FR2853663A1 - Procede d'obtention de lignees de mastocytes a partir de tissus de porcs et procede de production de molecules de type heparine - Google Patents
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Abstract
La présente demande a pour objet un procédé d'obtention de cultures ou de lignées de mastocytes. Elle est en outre relative à un procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture de cultures ou lignées de mastocytes.
Description
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Procédé d'obtention de lignées de mastocytes à partir de tissus de porcs et procédé de production de molécules de type héparine
La présente demande a pour objet un procédé d'obtention de cultures ou de lignées de mastocytes. Elle est en outre relative à un procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture de cultures ou lignées de mastocytes.
La présente demande a pour objet un procédé d'obtention de cultures ou de lignées de mastocytes. Elle est en outre relative à un procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture de cultures ou lignées de mastocytes.
Les mastocytes sont des cellules du système immunitaire, dérivés de précurseurs hématopoïétiques, qui interviennent dans la réponse inflammatoire, notamment dans les phénomènes d'allergie et d'hypersensibilité. Ils sont localisés dans le tissu conjonctif, notamment au niveau de la peau, des muqueuses intestinales et respiratoires.
Les mastocytes se présentent sous la forme de cellules arrondies d'un diamètre compris entre environ 5 à 25 m et possèdent un noyau arrondi, unique, central ou excentré. Ils sont aussi caractérisés par la présence de nombreuses granulations cytoplasmiques méta-chromatiques.
Ces granules renferment diverses espèces moléculaires ayant une activité proinflammatoire telles que l'histamine, la sérotonine, des protéoglycanes tels que l'héparine ou le chondroïtine sulfate, des enzymes, des cytokines et des facteurs chimioattractants des éosinophiles et des neutrophiles. Ces espèces sont libérées lors de l'activation mastocytaire.
Après activation, une réponse secondaire se met en place durant laquelle a lieu la synthèse des médiateurs tels que les leucotriènes, les prostaglandines, le PAF (platelet activating factor), des interleukines (IL4, IL5, IL6, IL10, IL12 et IL 13), des cytokines (TGF beta, IFN gamma, GM-CSF) et des chimiokines (MCP-1,IL8, RANTES). L'ensemble de ces espèces participe au déclenchement d'un processus inflammatoire et à la mise en place d'une réponse immunitaire spécifique dépendante des lymphocytes T.
Des cultures de mastocytes ont été déjà obtenues chez l'homme et la souris, mais l'état de la technique ne fournit pas de description de telles cultures établies ou de lignées chez le porc.
Razin et al (J. Biol. Chem., 257,7229-7236, 1982) décrivent l'obtention de mastocytes de souris en utilisant des milieux de culture contenant de l'IL3.
Wang et al (Cire. Res., 84,74-83, 1999) décrivent l'isolement de mastocytes séreux obtenus à partir de cavités pleurales et péritonéales de rat. Diverses espèces moléculaires sont produites mais uniquement quand les mastocytes sont co-cultivés avec des cellules de muscle lisse aortique de rat. La demande W099/26983 décrit des travaux proches, et est très peu précise quant à l'application à d'autres espèces.
Des lignées cellulaires ont été établies chez la souris (Montgomery et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,11327-11331, 1992 et demande W090/14418) mais à partir de mastocytomes. Ces tumeurs sont extrêmement rares chez le porc.
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Chez l'homme l'obtention de cultures de mastocytes s'est révélée difficile. Elle a tout d'abord été permise par l'utilisation de système de co-culture avec des fibroblastes (Ishizaka et al, Current Opinion in Immunology, 5,937-943, 1993).
D'autres auteurs sont ensuite parvenus à obtenir des mastocytes à partir de cellules intestinales et à maintenir ces cellules en culture pendant environ 6 mois en présence de SCF (Bischoff et al, J. Immunol., 159,5560-5567, 1997).
Quant elle a été mesurée, les auteurs de ces différents articles n'ont reporté qu'une faible production de composés de type héparine.
Chez le porc Emery et al (Expérimental Hematology, 24,927-935, 1996) ont maintenu, durant 7 semaines, des cultures de cellules obtenues à partir de moelle osseuse. Néanmoins il apparaît que les cultures obtenues sont des mélanges de divers types cellulaires et non des cultures homogènes ou des lignées de mastocytes. De plus ces cultures contiennent des cellules non-différenciées en cultures homogènes de mastocytes.
Ashraf et al (Veterinary Parasitology; 29,134-158, 1988) ont isolé des mastocytes de porcs à partir de la muqueuse intestinale sans maintenir de cultures amplifiables. En outre la caractérisation des mastocytes isolés révèle l'absence d'héparine.
L'héparine appartient à la famille des glycosaminoglycanes (GAG), qui regroupe les polysaccharides linéaires contenant une répétition d'une séquence disaccharidique se composant d'un sucre aminé (D-glucosamine ou galactosamine) et d'un acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique).
Dans le cas de l'héparine, qui appartient, avec l'héparane sulfate, à la sous-famille des glucosaminoglycanes le sucre aminé est la D-glucosamine. L'acide uronique est soit l'acide glucuronique (Glc), soit l'acide iduronique (Ido). La glucosamine peut être N-acétylée, N-sulfatée et O-sulfatée.
Conventionnellement, on désigne sous le terme "héparine" des polysaccharides hautement sulfatés dans lesquels plus de 80% des résidus glucosamine sont Nsulfatés et le nombre de 0-sulfate est plus important que celui des N-sulfates. Le rapport sulfate/carboxylate est généralement supérieur à 2 pour l'héparine. Cependant, la structure de l'héparine est en fait très hétérogène, et il existe des chaînes pouvant contenir des rapports très différents.
Comme tous les GAGs, l'héparine est synthétisée sous forme d'un protéoglycane essentiellement par les mastocytes.
La première étape de la synthèse de l'héparine est la formation du noyau protéique serglycine, constitué d'une répétition de résidus sérine et glycine. L'élongation de la chaîne d'héparine se fait par ajout d'un tétrasaccharide, puis par ajouts successifs de glucosamines et d'acides uroniques, régulièrement alternés.
Le protéoglycane ainsi formé subit de nombreuses transformations séquentielles: N-déacétylation, N-sulfatation, épimérisation de l'acide D-glucuronique, et O-sulfatation.
Toutefois, cette maturation complète n'a lieu que sur une partie du protéoglycane, ce qui génère une grande variabilité structurale de l'héparine, responsable de son hétérogénéité.
Les chaînes de polysaccharides sont ensuite clivées de la serglycine par une
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endoglucuronidase. Ces chaînes ont alors un poids moléculaire entre 5000 et 30. 000 Da. Elles forment des complexes avec les protéases basiques et sont ainsi stockées dans les granules des mastocytes. L'héparine est excrétée uniquement lors de la dégranulation des mastocytes.
L'héparine joue un rôle biologique important, notamment dans l'hémostase, et est très largement utilisée en thérapeutique, en particulier en tant qu'agent anticoagulant et antithrombotique.
La majeure partie de l'héparine utilisée est isolée à partir de la muqueuse intestinale du porc, d'où elle est extraite par protéolyse, suivie de purification sur résine échangeuse d'anions (pour revue sur les différents procédés de préparation de l'héparine, cf. DUCLOS, L'Héparine : fabrication, structure, propriétés, analyse ; Ed. Masson, Paris, 1984).
L'analyse de la composition en disaccharides de l'héparine de porc après dépolymérisation et chromatographie permet de différencier l'héparine des autres glycosaminoglycanes. On distingue notamment huit principaux disaccharides (figure 6). Les disaccharides sulfatés, Is, Ils, Ils, IVs, sont proportionnellement les plus abondants avec majoritairement le Is dont la quantité est supérieure à 40%, et préférablement supérieure à 50%. Par ordre d'abondance viennent ensuite les disaccharides Ils, Ills et IVs. Le ratio entre les disaccharides Is et Ils est compris entre 3 et 8.
On peut observer une hétérogénéité dans la composition de l'héparine entre les lots issus de lots d'animaux d'origines différentes. Cette hétérogénéité est susceptible d'engendrer des variabilités dans l'activité biologique.
De plus l'utilisation d'animaux comme source d'héparine constitue un risque du fait de la présence éventuelle de virus susceptibles d'être transmis à l'homme.
En outre, l'approvisionnement en matière première peut se révéler irrégulier.
La présente invention propose de pallier ces inconvénients et de s'affranchir des problèmes d'approvisionnement en termes de quantité et de qualité, en utilisant une source de matière première plus facilement contrôlable.
La demanderesse a montré qu'il était possible de produire en quantité importante à partir de cultures de mastocytes, de l'héparine possédant des propriétés comparables à celles de l'héparine extraite du mucus intestinal porcin et reproductibles.
La demanderesse a en outre mis en évidence que les gènes codant trois protéines d'importance pour la production de molécules de type héparine ou l'indépendance des mastocytes vis à vis de facteurs de croissance, présentaient chez le porc des séquences différentes de celles d'autres espèces.
La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de cultures ou de lignées de mastocytes comprenant la mise en culture d'une population de cellules souches de moelle osseuse de jeunes porcs ou de foetus, dans un milieu comprenant au moins environ 0,2 ng/ml d'interleukine- 3 (IL-3) préférentiellement porcine (préférentiellement au moins 0,5 ng/ml, encore plus préférentiellement au moins 2 ng/ml), au moins environ 8 ng/ml de Stem Cell Factor (SCF) préférentiellement porcin (préférentiellement au moins 20 ng/ml, encore plus
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préférentiellement au moins 80 ng/ml) et au moins environ 0,1 ng/ml d'interleukine-4 ( IL-4) préférentiellement porcine (préférentiellement au moins 0,5 ng/ml, encore plus préférentiellement au moins 1 ng/ml), 10 ng/ml d'interleukine-6 (IL-6) préférentiellement porcine (préférentiellement au moins 50 ng/ml, encore plus préférentiellement au moins 100 ng/ml) et/ou 1 ng/ml de G-CSF préférentiellement porcin (préférentiellement au moins 5 ng/ml, encore plus préférentiellement au moins 10 ng/ml).
Ainsi le milieu d'obtention contient une combinaison d'IL4, d'IL6 et de G-CSF séparément, deux à deux ou tous les trois ensemble dans un milieu contenant de l'IL3 et du SCF.
Bien que ces différents facteurs soient préférentiellement d'origine porcine, c'est à dire que leur séquence est déduite de celle du facteur correspondant chez le porc, il est possible de remplacer au moins l'un d'entre eux par un facteur d'une autre origine.
Ainsi l'interleukine 4 (IL-4) bien que préférentiellement d'origine porcine, peut aussi être d'origine murine ou humaine.
Selon un mode de mise en oeuvre de ce procédé les porcs dont sont issues les cellules souches ont entre environ 2 jours et environ 6 semaines. Néanmoins le procédé peut être appliqué à des cellules issues d'embryons ou de porcs plus âgés.
De manière avantageuse les cellules sont maintenues dans le milieu pendant au moins environ 30 jours.
La présente invention a en outre pour objet des cultures et des lignées de mastocytes porcins susceptibles d'être obtenues par ledit procédé.
On entend par mastocytes des cellules qui, entre autres caractéristiques, présentent des granules cytoplasmiques métachromatiques contenant des molécules de type héparine et des protéases telles que de la tryptase, et expriment à leurs surfaces des récepteurs tels que le récepteur au SCF nommé ckit ou encore le récepteur des IgE.
Le terme culture désigne ici, de manière générale, une cellule ou un ensemble de cellules cultivées in vitro. Une culture développée directement à partir d'un prélèvement cellulaire ou tissulaire effectué sur un animal est dénommée culture primaire .
Le terme lignée est employé à partir du moment où au moins un passage, et généralement plusieurs passages consécutifs en sous-culture ont été effectués avec succès, et désigne toute culture qui en est issue (SCHAEFFER, In Vitro Cellular and Developmental Biology, 26,91-101, 1990).
La présente invention a en outre pour objet des cultures ou lignées de mastocytes porcins caractérisées en ce qu'elles produisent des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disaccharides Ils et Ills proche de celui de l'héparine porcine.
On entend par molécules de type héparine des polysaccharides hautement sulfatés dans lesquels plus de 80% des résidus glucosamine sont N-sulfatés et le nombre de O-sulfate est plus important que celui des N-sulfates.
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De manière avantageuse de telles cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disaccharides Ils et Ills compris entre 0,5 et 5 (préférentiellement entre1 et 2,5, encore plus préférentiellement entre 1,3 et 1,9) et/ou des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disaccharides Is et Ils compris entre environ 3 et 8 (préférentiellement entre 4 et 7 encore plus préférentiellement entre 5 et 7).
