EP1616002A2 - Procede d obtention de lignees de mastocytes a partir de tis sus de porcs et procede de production de molecules de type heparine - Google Patents

Procede d obtention de lignees de mastocytes a partir de tis sus de porcs et procede de production de molecules de type heparine

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EP1616002A2
EP1616002A2 EP04742485A EP04742485A EP1616002A2 EP 1616002 A2 EP1616002 A2 EP 1616002A2 EP 04742485 A EP04742485 A EP 04742485A EP 04742485 A EP04742485 A EP 04742485A EP 1616002 A2 EP1616002 A2 EP 1616002A2
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EP
European Patent Office
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heparin
culture
cells
mast cells
porcine
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04742485A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Marc Guillaume
Werner Dittrich
Sandrine Perez
Christine Andreoni
Romain Paillot
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma SA filed Critical Aventis Pharma SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0642—Granulocytes, e.g. basopils, eosinophils, neutrophils, mast cells
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Definitions

  • the present application relates to a process for obtaining cultures or lines of mast cells. It also relates to a process for the production of heparin-like molecules comprising the cultivation of cultures or lines of mast cells.
  • Mast cells are cells of the immune system, derived from hematopoietic precursors, which are involved in the inflammatory response, especially in the phenomena of allergy and hypersensitivity. They are localized in the connective tissue, especially in the skin, intestinal and respiratory mucosa.
  • Mast cells are in the form of rounded cells with a diameter of between about 5 to 25 ⁇ m and have a rounded, single, central or eccentric nucleus. They are also characterized by the presence of numerous meta-chromatic cytoplasmic granulations.
  • These granules contain various molecular species with proinflammatory activity such as histamine, serotonin, proteoglycans such as heparin or chondroitin sulfate, enzymes, cytokines and chemoattractants of eosinophils and neutrophils. These species are released during mast cell activation.
  • proinflammatory activity such as histamine, serotonin, proteoglycans such as heparin or chondroitin sulfate, enzymes, cytokines and chemoattractants of eosinophils and neutrophils.
  • a secondary response is set up during which the synthesis of mediators such as leukotrienes, prostaglandins, PAF (platelet activating factor), interleukins (IL4, IL5, IL6, IL10, IL12 and IL 13) takes place.
  • mediators such as leukotrienes, prostaglandins, PAF (platelet activating factor), interleukins (IL4, IL5, IL6, IL10, IL12 and IL 13) takes place.
  • cytokines TGF beta, IFN gamma, GM-CSF
  • MCP-1, IL8, RANTES chemokines
  • Ashraf et al (Veterinary Parasitology; 29, 134-158, 1988) isolated pig mast cells from the intestinal mucosa without maintaining cultures amplifiable. In addition, the characterization of the isolated mast cells reveals the absence of heparin.
  • Heparin belongs to the family of glycosaminoglycans (GAG), which includes linear polysaccharides containing a repetition of a disaccharide sequence consisting of an amino sugar (D-glucosamine or galactosamine) and an uronic acid (D-glucuronic or L-iduronic).
  • GAG glycosaminoglycans
  • the amino sugar is D-glucosamine.
  • Uronic acid is either glucuronic acid (GIc) or iduronic acid (Ido).
  • Glucosamine can be N-acetylated, N-sulfated and O-sulfated.
  • heparin denotes highly sulphated polysaccharides in which more than 80% of the glucosamine residues are N-sulphates and the number of O-sulphates is greater than that of the N-sulphates.
  • the sulfate / carboxylate ratio is generally greater than 2 for heparin.
  • heparin is actually very heterogeneous, and there are chains that can contain very different relationships.
  • heparin is synthesized in the form of a proteoglycan mainly by mast cells.
  • the first step in the synthesis of heparin is the formation of the serglycine protein nucleus, consisting of a repetition of serine and glycine residues.
  • the heparin chain is extended by adding a tetrasaccharide, then by successive additions of glucosamines and uronic acids, regularly alternated.
  • proteoglycan thus formed undergoes numerous sequential transformations:
  • polysaccharide chains are then cleaved from serglycine by an endoglucuronidase. These chains then have a molecular weight between 5000 and 30,000 Da. They form complexes with basic proteases and are thus stored in the granules of mast cells. Heparin is excreted only during degranulation of mast cells.
  • Heparin plays an important biological role, especially in hemostasis, and is very widely used in therapy, in particular as an anticoagulant and antithrombotic agent.
  • heparin Most of the heparin used is isolated from the intestinal mucosa of the pig, from where it is extracted by proteolysis, followed by purification on anion exchange resin (for review on the different processes for preparing heparin , cf. DUCLOS, “Heparin: fabrication, structure, properties, analysis”; Ed. Masson, Paris, 1984).
  • the use of animals as a source of heparin constitutes a risk due to the possible presence of viruses capable of being transmitted to humans.
  • the supply of raw material can be irregular.
