透圧的に安定
化された溶液（例．１Ｍソルビトール）中において酵素
的に除去される。工程２ ：ＰＥＧの存在下で酵母スフェロプラストが凝集
し、そして細胞質膜の局所的融合が誘発される。「融合
様」条件の生成が重要であり、多くの形質転換酵母細胞
は形質転換の過程において２倍体或いは３倍体にさえも
なる。融合したスフェロプラストの選択を可能にする操
作を用いて形質転換体を濃縮することができる。即ち、
形質転換された細胞は予備選択された融合生成物中から
容易にスクリーニングすることができる。
【００６３】工程３：細胞壁のない酵母細胞は分裂しな
いので細胞壁は再生されなければならない。この再生は
スフェロプラストを寒天中に包埋することによりなされ
るのが便利である。例えば、溶融寒天（約５０℃）をス
フェロプラストと混合する。溶液を酵母生育温度（約３
０℃）まで冷却すると、固体層が得られる。この寒天層
はスフェロプラストからの必須巨大分子の迅速的な拡散
及び損失を防止して細胞壁の再生を容易にする。しかし
ながら、細胞壁再生は又（より低い効率であるが）スフ
ェロプラストを予備形成された寒天層の表面上にプレー
ト培養することによっても得られる。
【００６４】好ましくは、再生寒天は形質転換細胞の再
生及び選択を同時に行うようにして調製される。アミノ
酸生合成経路の酵素をコードする酵母遺伝子が一般的に
選択マーカー（上記）として用いられるので、再生は好
ましくは酵母最小培地寒天内で行われる。極めて高い再
生効率が必要とされる場合には、次の二つの工程操作が
有利である：（１）富んだ複合培地内における細胞壁の
再生、及び（２）細胞層の選択寒天プレート上へのレプ
リカプレーティングによる形質転換細胞の選択。
【００６５】ハイブリッドベクターの哺乳動物細胞中へ
の導入はヘルパー化合物例えばジエチルアミノエチルデ
キストラン、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ポ
リエチレングリコールなど、或いは共沈澱としてのベク
ターＤＮＡ及びリン酸カルシウムの存在下におけるトラ
ンスフェクションによりなされる。更に適当な方法とし
ては、ベクターＤＮＡの細胞核中への直接マイクロイン
ジェクション及びエレクトロポレーション即ち細胞膜の
透過性を増大する短い電気パルスによるＤＮＡの導入な
どが挙げられる。トランスフェクションされた細胞の引
続く選択は、発現ベクターに共有結合により一体化され
るか或いは別の存在として添加される選択マーカーを用
いて行うことができる。選択マーカーとしては抗生物質
に対する耐性を与える遺伝子或いは宿主細胞の遺伝的欠
陥を補完する遺伝子が挙げられる（上記）。
【００６６】一つの好ましい選択系は外因的ＤＨＦＲ遺
伝子が供給されなければ成長に絶対にチミジン、グリシ
ン及びプリン類を必要とするジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ
ＨＲＦ- ）に欠ける細胞、例えばＣＨＯ細胞を利用す
る。ハイブリッドＰＡ遺伝子を含有するベクター及びこ
れに加えてＤＨＦＲ遺伝子を適当なＤＨＦＲ- 細胞例え
ばＣＨＯ細胞に導入すると、形質転換細胞は抗−葉酸剤
メトトレキセートの濃度を培地中において増大すること
により選択される。特に、好ましいのは適当な哺乳動物
細胞例えばＣＨＯ細胞がハイブリッドＰＡ遺伝子及び抗
生物質耐性例えばＧ−４１８に対する耐性をコードする
遺伝子を含有するベクターＤＮＡと、リン酸カルシウム
との共沈澱により処理される選択方法である。形質転換
された細胞は対応する抗生物質例えばＧ−４１８中で培
養し、そして／又はハイブリッドＰＡ発現についてスク
リーニングすることにより選択される。
【００６７】本発明の形質転換された宿主生物体は公知
の突然変異及び選択適用方法によりハイブリッドＰＡ或
いは突然変異体ハイブリッドＰＡの産生について改良さ
れる。この突然変異は例えば紫外線照射或いは適当な化
学薬品により行うことができる。特に好ましいのは、産
生されたハイブリッドＰＡ及び突然変異体ハイブリッド
ＰＡのタンパク質分解的破壊をそれぞれ回避するための
プロテアーゼ−欠陥突然変異体、特に酵母突然変異体の
製造である。
【００６８】形質転換された宿主細胞の培養 本発明は更にアミノ酸の同一性及び数においてヒトｔ−
ＰＡ及びヒトｕ−ＰＡの部分配列に対応する少なくとも
２個の部分配列により構成されるアミノ酸配列を有する
一本鎖ハイブリッドＰＡ或いはその突然変異体の製造方
法であって、適当な栄養条件下において該ハイブリッド
ＰＡ或いは突然変異体ハイブリッドＰＡをコード化する
ＤＮＡ配列を含有する形質転換真核生物宿主を培養し、
そして該ハイブリッドＰＡ或いはその突然変異体を単離
することを特徴とする方法に関する。形質転換された宿
主細胞は同化可能な炭素源、窒素源及び無機塩類を含有
する液体培地中において公知の方法により培養される。
【００６９】本発明の形質転換された酵母細胞の培養の
ためには、各種炭素源を用いることができる。好ましい
炭素源の具体例は同化可能な炭水化物、例えばグルコー
ス、マルトース、マンニトール或いはラクトース或いは
アセテートであり、これらはそれ自体或いは適当な混合
物として用いることができる。適当な窒素源の具体例と
しては、アミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド類及び
タンパク質及びそれらの劣化生成物例えばトリプトン、
ペプトン或いは肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、及
び又アンモニウム塩例えば塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、或いは硝酸アンモニウムなどであり、それら
はそれ自体或いは適当な混合物として用いることができ
る。更に使用することのできる無機塩類はナトリウム、
カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化
物、リン酸塩、及び炭酸塩である。
【００７０】培地は更に例えば成長促進物質、例えば微
量元素例えば鉄、亜鉛、マンガンなど、及び好ましくは
選択圧力を働かせて発現プラスミドを失った細胞の成長
を防止する物質を含有する。即ち、例えば、必須アミノ
酸中で栄養素要求性である酵母菌株が宿主微生物として
用いられる場合に、プラスミドはこの宿主の欠陥を補完
する酵素をコード化する遺伝子を含有するのが好まし
い。この酵母菌株の培養は該アミノ酸に欠ける最小培地
中において行われる。培養は公知の方法により行われ
る。培養条件例えば温度、培地のpH値、及び発酵時間は
本発明のＰＡタンパク質の最大力価が得られるように選
ばれる。即ち、酵母菌株は通気条件下に浸透或いは攪拌
しながら液内培養により約２０〜４０℃、好ましくは約
３０℃の温度、５〜８のpH値好ましくは約pH７において
約４〜３０時間、好ましくは本発明のタンパク質の最大
収量に達するまで培養されるのが好ましい。
【００７１】哺乳動物細胞は任意に成長促進物質及び／
又は哺乳動物血清を補給された市販の培地を用いて組織
培養条件下に生育される。細胞は固体支持体例えばマイ
クロキャリヤー或いは多孔性ガラス繊維に付着するか或
いは適当な培養容器内で自由浮遊されて生育される。培
養培地は選択圧力が働いて遺伝子マーカーを含むハイブ
リッドベクターＤＮＡを尚含有する細胞のみが生残るよ
うにして選択される。即ち、例えば、ハイブリッドベク
ターが対応する抗生物質耐性遺伝子を含む場合に抗生物
質が培地に添加される。
【００７２】細胞密度が十分な値に到達した時点で培養
を中断し、タンパク質を単離する。哺乳動物細胞を用い
る場合には、ハイブリッドＰＡ或いは突然変異体ハイブ
リッドＰＡタンパク質は通常培地中に分泌される。この
生成物を含有する培地を細胞から分離し、この細胞に新
たな培地を与えられて連続製造に用いることができる。
酵母細胞が用いられる場合には、タンパク質は又細胞
内、特にペリプラズム空間にも蓄積することができる。
後者の場合、ＰＡタンパク質の回収のための第１工程は
タンパク質を細胞内部から放出することにある。
【００７３】殆んどの操作において、細胞壁を先ずグル
コシターゼ類（上記）による細胞壁の酵素消化により除
去する。或いは又、細胞壁を化学薬品例えばチオール試
薬或いはＥＤＴＡなどによる処理により除去するが、こ
れは細胞壁に傷を生ぜしめ、産生されたハイブリッドＰ
Ａ或いはその変異体を放出させる。得られた混合物は通
常の手段に例えばポリエチレンイミンを用いる処理によ
る殆んどの非タンパク質物質の除去、硫酸アンモニウム
を用いるタンパク質の沈澱、ゲル電気泳動、透析、クロ
マトグラフィ、例えばイオン交換クロマトグラフィ、サ
イズ排除クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ或いは逆相ＨＰＬ
Ｃ、適当なＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラム上にお
ける分子サイジングなどにかけてハイブリッドＰＡ或い
はその変異体の濃縮を行う。
【００７４】この予備精製された生成物の最終精製は、
例えばアフィニティクロマトグラフィ例えば抗体アフィ
ニティクロマトグラフィ、特に公知の方法で不溶性マト
リックス上に固定されたモノクローナル抗−ｔ−ＰＡ或
いは抗−ｕ−ＰＡ抗体を用いるモノクローナル抗体アフ
ィニティクロマトグラフィ或いはｔ−ＰＡの触媒作用Ｂ
−鎖を含有するハイブリッドＰＡの場合には、ＤＥ−３
アフィニティクロマトグラフィ（ＤＥ−３はErytrina l
atissimaから単離されたプロテアーゼ阻害剤である）な
どにより達成される。
【００７５】ｔ−ＰＡ或いはｕ−ＰＡの特異的ドメイン
に向けられたモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞系統及び該モノクローナル抗体は又本発明の目
的である。二本鎖形態を実質的伴わない一本鎖形態のハ
イブリッドＰＡ或いは突然変異体ハイブリッドＰＡの便
利な製造のためには、培養培地中に存在し、一本形態の
二本鎖形態への（部分的）転換を引起こすことのある微
量のプロテアーゼを阻害するために、プロテアーゼ阻害
剤例えばアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ（登録商
標））或いは塩基性膵臓トリプシン阻害剤を精製操作時
に含ませるのが有利である。最終精製は、次いで、選択
的アフィニティ試薬を含有するカラム上でのクロマトグ
ラフィにより達成される。
【００７６】５．医薬組成物 本発明によって得ることのできる新規一本鎖ハイブリッ
ドＰＡタンパク質及びその突然変異体は貴重な薬学的性
質を示す。それらはプラスミノーゲン活性の機構を介し
て局所的フィブリン分解或いはタンパク質分解活性をも
たらしたい場合の血栓症その他の状態例えばアテローム
性動脈硬化症、心筋及び脳梗塞、静脈血栓症、血栓塞栓
症、手術後血栓症、血栓静脈炎及び糖尿性血管症などの
予防或いは治療のためにヒトにおける公知のプラスミノ
ーゲンアクチベータと同様に用いることができる。
【００７７】驚くべきことに、本発明による新規ハイブ
リッドＰＡタンパク質及びその突然変異体は天然ｔ−Ｐ
Ａ及びｕ−ＰＡの有益な性質を合わせ持つことが判明し
た。即ち、新規ハイブリッドＰＡタンパク質及びその突
然変異体は繊維素分解活性を有する。この独特なフィブ
リン−指向特性即ちフィブリンの存在下において優先的
にプラスミノーゲン活性化する能力が保持されている。
更に新規タンパク質は真性のｔ−ＰＡに比較して長時間
のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を有する。本発明は又治療的に
有効量の有効成分（ハイブリッドＰＡ或いはその突然変
異体）を非経口的、即ち筋肉内、皮下或いは腹腔内投与
に適し、有効成分と悪い相互作用を行わない有機或いは
無機の固体或いは液体の薬学的に許容可能な担体と共に
含んでなる医薬組成物にも関する。
【００７８】適当な注入溶液、好ましくは水溶性或いは
水性分散液があり、これらは使用前に例えば有効成分単
独、或いはマンニトール、ラクトース、グルコース、ア
ルブミンなどの担体と共に含有する凍結乾燥調剤から調
製することが可能である。この医薬組成物は殺菌され及
び必要に応じて補助剤例えば防腐剤、安定剤、乳化剤、
可溶化剤、緩衝剤及び／又は浸透圧を制御するための塩
類などと混合される。殺菌は小孔径（０．４５μｍ直径
以下）のフィルターを通す殺菌濾過により達成すること
ができ、その後組成物を必要に応じて凍結することがで
きる。殺菌性を保存するのが助けるために抗生物質も又
添加されてよい。
【００７９】本発明による医薬組成物は単位投与形態、
例えば単位投与当り１〜２０００mgの薬学的に許容可能
な担体及び単位投与当り約１〜２００mg、好ましくは約
５〜１００mgの有効成分を含んでなるアンプルとして調
剤される。病気のタイプ及び患者の年令、状態に応じ
て、約７０kgの体重の患者の治療に投与される毎日の投
与量は２４時間当り３〜１００mg、好ましくは５〜５０
mgである。心筋梗塞の場合には、好ましくは約３０〜８
０mgが６０〜１２０分以内に、好ましくは約９０分以内
に３回分けて投与される。ハイブリッドＰＡ或いは突然
変異体ハイブリッドＰＡの全量は又ボーラス注射として
も投与することができる。
【００８０】本発明は又本発明により生物学的に活性な
タンパク質が薬学的に許容可能な担体と混合されること
を特徴とする医薬組成物の製造方法も提供する。新規タ
ンパク質の人体の予防的及び治療的治療の使用も又本発
明の目的である。本発明は特に実施例において説明され
たＤＮＡ類、ハイブリッドベクター、形質転換された宿
主菌株、ハイブリッドＰＡタンパク質、突然変異体ハイ
ブリッドＰＡタンパク質、ハイブリドーマ細胞系統、モ
ノクロナール抗体及びそれらの製造方法に関する。
【００８１】実験の部 実施例１：ヒトｔ−ＰＡ ｃＤＮＡにおけるクリングル
構造及び酵素ドメイン間の連結部におけるＳｃａＩ部位
の導入 ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡ両者のドメインを含有するキメラ
或いはハイブリッド分子を造成するために用いられる一
つの手法は、各々のクローンから得られた目的制限断片
を調製し、それらを溶液中において再編成し、次いで得
られた造成物をクローン化することにある。クローン化
後、キメラ分子の構造は制限マッピング及びＤＮＡ配列
分析により検証される。
【００８２】ハイブリッド分子を得るためには、ｔ−Ｐ
Ａ及びｕ−ＰＡ ｃＤＮＡの両者を各々のクリングル構
造及び酵素ドメインの間の連結部において切断する。こ
れはｕ−ＰＡについては、非−触媒作用ドメインを酵素
ドメイン及びその３′末端における関連配列と分離する
制限酵素ＭｓｔＩによる部分的消化を行うことにより達
成される。ｔ−ＰＡ中にはこれに匹敵し得る有用な潜在
的切断部位が存在しないので従って、これを以下の様に
して導入する。
【００８３】Ａ）プラスミドｐＥｃｏ０．４７ΔＳｃａ
Ｉの造成（図９参照） この造成において、ｔ−ＰＡ ｃＤＮＡのヌクレオチド
位置９４０−９４５における非反復ＳｃａＩ部位（AGTA
CT）を破壊し、（ＡＧＴＡＣＴ→ＡＧＴＡＴＴ）及びも
う一つのＳｃａＩ部位をクリングル２の３′末端におけ
るヌクレオチド位置９６３−９６８（ＴＣＣＡＣＣ→Ａ
ＧＴＡＣＴ）において導入する（図２及び図４参照）。
これらの変化によってはいづれのアミノ酸のコードも影
響を及ぼされない。
【００８４】全ての制限消化は製造元（New England Bi
olabs, Bethesda Research Labs ）の指示事項に従って
行われ、得られた消化物は３．５％ポリアクリルアミド
ゲル上の電気泳動により分析された。ゲルはエチジウム
ブロマイド（１．０μｇ／ml）で染色し、紫外線で可視
化された。適当なバンドを切出し、０．５×ＴＢＥ（１
×ＴＢＥ＝９０mM Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、pH８．３、
２．５mM ＥＤＴＡ）中で電気溶出された。電気溶出さ
れた物質をＥｌｕｔｉｐ−ｄカラム（Schleicherand Sc
huell）にかけ、結合ＤＮＡを高塩中に溶出させ、エタ
ノールを添加して沈澱した。ペレットをエタノールで洗
浄し、乾燥し、水に溶解した。
【００８５】ヒトｔ−ＰＡ ｃＤＮＡ（ＨｅＬａＳ３細
胞から単離したｍＲＮＡから合成したプラスミドｐＢＲ
３２２のＰｓｔＩ部位中にクローン化したもの）を含有
するプラスミドｐＷ３４９Ｆ（ヨーロッパ特許出願１４
３，０８１号明細書）をＥｃｏＲＩで消化し、４７０塩
基対（bp）断片（図４参照）を単離した。４７０bpＥｃ
ｏＲＩ断片をＳｃａＩ及びＨａｅIII でそれぞれ消化す
ることにより、１５０bp ＥｃｏＲＩ−ＳｃａＩ及び２
９０bp ＥｃｏＲＩ−ＨａｅIII 断片を得た。ＤＮＡを
ＤＭＳＯ緩衝液（３０％ ＤＭＳＯ、１mM ＥＤＴＡ、
０．５％キシレンシアノール、０．０５％ブロムフェノ
ールブルー）中において変性し、そして０．５×ＴＢＥ
中において５％ポリアクリルアミドゲル中で８ボルト／
cmにおいて電気泳動することにより、４７０bp Ｅｃｏ
ＲＩ断片の二本の鎖を分離した〔Maniatis et al. Mole
cular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor Laboratory : 1982〕。
【００８６】分離された鎖は、電気溶出及びそれに続く
エタノール沈澱により回収した。ホスホトリエステル法
を用いて３１−マーデオキシオリゴヌクレオチド（５個
の目的ヌクレオチド変化を含む、図９参照）が合成され
た。５０ｐモルの３１−マーを、１×キナーゼ緩衝液
（１０×キナーゼ緩衝液＝０．５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ、pH７．５、０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 ５０mM ＤＴＴ、
１mMスペルミジン、１mMＥＤＴＡ）、３０μＣｉ〔α32
Ｐ〕ＡＴＰ（Amersham、約３０００Ci／ｍモル）及び１
０単位のＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼ（Bethesda Res
earch Labs. ）を含有する２０μｌ反応液中において
５′末端において32Ｐ−標識化した。反応液を３７℃で
３０分間インキュベート後、１μｌの１０mM ＡＴＰ、
１０単位のＴ 4 キナーゼを添加し、更に３２℃で３０分
間インキュベートした。反応は６８℃において１０分間
加熱することにより終了させた。
【００８７】その配列が非転写鎖のそれである標識化さ
れた３１−マーをドットブロット分析におけるプローブ
として使用して〔Zoller and Smith, Nucl.Acids Res.,
10, 6487-6500 (1982)に従って行った；但しプリハイ
ブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは５０
℃において行われ、洗浄は６０℃において行われた〕、
二本鎖のいづれかそれにハイブリダイズするか即ち転写
された鎖を表わすかを決定した。四つのＤＮＡを０．３
ｐモルの転写鎖、各２ｐモルの１５０bp ＥｃｏＲＩ−
ＳｃａＩ断片及び２９０bp ＥｃｏＲＩ−ＨａｅIII 断
片、２５ｐモルのホスホリル化３１−マー及び１×アニ
ーリング緩衝液（５×アニーリング緩衝液＝０．５Ｍ
ＮａＣｌ、３２．５mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、
４０mMＭｇＣｌ2 及び５mM β−メルカプトエタノー
ル）よりなる２０μｌのアニーリング反応液において一
緒に混合した。
【００８８】この混合物を１００℃で３分間、３０℃で
３０分間、４℃で３０分間インキュベートした後、１０
分間氷上で冷却後４００単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼ（Ne
w England Biolabs ）を添加し、反応液を１２．５℃で
一昼夜インキュベートした。４７０bpのアニーリングさ
れた断片を上記の如く３．５％ポリアクリルアミドゲル
から回収し、１２℃における一昼夜のインキュベーショ
ンにより、５０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１０
mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ＤＴＴ、１mM ＡＴＰ、１mM
スペルミジン、０．１mg／mlウシ血清アルブミン中にお
いて、ＥｃｏＲＩ消化された脱ホスホリル化ｐＢＲ３２
２ＤＮＡ（New England Biolabs ）に連結した。
【００８９】５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬ
−寒天上でアンピシリン耐性コロニーを選択し、４７０
bp断片を含有するコロニーを３１−マーをプローブとし
て用いるコロニーハイブリダイゼーションにより確認し
た〔D.Woods, Focus ６, 1-3 (1984)〕。プラスミドＤ
ＮＡを幾つかの陽性にハイブリダイズするコロニーから
小規模に単離し〔Holmes et al., Analyt.Biochem. 11
4 , 193-197 (1981)〕、そして新しいＳｃａＩ部位の生
成をＥｃｏＲＩ及びＳｃａＩ消化の組合せにより検証し
た。純度を確実にするために、陽性コロニーからのプラ
スミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１の第２ラウン
ドの形質転換に用いた。大規模プラスミド調製はその様
な第二世代陽性コロニーから行われ〔Katz et al., J.B
acteriol. 114 , 577-591 (1973) ; Biochemistry 16,
1677-1683 (1977)〕、そして元のＳｃａＩ部位の破壊及
び新しいＳｃａＩ部位の生成はMaxam 及びGilbert の方
法〔Methods Enzym. 65, 499-560 (1980) 〕を用いるＤ
ＮＡ配列分析により検証された。このプラスミドをｐＥ
ｃｏ０．４７ΔＳｃａＩと命名する。
【００９０】Ｂ）ヒトｔ−ＰＡの変異体ＳｃａＩ部位に
よる再造成（図１０参照） この造成においては野性型ヒトｔ−ＰＡ上に存在する４
７０bp ＥｃｏＲＩ断片を変異体ＳｃａＩ部位を含有す
る４７０bp ＥｃｏＲＩ断片と交換した。ヒトｔ−ＰＡ
ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＷ３４９Ｆ（上記参
照）をＣｌａＩで消化し、得られた粘着末端を各々５０
μｍのｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及び１０単位のＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、クレノウ断片（Boehringer, Mannheim）を添
加することにより、平滑化した。反応液を室温で３０分
間インキュベート後、フェノール及びエーテル抽出及び
エタノール沈澱を行った。ペレットを水に溶解し、Ｅｃ
ｏＲＩ及びＳｃａＩで消化し、そして１．５kb Ｅｃｏ
ＲＩ−ＳｃａＩ断片及び４．３kb ＣｌａＩ（平滑末
端）−ＥｃｏＲＩ断片を単離した。
【００９１】これらの二つの断片を、ＥｃｏＲＩ消化後
にプラスミドｐＥｃｏ０．４７ΔＳｃａＩから回収した
４７０bp断片と混合し、上記の如く一昼夜１２℃におい
て連結させた。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
細胞を連結ミックスで形質転換し、テトラサイクリン耐
性コロニーを１２．５μｇ／mlテトラサイクリンを含有
するＬ−寒天上で選択した。４７０bp突然変異体断片を
含有するコロニーを前記３１−マーをプローブとして用
いるコロニーハイブリダイゼーションにより確認した。
幾つかの陽性にハイブリダイズするコロニーのミニ溶解
物からＤＮＡを調整し、適当な制限消化を行うことによ
り造成物の正確な性質を検証した。所望の変化を起こし
たその様な一つのプラスミドをｐｈ・ｔＰＡΔＳｃａＩ
と称する。
【００９２】実施例２：ｕ−ＰＡ／ｔ−ＰＡハイブリッ
ド分子の造成；プラスミドｐＵＮＣ・ｔｃ（図１１参
照） この造成はｕ−ＰＡの非触媒作用ドメイン（５′非コー
ド化領域、シグナル、成長因子及びクリングル配列を含
有する）とヒトｔ−ＰＡの触媒作用即ち酵素ドメイン間
のハイブリッドである。ウロキナーゼｃＤＮＡをヒトＨ
ｅｐ３細胞から得られるｍＲＮＡから調整した〔T.Mani
atis et al., Molecular Cloning (1982), p.188-246参
照〕。ｕ−ＰＡｃＤＮＡ １．３kb ＳｍａＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片及び１kb ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＵ
Ｎ１２１のＳｍａＩ，ＥｃｏＲＩ部位中にクローン化し
〔B.Nilsson et al., Nucl.Acids Res. 11, 8019-8030
(1983)〕、プラスミドｐｃＵＫ１７６を得た。ヒトｕ−
ＰＡ ｃＤＮＡインサートの制限酵素地図を図８に示
す。ｕ−ＰＡインサートのヌクレオチド配列及び推定ア
ミノ酸配列を図７に示す。
【００９３】プラスミドｐｃＵＫ１７６をＸｍａＩ（図
８参照、ＸｍａＩはＳｍａＩのアイソシゾマーである）
及びＭｓｔＩで消化し、５２１bp断片を単離した。制限
酵素ＭｓｔＩはＤＮＡ配列ＴＧＣ／ＧＣＡ（／印は切断
部位を示す）を認識し、消化時に平滑末端を生成する。
この酵素は従ってｕ−ＰＡ ｃＤＮＡをヌクレオチド５
２０−５２５において、即ち最後のシスティン残基（ア
ミノ酸残基１３１）直後のクリングルよりなるところで
切断し〔Holmes et al., Biotechnology ３,923-929