Des cultures établies ou lignées de mastocytes porcins selon la présente invention peuvent aussi être caractérisées en ce qu'elles produisent, au moins 0,1 g de molécules de type héparine/106 cellules (préférentiellement au moins 1 g, encore plus préférentiellement au moins 10 g).
De manière avantageuse de telles cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine dans lesquelles les quantités en disaccharides Is sont supérieures aux quantités en disaccharides Ils, les quantités en disaccharides Ils sont supérieures aux quantités en disaccharides Ills, et les quantités en disaccharides Ills sont supérieures aux quantités en disaccharides IVs, Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de telles cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine présentant des rapports entre les disaccharides !s, Ils, Ills et IVs proches de ceux de l'héparine.
De manière avantageuse de telles cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine comprenant au moins 30% de disaccharides Is (préférentiellement au moins 40%, encore plus préférentiellement au moins 50%).
De manière avantageuse de telles cultures ou lignées produisent, des molécules de type héparine présentant une activité anti-Xa supérieure à au moins 10 UI/mg (préférentiellement au moins 20 UI/mg) et/ou présentant une activité anti-Ila supérieure à au moins 10 Ul/mg (préférentiellement au moins 20 Ul/mg).
Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de l'invention de telles lignées sont les lignées de mastocytes porcins déposées auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France, le 09 Avril 2003 respectivement sous les n 1-3010, 1- 3011, 1-3012, 1-3013, 1-3014.
Ces lignées, déposées auprès de la CNCM, présentent l'avantage d'avoir été obtenues à partir de porcs répondant à des exigences sanitaires en adéquation avec un usage des produits dérivés de leurs cellules en thérapeutique humaine. Ces porcs sont issus d'élevages protégés, indemnes d'organismes pathogènes spécifiques (IOPS) du porc.
Des acides nucléiques, comprenant des gènes codant pour des facteurs susceptibles d'améliorer les caractéristiques des cultures et lignées selon la présente invention peuvent être introduits dans ces cellules. Le terme acide nucléique est employé pour désigner un ADN ou un ARN. Avantageusement il est un ADN complémentaire ou génomique.
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De tels facteurs peuvent permettre soit de favoriser la croissance des cellules soit de moduler la composition des molécules biologiques qu'elles produisent, et en particulier la composition des molécules de type héparine.
Ils peuvent être des gènes codants pour des protéines immortalisantes telles que l'antigène T du virus simien 40 (SV40), les protéine E6 et E7 du virus humain papilloma HPV, les protéines E1A de l'adénovirus, les protéines EBNA2 du virus d'Epstein-Barr ou encore les protéines Tax du virus HTLV-1. L'acide nucléique codant pour la sous-unité catalytique de la télomérase, TERT, peut aussi être utilisé comme gène immortalisant.
On utilisera préférentiellement l'AgT du virus SV-40, la séquence de l'ADN complémentaire de cet antigène est disponible dans GenBank sous la référence NC~001669..
Ils peuvent encore être des gènes codant pour des protéines permettant aux cellules de proliférer comme par exemple le G-CSF, le SCF et les interleukines (IL-3, IL-4 et IL-6).
Récemment, l'étude de mastocytomes murin et humain a permis d'identifier des mutations ou délétions du gène c-kit responsables de l'activation constitutive du récepteur c-kit. L'expression du gène c-kit muté au niveau du V814 dans des mastocytes immatures IC2 induit la transformation de ces cellules à savoir l'acquisition d'une croissance indépendante du SCF et d'un potentiel tumorigène (Pia et al, Blood, 87 (8), 3117-3123, 1996). Un acide nucléique comprenant un tel gène muté peut être introduit dans ces cellules.
Ils peuvent être des gènes codant pour des protéines comme la ser/gly ou des enzymes agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine. Une telle enzyme peut être une O-sulfatase, telle qu'une 3-0-sulfatase. ou encore une 6-0 sulfatase.
Avantageusement une telle enzyme est la 3 O-sulfatase-1 (3-OST-1), préférentiellement la 3 O-sulfatase-1 porcine.
Les acides nucléiques comprenant ces gènes peuvent être introduits dans ces cellules par toute méthode connue de l'homme du métier et en particulier par transfection, par nucléoporation ou par électroporation. Des vecteurs rétroviraux portant ces gènes peuvent aussi être utilisés pour transfecter ces cellules.
Dans le cadre de la présente invention la demanderesse a mis en évidence que l'introduction d'un acide nucléique codant une 3-OST, et en particulier la 3-OST-1, permet de moduler la composition des molécules de type héparine des mastocytes, quel que soit le type de mastocyte d'origine porcine.
La demanderesse n'entend donc pas limiter cet objet de son invention aux mastocytes obtenus par le procédé décrit ci dessus. Aussi la présente demande a pour objet tout mastocyte d'origine porcine dans lequel un acide nucléique codant une 3-OSTa été introduit.
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La demanderesse a en outre déterminé les séquences de trois protéines d'origine porcine pouvant être utilisées pour la mise en oeuvre de la présente invention et des séquences nucléotidiques codant ces protéines.
Ainsi la présente demande a pour objet une protéine d'origine porcine de type c-kit caractérisée en ce qu'elle présente une extrémité C-terminale ayant la séquence SEQ ID N 3. Une telle protéine peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 99% avec la séquence SEQ ID N 2. De manière préférentielle une telle protéine présente une glutamine (Q) en position 40 et/ou une lysine (K) en position 173. La présente invention a en outre pour objet un polynucléotide ou un acide nucléique, comprenant une séquence codant une protéine d'origine porcine de type c-kit. Un tel acide nucléique peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 99% avec la séquence SEQ ID N 1.
L'obtention de la séquence complète du c-kit porcin n'était pas évidente au vu de l'état de la technique.
La présente demande a de plus pour objet une protéine d'origine porcine
présentant une activité 3 -0-sulfatase. Une telle protéine peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 95%, préférentiellement d'au moins 97%, et encore plus préférentiellement d'au moins 99%, d'identité en acides aminés avec une protéine de séquence SEQ ID N 5.
présentant une activité 3 -0-sulfatase. Une telle protéine peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 95%, préférentiellement d'au moins 97%, et encore plus préférentiellement d'au moins 99%, d'identité en acides aminés avec une protéine de séquence SEQ ID N 5.
La présente invention a en outre pour objet un polynucléotide ou un acide nucléique, comprenant une séquence codant une protéine d'origine porcine présentant une activité 3-OST. Un tel acide nucléique peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 95%, préférentiellement d'au moins 97%, et encore plus préférentiellement d'au moins 99%, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N 4.
L'obtention de la séquence de la 3-OST porcine n'était pas évidente au vu de l'état de la technique. La 3-OST porcine isolée est susceptible de présenter des propriétés inattendues, et en particulier de présenter une meilleure activité dans les mastocytes porcins par rapport aux 3-OSTd'autres espèces connues de l'homme du métier La présente demande a encore pour objet une protéine d'origine porcine présentant une activité 6-0-sulfatase. Une telle protéine peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, et encore plus préférentiellement d'au moins 99%, d'identité en acides aminés avec une protéine de séquence SEQ ID N 7. La présente invention a en outre pour objet un polynucléotide ou un acide nucléique, comprenant une séquence codant une protéine d'origine porcine présentant une activité 6-OST. Un tel acide nucléique peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 95% préférentiellement d'au moins 97%, et encore plus préférentiellement d'au moins 99%, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N 6.
L'obtention de la séquence de la 6-OST porcine n'était pas évidente au vu de l'état de la technique. La 6-OST porcine isolée est susceptible de présenter des propriétés inattendues, et en particulier de présenter une meilleure activité dans
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les mastocytes porcins par rapport aux 3-OSTd'autres espèces connues de l'homme du métier En outre la présente demande a pour objet des acides nucléiques s'hybridant en conditions de forte stringence avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 4 ou de séquence SEQ ID N 6.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor , Madison, WISCONSIN.
A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1. 4.9 de mars 1996, BLAST 2. 0.4 de février 1998 et BLAST 2. 0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F Altschul et al, J. Mol. Biol. 1990 215 : 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25 : 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence requête de référence, à l'aide de l'algorithme d'Altschul et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.
Par conditions d'hybridation de forte stringence au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes : 1- Pré-hybridation des membranes et: -Mélanger: 40 l ADN sperme de saumon (10mg/ml)+ 40 pl ADN placentaire humain (10mg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace le mélange.
- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.
- Incubation à 42 C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- Compétition de la sonde marquée :
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- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 pl ADN Cot I, selon la quantité de répétitions.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C.
- Incuber à 65 C pendant 2 à 5 heures.
3- Hybridation : - Oter le mix de pré hybridation.
- Mélanger 40 l ADN sperme de saumon + 40 l ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace.
- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot # dénaturée.
- Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation.
4- Lavages : - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.
- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1 % à 65 C.
- 2 fois 15 minutes à 65 C SSC 1X et SDS 0,1% à 65 C.
Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.
Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985,"Nucleic acid hybridization : a practical approach", Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de F. AUSUBEL et al (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y).
Les protéines objets de la présente invention peuvent être obtenues par tous moyens connus de l'homme du métier. Elles sont néanmoins avantageusement obtenues par expression des acides nucléiques tels que décrits ci-dessus, codant pour ces protéines, éventuellement insérés dans des vecteurs d'expression, dans des cellules avantageusement choisies, suivie éventuellement par une extraction et une purification qui peut être totale ou partielle.
L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'invention.
Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprendra un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique codant pour une protéine ayant au moins 60% d'identité en acides aminés avec une séquence SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 7 ou un fragment peptidique ou un variant de cette dernière ;
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b) un acide nucléique comprenant un acide nucléique ayant une séquence
SEQ ID N 1, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 6, ou un fragment ou un variant de ce dernier ; c) un acide nucléique ayant au moins 60% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique ayant une séquence SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 6 ou un fragment ou un variant de ce dernier ; d) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 6, ou un fragment ou un variant de ce dernier.
SEQ ID N 1, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 6, ou un fragment ou un variant de ce dernier ; c) un acide nucléique ayant au moins 60% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique ayant une séquence SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 6 ou un fragment ou un variant de ce dernier ; d) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 6, ou un fragment ou un variant de ce dernier.
Par vecteur au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.
Selon un mode de réalisation, le vecteur d'expression comprend, outre un acide nucléique conforme à l'invention, des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants : (1) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique à insérer, tels que des promoteurs et des enhanceurs ; (2) la séquence codante comprise dans l'acide nucléique conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits aux (1) ; et (3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection.
Des cellules comprenant de tels acide nucléiques et/ou exprimant de telles protéines constituent d'autres objets de la présente invention. La présente demande est de plus relative à un procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture de cultures ou lignées de mastocytes porcins tels que décrits ci-dessus.
Les mastocytes, obtenus selon l'invention dans un milieu contenant de l'IL-3, du SCF et de l'IL-4, présentent une structure disaccharidique meilleure que ceux obtenus dans un milieu ne contenant que de l'IL-3 et du SCF.
La demanderesse a aussi montré que l'ajout d'IL-4 au milieu de culture permet d'obtenir à partir des mastocytes des molécules de type héparine présentant des caractéristiques plus proches de l'héparine porcine par rapport à celles obtenues en utilisant des cellules obtenues dans un milieu ne contenant que de l'IL-3 et du SCF ou contenant de l'IL-3 du SCF et de l'IL-6 ou de l'IL-3 du SCF et du G-CSF.
Aussi, la présente demande est de plus relative à un procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture, dans un milieu adapté, de cultures ou lignées de mastocytes porcins dans un milieu de culture
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comprenant au moins environ 0,1 ng/ml de IL-4 (préférentiellement au moins environ 0,5 ng/ml, encore plus préférentiellement au moins environ 1 ng/ml).
Des mastocytes peuvent aussi être modifiés afin de surexprimer de l'IL4. Ainsi un autre objet de la présente demande est un procédé de production de molécules de type héparine comprenant l'obtention de cultures ou lignées de mastocytes porcins transfectées par un acide nucléique codant pour l'IL4, et la mise en culture des ces cellules dans un milieu de culture adapté. De tels mastocytes constituent en eux-même un objet de la présente demande.
Ils peuvent être obtenus par toute méthode connue de l'homme du métier et en particulier par transfection, par nucléoporation ou par électroporation d'un acide nucléique comprenant un gène codant pour l'IL-4. Des vecteurs rétroviraux portant ces gènes peuvent aussi être utilisés pour transfecter ces cellules. La séquence de l'ADN complémentaire de l'IL-4 a été décrite par Bailey et al (Biochim. Biophys.Acta. 1171(3), 328-330,1993).