  • the present invention proposes to overcome these drawbacks and to overcome the supply problems in terms of quantity and quality, by using a source of raw material more easily controllable.
  • the applicant has shown that it is possible to produce in large quantities from mast cell cultures, heparin with properties comparable to those of heparin extracted from porcine intestinal mucus and reproducible.
  • the Applicant has also demonstrated that the genes encoding three proteins of importance for the production of heparin-like molecules or the independence of mast cells with respect to growth factors, present in pigs sequences different from those of other species.
  • the subject of the present invention is a process for obtaining cultures or lines of mast cells comprising the cultivation of a population of stem cells from bone marrow of young pigs or fetuses, in a medium comprising at least approximately 0.2 ng / ml of interleukin-3 (IL-3) preferably porcine (preferably at least 0.5 ng / ml, even more preferably at least 2 ng / ml), at least about 8 ng / ml of Stem Cell Factor (SCF ) preferably porcine (preferably at least 20 ng / ml, even more preferably at least 80 ng / ml) and at least approximately 0.1 ng / ml of interleukin-4 (IL-4) preferentially porcine (preferably at least 0, 5 ng / ml, even more preferably at least 1 ng / ml), 10 ng / ml of interleukin-6
  • IL-6 preferably porcine (preferably at least 50 ng / ml, even more preferably at least 100 ng / ml) and / or 1 ng / ml of G-CSF preferentially porcine (preferably at least 5 ng / ml, even more preferably at least 10 ng / ml).
  • the obtaining medium contains a combination of IL4, IL ⁇ and G-CSF separately, two by two or all three together in a medium containing IL3 and SCF.
  • these various factors are preferably of porcine origin, that is to say that their sequence is deduced from that of the corresponding factor in pigs, it is possible to replace at least one of them by a factor of another origin.
  • interleukin 4 although preferably of porcine origin, can also be of murine or human origin.
  • the pigs from which the stem cells are produced have between approximately 2 days and approximately 6 weeks.
  • the process can be applied to cells from embryos or older pigs.
  • the cells are kept in the medium for at least about 30 days.
  • the present invention further relates to cultures and lines of pig mast cells capable of being obtained by said method.
  • the term “mast cells” is understood to mean cells which, among other characteristics, have metachromatic cytoplasmic granules containing heparin-type molecules and proteases such as tryptase, and express on their surfaces receptors such as the SCF receptor called c-kit or still the IgE receptor.
  • the term “culture” here generally designates a cell or a set of cells cultured in vitro. A culture developed directly from a cell or tissue sample taken from an animal is called "primary culture".
  • the present invention further relates to cultures or lines of porcine mast cells characterized in that they produce heparin-type molecules having a ratio between the disaccharides Ils and III close to that of porcine heparin.
  • heparin-type molecules is understood to mean highly sulphated polysaccharides in which more than 80% of the glucosamine residues are N-sulphates and the number of O-sulphates is greater than that of N-sulphates.
  • such cultures or lines produce heparin-like molecules having a relationship between the disaccharides Ils and llls included.
  • Established cultures or lines of porcine mast cells according to the present invention can also be characterized in that they produce, at least 0.1 ⁇ g of heparin-type molecules / 10 6 cells (preferably at least 1 ⁇ g, even more preferably at least 10 ⁇ g).
  • such cultures or lines produce heparin-type molecules in which the amounts of disaccharides ls are greater than the amounts of disaccharides They, the amounts of disaccharides They are greater than the amounts of disaccharides llls, and the amounts of disaccharides llls are greater to the quantities of disaccharides IVs,
  • such cultures or lines produce heparin-type molecules having relationships between the disaccharides ls, Ils, llls and IVs close to those of heparin.
  • such cultures or lines produce heparin-like molecules comprising at least 30% of disaccharides ls (preferably at least 40%, even more preferably at least 50%).
  • such cultures or lines produce heparin-like molecules having an anti-Xa activity greater than at least 10 IU / mg (preferably at least 20 IU / mg) and / or having an anti-Ia activity greater than at least minus 10 IU / mg (preferably at least 20 IU / mg).
  • such lines are the lines of porcine mast cells deposited with the Collection of Cultures of Microorganisms of the Institut Pasteur (CNCM) 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris cedex 15, France , on April 09, 2003 respectively under n ° 1-3010, I-3011, 1-3012, 1-3013, 1-3014.
  • CNCM Collection of Cultures of Microorganisms of the Institut Pasteur
  • IOPS pathogenic organisms
  • nucleic acids comprising genes coding for factors capable of improving the characteristics of the cultures and lines according to the present invention can be introduced into these cells.
  • the term nucleic acid is used to refer to DNA or RNA.
  • RNA is a complementary or genomic DNA.
  • Such factors can either promote cell growth or modulate the composition of the biological molecules they produce, and in particular the composition of heparin-like molecules.