(1985)〕、従って非触媒作用ドメイン及び触媒ドメイン
のためのコード配列を明確に分離する。
【００９４】プラスミドｐｈ・ｔＰＡΔＳｃａＩをＳｃ
ａＩ及びＨｉｎｄIII （ＨｉｎｄIII はベクター中に存
在する）で消化し、１．８kb断片を回収した。制限酵素
ＳｃａＩはＤＮＡ配列ＡＧＴ／ＡＣＴ（／印は切断部位
を示す）を認識し、又消化時に平滑末端を生ずる。Ｓｃ
ａＩはｐｈ・ｔＰＡΔＳｃａＩ ＤＮＡをセリン残基２
６２の後で切断する〔クリングル２の最後のシスティン
を過ぎた１アミノ酸；Pennica et al., Nature 301, 21
4-221 (1983)〕、従って、非触媒作用ドメイン及び触媒
作用ドメインを分離する。
【００９５】これらの二つの断片を混合し、ＸｍａＩ，
ＨｉｎｄIII 断片ｐＵＣ１８ベクターＤＮＡに連結し
た。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１の形質転換後、正しいイ
ンサートを有するコロニーをヒトｔ−ＰＡの２．０kb
ＢｇｌII断片（図４参照）をプローブとして用いるコロ
ニーハイブリダイゼーションにより確認した〔このプロ
ーブはランダムプライミング法により標識化された：Fe
inberg et al., Analyt.Biochem. 132 , 6-13 (1983)
〕。ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ断片の連結部におけるＤＮ
Ａ配列はＤＮＡ配列分析により検証された。一つの正し
いクローンをｐＵＮＣ・ｔｃと命名する。
【００９６】実施例３：ｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡハイブリッ
ド分子の造成；プラスミドｐｔＮＣ・ＵＣ（図１２参
照） この造成物は、ｐｈ・ｔＰＡΔＳｃａＩの非触媒作用ド
メイン（５′非コード化領域、リーダー、フィンガー、
成長因子、クリングル１及びクリングル２ドメインを含
有する）がヒトｕ−ＰＡの触媒作用ドメインに融合して
いる点において正にｐＵＮＣ・ｔｃの逆である。プラス
ミドｐｈ・ｔＰＡΔＳｃａＩをＳａｃＩ及びＳｃａＩ
（図１２参照）で消化し、約１．０kb断片を単離した。
プラスミドｐｃＵＫ１７６を先ずＢａｍＨＩで消化し、
次いでＭｓｔＩで部分的に切断し、約８００bpの断片を
回収した。次いでＢａｍＨＩ消化物をＥｃｏＲＩで切断
し、約１．０kbの断片を単離した。これらの三つの断片
をＳａｃＩ，ＥｃｏＲＩで消化されたｐＵＣ１９ベクタ
ーと混合し、連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１をこ
の連結ミックスで形質転換し、正しいインサートを有す
るコロニーを上記と同一の２．０kb ＢｇｌIIを用いる
コロニーハイブリダイゼーションにより確認した。ｔ−
ＰＡ及びｕ−ＰＡ ＤＮＡの連結部におけるＤＮＡ配列
はＤＮＡ配列分析により検証した。一つの正しいクロー
ンをｐｔＮＣ・ＵＣと称する。
【００９７】実施例４：哺乳動物細胞用の発現ベクター
の造成 Ａ）ｔ−ＰＡ ｃＤＮＡにおけるＨｇｉＡＩ部位のＨｉ
ｎｄIII 部位への転換 これは五工程により達成される（図１３）。プラスミド
ｐＷ３４９Ｆ（ヨーロッパ特許出願１４３，０８１号明
細書）を、プラスミドの二次的切断を抑制するために１
０μｇ／mlのエチジウムブロマイドを補給された以外は
製造元（Bethesda Research Laboratories）により推薦
された緩衝液中において、１２Ｕ／mlの酵素により３７
℃で１時間、２０μｇ／mlＤＮＡのインキュベーション
により制限酵素ＨｇｉＡＩで部分的に切断した。線形化
されたプラスミドＤＮＡを次いでＴＢＥ緩衝液（ＴＢ
Ｅ：１mM ＥＤＴＡを含有する８９mM Ｔｒｉｓホウ酸
塩、pH８．９）中の０．８％アガロースゲルにかけ、同
一緩衝液内で電気泳動的に溶出させ、フェノールで２回
抽出し、クロロホルムで２回抽出し、最後に０．１容の
３Ｍ酢酸ナトリウム（pH５．２）を添加後に−２０℃で
アルコールで沈澱させた。ペレット化されたＤＮＡを
０．２mg／mlでＴＥ（ＴＥ：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
pH７．２及び０．１mM ＥＤＴＡ）中において溶解し
た。
【００９８】６３μｌの線形化されたＤＮＡを次いでリ
ガーゼ緩衝液〔３３mM Ｔｒｉｓ−酢酸塩（pH７．
９）、６６mM酢酸カリウム、１０mM酢酸マグネシウム、
０．５mMジチオスレイトール及び０．１mg／mlウシ血清
アルブミン〕中１５ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで３
７℃において３０分間インキュベート後６０℃において
１０分間加熱することにより酵素を不活性化した。この
インキュベーションの目的はＴ４ポリメラーゼのエキソ
ヌクレオチド分解活性を用いてＨｇｉＡＩで消化後残さ
れた突出する４個のヌクレオチドを除去して平滑末端Ｄ
ＮＡ分子を得ることである。
【００９９】ＨｉｎｄIII リンカー（CAAGCTTG）をブラ
ンド（平滑）末端ＤＮＡに連結するために６μｌ（３０
０ng）のキナーゼ化リンカーを４μｌの１０mM ＡＴＰ
及び３μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biol
abs 、４００ｕ／μｌ）と共に上記溶液に添加した後１
６℃で１６時間インキュベートした。混合物を６８℃で
１０分間加熱することにより停止し連結をその後ＤＮＡ
をＨｉｎｄIII 及びＢｇｌIIで消化した。即ち、１５μ
ｌ（１３５Ｕ）ＨｉｎｄIII を１．５μｌ ４Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．２μｌ １Ｍ ＭｇＣｌ2 及び１１μｌ １
mg／mlウシ血清アルブミンと共に添加し、１時間３７℃
でインキュベート後４０Ｕ ＢｇｌIIを添加して更に３
７℃で１時間インキュベートした。得られた１７７塩基
対の断片をＴＢＥ中で６％ポリアクリルアミドゲル上に
おいて精製し、ＴＮＥ（ＴＮＥ：１００mM ＮａＣｌ及
び１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、pH８．８）中で溶出し、ＤＥＡＥセルロース（What
man DE52）に吸着させ、ＴＮＥ中１Ｍ ＮａＣｌで溶出
し、４容の水で稀釈し、２．５容のエタノール添加後−
２０℃で沈澱させ最後に１７μｌ ＴＥ（ＴＥ：１mM
ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．
０）中に溶解した。
【０１００】プラスミドｐＲＳＶｎｅｏは、ＳＶ４０−
由来ＰｖｕII−ＨｉｎｄIII 断片が、ｐＲＳＶｃａｔが
ｐＳＶ２ｃａｔから造成された〔C.M.Gorman et al., P
roc.Natl.Acad.Sci. USA 79, 6777-6781 (1982) 〕と同
様にして、ラウス肉腫ウイルスからのＬＴＲプロモータ
ーを含有するＰｖｕII−ＨｉｎｄIII で置換されたプラ
スミドｐＳＶ２ｎｅｏの誘導体である〔P.J.Southern a
nd P.Berg, J.Mol.Appl.Genet. １, 327-341 (198
2)〕。５μｇのこのプラスミドを製造元の指示事項に従
って２４Ｕ ＢｇｌIIで５０μｌ容量に切断した。３７
℃で１時間インキュベーション後４０Ｕ ＨｉｎｄIII
を添加し、インキュベーションを１．５時間継続し、そ
の後大きい５．４kb断片を上記の如く精製した。
【０１０１】１７μｌの精製１７７bp断片を２μｌ（２
０ng）のｐＲＳＶｎｅｏ断片と、０．２５μｌ（１００
Ｕ）Ｔ４リガーゼを用いて全容量２２μｌリガーゼ緩衝
液中において１６℃で１８時間連結させ、その後プラス
ミドＤＮＡを用いて、D.Hanahan 〔J.Mol.Biol. 166 ,
557-580 (1983)〕に従ってＥ．ｃｏｌｉを形質転換し
た。得られたアンピシリン耐性菌株から、制限分析によ
り証明された１７７kbＨｉｎｄIII −ＢｇｌII断片を有
するｐｔＰＡＬと称するプラスミドを含有するものが選
択された。０．１μｇのプラスミドを製造者により推薦
されるように１６Ｕ ＢｇｌIIで６０μｌ中において３
７℃で１．５時間切断した。
【０１０２】この溶液に次いで２０Ｕの仔ウシ腸アルカ
リホスファターゼ（Boehringer Mannheim ）を添加し、
インキュベーションを３０分間継続し、その後ＤＮＡを
２度フェノール、２度クロロホルムで抽出し、０．１容
の３．０Ｍ酢酸ナトリウム（pH５．２）及び０．６容の
イソプロパノールを添加後沈澱させ、ＴＥに溶解し、更
に上記の如くアガロースゲル電気泳動により精製し、フ
ェノールで２度、クロロホルムで２度抽出し、２．５容
のエタノール及び０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH
５．２）を添加後−２０℃で沈澱させ、最後に３０μｌ
ＴＥに溶解した。
【０１０３】次いで２．１kb ｔＰＡ ＢｇｌII断片
を、２０Ｕ ＢｇｌIIを用いて２５μｌ反応溶液中にお
いて３７℃において２時間５μｇのｐＷ３４９Ｆから切
出し、０．８％アガロースゲル上で精製し、上記の如く
電気泳動的に溶出させ、フェノールで２度、クロロホル
ムで２度抽出し、２．５容のエタノール及び０．１容の
３Ｍ酢酸ナトリウム（pH５．２）を添加後、−２０℃で
沈澱させ、そして８ng／μｌの濃度でＴＥ中に溶解し
た。１μｌのこのｔ−ＰＡ断片を次いで１０μｌの反応
液中において１００Ｕ Ｔ４リガーゼ（Biolabs ）を用
いて１６℃において１７時間７．５ng ＢｇｌII切断ベ
クターＤＮＡに連結させ、引続いてＥ．ｃｏｌｉ中に形
質転換させた。ｐＤ０２と命名された得られたクローン
の一つは、プラスミドがヒトｔ−ＰＡの連続的オープン
リーディングフレームを含有するように挿入されたｔ−
ＰＡ ＢｇｌII断片を含有する。
【０１０４】Ｂ）ｔ−ＰＡ ｃＤＮＡとベータグロビン
断片との結合 プラスミドｐＤ０１０（図１４）を、次の３個のＤＮＡ
断片を共連結することにより造成した：（ｉ）全ｔ−Ｐ
Ａコード配列を含有するＨｉｎｄIII 部位で開始し、Ｂ
ｇｌII部位で終了する２．１kb断片を、ＢｇｌIIで部分
的に及びＨｉｎｄIII で完全に切断した１０μｇのｐＤ
０２ ＤＮＡを負荷したアガロースゲルから単離した。
（ii）ｐＵＢは、プラスミドｐＵＣ９〔J.Vieira and
J.Messing, Gene 19, 259-268 (1982)；同19, 269-276
(1982)〕のＢａｍＨＩ部位中にＢｇｌII部分消化物と
してサブクローン化されたウサギベータグロビン遺伝子
を含有するプラスミドである〔A.Van Ooyen et al., Sc
ience 206 , 337 (1979)〕。
【０１０５】このプラスミドから第２イントロン及びポ
リアデニル化部位を含有する１．２kb ＢａｍＨＩ−Ｈ
ｉｎｄIII 断片を切出し、アガロースゲル電気泳動によ
り精製した。（iii ）ベクターｐＤ０１は、複製の起点
を含むｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII −ＡｃｃＩ断片のＨ
ｉｎｄIII 部位（図１４）から左過りの順序で、合成Ｘ
ｂａＩ部位で終了するヒトサイトメガロウイルス（ＨＣ
ＭＶ）のエンハンサを含有する０．３kb断片合成Ｈｉｎ
ｄIII 部位において終了する相同プロモーターに付着し
たこのエンハンサーの第２番目のコピーから構成されて
いる。このベクターＤＮＡをＨｉｎｄIII で切断し、
６．３kb線状プラスミドをアガロースゲル電気泳動によ
り精製した。
【０１０６】Ｃ）ｔＰＡ／グロビン組合せのｐＳＰ６２
Ｐｓｔ３３中への挿入（図１５参照） ｐＳＰ６２Ｐｓｔ３３（図１５）は、ウイルスの即時初
期（ＩＥ）プロモーターを含むマウスサイトメガロウイ
ルス（ＭＣＭＶ）ＤＮＡの２．１kb ＰｓｔＩ切断を、
図示したプラスミドｐＳＰ６２（Boehringer Mannheim
）のＰｓｔＩ部位に挿入して含有するプラスミドであ
る。ｐＳＰ６２Ｐｓｔ３３のこのＨｉｎｄIII 部位中に
はｐＤ０１０からのＨｉｎｄIII 部位が挿入される。ｔ
−ＰＡコード配列がＭＣＭＶ ＩＥプロモーターからの
「センス」方向に転写されることができるように挿入さ
れているプラスミドｐＣＧＡ２６が選択される。
【０１０７】Ｄ）ＭＣＭＶ／ｔＰＡ／グロビンユニット
のｐＦＡＳＶ２９１１ｎｅｏ中への挿入（図１６参照） プラスミドｐＳＶ２９１１ｎｅｏ〔F.Asselbergs et a
l., J.Mol.Biol. 189, 401-411 (1986)〕はＳＶ４０発
現カセット内にトランスポソンＴＮ５からのネオマイシ
ン（ｎｅｏ）ホスホトランスフェラーゼを含有する（図
１６）。即ち、それは哺乳動物組織培養細胞中に導入さ
れた際にネオマイシン及びカナマイシンに耐性を付与す
る。ｐＳＶ２９１１ｎｅｏ ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断
し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、フェノ
ールで２回、クロロホルムで２回抽出し、アルコールで
沈澱され最後にＴＥ中に溶解してクローン化の準備をす
る。
【０１０８】プラスミドｐＣＧＡ２６は、ＭＣＭＶエン
ハンサー／プロモーター領域中の位置３４５における配
列ＧＴ／ＡＣＡＣ〔K.Doersch-Haessler et al., Proc.
Natl.Acad.Sci. USA 82, 8325-8329 (1985) 〕及びグロ
ビン部分の後の配列ＧＴ／ＣＧＡＣ（又ＳａｌＩで切断
することもできる）を切断する制限酵素ＡｃｃＩで切断
される。切断後に生ずるこの二つの塩基突出部をＥ．ｃ
ｏｌｉ（大断片）ＤＮＡポリメラーゼＩによりフィルイ
ンし、この平滑化された末端をＢａｍＨＩリンカー（CG
GATCCG）に連結し、これらをＢａｍＨＩ酵素で切断す
る。このＢａｍＨＩ末端を有するＭＣＭＶ／ｔＰＡ／グ
ロビンを担持する３．８kb断片をアガロースゲルにより
精製し、次いで上記の如く調製したｐＳＶ２９１１ｎｅ
ｏ ＤＮＡに連結して発現プラスミドｐＣＧＡ２８を得
た。
【０１０９】Ｅ）ｐＣＧＡ２８から得られる発現ベクタ
ー ｐＣＧＡ４８は、ｎｅｏコード配列（ＢｇｌII部位及び
ＳａｍＩ部位間）がハイグロマイシン耐性遺伝子のコー
ド配列により置換されたｐＣＧＡ２８の誘導体である。
これは、プラスミドｐＳＶ２９１１ｎｅｏをその非反復
ＳａｍＩ部位において切断し、ＢｇｌIIリンカー（CAGA
TCTG）をＤＮＡに連結後ＢｇｌIIで切断することにより
達成される（図１７）。得られたベクターマイナスｎｅ
ｏコード化配列よりなる大ＤＮＡ断片をアガロースゲル
上で精製し、同様にアガロースゲルで精製されたプラス
ミドｐＬＧ８９〔L.Gritz et al., Gene 25, 179-188
(1983)〕からの小ＢａｍＨＩ断片に連結し、ハイグロマ
イシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をセンス及びア
ンチセンス方向にそれぞれ含有する。プラスミドｐＣＧ
Ａ２５ｃ及びｐＣＧＡ２５ｄに導いた。
【０１１０】標準条件においてＣＨＯ ＤＵＫＸＢＩ細
胞中にトランスフェクションした際に（実施例１６参
照）、ｐＣＧＡ２５ｃは、ハイグロマイシン耐性をコー
ドしないプラスミド例えばｐＣＧＡ２８を含有するＣＨ
Ｏ細胞を殺す濃度の０．２μｇ／mlハイグロマイシンＢ
に耐性の６０コロニー／μｇ ＤＮＡを与える。ｐＣＧ
Ａ２５ｃ中で、ハイグロマイシン−Ｂ耐性をコードする
配列はＥ．ｃｏｌｉ中においてそれらがＴｎ５プロモー
ター（トランスポソンＴｎ５においてカナマイシン耐性
遺伝子を転写する）から転写されるように配置されてい
る。このように、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＩ細菌の一夜培養
物すなわち飽和培養物（５０mg／ｌアンピシリン選択下
に生育）０．０５mlを接種された４０mg／ｌハイグロマ
イシン−Ｂを含有するＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）の２．
５ml培養液は３７℃における３時間の通気培養後に少な
くとも１０倍高い細菌密度に到達し、次いでＥ．ｃｏｌ
ｉ中で機能するハイグロマイシン遺伝子を含有しないプ
ラスミド例えばｐＣＧＡ２５ｄ，ｐＣＧＡ２８或いはｐ
ＡＴ１５３を有する細菌〔A.J.Twing et al., Nature28
3 , 216-218 (1980)〕を試験した。
【０１１１】動物組織培養細胞及びＥ．ｃｏｌｉの両者
におけるハイグロマイシン−Ｂ耐性の機能性はプラスミ
ドｐＣＧＡ２５ｃ及びその誘導体の使用を極めて容易に
する。次いで、プラスミドｐＣＧＡ４２を、ＭＣＭＶ／
ｔ−ＰＡ／ベーターグロビンカセットを含有するｐＣＧ
Ａ２８からのＢａｍＨＩ断片をｐＣＧＡ２５ｃ中に挿入
することにより造成した。その使用はゲネティシン耐性
に形質転換することのできない或いは既にゲネティシン
耐性である細胞中にｔ−ＰＡ発現遺伝子を転移するため
である。又、ｐＣＧＡ４２は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてこ
のハイグロマイシン遺伝子を発現することができ、ｐＣ
ＧＡ４２を含有するＥ．ｃｏｌｉ ＤＨＩを、上記の如
く試験された際に例えばｐＣＧＡ２８を含有するＥ．ｃ
ｏｌｉよりも少なくとも１０倍より高い密度に成長させ
る。
【０１１２】プラスミドｐＣＧＡ２８は２個のＳａｃＩ
部位を有し、一つは元々ＭＣＭＶプロモーターの直ぐ後
のリンカーの一部であり、他方はｔ−ＰＡ ｃＤＮＡ中
にあるものである。これらのＳａｃＩ部位間の配列は、
先ず制限酵素で切断し、大断片をアガロースゲルにより
精製し、そしてこの線状ＤＮＡをＤＮＡリガーゼを用い
て環化させてプラスミドｐＣＧＡ４４（図１６）を形成
することにより削除される。ｐＣＧＡ４４のこの様に唯
一のものとなったＳａｃＩ部位中へ適当な方向でクロー
ン化された任意のｃＤＮＡは、ｐＣＧＡ２８中のｔ−Ｐ
Ａコード配列を有効に置換し、そして効率的に発現され
る。ｐＣＧＡ４２ｄは、１．４kb ＳａｃＩ断片を削除
することによりｐＣＧＡ４２から得られる（図１７参
照）。この様に唯一のものとなったＳａｃＩ部位にはｔ
−ＰＡ以外のｃＤＮＡを挿入することができ、組織培養
細胞中で高割合で発現することができる。
【０１１３】実施例５：ｕ−ＰＡ，ｔ−ＰＡ及びハイブ
リッドＰＡ ｃＤＮＡの発現ベクターｐＣＧＡ２８中へ
の挿入 Ａ）ｔ−ＰＡ ｃＤＮＡの挿入（図１９参照） この造成において、プラスミドｐｈ・ｔＰＡΔＳｃａＩ
からのｔ−ＰＡ ｃＤＮＡ断片がｐＣＧＡ２８に挿入さ
れた。この造成はＳｃａＩ部位の再構成時に偶然に生じ
るかもしれないなんらかの変化のための対照として働く
ように必要であるものと思われる。この１．４kb Ｓａ
ｃＩ断片はＳｃａＩ消化後にプラスミドｐｈ・ｔＰＡΔ
ＳｃａＩから回収された。この発現ベクターｐＣＧＡ２
８はＳａｃＩで切断され、８．２kbベクター断片が単離
され、そして０．１mM ＴｒｉｓpH８．０、０．１％
ＳＤＳ及び０．０２単位の細菌アルカリ性ホスファター
ゼを含有する１００μｌ反応液中において脱ホスホリル
化される。
【０１１４】６０℃において３０分間のインキュベーシ
ョン後、反応液を２回フェノール及びエーテルで抽出
し、次いでエタノール沈澱させる。ペレットを水に溶解
し、そのアリコートをｐｈ・ｔＰＡ ＳｃａＩからの
１．４kb ＳａｃＩ断片との連結に用いた。この連結ミ
ックスを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換さ
せそしてアンピシリン−耐性コロニーから造成されたミ
ニ細胞溶解物ＤＮＡを適当な制限酵素で消化してＳａｃ
Ｉインサートが所望方向にあるかどうかを検証した。所
望方向を有するプラスミドをｐＢＲ１Ａと称する。反対
方向にあるＳａｃＩ断片を有するプラスミドをｐＢＲ１
Ｂと称する。
【０１１５】Ｂ）ハイブリッドＵＰＡA ＴＰＡB ｃＤＮ
Ａの挿入（図２０参照） この造成においては、プラスミドｐＵＮＣ．ｔｃからの
ハイブリッドＵＰＡAＴＰＡB ｃＤＮＡ断片を発現ベク
ターｐＣＧＡ２８に挿入した。ｐＵＮＣ．ｔｃＤＮＡを
ＳｍａＩ（図１１参照）で消化し、１．２４kb断片を単
離し、そしてＳａｃＩ消化、脱ホスホリル化８．２kb
ｐＣＧＡ２８ベクターＤＮＡに連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１細胞を連結ミックスで形質転換し、Ｓａｃ
Ｉインサートを所望方向に含有するコロニーをミニ細胞
溶解物ＤＮＡ上で制限消化を行うことにより確認した。
所望方向にｐＵＮＣ．ｔｃ ＤＮＡインサートを有する
プラスミドをｐＢＲ２Ａと命名し、そして反対方向のも
のをｐＢＲ２Ｂと命名する。
【０１１６】Ｃ）ｕ−ＰＡ ｃＤＮＡの挿入（図２１参
照） この造成において、ヒトｕ−ＰＡ ＤＮＡを発現ベクタ
ーｐＣＧＡ２８中に挿入した。ｐＢＲ１と共にこのプラ
スミドは親プラスミド対照として働き、ｐＣＧＡ２８−
タイプベクターの有用性が確認される。プラスミドｐｃ
ＵＫ１７６をＳｍａＩ、及びＡｈａIII （図８参照）で
消化し、２．２５kb断片を単離し、上記の如くホスホリ
ル化ＳａｃＩリンカーに連結した。ＳａｃＩ消化後、
２．２５kb断片を回収し、ＳａｃＩ消化、脱ホスホリル
化８．２kb ｐＣＧＡ２８ ＤＮＡ断片に連結した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、制限酵素でミ
ニ細胞溶解物ＤＮＡを消化することにより所望プラスミ
ドを有するコロニーを確認した。正しい方向にヒトｕ−
ＰＡ ＤＮＡを有するプラスミドをｐＢＲ２３Ａと命名
し、そして反対方向のものをｐＢＲ３Ｂと命名する。
【０１１７】Ｄ）ハイブリッドＴＰＡA ＵＰＡB ｃＤＮ
Ａ（図２２）の挿入 茲で、プラスミドｐｔＮＣ．ＵＣからのハイブリッドＴ
ＰＡA ＵＰＡB ｃＤＮＡを発現ベクターｐＣＧＡ２８中
に挿入した。２．７５kb ＳｍａＩ（ベクター中に存
在）−ＡｈａIII 断片をｐｔＮＣ．ＵＣ ＤＮＡから単
離し、ホスホリル化ＳａｃＩリンカーに連結し、リンカ
ー連結２．７５kb断片を回収し、ＳａｃＩ消化、脱ホス
ホリル化ベクターＤＮＡに連結し、そして所望コロニー
を上記の如く確認した。正しい方向にｐｔＮＣ．ＵＣ
ＤＮＡインサートを有するプラスミドをｐＢＲ４Ａと称
する。
【０１１８】実施例６：ＰＨ０５プロモーター、インベ
ルターゼシグナル配列及びｔ−ＰＡコード領域を含有す
る酵母発現ベクターの造成 Ａ）インベルターゼシグナル配列のためのオリゴデオキ
シヌクレオチドの合成 四つのオリゴデオキシリボヌクレオチド：Ｉ−１，Ｉ−
２，Ｉ−３，Ｉ−４をＤＮＡシンセサイザー（モデル３
８０Ｂ Applied Biosystems）により合成した。脱保護
後、合成断片を８Ｍ尿素を含有する１２％ポリアクリル
アミドゲル上で精製した。塩のない純粋オリゴデオキシ
リボヌクレオチドをSep.Pak （Waters Associates ）を
用いて得た。これらの断片は、しばしば用いられる酵母
コドンを有するインベルターゼシグナル配列をコードす
る二本鎖を構成する。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】Ｂ）インベルターゼシグナル配列のプラス
ミドｐ３１におけるサブクローン化 ａ）ベクターの調製 １．５μｇのｐ３１Ｒ／ＳＳ−ＴＰＡ ２（ヨーロッパ
特許出願１４３，０８１号明細書）を５０μｌの１０mM
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、６mM ＭｇＣｌ2 、１
００mM ＮａＣｌ、６mMメルカプトエタノール中におい
て１０ＵのＥｃｏＲＩ（Boehringer）で３７℃において
１時間消化した。１μｌの２．５Ｍ ＮａＣｌの添加
後、１０ＵのＸｈｏＩ（Boehringer）を添加し、３７℃
で１時間インキュベートした。４．２kbベクターを０．
８％調製アガロースゲル上で単離した。このゲルスライ
スをMicro Colloidor チューブ（Sartorius GmbH）に移
し、２００μｌのＴＥで被覆し、及び電気溶出させた
（９０mAで５０分間電気泳動）。このＴＥ溶液を集め、
０．１容の１０×ＴＮＥの添加後２．５容の無水エタノ
ール中で沈澱させた。ＤＮＡペレットを冷８０％エタノ
ールで洗浄し、真空乾燥させた。このＤＮＡを６μｌ
ＴＥ（４０ｐモル／μｌ）中に再懸濁させた。
【０１２１】ｂ）オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｉ
−１，Ｉ−２，Ｉ−３，Ｉ−４）のアニーリング、リン
酸化及びベクターとの連結 これらの四つのデオキシリボヌクレオチドの各１０ｐモ
ルを１０μｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH８中に
含有する溶液を水浴上で５分間９５℃でインキュベート
した。この水浴を３０℃でゆっくり５時間に亘って冷却
した。このアニーリングされた混合物に各２μｌの０．
１Ｍ ＭｇＣｌ2 、０．１Ｍ ＮａＣｌ、３０mM ＤＴ
Ｔ、４mM ＡＴＰ及び８Ｕ（１μｌ）のポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Boehringer）を添加した。リン酸化は３７
℃で１時間行った。このアニーリングされた、リン酸化
オリゴデオキシリボヌクレオチド及び６０ｐモルのｐ３
１Ｒ／ＳＳ−ＴＰＡ ２切断ベクター（１．５μｌ）を
４００Ｕ（１μｌ）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Biolabs ）
で１４℃において１７時間連結させた。
【０１２２】６５℃で１０分間インキュベートして反応
を停止させた。１０μｌのこの連結混合物を用いてＥ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ Ｃａ++細胞〔M.Dagert and S.