Les cellules, lignées et cultures selon la présente invention peuvent être maintenues en culture dans les conditions dans lesquelles elles ont été obtenues.
Elles peuvent aussi être maintenues en culture dans des milieux comprenant des quantités réduites de SCF, de GM-CSF, d'IL-3, d'IL-4 et/ou d'IL-6. Elles seront néanmoins préférentiellement maintenues dans un milieu contenant de l'IL-4.
Ces mastocytes seront de préférence cultivés dans un milieu de culture défini (MEMa/DMEM, RPMI, IMDM, ...) supplémenté en facteurs de croissance, utilisés en combinaison ou de façon individuelle.
Les milieux peuvent également être supplémentés avec du sérum bovin, à une concentration comprise entre 0,5% et 20% (v/v).
L'addition de sérum bovin dans les milieux de culture peut être remplacée par l'utilisation d'un milieu de culture sans sérum tel que AIMV (INVITROGEN) de façon à réduire la concentration protéique du milieu et les risques associés à l'utilisation de composés d'origine animale (KAMBE et al., J. Immunol. Methods, 240, 101-10, 2000).
L'indépendance des cellules vis-à-vis de l'ajout de sérum et/ou de l'utilisation de facteurs de croissance, peut être obtenue par mutation du phénotype cellulaire par l'action d'agents transformants et/ou immortalisants (TSUJIMURA, Pathology International, 46,933-8, 1996; PIAO et BERNSTEIN, Blood, 87 (8), 3117-23, 1996).
Les mastocytes peuvent être cultivés en utilisant les techniques développées pour la culture en masse de cellules eucaryotes, comme décrit par exemple par GRIFFITHS et al. (Animal Cell Biology, Eds. Spier et Griffiths, Académie Press, Londres, vol.3, 179-220,1986). On peut utiliser des bioréacteurs de capacité supérieure à plusieurs m3 comme décrit par PHILIPS et al. (Large Scale Mammalian Cell Culture, Eds. Feder et Tolbert, Académie Press, Orlando, U. S.A., 1985), ou par MIZRAHI (Process Biochem, Août, 9-12, 1983).
La culture peut également être réalisée en suspension ou sur micro-support selon la technique décrite par VAN WEZEL (Nature, 216,64-65, 1967).
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On peut également utiliser des systèmes de culture en lots (batch), qui sont fréquemment utilisés pour les cultures de cellules eucaryotes, du fait de leur plus grande simplicité de mise en #uvre à l'échelle industrielle (VOGEL et TODARO, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd edition, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, U. S.A., 1997). Les densités cellulaires obtenues avec ces systèmes sont généralement comprises entre 106 et 5 x 106 cellules/ml.
La productivité des cultures en batch peut être avantageusement augmentée en prélevant une partie des cellules du bioréacteur (70% à 90%) pour les opérations d'extraction des GAGs et d'isolement de l'héparine et en conservant les cellules restantes au sein du même bioréacteur pour initier une nouvelle culture. Dans ce mode de culture dit en batch répété on peut de plus distinguer les paramètres optimum de la phase de croissance cellulaire, de ceux permettant une plus grande accumulation de GAGs et d'héparine au sein des cellules.
Des systèmes de culture en continu de type perfusés, avec ou sans rétention cellulaire peuvent également être utilisés (VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102 (2), 275-278, 1987 ; CHAUBARD et al., Gen. Eng. News, 20,18-48, 2000).
Dans le cadre de la présente invention on peut notamment utiliser des systèmes de culture perfusés permettant la rétention des cellules à l'intérieur du réacteur, et aboutissant à une croissance et une production supérieure à celle pouvant être obtenue en batch. La rétention peut être effectuée par l'intermédiaire de systèmes de rétention de type filtre tournant (spin-filter), fibres creuses ou matrice solide (WANG et al., Cytotechnology, 9,41-49, 1992; VELEZ et al., J. Immunol.
Methods, 102 (2), 1987) Les densités cellulaires obtenues sont généralement comprises entre 107 et 5 x 107 cellules/ml. La culture en bio-réacteurs permet, par l'utilisation de capteurs de mesure en ligne, un meilleur contrôle des paramètres physico-chimiques de la croissance cellulaire : pH, p02, Red/Ox, substrats de croissance tels que vitamines, acides aminés, substrats carbonés (par exemple glucose, fructose, galactose), métabolites tels que lactate ou ammoniaque, etc.
Il peut être envisagé d'augmenter quantitativement et qualitativement le contenu en molécules de type héparine des mastocytes suite à un traitement avec le sodium butyrate (Nakamura et al (Biochim. Biophys.Acta. 627,60-70, 1980).
Après 3 à 14 jours de culture, de préférence après 3 à 5 jours, les cellules sont récoltées et séparées du milieu de culture, généralement par centrifugation ou filtration.
Différents systèmes de centrifugation peuvent être utilisés, on citera par exemple ceux décrits par VOGEL et TODARO (Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd Edition, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, U.S.A.).
Alternativement ou en combinaison avec la centrifugation, on peut effectuer la séparation par microfiltration tangentielle, à l'aide de membranes dont la porosité est inférieure au diamètre moyen des cellules (5 à 20pm) tout en permettant le passage des autres composés en solution/suspension. La vitesse du flux tangentiel et la pression appliquée sur la membrane sera choisie de façon à
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générer peu de force de cisaillement (nombre de Reynolds inférieur à 5000 sec-1) afin de réduire le colmatage des membranes et préserver l'intégrité des cellules pendant l'opération de séparation.
Différentes membranes peuvent être utilisées, par exemple, des membranes spirales (AMICON, MILLIPORE), des membranes planes ou des fibres creuses (AMICON, MILLIPORE, SARTORIUS, PALL, GF).
On peut aussi choisir des membranes dont la porosité, la charge ou le greffage permet d'effectuer une séparation et une première purification vis-à-vis d'éventuels contaminants pouvant être présents dans le milieu de culture, tels que protéines cellulaires, ADN, virus ou autres macromolécules.
L'utilisation de membranes de porosité plus réduite peut aussi être envisagée dans le cas où l'héparine aurait été libérée du contenu intracellulaire, par dégranulation ou lyse de tout ou partie des mastocytes, et est présente dans le milieu de culture au moment de l'étape de séparation. Dans ce cas, la séparation des cellules est combinée à une étape ultrafiltration sur une ou plusieurs membranes dont l'agencement et la porosité permet de concentrer l'héparine et de la séparer des autres espèces présentes dans le milieu, en fonction de la taille et du poids moléculaire, et éventuellement de la charge électrique ou des propriétés biologiques.
Dans le cadre de ce mode de mise en #uvre, le seuil de coupure des membranes est de préférence compris entre 1000 et 5 Kda. On peut utiliser des systèmes de membranes similaires à ceux employés pour la micro-filtration, par exemple, membranes spirales, membranes planes ou fibres creuses. On peut avantageusement utiliser des membranes permettant d'effectuer une séparation et une purification de l'héparine, du fait de leurs propriétés de charge ou du greffage de ligands présentant une affinité pour l'héparine (par exemple anticorps, ATIII, lectine).
Toutefois, on préférera généralement utiliser des méthodes de production et de récolte des cellules permettant de conserver l'héparine dans le contenu intracellulaire.
La récupération de l'héparine à partir des mastocytes peut aussi se faire après dégranulation ou lyse des cellules.
La dégranulation peut être provoquée par la fixation de ligands spécifiques sur les récepteurs présents à la surface des mastocytes, par exemple la fixation d'agents de type allergène (tels que fragment Fc des IgE ou analogues de ce fragment) sur les récepteurs IgE des mastocytes.
D'autres agents peuvent aussi induire une dégranulation des mastocytes. Ces agents peuvent être classés en plusieurs catégories telles que les agents cytotoxiques, les enzymes, les polysaccharides, les lectines, les anaphylatoxines, les composés basiques (composé 48/80, substance P, etc), le calcium (ionophore A23187, ionomycine, etc). [D. Lagunoff and T. W. Martin. 1983. Agents that release histamine from mast cells. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 23 :331-51]. L'utilisation d'agent de dégranulation peut être effectuée de façon répétée sur les
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mêmes cellules maintenues en culture. Dans ce mode de production la productivité est augmentée de façon significative par la simplification du procédé de récolte à partir du surnageant et par le maintien en culture des cellules.
Dans le cas particulier de l'ionophore A23187, la déranulation des mastocytes peut être induite par exemple par traitement de 2.10 cellules/ml de mastocytes avec l' ionophore A23187 à des concentrations comprises entre 1 à 100 g/ml et des temps d'action variant de 1 minute à 4 heures.
La lyse des mastocytes, peut être induite, par exemple, par choc osmotique en utilisant des solutions hypotoniques ou hypertoniques, par choc thermique (congélation/décongélation), par choc mécanique (par exemple sonication ou variation de pression), par action d'agents chimiques (NaOH, THESITTM, NP40TM,
TWEEN 20TM, BRIJ-58 M, TRITON X M-100,...) ou par lyse enzymatique (papaïne, trypsine,...) ou par combinaison de deux ou plusieurs de ces méthodes.
TWEEN 20TM, BRIJ-58 M, TRITON X M-100,...) ou par lyse enzymatique (papaïne, trypsine,...) ou par combinaison de deux ou plusieurs de ces méthodes.
Pour extraire et purifier l'héparine à partir du lysat cellulaire, séparer les chaînes polysaccharidiques du noyau serglycine, et séparer les chaînes d'héparine des autres GAGs présents dans le milieu d'extraction, on pourra utiliser des méthodes similaires à celles utilisées dans le cadre de l'extraction et la purification d'héparine à partir de tissus animaux, qui sont connues en elles-mêmes, et décrites dans des ouvrages généraux, tels que le manuel de DUCLOS, cité cidessus).
A titre d'exemples non-limitatifs, pour séparer l'héparine des acides nucléiques et des protéines cellulaires, et la solubiliser, c'est à dire rompre les liaisons avec le noyau serglycine : - on peut soumettre le lysat cellulaire à une ou plusieurs digestions enzymatiques (pronase, trypsine, papaïne, etc...) ; - les liaisons héparine-protéine peuvent être hydrolysées en milieu alcalin, en présence de sulfates ou de chlorures ; - on peut également effectuer un traitement en milieu acide (par exemple par de l'acide trichloracétique à froid) pour détruire les acides nucléiques et les protéines provenant des cellules, complété par l'utilisation d'une solution ionique qui permet de dissocier les interactions GAGs- protéines.
On peut également effectuer une extraction par la guanidine, après hydrolyse enzymatique ; pour purifier l'héparine solubilisée, on peut par exemple la précipiter par l'acétate de potassium, par un ammonium quaternaire, par l'acétone, etc.
Ces étapes de purification peuvent avantageusement être complétées ou remplacées par une ou plusieurs étapes de chromatographie, notamment de chromatographie d'échange d'anions.
La présente invention a également pour objet les préparations d'héparine susceptibles d'être obtenues à partir de cultures de mastocytes en mettant en #uvre un procédé selon l'invention.
Les préparations d'héparine conformes à l'invention, qui possèdent des propriétés biologiques comparables à celles des préparations d'héparine obtenues dans l'art antérieur à partir de tissus animaux, peuvent être utilisées dans toutes les applications usuelles de l'héparine.
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Les figures 1 A à 1 H illustrent le marquage anti-tryptase des mastocytes obtenus après 3 semaines de culture, respectivement dans les conditions C1 à C8. Les pics ombrés et clairs correspondent respectivement aux témoins(sans anticorps) et aux cellules obtenues dans les conditions C1 à C8.
Les figures 2 A à 2H illustrent le marquage des récepteurs IgE des mastocytes obtenus après 5 semaines de culture, respectivement dans les conditions C1 à C8. Les pics hachurés, ombrés et clairs correspondent respectivement à des cellules non-marquées (cellules porcines non-mastocytaires), à des cellules témoins et aux cellules obtenues dans les conditions C1 à C8.
Les figures 3 A à 3H illustrent le marquage anti-tryptase des mastocytes obtenus après 7 semaines de culture, respectivement dans les conditions C1 à C8. Les pics ombrés et clairs correspondent respectivement aux témoins et aux cellules obtenues dans les conditions C1 à C8.
Les figures 4 A à 4H illustrent le marquage FGF des mastocytes obtenus après 8 semaines de culture, respectivement dans les conditions C1 à C8. Les pics ombrés et clairs correspondent respectivement aux témoins et aux cellules obtenues dans les conditions C1 à C8.
La figure 5 illustre la croissance des cultures dans les différentes conditions C1 à C8 dans les 7 premières semaines de culture.
La figure 6 représente les structures chimiques des disaccharides Is, Ils Ills et IVs correspondant aux disaccharides N sulfatés de l'héparine, ainsi que les disaccharides homologues acétylés la lla, Illa et.lva.