  • telomere catalytic subunit TERT
  • TERT telomerase catalytic subunit
  • the AgT of the SV-40 virus will preferably be used, the DNA sequence complementary to this antigen is available in GenBank under the reference NC_001669 ..
  • genes coding for proteins allowing cells to proliferate for example G-CSF, SCF and the interleukins (IL-3, IL-4 and IL-6).
  • They can be genes coding for proteins such as ser / gly or enzymes acting on the sulfation of heparin-like molecules.
  • Such an enzyme can be an O-sulfatase, such as a 3-O-sulfatase. or a 6-0 sulfatase.
  • such an enzyme is 3 O-sulfatase-1 (3-OST-1), preferably 3 O-sulfatase-1 from pigs.
  • nucleic acids comprising these genes can be introduced into these cells by any method known to a person skilled in the art and in particular by transfection, by nucleoporation or by electroporation. Retroviral vectors carrying these genes can also be used to transfect these cells.
  • the applicant has demonstrated that the introduction of a nucleic acid encoding a 3-OST, and in particular 3-OST-1, makes it possible to modulate the composition of heparin-like molecules of mast cells , regardless of the type of mast cell of porcine origin.
  • the Applicant therefore does not intend to limit this object of its invention to the mast cells obtained by the process described above.
  • the present application therefore relates to any mast cell of porcine origin into which a nucleic acid encoding a 3-OST has been introduced.
  • the Applicant has also determined the sequences of three proteins of porcine origin that can be used for the implementation of the present invention and the nucleotide sequences encoding these proteins.
  • the subject of the present application is a protein of porcine origin of the c-kit type, characterized in that it has a C-terminal end having the sequence SEQ ID N ° 3.
  • a protein can comprise a sequence having an identity of at least 99% with the sequence SEQ ID No. 2.
  • a protein has a glutamine (Q) at position 40 and / or a lysine (K) at position 173.
  • the present invention further relates to a polynucleotide or a nucleic acid, comprising a sequence coding for a protein porcine origin type c-kit.
  • Such a nucleic acid can comprise a sequence having an identity of at least 99% with the sequence SEQ ID No. 1. Obtaining the complete sequence of the porcine c-kit was not evident from the state of the art.
  • the present application further relates to a protein of porcine origin having a 3-O-sulfatase activity.
  • a protein of porcine origin having a 3-O-sulfatase activity.
  • Such a protein can comprise a sequence having an identity of at least 95%, preferably at least 97%, and even more preferably at least 99%, of amino acid identity with a protein of sequence SEQ ID N 5.
  • the present invention further relates to a polynucleotide or a nucleic acid, comprising a sequence coding for a protein of porcine origin exhibiting 3-OST activity.
  • a nucleic acid may comprise a sequence having an identity of at least 95%, preferably at least 97%, and even more preferably at least 99%, of identity in nucleotides with a nucleic acid of sequence SEQ ID # 4.
  • porcine 3-OST sequence was not obvious from the state of the art. Isolated porcine 3-OST is capable of exhibiting unexpected properties, and in particular of exhibiting better activity in porcine mast cells compared to 3-OST of other species known to those skilled in the art.
  • the present application also relates to a protein of porcine origin having a 6-O-sulfatase activity.
  • a protein can comprise a sequence having an identity of at least 90%, preferably at least 95%, and even more preferably at least 99%, of amino acid identity with a protein of sequence SEQ ID N 7.
  • the present invention has in in addition to the subject a polynucleotide or a nucleic acid, comprising a sequence coding a protein of porcine origin having a 6-OST activity.
  • Such a nucleic acid may comprise a sequence having an identity of at least 95% preferably of at least 97%, and even more preferably of at least 99%, of identity in nucleotides with a nucleic acid of sequence SEQ ID # 6.
  • porcine 6-OST sequence was not obvious from the state of the art. Isolated porcine 6-OST is capable of exhibiting unexpected properties, and in particular of exhibiting better activity in porcine mast cells compared to 3-OST of other species known to those skilled in the art.
  • nucleic acids which hybridize under high stringency conditions with a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4 or of sequence SEQ ID No. 6.
  • the “percentage of identity” between two nucleotide or amino acid sequences can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide or polypeptide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain an optimal alignment of the two sequences.
  • the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base or amino acid residue is observed for the two sequences (nucleic or peptide) compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two bases or amino acid residues by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by 100 to obtain the percentage of sequence identity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be achieved by computer using known algorithms contained in the package of the company WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.
  • the percentage of sequence identity may be carried out using the BLAST software (BLAST versions 1.4.9 of March 1996, BLAST 2.0.4 of February 1998 and BLAST 2.0.6 of September 1998), using only the default parameters (S. F Altschul et al, J. Mol. Biol. 1990 215: 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402).
  • Blast searches for sequences similar / homologous to a reference “query” sequence using the algorithm of AltschuI et al.
  • the request sequence and the databases used can be peptide or nucleic, any combination being possible.