D.Ehrlich, Gene 56, 23-28 (1979)〕を形質転換させ
た。２０ａｍｐR コロニーを拾い上げた。ＤＮＡを迅速
単離法により調製した（D.S.Holmes and M.Quigley.Ana
l.Biochem. 114, 193-197 (1981)〕。ＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉ及びＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＩ末端において放射
線標識し、放射線標識ｐＢＲ３２２ＨａｅIII 切断ＤＮ
Ａをマーカーとして用いて８Ｍ尿素を含有する６％ポリ
アクリルアミドゲル上で分析した。正しい大きさのバン
ドが２０クローン全てから得られたＤＮＡについて観察
された。一つのクローンを１００μｇ／mlのアンピシリ
ンを含有する１００ml ＬＢ培地中において生育させ
た。プラスミドＤＮＡを単離し、ｐ３１ＲＩＴ−１２と
称する。
【０１２３】Ｃ）ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＴＰ
Ａの造成（図２３参照） ａ）ベクターの調製 ３μｇのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ １８（ヨ
ーロッパ特許出願１４３，０８１号明細書）を１０Ｕの
ＢａｍＨＩと共に５０μｌの１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
pH７．５、６mM ＭｇＣｌ2 、１００mM ＮａＣｌ、
６mMメルカプトエタノール中において３７℃で１時間イ
ンキュベートした。ＴＢＥ緩衝液中において１％アガロ
ースゲル上でアリコートをチェックして完全な消化を確
認した。この消化物を６５℃で１０分間インキュベート
した。次いで０．５μｌの５ＭＮａＣｌを添加した後１
５ＵのＸｈｏＩ（Boehringer）を添加した。これを３７
℃で１時間インキュベートした。６．８kbベクターを
０．８％調製用アガロースゲル上で単離した。ＤＮＡを
電気溶出により抽出し、沈澱後ＴＥ中に溶解した。
【０１２４】ｂ）ｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ １８のＸ
ｈｏＩ消化 ３０μｇのｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ １８（ヨーロッ
パ特許出願１４３，０８１号明細書）を６０ＵのＸｈｏ
Ｉ（１５Ｕ／μｌ）と共に２００μｌの１０mMＴｒｉｓ
・ＨＣｌ pH８、６mM ＭｇＣｌ2 、１５０mM ＮａＣ
ｌ、６mMメルカプトエタノール中で３７℃において１時
間インキュベートし、等容量のフェノール−クロロホル
ムで抽出し、そしてエタノール中で沈澱させた。 ｃ）ＸｈｏＩ切断ｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ １８の部
分的ＰｓｔＩ消化 沈澱したＸｈｏＩ切断ｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ １８
ＤＮＡを２５０μｌの１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH
７．５、６mM ＭｇＣｌ2 、５０mM ＮａＣｌ、６mMメ
ルカプトエタノール、２．５mgエチジウムブロマイド中
に再懸濁させ、２２．５ＵのＰｓｔＩと共に３７℃で３
５分間インキュベートし、等モル容量のフェノールで抽
出した後、等容量のクロロホルム−イソアミルアルコー
ル（５０：１）で抽出した。１．６kb断片を１％調製用
アガロースゲル上で単離した。ＤＮＡを電気溶出により
抽出し、沈澱させた〔インサート１〕。
【０１２５】ｄ）ｐ３１ＲＩＴ−１２のＳａｌＩ−Ｘｈ
ｏＩ消化 ３０μｇのｐ３１ＲＩＴ−１２を６０ＵのＳａｌＩ（Bo
ehringer １２Ｕ／μｌ）及び６０ＵのＸｈｏＩ（１５
Ｕ／μｌ）と共に２００μｌの１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ pH８、６mM ＭｇＣｌ2 、１５０mM ＮａＣｌ、６
mMメルカプトエタノール中で３７℃で１時間インキュベ
ートし、等容量のフェノール−クロロホルムで抽出し、
エタノール中で沈澱させた。８６９bp断片を１．２％調
製アガロースゲル上で単離した。ＤＮＡを電気溶出によ
り抽出し、ＤＥ−５２上で脱塩し、エタノール中で沈澱
させた。
【０１２６】ｅ）ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ切断ｐ３１ＲＩＴ
−１２のＨｇａＩ消化 ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ切断ｐ３１ＲＩＴ−１２を１００μ
ｌの６mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１０mM Ｍｇ
Ｃｌ2 、５０mM ＮａＣｌ、１mMジチオスレイトール、
１０mgウシ血清アルブミン中に再懸濁させ、６ＵのＨｇ
ａＩ（Biolabs、０．５Ｕ／μｌ）と共に３７℃で１時
間インキュベートした。６００bp断片を１．２％アガロ
ースゲル上で単離した。このＤＮＡを電気溶出により抽
出し、エタノール中で沈澱させた。 ｆ）リンカーオリゴヌクレオチドのアニーリング ９０ｐモルの下記配列を有する二つのオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドをシリコーン処理をしたＥｐｐｅｎｄｏ
ｌｆ管中において１０μｌの０．５mM Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ pH８内に懸濁させた：
【０１２７】
【表２】 この溶液を９５℃で５分間インキュベートし、次いで一
昼夜ゆっくり室温まで冷却した。
【０１２８】ｇ）リンカーのリン酸化 上記溶液に２μｌの０．１Ｍ ＫＣｌ、２μｌの０．１
Ｍ ＭｇＣｌ2 、３μｌの３０mM ＤＴＴ、１μｌの２
００mM ＡＴＰ、８Ｕのポリヌクレオチド（８Ｕ／μ
ｌ）を添加した。これを３７℃で１時間インキュベート
した。 ｈ）ｐ３１ＲＩＴ−１２からのＨｇａＩ断片のキナーゼ
処理されたリンカーとの連結 キナーゼ処理されたリンカー溶液を乾燥ＨｇａＩ断片を
含有する管に移し、次いで４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼを添加した。この溶液を室温（２１〜２２℃）で９
０分間インキュベートし、ＴＥで１００μｌに稀釈し、
等容量のフェノール−クロロホルムで抽出した。０．６
容のイソプロパノール及び０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムを室温においてこの水溶液に添加することにより断片
を沈澱させた。
【０１２９】ｉ）上記断片のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ消化 上記乾燥ＤＮＡを１０ＵのＢａｍＨＩ及び１０ＵのＰｓ
ｔＩにより２０μｌの１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH
７．５、１００mM ＭｇＣｌ2 、６mMメルカプトエタノ
ール中で３７℃で１時間消化した。１００μｌに稀釈
後、溶液を等容量のフェノール−クロロホルムで抽出
し、水層をイソプロパノール中で沈澱させた〔インサー
ト２〕。
【０１３０】ｊ）三つの断片の連結 １００ｆモルのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ １
８ ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ切断ベクター断片、２００ｆ
モルのその他の二つのインサート断片〔１及び２〕の各
々を１０μｌの５０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、
１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ＤＴＴ、２mM ＡＴＰ、
０．５μｇゼラチン中において４００ＵのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼで１５℃で１６時間連結した。６５℃で１０分
間インキュベーションすることにより反応を停止した。
５μｌのこの連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１ Ｃａ++細胞を形質転換した。１０ａｍｐR コロニ
ーを拾い上げ、ＤＮＡを迅速単離法により調製した。Ｅ
ｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII で分
析して正しい大きさの断片を観察した。一つのクローン
を１００mlの１００μｇ／mlのアンピシリンを含有する
ＬＢ培地中で生育させた。プラスミドＤＮＡを単離し、
ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＴＰＡと称する。
【０１３１】実施例７：ｕ−ＰＡコード化領域を含んで
なるプラスミドｐＣＳ１６／ＵＰＡの造成 Ａ）プラスミドｐＣＳ１６の造成（図２４参照） ファージラムダのｃＩ遺伝子及びテトラサイクリン耐性
遺伝子の部分を含んでなるプラスミドｐＵＮ１２１の
１．５kb ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片〔B.Nilsson et a
l., Nucl.Acids Res. 11, 8019-8030 (1983)〕をｐＵＣ
１８〔J.Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983)
〕中にクローン化し、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで切断
した。得られたクローンをＰｓｔＩで消化した。３′突
出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いる反応で除去
し、そしてＸｈｏＩリンカーを平滑末端に連結した。Ｘ
ｈｏＩで消化後、分子を連結により再環化した。連結混
合物のアリコートを用いてＣａ++処理Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂ１０１細胞を形質転換した。個々のアンピシリン耐
性、形質転換コロニーのＤＮＡを分析した。幾つかの正
しいコロニーの一つを選びｐＣＳ１６と称する。
【０１３２】Ｂ）プラスミドｐＣＳ１６／ＵＰＡの造成
（図２５参照） プラスミドｐｃＵＫ１７６（実施例２参照）内に含まれ
るウロキナーゼｃＤＮＡをプラスミドｐＣＳ１６中にお
いてサブクローン化した。このサブクローン化ｃＤＮＡ
は５′非翻訳領域（図８）中のＳｍａＩ部位から３′非
翻訳領域中のヌクレオチド位置１４３９−１４４４（図
６による付番）におけるＰｖｕII部位に延びる。
【０１３３】１５μｇのプラスミドｐｃＵＫ１７６をＰ
ｖｕIIで消化した。３７９bp ＰｖｕII断片をＴｒｉｓ
−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中において
１．５％アガロースゲル上で他の断片から単離した。こ
のＤＮＡを電気溶出し、ＤＥ５２（Whatman ）イオン交
換クロマトグラフィにより精製し、そしてエタノールで
沈澱させた。１．２μｇの一本鎖ＸｈｏＩリンカー
（５′−CCTCGAGG−３′）をそれらの５′末端でホスホ
リル化し、７５℃で１０分間加熱し、室温までの冷却時
に自己アニーリングし、−２０℃で貯蔵した。０．９μ
ｇのキナーゼ処理された、二本鎖ＸｈｏＩリンカーを８
０−倍モル過剰でｐｃＵＫ１７６（上記参照）の３７９
bp ＰｖｕII断片の平滑末端に、２０μｌの６０mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌpH７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、５mM
ＤＴＴ、３．５mM ＡＴＰ及び４００単位のＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ（Biolabs ）中で１５℃で１６時間連結し
た。この混合物を８５℃で１０分間加熱した。
【０１３４】過剰リンカー分子を０．５４容のイソプロ
パノールで１０mM ＥＤＴＡ及び３００mMの酢酸ナトリ
ウムpH６．０の存在下において室温で３０分間沈澱させ
て、除去した。ＤＮＡをＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化
した。１２１bp ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片をＴｒｉｓ
−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中１．５％ア
ガロースゲル上で単離した。６μｇのプラスミドｐｃＵ
Ｋ１７６をＳｍａＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ｕ−Ｐ
Ａコード配列の殆んどを含んでなる１．３kbＳｍａＩ−
ＢａｍＨＩ断片を単離した。６μｇのプラスミドｐＣＳ
１６をＳｍａＩ及びＸｈｏＩで消化した。２．７kbベク
ター断片を単離した。ＤＮＡ断片をゲルから電気溶出
し、エタノール沈澱させた。
【０１３５】０．２ｐモルの１．３kb ＳｍａＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片、０．２ｐモルの１２１bp ＢａｍＨＩ−Ｘ
ｈｏＩ断片（両者の断片は一緒になって全ｕ−ＰＡコー
ド化配列を含む）及び０．１ｐモルの２．７kbベクター
断片を１０μｌの６０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．
５、１０mM ＭｇＣｌ2 、５mM ＤＴＴ、３．５mM Ａ
ＴＰ及び４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ中で１５℃
において連結した。連結混合物の１μｌ及び３μｌのア
リコートを１００μｌのＣａ++処理Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１
０１細胞に添加した。形質転換は記載されているように
行われた〔A.Hinnen et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA
75, 1929 (1978) 〕。１２個のアンピシリン耐性コロ
ニーを１００mg／ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地中
で生育させた。ＤＮＡをHolmes等〔Anal.Biochem. 114
, 193 (1981)〕に従って単離し、ＥｃｏＲＩ，ＰｖｕI
I及びＸｈｏＩ制限消化により分析した。期待された制
限断片を有する一つのクローンをｐＣＳ１６／ＵＰＡと
称する。
【０１３６】実施例８：プラスミドｐＪＤＢ２０７／Ｐ
Ｈ０５−Ｉ−ＵＰＡの造成（図２６） ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡは、ＰＨ０５プ
ロモーター、インベルターゼシグナル配列、成熟ウロキ
ナーゼのコード配列及びＰＨ０５転写ターミネーターを
タンデム列でｐＪＤＢ２０７酵母発現ベクターにクロー
ン化して含有する。２０μｇのプラスミドｐＣＳ１６／
ＵＰＡを４０単位のＥｃｏＲＩで完全に消化した。フェ
ノール抽出及びエタノール沈澱後、ＥｃｏＲＩ消化ＤＮ
Ａを更にＴａｑＩにより６５℃で切断した。得られた断
片を調製用１．２％アガロースゲル上で分離した。４６
２bp ＴａｑＩ−ＥｃｏＲＩ断片をゲルからの電気溶出
及びエタノール沈澱により単離した。
【０１３７】次式 （Ｉ）５′−CTGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT−３′ （II）３′ TCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC−５′ を有するオリゴデスオキシリボヌクレオチドリンカーを
ＤＮＡ断片のＴａｑＩ部位に連結した。このリンカーは
成熟ｕ−ＰＡのコード配列（ヌクレオチド１３０−１５
４、図５）の５′末端を回復し、インベルターゼシグナ
ル配列とのインフレーム融合を確立する。このリンカー
の５′−CTGCA 配列はＨｇａＩ切断により創出されるイ
ンベルターゼシグナル配列の対応する３′陥凹末端を充
たす。
【０１３８】各々３００ｐモルのオリゴデスオキシヌク
レオチドＩ及びIIをホスホリル化し、アニーリングし
た。５．２５μｇ（６００ｐモル）のホスホリル化、二
本鎖リンカーＤＮＡを１．７μｇ（５．６ｐモル）の４
６２bp ＴａｑＩ−ＥｃｏＲＩ断片（上記参照）と１７
５μｌの６０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．５、１０mM
ＭｇＣｌ2 、１mM ＡＴＰ、５mM ＤＴＴ及び８００単
位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ中において１５℃で１６時間
連結した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを８５℃で１０分間不
活性化させた。過剰のリンカーを１０mM ＥＤＴＡ、３
００mM酢酸ナトリウムpH６．０及び０．５４容のイソプ
ロパノール中において沈澱させて除去した。このＤＮＡ
をＰｓｔＩで消化した。ｕ−ＰＡをヌクレオチド４３６
までコードするＤＮＡ配列（ＰｓｔＩ部位、図５参照）
に結合したリンカーを含有するユニーリ３１２bp断片を
単離した。このＤＮＡ断片を電気溶出及びエタノールに
よる沈澱で精製した。
【０１３９】プラスミドｐＣＳ１６／ＵＰＡをＸｈｏＩ
及びＰｓｔＩで消化した。１００７bp ＰｓｔＩ−Ｘｈ
ｏＩ断片を単離し、精製した。この断片はウロキナーゼ
のコード配列の殆んどを含有する。プラスミドｐ３１Ｒ
ＩＴ−１２（実施例６Ｂ参照）をＳａｌＩ及びＸｈｏＩ
で消化した。８８２bp ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を電気
溶出及びエタノール沈澱によりゲルから単離した。この
断片を更にＢａｍＨＩ及びＨｇａＩで消化した。ＰＨ０
５プロモーター領域及びインベルターゼシグナル配列を
含有する５９１bpＢａｍＨＩ−ＨｇａＩ断片を単離し
た。プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ １
８（ヨーロッパ特許出願１４３，０８１号明細書参照）
をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化した。６．８kbベクタ
ー断片をＴｒｉｓ−酢酸緩衝液pH８．２中調製０．６％
アガロースゲル上で単離した。このＤＮＡを電気溶出
し、エタノールで沈澱させた。
【０１４０】全てのＤＮＡ断片を０．１ｐモル／μｌの
濃度で水中に再懸濁した。０．２ｐモルの５９１bp Ｂ
ａｍＨＩ−ＨｇａＩ断片、０．２ｐモルの３１２bp Ｈ
ｇａＩ−ＰｓｔＩ断片、０．２ｐモルの１００７bp Ｐ
ｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片及び０．１ｐモルの６．８kb Ｂ
ａｍＨＩ−ＸｈｏＩベクター断片を１０μｌの５０mMＴ
ｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、５mM
ＤＴＴ、１mM ＡＴＰ及び４００単位のＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ中で１５℃で１５時間連結した。１μｌの連結
混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ Ｃａ++細胞
を形質転換した。１２ａｍｐR コロニーを拾い上げ、１
００mg／ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地中におい
て生育させた。ＤＮＡは迅速単離法〔D.S.Holmes et a
l., Anal Biochem. 114 , 193 (1981)〕により調製し
た。このプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲ
Ｉの制限消化した時に期待された制限断片が観察され
た。単一クローンのプラスミドＤＮＡを選択し、ｐＪＤ
Ｂ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡと称する。
【０１４１】実施例９：ｔ−ＰＡ Ａ−鎖領域及びｕ−
ＰＡ Ｂ−鎖を有するｔ−ＰＡ／ｕ−ＰＡハイブリッド
プラスミノーゲンアクチベータ（一次ＤＮＡ造成物） ｔ−ＰＡのＡ−鎖及び所定位置のｕ−ＰＡのＢ−鎖をコ
ードする。ＤＮＡ配列のインフレーム融合の造成のため
のもう一つの手法は次の二段階よりなる。先ず、便利な
コード配列を有する制限断片を連結する。ＤＮＡをＥ．
ｃｏｌｉ中において調製し、Ｍ１３中にサブクローン化
して一本鎖鋳型を得る。第二段階において、過剰ヌクレ
オチド配列をｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により除去
する。ｔ−ＰＡ Ａ−鎖及びｕ−ＰＡ Ｂ−鎖間の正確
なインフレーム結合は活性化部位にある。変異体ＤＮＡ
を酵母及び哺乳動物細胞系のための適当な発現ベクター
内でサブクローン化する。
【０１４２】ａ）ｔ−ＰＡ Ａ−鎖をコードするＤＮＡ
断片の単離 １０μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−
ＴＰＡ（実施例６参照）をＢａｍＨＩ及びＰｖｕIIで消
化した。１．７kb ＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片をＴｒｉ
ｓ−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液（pH８．３）中で０．８
％アガロースゲル上で分離した。このＤＮＡ断片はＰＨ
０５プロモーター、インベルターゼシグナル配列及びＰ
ｖｕII制限部位までの成熟ｔ−ＰＡのコード配列〔図２
参照、ヌクレオチド位置１３０５−１３１０〕を含有す
る。このＤＮＡを電気溶出し、エタノール沈澱させ、
０．１ｐモル／μｌの濃度でＨ2 Ｏ中に再懸濁させた。
【０１４３】ｂ）ｕ−ＰＡ Ｂ−鎖をコードするＤＮＡ
断片の単離 プラスミドｐＣＳ１６／ＵＰＡ（実施例７Ｂ参照）をＢ
ａｌＩ（図５及び図８参照、ヌクレオチド位置５７３−
５７８）及びＸｈｏＩで消化した。この８６８bp Ｂａ
ｌＩ−ＸｈｏＩ断片を上記の如く単離し、０．１ｐモル
／μｌの濃度でＨ2 Ｏ中に再懸濁した。 ｃ）断片のベクター断片への連結 プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ １８
（ヨーロッパ特許出願１４３，０８１号明細書）をＢａ
ｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化した。６．７kbベクター断片
をＴｒｉｓ−酢酸緩衝液pH８．２中で０．８％アガロー
スゲル上で単離した。このＤＮＡを電気溶出し、エタノ
ール沈澱させ、０．１ｐモル／μｌの濃度でＨ2 Ｏ中に
再懸濁した。
【０１４４】０．２ｐモルの１．７kb ＢａｍＨＩ−Ｐ
ｖｕII断片、０．２ｐモルの８６８bp ＢａｌＩ−Ｘｈ
ｏＩ断片及び０．１ｐモルの６．７kb ＢａｍＨＩ−Ｘ
ｈｏＩベクター断片を１０μｌの６０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、５mM ＤＴＴ、
３．５mM ＡＴＰ及び４００単位のＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（Biolabs ）中で１５℃で１６時間連結した。この連
結混合物の１μｌ及び３μｌのアリコートを１００μｌ
のＣａ++処理Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞に添加し
た。形質転換は常法により行った。六つの形質転換され
た、アンピシリン耐性コロニーを１００mg／ｌアンピシ
リンを含有するＬＢ培地内で生育させた。プラスミドＤ
ＮＡをHolmes et al. 〔Analyt.Biochem. 114 , 193 (1
981)〕の方法に従って調製し、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩ
を用いる制限消化により分析した。期待された制限断片
を有する一つのクローンをｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−
Ｉ−ＴＰＡA ＵＰＡB と称する。
【０１４５】実施例１０：ｕ−ＰＡ Ａ−鎖領域及びｔ
−ＰＡ Ｂ−鎖を有するｕ−ＰＡ／ｔ−ＰＡハイブリッ
ドプラスミノーゲンアクチベータ（一次ＤＮＡ造成物） 主たるハイブリッドＤＮＡ造成物は、ＳｃａＩ部位（位
置９４０−９４５）からＫｈｏＩリンカーを介して１８
００位に導入されたＸｈｏＩ部位までのｔ−ＰＡヌクレ
オチド配列に連結された、ＳｍａＩからＥｃｏＲＩ部位
までのｕ−ＰＡヌクレオチド配列（図８参照）を含んで
なる。得られたハイブリッドＤＮＡ配列は過剰のヌクレ
オチドを含有し、これはｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発
により除去される。正確なｕ−ＰＡ Ａ−鎖及びｔ−Ｐ
Ａ Ｂ−鎖間のインフレーム結合部は活性化部位にあ
る。
【０１４６】ａ）ｕ−ＰＡ Ａ−鎖をコード化するＤＮ
Ａ断片の単離 ７μｇのプラスミドｐＣＳ１６／ＵＰＡをＥｃｏＲＩで
消化した。得られた三つの断片の粘着末端を７．５単位
のクレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を用いる６０
mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１０mM ＭｇＣ
ｌ2 、０．１mM ｄＡＴＰ及び０．１mM ｄＴＴＰの存
在下における２５℃での３０分間のフィルイン反応によ
り平滑末端に転換した。反応はＥＤＴＡを１２．５mMの
最終濃度まで添加することにより停止した。このＤＮＡ
を更にＫｐｎＩで消化した。６１９bpＫｐｎＩ−平滑
〔ＥｃｏＲＩ〕末端断片をＴｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ
緩衝液（pH８．３）中１．５％アガロースゲル上で単離
し、電気溶出し及びエタノール沈澱させた。
【０１４７】ｂ）ｔ−ＰＡ Ｂ−鎖をコード化するＤＮ
Ａ断片の単離 ６μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ
１８をＳｃａＩ及びＸｈｏＩで消化した。８６０bp断
片をＴｒｉｓ−ホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液pH８．３中１．２
％アガロースゲル上で単離し、電気溶出し、エタノール
沈澱させた。 ｃ）ＤＮＡ断片のｐＵＣ１８誘導ベクターへの連結 ５μｇのプラスミドｐＣＳ１６／ＵＰＡ（実施例７参
照）をＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで消化した。得られた２．
７kb断片をＴｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液pH８．３
中０．８％アガロースゲル上で単離した。ＤＮＡを電気
溶出し、エタノール沈澱させた。全てのＤＮＡ断片を
０．１ｐモル／μｌの濃度でＨ2 Ｏ中に再懸濁させた。
【０１４８】０．２ｐモルの６１９bp Ｋｐｎ−平滑末
端ｕ−ＰＡ断片、０．２ｐモルの８６０bp ＳｃａＩ−
ＸｈｏＩ ｔ−ＰＡ断片及び０．１ｐモルの２．７kb
ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩベクター断片を上記の如く連結した
（実施例９）。Ｃａ++処理Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細
胞を形質転換した。１２個の形質転換されたアンピシリ
ン耐性コロニーをアンピシリン（１００mg／ｌ）を補給
した培養培地内で生育させた。ＤＮＡはHolmes et al.