La figure 7 illustre la croissance en réacteur des mastocytes obtenus dans les conditions C1, C7 et C8.
La présente invention est illustrée par les exemples de mise en oeuvre qui suivent. Ces exemples sont purement illustratifs et ne doivent pas être considérés comme limitatifs.
EXEMPLES EXEMPLE 1 : Isolement de populations de mastocytes à partir de moelle osseuse de jeunes porcs et obtention de lignées Les animaux utilisés pour les prélèvements sont issus d'élevages protégés, indemnes d'organismes pathogènes spécifiques (IOPS) du porc (MERIAL SA Lyon France) Le sternum de porcelets âgés de quatre et six semaines, respectivement PI et PIII sont prélevé aseptiquememt puis transporté dans un container stérile au laboratoire pour être décontaminé et rincé par successivement une solution d'eau de javel pure diluée au 1/100 en tampon PBS (Phosphate Buffer Saline pH 7. 4) puis en PBS. Les sternum sont ensuite coupés, puis la moelle osseuse est aspirée à l'aide d'une seringue pour être ensuite dilué en PBS.
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La suspension médullaire est tamisée sur une compresse stérile ; diluée dans 40 ml de PBS puis centrifugée 10 minutes à 400 g. Le culot cellulaire est repris dans 5 ml de PBS puis purifié sur 5ml de Ficoll (Dutscher) (1100gx10'). L'anneau contenant les cellules médullaires est récupéré puis rincé deux fois en PBS ( 14ml, 400gx10min) puis repris dans 2 ml de PBS pour être comptée, environ 1x 108 cellules totales par sternum.
Après comptage, les cellules sont centrifugées puis reprise à une concentration de 1-3 x106 cellules /ml en plaques de culture 6 puits et 4 ml par puits dans le milieu contentant les composants suivants : MEMO (Invitrogen) Sérum de veau Fetal
15% (PAA Laboratories) Penicilline (Sigma) 100 UI/mI, 100ug/ml Streptomycine (Sigma) 2ng/ml r-IL3 porcine (Biotransplant) 80ng/ml r-SCF porcin (Biotransplant).
15% (PAA Laboratories) Penicilline (Sigma) 100 UI/mI, 100ug/ml Streptomycine (Sigma) 2ng/ml r-IL3 porcine (Biotransplant) 80ng/ml r-SCF porcin (Biotransplant).
Dés la mise en culture les cellules sont cultivées dans le milieu de cultures décrit ci-dessus supplémenté en cytokines (IL4 recombinante porcine 1ng/ml R1 D systems; IL6 recombinante porcine 100ng/ml, R&D systems; G-CSF humain recombinant 10ng/ml) comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : conditions de culture des cellules
<tb>
<tb> cytokines <SEP> C1 <SEP> C2 <SEP> C3 <SEP> C4 <SEP> C5 <SEP> C6 <SEP> C7 <SEP> C8
<tb> IL4 <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP>
<tb> IL6 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> G-CSF <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
( + milieu avec; - milieu sans cytokine) Les plaques de cultures sont incubées à 38 C +/- 0.5 et sous atmosphère à 5% de C02.
<tb> cytokines <SEP> C1 <SEP> C2 <SEP> C3 <SEP> C4 <SEP> C5 <SEP> C6 <SEP> C7 <SEP> C8
<tb> IL4 <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP>
<tb> IL6 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> G-CSF <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
( + milieu avec; - milieu sans cytokine) Les plaques de cultures sont incubées à 38 C +/- 0.5 et sous atmosphère à 5% de C02.
Deux fois par semaine et pendant huit semaines, le milieu de chaque puits est renouvelé avec du milieu frais. La caractérisation du phénotype mastocytes des cellules isolées est réalisée dés la semaine 2 puis à intervalles réguliers (semaine 3, semaine 5 et semaine 7) Des lignées de mastocytes porcins, obtenues dans certaines des conditions indiquées ci-dessus, ont été déposées auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) le 09 avril 2003.
Ces lignées déposées sous les n 1-3010, 1-3011, 1-3012, 1-3013, 1-3014 ont été respectivement obtenues dans les conditions C1, C2, C3, C4 et C5 décrites dans le tableau 1.
La confirmation du phénotype mastocyte des cellules dans chaque condition de culture est mise en évidence par la détection en fluorocytometrie de la présence des marqueurs spécifiques tel que récepteur aux IgE, et tryptase. La détection du marquage avec le FGF est aussi réalisée pour la révélation du site de fixation du FGF sur l'héparine des mastocytes.
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Marquage de la tryptase 1 ml de suspension cellulaire de chaque condition est prélevé. Chaque échantillon est rincé une fois par centrifugation en tampon PBS, puis les cellules sont resuspendues dans 400 l de tampon PBS contenant 0. 5% de BSA ( Bovine Sérum Albumine ) et 0.01 %d 'azide de sodium.
Les cellules sont ensuite perméabilisées à 4 C en solution cytofix/cytoperm (Pharmingen), 200ml par échantillon et incubées 25 minutes. Après deux rinçage en tampon permawash( Pharmingen) les échantillons sont incubés 30 minutes à 4 C avec 1 g d'anticorps monoclonal murin spécifique de la tryptase (Mouse antihuman Mast cell tryptase ; Chemicon) Après trois rinçages en tampon permawash, le marquage est révélé par incubation pendant 25 minutes avec un conjugué anti immunoglobulines de souris marqué au FITC ( FITC-conjugates Affinity pure Goat Anti Mouse IgG ; Jackson Immunoresearch) Des dupliquas d 'échantillons sont réalisés selon la même procédure à l'exception de l'incubation avec l'anticorps anti tryptase afin de pouvoir soustraire lors de l'analyse la fluorescence due à la liaison non spécifique du conjugué marqué FITC.
A la fin de la dernière incubation, les cellules sont rincées deux fois en tampon permawash, puis remise ne suspension en tampon PBS froid additionné de 1% de formaldéhyde (Sigma) L'analyse en cytofluorimétrie est réalisée sur FACS (Faxcalibur Becton Dickinson) Marquage du récepteur aux IgE Environ 2x105 cellules de chaque condition sont prélevées, rincées deux fois en PBS puis incubées avec 2 g pour 106 cellules d'IgE canine (Monoclonal Canine IgE; Bethyl) Les échantillons sont incubés 3h30min à 37 C, puis rincée deux fois en PBS. Après remise en suspension en PBS, les échantillons sont ensuite incubés pendant 30 minutes à 4 C avec 5 g pour 106 cellules d'anticorps de chèvre anti IgE canine (Goat anti Dog IgE affinity purified ; Bethyl) Après incubation, les échantillons sont rincés de nouveau deux fois en PBS, puis incubés pendant 30 minutes avec un conjugué anti Ig de chèvre marqué au FITC (Donkey anti Goat/Sheep FITC; Serotec) Après deux rinçages en tampon PBS, les échantillons sont remis en suspension et fixés en tampon additionné de 1% de formaldéhyde. Comme précédemment des dupliquas d'échantillons sont aussi réalisés en omettant l'incubation avec l'IgE afin de soustraire lors de l'analyse la fluorescence due à la liaison non spécifique du conjugué marqué FITC. Un échantillon de cellules porcines non mastocytaire (IRP) est aussi analysé dans les mêmes conditions afin de confirmer la spécificité du marquage.
Marquage du site de fixation du FGF.
Les échantillons de culture cellulaire à analyser sont répartis dans une plaque 96 puits, fond conique, à raison de 0,2.106 par puits puis centrifugés à 1400 trs/mn, 4 mn. Le culot cellulaire est rincé dans 100 l de tampon PBS contenant 5g/l
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d'albumine bovine puis centrifugé à 1400 trs/mn, 4 mn. Deux rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions.
Les culots cellulaires sont dilué dans un tampon de fixation/perméabilisation
Cytofix/Cytoperm, (Pharmingen), rincé dans 100 l de tampon PermIWash (Pharmingen) puis centrifugé à 1400 trs/mn, 4 mn, 4 C. Trois rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions.
Cytofix/Cytoperm, (Pharmingen), rincé dans 100 l de tampon PermIWash (Pharmingen) puis centrifugé à 1400 trs/mn, 4 mn, 4 C. Trois rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions.
Les culots cellulaires sont dilués dans 100 l de tampon PermIWash contenant 172 ng/ml de FGF basic (R&D systems) et incubés 30 minutes dans la glace. Les cellules sont rincées dans 100 l de tampon PermIWashTM puis centrifugées à
1400 trs/mn, 4 mn, 4 C. Trois rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions.
1400 trs/mn, 4 mn, 4 C. Trois rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions.
Les culots cellulaires sont dilués dans 100 l de tampon Perm/Wash contenant
1 g d'anticorps monoclonal de souris anti-FGF basic (R&D systems) couplé à la biotine et incubés 30 minutes dans la glace. Les cellules sont rincées dans 100 l de tampon Perm/Wash puis centrifugées à 1400 trs/mn, 4 mn, 4 C. Trois rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions.
1 g d'anticorps monoclonal de souris anti-FGF basic (R&D systems) couplé à la biotine et incubés 30 minutes dans la glace. Les cellules sont rincées dans 100 l de tampon Perm/Wash puis centrifugées à 1400 trs/mn, 4 mn, 4 C. Trois rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions.
Les culots cellulaires sont dilués dans 100 l de tampon Perm/Wash contenant une solution de streptavidin peridinin chlorophyll-a protein et incubés 20 minutes, dans la glace, à l'obscurité. Les cellules sont rincées dans 100 l de tampon PermIWashTM puis centrifugées à 1400 trs/mn, 4 mn, 4 C. Trois rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions. Le culot est dilué dans 150 l de tampon PBS froid contenant 5g/l d'albumine bovine, 0,01% d'azide de sodium, 1% formaldehyde. La présence du marquage intra cytoplasmique est détectée par cytofluorimétrie.
Des dupliquas d'échantillons sont réalisés selon la même procédure à l'exception de l'incubation avec l'anticorps anti-FGF afin de pouvoir soustraire lors de l'analyse la fluorescence due à la liaison non spécifique du conjugué marqué FITC. Un échantillon de cellules porcines non mastocytaire (IRP) est aussi analysé dans les mêmes conditions afin de confirmer la spécificité du marquage Les figures 1,2, 3 et 4 présentent les résultats de la caractérisation phénotypique des mastocytes obtenus respectivement après 3,7et 8 semaines de culture.
On observe un marquage positif et spécifique des cellules vis à vis des marqueurs des mastocytes, récepteur IgE, et tryptase ainsi que la détection de la liaison intracellulaire du FGF. La détection réalisée sur les cellules à partir de la troisième semaine de mise en culture est positive pour la présence de tryptase. Les cultures dans les conditions 1à 5 sont homogène, et contiennent 100% de mastocytes, comme révélé par un marquage du récepteur aux IgE à partir de la semaine 5.
En semaine 7, les cultures en conditions C1à C5 et C7 sont homogènes à 100%, l'homogénéité des cultures en conditions C6 et C8 est supérieure à 50%.
Analyse en microscopie Electronique La caractérisation des cellules isolée a aussi été complétée par observation en microscopie électronique. Les cellules présente une morphologie caractéristique
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des mastocytes avec de nombreuses granulations, avec un gros noyau excentré, un contour irrégulier.
Prolifération cellulaire lors de l'isolement A intervalles réguliers, des échantillons de culture pour chaque condition (C1 à C8) sont prélevés et comptés au microscope après dilution en tampon PBS additionné de 0. 4% de bleu trypan.
On observe une diminution de la concentration cellulaire lors des quatre premières semaines de culture (S1 à S4) correspondant à la mort et la lyse des cellules médullaire non stimulées par le SCF et au passage d'une culture hétérogène à une culture essentiellement mastocytaire. Dés la cinquième semaine (S5) on observe une prolifération des cultures corrélée avec un marquage plus intense des marqueurs spécifiques de mastocytes. La prolifération est sensiblement plus importante pour les conditions de culture comprenant de l'IL4 (figure 5).
Caractérisation du contenu héparine des cultures en HPLC Après 15 semaines de culture et amplification, des échantillons ont été prélevés pour analyser la composition en protéoglycanes des mastocytes selon le protocole décrit par Linhardt et al (Biomethodes, 9,183-197, 1997) Les échantillons sont traités de la façon suivante :
Protéolyse : Les échantillons cellulaires, 2x1 06 cellules, sont centrifugés et rincés deux fois en tampon PBS. Chaque culot est repris dans 100 l d'eau distillée additionnés de 10 l d'alcalase (Novozymes) puis chauffé pendant 5 heures à 60 C sous agitation. Puis les échantillons sont dilués avec 200 l de tampon Tris 10mM pH 7. 0 ( Prolabo) 0. 5M NaCI (Prolabo) avant d'être centrifugés pendant 10 minutes à 10.000 Trs/min. L'étape de protéolyse permet de libérer le contenu intracellulaire et de dissocier les liaisons protéines-polysaccharides.