  • hybridization conditions described above are suitable for hybridization, under high stringency conditions, of a nucleic acid molecule of variable length from 20 nucleotides to several hundred nucleotides.
  • hybridization conditions described above can be adapted as a function of the length of the nucleic acid for which hybridization is sought or of the type of labeling chosen, according to techniques known to those skilled in the art. .
  • Suitable hybridization conditions can, for example, be adapted according to the teaching contained in the work of HAMES and HIGGINS (1985, "Nucleic acid hybridization: a practical approach", Hames and Higgins Ed.,
  • the proteins which are the subject of the present invention can be obtained by any means known to those skilled in the art. They are nevertheless advantageously obtained by expression of the nucleic acids as described above, coding for these proteins, optionally inserted into expression vectors, in advantageously selected cells, optionally followed by an extraction and a purification which can be total or partial.
  • the invention also relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid according to the invention.
  • a recombinant vector will comprise a nucleic acid chosen from the following nucleic acids:
  • SEQ ID No. 6 or a fragment or variant thereof.
  • vector within the meaning of the present invention is meant a circular or linear DNA or RNA molecule which is either in the form of single strand or double strand.
  • the expression vector comprises, in addition to a nucleic acid in accordance with the invention, regulatory sequences making it possible to direct its transcription and / or translation.
  • a recombinant vector according to the invention will notably comprise the following elements:
  • elements for regulating the expression of the nucleic acid to be inserted such as promoters and enhancers;
  • the recombinant vectors according to the invention may include one or more origins of replication in cellular hosts in which their amplification or expression is sought, markers or selection markers.
  • the present application further relates to a process for the production of heparin-like molecules comprising the cultivation of cultures or lines of porcine mast cells as described above.
  • the mast cells obtained according to the invention in a medium containing IL-3, SCF and IL-4, have a better disaccharide structure than those obtained in a medium containing only IL-3 and of the CFS.
  • the Applicant has also shown that the addition of IL-4 to the culture medium makes it possible to obtain from mast cells heparin-like molecules having characteristics closer to porcine heparin compared to those obtained using cells. obtained in a medium containing only IL-3 and SCF or containing IL-3 of SCF and IL-6 or IL-3 of SCF and G-CSF.
  • the present application further relates to a process for the production of heparin-like molecules comprising the cultivation, in a suitable medium, of cultures or lines of porcine mast cells in a culture medium comprising at least about 0.1 ng / ml of IL-4 (preferably at least about 0.5 ng / ml, even more preferably at least about 1 ng / ml).
  • Mast cells can also be modified to overexpress IL4.
  • Another object of the present application is therefore a process for the production of heparin-like molecules comprising obtaining cultures or lines of porcine mast cells transfected with a nucleic acid coding for IL4, and culturing these cells in a suitable culture medium.
  • Such mast cells constitute in themselves an object of the present application. They can be obtained by any method known to a person skilled in the art and in particular by transfection, by nucleoporation or by electroporation of a nucleic acid comprising a gene coding for IL-4. Retroviral vectors carrying these genes can also be used to transfect these cells.
  • the DNA sequence complementary to IL-4 has been described by Bailey et al (Biochim.Biophys.Acta. 1171 (3), 328-330, 1993).
  • the cells, lines and cultures according to the present invention can be maintained in culture under the conditions under which they were obtained. They can also be maintained in culture in media comprising reduced amounts of SCF, GM-CSF, IL-3, IL-4 and / or IL-6. They will nevertheless preferably be maintained in a medium containing IL-4.
  • mast cells will preferably be cultivated in a defined culture medium (MEM / DMEM, RPMI, IMDM, etc.) supplemented with growth factors, used in combination or individually.
  • MEM / DMEM, RPMI, IMDM, etc. defined culture medium
  • the media can also be supplemented with bovine serum, at a concentration of between 0.5% and 20% (v / v).
  • bovine serum to the culture media can be replaced by the use of a culture medium without serum such as AIMV (INVITROGEN) so as to reduce the protein concentration of the medium and the risks associated with the use of compounds of animal origin (KAMBE et al., J. Immunol. Methods, 240, 101-10, 2000).
  • AIMV AIMV
  • the independence of the cells with respect to the addition of serum and / or the use of growth factors can be obtained by mutation of the cell phenotype by the action of transforming and / or immortalizing agents (TSUJIMURA , Pathology International, 46, 933-8, 1996; PIAO and BERNSTEIN, Blood, 87 (8), 3117-23, 1996).
  • Mast cells can be cultured using techniques developed for the mass culture of eukaryotic cells, as described for example by GRIFFITHS et al. (Animal Cell Biology, Eds. Spier and Griffiths, Académie Press, London, vol. 3, 179-220, 1986). Bioreactors with a capacity greater than several m 3 can be used as described by PHILIPS et al. (Large Scale Mammalian Cell Culture, Eds. Feder and Tolbert, Académie Press, Orlando, USA, 1985), or by MIZRAHI (Process Biochem, August, 9-12, 1983). The culture can also be carried out in suspension or on micro-support according to the technique described by VAN WEZEL (Nature, 216, 64-65, 1967).