（上記）に従って調製し、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを用
いる制限消化により分析した。期待された制限断片を有
する単一クローンをｐＣＳ１６／ＵＰＡA ＴＰＡB と称
する。
【０１４９】実施例１１：ｔ−ＰＡの第２クリングル及
び触媒作用Ｂ−鎖を有するｕ−ＰＡ／ｔ−ＰＡハイブリ
ッドプラスミノーゲンアクチベータ（一次造成物） ウロキナーゼ「成長因子様」（Ｕ）−ドメイン、ｔ−Ｐ
Ａの第２クリングルドメイン（Ｋ2 ）及びｔ−ＰＡの触
媒作用Ｂ−鎖のＤＮＡ配列を含んでなるハイブリッドプ
ラスミノーゲンアクチベータ遺伝子を次の様にして造成
した。ｕ−ＰＡ成長因子ドメイン及びｔ−ＰＡ Ｋ2 ク
リングル及びＢ−鎖をそれぞれコード化する二つのＤＮ
Ａ制限断片を連結し、プラスミドｐＣＳ１６中に挿入し
た。得られたクローンをｐＣＳ１６／ＵＫ2 ＴＰＡB と
称する。ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡコード化配列を含有する
断片をＭ１３中にサブクローン化した。ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ突然変異誘発を一本鎖ＤＮＡ上に行いｕ−ＰＡ及びｔ
−ＰＡ配列間の結合において過剰のＤＮＡ配列を除去し
た。
【０１５０】５μｇのプラスミドｐＣＳ１６／ＵＰＡを
ＮｃｏＩ（ヌクレオチド位置３２６−３３１、図８参
照）で消化した。この制限断片の粘着末端を反応におい
て５単位のクレノウＤＮＡポリメラーゼＩ（ＢＲＬ）を
用いて５０μｌ中各々０．１mMｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄ
ＣＴＰ，ｄＧＴＰ、６０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．
５、１０mM ＭｇＣｌ2 の存在下において室温で３０分
間フィルインした。反応はＥＤＴＡを１２．５mMの最終
濃度まで添加することにより停止した。このＤＮＡをエ
タノール沈澱させ更にＸｈｏＩで消化した。３kb Ｘｈ
ｏＩ−平滑末端〔ＮｃｏＩ〕断片をＴｒｉｓ−ホウ酸−
ＥＤＴＡ pH８．３中０．８％アガロースゲル上で単離
し、電気溶出しそしてエタノール沈澱させた。この断片
はｐＣＳ１６ベクター及びｕ−ＰＡ成長因子ドメインの
コード領域を含有する。１０μｇのプラスミドｐＪＤＢ
２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ １８（ヨーロッパ特許出願
１４３，０８１号明細書）をＢｓｔXI〔ヌクレオチド位
置５７７−５８８〕で消化した。
【０１５１】３′突出末端を有するこの線状ＤＮＡ断片
を１００μｌの３３mM Ｔｒｉｓ−酢酸pH７．９、６６
mM酢酸カリウム、１０mM酢酸マグネシウム、０．５mM
ＤＴＴ及び０．１mg／mlのウシ血清アルブミン中の１０
単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）で３７℃に
おいて２．５分間インキュベートした。次いでインキュ
ベーションを全容量２００μｌ中の各々０．１mMのｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰの存在下において
３７℃で３５分間継続した。ＤＮＡをエタノール沈澱さ
せ、更にＸｈｏＩで消化した。１．２kb平滑末端〔Ｂｓ
ｔXI〕−ＸｈｏＩ断片を０．８％アガロースゲル上で分
離し、電気溶出し、エタノール沈澱させた。この断片は
Ｋ２のコード化領域及びｔ−ＰＡのＢ−鎖を含有する。
【０１５２】０．２ｐモルの１．２kb ｔ−ＰＡ断片及
び０．１ｐモルの３kb ｕ−ＰＡ／ベクター断片（上記
参照）を上記の如く連結した。この連結混合物のアリコ
ートを用いてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細
胞を形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを１００
mg／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で選
択した。ＤＮＡは個々の形質転換体から調製し、Ｓｃａ
Ｉ及びＳｍａＩ制限消化により分析した。０．５kb Ｓ
ｃａＩ及び１．５５kb ＳｍａＩ結合断片を含有するク
ローンを選択し、ｐＣＳ１６／ＵＫ2 ＴＰＡB と称す
る。
【０１５３】実施例１２：ｔ−ＰＡの第２クリングル及
びｕ−ＰＡの触媒作用Ｂ−鎖を有するｔ−ＰＡ／ｕ−Ｐ
Ａハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ（二次造
成） ウロキナーゼ「成長因子様」（Ｕ）ドメイン、ｔ−ＰＡ
の第２クリングル（Ｋ２）及びｕ−ＰＡの触媒作用Ｂ−
鎖のＤＮＡ配列を含んでなるハイブリッドプラスミノー
ゲンアクチベータ遺伝子を実施例１１で説明した方法と
同様の方法により造成した。
【０１５４】プラスミドｐＣＳ１６／ＵＫ2 ＵＰＡB の
造成 ５μｇのプラスミドｐＣＳ１６／ＵＰＡをＢｇｌII及び
ＮｃｏＩ（それぞれヌクレオチド位置３９１−３９６及
び３２６−３３１、図８参照）で消化した。これらの制
限断片の粘着末端を上記の如く反応においてクレノウＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（ＢＲＬ）を用いてフィルインし
た。平滑末端を有する４．２kb ＤＮＡ断片をＴｒｉｓ
−酢酸緩衝液pH８．２中０．８％アガロースゲル上で単
離した。ＤＮＡを電気溶出し、エタノール沈澱させた。
この断片はベクター分子に連結したｕ−ＰＡ Ｇ−領域
及びｕ−ＰＡ Ｂ−鎖を含有する。１０μｇのプラスミ
ドｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ １８（ヨーロッパ特許出
願１４３，０８１号明細書）をＡｌｕＩで消化した。ｔ
−ＰＡの全Ｋ２ドメインを含有する４４７bp ＡｌｕＩ
断片をＴｒｉｓ−ホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液pH８．３中１．
５％アガロースゲル上で単離した。このＤＮＡ断片を電
気溶出し、エタノール沈澱させた。
【０１５５】０．２ｐモルの４４７bp断片及び０．１ｐ
モルの４．２kb断片を連結した。この連結混合物のアリ
コートを用いてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
細胞を形質転換した。形質転換された細胞を１００mg／
ｌアンピシリンを有するＬＢ寒天プレート上で選択し
た。ＤＮＡをアンピシリン耐性細胞から調製し、Ｅｃｏ
ＲＩ及びＳｃａＩ消化により分析した。５５１bp Ｅｃ
ｏＲＩ断片及び４０３bpＳｃａＩ断片を示す単一クロー
ンは正しい方向に挿入されたＡｌｕＩ断片を有する。こ
のクローンをｐＣＳ１６／ＵＫ2 ＵＰＡB と称する。
【０１５６】実施例１３：主たるハイブリッドＤＮＡ造
成物のＭ１３ｍｐ１８中におけるクローニング Ａ．ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＴＰＡA ＵＰＡB
ＢａｍＨＩ断片のＭ１３ｍｐ１８中におけるクローニン
グ 迅速ＤＮＡ調製から得られた１．５μｇのｐＪＤＢ２０
７／ＰＨ０５−Ｉ−ＴＰＡA ＵＰＡB （実施例９参照）
を２０μｌの１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、６
mM ＭｇＣｌ2 、１００mM ＮａＣｌ、６mMメルカプト
エタノール中において３７℃で１時間９ＵのＢａｍＨＩ
（Boehringer）で消化した。１μｌのＲＮａｓｅ（Ｓｅ
ｒｖａ、１mg／ml）を添加し、３７℃で１５分間インキ
ュベートし、そしてフェノール化後、２．５kbインサー
トを０．８％調製アガロースゲル上で単離した。ＤＮＡ
を電気溶出により抽出し沈澱させた。
【０１５７】１μｇのＭ１３ｍｐ１８（ＲＦ）をＢａｍ
ＨＩで切断し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理
し、及び７．３kbベクター断片を０．７％調製アガロー
スゲル上で単離した。ＤＮＡを電気溶出し、沈澱させ
た。１００ｐモルのＭ１３ｍｐ１８ ＢａｍＨＩ切断ベ
クター及び２００ｐモルのＢａｍＨＩ ＴＰＡA ＵＰＡ
B インサートを１０μｌの５０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ＤＴＴ、２mM
ＡＴＰ、０．５μｇゼラチン中において４００ＵのＴ
４ ＤＮＡリガーゼで１５℃で７時間連結した。
【０１５８】６５℃で１０分間インキュベーション後、
５μｌのこの連結混合物を用いてAmershamより発行され
たマニュアル「M13 Cloning and sequencing handbook
」に従ってＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１のコンピテント
細胞を形質転換した。３６個の無色プラークをつゝき出
し、一本鎖及び複製形（ＲＦ）ＤＮＡを調製した。ＲＦ
−ＤＮＡを分析すると、全てのクローンはＢａｍＨＩ消
化後に正しい大きさのインサートを示す。ＥｃｏＲＩ及
びＰｓｔＩ消化後の正しい大きさの断片は全てのクロー
ンにおけるＤＮＡインサートが誤った方向にあることを
示した（一本鎖鋳型ＤＮＡは非コード鎖であった）。こ
れらのクローンの一つをｍｐ１８／ＢａｍＨＩ／ＴＰＡ
A ＵＰＡB と称し、削除突然変異誘発に用いた。
【０１５９】Ｂ．ｐＣＳ１６／ＵＰＡA ＴＰＡB Ｋｐｎ
Ｉ−ＨｉｎｄIII 断片のＭ１３ｍｐ１８中におけるクロ
ーニング 迅速ＤＮＡ調製から得られた１．５μｇのｐＣＳ１６／
ＵＰＡA ＴＰＡB （実施例１０参照）を２０μｌの１０
mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、６mM ＭｇＣｌ2 、
６mMメルカプトエタノール中において３７℃で１時間１
２ＵのＫｐｎＩで消化した。１μｌの１Ｍ ＮａＣｌを
添加後、ＤＮＡを１２ＵのＨｉｎｄIIIで３７℃で１時
間消化した。１．５kb断片を０．８％調製アガロースゲ
ル上で単離した。ＤＮＡを電気溶出により抽出し沈澱さ
せた。０．５μｇのＭ１３ｍｐ１８（ＲＦ）をＫｐｎＩ
及びＨｉｎｄIII で消化した。７．３kbベクター断片を
０．７％調製アガロースゲル上で単離した。ＤＮＡを電
気溶出し沈澱させた。
【０１６０】１００ｆモルのＭ１３ｍｐ１８ ＫｐｎＩ
−ＨｉｎｄIII 切断ベクター及び２００ｆモルのＫｐｎ
Ｉ−ＨｉｎｄIII インサートを１０μｌの５０mM Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM
ＤＴＴ、２mM ＡＴＰ、０．５μｇゼラチン中におい
て４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で７
時間連結した。６５℃で１０分間インキュベーションし
て反応を停止した。この連結混合物５μｌを用いてＥ．
ｃｏｌｉ ＪＭ１０１コンピテント細胞を形質転換し
た。１０個の無色プラークを拾い上げ、一本鎖及び複製
形（ＲＦ）ＤＮＡを調製した。ＲＦ−ＤＮＡを分析する
と、全てのクローンは正しい大きさのインサート及び正
しい大きさの断片を示した。これらのクローンの一つを
ｍｐ１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／ＵＰＡA ＴＰＡB
と称し、削除突然変異誘発に用いた。
【０１６１】Ｃ．ｐＣＳ１６／ＵＫ2 ＴＰＡB ＫｐｎＩ
−ＨｉｎｄIII 断片のＭ１３ｍｐ１８中におけるクロー
ニング 迅速ＤＮＡ調製から得られた１．５μｇのｐＣＳ１６／
ＵＫ2 ＴＰＡB （実施例１１参照）を２０μｌの１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．５、６mM ＭｇＣｌ2 、６
mMメルカプトエタノール中において３７℃で１時間、１
２ＵのＫｐｎＩ（Boehringer）で消化した。１μｌの１
Ｍ ＮａＣｌを添加後、ＤＮＡを１２ＵのＨｉｎｄIII
で３７℃において１時間消化した。１．５kb断片を０．
８％調製アガロースゲル上で単離した。ＤＮＡを電気溶
出により抽出し、沈澱させた。０．５μｇのＭ１３ｍｐ
１８（ＲＦ）をＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIII で消化した。
７．３kbベクター断片を０．７％調製アガロースゲル上
で単離した。このＤＮＡを電気溶出し沈澱させた。
【０１６２】１００ｆモルのＭ１３ｍｐ１８ ＫｐｎＩ
−ＨｉｎｄIII 切断ベクター及び２００ｆモルのＫｐｎ
Ｉ−ＨｉｎｄIII インサートを１０μｌの５０mM Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM
ＤＴＴ、２mM ＡＴＰ、０．５μｇゼラチン中で４０
０ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で７時間連
結した。６５℃で１０分間インキュベーションにより反
応を停止した。この連結混合物５μｌを用いてＥ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０１の受容能力のある細胞を形質転換し
た。７つの無色のプラークを拾い上げ、一本鎖及び複製
形（ＲＦ）ＤＮＡを調製した。ＲＦ−ＤＮＡを分析する
と、全てのクローンは正しい大きさのインサート及び正
しい大きさの断片を示した。これらのクローンの一つを
ｍｐ１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／ＵＫ2 ＴＰＡB と
称し、削除突然変異誘発に用いた。
【０１６３】Ｄ．ｐＣＳ１６／ＵＫ2 ＵＰＡB ＫｐｎＩ
−ＨｉｎｄIII 断片のＭ１３ｍｐ１８におけるクローニ
ング 迅速ＤＮＡ調製から得られた１．５μｇのｐＣＳ１６／
ＵＫ2 ＵＰＡB （実施例１２参照）を１２ＵのＫｐｎＩ
で２０μｌの１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、６
mM ＭｇＣｌ2 、６mMメルカプトエタノール中で３７℃
で１時間消化した。１μｌの１Ｍ ＮａＣｌを添加後Ｄ
ＮＡを１２ＵのＨｉｎｄIII で３７℃において１時間消
化した。１．７kb断片を０．８％調製アガロースゲル上
で単離した。ＤＮＡを電気溶出により抽出し、沈澱させ
た。０．５μｇのＭ１３ｍｐ１８（ＲＦ）をＫｐｎＩ及
びＨｉｎｄIII で消化した。７．３kbベクター断片を
０．７％調製アガロースゲル上で単離した。ＤＮＡを電
気溶出し沈澱させた。
【０１６４】１００ｆモルのＭ１３ｍｐ１８ ＫｐｎＩ
−ＨｉｎｄIII 切断ベクター及び２００ｆモルのＫｐｎ
Ｉ−ＨｉｎｄIII インサートを１０μｌの５０mM Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM
ＤＴＴ、２mM ＡＴＰ、０．５μｇゼラチン中におい
て４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて７時間１５
℃で連結した。６５℃で１０分間インキュベーションに
より反応を停止した。５μｌのこの連結混合物を用いて
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１のコンピテント細胞を形質転
換した。１０個の無色プラークを拾い上げ、一本鎖及び
複製形（ＲＦ）ＤＮＡを調製した。ＲＦ−ＤＮＡを分析
すると全てのクローンは正しい大きさのインサート及び
正しい大きさの断片を示した。これらのクローンの一つ
をｍｐ１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／ＵＫ2 ＵＰＡB
と称し、削除突然変異誘発に用いた。
【０１６５】実施例１４：一次ハイブリッドＤＮＡ造成
体の削除突然変異誘発 Ａ）削除突然変異誘発の一般的実験方法 ａ）突然変異誘発プライマーのホスホリル化 突然変異誘発のために、２００ｐモルの突然変異プライ
マーを、８ＵのＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehri
nger、８Ｕ／μｌ）を用いて２０μｌの、１μｌの１０
mM ＡＴＰを含有する５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH
７．５、１０mMＭｇＣｌ2 、５mM ＤＴＴ、０．１mMス
ペルミジン、０．１mM ＥＤＴＡ中においてホスホリル
化した。３７℃で１時間インキュベーション後、６５℃
で１０分間加熱することにより反応を停止した。ハイブ
リダイゼーションスクリーニングのために、２０ｐモル
の突然変異誘発プライマーを唯一のＡＴＰ源において３
０μＣｉγ32Ｐ−ＡＴＰ（３０００Ci／ｍモル；Amersh
am International）を用いて上記の如くホスホリル化し
た。このプライマーを３．５ml・６×ＳＳＣで稀釈し、
直接プローブとして用いた。
【０１６６】ｂ）突然変異プライマー及びユニバーサル
配列決定プライマーの一本鎖鋳型へのアニーリング ０．２ｐモルの一本鎖鋳型を２０ｐモルのホスホリル化
突然変異誘発オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマ
ー（１０ｐモル／μｌ）及び１０ｐモルのユニバーサル
Ｍ１３配列決定プライマーと共に１０μｌの２０mM Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌpH７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、５０mM
ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴ中において９５℃で５分間イ
ンキュベートした。溶液をゆっくり室温まで３０分間に
亘って冷却させた。
【０１６７】ｃ）延長−連結反応 上記アニーリングされた混合物に１μｌの緩衝液〔０．
２Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．５）、０．１ＭｇＣｌ
2 、０．１Ｍ ＤＴＴ〕、４μｌの２．５mMｄＮＴＰ混
合物、１μｌの１０mM ＡＴＰ、０．５μｌ Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ（Biolabs 、４００Ｕ／μｌ）、０．６７
μｌのクレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ、２．９９
Ｕ／μｌ）を含有する１０μｌの酵素−ｄＮＴＰ（ｄＡ
ＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ）溶液を添加し
た。この混合物を１５℃で１時間インキュベート後、８
〜９℃で１６時間インキュベートした。６５℃で１０分
間インキュベートすることにより反応を停止した。
【０１６８】ｄ）連結混合物の形質転換 連結混合物をＴＥで１：２０及び１：２００に稀釈し、
これらの稀釈溶液のそれぞれ１μｌ及び５μｌを用いて
０．２mlのＥ．ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳの
修復マイナス菌株〔ＢＭＨ７１−１８（ΔＣｌａｃ−ｐ
ｒｏＡＢ），ｔｈｉ，ｓｕｐＥ，Ｆ′ｌａｃｉq ，ＺΔ
Ｍ１５，ｐｒｏＡ + Ｂ + 〕のコンピテント細胞を形質転
換した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ（Ｂ
ＭＨ７１−１８，ｍｕｔＳ２１５：Ｔｎｉｏ）の造成は
Kramer et al. 〔Cell 38, 879-887 (1984)〕により記
載されている。トランスフェクション後、修復マイナス
株の変異表現型へのファージの曝露を最少にするため
に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１の修復＋菌株によりラウ
ン（ｌａｗｎ）細胞を与えた〔P.Carter, H.Bedouelle
and G.Winter, Nucl.Acids Res. 13, 4431-4443 (198
5)〕。
【０１６９】ｅ）ファージのスクリーニング トランスフェクションされたＤＮＡから得られた１００
個のプラークをＹＴプレート上につま楊子で移し、感染
細菌のコロニーとして１５〜１８時間生育させた。コロ
ニーブロッティングはGrunstein 及びHogness 〔Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 72, 3961-3965 (1985)〕から適用さ
れた。ニトロセルロースフィルター（Millipore S.A.,
Cat.No.HAWP 090 、孔径０．４５μｍ）をコロニープレ
ート上に室温で１０分間置いた。フィルターを０．５Ｎ
ＮａＯＨで変性し、１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．
５で中和し、次いで高塩溶液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ pH７．５＋１．５Ｍ ＮａＣｌ）で処理した。こ
れらのフィルターを８０℃で３０分間真空焼付けし、密
封可能なプラスチック袋内で１００mlの１０×デンハル
ト溶液（D.T.Denhardt, Biochem.Biophys.Res.Commun.
23, 641-646 ）、６×ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳ中に
おいてプリハイブリダイズした。
【０１７０】ハイブリダイゼーションスクリーニングの
ために、プリハイブリダイズされたフィルターを５０ml
の６×ＳＳＣ中で１分間洗浄し、次いで32Ｐ−標識化突
然変異誘発プライマーを含有する３．５mlのプローブ内
で３０分間ハイブリダイズせしめた。ハイブリダイズさ
れたフィルターを１００ml ６×ＳＳＣ中において室温
で合計２分間３回洗浄し、次いでオートラジオグラフに
かけた。野性種と突然変異ファージ間の良好な区別が１
００mlの０．１×ＳＳＣ＋０．１％ ＳＤＳ中における
６０℃での簡単な洗浄（５分間）により得られた。
【０１７１】ｆ）ハイブリダイゼーションから得られた
陽性クローンにおける削除突然変異の確認 陽性クローンからのファージを１mlの２×ＹＴ中につま
楊子で移し、７０℃で２０分間加熱して細菌を殺し、次
いで１００μｌのこのファージ懸濁液を１．５mlの新た
に生育するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１培養液（ＯＤ600
約０．４５）に接種した。培養液を３７℃で４時間激し
く振盪した（３００rpm ）。陽性クローンからのファー
ジ−ストック及び複製形ＤＮＡを調製した〔J.Messing,
Methodsin Enzymology, 101 , 21-78 (1983)〕。突然
変異体（削除突然変異誘発後）からのＤＮＡを適当な制
限酵素で分析し、野性種（削除突然変異誘発前）ＤＮＡ
の制限断片と対比した。制限分析による確認後、一つの
正しい突然変異体からのＤＮＡをプラーク精製した。突
然変異は更に制限分析及び鎖−ターミネーター法を用い
る配列決定により検証した〔F.Sanger, S.Niclen及びA.
R.Coulson, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74, 5463-5467 (1
977)〕。
【０１７２】Ｂ）ｍｐ１８／ＢａｍＨＩ／ＴＰＡA ＵＰ
ＡB に対する削除突然変異誘発（図２７参照） 削除突然変異誘発は一般的実験方法で説明したように行
った。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クロー
ンは制限分析により確認された。３３３bpをＢａｍＨＩ
断片から削除突然変異誘発により除去した。ＢａｍＨＩ
を用いる制限分析で２１５０bp断片を確認した。Ｅｃｏ
ＲＩを用いる制限分析は野性種に見られた６６０，４７
２，４１６及び２８７断片の代りに突然変異体上に６６
０，４１６，２８７，２３０bp断片をもたらした。
【０１７３】ＰｓｔＩを用いる分析は突然変異体につい
て６１１及び４１４bpの大きさの二つの断片を示した。
野性種ＤＮＡは６２２，６１１及び４１４bpの三つの断
片を示した。正しい構造を有する一つの変異体クローン
をｍｐ１８／ＢａｍＨＩ／ＭＯＴＰＡA ＵＰＡB と称す
る。ｔ−ＰＡ Ａ鎖及びｕ−ＰＡ Ｂ鎖の間の結合にお
けるＤＮＡ配列は５′CAGAGCCCCCCCGGTGC ３′の配列の
配列プライマーを有する鎖−ターミネーター配列決定方
法により検証した。このプライマーはｕ−ＰＡ（６８２
−６６６）のコード化鎖に相補的である。
【０１７４】Ｃ）ｍｐ１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／
ＵＰＡA ＴＰＡB に対する削除突然変異誘発（図２８参
照） 削除突然変異誘発は一般的実験方法と同様にして行っ
た。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クローン
はＰｓｔＩを用いる制限分析により確認した。突然変異
体においては、５４４bp断片をもたらす野性種に対し
て、４６７bpバンドが観察された。正しい構造を有する
一つの変異体クローンをｍｐ１８／ＫｐｎＩ−Ｈｉｎｄ
III ／ＭＯＵＰＡA ＴＰＡB と称する。削除は５′CAAA
GATGGCAGCCTGC ３′の配列の配列決定プライマーを用い
る鎖−ターミネーター配列決定法により検証された。こ
のプライマーはｔ−ＰＡ（１０６２−１０４６）のコー
ド化鎖に相補的である。
【０１７５】Ｄ）ｍｐ１８／ＫｎｐＩ−ＨｉｎｄIII ／
ＵＫ2 ＴＰＡB に対する削除突然変異誘発（図２９参
照） 削除突然変異誘発は一般的実験方法と同様にして行っ
た。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クローン
はＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII 、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを
用いる制限分析により確認された。得られた断片は下記
の通りである：
【０１７６】
【表３】
【０１７７】正しい大きさのインサート及び正しい大き
さの断片が変異体について観察された。正しい構造を有
する一つの変異体クローンをｍｐ１８／ＫｐｎＩ−Ｈｉ
ｎｄIII ／ＭＯＵＫ2 ＴＰＡB と称する。削除は５′CC
CAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG ３′配列の配列決定
プライマーを用いる鎖−ターミネーター配列決定法によ
り検証された。このプライマーはｔ−ＰＡ（８５３−８
２１）のコード鎖に相補的である。
【０１７８】Ｅ）ｍｐ１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／
ＵＫ2 ＵＰＡB に対する削除突然変異誘発（図３０参
照） ＵＫ2 ＵＰＡB の合成においては二つの別々の削除突然
変異が用いられた。第一の削除突然変異誘発は一般的実
験方法と同様にして行なわれた。ハイブリダイゼーショ
ンから得られた陽性クローンはＥｃｏＲＩを用いる制限
分析により確認された。変異体には５４９，４５２，４
１６bp断片をもたらす野性種に対比して、５４９，４１
６，３５１bpバンドが観察された。正しい構造を有する
一つの変異体クローンをｍｐ１８／ＫｐｎＩ−Ｈｉｎｄ
III ／ＭＯＵＫ2 ＵＰＡB −１と称する。削除は５′CC
CAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG ３′の配列の配列決
定プライマーを用いる鎖−ターミネーター配列決定法に
より検証された。このプライマーはｔ−ＰＡ（８５３−
８２１）のコード化鎖に相補的である。
【０１７９】削除突然変異誘発の第二工程において、削
除は点突然変異の導入と共になされた。削除突然変異誘
発は一般的実験方法と同様にして行われた。ハイブリダ
イゼーションから得られた陽性クローンはＥｃｏＲＩを
用いる制限分析により確認された。突然変異体におい
て、５４９，４１６及び３５１bp断片をもたらす野性種
に対比して、４１６，３５１，２５９bpバンドが観察さ
れた。正しい構造を有する一つの変異体クローンをｍｐ
１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／ＭＯＵＫ2 ＵＰＡB と
称する。この削除は配列５′CAGAGCCCCCCCGGTGC ３′の
配列決定プライマーを用いる鎖−ターミネーター配列決
定方法により検証された。このプライマーはｕ−ＰＡ
（６８２−６６６）のコード鎖に相補的である。
【０１８０】実施例１５：ハイブリッドｔ−ＰＡ／ｕ−
ＰＡ ｃＤＮＡ造成体の酵母発現ベクターｐＪＤＢ２０
７中へのクローニング Ａ）ＴＰＡA ＵＰＡB ハイブリッド遺伝子のｐＪＤＢ２
０７中へのクローニング ＲＦ−ＤＮＡを迅速ＤＮＡ単離法によりｍｐ１８／Ｂａ
ｍＨＩ／ＭＯＴＰＡAＵＰＡB について調製した〔D.S.H
olmes及びM.Quingley, Anal.Biochem. 114 ,192-197 (1
981)〕。
【０１８１】ＲＦ−ＤＮＡ（〜１．５μｇ）を９ＵのＢ
ａｍＨＩで２０μｌの１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH
７．５）、６mM ＭｇＣｌ2 、１００mM ＮａＣｌ、６
mMメルカプトエタノール中において３７℃で１時間消化
した。１μｌのＲＮａｓｅ（１mg／ml）を添加し、３７
℃で１０分間インキュベート後、２．１kbインサートを
０．７％調製用アガロースゲル上で単離した。このＤＮ
Ａインサートを電気溶出により抽出し、エタノール中で
沈澱させた。１．５μｇのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−
Ｉ−ＴＰＡA ＵＰＡB をＢａｍＨＩで切断し、仔ウシ腸
アルカリホスファターゼで処理し、そして６．７kbベク
ターを単離した。電気溶出後ベクターＤＮＡを沈澱させ
た。
【０１８２】１００ｆモルのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５
−Ｉ−ＴＰＡA ＵＰＡB ＢａｍＨＩ切断ベクター、２０
０ｆモルのＴＰＡA ＵＰＡB インサートを４００ＵのＴ
4 ＤＮＡリガーゼで、１０μｌの５０mM Ｔｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ＤＴ
Ｔ、２mM ＡＴＰ、０．５μｇのゼラチン中において１
５℃で８時間連結した。６５℃で１０分間インキュベー
ションして反応を停止した。５μｌのこの連結混合物を
用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ Ｃａ2+細胞〔M.Dage
rt及びS.D.Ehrlich, Gene ６, 23-28 (1979)〕を形質転
換した。１２ａｍｐR コロニーを拾い上げ、迅速単離方
法によりＤＮＡを調製した。ＤＮＡを分析すると、５個
のクローンが共に正しい大きさのインサート及び正しい
方向を示した。一つのクローンを１００mg／mlのアンピ
シリンを含有する１００mlのＬＢ培地中において生育せ
しめた。プラスミドＤＮＡを単離し、ｐＪＤＢ２０７／
ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＴＰＡA ＵＰＡB と称する。
【０１８３】Ｂ）ＭＯＵＰＡA ＴＰＡB 、ＭＯＵＫ2 Ｔ
ＰＡB 及びＭＯＵＫ2 ＵＰＡB 遺伝子インサートのプラ
スミドｐＣＳ１６中へのクローニング ＲＦ−ＤＮＡを、迅速ＤＮＡ単離法により、ｍｐ１８／
ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／ＭＯＵＰＡA ＴＰＡB 、ｍｐ
１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／ＭＯＵＫ2 ＴＰＡB 、
ｍｐ１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／ＭＯＵＫ2 ＵＰＡ
B について調製した。これらの三つのＲＦ−ＤＮＡ（約
１．５μｇ）をそれぞれ１２ＵのＫｐｎＩ及び１２Ｕの
ＨｉｎｄIII で２０μｌの１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
pH７．５、６mM ＭｇＣｌ2 、６mMメルカプトエタノー
ル中において３７℃で１時間消化した。１μｌの１Ｍ
ＮａＣｌを添加し、これらのＤＮＡを更に１２ＵのＨｉ
ｎｄIII で消化した。１μｌのＲＮａｓｅ（１mg／ml）
を添加し、３７℃で１０分間インキュベート後、１．４
kbインサートを各々０．８％調製アガロースゲル上で単
離した。これらのＤＮＡインサートを電気溶出により抽
出し、エタノール中で沈澱させた。
【０１８４】３μｇのｐＣＳ１６／ＵＰＡをＫｐｎＩ及
びＨｉｎｄIII で消化し、２．７kbベクター断片を単離
した。電気溶出後、ベクターＤＮＡをエタノール中で沈
澱させた。１００ｆモルのｐＣＳ１６ ＫｐｎＩ−Ｈｉ
ｎｄIII 切断ベクター、２００ｆモルのＫｐｎＩ−Ｈｉ
ｎｄIII 切断インサート断片を１０μｌの５０mM Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM
ＤＴＴ、２mM ＡＴＰ、０．５μｇゼラチン中におい
て４００ＵのＴ4 ＤＮＡリガーゼで１５℃において８時
間連結した。６５℃で１０分間インキュベーションして
反応を停止し、５μｌのこの連結混合物を用いてＥ．ｃ
ｏｌｉ ＨＢ１０１ Ｃａ2+細胞を形質転換した。
【０１８５】これらの三つの連結の各々から６個のａｍ
ｐR コロニーをつゝき出した。ＤＮＡを迅速単離法によ
り調製した。ＤＮＡをＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII で分析す
ると、正しい大きさのインサートバンドが観察された。
これら三つの各々の連結体から一つのクローンを１００
μｇ／mlのアンピシリンを含有する１００ml ＬＢ培地
中で生育させた。ｍｐ１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／
ＭＯＵＰＡA ＴＰＡB、ｍｐ１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄI
II ／ＭＯＵＫ2 ＴＰＡB 及びｍｐ１８／ＫｐｎＩ−Ｈ
ｉｎｄIII ／ＭＯＵＫ2 ＵＰＡB から誘導されたプラス
ミドＤＮＡを単離し、それぞれｐＣＳ１６／ＭＯＵＰＡ
A ＴＰＡB 、ｐＣＳ１６／ＭＯＵＫ2 ＴＰＡB 及びｐＣ
Ｓ１６／ＭＯＵＫ2 ＵＰＡB と称する。
【０１８６】Ｃ）ＭＯＵＰＡA ＴＰＡB 、ＭＯＵＫ2 Ｔ
ＰＡB 及びＭＯＵＫ2 ＵＰＡB 遺伝子インサートのｐＪ
ＤＢ２０７中へのクローニング ５μｇのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡを１５
ＵのＳｃａＩ及び５ＵのＸｈｏＩ（Boehringer）により
１５μｌの１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．５）、６
mM ＭｇＣｌ2 、１５０mM ＮａＣｌ、６mMメルカプト
エタノール中で３７℃で１時間消化した。１μｌのＲＮ
ａｓｅ（１mg／ml）を添加後、６．７kbベクター断片を
単離した。電気溶出後、ベクターＤＮＡを沈澱させた。
【０１８７】各々１５μｇのｐＣＳ１６／ＭＯＵＰＡA
ＴＰＡB 、ｐＣＳ１６／ＭＯＵＫ2ＴＰＡB 、ｐＣＳ１
６／ＭＯＵＫ2 ＵＰＡB を３０ＵのＸｈｏＩと共に２０
０の１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH８、６mM ＭｇＣｌ
2 、１５０mM ＮａＣｌ、６mMメルカプトエタノール中
において３７℃で１時間インキュベートし、等容量のフ
ェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール中で沈澱
させた。沈澱したＸｈｏＩ切断ｐＣＳ１６／ＭＯＵＰＡ
A ＴＰＡB 、ｐＣＳ１６／ＭＯＵＫ2 ＴＰＡB、及びｐ
ＣＳ１６／ＭＯＵＫ2 ＵＰＡB ＤＮＡ遺伝子を各々１５
０μｌの１０mMＴｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．５、６mM Ｍ
ｇＣｌ2 、１５０mM ＮａＣｌ、６mMメルカプトエタノ
ール中に再懸濁させ、３７℃で４０分間１２ＵのＳｃａ
Ｉ（部分消化物）とインキュベートし、等容量のフェノ
ールで抽出した後、等容量のクロロホルム−イソアミル
アルコール（５０：１）で抽出した。１．２kb断片を各
々１％調製アガロースゲル上で単離した。これらのＤＮ
Ａを電気溶出により抽出し、沈澱させた。
【０１８８】１００ｆモルのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５
−Ｉ−ＵＰＡ ＳｃａＩ−ＸｈｏＩ切断ベクター及び２
００ｆモルのＸｈｏ−ＳｃａＩ切断ｐＣＳ１６／ＭＯＵ
ＰＡ A ＴＰＡB 、ｐＣＳ１６／ＭＯＵＫ2 ＴＰＡB 或い
はｐＣＳ１６／ＭＯＵＫ2 ＵＰＡB １．２kbインサート
を各々１０μｌの５０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ pH７．
５、１０mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ＤＴＴ、２mM ＡＴ
Ｐ、０．５μｇのゼラチン中で、４００ＵのＴ4 ＤＮＡ
リガーゼを用いて１５℃で１６時間連結した。６５℃で
１０分間インキュベーションすることにより反応を停止
した。５μｌのこの連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１ Ｃａ2+細胞を形質転換した。
【０１８９】６個のａｍｐR コロニーをこれらの三つの
連結体の各々から拾い上げた。ＤＮＡを迅速単離法によ
り調製した。ＤＮＡの制限分析は正しい大きさのインサ
ートバンドを示す。これらの三つの連結体のそれぞれか
らの一つのクローンを１００μｇ／mlのアンピシリンを
含有する１００ml ＬＢ培地中で生育せしめた。ｐＣＳ
１６／ＭＯＵＰＡA ＴＰＡB 、ｐＣＳ１６／ＭＯＵＫ2
ＴＰＡB 、ｐＣＳ１６／ＭＯＵＫ2 ＵＰＡB から誘導さ
れたプラスミドＤＮＡはそれぞれｐＪＤＢ２０７／ＰＨ
０５−Ｉ−ＭＯＵＰＡA ＴＰＡB 、ｐＪＤＢ２０７／Ｐ
Ｈ０５−Ｉ−ＭＯＵＫ2 ＴＰＡB 及びｐＪＤＢ２０７／
ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＵＫ2 ＵＰＡB と称される。
【０１９０】実施例１６：サッカロミセス・セレビジア
エＧＲＦ１８の形質転換及び酵母細胞抽出液の調製 プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＴＰＡ
A ＵＰＡB 、ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＵＰ
ＡA ＴＰＡB 、ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＵ
Ｋ2 ＴＰＡB 及びｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯ
ＵＫ2 ＵＰＡBを各々Hinnen et al. 〔Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 75, 1929 (1978）〕により記載されている形
質転換方法を用いてサッカロミセス・セレビジアエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）菌株ＧＲＦ１８中に導入し
た。各々５μｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌのスフ
ェロプラスト懸濁液に添加し、混合物をポリエチレング
リコールで処理した。スフェロプラストを１０ml再生寒
天と混合し、酵素最少培地プレート上にロイシンなしに
プレーティングした。３０℃で３日間インキュベーショ
ン後約２００個の形質転換細胞が得られた。
【０１９１】酵母転換体の各々から一つのコロニーをつ
ゝき出した。これらの異ったコロニーをSaccharomyces cerevisiae GRF18／pJDB207 ／PH05-I-MOTPAA UPAB Saccharomyces cerevisiae GRF18／pJDB207 ／PH05-I-MOUPAA TPAB Saccharomyces cerevisiae GRF18／pJDB207 ／PH05-I-MOUK2 TPAB Saccharomyces cerevisiae GRF18／pJDB207 ／PH05-I-MOUK2 UPAB と称する。
【０１９２】酵母細胞を、３０℃において２０mlのＨＥ
−１７培地〔８．４ｇの酵母窒素ベース（Difco ）、１
０ｇのＬ−アスパラギン（Sigma ）、１ｇのＬ−ヒスチ
ジン（Sigma ）、４０mlの５０％のグルコース／１ｌ溶
液〕中において５０mlのエルレンマイヤーフラスコ内で
８−１０×１０7 細胞／mlの密度に到達するまで２４時
間振盪しながら生育させた。細胞を遠心分離し、１０ml
の０．９％ＮａＣｌ中に再懸濁させた。２mlの再懸濁細
胞を用いて５０mlの低−Ｐｉ最小培地（ヨーロッパ特許
出願１４３０８１号明細書記載のもの）を接種し、これ
に１０ｇ／ｌＬ−アスパラギン（Sigma ）、及び１０ｇ
／ｌ Ｌ−ヒスチジン（Sigma ）を２５０mlのエルレン
マイヤーフラスコ内で添加した。インキュベーションは
２５０rpm にて３０℃で行った。
【０１９３】１０mlの低−Ｐｉ最小培地からの細胞を４
８時間後に３０００rpm の１０分間の遠心分離によりＦ
ａｌｃｏｎ ２０７０チューブ内に集めた。これらの細
胞を一度１０mlの低−Ｐｉ培地で洗浄し、遠心分離し
た。細胞ペレットを溶解緩衝液〔６６mMリン酸カリウム
pH７．４、４mM Zwittergent (Calbiochem.)〕中に浮遊
させた。この細胞浮遊液に８ｇのガラスビーズ（０．５
〜０．７５mm直径）及び小ガラス棒を添加し、浮遊液を
Vortex Mixer (Scientific Instruments Inc., USA）上
でフルスピードで４×２分間氷上で２分間の間隔をもっ
て振盪した。これらの９０％を越える細胞はこの方法に
より破壊された。細胞破片及びガラスビーズを４℃で３
０００rpm にて５分間遠心分離により沈澱させた。上澄
液をＰＡ活性の測定及びＰＡの精製及び単離に用いた。
【０１９４】実施例１７：ハイブリッドＰＡコード配列
の哺乳動物細胞発現ベクター中への挿入 Ａ）ＵＰＡA ＴＰＡB 「完全」ハイブリッドコード配列
の挿入 ｍｐ１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／ＭＯＵＰＡA ＴＰ
ＡB のＲＦ ＤＮＡをコード配列の開始の直ぐ上流に位
置するＳｍａＩ部位において切断し、ＳａｃＩリンカー
（CGAGCTCG）に連結した。引き続きこのプラスミドをＳ
ａｃＩで切断し、それはリガンドリンカーの位置及びハ
イブリッドＰＡコード配列のｔ−ＰＡ−由来部分におけ
る自然ＳａｃＩ部位において切断した。二つの得られた
断片の小さい方をアガロースゲルにより精製し、Ｓａｃ
Ｉ切断ｐＣＧＡ４４（実施例４参照）に連結し、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＨＢ１０１中に形質転換し、そして候補クロー
ンからのＤＮＡをＥｃｏＲＩで試験した。期待された制
限パターンを有するクローンをｐＣＧＣ１／ＵＰＡA Ｔ
ＰＡB と称する。
【０１９５】Ｂ）ＵＫ2 ＴＰＡB ハイブリッドコード配
列の挿入 ｍｐ１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／ＭＯＵＫ2 ＴＰＡ
B のＲＦ ＤＮＡを、コード配列の開始の直ぐ上流に位
置するＳｍａＩ部位で切断し、上記の如くＳａｃＩと連
結した。ＳａｃＩで切断後、得られた小断片を上記の如
くＳａｃＩ−切断ｐＣＧＡ４４中にクローニングし、そ
して期待された制限パターンを有するクローンをｐＣＧ
Ｃ２／ＵＫ2 ＴＰＡB と称する。
【０１９６】Ｃ）ＵＫ2 ＵＰＡB ハイブリッドコード配
列の挿入 ｍｐ１８／ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII ／ＭＯＵＫ2 ＵＰＡ
B のＲＦ ＤＮＡをｕ−ＰＡ配列の上流のＳｍａＩ部位
及びコード配列下流のＸｈｏＩ部位（ベクターＤＮＡ中
の）において切断した。このＤＮＡ断片の粘着末端を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（実施例５Ｄ参
照）を用いてフィルインした。ＳａｃＩリンカーを平滑
末端に連結し、ＤＮＡをＳａｃＩで切断し、二つの得ら
れた断片の小さい方をアガロースゲルで精製し、Ｓａｃ
Ｉ−切断ｐＣＧＡ４４中にクローニングした。期待され
たＥｃｏＲＩ制限パターンを有するクローンをｐＣＧＣ
３／ＵＫ2 ＵＰＡB と称する。
【０１９７】Ｄ）ＴＰＡA ＵＰＡB 「完全」コード配列
の挿入 工程１：ｍｐ１８／ＢａｍＨＩ／ＭＯＴＰＡA ＵＰＡB
のＲＦ ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、小さい（約２．
１kb）断片をＢａｍＨＩ切断ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５
−Ｉ−ＴＰＡA ＵＰＡB （実施例９参照）ベクター中に
クローニングした。正しい方向はＨｉｎｄIII による消
化により選択され、一つの正しいプラスミドをｐＪＤＢ
２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＴＰＡA ＵＰＡB と称す
る。 工程２：ｐｔＮＣ・ＵＣからの約６００bpのＳａｃＩ−
ＮａｒＩ断片（実施例３参照）及びｐＪＤＢ２０７／Ｐ
Ｈ０５−Ｉ−ＴＰＡA ＵＰＡB からの約１３５０bp Ｎ
ａｒＩ−ＸｈｏＩ断片を単離し、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ切
断ｐＣＳ１６（実施例７参照）ベクター中にクローニン
グした。この約１．９kbインサートはＳａｃＩ−Ｘｈｏ
Ｉ及びＥｃｏＲＩによる消化により確認した。一つの正
しいプラスミドをｐＣＳ１６／ＭＯＴＰＡA ＵＰＡB と
称する。
【０１９８】工程３：プラスミドｐＣＳ１６／ＭＯＴＰ
ＡA ＵＰＡB をｕ−ＰＡコード配列の下流に位置するＸ
ｈｏＩ部位で切断し、粘着末端をＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ
ポリメラーゼＩを用いてフィルインする。ＳａｃＩリン
カーを平滑末端に連結し、ＤＮＡをＳａｃＩで切断し
た。二つの断片の小さい方をアガロースゲルにより精製
し、ＳａｃＩ−切断ｐＢＲ４ａ（実施例５参照）ベクタ
ー断片中にクローニングした。正しい方向及び正しい大
きさのインサートはそれぞれＢａｍＨＩ及びＳａｃＩに
よる消化により確認した。一つの正しいプラスミドをｐ
ＣＧＣ４ａ／ＴＰＡ A ＵＰＡB と命名する。
【０１９９】実施例１８：他のハイブリッドＰＡコード
配列の造成及びその哺乳動物細胞発現ベクター中への挿
入 Ａ）ｐＣＧＣ４ａ／ＴＰＡA ＵＰＡB 断片のＭ１３ｍｐ
１８中へのクローニング ３μｇのｐＣＧＣ４ａ／ＴＰＡA ＵＰＡB （実施例１７
参照）を１２０のＳａｃＩ（Boehringer）で２０μｌの
１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．５、６mMＭｇＣ
ｌ2 、６mMメルカプトエタノール中において３７℃で１
時間消化した。約１．９kbの断片を０．７％調製アガロ
ースゲル上で単離した。このＤＮＡを電気溶出により抽
出し、沈澱させた。０．５μｇのＭ１３ｍｐ１８（Ｒ
Ｆ）をＳａｃＩで消化した。この７．３kbベクター断片
を０．７％調製アガロースゲル上で単離した。このＤＮ
Ａを電気溶出し、沈澱させた。
【０２００】１００ｆモルのＭ１３ｍｐ１８ ＳａｃＩ
切断ベクター及び２００ｆモルのＳａｃＩインサートを
１０μｌの５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．５、１０
mMＭｇＣｌ2 、１０mM ＤＴＴ、２mM ＡＴＰ、０．５
μｇのゼラチン中において４００ＵのＴ4 ＤＮＡリガー
ゼで１５℃において７時間連結した。６５℃で１０分間
インキュベートして反応を停止した。５μｌのこの連結
混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１のコンピテン
ト細胞を形質転換した。６個の無色プラークを拾い上
げ、一本鎖及び複製形（ＲＦ）ＤＮＡを調製した。ＲＦ
−ＤＮＡを分析すると、４個のクローンは正しい大きさ
のインサート及び正しい方向を示した。これらのクロー
ンの一つをｍｐ１８／ＳａｃＩ／ＴＰＡA ＵＰＡB （Ｂ
Ｃ）と称する。
【０２０１】Ｂ）ｐＢＲ４ａ ＳａｃＩ断片のＭ１３ｍ
ｐ１８へのクローニング ｐＢＲ４ａ（実施例５参照）ＳａｃＩ断片をＭ１３ｍｐ
１８中でクローン化した。正しい大きさのインサート及
び正しい方向を有するこれらのクローンの一つをｍｐ１
８／ＳａｃＩ／ＴＰＡA ＵＰＡB （ＢＲ）と称する。 Ｃ）ＴＰＡ−ＵＰＡハイブリッド造成物上での削除突然
変異誘発 １）Ｋ2 ＵＰＡB （ＢＣ）〔即ち、ｔＰＡ（１−３）−
ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１
１）〕の造成 削除突然変異誘発を、ｍｐ１８／ＳａｃＩ／ＴＰＡA Ｕ
ＰＡB （ＢＣ）について一般的実験方法（実施例１４参
照）と同様にして行った。ハイブリダイゼーションから
得られた陽性クローンはＳａｃＩを用いる制限分析によ
り確認された。
【０２０２】変異体においては、約１９００bp断片をも
たらす野性種に対比して約１３８０bpバンドが観察され
た。変異体を更にＥｃｏＲＩ消化により確認した。正し
い構造を有する一つの変異体クローンはｍｐ１８／Ｓａ
ｃＩ／Ｋ2 ＵＰＡB （ＢＣ）と称する。削除は配列５′
CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG ３′の配列決定プ
ライマーを用いる鎖ターミネーター配列決定方法により
検証された。このプライマーは位置８３８（ｔ−ＰＡ）
におけるミスマッチを有するｔ−ＰＡ（８５３−８２
１）のコード鎖に相補的であった。
【０２０３】２）ＦＵＰＡB （ＢＣ）〔即ちｔＰＡ（１
−４９）−ｔＰＡ（２６２−２７５）−ｕＰＡ（１５９
−４１１）〕の造成 削除突然変異誘発を、ｍｐ１８／ＳａｃＩ／ＴＰＡA Ｕ
ＰＡB （ＢＣ）について一般的方法（実施例１４参照）
と同様にして行った。ハイブリダイゼーションから得ら
れた陽性クローンはＳａｃＩを用いる制限分析により確
認された。変異体においては、約１９００bp断片をもた
らす野性種に対比して、約１２００bpのバンドが観察さ
れた。変異体は更にＥｃｏＲＩ消化により確認された。
正しい構造を有する一つの変異体クローンはｍｐ１８／
ＳａｃＩ／ＦＵＰＡB （ＢＣ）と称される。削除は５′
CAGAGCCCCCCCGGTGC ３′配列の配列決定プライマーを用
いる鎖ターミネーター配列決定方法により検証された。
【０２０４】このプライマーはｕ−ＰＡ（６６６−６８
２）のコード鎖に相補的である。 ３）ＦＫ2 ＵＰＡB （ＢＣ）〔即ち、ｔＰＡ（１−４
９）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４
１１）〕の造成 削除突然変異誘発をｍｐ１８／ＳａｃＩ／ＴＰＡA ＵＰ
ＡB （ＢＣ）について一般的実験方法（実施例１４参
照）と同様にして行った。ハイブリダイゼーションから
得られた陽性クローンはＳａｃＩを用いる制限分析によ
り確認された。変異体においては、約１９００bpの断片
をもたらす野性種に対比して約１４７０bpのバンドが観
察された。変異体は更にＥｃｏＲＩ消化により確認され
た。正しい構造を有する一つの変異体クローンはｍｐ１
８／ＳａｃＩ／ＫＦ2 ＵＰＡB （ＢＣ）と称される。削
除は配列５′CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG ３′
の配列決定プライマーを用いる鎖ターミネーター配列決
定方法により検証された。このプライマーは位置８３８
（ｔ−ＰＡ）におけるミスマッチを伴ってｔ−ＰＡ（８
５３−８２１）のコード鎖に相補的である。
【０２０５】４）ＦＧＫ2 ＵＰＡB （ＢＣ）〔即ちｔＰ
Ａ（１−８６）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ
（１５９−４１１）〕の造成 削除突然変異誘発はｍｐ１８／ＳａｃＩ／ＴＰＡA ＵＰ
ＡB （ＢＣ）について一般的実験方法（実施例１４参
照）と同様にして行われた。ハイブリダイゼーションか
ら得られた陽性クローンはＳａｃＩを用いる制限分析に
より確認された。変異体においては、約１９００bpの断
片をもたらす野性種に対比して約１５８０bpのバンドが
確認された。変異体は更にＥｃｏＲＩ消化により確認さ
れた。正しい構造を有する一つの変異体クローンはｍｐ
１８／ＳａｃＩ／ＦＧＫ2 ＵＰＡB（ＢＣ）と称され
る。削除は配列５′CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGT
G ３′の配列決定プライマーを用いる鎖ターミネーター
配列決定方法により検証された。このプライマーは位置
８３８（ｔ−ＰＡ）におけるミスマッチを伴ってｔ−Ｐ
Ａ（８５３−８２１）のコード鎖に相補的である。
【０２０６】５）同様な削除突然変異誘発実験方法を用
いてＫ2 ＵＰＡB （ＢＲ）〔ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ
（１７６−２６２）−ｕＰＡ（１３２−４１１） ＦＵＰＡB （ＢＲ）〔ｔＰＡ（１−４９）−ｕＰＡ（１
３４−４１１）〕 ＦＫ2 ＵＰＡB （ＢＲ）〔ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ
（１７６−２６２）−ｕＰＡ（１３２−４１１）、及び
ＦＧＫ2 ＵＰＡB （ＢＲ）〔ｔＰＡ（１−８６）−ｔＰ
Ａ（１７６−２６２）−ｕＰＡ（１３２−４１１）〕を
生成した。
【０２０７】Ｄ）ハイブリッドＰＡコード配列の哺乳動
物細胞発現ベクター中への挿入 １．ＦＵＰＡB （ＢＣ），Ｋ2 ＵＰＡB （ＢＣ），ＦＫ
2 ＵＰＡB （ＢＣ）及びＦＧＫ2 ＵＰＡB （ＢＣ）の挿
入 ｍｐ１８／ＳａｃＩ／Ｋ2 ＵＰＡB （ＢＣ），ｍｐ１８
／ＳａｃＩ／ＦＵＰＡ B （ＢＣ），ｍｐ１８／ＳａｃＩ
／ＦＫ2 ＵＰＡB （ＢＣ）及びｍｐ１８／ＳａｃＩ／Ｆ
ＧＫ2 ＵＰＡB （ＢＣ）からのＲＦ ＤＮＡを各々Ｓａ
ｃＩで切断した。二つの得られた断片の小さい方を単離
し、ＳａｃＩ切断ｐＢＲ４ａ（実施例５参照）ベクター
断片に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１中に転移し、
そして正しい方向及び正しい大きさのインサートをそれ
ぞれＢａｍＨＩ及びＳａｃＩによる消化により確認し
た。得られたプラスミドをそれぞれｐＣＧＣ５／Ｋ2 Ｕ
ＰＡ B ，ｐＣＧＣ６／ＦＵＰＡB ，ｐＣＧＣ７／ＦＫ2
ＵＰＡB 及びｐＣＧＣ８／ＦＧＫ2 ＵＰＡB と命名す
る。
【０２０８】２．同様に、Ｋ2 ＵＰＡB （ＢＲ），ＦＵ
ＰＡB （ＢＲ），ＦＫ2 ＵＰＡB （ＢＲ）及びＦＧＫ2
ＵＰＡB （ＢＲ）ＤＮＡ（上記参照）を各々ｐＢＲ４ａ
中に挿入した。得られたプラスミドをそれぞれｐＢＲ
５，ｐＢＲ６，ｐＢＲ７及びｐＢＲ８命名する。
【０２０９】実施例１９：ＤＨＦＲ遺伝子を含んでなる
哺乳動物発現ベクター プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４５）
は抗葉酸剤メトトレキセートを用いる選択或いはＤＨＦ
Ｒ- ＣＨＯ細胞のＤＨＦＲ+ 形質転換体の選択によりＤ
ＨＦＲ- 含有細胞の形質転換体の選択を可能にするプラ
スミドである〔ＤＵＫＸＢ１細胞；G.Urlaub, Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A. 77, 4216-4220 (1980)〕。このプラ
スミドの単一ＢａｍＨＩ部位にモジュールｔ−ＰＡ遺伝
子を含有するｐＣＧＡ２８のＢａｍＨＩ断片をクローン
化することができる。これらの二つの可能性のある方向
のいづれかを含有するプラスミドはｐＣＧＡ７００ａ／
ｔＰＡ及びｐＣＧＡ７００ｂ／ｔＰＡと命名される。両
者を用いて組織培養細胞内にｔ−ＰＡを発現することが
できるが、しかし、ｔ−ＰＡ遺伝子の転写がＤＨＦＲ遺
伝子のそれと同一方向であるｐＣＧＡ７００ａ／ｔＰＡ
の方がしばしば収束的に転写されるプラスミドよりも僅
かにより高い発現レベルに導くので好ましい。
【０２１０】同様にしてプラスミドｐＢＲ１ａ／ｔＰ
Ａ，ｐＢＲ２ａ／ＵＰＡA ＴＰＡB ，ｐＣＧＣ１／ＵＰ
ＡA ＴＰＡB 、及びｐＣＧＣ２／ＵＫ2 ＴＰＡB からの
ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータ（下記）を
コードするモジュール遺伝子は、ＢａｍＨＩ断片とし
て、ｐＣＧＡ７００ａ／ｔＰＡのＤＨＦＲ遺伝子と組合
わせて、モジュールプラスミノーゲンアクチベータ遺伝
子がＤＨＦＲ遺伝子と同一方向に転写されるプラスミド
ｐＣＧＡ７０１ａ／ｔＰＡ，ｐＣＧＡ７０２ａ／ＵＰＡ
A ＴＰＡB ，ｐＣＧＡ７０５ａ／ＵＰＡA ＴＰＡB 、及
びｐＣＧＡ７０７ａ／ＵＫ2 ＴＰＡB からそれぞれ形成
され、そして両方の遺伝子が反対方向に転写されるｐＣ
ＧＡ７０１ｂ／ｔＰＡ，ｐＣＧＡ７０２ｂ／ＵＰＡA Ｔ
ＰＡB ，ｐＣＧＡ７０５ｂ／ＵＰＡA ＴＰＡB ，ｐＣＧ
Ａ７０７ｂ／ＵＫ2 ＴＰＡB が形成される。ｕ−ＰＡＢ
−鎖をコードする部分におけるＢａｍＨＩ配列の存在の
ために、モジュールプラスミノーゲンアクチベータ遺伝
子はｎｅｏR プラスミドの部分的切断（３個のＢａｍＨ
Ｉ部位の２個）の後、アガロースゲル電気泳動により適
当な断片を単離（図面参照）することによってのみ単離
することができる。
【０２１１】この様にして、ｐＢＲ３ａ／ｕＰＡ，ｐＢ
Ｒ４ａ／ＴＰＡA ＵＰＡB ，ｐＢＲ５／Ｋ2 ＵＰＡB ，
ｐＢＲ６／ＦＵＰＡB ，ｐＢＲ７／ＦＫ2 ＵＰＡB ，ｐ
ＢＲ８／ＦＧＫ2 ＵＰＡB ，ｐＣＧＣ３／ＵＫ2 ＵＰＡ
B ，ｐＣＧＣ４ａ／ＴＰＡAＵＰＡB ，ｐＣＧＣ５／Ｋ
2 ＵＰＡB ，ｐＣＧＣ６／ＦＵＰＡB ，ｐＣＧＣ７／Ｆ
Ｋ2 ＵＰＡB 、及びｐＣＧＣ８／ＦＧＫ2 ＵＰＡB か
ら、プラスミノーゲンアクチベータ遺伝子が全てＤＨＦ
Ｒ遺伝子と同方向に転写されるｐＣＧＡ７０３ａ／ｕＰ
Ａ，ｐＣＧＡ７０４ａ／ＴＰＡA ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７
０５ａ／Ｋ2 ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７０８ａ／ＦＵＰ
ＡB ，ｐＣＧＡ７０６ａ／ＦＫ2 ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７
０７ａ／ＦＧＫ2 ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７０９ａ／ＵＫ2
ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７１１ａ／ＴＰＡA ＵＰＡB ，ｐＣ
ＧＡ７１２ａ／Ｋ2 ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７１３ａ／ＦＵ
ＰＡB ，ｐＣＧＡ７１４ａ／ＦＫ2 ＵＰＡB 及びｐＣＧ
Ａ７１５ａ／ＦＧＫ2 ＵＰＡB をそれぞれ造成すること
ができ、
【０２１２】更に両方の遺伝子が非収束的に（inconver
gently）転写されるｐＣＧＡ７０３ｂ／ｕＰＡ，ｐＣＧ
Ａ７０４ｂ／ＴＰＡA ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７０８ｂ／Ｆ
ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７０５ｂ／Ｋ2 ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ
７０６ｂ／ＦＫ2 ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７０７ｂ／ＦＧＫ
2 ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７０９ｂ／ＵＫ2 ＵＰＡB ，ｐＣ
ＧＡ７１１ｂ／ＴＰＡA ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７１２ｂ／
Ｋ2 ＵＰＡB ，ｐＣＧＡ７１３ｂ／ＦＵＰＡB ，ｐＣＧ
Ａ７１４ｂ／ＦＫ2 ＵＰＡB 、及びｐＣＧＡ７１５ｂ／
ＦＧＫ2 ＵＰＡB 、を造成することができる。
【０２１３】実施例２０：形質転換哺乳動物細胞による
ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータの製造 Ａ）組織培養細胞の維持及びＤＮＡトランスフェクショ
ン；一般的操作 ＤＮＡ造成体は酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素を欠乏する
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の変異体で
あるＤＵＫＸＢ１中で発現される〔G.Urlaub et al., P
roc.Nat.Acad.Sci.USA 77, 4216-4220 (1980)〕。ＤＵ
ＫＸＢ１細胞は５％ウシ胎児血清を補給したヌクレオシ
ドを含有するアルファ−ＭＥＭ培地（GIBCO ）内で培養
された。
【０２１４】細胞は６−ウエルマルチプレート（３．４
cm直径）内において１０，０００個／cmの密度でプレー
ト培養され、４μｇのＤＮＡで形質転換された。ＤＮＡ
を０．１mM ＥＤＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ pH７．０中に５０μｇ／mlで溶解し、氷上で５分
間冷却し、０．２５容量の１Ｍ ＣａＣｌ2 を添加し、
そして氷上で１０分間インキュベートした。この混合物
を次いで等容量の２×ＨＢＳ（５０mM Ｈｅｐｅｓ、２
８０mM ＮａＣｌ、０．７５mM Ｎａ2 ＨＰＯ 4 、０．
７５mM ＮａＨ2 ＰＯ4 、pH７．１２）と混合した後更
に１０分間氷上でインキュベートした。
【０２１５】最後に、このＤＮＡ−Ｃａ−ホスフェート
共沈澱を培養培地に添加し、細胞をＤＮＡと共に１６〜
１８時間インキュベートし、その後グリセロールショッ
クを与えた。即ち細胞をＴＢＳ（８０ｇ／ｌ ＮａＣ
ｌ、３．８ｇ／ｌ ＫＣｌ、１ｇ／ｌ Ｎａ2 ＨＰＯ4
・２Ｈ2 Ｏ、０．１１４ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ
2 Ｏ、０．１１ｇ／ｌ ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、２５mM
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ pH７．５）で濯ぎ、ＴＢＳ中２０
％（ｖ／ｖ）グリセロールで１分間インキュベートし、
再びＴＢＳで濯ぎ、そして組織培養培地中で２４時間培
養した。細胞を次いでトリプシン処理し、そして細胞を
８cm直径のペトリ皿に移した。
【０２１６】次の日、初期培養培地を選択剤なしに１mg
／mlジェネテイシンを含有する培地で置換えた。培地は
３日目或いは４日目毎に置換した。コロニーは約１４日
目に見ることができた。個々のコロニーからの細胞をそ
れらのピペットの先端でかき落とすと共に同時にそれら
をトリプシン溶液を充填したチップ中に吹込み、そして
各々をジェネテイシンを含有する培地を供給された２４
ウエルマルチプレートのウエルに移しながら単離した。
コンフルエントになった時点でこれらの培養液を６ウエ
ルマルチプレートのウエル及び引続いて８cm直径のペト
リ皿に分割した。
【０２１７】Ｂ．プラスミノーゲンアクチベータに対す
るアガロースプレートアッセイ これらのプラスミノーゲンアクチベータに対する高感度
アッセイはプラスミノーゲン（プラスミノーゲンSigma
Ａ−６８７７を１mg／mlにて１００容量の５０mM Ｔｒ
ｉｓ／ＨＣｌ（pH８．０）中に溶解し、そしてそれに対
して２回透析することにより調製された原液）或いはカ
ゼイン（非−脂肪ミルクとして添加）、或いはフィブリ
ン（フィブリノーゲン＋トロンビンとして添加）が添加
されたアガロースゲルを使用する。プラスミノーゲンア
クチベータを含有する試料を４mm厚のアガロース層中に
開けられた穴に適用し、そしてゲルを引続いて３７℃で
インキュベートする。
【０２１８】次いで、酵素活性は、プラスミノーゲンア
クチベータが試料ウエルから放射状に拡散し、ゲル内の
プラスミノーゲンをプラスミンに転換し、それが次いで
カゼイン或いはフィブリンを消化してサンプルウエルの
周りの不透明なゲル内に透明なハローを生成することに
より検知される。ハローの半径（試料ウエルの縁から測
定）が活性化されたプラスミノーゲン量の目安である。
このアッセイは添加されたプラスミノーゲンアクチベー
タの量に直線的応答を示さない。低い量のプラスミノー
ゲンアクチベータのアッセイのためにはインキュベーシ
ョンは数日間延長することができる。カゼインアッセイ
の操作及び検量は２％（ｗ／ｖ）ｃａｒｎａｔｉｏｎ非
−脂肪ミルク粉末の代りにMigros Corp.（スイス）から
の１２．５％（ｖ／ｖ）殺菌（ＵＨＴ）無脂肪ミルクを
用いた他はTang et al. 〔Ann.N.Y.Acad.Sci. 434 , 53
6-540 (1984)〕に記載されたものと同様であった。
【０２１９】フィブリン〔Granelli-Piperno and Reic
h, J.Exp.Med. 148 , 223-234 (1978)〕が基質として
用いられた場合には、０．２ｇアガロースが１５mlの
０．９％ＮａＣｌに溶解され、４２℃に冷却された。こ
の時点において、８０mgのウシフィブリノーゲン（Sigm
a Ｆ−８６３０）を含有する５mlの０．９％ＮａＣｌ、
０．１mlのプラスミノーゲン溶液（上記）及び０．１ml
の１００mg／mlナトリウムアジドが４２℃で添加され
た。最後に、０．２mlのウシトロンビン（Sigma Ｔ−６
６３４、１６．６ NIH単位／mlで０．９％ＮａＣｌ中に
溶解）を添加し、混合物を迅速にペトリ皿（８cm直径）
中に注ぎ１時間で室温に冷却した。得られたゲルは約４
mm厚であり、４℃で数日間貯蔵することができるか或い
は上記カゼイン含有ゲルと同様に直ちに用いることがで
きた。
【０２２０】Ｃ．ハムスター細胞におけるハイブリッド
ＰＡタンパク質の生産 ＣＨＯ ＤＵＫＸＢ１細胞を上記の如く（実施例２０
Ａ）、それぞれプラスミドｐＢＲ１Ａ，ｐＢＲ１Ｂ，ｐ
ＢＲ２Ａ，ｐＢＲ２Ｂ，ｐＢＲ３Ａ，ｐＢＲ３Ｂ，ｐＢ
Ｒ４Ａ，ｐＢＲ５，ｐＢＲ７，ｐＢＲ８，ｐＣＧＣ１，
ｐＣＧＣ２，ｐＣＧＣ３，ｐＣＧＣ４ａ，ｐＣＧＣ５，
ｐＣＧＣ６，ｐＣＧＣ７及びｐＣＧＣ８のＤＮＡで形質
転換した。コロニーは１０日目頃に現われ、コロニーを
１５日目頃上記の如く拾い上げ２週間後に細胞数は上記
の如くＰＡを測定するのに十分増加した。未形質転換細
胞及び挿入ＳａｃＩ断片をアンチセンス方向に含有する
ｐＢＲ１Ｂ，ｐＢＲ２Ｂ，ｐＢＲ３Ｂで形質転換された
細胞系統は検出可能な量のＰＡを産生しなかった。
【０２２１】Ｄ．形質転換ＣＨＯ細胞により条件化され
た培地中における酵素活性 プラスミド形質転換及び対照ＣＨＯ細胞からの条件化培
地はヌクレオシド類及び５％ウシ胎児血清を有するアル
ファ−ＭＥＭ中において２００，０００−５００，００
０細胞／mlを２４時間培養することにより調製され、そ
して０．０３mlをカゼイン或いはフィブリンを含有する
アガロースプレート上で下記に示す時間インキュベート
した。フィブリンプレート上では、おそらく内在ハムス
ターｔ−ＰＡによる最小のバックグラウンド活性がＤＵ
ＫＸＢ１条件化培地中に検出された。ハイブリッドタン
パク質の試料が３μｌのウサギ抗−ｔＰＡ抗体（精製Ｂ
ｏｗｅｓメラノーマｔ−ＰＡに対して産生）或いは抗−
ウロキナーゼ抗体（Ｓｅｒｏｎｏウロキナーゼに対して
産生）と混合された場合にはカゼインプレート上にはハ
ローが現われない。抗−ｔＰＡ抗体はｕ−ＰＡ酵素を阻
害せず、又抗ウロキナーゼ抗体もｔ−ＰＡを有意な程度
に阻害しない。これらの結果を表４にまとめて示す。
【０２２２】
【表４】
【０２２３】実施例２１：ハイブリドーマ細胞の調製及
びモノクローナル抗体の単離 ａ）免疫原：推定純度＞９０％を有する準−精製天然ヒ