Protéolyse : Les échantillons cellulaires, 2x1 06 cellules, sont centrifugés et rincés deux fois en tampon PBS. Chaque culot est repris dans 100 l d'eau distillée additionnés de 10 l d'alcalase (Novozymes) puis chauffé pendant 5 heures à 60 C sous agitation. Puis les échantillons sont dilués avec 200 l de tampon Tris 10mM pH 7. 0 ( Prolabo) 0. 5M NaCI (Prolabo) avant d'être centrifugés pendant 10 minutes à 10.000 Trs/min. L'étape de protéolyse permet de libérer le contenu intracellulaire et de dissocier les liaisons protéines-polysaccharides.
Extraction : Le surnageant de chaque échantillon est purifié par échange d'ions sur résine ammonium quaternaire SAX en format plaque 96 puits, 100mg/2ml (Thermohypersil).. Après fixation et lavage en tampon Tris pH7, NaCI 0. 5M, les Glyco-aminoglycans (GAGs) sont élués par 500 pl de tampon Tris pH7.0, NaCI 3M.
Dessalage/concentration: Les échantillons sont ensuite dessalés sur colonne de gel perméation (NAP-5, Pharmacia) Après élution dans un volume de 1 ml, les échantillons sont concentrés par lyophilisation, puis repris dans 130 l d'eau distillée.
Dépolymérisation.
Pour l'analyse HPLC, les GAGs sont dépolymérisés par un mélange d'héparinases I, Il et III (Grampian enzymes) Chaque solution d'héparinase est ajustée à 0.5UI/ml en tampon phosphate. La solution d'héparinases I, II, III est préparée en mélangeant 1/3 volume à volume de chaque solution d'héparinase. Pour 100 l d'échantillon à analyser, on ajoute 15 l du mélange d'héparinase et 10 l de tampon acétate contenant 0.73 ml d'acide acétique 100% (Prolabo) 12. 5mg d'albumine bovine (Sigma) et 39. 5 mg d'acétate de calcium (Prolabo) pour 30 ml d'eau distillée.
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Analyse HPLC.
Les échantillons sont ensuite analysés par HPLC sur colonne Waters spherisorb SAX 5 m, 250x3mm, Thermohypersil. 50 pl d'échantillon sont injectés par analyse, le tampon de la phase mobile est composé de 2.5mM de Sodium Di Hydrogeno Phosphate (Na2HP04, Prolabo) dont le pH est ajusté à 2. 9 avec de l'acide ortho-phosphorique(H3P04,Prolabo). L'élution des disaccharides constitutifs des GAGs extraits des échantillons cellulaires est réalisé dans un gradient de 0 à 100% en 50 minutes de tampon Na2HP04 2. 5 mM et 1M de perchlorate (NaCI04, Prolabo) Les disaccharides sont détectés par leur temps de rétention et par rapport à un échantillon d'héparine standard (Aventis) en UV à 234 nM.
L'analyse des cultures cellulaire après 15 semaines de culture révèle la présence en quantités importantes de composés de type héparine dans les cellules, confirmant la nature spécifiquement mastocytaire des cultures isolées.
On retrouve en effet les disaccharides majeurs constitutifs de l'héparine tel que décrit par Linhardt et al (Biomethodes, 9,183-197, 1997).
Ces disaccharides sont principalement représentés par le Is, Ils Ills et IVs (structures chimiques représentées sur la figure 6) correspondant aux disaccharides N sulfatés de l'héparine. On retrouve aussi les disaccharides homologues acétylés lia, Illa et !Va (figure 6).
Le tableau 2 présente les compositions obtenues pour chaque culture.
On observe une modulation reproductible de la structure disaccharidique en fonction de la présence ou non d'IL4, cette modulation est majoritairement observée sur le pourcentage des disaccharides Ils et Ills.
EXEMPLE 2 : Mise en culture des lignées et analyse de la production de molécules de type héparine Le profil disaccharidique des mastocytes isolée, a été analysé pour trois conditions de milieux de culture (C1, C7 et C8) Les cellules ont été amplifiées en suspension et mises en culture en spinner de 100ml.
Culture cellulaire.
La densité cellulaire initiale est de 2x105 cellules par ml, les cellules sont incubées sous atmosphère de 5% de C02 à 37 C et un comptage à intervalle régulier est effectué au microscope.
Des échantillons des cultures ainsi réalisées sont prélevés lors des comptages pour analyse en HPLC du contenu en polysaccharides de types héparine et mesure de l'activité biologique anti lia et anti Xa.
Dans ces conditions, la densité cellulaire maximale est comprise entre 4 et 6.105 cellules/ml avec un temps de doublement en phase exponentielle compris entre 24 et 48 heures.
La figure 7 illustre la croissance des mastocytes au 14éme passage.
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Analyse des polysaccharides.
L'analyse en HPLC des échantillons pour trois jours de récolte (J4, J7 et J10) montre pour toutes les cultures un profil de type héparinique des polysaccharides avec un effet de l'IL4 sur le pourcentage relatif des disaccharides Ils et Ills. La productivité des cultures est significative, comprise entre 2 et 12 g pour 106 cellules.
Par comparaison, les cultures de lignées de mastocytes de l'espèce murine tel que les cellules MST décrite par Montgomery et al (Proc.Natl. Acad. Sci., 89, 11327-11331,1992) ou la lignée humaine de mastocytes HMC1 (Butterfield et al Leuk Res, 12 (4),345-355,1988) une productivité de composés de type héparine 20 à 200 fois inférieure aux lignées porcine objets de la présente invention. (Tableaux 3 et 4) Activité biologique des polysaccharides : L'inactivation des facteurs Xa et lla est caractéristique de l'héparine et permet de la différencier de l'héparane sulfate et du dermatane. La méthode utilisée est celle décrite dans la monographie de la pharmacopée Européénene3ieme édition (1997).
La réaction se déroule en trois étapes : 1 : ATIII + héparine [ATIII- Héparine] 2 : [ATIII - Héparine] + Facteur en excès [ATIII-Heparine-Facteur] + Facteur résiduel 3 : Facteur résiduel + Substrat chromophore Para-nitroaniline coloré La quantité de Paranitroaniline libérée est inversement proportionnelle à la quantité d'héparine.
La quantité anti-Xa ou Anti-Ila est mesurée par rapport à une droite d'étalonnage établie avec le standard SPIM ( Standard International Héparine) La sensibilité de la méthode est de 0.006UI/ml.
L'activité biologique est exprimée en Ullmg en tenant compte de la quantification des disaccharides obtenue par HPLC.
L'analyse réalisée au 10 jour de récolte après la fin de la phase de croissance révèle une activité biologique anti-Xa et anti-Ila comprise entre 10 à 25 Ul/mg.
On remarque que pour ce stade de la culture, que le ratio entre les deux activités est proche de 1, ce qui est le ratio caractéristique de l'héparine issue de l'extraction à partir de la muqueuse intestinale de porc.
Les résultats obtenus par mesure de l'inactivation des facteurs Xa et lia sont résumés dans le tableau 5.
Tableau 5 : mesure de l'inactivation des facteurs Xa et lia
<tb>
<tb> Condition <SEP> C1 <SEP> C7 <SEP> C8
<tb> Activité <SEP> anti-Ila <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 26
<tb> (Ul/mg)
<tb> Activité <SEP> anti-Xa <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 26
<tb> (Ul/mg)
<tb>
<tb> Condition <SEP> C1 <SEP> C7 <SEP> C8
<tb> Activité <SEP> anti-Ila <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 26
<tb> (Ul/mg)
<tb> Activité <SEP> anti-Xa <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 26
<tb> (Ul/mg)
<tb>
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EXEMPLE 3 : Modificationgénétique des cellules isolées
Les mastocytes peuvent être modifiés génétiquement par l'introduction d'un acide nucléique exogène en utilisant par exemple des techniques de transfection, d'électroporation, de nucléoporation ou d'infection ce qui résultera en l'expression transitoire ou stable de l'acide nucléique introduit. Dans le cas d'une expression stable, l'ADN peut être intégré dans le génome cellulaire ou être maintenu comme épisome.
Les mastocytes peuvent être modifiés génétiquement par l'introduction d'un acide nucléique exogène en utilisant par exemple des techniques de transfection, d'électroporation, de nucléoporation ou d'infection ce qui résultera en l'expression transitoire ou stable de l'acide nucléique introduit. Dans le cas d'une expression stable, l'ADN peut être intégré dans le génome cellulaire ou être maintenu comme épisome.
1Transfection par nucléoporation et électroporation.
Des cellules transfectées stablement peuvent être obtenues en utilisant la méthode de nucléoporation décrite ci-dessous, en appliquant, 24 à 72 heures après la nucléoporation, une pression de sélection (hygromycine, généticine, blasticidine, puromycine ou zeocine. La résistance à l'agent de sélection est conférée par l'intégration du plasmide porteur du gène d'intérêt et du gène de résistance.
Nucléoporation Cette méthode, est utilisée préférentiellement car elle permet de cibler l'ADN directement dans le noyau.
1 à 2.106 mastocytes, en phase exponentielle, préférentiellement après 3 ou 4 jours de culture, sont centrifugés à 1000 rpm 5 minutes et repris dans 100 l de solution de nucléofection (Amaxa, Kit 8351). 2 à 4 g de pcDNA3.1-eGFP, plasmide codant pour la GFP, sont ensuite ajoutés à la suspension cellulaire. Les cellules sont alors transférées dans la cuvette d'électroporation et soumises à un choc électrique par l'utilisation d'un programme spécifique (comme U14, T20 et T22 AMAXA) Les cellules sont ensuite transférées dans 2 ml de milieu complet préchauffé à 37 C puis incubées à 37 C, 5%C02.
24 à 48 heures après la transfection, les cellules sont récoltées pour être fixées au paraformaldéhyde (Prolabo) 1 %. Pour cela, la totalité de la culture est centrifugée 5 min à 1000 rpm. Après élimination du surnageant, les cellules sont lavées dans 4 ml de PBS 1x puis centrifugées à nouveau. Le culot cellulaire est ensuite repris dans 1 ml de paraformaldéhyde 1 %. Les cellules ainsi fixées sont ensuite analysées au cytomètre (Cytomics FC 500, Beckman Coulter) Les conditions de nucléoporation décrites ci-dessus permettent de transfecter les mastocytes de porc avec une efficacité de transfection comprise entre 30 à 50 % tout en obtenant une bonne viabilité cellulaire, supérieure à 50% Electroporation 1 à 5.106 cellules, en phase exponentielle, sont mises en contact avec 1 à 30 g d'ADN. Les cellules, transférées dans une cuvette d'électroporation 4 mm, sont incubées 5 min dans la glace avant d'être électroporées à un voltage compris entre 150 V et 400 V avec une capacitance de 500 ou 960 F (Gene Pulser II, Biorad) Après électroporation, les cellules sont à nouveau incubées 5 min dans la
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glace pour être finalement transférées dans 5 ml de milieu de culture complet et incubées à 37 C, 5%C02.
Le processus de sélection de cellules ayant intégrées le transgène de façon stable utilise la même technique que décrit ci-dessus en utilisant la résistance conférée par l'intégration du plasmide à un agent de sélection.
2 Transfection par des vecteurs viraux, utilisation de vecteurs retro-viraux pantropiques.
Alternativement aux méthodes de transfection par éléctroporation et nucléoporation, on peut utiliser des vecteurs retro-viraux recombinants et délétés pour la réplication. On peut par exemple utiliser des vecteurs pseudo typés avec la glycoprotéine d'enveloppe du vesicular stomatitis virus (VSV-G) qui permet la production de vecteurs retro-viraux pantropiques, capable d'infecter des cellules porcines.
Dans ce mode de transfection, le vecteur rétro-viral porteur du gène d'intérêt à exprimer ou intégrer dans le mastocyte porcin est produit dans un premier temps à l'aide du cellule d'empaquetage telle que GP-293 (Clontech protocol ref PT 3132-1), qui possède les éléments génétique pour la production du vecteur (gag et pol) à l'exception du gène pour la production de la protéine d'enveloppe pseudo- typée (env- VSV-G).
Lors de la production du vecteur rétro-viral, les cellules d'empaquetage sont co- transfectées avec le plasmide codant pour le gène d'enveloppe VSV-G et un plasmide rétro-viral codant pour le gène d'intérêt sous contrôle d'un promoteur avec ou sans gène de sélection.