  • the productivity of batch cultures can be advantageously increased by removing part of the cells from the bioreactor (70% to 90%) for the operations of extracting GAGs and isolating heparin and by conserving the remaining cells within the same bioreactor to initiate a new culture.
  • this so-called repeated batch culture method it is also possible to distinguish the optimum parameters of the cell growth phase from those allowing a greater accumulation of GAGs and heparin within the cells.
  • Continuous perfusion-type culture systems with or without cell retention can also be used (VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102 (2), 275-278, 1987; CHAUBARD et al., Gen. Eng News, 20, 18-48, 2000).
  • perfused culture systems allowing the retention of cells inside the reactor, and resulting in growth and a production greater than that which can be obtained in batch.
  • Retention can be carried out using spin-filter, hollow fiber or solid matrix retention systems (WANG et al., Cytotechnology, 9, 41-49, 1992; VELEZ et al., J Immunol.
  • the cell densities obtained are generally between 10 7 and 5 x 10 7 cells / ml.
  • the culture in bio-reactors allows, through the use of online measurement sensors, better control of the physico-chemical parameters of cell growth: pH, p02, Red / Ox, growth substrates such as vitamins, amino acids, carbon substrates (for example glucose, fructose, galactose), metabolites such as lactate or ammonia, etc.
  • the cells are harvested and separated from the culture medium, generally by centrifugation or filtration.
  • centrifugation systems can be used, for example those described by VOGEL and TODARO (Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2 nd Edition, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, USA).
  • separation can be carried out by tangential microfiltration, using membranes whose porosity is less than the average diameter of the cells (5 to 20 ⁇ m) while allowing the passage of the other compounds in solution / suspension. .
  • the speed of the tangential flow and the pressure applied to the membrane will be chosen so as to generate little shear force (Reynolds number less than 5000 sec "1 ) in order to reduce the clogging of the membranes and preserve the integrity of the cells during l separation operation.
  • membranes can be used, for example, spiral membranes (AMICON, MILLIPORE), flat membranes or hollow fibers (AMICON, MILLIPORE, SARTORIUS, PALL, GF).
  • membranes of reduced porosity can also be envisaged in the case where heparin has been released from the intracellular content, by degranulation or lysis of all or part of the mast cells, and is present in the culture medium at the time of l 'separation step.
  • the separation of the cells is combined with an ultrafiltration step on one or more membranes whose arrangement and porosity makes it possible to concentrate the heparin and to separate it from the other species present in the medium, depending on the size and molecular weight, and possibly electrical charge or biological properties.
  • the cut-off threshold for the membranes is preferably between 1000 and 5 Kda.
  • Membrane systems similar to those used for microfiltration can be used, for example, spiral membranes, flat membranes or hollow fibers.
  • Degranulation can be caused by the binding of specific ligands to receptors present on the surface of mast cells, for example the binding of allergen-type agents (such as Fc fragment of IgE or analogs of this fragment) to IgE receptors of mast cells .
  • allergen-type agents such as Fc fragment of IgE or analogs of this fragment
  • agents can also induce degranulation of mast cells. These agents can be classified into several categories such as agents cytotoxics, enzymes, polysaccharides, lectins, anaphylatoxins, basic compounds (compound 48/80, substance P, etc.), calcium (ionophore A23187, ionomycin, etc.). [D. Lagunoff and T. W. Martin. 1983. Agents that release histamine from mast cells. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 23: 331-51]. The use of degranulating agent can be carried out repeatedly on the same cells maintained in culture. In this production mode, productivity is significantly increased by simplifying the harvesting process from the supernatant and by maintaining the cells in culture.
  • the degranulation of the mast cells can be induced for example by treatment of 2.10 6 cells / ml of mast cells with the ionophore A23187 at concentrations between 1 to 100 ⁇ g / ml and times of action varying from 1 minute to 4 hours.
  • Mast cell lysis can be induced, for example, by osmotic shock using hypotonic or hypertonic solutions, by thermal shock (freezing / thawing), by mechanical shock (for example sonication or pressure variation), by action of agents chemical (NaOH, THESIT TM, NP40 TM, TWEEN 20 TM, BRIJ-58 TM, TRITON X TM -100, ...) or by enzymatic lysis (papain, trypsin, ...) or by a combination of two or more of these methods.
  • the cell lysate can be subjected to one or more enzymatic digestions (pronase, trypsin, papain, etc.); - the heparin-protein bonds can be hydrolyzed in an alkaline medium, in the presence of sulfates or chlorides;
  • the present invention also relates to the heparin preparations capable of being obtained from mast cell cultures by implementing a method according to the invention.
  • heparin preparations according to the invention which have biological properties comparable to those of the heparin preparations obtained in the prior art from animal tissues, can be used in all the usual applications of heparin.