トの試料（メラノーマｔ−ＰＡ）。 ｂ）免疫感作実験方法：１０〜１４週令のＢＡＬＢ／ｃ
マウス（Tierfarm Sisseln, スイス）三つの群を完全フ
ロイントアジュバント（Difco ）中に乳化した１００μ
ｇのメラノーマｔ−ＰＡを二つの後足及び皮下に注射す
ることにより免疫感作した。引続いて第１群（Nr. ４０
５）には毎週６週間に亘り１０μｇの不完全アジュバン
ト中のｔ−ＰＡを投与したのに対し、第２群（４０６）
には同一量を２週間ごとに投与した。第３群（４０７）
には３週間間隔で２回５０μｇのｔ−ＰＡを与えた。全
ての動物を４週間目及び８週間目に採血した。最後の注
射ではＰＢＳ中１００μｇが腹腔内に与えられ、そして
４日後に脾臓細胞を標準的操作によりＳＰ２／ｏミエロ
ーマ系統と融合せしめた。高抗−ｔ−ＰＡ抗体力価を有
するマウスのみを融合に用いた。
【０２２４】ｃ）細胞融合：全ての融合実験は G.Koehl
er及びC.Milstein〔 Nature 256 , 495 (1975)〕に従っ
て非分泌Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ系統〔M.Shul
man, C.D.Wilde及びG.Koehler, Nature 276 , 269 (197
8)〕を用いて行った。１０8 個の脾臓細胞を１０7 個の
ミエローマ細胞と１mlの５０％ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ１５００、Serva ）の存在下において混合し
た。洗浄後、細胞を４８mlの標準ダルベッコ最小必須培
地（Gibco No.０４２２５０１）中に再浮遊させた。融
合当り３×１０6 個の正常マウス腹腔浸出液細胞をフィ
ーダー細胞として添加した。これらの細胞は４８×１ml
コスターウエル中に分配され、毎週３回標準ＨＡＴ選択
培地が３〜６週間に亘って供給された。
【０２２５】ハイブリドーマ細胞の生育が目に見えるよ
うになった時点で、上澄液を直接抗原結合アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）及び中和（カゼイン）アッセイ（下記参照）
の両方によりスクリーニングした。四つの融合実験の結
果は次の通りである。接種した１９２個のウエルのう
ち、１９２個のハイブリドーマが得られた。それらのう
ち、２４個は抗−ｔ−ＰＡ抗体を産生した。２４個の陽
性ハイブリドーマのうち１４個がクローニングされ、得
られた５７４個のクローンから３１が抗−ｔ−ＰＡｍＡ
ｂを安定に産生することが判明した。これらの内、３個
（クローン４０５Ｂ．３３．３，４０６Ａ．２３．７、
及び４０７Ａ．１５．２７）をマウスに注射し、腹水を
更に研究するために生産した。
【０２２６】ｄ）モノクローナル抗体の単離及び精製 ８〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（Tierfarm Sissel
n, スイス）を０．３mlプリスタン（Aldrich ）により
腹腔内前処理した。２〜３週間後２〜５×１０6個のク
ローニングされたハイブリドーマ細胞４０５Ｂ．３３．
３，４０６Ａ．２３．７及び４０７Ａ．１５．２７、並
びに０．２mlのプリスタンを腹腔内に接種した。８〜１
０日後腹水を集め、８００×ｇで遠心分離し、−２０℃
で貯蔵した。
【０２２７】解凍された腹水を５００００×ｇで６０分
間遠心分離した。表面に浮かぶ脂肪層を注意深く取除き
タンパク質濃度を１０〜１２mg／mlの濃度に調整した。
粗製イムノグロブリンを０．９容量等量の飽和硫酸アン
モニウムを０℃で滴加することにより沈澱させ、次いで
２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０mM ＮａＣｌ（pH７．
９）中に溶解し、同一緩衝液に対して透析した。イムノ
グロブリン画分は２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２５−４
００mM ＮａＣｌ（pH７．９）の緩衝液勾配系を用いて
ＤＥＡＥ−Ｄ５２セルロース（Whatman ）クロマトグラ
フィにより得られた。このイムノグロブリンを再び硫酸
アンモニウムで沈澱させ、ＰＢＳ中に１０mg／mlの濃度
で溶解した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は９５％を越える
モノクローナル抗体の純度を示す。
【０２２８】ｅ）モノクローナル抗体のクラス及びサブ
クラスの決定 クローン化されたハイブリドーマ細胞により産生される
モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスはクラス及
びサブクラス特異的ウサギ抗体（Bionetics ）を用いて
Ouchterlonyの公知の免疫拡散技術（寒天−ゲル免疫拡
散法）により決定した。ｍＡｂｓのサブクラスは下記の
通りである： ４０５Ｂ．３３．３：γ1 κ ４０６Ａ．２３．７：γ2 ｂκ ４０７Ａ．１５．２７：γ2 ｂκ
【０２２９】ｆ）酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）：
マイクロタイタープレートを、ウエル当り０．５μｇの
１００μｌ ＰＢＳ中ｔ−ＰＡ調製物（純度＞９５％）
で被覆した。このプレートの遊離結合能力を０．２％
ＮａＮ3 （ｗ／ｖ）（pH７．４）を含有するＰＢＳ中
０．２％ゼラチンの緩衝液で飽和した。それぞれモノク
ローナル抗体４０５Ｂ．３３．３、４０６Ａ．２３．７
及び４０７Ａ．１５．２７を含有する１００μｌのプロ
ーブをウエル内で３７℃で２時間インキュベートした。
プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ
で洗浄し、次いでホスファターゼ結合ウサギ抗−マウス
イムノグロブリン調製物と共に３７℃で２時間インキュ
ベートした。固定された酵素を、酵素基質ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート〔０．５mM ＭｇＣｌ2 及び０．０
２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3 、pH９．８を含有するジエタノ
ールアミン緩衝液１０％中１mg／ml〕と共にインキュベ
ート（３７℃、３０〜６０分）することにより発色せし
め、そして４０５nmにおける光学密度を測定した。
【０２３０】同じＥＬＩＳＡをウロキナーゼを用いて行
った。ｍＡｂのいづれもウロキナーゼに結合しなかっ
た。全てのｍＡｂはｔ−ＰＡ特異性であった。 ｇ）カゼイン溶解アッセイ（中和試験）：ｍＡｂ類の阻
害作用を求めるために、ｔ−ＰＡを先ずそれぞれｍＡｂ
４０５Ｂ．３３．３，４０６Ｂ．２３．７及び４０７
Ａ．１５．２７と混合し、４℃で３０〜６０分間インキ
ュベートした後、通常のカゼイン／プラスミノーゲン寒
天アッセイを行った（実施例２０Ｂ参照）。ｍＡｂのい
づれも、ｍＡｂ ４０５Ｂ．３３．３がカゼイン溶解に
おいて遅れ（６時間を越える）を引起こす他は、ｔ−Ｐ
Ａ活性を阻害しなかった。
【０２３１】実施例２２：ハイブリッドプラスミノーゲ
ンアクチベータの精製、一般的操作 形質転換された酵母細胞からの抽出液を実施例１６と同
様にして調製した。プラスミドにより形質転換された哺
乳動物細胞例えばＣＨＯ細胞からの抽出液は下記の様に
して調製された。細胞を先ず７０〜８０％のコンフルエ
ンスまで培養した。次いで細胞単層を血清を省略する以
外は上記と同様に培地で濯ぎ、次いで細胞を更に５〜７
日間培養した。培地を２４時間毎に採集し、同時に新し
い培地を細胞に供給した。この様にして得られた条件化
培地を次いで５０００×ｇで３０分間遠心分離し、０．
４５μｍフィルターを通して濾過して望ましくない細胞
破片を除去してアフィニティクロマトグラフィを行っ
た。アフィニティマトリックスとしてはエリスリナ・ラ
テシマ（Erythrina latissima ）からの固定化プロテ
アーゼ阻害剤ＤＥ−３、或いはｕ−ＰＡ又はｔ−ＰＡに
対する固定化抗体のいづれかが用いられた。
【０２３２】ｔ−ＰＡの触媒作用Ｂ−鎖を含有するハイ
ブリッドＰＡを、上記の如く調製された条件化培地から
或いはメラノーマ細胞−条件化培地から、酵母細胞抽出
液からのｔ−ＰＡの精製のために元々開発された実験方
法〔C.Heussen et al., J.Biol.Chem. 259 , 11635-11
638 (1984)参照〕を用いて精製する。全てのハイブリッ
ドＰＡ類は、親ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ酵素に対してウサ
ギ或いはヤギ中で産生されたポリクローナル抗体を用い
て、或いは親酵素に対して産生されたモノクローナル抗
体（マウス起源）（これらが問題のハイブリッドＰＡ内
に存在するエピトープを認識する場合）を用いて精製さ
れた（実施例２１参照）。選択された抗体はＡｆｆｉｇ
ｅｌ或いはＳｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂなどの不溶性マト
リックス上に固定化された。
【０２３３】上記の如く調製された条件化培地或いは酵
素細胞抽出液を次いでアフィニティ−マトリックスのカ
ラムにかけ、望ましくないタンパク質を適当な緩衝液例
えばダルベッコのＰＢＳ〔０．１ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 、
０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ、０．２ｇ／ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 、
０．０４７ｇ／ｌ ＭｇＣｌ2 、８．０ｇ／ｌ ＮａＣ
ｌ、１．１５ｇ／ｌ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ；J.Exp.Med. 9
9，167 (1954)〕を用いて洗流し、次いでＰＡをカオト
ロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤チオシアン酸カリ
ウム〔M.Einarsson et al., Biochem.Biophys.Acta 83
0 , 1-10 (1985)〕或いは低pH緩衝液例えば０．１−
０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ（pH２．１）を用いてカラム
から溶出した。モノクローナル抗体を用いる精製の後、
ハイブリッドＰＡ類は９０％を越える純度を有する。
【０２３４】実施例２３：ＵＫ2 ＴＰＡB （ＢＣ）の精
製 ａ．ＤＥ−３ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム
の調製 シアノーゲンブロマイド活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４
Ｂ（登録商標）（Pharmacia ）に、ml当り５mgのエリス
リナ・ラティシマ（Erythrina latissima ）からの精
製された阻害剤〔F.J.Joubert et al., Hoppe-Seyler's
Zeitschr.Physiol.Chem. 302. 531 (1981) 〕を製造元
の指示事項にに従ってカップリングさせた。マトリック
スを０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１％Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉ
ｃ（登録商標）及び０．０２％ナトリウムアジドを含有
する０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液pH７．０で平衡化
させた。
【０２３５】ｂ．ＤＥ−３ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ
（登録商標）上でのＵＫ2 ＴＰＡB （ＢＣ）のクロマト
グラフ精製 条件化培地（実施例２２参照）をＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ
（登録商標）に対して０．１％とし、次いでＤＥ−３
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）にかけた。４℃で１時
間ゆっくり攪拌後、ＤＥ−３ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４
Ｂ（登録商標）をカラムに注ぎ２８０nmにおけるＵＶ吸
光度が溶出液中のタンパク質の不存在を示すベースライ
ンレベルに到達するまで０．２mM ＮａＣｌ、０．１％
Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃで洗浄した。
【０２３６】洗浄を次いで０．２Ｍチオシアン酸アンモ
ニウム及び０．１％Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃを含有する
０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH７．０）を用いて
継続した。２８０nmにおけるＵＶ吸光度が溶出液中のタ
ンパク質の不存在を示した後、カラムを１．６Ｍチオシ
アン酸アンモニウム及び０．１％Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ
（登録商標）を含有する０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝
液（pH７．０）で溶出した。 Cbz-Gly-Gly-Arg-AMCを基
質として用いる〔M.Zimmerman et al., Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA. 75, 750 (1978)〕螢光定量アッセイを用い
て測定した最高のアミド分解活性を有する画分をプール
した。ＤＥ−３ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（登録商
標）物質に適用された活性の少なくとも８０％が単一ピ
ーク内に回収された。
【０２３７】プールされた活性画分を、０．１％Ｓｙｎ
ｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）を含有する０．２Ｍ酢酸ア
ンモニウム緩衝液に対して透析し、内在ｔ−ＰＡを除去
するために、ｔ−ＰＡの第１クリングル領域に向けられ
たモノクローナル抗体であって、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ（登録商標）にカップリングされ、そして０．１％
Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）を含有する０．２Ｍ
酢酸アンモニウム緩衝液中（pH７．０）で平衡化された
モノクローナル抗体４０７Ａ．１５．２７を含有するカ
ラムにかけた。ＵＫ2 ＴＰＡB （ＢＣ）を含有する抽出
液を集めた。
【０２３８】寸法４×１１０mmを有するＮｕｃｌｅｏｓ
ｉｌ（登録商標）３００−５−Ｃ１８カラム上での精製
ＵＫ2 ＴＰＡB （ＢＣ）の逆相ＨＰＬＣは、０．１％ト
リフルオロ酢酸を含有する水よりなる溶液Ａ ７０％及
び０．０８％のトリフルオロ酢酸を含有するアセトニト
リルよりなる溶液Ｂ ３０％から出発し、そして４０％
Ａ及び６０％Ｂで終る３０分間に亘る線形勾配による溶
出で単一ピークを示す。この精製タンパク質は最初の１
０個のアミノ酸残基のＮ−末端配列分析をした際に配列
SNELHQVPSNを示し、これはこの分子をコードするＤＮＡ
配列から期待された配列と同一であった。
【０２３９】実施例２４：ＦＫ2 ＵＰＡB （ＢＣ）及び
Ｋ2 ＵＰＡB （ＢＣ）の精製 ａ．抗体アフィニティカラムの調製 ウサギ抗−ｕＰＡ血清から精製したウサギ抗−ｕＰＡ抗
体、並びにモノクローナル抗体４０５Ｂ．３３．３及び
４０６Ａ．２３．７を、活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓ
ｅml当り６mgの抗体を用いて、製造者の指示事項に従っ
てシアノーゲンブロマイド活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ（登録商標）（Pharmacia ）にカップリングした。
ゲルマトリックスは０．１％Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登
録商標）及び０．１％のナトリウムアシドを含有するＰ
ＢＳで平衡化した。
【０２４０】ｂ．抗体Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ上のＦ
Ｋ2 ＵＰＡB （ＢＣ）及びＫ2 ＵＰＡ B （ＢＣ）上のク
ロマトグラフ精製 条件化培地（実施例２２参照）をＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ
（登録商標）に関して０．１％とし、抗−ｕＰＡ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂ或いは４０５Ｂ．３３．３或いは
４０６Ａ．２３．７ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂにかけ
た。後者の二つの抗体はｔ−ＰＡの第２クリングルドメ
インに向けられたものであった。４℃において２時間ゆ
っくり攪拌後、抗体Ｓｅｐｈａｒｏｓｅをカラム内に注
ぎ、２８０nmにおけるＵＶ吸光度が溶出液におけるタン
パク質の不存在を示すまで１ＭＮａＣｌ及び０．１％Ｓ
ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）を含有するＰＢＳで洗
浄した。カラムを次いで０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝
液（pH２．５）で溶出した。画分を中和量の１Ｍ Ｔｒ
ｉｓを含有する管内に集めた。 Cbz-Gly-Gly-Arg-AMCを
基質として用いる螢光定量アッセイ〔M.Zimmermann et
al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 75, 750 (1978) 〕で測
定した高度アミド分解活性を含有する画分をプールし
た。
【０２４１】寸法４×１１０mmを有するＮｕｃｌｅｏｓ
ｉｌ（登録商標）３００−５−Ｃ１８カラム上での精製
ＦＫ2 ＵＰＡB （ＢＣ）及びＫ2 ＵＰＡB （ＢＣ）の逆
相ＨＰＬＣは、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水
よりなる溶液Ａ ７０％及び０．０８％のトリフルオロ
酢酸を含有するアセトニトリルよりなる溶液Ｂ ３０％
から出発し、そして４０％Ａ及び６０％Ｂで終る３０分
間にわたる直線勾配による溶出で単一ピークを示す。精
製タンパク質の最初の５個の残基のＮ−末端配列分析の
結果、Ｋ2 ＵＰＡB （ＢＣ）について配列 SYQGN、及び
ＦＫ2 ＵＰＡB（ＢＣ）について配列 SYQVIが得られ、
これらは化分子のＤＮＡ配列から期待される配列に同一
であった。
【０２４２】実施例２５：フィブリノーゲン断片の存在
下或いは不存在下におけるハイブリッドプラスミノーゲ
ンアクチベータの活性測定 プラスミノーゲンアクチベータによるプラスミノーゲン
のプラスミンへの転換、及びこれに続くプラスミンと発
色プラスミン基質Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−
ロイシン−ｐ−ニトロアニリン二塩酸塩との反応に基づ
き、Verheyen et al. 〔Thromb.Haemost. 48, 266 (198
2)〕により記載されている二重速度アッセイを用いた。
このアッセイは９６個のウエルを有するマイクロタイタ
ープレート中においてＴｉｔｅｒｔｅｋ（登録商標）マ
イクロタイタープレート読取器を用いて行った。
【０２４３】これらのウエルは、０．１％Ｔｗｅｅｎ８
０を含有する０．１モル／ｌ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液
（pH７．５）１２０−Ｘμｌ、上記Ｔｒｉｓ緩衝液中
１．３μモル／ｌのＧｌｕ−プラスミノーゲン２０μ
ｌ、Ｔｒｉｓ緩衝液中０．７ｍモル／ｌのプラスミン基
質１００μｌ、公知濃度の試料（Ｘはそれぞれ１０，２
０，４０及び６０μｌに対応する）Ｘμｌ或いは国際単
位で表わされた規定された活性のウロキナーゼ標準Ｘμ
ｌ、及び蒸留水中３mg／mlの刺戟剤（フィブリノーゲン
断片）１０μｌ或いは実験が刺戟剤なしに行われる場合
には１０μｌの蒸留水、を含有する。インキュベーショ
ン時間の平方で除された光吸収の増加は、既知アクチベ
ータ濃度におけるプラスミノーゲンアクチベータ活性に
比例し、国際単位で表わされる。
【０２４４】国際単位で表わされる定義された活性を有
する高分子量ウロキナーゼ（American Diagnostics）が
標準として用いられた。各プラスミノーゲンアクチベー
タはそれぞれフィブリノーゲン断片の不存在下或いは存
在下において同一条件下で分析された。これらの条件下
において得られた活性の差異はフィブリノーゲン断片に
よるプラスミノーゲンアクチベータの刺戟の目安とな
る。表５は分析結果を示し、それはウロキナーゼの触媒
作用ドメインを含有する新規プラスミノーゲンアクチベ
ータ分子に対してフィブリノーゲン断片により及ぼされ
る刺戟とは対照的に、ウロキナーゼ標準に対する刺戟の
不存在を示す。組織プラスミノーゲンアクチベータの１
個以上の非触媒作用ドメインＦ，Ｇ，Ｋ１、或いはＫ２
の不存在の如何に拘らず全ての試験されたハイブリッド
分子に対してフィブリノーゲン断片による刺戟が観察さ
れた。
【０２４５】
【表５】
【０２４６】実施例２６：変異体プラスミノーゲンアク
チベータの血餅溶解活性 血餅溶解活性は R.D.Philo及びP.J.Gaffney 〔Thromb.H
aemost. 45, 107-109(1981)〕により記載されたアッセ
イを用いて求めた。溶解時間対プラスミノーゲンアクチ
ベータ濃度の対数プロットの結果、直線が得られた。プ
ラスミノーゲンアクチベータの比活性は組織プラスミノ
ーゲンアクチベータ或いはウロキナーゼの標準調製物か
ら得られた曲線と対比することにより得られた。
【０２４７】測定された全てのアクチベータの曲線は血
餅溶解に必要とされた時間とそれらの比活性の直接の関
係を許容するほぼ同一の傾斜を有した。異ったプラスミ
ノーゲンアクチベータは同一分子量を有しないので、異
った分子の効率に対して意味のある標準を得るために
は、通常の重量濃度の代りに比活性をモル濃度で表わさ
なければならない。ＵＫ2 ＴＰＡB （ＢＣ）は少なくと
も標準ｔ−ＰＡと同程度に活性であることが判明したの
に対し、ＦＧＫ2 ＵＰＡB （ＢＣ）及びＦＫ2 ＵＰＡB
（ＢＣ）は殆んどｔ−ＰＡに等しいが、しかし、ｕ−Ｐ
Ａ標準よりは相当に高い活性を示した。Ｋ2 ＵＰＡ
B （ＢＣ）はｕ−ＰＡ標準と殆んど同一の活性を有する
ことが判明した。分析活性を表６にまとめて示す。
【０２４８】
【表６】
【０２４９】実施例２７：プラスミノーゲンアクチベー
タ変異体分子のウサギの循環系からのクリアランス １．標準化 全ての変異体分子をヨードゲン法〔 P.J.Fraker et a
l., Biochem.Biophys.Res.Comman. 80, 849-857 (197
8)〕を用いて 125Ｉで放射線標識化した。過剰の遊離
125Ｉを除去するために、変異体分子を実施例３（ｔ−
ＰＡ Ｂ−鎖を有するＰＡ）に記載される方法或いは実
施例２４（ｕ−ＰＡ Ｂ−鎖を有するＰＡ）に記載され
る方法のいづれかを用いてアフィニティ精製した。２−
２０μCi／μｇタンパク質の比放射性活性が通常得られ
た。標識化された分子の均質性はＳＤＳ電気泳動に引続
き、Ｘ−線オートラジオグラフィを行って推定した。全
ての場合において、変異体分子は非還元化条件下におい
て単一バンドとして移動し、そしてＭｒは非標識化タン
パク質と同一であった。
【０２５０】２．クリアランス研究 実験は１．８〜２．４kgの体重のニュージーランド白色
ウサギにおいて行った。これらの動物は１７５０mg／kg
のＵｒｅｔｈａｎ（登録商標）（Merck, Darmstadt, 西
ドイツ）を用いて皮下投与麻酔した。気管切開を行い、
プラスチックチューブを外部頸静脈及び共通頸動脈に挿
入した。変異体ＰＡ約３００〜５００ngを含有する０．
５mlリン酸緩衝塩溶液を頸静脈中に注射し、そして逐次
血液試料（各２ml）を頸動脈を介して６０分間に亘って
逐次獲得した。血液試料をクエン酸塩上に集め、直ちに
３０００rpm で１５分間遠心分離し、血漿を傾瀉分離し
た。アリコートを１０％トリクロロ酢酸中で沈澱させペ
レットをγ−カウンター中でカウントした。Ｂｏｗｅｓ
メラノーマ細胞系統から単離したｔ−ＰＡに対比して、
変異体分子は循環系における次の様な半減期を示す。
【０２５１】
【表７】 ｔ−ＰＡのクリアランスパターンは典型的に極めて迅速
なα−期に引続きより遅いβ−期クリアランスを伴い、
典型的に二次指数的である。ＵＫ2 ＴＰＡB （ＢＣ）及
びＫ2 ＵＰＡB （ＢＣ）のクリアランスは殆んど単相的
であり、第二コンパートメントへの分布が抑制されてい
ることを示唆する。
【０２５２】３．器官分布 ウサギは上記の如く処理した。ヨード化変異体分子の注
射の２０分後にウサギを殺し、主たる器官を取出し重量
を測定し、均質化後のアリコートをγ−カウンター中で
カウントした。
【０２５３】
【表８】 変異体ＰＡは、放射性活性分子の大部分がなお循環系
（上記）に残存することを示し、はるかに減少した肝臓
−クリアランスと一致する。肝臓による減少した摂取は
従って、変異体分子特にＵＫ2 ＴＰＡB （ＢＣ）及びＫ
2 ＵＰＡB （ＢＣ）の延長された半減期及び単相クリア
ランスパターンに対する説明となる。
【０２５４】実施例２８〜３４においては、プラスミド
ｐＣＧＣ５／Ｋ2 ＵＰＡB ，ｐＣＧＣ６／ＦＵＰＡB ，
ｐＣＧＣ７／ＦＫ2 ＵＰＡB 及びｐＣＧＣ８／ＦＧＫ2
ＵＰＡB （実施例１８参照）を用いて酵母発現プラスミ
ドを造成した。酵母インベルターゼシグナル配列を異る
コード化配列にインフレーム融合した。それらは誘導性
ＰＨＯ５プロモーターの制御下に発見された。ある造成
体においては、グリコシル化部位を変異させた。
【０２５５】実施例２８：ファージＦ１複製原の発現ベ
クターｐＪＤＢ２０７中へのクローニング ｐＥＭＢＬ系のプラスミド〔Dente et al., Nucl.Acids
Res. 11, 1645-55 (1983)〕はＤＮＡ複製及び形態形成
に対する全てのシス−作用要素を与えるファージＦ１ゲ
ノムの領域を含有する。ファージＦ１（ヘルパー）によ
るスーパーインフェクション時にのみ多量の一本鎖プラ
スミドＤＮＡが培地中に排出される。プラスミドｐＥＭ
ＢＬ１９（＋）をＳｃａＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。
ｐＢＲ３２２（ＳｃａＩ部位）のアンピシリン耐性遺伝
子の部分、Ｆ１遺伝子間領域及びポリリンカー領域（Ｅ
ｃｏＲＩ部位）までのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の部
分を含有する２．２kb断片を単離した。
【０２５６】プラスミドｐＪＤＢ２０７をＨｐａＩで切
断することにより線状化した。１０μｇの線状化された
プラスミドを０．１mg／mlのエチジウムブロマイドの存
在下において３７℃において２４０分間７．５単位のＥ
ｃｏＲＩで部分的に消化した。反応は１０mM ＥＤＴＡ
を添加することにより停止した。１．８kbのＥｃｏＲＩ
−ＨｐａＩ断片を調製０．８％アガロースゲル上で単離
した。
【０２５７】３μｇのＨｐａＩ切断ｐＪＤＢ２０７を更
にＳｃａＩで消化した。４．８kbの大ＨｐａＩ−Ｓｃａ
Ｉ断片を単離した。ＤＮＡ断片をアガロースゲルブロッ
クから電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグラフィ及びエタ
ノール沈澱により精製した。各々０．２ｐモルの２．２
kb ＳｃａＩ−ＥｃｏＲＩ断片及び１．８kb ＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｐａＩ断片、並びに０．１ｐモルのＨｐａＩ−Ｓ
ｃａＩベクター断片を連結した。この連結混合物を用い
てコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１Ｃａ2+細胞を
形質転換した。１２個のアンピシリン耐性コロニーのプ
ラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ二重消化により
分析した。正しい制限断片を有する単一クローンのＤＮ
Ａを選択し、ｐＪＤＢ２０７ Ｆ１ｌａｃと称する。
【０２５８】実施例２９：プラスミドｐＪＤＢ２０７／
ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＫ2 ＵＰＡB の造成 プラスミドｐＣＧＣ７／ＦＫ2 ＵＰＡB に存在するＦＫ
2 ＵＰＡB のコード配列を、酵母インベルターゼシグナ
ル配列を融合し、そしてこの遺伝子をＰＨＯ５プロモー
ターの制御下に発現することにより酵母内で発現するよ
う適応させた。プラスミドｐＣＧＣ７／ＦＫ2 ＵＰＡB
（実施例１８Ｄ参照）をＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで消化
した。この１１４７bp ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片はｔ
−ＰＡのヌクレオチド位置１９９におけるＰｓｔＩ部位
（図１）からｕ−ＰＡの位置１３２２におけるＢａｍＨ
Ｉ部位（図６）までのＦＫ2 ＵＰＡB コード配列を含有
する。
【０２５９】プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ
−ＴＰＡ（実施例６Ｃ参照）をＳａｌＩ及びＰｓｔＩで
切断した。８９１bp断片を単離した。それはＰＨＯ５プ
ロモーター、インベルターゼシグナル配列及びｔ−ＰＡ
の１９塩基（ＰｓｔＩ部位）を含有する。プラスミドｐ
ＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＵＰＡ（実施例８参照）
をＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化した。６．６kbベクタ
ー断片はヌクレオチド位置１３２３（図６）におけるＢ
ａｍＨＩ部位から位置１４４１（付加したＸｈｏＩリン
カーのＰｖｕII部位）及びＰＨＯ５転写停止シグナルま
でのｕ−ＰＡ遺伝子の３′部分を含有する。
【０２６０】各々０．２ｐモルの８９１bp ＳａｌＩ−
ＰｓｔＩ断片及び１１４７bp ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断
片及び０．１ｐモルの６．６kb ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ
ベクター断片を連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ Ｃ
ａ2+細胞の形質転換に用いた。８アンピシリン耐性コロ
ニーをアンピシリン（１００mg／ｌ）を含有するＬＢ培
地中において生育せしめた。プラスミドＤＮＡを単離
し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII 制限消化により分析し
た。期待された制限断片を有する一つのプラスミドを選
びｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＫ2 ＵＰＡB と称
する。プラスミドｐＣＧＣ６／ＦＵＰＡB 及びｐＣＧＣ
８／ＦＧＫ2 ＵＰＡB をｐＣＧＣ７／ＦＫ2 ＵＰＡB と
同様にして使用することができる。得られた酵母発現プ
ラスミドをそれぞれｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−Ｆ
ＵＰＡB 及びｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＧＫ2
ＵＰＡB と称する。
【０２６１】実施例３０：ウロキナーゼＢ−鎖の〔Ａｓ
ｎ３０２〕におけるグリコシル部位の突然変異 ａ）ｕ−ＰＡのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片のＭ１３ｍｐ
１８中へのクローニング：プラスミドｐＪＤＢ２０７／
ＰＨＯ５−Ｉ−ＵＰＡ（実施例８参照）はウロキナーゼ
の完全コード領域を含有する。このＤＮＡをＰｓｔＩ及
びＢａｍＨＩで切断した。ウロキナーゼ遺伝子からの８
８６bp ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片はヌクレオチド位置
１０３３−１０４１にグリコシル部位（Ａｓｎ３０２）
を含有する。同様な大きさのもう一つの断片を更にＢｓ
ｔＥIIにより切断した。この８８６bp ＰｓｔＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片を調製０．８％アガロースゲル上で単離し
た。
【０２６２】Ｍ１３ｍｐ１８ ＲＦ−ＤＮＡをＰｓｔＩ
及びＢａｍＨＩで切断した。この７．３kb断片を調製用
０．８％アガロースゲル上で単離した。ＤＮＡ断片をア
ガロースゲルから電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグラフ
ィ及びエタノール沈澱により精製した。０．１ｐモルの
７．３kb ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ切断ベクター及び０．
２ｐモルの８８６bp ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ ｕ−ＰＡ
断片を連結した。この連結混合物の１μｌ及び３μｌを
用いてAmershamにより発行されたマニュアル "M13 Clon
ing and sequencing handbook"に従ってＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９ Ｃａ2+細胞の形質転換を行った。１２個の
無色プラークを拾い上げ、一本鎖ＤＮＡを調製した〔J.