Pratiquement, les cellules GP-293 sont mises en culture 48h à 72 heures avant la transfection afin d'être en phase exponentielle de croissance. Le jour de la transfection, le milieu de culture est changé par du milieu frais (15-20 ml pour 106 cellules), puis 1 à 2 ml de solution contenant le mélange du plasmide VSV-G (5 à 20g pour 106 cellules) et du plasmide porteur du gène d'intérêt (10 à 30 g pour 10 cellules), en tampon pH7 phosphate de calcium sont ajoutés goutte à goutte dans le milieu de culture (1 à 2ml (Promega) Les cellules sont ensuite remises à incuber pendant 16 à 24 heures à 37 C ou préférablement à une température comprise entre 32 et 35 C. Le milieu de culture est changé à nouveau avec du milieu frais. Les cellules sont incubées pendant 48 heures supplémentaires à 32-35 C. A la fin de la période d'incubation, le surnageant de culture contenant les vecteurs rétro-viraux néo-formés est récolté.
Une partie du surnageant d'infection des cellules d'empaquetage est aliquoté et congelé à -80 C, l'autre partie est mélangée au milieu de culture des mastocytes en phase exponentielle de croissance de croissance. En pratique les mastocytes en culture sont centrifugés et resupendus dans un milieu contenant 50% de milieu frais et 50% de surnageant d'infection. Les mastocytes sont mis à incuber pendant 24 heures à 32-35 C, puis le milieu est changé à nouveau par du milieu frais.
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48 à 72 heures après l'infection des mastocytes, des échantillons sont prélevés pour analyser par cytofluorimetrie dans le cas du témoin d'infection avec le gène rapporteur fluorescent GFP (Green Fluorescent Protein) ou par PCR pour les infections avec le gène d'intérêt. Par cytofluorimetrie la mesure de l'efficacité de transfection est supérieure à 20% des cellules totales.
Les populations de cellules transfectés sont ensuite sélectionnées en ajoutant dans le milieu de culture l'agent cytotoxique (Hygromycine, puromycine, G418, Zeocyne) pour lequel seuls les mastocytes transfectés avec le vecteur retro-viral porteur du gène d'intérêt et du gène de résistance continuent à pousser. Par cette méthode le gène d'intérêt est stablement intégré et s'exprime de manière stable.
Après sélection et clonage des populations, l'agent de sélection peut être enlevé du milieu de culture tout en conservant l'expression du gène d'intérêt. Le vecteur rétroviral produit de cette façon ne se réplique pas dans le mastocyte hôte et il n'y' a donc pas production de vecteurs réplicatifs.
Alternativement, on peut aussi utiliser des vecteurs pour lesquels l'expression est soumise à une induction du promoteur régulant l'expression du gène d'intérêt par un composé ajouté au moment voulu dans le milieu de culture.
EXEMPLE 4 : Isolement du gène c-kit porcin Le gène c-kit porcin a été isolé par 3'-RACE en utilisant comme source d'ARN, des ARN totaux isolés à partir d'une culture de mastocytes de foie de porc d'après la procédure publiée précédemment (Piu et al, CR Acad. Sci. Paris, 316,772-779, 1993).
La transcription inverse de 2 g d'ARN totaux en ADNc a été effectuée en suivant le protocole du kit 5'/3' RACE (Roche), en utilisant comme amorce un oligodT nommé OligodT anchor primer de séquence SEQ ID N 8 5' gac cac gcg tat cga tgt cga ctt ttt ttt ttt ttt ttv . L'ADNc est ensuite amplifié par PCR en utilisant le protocole du kit Expand High fidelity system (Roche).
La PCR a été réalisée sur 1 l d'ADNc, avec l'amorce sens C15203 s'hybridant spécifiquement dans la région 5' non codante du gène c-kit porcin (nucléotides 24 à 42 par rapport à la séquence c-kit porcin publiée, Réf GenBank AJ223228, de séquence SEQ ID N 9 5' gga att cct cga gag cag gaa cgt gga aag gag et l'amorce anti-sens nommée PCR anchor primer de séquence SEQ ID N 10 5 gac cac gcg tat cga tgt cga c 3' s'hybridant de façon spécifique en 3' au niveau de l'amorce oligo dT. 10 cycles puis 25 cycles PCR ont été appliqués (cycle 1 : 15 sec de dénaturation à 94 C, 45 sec d'hybridation à 55 C et 4 min d'élongation à 68 C, cycle 2 : 15 sec de dénaturation à 94 C, 45 sec d'hybridation à 60 C et 4 min d'élongation à 68 C).
Le produit PCR obtenu est purifié sur gel agarose 1 % TBE1x, en utilisant le kit Quiaquick gel extraction kit (Quiagen).
Une seconde PCR, identique à la première est réalisée sur 1/30'ème du produit PCR purifié, en appliquant 25 cycles thermiques (15 sec de dénaturation à 94 C, 45 sec d'hybridation à 60 C et 4 min d'élongation à 68 C). A l'issue de la seconde
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PCR, le produit PCR est à nouveau purifié pour le cloner dans un vecteur pGEMTeasy suivant le protocole pGEM-T Easy vector system (Promega).
La séquence du gène porcin est ensuite partiellement déterminée par séquençage. La séquence nucléotidique obtenue est la séquence SEQ IDN 1. La séquence protéique déduite est la séquence SEQ IDN 2. Cette séquence SEQ ID N 1 montre des différences par rapport à la séquence publiée sous la référence AJ 223228. En effet l'extrémité C terminale présente 9 acides aminés supplémentaires et les différences suivantes dans la séquence nucléotidique ont été observées, conduisant à la modification de deux acides aminés : Modifications(par rapport à la séquence publiée AJ 223228): nt237t-g, : H # Q nt351 a # t nt 523 a # c nt 606 c # t nt 609 g # a nt635g->a,: R-K nt 639 c t nt 663 c # g nt 669 c # a
nt 2016 a g nt 2865 c # t EXEMPLE 5: Isolement et séquençage de la séquence 3' codante du aène 3OST porcin La séquence partielle du gène porcin codant pour la 3-OST est disponible dans une banque EST (GenBank accession number BF075483). L'alignement de cette séquence avec la séquence humaine montre qu'il manque environ 650 pb de la région codante en 3'.
nt 2016 a g nt 2865 c # t EXEMPLE 5: Isolement et séquençage de la séquence 3' codante du aène 3OST porcin La séquence partielle du gène porcin codant pour la 3-OST est disponible dans une banque EST (GenBank accession number BF075483). L'alignement de cette séquence avec la séquence humaine montre qu'il manque environ 650 pb de la région codante en 3'.
La portion manquante du gène 3-OST porcin a été identifiée en combinant la RTPCR et le 3'-RACE en utilisant comme source d'ARN, des ARN de foie de porc isolés d'après le protocole du kit Trizol (Invitrogen) La transcription inverse de 2 g d'ARN totaux en ADNc a été effectuée en suivant le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem (Invitrogen), en utilisant comme amorce un mélange des oligonucléotides BS02 et BS03 de séquences respectives SEQ ID N 11 5'-GCA GCA GCC ACG TCG GG-3' et SEQ ID N 12 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC-3'.
2 l de ces ADNc ont ensuite été amplifiés par PCR en présence d'une amorce sens BS05 de séquence SEQ ID N 13 5'-CGG NGA CCG CCT NAT CAG-3' et d'une amorce anti-sens BS06 de séquence SEQ ID N 14 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC-3' avec la KOD hot start Polymerase (Novagen). Après les 30 cycles thermiques (15 sec de dénaturation à 98 C, 30 sec d'hybridation à 60 C et 30 sec d'élongation à 68 C), le fragment amplifié de 277 pb a été cloné dans le vecteur
pCR-Blunt Il TOPO (invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit) puis séquence.
pCR-Blunt Il TOPO (invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit) puis séquence.
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La séquence de ce fragment a été utilisée pour générer 2 amorces BS21 et BS22 pour isoler, par 3'-RACE, la totalité de la région 3'.
Dans le cadre du 3'-RACE, 1 l d'ARN porcin de foie a été reverse transcrit en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en utilisant comme amorce l'oligodT CDSIII de séquence SEQ ID N 15 (5'-ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG T30 VN-3').
La région 3' du gène codant pour la 3-OST a été ensuite amplifié par 2 PCR successives. La première PCR a été réalisée sur 2 pl d'ADNc, obtenu précédemment, avec l'amorce sens BS21 de séquence SEQ ID N 16 5'-GCA CCC CCA GAT CGA CCC C-3' et une amorce anti-sens CDSIII. 30 cycles thermiques ont été appliqués (10 sec de dénaturation à 94 C, 30 sec d'hybridation à 60 C et 120 sec d'élongation à 68 C). La seconde PCR a ensuite été réalisée dans les mêmes conditions que la première PCR avec 1 l de produit issu de la première PCR en utilisant l'amorce sens BS22 de séquence SEQ ID N 17 5'-CAA ACT CCT CAA TAA ACT GCA CG-3' et l'amorce anti-sens CDSIII.
Le séquencage du produit PCR ainsi obtenu à l'issue du 3'-RACE a permis d'identifier la séquence 3' de la 3-OST porcine ainsi qu'environ 250 pb de la région non codante.
Isolement de la phase codante complète du gène 3-OST porcin.
Afin de cloner la phase codante complète de la 3-OST porcine, une nouvelle expérience de RT-PCR a été réalisée en utilisant les informations obtenues dans la première étape.
La source d'ARN est la même que dans l'étape précédente.
2 g d'ARN ont été reverse transcrit en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en utilisant comme amorce un oligonucléotide dT24.
Le gène codant pour la 3-OST a été ensuite amplifié par PCR en deux étapes. La première PCR a permis d'amplifier le gène y compris une portion de la séquence 3' non codante du gène, la seconde PCR a ensuite permis d'amplifier la séquence codante en utilisant des amorces compatibles avec le système Gateway (I nvitrogen) La première PCR a été réalisée sur 2 l d'ADNc avec une amorce sens BS10 de séquence 5'-AGG CCC GTG ACA CCC ATG AGT-3' s'hybridant spécifiquement dans la région 5' non codante du gène 3-OST porcin et une amorce BS30 antisens de séquence 5'-CAC CTA GTG TAC ACC ACA ATT TAC-3' s'hybridant de façon spécifique en 3' au niveau de l'UTR. 35 cycles thermiques ont été appliqués (10 sec de dénaturation à 98 C, 30 sec d'hybridation à 64 C et 150 sec d'élongation à 68 C) Une seconde PCR est ensuite réalisée sur 1 pl du produit PCR afin d'amplifier spécifiquement la phase codante. Pour cela, nous utilisons l'amorce sens BS31 de séquence SEQ ID N 18 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTC AGC ATG GCC GCG CTG CTC 3' et l'amorce anti-sens BS32 de séquence SEQ ID N 19 5' GGG ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGG TTT AGT GCC AGT
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CAA ATG TTC TGC C 3'. Le programme PCR utilisé est identique à celui utilisé pour la première PCR.
Le produit PCR de 1 kb a ensuite été cloné d'après la procédure du kit Gateway cloning technology, Invitrogen dans le vecteur épisomal pE-IRES-neo2. La séquence du gène porcin a été vérifiée par séquençage.
La séquence nucléotidique obtenue est la séquence SEQ IDN 4. La séquence protéique déduite est la séquence SEQ IDN 5.
EXEMPLE 6: Identification de la séquence complète codante du gène 6-OST porcin La séquence partielle du gène porcin (nucléotide 682 à 910 de la séquence humaine) codant pour la 6-OST est disponible dans une banque EST (GenBank accession number BE235545) La séquence codante complète du gène 6-OST a été identifiée en combinant deux expériences de RT-PCR avec des expériences de 5' et 3'-RACE en utilisant comme source d'ARN, des ARN de foie de porc isolés d'après le protocole du kit Trizol (Invitrogen) La transcription inverse de 80 ng d'ARN totaux en ADNc a été effectuée en suivant le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem (Invitrogen), en utilisant comme amorce un oligonucléotide dT24.
2 l de ces ADNc ont ensuite été amplifiés par PCR en présence d'une amorce sens 386-03 de séquence SEQ ID N 20 5'-AGA TGA CTG GTC GGG CTG C-3' et d'une amorce anti-sens 386-01 de séquence SEQ ID N 21 5'-CAA TGA TRT GGC TCA TGT AGT CC-3' avec la KOD hot start Polymerase (Novagen). Après les 35 cycles thermiques (15 sec de dénaturation à 95 C, 30 sec d'hybridation à 60 C et 2 min d'élongation à 68 C), le fragment amplifié de 537 pb a été cloné dans le vecteur pCR-Blunt Il TOPO (Invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit) puis séquence.