  • FIGS. 1 A to 1 H illustrate the anti-tryptase labeling of the mast cells obtained after 3 weeks of culture, respectively under conditions C1 to C8.
  • the shaded and clear peaks correspond respectively to the controls (without antibody) and to the cells obtained under conditions C1 to C8.
  • FIGS. 2A to 2H illustrate the labeling of the IgE receptors of the mast cells obtained after 5 weeks of culture, respectively under conditions C1 to C8.
  • the hatched, shaded and clear peaks correspond respectively to unlabeled cells (non-mast cell swine cells), to control cells and to cells obtained under conditions C1 to C8.
  • FIGS. 3A to 3H illustrate the anti-tryptase labeling of the mast cells obtained after 7 weeks of culture, respectively under conditions C1 to C8.
  • the shaded and clear peaks correspond respectively to the controls and to the cells obtained under conditions C1 to C8.
  • Figures 4 A to 4H illustrate the FGF labeling of mast cells obtained after 8 weeks of culture, respectively under conditions C1 to C8.
  • the shaded and clear peaks correspond respectively to the controls and to the cells obtained under conditions C1 to C8.
  • FIG. 5 illustrates the growth of the cultures under the different conditions C1 to C8 in the first 7 weeks of culture.
  • FIG. 6 represents the chemical structures of the disaccharides ls, Il llls and IVs corresponding to the disaccharides N sulfated by heparin, as well as the homologous acetylated disaccharides la lia, llla et.lva.
  • Figure 7 illustrates the reactor growth of mast cells obtained under conditions C1, C7 and C8.
  • the animals used for the samples come from protected breeding, free from specific pathogenic organisms (IOPS) of the pig (MERIAL SA Lyon France)
  • IOPS pathogenic organisms
  • the sternum of piglets aged four and six weeks, respectively PI and PHI are aseptically removed and then transported in one sterile container in the laboratory to be decontaminated and rinsed successively with a solution of pure bleach diluted 1/100 in PBS buffer (Phosphate Buffer Saline pH 7.4) then in PBS.
  • PBS buffer Phosphate Buffer Saline pH 7.4
  • the sternum is then cut, then the bone marrow is aspirated using a syringe to be then diluted in PBS.
  • the medullary suspension is sieved on a sterile pad; diluted in 40 ml of PBS and then centrifuged for 10 minutes at 400 g.
  • the cell pellet is taken up in 5 ml of PBS and then purified on 5 ml of Ficoll (Dutscher) (1100 g ⁇ 10 ').
  • the ring containing the medullary cells is recovered then rinsed twice in PBS (14ml, 400gx10min) then taken up in 2 ml of PBS to be counted, approximately 1x 108 total cells per sternum.
  • the cells are centrifuged then taken up at a concentration of 1-3 x10 6 cells / ml in 6-well culture plates and 4 ml per well in the medium containing the following components: MEMD (Invitrogen) Fetal calf serum 15% (PAA Laboratories) Penicillin (Sigma) 100 IU / ml, 100 ⁇ g / ml Streptomycin (Sigma) 2ng / ml porcine r-IL3 (Biotransplant) 80ng / ml r-porcine r-SCF (Biotransplant).
  • MEMD Invitrogen
  • Fetal calf serum 15% PAA Laboratories
  • Penicillin Sigma
  • 100 IU / ml 100 ⁇ g / ml Streptomycin (Sigma) 2ng / ml porcine r-IL3 (Biotransplant) 80ng / ml r-porcine r-SCF (Biotransplant).
  • the cells are cultured in the culture medium described above supplemented with cytokines (recombinant porcine IL4 1 ng / ml R1 D Systems; recombinant porcine IL6 100ng / ml, R&D Systems; recombinant human G-CSF 10ng / ml) as shown in Table 1 below.
  • cytokines recombinant porcine IL4 1 ng / ml R1 D Systems; recombinant porcine IL6 100ng / ml, R&D Systems; recombinant human G-CSF 10ng / ml
  • the culture plates are incubated at 38 ° C +/- 0.5 ° and under an atmosphere containing 5% CO 2. Twice a week and for eight weeks, the medium of each well is renewed with fresh medium.
  • the characterization of the mast cell phenotype of the isolated cells is carried out from week 2 and then at regular intervals (week 3, week 5 and week 7)
  • Pig mast cell lines obtained under some of the conditions indicated above, were deposited with the Collection of Cultures of Microorganisms of the Institut Pasteur (CNCM) on April 09, 2003.