Messing, Methods in Enzymology 101 , 21-78 (198
3)〕。
【０２６３】この一本鎖ＤＮＡを用いてＭ１３万能プラ
イマーをクレノウポリメラーゼでアニーリングし、延長
することにより部分的に二本鎖ＤＮＡを調製した。反応
生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡを
エタノールで沈澱させた。このＤＮＡをＰｓｔＩ及びＢ
ａｍＨＩで切断した。８８６bp断片はｕ−ＰＡ断片がＭ
１３ｍｐ１８ベクターにクローン化されたことを示す。
一つのクローンを更に分析し、正しいインサートが配列
決定により確認された。このクローンをＭ１３ｍｐ１８
／ＵＰＡと称する。
【０２６４】ｂ）Ａｓｎ３０２におけるグリコシル化部
位の突然変異：
【表９】
【０２６５】突然変異誘発及び配列決定プライマーはホ
スホルアミダイト法〔M.H.Caruthers, in : Chemical a
nd Enzymatic Synthesis of Gene Fragments（編者 H.
G.Gassen and A.Lang) Verlag Chemie, Weinheim,ドイ
ツ連邦共和国〕を用いてApplied Biosystem Model 380B
シンセサイザー上で合成した。一本鎖鋳型ＤＮＡ上での
ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発はT.A.Kunkel〔Proc.Na
t.Acad.Sci.USA 82, 488-492 (1985)〕により記載され
るようにして行った。ウラシル含有一本鎖鋳型ＤＮＡを
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＲＺ１０３２（ｄｕｔ- ，ｕｎｇ- ）
の１サイクルの増殖により生産した。
【０２６６】１００ｐモルの突然変異誘発オリゴヌクレ
オチドプライマーＷを２０μｌの５０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、５mM ＤＴＴ、
０．５mM ＡＴＰ及び２０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（Boehringer）中でホスホリル化した。３７℃で
３０分後、反応を７０℃で１０分間加熱することにより
停止した。０．３ｐモルのウラシル含有Ｍ１３ｍｐ１８
／ＵＰＡ鋳型ＤＮＡを１０ｐモルのホスホリル化突然変
異誘発オリゴデスオキシリボヌクレオチドプライマーＷ
及び１０ｐモルのＭ１３万能配列決定プライマーと３０
μｌの１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０、１０mM
ＭｇＣｌ2 中でインキュベートした。試料を８０℃に加
熱し、小さな水浴中において室温まで冷却した。
【０２６７】ｃ）延長−連結反応：上記アニーリングさ
れた試料に１０μｌの１mM ｄＮＴＰS 、１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ pH８．０、１０mM ＭｇＣｌ2 、２０mM
ＤＴＴ、１mM ＡＴＴ、４００単位Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼ（Biolabs, ４００Ｕ／μｌ）及び６単位のクレノ
ウＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer, ６Ｕ／μｌ）を含
有する酵素−ｄＮＴＰ混合物を添加した。インキュベー
ションは１５℃で一昼夜行われた。
【０２６８】ｄ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１細胞の形質
転換：この連結混合物をＴＥで２００μｌに稀釈した。
この延長−連結混合物の０．１μｌ，１μｌ及び１０μ
ｌをコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１ Ｃａ2+細
胞（Kunkel, 上記）に添加した。氷上で３０分後細胞を
４２℃において３分間ヒートショックを与え、次いで氷
上に保った。細胞を上層寒天及びＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０
１インジケーター細胞と共にプレートした。６個のプラ
ークを拾い上げＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を感染させ
た。ファージをＰＥＧ沈澱により上澄液から単離した。
一本鎖ＤＮＡをフェノールによる抽出及びエタノールに
よる沈澱により調製した。鋳型ＤＮＡをＴＥ中に再懸濁
した。
【０２６９】ＡＡＴコドン（Ａｓｎ３０２）からＣＡＡ
コドン（Ｇｌｎ３０２）への突然変異は一つのクローン
に対して鎖ターミネーション法〔F.Sanger et al., Pro
c.Nat.Acad.Sci.USA 74, 5463-67 (1977) 〕を用いて上
記配列決定プライマーによるＤＮＡ配列決定により確認
された。この突然変異の結果、ｕ−ＰＡのアミノ酸位置
３０２においてＡｓｎ→Ｇｌｎ変化が生じてウロキナー
ゼにおける単一グリコシル化部位が除去される。Ｗはｕ
−ＰＡ Ｂ−鎖におけるグリコシル化部位の突然変異を
示す（Ａｓｎ３０２→Ｇｌｎ３０２）。陽性クローンは
Ｍ１３ｍｐ１８／ＵＰＡ−Ｗと称される。
【０２７０】実施例３１：ウロキナーゼＢ−鎖中の突然
変異〔Ｇｌｎ３０２〕のＦＫ2 ＵＰＡ B ハイブリッドへ
の転移 プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＫ2 ＵＰ
ＡB をＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化した。この２．２kb
ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を単離し、アガロースゲルか
ら電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグラフィで精製しそし
てエタノール中で沈澱させた。このＤＮＡ断片はＰＨＯ
５プロモーター及びｕ−ＰＡ配列において２個のＭｓｔ
Ｉ部位を含有する。
【０２７１】３μｇの２．２kb ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断
片を３単位のＭｓｔＩで３７℃において１０分間消化し
た。反応生成物を調製用０．８％アガロースゲル上で分
離し、１６５１bp ＳａｌＩ−ＭｓｔＩ断片を単離し、
そしてゲルから電気溶出した。このＤＮＡ断片はｐＢＲ
３２２のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ配列、ＰＨＯ５プロモー
ター、インベルターゼシグナル配列及びヌクレオチド位
置９３５におけるｕ−ＰＡ部のＭｓｔＩ部位までのＦＫ
2 ＵＰＡB コード配列を含有する。
【０２７２】ＲＦ−ＤＮＡをＭ１３ｍｐ１８／ＵＰＡ−
Ｗ（実施例３０参照）について迅速ＤＮＡ単離法〔 D.
S.Holmes et al. Analyt. Biochem. 114 , 193-97 (198
1）〕により調製した。５μｇのＤＮＡをＢａｍＨＩ及
びＭｓｔＩに消化した。２μｇのＲＮａｓｅ（Serva ）
を添加し、３７℃で５分間インキュベート後、３８７bp
ＭｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を調製０．８％アガロースゲ
ル上で単離した。このＤＮＡ断片を電気溶出し、エタノ
ール中で沈澱させた。この断片はウロキナーゼＢ−鎖に
おけるヌクレオチド位置１０３３−１０３５（Ａｓｎ３
０２→Ｇｌｎ）においてＡＡＴ→ＣＡＡの突然変異を含
む。
【０２７３】プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ
−ＵＰＡをＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで切断した。この
６．６kbのベクター断片（実施例２９参照）を単離し
た。０．２ｐモルの１６５１bp ＳａｌＩ−ＭｓｔＩ断
片、０．２ｐモルの３８７bp ＭｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断
片及び０．１ｐモルの６．６kb ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ
ベクター断片を連結した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１ Ｃａ2+細胞を形質転換した。
【０２７４】１２個のアンピシリン耐性形質転換体を生
育せしめた。プラスミドＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄIII 制限切断により分析した。グリコシル化
部位における突然変異（Ｗ）はヌクレオチド位置１０３
２−１０３７におけるＥｃｏＲＩ部位を破壊した。突然
変異の存在はＤＮＡ配列決定により確認された。ｕ−Ｐ
Ａ Ｂ−鎖内に突然変異を有する一つのプラスミドＤＮ
ＡはｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＫ2 ＵＰＡB −
Ｗと称される。このプラスミドはクリングルＫ 2 におい
て無傷のグリコシル化部位を有するが、しかしｕ−ＰＡ
Ｂ−鎖においては突然変異部位Ｗ（Ａｓｎ３０２→Ｇ
ｌｎ）を有した。
【０２７５】プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ
−ＦＵＰＡB −Ｗ及びｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−
ＦＧＫ2 ＵＰＡB −Ｗを対応する未突然変異プラスミド
（実施例２９参照）から出発して同様にして造成した。
ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＫ2 ＵＰＡB −Ｗの
４．８kb ＳａｌＩ−ＨｐａＩベクター部分をｐＪＤＢ
２０７ Ｆ１Ｌａｃ（実施例２８参照）の６．２kb Ｓ
ａｌＩ−ＨｐａＩベクター断片により置換した。この
６．２kb断片は、ｐＪＤＢ２０７の４．８kb断片中にク
ローニングされたｐＥＭＢＬ１９の１．４kb Ｆ１Ｌａ
ｃインサートを有した。連結の後、形質転換しそして新
しい造成物を分析してＦ１Ｌａｃインサートを有する一
つの正しいプラスミドをｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／
ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＫ2 ＵＰＡB −Ｗと称する。
【０２７６】プラスミドｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／
ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＧＫ2 ＵＰＡB −Ｗを同様にして得
た。同様にして、ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＭＯ
Ｕ−Ｋ2 ＴＰＡB （実施例１５Ｃ参照）の４．８kb Ｓ
ａｌＩ−ＨｐａＩベクター部分をｐＪＤＢ２０７Ｆ１Ｌ
ａｃの６．２kb ＳａｌＩ−ＨｐａＩベクター断片によ
り置換した。得られたプラスミドをｐＪＤＢ２０７ Ｆ
１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−ＵＫ2 ＴＰＡBと称する。プ
ラスミドｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−
ＵＫ2 ＵＰＡB ，ｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ
５−Ｉ−ＴＰＡA ＵＰＡB 及びｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌ
ａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−ＵＰＡA ＴＰＡB はＦ１Ｌａｃベ
クター断片なしにこれらのプラスミドから同様にして得
られた。
【０２７７】実施例３２：ＦＫ2 ＵＰＡB −Ｗのクリン
グルＫ2 におけるグリコシル化部位〔Ａｓｎ１８４ Ｇ
ｌｙ Ｓｅｒ〕の突然変異 ａ）一本鎖鋳型の調製 プラスミドｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ
−ＦＫ2 ＵＰＡB −Ｗを用いてコンピテントＥ．ｃｏｌ
ｉ ＲＺ１０３２ Ｃａ2+細胞〔T.A.Kunkel,上記〕を
形質転換した。一つのアンピシリン耐性コロニーを１０
０μｇ／mlのアンピシリン、２０μｇ／mlのチミジン及
び２０μｇ／mlのデスオキシアデノシンを補給したＬＢ
培地中において生育せしめた。１・１０8 個／mlの細胞
密度において、細胞を集め、ＬＢ培地中で洗浄し、そし
て１００μｇ／mlのアンピシリン、及び０．２５μｇ／
mlのウリジンを含有するＬＢ培地中に再浮遊させた。
【０２７８】０．３のＯＤ600 においてヘルパーファー
ジＲ４０８（Pharmacia-PL Biochemicals, Inc.）を２
０m.o.i.において添加した。この培養液を３７℃におい
て５時間激しく振盪した。この培地中ウラシル含有一本
鎖ＤＮＡをT.A.Kunkel（上記）により説明されるのと同
様にして単離した。ｐＥＭＢＬ１９（＋）（実施例２８
参照）から出発して、Ｆ１領域を左廻り方向にｐＪＤＢ
２０７中にクローン化した。単離一本鎖ＤＮＡは発現プ
ラスミド内のＦＫ2 ＵＰＡB インサートのセンス鎖であ
った。
【０２７９】ｂ）ｔ−ＰＡのクリングルＫ2 のＡｓｎ１
８４におけるグリコシル化部位の突然変異：この突然変
異はグリコシル化のコンセンサスアミノ酸認識配列の第
３位置に関する。Ｓｅｒ１８６がＡｌａにより置換され
た。
【０２８０】
【表１０】
【０２８１】突然変異実験方法は実施例３０と同様であ
った。Ｍ１３ユニバーサル配列決定プライマーの代りに
式５′−AGTCGAGGTTAGTATGGC−３′のＰＨＯ５オリゴヌ
クレオチドプライマーを用いたところ、それはＰＨＯ５
プロモーターにおけるＡＴＧからのヌクレオチド−６０
〜−７７にハイブリダイズした。延長及び連結反応の
後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１ Ｃａ2+細
胞〔Kunkel 上記〕を形質転換した。アンピシリン耐性
コロニーを拾い上げ、１００mg／ｌのアンピシリンを含
有するＬＢ培地中において生育せしめた。プラスミドＤ
ＮＡを調製し、ＤＮＡ配列決定により突然変異の存在を
分析した。ＴＣＡコドンのＧＣＡへの突然変異の結果、
ｔ−ＰＡのアミノ酸位置１８６においてＳｅｒ→Ａｌａ
の変化が生じた。コンセンサス配列の第３位置における
突然変異はグリコシル化部位を除去した。突然変異ＤＮ
Ａを有する一つのクローンをｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａ
ｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＫ2 ＵＰＡB −ＷＹと称する。
【０２８２】Ｙはｔ−ＰＡのＫ2 におけるＡｓｎ１８４
のグリコシル化部位の突然変異を示し、Ｗはｕ−ＰＡ
Ｂ−鎖内のＡｓｎ３０２における突然変異を示す。得ら
れた非グリコシル化ＦＫ2 ＵＰＡB ハイブリッドタンパ
ク質は次の二つのアミノ酸変化即ちｔ−ＰＡクリングル
Ｋ2 におけるＳｅｒ１８６→Ａｌａ及びｕ−ＰＡ Ｂ−
鎖におけるＡｓｎ３０２→Ｇｌｎを有する。プラスミド
ｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＧＫ2
ＵＰＡB −Ｗ（実施例３１参照）の同様な突然変異は非
グリコシル化ＦＧＫ2 ＵＰＡB ハイブリッドタンパク質
をコードするプラスミドｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／
ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＫ2 ＵＰＡB −ＷＹを導く。
【０２８３】実施例３３：プラスミドｐＪＤＢ２０７／
ＰＨＯ５−Ｉ−Ｋ2 ＵＰＡB −ＷＹの造成 アミノ酸配列ｔＰＡ（Ser1-Gln3) (Gly176-Arg275)−ｕ
ＰＡ(Ile159-Leu411)により定義されるハイブリッドＫ
2 ＵＰＡB タンパク質をコードするヌクレオチド配列は
プラスミドｐＣＧＣ５／Ｋ2 ＵＰＡB 中に含有された。
酵母内での発現のために、誘導性ＰＨＯ５プロモーター
を用いインベルターゼシグナル配列をＫ 2 ＵＰＡB コー
ド化領域にインフレーム融合した。プラスミドｐＣＧＣ
５／Ｋ2ＵＰＡB をＢｇｌII及びＡｃｃＩで切断した。
４８７bp ＢｇｌII−ＡｃｃＩ断片を単離した。それは
ｔ−ＰＡのＢｇｌII部位（ヌクレオチド位置１７８）か
らｕ−ＰＡ内のＡｃｃＩ部位（ヌクレオチド位置７７
９）までのコード領域を含有した。この断片をＨｐｈＩ
で切断したところ４個の断片が得られた。次式で表わさ
れる二つのオリゴデスオキシリボヌクレオチド
【０２８４】
【表１１】
【０２８５】をApplied Biosystem Model 380Bシンセサ
イザー上でホスホルアミダイト法を用いて合成した。オ
リゴヌクレオチド類Ｉ及びIIは二本鎖ＤＮＡリンカーを
形成した。ジグザグ状５′末端の５個のヌクレオチドは
酵母インベルターゼシグナル配列の部分であり、これに
続いてヌクレオチド位置７５２における第１のＨｐｈＩ
切断部位へのｔ−ＰＡコード配列（Ser1-Gln3)(Gly176-
Thr191) がある。位置７２９−７３７（Asn Gly Ser ）
におけるグリコシル化部位はＴＣＡ（Ｓｅｒ）〜ＧＣＡ
（Ａｌａ）までの合成配列において突然変異され、グリ
コシル化認識配列が除去される。ｔ−ＰＡのアミノ酸位
置１８４−１８６におけるグリコシル化部位（例えば、
真性ｔ−ＰＡにおける第２番目のグリコシル化部位）の
突然変異はＹにより示される。
【０２８６】オリゴヌクレオチドＩ及びIIはこれらの
５′末端においてホスホリル化され、８５℃で１０分間
加熱され、室温に冷却される際にアニーリングされた。
１０．５μｇ（２７０ｐモル）のキナーゼ処理された二
本鎖リンカーＤＮＡを実施例８Ｂに記載したように３０
倍モル過剰にてＨｐｈＩ切断ＤＮＡ断片（上記参照）に
連結した。過剰リンカー分子をイソプロパノールによる
沈澱により除去した。このＤＮＡを更にＳｃａＩで消化
した。この２５２bp断片を調製用１．５％アガロースゲ
ルで単離し、電気溶出し、そしてエタノール中で沈澱さ
せた。
【０２８７】プラスミドｐ３１ＲＩＴ−１２（実施例６
Ｂ参照）をＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化した。単離され
た断片を更にＨｇａＩ（実施例６Ｃ参照）及びＢａｍＨ
Ｉで消化した。得られた５９１bp ＢａｍＨＩ−Ｈｇａ
Ｉ断片を単離した。それはＰＨＯ５プロモーター及びイ
ンベルターゼシグナル配列を含有した。プラスミドｐＪ
ＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＫ2 ＵＰＡB −ＷをＢａ
ｍＨＩで消化した。５μｇのこの線状ＤＮＡを１０単位
のＳｃａＩで１０分間部分的に消化した。１０mM ＥＤ
ＴＡを添加することにより反応を停止した。７．７kbＢ
ａｍＨＩ−ＳｃａＩベクター断片を単離し、電気溶出し
そしてエタノール中で沈澱させた。これはｔ−ＰＡにお
けるＳｃａＩ部位（位置９５３）からｕ−ＰＡ
【０２８８】Ｂ−鎖の末端（ＸｈｏＩリンカーが添加さ
れた位置１４４１におけるＰｖｕII部位）までのコード
化領域の３′部分、ＰＨＯ５ターミネーター及びｐＪＤ
Ｂ２０７ベクター配列を含む。各々０．２ｐモルの５９
１bp ＢａｍＨＩ−ＨｇａＩ断片及び２５２bp粘着末端
（リンカー）−ＳｃａＩ断片及び０．１ｐモルの７．７
kbベクター断片を連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
Ｃａ2+細胞を形質転換後、１２個のアンピシリン耐性
コロニーを生育させた。プラスミドＤＮＡを単離し、Ｅ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII 消化により分析した。突然変
異の存在はＤＮＡ配列決定により検証した。一つの正し
いクローンを選びｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−Ｋ2
ＵＰＡB −ＷＹと称する。ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡ Ｂ−
鎖におけるクリングルＫ2 のグリコシル化部位は共に突
然変異された（それぞれＹ及びＷ）。得られた未グリコ
シル化Ｋ2 ＵＰＡB ハイブリッドタンパク質は二つのア
ミノ酸変化（ｔ−ＰＡ Ｋ2 領域におけるＳｅｒ１８６
→Ａｌａ及びｕ−ＰＡ Ｂ−鎖におけるＡｓｎ３０２→
Ｇｌｎ）を有した。
【０２８９】実施例３４：ＵＫ2 ＴＰＡB ハイブリッド
におけるグリコシル化部位〔Asn184 Gly Ser〕及び〔As
n448 Arg Thr〕の突然変異 プラスミドｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ
−ＵＫ2 ＴＰＡB （実施例３１参照）のウラシル含有一
本鎖鋳型〔T.A.Kunkel, 上記〕を実施例３０と同様にし
て調製した。Ａｓｎ１８４におけるグリコシル化部位の
突然変異方式は実施例３２に説明したのと同様であっ
た。Ａｓｎ４４８におけるグリコシル化部位の突然変異
の結果Ｔｈｒ４５０→Ａｌａアミノ酸変化が生じた。
【０２９０】
【表１２】
【０２９１】突然変異実験方法は実施例３０において説
明したと同様であった。ホスホリル化された突然変異誘
発プライマーＹ及びＺを共にｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａ
ｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−ＵＫ2 ＴＰＡB のウラシル含有一本
鎖鋳型にアニーリングした。ＰＨＯ５オリゴヌクレオチ
ドプライマー（実施例３２参照）の追加の使用は任意で
ある。延長及び連結反応の後、コンピテントＥ．ｃｏｌ
ｉ ＢＭＨ７１ Ｃａ2+細胞を形質転換した。アンピシ
リン耐性形質転換体のプラスミドＤＮＡを調製し、示さ
れた配列決定プライマーにより両方の突然変異の存在を
分析した。
【０２９２】両方の突然変異を有する一つのクローンの
プラスミドＤＮＡをｐＪＤＢ２０７Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ
５−Ｉ−ＵＫ2 ＴＰＡB −ＹＺと称する。ＹはＡｓｎ１
８４におけるグリコシル化部位の突然変異を示し、及び
ＺはＡｓｎ４４８における突然変異を示す。この非グリ
コシル化ＵＫ2 ＴＰＡB ハイブリッドタンパク質は次の
二つのアミノ酸変化、即ちｔ−ＰＡのＫ2 クリングルに
おけるＳｅｒ１８６→Ａｌａ及びｔ−ＰＡ Ｂ−鎖にお
けるＴｈｒ４５０→Ａｌａを有した。
【０２９３】この突然変異実験方法は又、ｐＪＤＢ２０
７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−ＵＫ2 ＵＰＡB ，ｐＪ
ＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−ＴＰＡA ＵＰ
ＡB及びｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−
ＵＰＡA ＴＰＡB （実施例３１参照）の鋳型にも適用可
能であり、この場合、ｕ−ＰＡ Ｂ−鎖におけるグリコ
シル化部位の突然変異のための突然変異誘発プライマー
Ｗ及び／又は突然変異誘発プライマーＹ及びＺ、並びに
ｔ−ＰＡにおけるグリコシル化部位の突然変異のために
ヨーロッパ特許出願２２５２８６号明細書に記載されて
いるその他のものが使用される。
【０２９４】実施例３５：サッカロミセス・セレビジア
エＧＲＦ１８の形質転換及び酵母細胞抽出液の調製 プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＫ2 ＵＰ
ＡB ，ｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−Ｆ
Ｋ2 ＵＰＡB −Ｗ，ｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨ
Ｏ５−Ｉ−ＦＫ2 ＵＰＡB −ＷＹ，ｐＪＤＢ２０７ Ｆ
１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−ＵＫ2 ＴＰＡB ，ｐＪＤＢ２
０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−ＵＫ2 ＴＰＡB −Ｙ
Ｚ，ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−Ｋ2 ＵＰＡB −Ｗ
Ｙ，ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＵＰＡB ，ｐＪ
ＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＵＰＡB −Ｗ，ｐＪＤＢ
２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＧＫ2 ＵＰＡB ，ｐＪＤＢ２
０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＧＫ2 ＵＰＡB −Ｗ，ｐＪＤＢ
２０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−ＦＧＫ2 ＵＰＡB
−Ｗ及びｐＪＤＢ２０７ Ｆ１Ｌａｃ／ＰＨＯ５−Ｉ−
ＦＧＫ2 ＵＰＡB −ＷＹをサッカロミセス・セレビジア
エ（Saccharomyces cerevisiae）菌株ＧＲＦ１８（Ｄ
ＳＭ３６６５）中に形質転換した。形質転換、細胞の生
育及び細胞抽出液の調製は実施例１６に記載されてい
る。得られたハイブリッドプラスミノーゲンアクチベー
タは実施例２２〜２４に説明された方法と同様にして精
製することができる。
【０２９５】実施例３６：凍結乾燥ハイブリッドプラス
ミノーゲンアクチベータの調製 実施例２２〜２４のいづれかで得られた溶液を更に下記
の如く精製しそして凍結乾燥した。溶液を１０容の０．
１Ｍ酢酸アンモニウム（pH５．０）（全容量８０ml）で
稀釈し、５mlのCM-Sepharose Fast Flow (Pharmacia ）
を含有するカラムに室温で２５ml／ｈの流速で適用した
（カラムは０．１Ｍ酢酸アンモニウムで予備平衡化され
た）。生成物を含有しない濾過液を廃棄した。カラムを
１５mlの０．１Ｍ酢酸アンモニウム（pH５．０）及び１
０μｌの酢酸アンモニウム（pH７．０）で洗浄した。次
いで、吸着ハイブリッドＰＡの溶出を１Ｍ酢酸アンモニ
ウムpH８．６により室温で行った（流速５ml／ｈ）。カ
ラム上でのガス形成を防止するために、溶出は１〜１．
５バールの過剰圧力にて行った。溶出液のハイブリッド
ＰＡ含量はＵＶモニター（２８０nm）により測定した。
溶出ハイブリッドＰＡの約９０％を含有する画分を集
め、凍結乾燥に付した。固体ハイブリッドＰＡ凍結乾燥
物の純度はＨＰＬＣにより判断して約９５％を越えるも
のであった。生成物には洗剤が含まれなかった。
【０２９６】実施例３７：非経口投与用第一番目の医薬
組成物 上記の如く得られた純粋ｕＰＡ（１−４４）−ｔＰＡ
（１７６−５２７）を含有する溶液を０．０１％Ｔｗｅ
ｅｎ８０（登録商標）を含有する０．３モル濃度の塩化
ナトリウムに対して透析し、−８０℃で貯蔵した。投与
前に濃度を７５μｇ／mlの全ＰＡ及び０．３Ｍ ＮａＣ
ｌに調整した。溶液を０．２２μｍ膜フィルターを通過
させる濾過により殺菌した。上記ＰＡの代りに同一量の
前記実施例において説明した異ったＰＡ、例えばuPA (1
-158)-tPA (276-527),uPA (1-131)-tPA (263-527),tPA
(1-275)-uPA (159-411),tPA (1-262)-uPA (132-411),uP
A (1-44)-tPA (176-261)-uPA (134-411),tPA (1-49)-tP
A (262-275)-uPA (159-411),tPA (1-49)-uPA (134-41
1),tPA (1-49)-tPA (176-275)-uPA (159-411),tPA (1-4
9)-tPA (176-262)-uPA (132-411),tPA (1-3)-tPA (176-
275)-uPA (159-411),tPA (1-86)-tPA (176-275)-uPA (1
59-411)
【０２９７】或いはtPA (1-86)-tPA (176-262)-uPA (13
2-411)、或いは変異体ハイブリッドＰＡ、例えばtPA (1
-49)-tPA (262-275)-uPA (159-301, Gln, 303-411),tPA
(1-49)-tPA (176-185, Ala, 187-275)-uPA (159-301,
Gln, 303-411),uPA (1-44)-tPA (176-185, Ala, 187-44
9, Ala, 451-527),tPA (1-3)-tPA (176-185, Ala, 187-
275)-uPA (159-301, Gln, 303-411) 或いはtPA (1-86)-
tPA (176-185, Ala, 187-275)-uPA (159-301, Gln, 303
-411)などを用いることも可能である。
【０２９８】実施例３８：非経口投与用の第二番目の医
薬組成物（注射用分散液） １６９．３mgの大豆レシチン（大豆ホスファチドＮＣ９
５、製造者：Nattermann, Cologne, 西ドイツ；純度９
０〜９６％；脂肪酸組成：リノール酸６１〜７１％、リ
ノレン酸４〜７％、オレイン酸６〜１３％、パルミチン
酸１０〜１５％、ステアリン酸１．５〜３．５％）、及
び９２．７mgの純粋ナトリウムグリコレートを７５２．
５mlの殺菌水中に溶解した。溶液を１Ｎ ＮａＯＨでpH
７．４に調整した。１０mgの凍結乾燥したｕＰＡ（１−
４４）−ｔＰＡ（１７６−５２７）を添加した。溶液を
０．２２μｍ膜フィルターを通過させる濾過により殺菌
し、アンプル中に充填した。
【０２９９】上記ＰＡの代りに、同一量の前記実施例に
説明した異ったＰＡ、例えばuPA (1-158)-tPA (276-52
7),uPA (1-131)-tPA (263-527),uPA (1-275)-uPA (159-
411),tPA (1-262)-uPA (132-411),uPA (1-44)-tPA (176
-261)-uPA (134-411),tPA (1-49)-tPA (262-275)-uPA
(159-411),tPA (1-49)-uPA (134-411),tPA (1-49)-tPA
(176-275)-uPA (159-411),tPA (1-49)-tPA (176-262)-u
PA (132-411),tPA (1-3)-tPA (176-275)-uPA (159-41
1),tPA (1-86)-tPA (176-275)-uPA (159-411)又はtPA
(1-86)-tPA (176-262)-uPA (132-411)、
【０３００】或いは変異体ハイブリッドＰＡ、例えばtP
A (1-49)-tPA (262-275)-uPA (159-301, Gln, 303-41
1),tPA (1-49)-tPA (176-185, Ala, 187-275)-uPA (159
-301, Gln, 303-411),uPA (1-44)-tPA (176-185, Ala,
187-449, Ala, 451-527),tPA (1-3)-tPA (176-185, Al
a, 187-275)-uPA (159-301, Gln, 303-411) 、又はtPA
(1-86)-tPA (176-185, Ala, 187-275)-uPA (159-301, G
ln, 303-411)などを用いることも可能である。
【０３０１】実施例３９：非経口投与用第三番目の医薬
組成物（ボーラス注射を含む） １００mgの実施例３７及び３８で述べたようなハイブリ
ッドプラスミノーゲンアクチベータ或いは変異体ハイブ
リッドプラスミノーゲンアクチベータを０．７％ＮａＣ
ｌを含有する１００mlの５０mMグルタミン酸／グルタミ