La séquence de ce fragment a été utilisée pour générer trois amorces 386-05, 386-19 et 386-20 utilisées pour la prochaine PCR et le 3'-RACE.
2 pl des ADNc obtenus précédemment ont été amplifiés par PCR en présence d'une amorce sens 386-07 de séquence SEQ ID N 22 5'-ATG GTT GAG CGC GCC AGC AAG TTC G-3' et de l'amorce anti-sens 386-05 de séquence SEQ ID N 23 5'-GGT TAT TGG CCA GGT TGT AGG GGC-3' avec la KOD hot start Polymerase (Novagen). Après les 30 cycles thermiques (15 sec de dénaturation à 95 C, 30 sec d'hybridation à 60 C et 1 min d'élongation à 68 C), le fragment amplifié de 718 pb a été cloné dans le vecteur pCR-Blunt Il TOPO (Invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit) puis séquence.
La séquence de ce fragment a été utilisée pour générer deux amorces 386-24, 386-26 utilisées pour le 5'-RACE.
Dans le cadre du 3'-RACE, 1 pl d'ARN porcin de foie a été reverse transcript en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en
<Desc/Clms Page number 28>
utilisant comme amorce l'oligodT CDS-C de séquence SEQ ID N 24 5'-ATT CTA
GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG T30 VC-3'.
GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG T30 VC-3'.
* La région 3' du gène codant pour la 6-OST a été ensuite amplifié par 2 PCR successives. La première PCR a été réalisée sur 2 pl d'ADNc, obtenu précédemment, avec l'amorce sens 386-19 de séquence SEQ ID N 25 5'-GGA CCT CTT CCA GCA GCG-3' et l'amorce anti-sens CDS-C avec l'Advantage 2 polymerase micx (Clontech). 24 cycles thermiques ont été appliqués (7 sec de dénaturation à 98 C, 10 sec d'hybridation à 62 C et 2 min d'élongation à 68 C) Une seconde PCR a ensuite été réalisée sur 2 pl de produit issu de la première PCR en utilisant l'amorce sens 386-20 de séquence SEQ ID N 26 5'-GCT ATC AGT ACA AGC GGC AGC-3' et l'amorce anti-sens CDS-C. Après les 30 cycles thermiques (7 sec de dénaturation à 95 C, 10 sec d'hybridation à 62 C et 2 min d'élongation à 68 C), le fragment amplifié de 300 pb a été cloné dans le vecteur pCR-Blunt Il TOPO (Invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit) puis séquence. Cette expérience a permis d'identifier la région 3' codante pour la 6-OST et environ 32 pb de la région non codante.
Dans le cadre du 5'-RACE, 2 pl d'ARN porcin de foie a été reverse transcript en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en utilisant comme amorce l'oligonucléotide 386-28 de séquence SEQ ID N 27 5'CCA GGC TCA GCC CCG G-3'.
L'oligonucléotide okib57 phosphorylé de séquence SEQ ID N 28 5'-p GTA GGA ATT CGG GTT GTA GGG AGG TCG ACA TTG CC-3' a été gréffé en 5' de l'ADNc par ligation (RNA ligase, Roche).
La région 5' du gène codant pour la 6-OST a été ensuite amplifiée par 2 PCR successives. La première PCR a été réalisée sur 2 pl d'ADNc greffé, avec l'amorce sens okib58 de séquence SEQ ID N 29 5'-GGC AAT GTC GAC CTC CCT ACA AC-3' s'hybridant sur l'amorce okib57 et l'amorce anti-sens 386-24 de séquence SEQ ID N 30~ 5'-TCA GCC CCG GGC CCG CG-3' d'après le protocole du kit Adavantage 2 polymerase mix. 24 cycles thermiques ont été appliqués (10 sec de dénaturation à 98 C, 10 sec d'hybridation à 64 C et 2 min d'élongation à 72 C). Une seconde PCR a ensuite été réalisée sur 0,5 l de produit issu de la première PCR en utilisant l'amorce sens okib59 de séquence SEQ ID N 31~5'- CTC CCT ACA ACC CGA ATT CCT AC-3' et l'amorce anti-sens 386-26 de séquence SEQ ID N 32~5'-GCC CGC GTA CTG GTA GAG G-3'. Après les 40 cycles thermiques (10 sec de dénaturation à 98 C, 10 sec d'hybridation à 66 C et 2 min d'élongation à 72 C), le fragment amplifié de 170 pb a été séquence. Cette expérience a permis d'identifier la région 5' codante pour la 6-OST et environ 14 pb de la région non codante.
Isolement de la phase codante complète du gène 6-OST porcin.
Afin de cloner la phase codante complète de la 6-OST porcine, une nouvelle expérience de RT-PCR a été réalisée en utilisant les informations obtenues dans la première étape.
La source d'ARN est la même que dans l'étape précédente.
2 g d'ARN ont été reverse transcript en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem, en utilisant comme amorce l'oligonucléotide dT CDSIII.
<Desc/Clms Page number 29>
Le gène codant pour la 6-OST a été ensuite amplifié par PCR en utilisant des amorces compatibles avec le système Gateway (Invitrogen) La PCR a été réalisée sur 2 pl d'ADNc avec une amorce sens 386-33 de séquence SEQ ID N 33~5'-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT AGG ACA ATG GTG ACA CAT GCG GCG GC-3' et une amorce anti-sens 386-34 de séquence SEQ ID N 34 5'GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC CTA CCA CTT CTC GAT GAT GTG GCT C-3'. 35 cycles thermiques ont été appliqués (5 sec de dénaturation à 98 C, 20 sec d'hybridation à 66 C et 1 min 30 sec d'élongation à 72 C) Le produit PCR de 1 kb a ensuite été cloné d'après la procédure du kit Gateway cloning technology, Invitrogen dans le vecteur épisomal pE-IRES-neo2. La séquence du gène porcin a été vérifiée par séquençage.
La séquence nucléotidique obtenue est la séquence SEQ ID N 6. La séquence protéique déduite est la séquence SEQ ID N 7.
EXEMPLE 7: Transformation des !ignées selon l'invention par le gène c-kit porcin Afin d'obtenir des mastocytes de porc dont la croissance serait indépendante du SCF à long terme, les mastocytes peuvent être transformés avec le gène c-kit muté.
Pour cela, on peut utiliser le gène c-kit préférentiellement porcin portant une mutation ponctuelle responsable de la modification de la valine 556 en glycine (gène noté c-kitG556), cette mutation est analogue aux mutants c-kitG559 chez la souris et c-kitG560 chez l'homme. Alternativement, on peut aussi utiliser le gène ckit délété au niveau des acides aminés TQLPYDH 570 à 576, chez la souris cette délétion est analogue aux acides aminés 573 à 579, chez l'homme 574-580. De même, du fait de la conservation inter espèce du gène c-kit, les gènes murins, humains, bovins ou tout autre gène possédant au moins 80 % d'homologie avec le gène porcin peuvent être utilisés. Dans ce cas, il est alors aussi possible d'utiliser une mutation ponctuelle responsable de la modification de l'acide aspartique en valine 814 ou 816 respectivement chez la souris et chez l'homme.
Les mastocytes sont transfectés par une des méthodes décrites dans l'exemple 4, préférentiellement la nucléoporation, avec un vecteur intégratif dans lequel la phase codante du gène c-kit muté est cloné sous le contrôle d'un promoteur fort viral (CMV, RSV) ou cellulaire (EF1 a). En plus du gène c-kit muté, ce vecteur peut être aussi porteur d'un gène codant pour une résistance à un antibiotique (généticine, hygromycine, puromycine, etc) 48 heures après la transfection, les cellules sont comptées, centrifugées et ensemencées à 2.105 C/ml dans le milieu de culture complet supplémenté avec l'antibiotique de sélection. Les cellules sont cultivées en présence de sélection pendant 2 à 3 semaines ce qui permet d'éliminer les cellules qui ne sont pas transfectées de manière stable. Après cette période de sélection, les cellules sont amplifiées.
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Les cellules sont alors analysées génétiquement par PCR et RT-PCR afin de vérifier l'intégration du gène c-kit muté et son expression. L'indépendance de ces cellules vis à vis du SCF est mise en évidence par la comparaison de la croissance des cellules transfectées avec le gène c-kit muté dans un milieu sans SCF avec la croissance des cellules transfectées avec le vecteur vide dans un milieu avec et sans SCF.
Une variante à ce protocole consiste à utiliser un vecteur portant seulement le gène c-kit muté. Dans ce cas, les cellules sont sélectionnées 48 heures après la transfection sans utilisation d'agent de sélection mais en ensemençant les cellules à 2.105 C/ml dans un milieu dépourvu de SCF. Les cellules non transfectées ne sont pas capables de croître dans un milieu dépourvu en SCF contrairement aux cellules transfectées.
EXEMPLE 8: Transfection des lignées selon l'invention par le gène 30ST porcin.
Afin d'augmenter l'activité biologique des composés de type héparine issus des cultures de mastocytes, il est possible de surexprimer de façon stable le gène
codant pour la 3-OST-1 (3 0-sulfatase-1 ) Pour cela, on peut utiliser le gène porcin. Alternativement, il est possible d'utiliser des gènes d'autres espèces codant pour l'expression de l'activité 3-0 Sulfatase et présentant au moins 80% d'homologie avec le gène porcin notamment la 3-OST-1 murine.
codant pour la 3-OST-1 (3 0-sulfatase-1 ) Pour cela, on peut utiliser le gène porcin. Alternativement, il est possible d'utiliser des gènes d'autres espèces codant pour l'expression de l'activité 3-0 Sulfatase et présentant au moins 80% d'homologie avec le gène porcin notamment la 3-OST-1 murine.
Les mastocytes sont transfectés par la méthode de nucléoporation décrite dans l'exemple 4, avec un plasmide intégratif dans lequel la phase codante du gène 3OST a été clonée sous le contrôle d'un promoteur fort viral (CMV, RSV) ou cellulaire (EF1a) En plus du gène 3-OST, ce plasmide porte un gène codant pour une résistance à un antibiotique (généticine, hygromycine, puromycine, etc).
48 heures après la transfection, les cellules sont comptées, centrifugées et ensemencées à 2.105 C/ml dans le milieu de culture complet supplémenté avec l'antibiotique de sélection. Les cellules sont cultivées en présence de sélection pendant 2 à 3 semaines ce qui permet d'éliminer les cellules qui ne sont pastransfectées de manière stable. Après cette période de sélection, les cellules sont amplifiées.
Ces cellules sont analysées génétiquement par PCR et RT-PCR afin de vérifier l'intégration du gène c-kit muté et son expression.
La fonctionnalité de la 3-OST est mise en évidence par des analyses HPLC de l'héparine produite par les mastocytes comparativement avec celle produite par les mastocytes non transfectés. Des analyses de l'activité biologique du produit permettent de confirmer l'augmentation de l'activité biologique vis à vis du facteur Xa et lia .
<Desc/Clms Page number 31>
Tableau 2 : Analyse HPLC des disaccharides obtenus à partir des cultures isolés après 15 semaines.