  • the cells are then permeabilized at 4 ° C. in cytofix / cytoperm solution (Pharmingen), 200 ⁇ l per sample and incubated for 25 minutes. After two rinses in permawash buffer (Pharmingen) the samples are incubated for 30 minutes at 4 ° C with 1 ⁇ g of murine monoclonal antibody specific for tryptase (Mouse anti-human Mast cell tryptase; Chemicon) After three rinses in permawash buffer, the labeling is revealed by incubation for 25 minutes with an anti-mouse immunoglobulin conjugate labeled with FITC (FITC-conjugates Affinity pure Goat Anti Mouse IgG; Jackson Immunoresearch) Duplicates of samples are produced according to the same procedure except for the incubation with the anti tryptase antibody in order to be able to subtract during the analysis the fluorescence due to the non-specific binding of the FITC-labeled conjugate.
  • FITC FIT
  • the cells are rinsed twice in permawash buffer, then resuspended in cold PBS buffer supplemented with 1% formaldehyde (Sigma)
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • the samples are rinsed again twice in PBS, then incubated for 30 minutes with an anti-goat conjugate labeled with FITC (Donkey anti Goat / Sheep FITC; Serotec)
  • FITC Donkey anti Goat / Sheep FITC; Serotec
  • the samples are returned in suspension and fixed in a buffer supplemented with 1% formaldehyde.
  • duplicate samples are also produced by omitting the incubation with IgE in order to subtract during the analysis the fluorescence due to the non-specific binding of the FITC-labeled conjugate.
  • a sample of non mastocytic pig cells (PIR) is also analyzed under the same conditions in order to confirm the specificity of the labeling.
  • the cell culture samples to be analyzed are distributed in a 96-well plate, conical bottom, at the rate of 0.2.10 6 per well and then centrifuged at 1400 rpm, 4 min.
  • the cell pellet is rinsed in 100 ⁇ l of PBS buffer containing 5 g / l of bovine albumin and then centrifuged at 1400 rpm, 4 min. Two successive rinses are carried out under the same conditions.
  • the cell pellets are diluted in a Cytofix Cytoperm fixing / permeabilization buffer (Pharmingen), rinsed in 100 ⁇ l of Perm / Wash buffer (Pharmingen) and then centrifuged at 1400 rpm, 4 min, 4 ° C. Three successive rinses are carried out under the same conditions.
  • the cell pellets are diluted in 100 ⁇ l of Perm / Wash buffer containing 172 ng / ml of FGF basic (R&D Systems) and incubated for 30 minutes in ice.
  • the cells are rinsed in 100 ⁇ l of Perm / Wash TM buffer and then centrifuged at 1400 rpm, 4 min, 4 ° C. Three successive rinses are carried out under the same conditions.
  • the cell pellets are diluted in 100 ⁇ l of Perm / Wash buffer containing 1 ⁇ g of anti-FGF basic mouse monoclonal antibody (R&D Systems) coupled with biotin and incubated for 30 minutes in ice.
  • the cells are rinsed in 10 ⁇ l of Perm / Wash buffer and then centrifuged at 1400 rpm, 4 min, 4 ° C. Three successive rinses are carried out under the same conditions.
  • the cell pellets are diluted in 100 ⁇ l of Perm / Wash buffer containing a solution of streptavidin peridinin chlorophyll-a protein and incubated for 20 minutes, in ice, in the dark.
  • the cells are rinsed in 100 ⁇ l of Perm / Wash TM buffer and then centrifuged at 1400 rpm, 4 min, 4 ° C. Three successive rinses are carried out under the same conditions.
  • the pellet is diluted in 150 ⁇ l of cold PBS buffer containing 5 g / l of bovine albumin, 0.01% sodium azide, 1% formaldehyde. The presence of intra cytoplasmic labeling is detected by cytofluorimetry.
  • Duplicate samples are produced according to the same procedure with the exception of incubation with the anti-FGF antibody in order to be able to subtract during the analysis the fluorescence due to the non-specific binding of the FITC-labeled conjugate.
  • a sample of non mastocytic porcine cells (IRP) is also analyzed under the same conditions in order to confirm the specificity of the labeling.
  • Figures 1, 2, 3 and 4 present the results of the phenotypic characterization of the mast cells obtained respectively after 3, 7 and 8 weeks of culture.
  • a positive and specific labeling of the cells with respect to markers of mast cells, IgE receptor, and tryptase is observed, as well as the detection of the intracellular binding of FGF.
  • the detection carried out on the cells from the third week of culture is positive for the presence of tryptase.
  • the cultures in conditions 1 to 5 are homogeneous, and contain 100% of mast cells, as revealed by labeling of the IgE receptor from week 5.
  • the cultures in conditions C1 to C5 and C7 are 100% homogeneous , the homogeneity of the cultures under conditions C6 and C8 is greater than 50%.
  • the characterization of the isolated cells was also completed by observation by electron microscopy.
  • the cells have a characteristic morphology of mast cells with many granulations, with a large eccentric nucleus, an irregular contour.
  • a decrease in cell concentration is observed during the first four weeks of culture (S1 to S4) corresponding to the death and lysis of the medullary cells not stimulated by SCF and to the passage from a heterogeneous culture to an essentially mast cell culture. From the fifth week (S5) we observe a proliferation of cultures correlated with a more intense marking specific markers of mast cells. The proliferation is significantly greater for the culture conditions comprising NL4 (FIG. 5).