ン酸ナトリウム、pH４．５中に溶解した。この溶液をア
ンプルに充填したが、これを静脈内（ボーラス）注入に
使用することができる。
【０３０２】微生物の寄託 次の菌株はDeutsche Sammlung fuer Mikroorganismen
(DSM), Grisebachstrasse 8, D-3000 Goettingen に１
９８７年１０月２３日に寄託された。
【表１３】
【０３０３】次のハイブリドーマ細胞系統は "Collecti
on Nationale de Cultures de Microorganismes", Inst
itut Pasteur, Paris (CNCM)に１９８７年１１月２０日
に寄託された。
【表１４】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はヒトｔ−ＰＡ ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列及び推定アミノ酸配列を図示する。成熟タンパク質
の第１アミノ酸には下線が付されている。
【図２】図２はヒトｔ−ＰＡ ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列及び推定アミノ酸配列を図示する。
【図３】図３はヒトｔ−ＰＡ ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列及び推定アミノ酸配列を図示する。
【図４】図４はヒトｔ−ＰＡ ｃＤＮＡの制限酵素地図
である。
【図５】図５はヒトｕ−ＰＡ ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列及び推定アミノ酸配列を図示する。成熟タンパク質
の第１アミノ酸には下線が付されている。
【図６】図６はヒトｕ−ＰＡ ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列及び推定アミノ酸配列を図示する。
【図７】図７はヒトｕ−ＰＡ ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列及び推定アミノ酸配列を図示する。
【図８】図８はヒトｕ−ＰＡ ｃＤＮＡの制限酵素地図
である。
【図９】図９はプラスミドｐＥｃｏ ０．４７ΔＳｃａ
Ｉを造成するために用いられる技術の概略図である。
【図１０】図１０は突然変異されたｔ−ＰＡ ｃＤＮＡ
を含有するプラスミドｐｈ・ｔＰＡΔＳｃａＩの造成の
概略図である。
【図１１】図１１はｕ−ＰＡのＡ−鎖領域及びｔ−ＰＡ
のＢ−鎖を含んでなるｃＤＮＡインサートを含有するプ
ラスミドｐＵＮＣ・ｔｃ造成の概略図である。
【図１２】図１２はｔ−ＰＡのＡ−鎖領域及びｕ−ＰＡ
のＢ−鎖を含んでなるｃＤＮＡインサートを含有するプ
ラスミドｐｔＮＣ−ＵＣの造成の概略図である。
【図１３】図１３はプラスミドｐＤ０２の造成の概略図
である。
【図１４】図１４はｔ−ＰＡ ｃＤＮＡをベータグロビ
ン断片と組合わせて含有するプラスミドｐＤ０１０の造
成の概略図である。
【図１５】図１５はＭＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御
下のｔ−ＰＡ ｃＤＮＡ及びベータグロビン断片を含有
するプラスミドｐＣＧＡ２６の造成の概略図である。
【図１６】図１６は共にネオマイシン耐性遺伝子を含む
ｔ−ＰＡ発現プラスミドｐＣＧＡ２８及びユニバーサル
発現プラスミドｐＣＧＡ４４の造成の概略図である。
【図１７】図１７は共にハイグロマイシン耐性遺伝子を
含むｔ−ＰＡ発現プラスミドｐＣＧＡ４２及びユニバー
サル発現プラスミドｐＣＧＡ４２ｄの造成の概略図であ
る。
【図１８】図１８はネオマイシン耐性遺伝子及びＤＨＦ
Ｒ遺伝子を含むｔ−ＰＡ発現プラスミドｐＣＧＡ４８の
造成の概略図である。
【図１９】図１９はプラスミドｐｈ・ｔＰＡΔＳｃａＩ
の突然変異されたｔ−ＰＡ ｃＤＮＡインサートを含有
する発現プラスミドｐＢＲ１ａの造成の概略図である。
【図２０】図２０はｕ−ＰＡのＡ−鎖ドメイン及びｔ−
ＰＡのＢ−鎖を含んでなるハイブリッドＰＡ ｃＤＮＡ
インサートを含有する発現プラスミドｐＢＲ２ａの造成
の概略図である。
【図２１】図２１はｕ−ＰＡ発現プラスミドｐＢＲ３ａ
の造成の概略図である。
【図２２】図２２は、ｔ−ＰＡのＡ−鎖ドメイン及びｕ
−ＰＡのＢ−鎖を含んでなるハイブリッドＰＡ ｃＤＮ
Ａインサートを含有する発現プラスミドｐＢＲ４ａの造
成の概略図である。
【図２３】図２３は、ＰＨＯ５プロモーター、インベル
ターゼシグナル配列及びｔ−ＰＡｃＤＮＡを含有する酵
母発現ベクターｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｉ−ＴＰＡ
の造成の概略図である。
【図２４】図２４はプラスミドｐＣＳ１６の造成の概略
図である。
【図２５】図２５はｕ−ＰＡ ｃＤＮＡを含んでなるプ
ラスミドｐＣＳ１６／ＵＰＡの造成の概略図である。
【図２６】図２６はプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ
５−Ｉ−ＵＰＡの造成の概略図である。
【図２７】図２７はｔ−ＰＡのＡ−鎖ドメイン及びｕ−
ＰＡのＢ−鎖を含んでなるハイブリッドＰＡをコードす
る遺伝子の造成を示す。
【図２８】図２８はｕ−ＰＡのＡ−鎖ドメイン及びｔ−
ＰＡのＢ−鎖を含んでなるハイブリッドＰＡをコードす
る遺伝子の造成を示す。
【図２９】図２９はｕ−ＰＡ成長因子ドメイン、ｔ−Ｐ
Ａのクリングル２ドメイン及びｔ−ＰＡのＢ−鎖を含ん
でなるハイブリッドＰＡをコードする遺伝子の造成を示
す。
【図３０】図３０はｕ−ＰＡ成長因子ドメイン、ｔ−Ｐ
Ａのクリングル２ドメイン及びｕ−ＰＡのＢ−鎖を含ん
でなるハイブリッドＰＡをコード化する遺伝子の造成を
示す。
【図３１】図３１は実験の部に例示されるハイブリッド
ＰＡと変異体ハイブリッドＰＡの集成である。
【図３２】図３２は実験の部に例示されるハイブリッド
ＰＡと変異体ハイブリッドＰＡの集成である。
【図３３】図３３は実験の部に例示されるハイブリッド
ＰＡと変異体ハイブリッドＰＡの集成である。
【符号の説明】
ＡＭＰ，ＡｍｐR …アンピシリン耐性遺伝子（ベーター
ラクタマーゼ） ＴＥＴ，ＴｅｔR …テトラサイクリン耐性遺伝子 ＮＥＯ…Ｔｎ５ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ ＴＮ５ＰＲ…トランスポソンＴＮ５の細菌プロモーター ＨＰＨ…ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ ｐＢＲｏｒｉ…プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点 ＰＯＩＳ…‘毒性−配列’、すなわちＳＶ４０複製に抑
制的であるｐＢＲ３２２配列 ＳＶ４０ｏｒｉ…ＳＶ４０の複製開始点、初期及び後期
プロモーターと一致 ＳＶ４０ｅｎｈ ＳＶ４０Ｅ…７２bpエンハンサー、Ｓ
Ｖ４０初期プロモーターの部分 ＨＣＭＶＥ…ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の
主要即時初期遺伝子のエンハンサー ＭＣＭＶＰ…マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）
の主要即時初期遺伝子のプロモーター／ｍＲＮＡスター
ト部位 ＲＳＶ…ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（プロモーター） ＣＡＰ…真核性ｍＲＮＡの５′ｍ７Ｇｐ‘ｃａｐ’の位
置 ｐｏｌｙＡ…ｍＲＮＡのポリアデニル化部位 ＳＰＬＤ…スプライスドナー部位、イントロンの５′末
端 ＳＰＬＡ…スプライスアクセプター部位、イントロンの
３′末端 ＢＡＰ…細菌アルカリ性ホスファターゼ ＣＩＰ…仔ウシ腸ホスファターゼ （ＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ２）…ＢａｍＨＩ及びＢｇｌII部
位を共連結することから生ずるＳａｕ３ａ部位 Ｓｃａ１（ｄｅｌ）…変異されたＳｃａＩ部位 ｘ＜ｙ…ｙから右廻りに位置する制限酵素部位ｘ ｐ…プロモーター ｉｎｖ．ＳＳ…インベルターゼシグナル配列 ｔ…転写ターミネーター Ｌ…リンカーＤＮＡ ＤＨＦＲ…ジヒドロ葉酸還元酵素 ｍｔＰＡ…Ｂｏｗｅｓメラノーマｔ−ＰＡ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ８７１５８９０ (32)優先日 1987年７月６日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 ブハバトシュ チャウドフリ スイス国，4058 バーゼル，マウルベール シュトラーセ 15 (72)発明者 フレデリクス アルフォンズス マリア アセルベルクス スイス国，4125 リーヘン，ラインアレー 88／３ (72)発明者 ベルント マイハック スイス国，4312 マクデン，ヘーエンベー ク ９ (72)発明者 ユタ ハイム スイス国，4133 プラテルン，ランカッカ ーベーク 18 (72)発明者 ジャン バン オーストルム スイス国，4142 ミュンヒェンシュタイ ン，メルヒオル ベリシュトラーセ 10 (72)発明者 セフィック アルカン スイス国，4125 リーヘン，ビンセンアッ カーシュトラーセ ３

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメイン
    のアミノ酸１８０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメイン
    のアミノ酸１８９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ
    酸２６２−２７５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−
    １８８から成る連結配列； ｂ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；又は ｃ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡ成長因子ドメインのアミノ酸５１−８
    ４、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；から本質上成る単鎖ハイブリッドプラスミノ
    ーゲンアクチベータをコードするＤＮＡ。
  2. 【請求項２】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−２
    ７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１），ｔＰＡ（１−４
    ９）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４
    １１）及びｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（１７６−２７
    ５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）から成る群から選択さ
    れた単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータを
    コードする請求項１に記載のＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−２
    ７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）である単鎖ハイブリ
    ッドプラスミノーゲンアクチベータをコードする請求項
    １に記載のＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 ａ）ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメイン
    のアミノ酸１８０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメイン
    のアミノ酸１８９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ
    酸２６２−２７５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−
    １８８から成る連結配列； ｂ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；又は ｃ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡ成長因子ドメインのアミノ酸５１−８
    ４、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；から本質上成る単鎖ハイブリッドプラスミノ
    ーゲンアクチベータをコードするＤＮＡを含んで成る酵
    母又は哺乳類宿主において使用するためのハイブリッド
    ベクター。
  5. 【請求項５】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−２
    ７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１），ｔＰＡ（１−４
    ９）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４
    １１）及びｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（１７６−２７
    ５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）から成る群から選択さ
    れた単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータを
    コードするＤＮＡを含んで成る請求項４に記載のハイブ
    リッドベクター。
  6. 【請求項６】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−２
    ７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）である単鎖ハイブリ
    ッドプラスミノーゲンアクチベータをコードするＤＮＡ
    を含んで成る請求項４に記載のハイブリッドベクター。
  7. 【請求項７】 ａ）ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメイン
    のアミノ酸１８０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメイン
    のアミノ酸１８９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ
    酸２６２−２７５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−
    １８８から成る連結配列； ｂ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；又は ｃ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡ成長因子ドメインのアミノ酸５１−８
    ４、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；から本質上成る単鎖ハイブリッドプラスミノ
    ーゲンアクチベータをコードするＤＮＡを含んで成るハ
    イブリッドベクターにより形質転換された真核宿主細
    胞。
  8. 【請求項８】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−２
    ７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１），ｔＰＡ（１−４
    ９）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４
    １１）及びｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（１７６−２７
    ５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）から成る群から選択さ
    れた単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータを
    コードするＤＮＡを含んで成るハイブリッドベクターに
    より形質転換された請求項７に記載の真核宿主細胞。
  9. 【請求項９】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−２
    ７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）である単鎖ハイブリ
    ッドプラスミノーゲンアクチベータをコードするＤＮＡ
    を含んで成るハイブリッドベクターにより形質転換され
    た請求項７に記載の真核宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 ａ）ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメイ
    ンのアミノ酸１８０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメイ
    ンのアミノ酸１８９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミ
    ノ酸２６２−２７５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９
    −１８８から成る連結配列； ｂ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；又は ｃ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡ成長因子ドメインのアミノ酸５１−８
    ４、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；から本質上成る単鎖ハイブリッドプラスミノ
    ーゲンアクチベータをコードするＤＮＡの製造方法にお
    いて、前記ＤＮＡを化学的に合成するか、あるいはｕ−
    ＰＡ及びｔ−ＰＡ ｃＤＮＡのポリヌクレオチドサブ配
    列をコードする断片を調製し、そして１又は複数の段階
    でそれらを所定の順序で連結する、ことを含んで成る方
    法。
  11. 【請求項１１】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−
    ２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１），ｔＰＡ（１−４
    ９）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４
    １１）及びｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（１７６−２７
    ５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）から成る群から選択さ
    れた単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータを
    コードするＤＮＡの製造のための請求項１０に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−
    ２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）である単鎖ハイブ
    リッドプラスミノーゲンアクチベータをコードするＤＮ
    Ａの製造のための請求項１０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ａ）ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメイ
    ンのアミノ酸１８０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメイ
    ンのアミノ酸１８９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミ
    ノ酸２６２−２７５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９
    −１８８から成る連結配列； ｂ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；又は ｃ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡ成長因子ドメインのアミノ酸５１−８
    ４、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；から本質上成る単鎖ハイブリッドプラスミノ
    ーゲンアクチベータをコードするＤＮＡを含んで成る酵
    母又は哺乳類宿主中で使用するためのハイブリッドベク
    ターの製造方法において、真核性プロモーター、前記ハ
    イブリッドプラスミノーゲンアクチベータのためのコー
    ド領域、真性性遺伝子の３′−フランキング配列、及び
    ベクターＤＮＡを連結することを含んで成る方法。
  14. 【請求項１４】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−
    ２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１），ｔＰＡ（１−４
    ９）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４
    １１）及びｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（１７６−２７
    ５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）から成る群から選択さ
    れた単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータを
    コードするＤＮＡを含んで成る酵母又は哺乳類宿主中で
    使用するためのハイブリッドベクターを製造するための
    請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−
    ２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）である単鎖ハイブ
    リッドプラスミノーゲンアクチベータをコードするＤＮ
    Ａを含んで成る酵母又は哺乳類宿主中で使用するための
    ハイブリッドベクターの製造のための請求項１３に記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】 ａ）ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメイ
    ンのアミノ酸１８０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメイ
    ンのアミノ酸１８９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミ
    ノ酸２６２−２７５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９
    −１８８から成る連結配列； ｂ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；又は ｃ）ヒトｔ−ＰＡフィンガードメインのアミノ酸６−４
    ３、ヒトｔ−ＰＡ成長因子ドメインのアミノ酸５１−８
    ４、ヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメインのアミノ酸１８
    ０−２６１、ヒトｕ−ＰＡ触媒ドメインのアミノ酸１８
    ９−４１１並びにヒトｔ−ＰＡのアミノ酸２６２−２７
    ５及びヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１５９−１８８から成る
    連結配列；から本質上成る単鎖ハイブリッドプラスミノ
    ーゲンアクチベータをコードするＤＮＡを含んで成るハ
    イブリッドベクターにより形質転換された真核細胞の製
    造方法において、該ハイブリッドベクターにより真核宿
    主細胞を形質転換することを含んで成る方法。
  17. 【請求項１７】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−
    ２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１），ｔＰＡ（１−４
    ９）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４
    １１）及びｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（１７６−２７
    ５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）から成る群から選択さ
    れた単鎖ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータを
    コードするＤＮＡを含んで成るハイブリッドベクターに
    より形質転換された真核細胞を製造するための請求項１
    ６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−
    ２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）である単鎖ハイブ
    リッドプラスミノーゲンアクチベータをコードするＤＮ
    Ａを含んで成るハイブリッドベクターにより形質転換さ
    れた真核細胞を製造するための請求項１６に記載の方
    法。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5204255A (en) * 1986-01-31 1993-04-20 Sagami Chemical Research Center Hybrid tissue plasminogen activator/urokinase polypeptides
MY103358A (en) * 1987-04-15 1993-06-30 Novartis Ag Process for the production of protiens.
AU1893988A (en) * 1987-07-13 1989-01-19 Collaborative Research Inc. Nonglycosylated plasminogen activator and method of preparation
FR2637600B1 (fr) * 1988-10-11 1992-03-06 Pasteur Institut Peptides et polypeptides provenant de la glande sous maxillaire du rat, anticorps monoclonaux et polyclonaux correspondants, hybridomes correspondants et applications de ces produits au diagnostic, a la detection ou a des fins therapeutiques
WO1990004635A1 (en) * 1988-10-27 1990-05-03 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Thrombolytic agents with modified kringle domains
GB8826975D0 (en) * 1988-11-18 1988-12-21 Beecham Group Plc Novel compounds
DE3923339A1 (de) * 1989-05-31 1990-12-06 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogen-aktivator-derivat
IE901849A1 (en) * 1989-07-19 1991-06-19 Gruenenthal Gmbh Plasmids, their preparation and their use in the manufacture¹of a plasminogen activator
GB8919803D0 (en) * 1989-09-01 1989-10-18 Ciba Geigy Pharmaceutical compositions
GB8927546D0 (en) * 1989-12-06 1990-02-07 Ciba Geigy Process for the production of biologically active tgf-beta
EP0462651A1 (en) * 1990-06-15 1991-12-27 Leuven Research & Development V.Z.W. Chimeric plasminogen activators
DE69222013T2 (de) * 1991-12-16 1998-01-29 Ciba Geigy Ag Endoplasmatisches Retikulum-ständige rekombinante dibasische Endoprotease und deren Verwendungen
JPH07143877A (ja) * 1993-10-01 1995-06-06 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 新規なｔ−ＰＡ類似体
TW517059B (en) 1994-07-25 2003-01-11 Ciba Geigy Ag New process for the production of biologically active protein
US20070093443A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Madison Edwin L Modified proteases that inhibit complement activation
WO2008045148A2 (en) 2006-07-05 2008-04-17 Catalyst Biosciences, Inc. Protease screening methods and proteases identified thereby

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8334498D0 (en) * 1983-12-24 1984-02-01 Beecham Group Plc Compounds
US4916071A (en) * 1985-08-14 1990-04-10 American Home Products Corporation Poly-kringle plasminogen activator
WO1987004722A1 (en) * 1986-01-31 1987-08-13 Genetics Institute, Inc. Novel thrombolytic proteins
ES2043610T3 (es) * 1986-01-31 1994-01-01 Sagami Chem Res Procedimiento para la produccion de un polipeptido hibrido del tipo activador de plasminogeno.

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