<tb>
Disaccharides% <SEP> C1 <SEP> C2 <SEP> C3 <SEP> C4 <SEP> C5 <SEP> C6 <SEP> C7 <SEP> C8 <SEP> Reference
<tb> Héparine
<tb> standard
<tb> IVs <SEP> 12.9 <SEP> 8.6 <SEP> 9.9 <SEP> 10.1 <SEP> 10.5 <SEP> 9.8 <SEP> 6.6 <SEP> 7.6 <SEP> 4.1
<tb> lia <SEP> 3.9 <SEP> 4.0 <SEP> 4.7 <SEP> 3.9 <SEP> 3.9 <SEP> 4.1 <SEP> 4.2 <SEP> 2.9 <SEP> 4.0
<tb> Illa <SEP> 0.7 <SEP> 2.2 <SEP> 1.2 <SEP> 2.9 <SEP> 0.9 <SEP> 2.4 <SEP> 0.5 <SEP> 1.6 <SEP> 1.1
<tb> Ils <SEP> 16.3 <SEP> 8.5 <SEP> 18.2 <SEP> 7.6 <SEP> 16.7 <SEP> 8.0 <SEP> 17.4 <SEP> 8.0 <SEP> 10.6
<tb> IIIs <SEP> 12.4 <SEP> 23.7 <SEP> 14.0 <SEP> 26.8 <SEP> 12.2 <SEP> 26.2 <SEP> 13.2 <SEP> 24.6 <SEP> 6.4
<tb> la <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 0. <SEP> 5 <SEP> 0. <SEP> 5 <SEP> 0. <SEP> 5 <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 1. <SEP> 4
<tb> Is <SEP> 53.6 <SEP> 52.6 <SEP> 51.2 <SEP> 48.2 <SEP> 55.2 <SEP> 49.0 <SEP> 57.7 <SEP> 54.8 <SEP> 55.9
<tb>
<tb> Héparine
<tb> standard
<tb> IVs <SEP> 12.9 <SEP> 8.6 <SEP> 9.9 <SEP> 10.1 <SEP> 10.5 <SEP> 9.8 <SEP> 6.6 <SEP> 7.6 <SEP> 4.1
<tb> lia <SEP> 3.9 <SEP> 4.0 <SEP> 4.7 <SEP> 3.9 <SEP> 3.9 <SEP> 4.1 <SEP> 4.2 <SEP> 2.9 <SEP> 4.0
<tb> Illa <SEP> 0.7 <SEP> 2.2 <SEP> 1.2 <SEP> 2.9 <SEP> 0.9 <SEP> 2.4 <SEP> 0.5 <SEP> 1.6 <SEP> 1.1
<tb> Ils <SEP> 16.3 <SEP> 8.5 <SEP> 18.2 <SEP> 7.6 <SEP> 16.7 <SEP> 8.0 <SEP> 17.4 <SEP> 8.0 <SEP> 10.6
<tb> IIIs <SEP> 12.4 <SEP> 23.7 <SEP> 14.0 <SEP> 26.8 <SEP> 12.2 <SEP> 26.2 <SEP> 13.2 <SEP> 24.6 <SEP> 6.4
<tb> la <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 0. <SEP> 5 <SEP> 0. <SEP> 5 <SEP> 0. <SEP> 5 <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 0. <SEP> 4 <SEP> 1. <SEP> 4
<tb> Is <SEP> 53.6 <SEP> 52.6 <SEP> 51.2 <SEP> 48.2 <SEP> 55.2 <SEP> 49.0 <SEP> 57.7 <SEP> 54.8 <SEP> 55.9
<tb>
ulfates/carboxylates 2.36 2.38 2.35 2.31 2.40 2.33 2.46 2.43 2.38
<tb> g/106 <SEP> cellules <SEP> 3. <SEP> 3 <SEP> 9. <SEP> 4 <SEP> 0. <SEP> 9 <SEP> 14. <SEP> 3 <SEP> 1. <SEP> 6 <SEP> 9. <SEP> 4 <SEP> 2. <SEP> 3 <SEP> 8. <SEP> 6
<tb>
<tb>
<Desc/Clms Page number 32>
Tableau 3: Productivité et profil disaccharidique de lignées de mastocytes en culture pour différentes espèces
MST HMS1 Heparîn Mastocytes Mastocytes HMC1 Heparin
MST HMS1 Heparîn Mastocytes Mastocytes HMC1 Heparin
<tb> disaccharides <SEP> Porcin <SEP> Murins <SEP> Mastocytes <SEP> Standard
<tb> disaccharides <SEP> Porcin <SEP> Murions <SEP> Humains
<tb> IV-a <SEP> 4.8 <SEP> 7,7 <SEP> 7,2 <SEP> 5. <SEP> 4
<tb> IV-s <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 8,3 <SEP> 0,0 <SEP> 3. <SEP> 6
<tb>
<tb> disaccharides <SEP> Porcin <SEP> Murions <SEP> Humains
<tb> IV-a <SEP> 4.8 <SEP> 7,7 <SEP> 7,2 <SEP> 5. <SEP> 4
<tb> IV-s <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 8,3 <SEP> 0,0 <SEP> 3. <SEP> 6
<tb>
I I-a 5.9 8, 2 3, g 4.0 ~~~~
<tb> III-a <SEP> 07 <SEP> 4,4 <SEP> 1.2
<tb> II-s <SEP> 17.9 <SEP> 19,7 <SEP> 16,2 <SEP> 10.8 <SEP> . <SEP>
<tb>
<tb> II-s <SEP> 17.9 <SEP> 19,7 <SEP> 16,2 <SEP> 10.8 <SEP> . <SEP>
<tb>
III-s <SEP> 9.0 <SEP> 7,6 <SEP> 2,1 <SEP> 6 <SEP> 4 <SEP>
<tb> I-a <SEP> 0. <SEP> 6 <SEP> 0,7 <SEP> ~~~~~ <SEP> 1.4
<tb> I-s <SEP> 54 <SEP> 4 <SEP> 40,3 <SEP> 41,0 <SEP> 57.0
<tb> Masse
<tb> d'héparine <SEP> par <SEP> 2.6 <SEP> g <SEP> 0,11 <SEP> g <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> 106cellules
<tb>
<tb> I-a <SEP> 0. <SEP> 6 <SEP> 0,7 <SEP> ~~~~~ <SEP> 1.4
<tb> I-s <SEP> 54 <SEP> 4 <SEP> 40,3 <SEP> 41,0 <SEP> 57.0
<tb> Masse
<tb> d'héparine <SEP> par <SEP> 2.6 <SEP> g <SEP> 0,11 <SEP> g <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> 106cellules
<tb>
<Desc/Clms Page number 33>
Tableau 4 : Profil disaccharidique en cours de culture (JO à J10) condition de culture C1
<tb>
<tb> % <SEP> J0/C1 <SEP> J4/C1 <SEP> J7/C1 <SEP> J10/C1 <SEP> référence
<tb> Disaccharides <SEP> ilo'ci <SEP> référence
<tb> IV-a <SEP> 4,8 <SEP> 4,4 <SEP> 4,8 <SEP> 4,9 <SEP> 5,4
<tb>
<tb> % <SEP> J0/C1 <SEP> J4/C1 <SEP> J7/C1 <SEP> J10/C1 <SEP> référence
<tb> Disaccharides <SEP> ilo'ci <SEP> référence
<tb> IV-a <SEP> 4,8 <SEP> 4,4 <SEP> 4,8 <SEP> 4,9 <SEP> 5,4
<tb>
IV-s 5,7 7,2 6,8 6,6 3,6
<tb>
<tb> II-a <SEP> 5,0 <SEP> 6,3 <SEP> 5,9 <SEP> 5,6 <SEP> 4,0
<tb> III-a <SEP> 0,6 <SEP> 0,5 <SEP> 0,7 <SEP> 0,9 <SEP> 1,2
<tb> II-s <SEP> 17,1 <SEP> 17,1 <SEP> 16,6 <SEP> 16,7 <SEP> 10,8
<tb> III-s <SEP> 7,3 <SEP> 7,4 <SEP> 8,6 <SEP> 9,2 <SEP> 6,4
<tb>
<tb> II-a <SEP> 5,0 <SEP> 6,3 <SEP> 5,9 <SEP> 5,6 <SEP> 4,0
<tb> III-a <SEP> 0,6 <SEP> 0,5 <SEP> 0,7 <SEP> 0,9 <SEP> 1,2
<tb> II-s <SEP> 17,1 <SEP> 17,1 <SEP> 16,6 <SEP> 16,7 <SEP> 10,8
<tb> III-s <SEP> 7,3 <SEP> 7,4 <SEP> 8,6 <SEP> 9,2 <SEP> 6,4
<tb>
1-a 0,4 0,5 5 0,7 0,7 1,4
<tb>
<tb> I-s <SEP> 59,2 <SEP> 56,6 <SEP> 55,9 <SEP> 55,4 <SEP> 57,0
<tb> héparine <SEP> 2,4 <SEP> 2,1 <SEP> 2,4 <SEP> 2,1
<tb> 1106 <SEP> cellules <SEP>
<tb> (en <SEP> g)
<tb>
<tb> I-s <SEP> 59,2 <SEP> 56,6 <SEP> 55,9 <SEP> 55,4 <SEP> 57,0
<tb> héparine <SEP> 2,4 <SEP> 2,1 <SEP> 2,4 <SEP> 2,1
<tb> 1106 <SEP> cellules <SEP>
<tb> (en <SEP> g)
<tb>
Claims (34)
- REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de cultures ou de lignées de mastocytes comprenant la mise en culture d'une population de cellules souches de moelle osseuse de jeunes porcs ou de f#tus, dans un milieu comprenant au moins environ 0,2 ng/ml d'IL-3, au moins environ 8 ng/ml de SCF et au moins environ 0,1 ng/ml d'IL-4, 10 ng/ml d'IL-6 et/ou 1 ng/ml de G-CSF.
- 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les porcs ont entre environ 2 jours et environ 6 semaines.
- 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les cellules sont maintenues dans le milieu pendant au moins environ 30 jours.
- 4. Culture ou lignée de mastocytes porcins susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1 à 3.
- 5. Culture ou lignée de mastocytes porcins susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine dans lesquelles les quantités en disacharides Is sont supérieures aux quantités en disacharides Ils, les quantités en disacharides Ils sont supérieures aux quantités en disacharides Ills, et les quantités en disacharides Ills sont supérieures aux quantités en disacharides IVs,
- 6. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant des rapports entre les disacharides Is, Ils, Ills et IVs proches de ceux de l'héparine.
- 7. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine comprenant au moins 30% de disacharides Is.
- 8. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disacharides Ils et Ills proche de celui de l'héparine.
- 9. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disacharides Ils et Ills compris entre1,3 et 1,9.<Desc/Clms Page number 35>
- 10. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit, au moins 0,1 g de molécules de type héparine/106 cellules.
- 11. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disacharides Is et Ils compris entre environ 3 et 8.
- 12. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant une activité anti-Xa supérieure à au moins 10 Ul/mg.
- 13. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant une activité anti IIa supérieure à au moins 10 UI/mg.
- 14. Lignée de mastocytes porcins obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3 déposée auprès de la Collection de Cultures deMicroorganismes de l'Institut Pasteur le 09 Avril 2003 sous le n 1-3010
- 15. Lignée de mastocytes porcins obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3 déposée auprès de la Collection de Cultures deMicroorganismes de l'Institut Pasteur le 09 Avril 2003 sous le n 1-3011
- 16. Lignée de mastocytes porcins obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3 déposée auprès de la Collection de Cultures deMicroorganismes de l'Institut Pasteur le 09 avril 2003 sous le n 1-3012
- 17. Lignée de mastocytes porcins obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3 déposée auprès de la Collection de Cultures deMicroorganismes de l'Institut Pasteur le 09 avril 2003 sous le n 1-3013.
- 18. Lignée de mastocytes porcins obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3 déposée auprès de la Collection de Cultures deMicroorganismes de l'Institut Pasteur le 09 avril 2003 sous le n 1-3014
- 19. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisée en ce qu'elle est comprend un acide nucléique codant une protéine immortalisante.
- 20. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant le c-kit.<Desc/Clms Page number 36>
- 21. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant l'antigène T.
- 22. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine.
- 23. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant une 3-OST.
- 24. Procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture de cultures ou lignées de mastocytes porcins selon l'une des revendications 4 à 23, ou obtenues selon l'une des revendications 1 à 3.
- 25. Procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture, dans un milieu adapté, de cultures ou lignées de mastocytes porcins dans un milieu de culture comprenant au moins environ 0,1 ng/ml d'IL-4.
- 26. Procédé de production de molécules de type héparine comprenant l'obtention de cultures ou lignées de mastocytes porcins surexprimant l'IL4, et la mise en culture des ces cellules dans un milieu de culture adapté.
- 27. Procédé de production de molécules de type héparine comprenant l'obtention de cultures ou lignées de mastocytes porcins transfectés par un acide nucléique codant pour l'IL4, et la mise en culture des ces cellules dans un milieu de culture adapté.
- 28. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisée en ce qu'elle exprime une protéine d'origine porcine de type c-kit.
- 29. Culture ou lignée selon la revendication 28 caractérisée en ce que la protéine d'origine porcine de type c-kit présente une extrémité C- terminale ayant la séquence SEQ ID N 3.
- 30. Culture ou lignée selon la revendication 28 caractérisée en ce que la protéine d'origine porcine présente une identité d'au moins 99% avec la séquence SEQ ID N 2.
- 31. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisée en ce qu'elle exprime une protéine d'origine porcine présentant une activité 3 -O-sulfatase.<Desc/Clms Page number 37>
- 32. Culture ou lignée selon la revendication 31 caractérisée en ce que la protéine d'origine porcine présente une identité d'au moins 95% avec la séquence SEQ ID N 4.
- 33. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisée en ce qu'elle exprime une protéine d'origine porcine présentant une activité 6 -O-sulfatase.
- 34. Culture ou lignée selon la revendication 33 caractérisée en ce que la protéine d'origine porcine présente une identité d'au moins 90% avec la séquence SEQ ID N 6.
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