  • Proteolysis The cell samples, 2 ⁇ 10 6 cells, are centrifuged and rinsed twice in PBS buffer. Each pellet is taken up in 100 ⁇ l of distilled water added with 10 ⁇ l of alkalase (Novozymes) then heated for 5 hours at 60 ° C. with stirring. Then the samples are diluted with 200 ⁇ l of Tris 10mM buffer pH 7.0 (Prolabo) 0.5M NaCl (Prolabo) before being centrifuged for 10 minutes at 10,000 Trs / min. The proteolysis stage makes it possible to release the intracellular content and to dissociate the protein-polysaccharide bonds.
  • the samples After elution in a volume of 1 ml, the samples are concentrated by lyophilization, then taken up in 130 ⁇ l of distilled water.
  • the GAGs are depolymerized by a mixture of heparinases I, II and III (Grampian enzymes) Each heparinase solution is adjusted to 0.5 IU / ml in phosphate buffer.
  • the heparinase solution I, II, III is prepared by mixing 1/3 volume by volume of each heparinase solution.
  • the samples are then analyzed by HPLC on a Waters spherisorb SAX 5 ⁇ m, 250 ⁇ 3 mm, Thermohypersil column. 50 ⁇ l of sample are injected by analysis, the mobile phase buffer is composed of 2.5mM of Sodium Di Hydrogeno Phosphate (Na2HP04, Prolabo) whose pH is adjusted to 2.9 with ortho-phosphoric acid (H3P04, Prolabo ).
  • the elution of the disaccharides constituting the GAGs extracted from the cell samples is carried out in a gradient from 0 to 100% in 50 minutes of 2.5 mM Na2HP04 buffer and 1 M of perchlorate (NaCI04, Prolabo)
  • the disaccharides are detected by their retention time and compared to a standard heparin sample (Aventis) in UV at 234 nM.
  • Table 2 shows the compositions obtained for each culture. A reproducible modulation of the disaccharide structure is observed as a function of the presence or absence of IL4, this modulation is mainly observed on the percentage of the disaccharides They and IIIs. EXAMPLE 2 Cultivation of the lines and analysis of the production of heparin-like molecules
  • the disaccharide profile of the isolated mast cells was analyzed for three conditions of culture media (C1, C7 and C8).
  • the cells were amplified in suspension and cultured in a 100 ml spinner.
  • the initial cell density is 2 ⁇ 10 5 cells per ml, the cells are incubated under an atmosphere of 5% CO 2 at 37 ° C. and counting at regular intervals is carried out under the microscope.
  • Figure 7 illustrates the growth of mast cells on the 14th passage.
  • HPLC analysis of the samples for three days of harvest shows for all cultures a heparin-like profile of the polysaccharides with an effect of IL4 on the relative percentage of the disaccharides Ils and IIIs.
  • the productivity of the cultures is significant, ranging between 2 and 12 ⁇ g for 10 6 cells.
  • the reaction takes place in three stages:
  • the anti-Xa or Anti-lla quantity is measured relative to a calibration line established with the SPIM standard (International Heparin Standard).
  • the sensitivity of the method is 0.006IU / ml.
  • the biological activity is expressed in IU / mg taking into account the quantification of the disaccharides obtained by HPLC.
  • the analysis performed on the 10 day of harvest after the end of the growth phase reveals an anti-Xa and anti-Ila biological activity of between 10 to 25 IU / mg.
  • Mast cells can be genetically modified by the introduction of an exogenous nucleic acid using for example transfection, electroporation, nucleoporation or infection techniques which will result in transient or stable expression of the nucleic acid introduced.
  • DNA can be integrated into the cell genome or maintained as an episome.
  • Stably transfected cells can be obtained using the nucleoporation method described below, by applying, 24 to 72 hours after nucleoporation, a selection pressure (hygromycin, geneticin, blasticidin, puromycin or zeocin. Resistance to the agent selection is conferred by the integration of the plasmid carrying the gene of interest and the resistance gene.
  • a selection pressure hygromycin, geneticin, blasticidin, puromycin or zeocin. Resistance to the agent selection is conferred by the integration of the plasmid carrying the gene of interest and the resistance gene.
  • This method is used preferentially because it makes it possible to target DNA directly in the nucleus.
  • mast cells in the exponential phase, preferably after 3 or 4 days of culture, are centrifuged at 1000 rpm 5 minutes and taken up in 100 ⁇ l of nucleofection solution (Amaxa, Kit 8351). 2 to 4 ⁇ g of pcDNA3.1-eGFP, plasmid coding for GFP, are then added to the cell suspension. The cells are then transferred to the electroporation cuvette and subjected to an electric shock by the use of a specific program (such as U14, T20 and T22 AMAXA) The cells are then transferred into 2 ml of complete medium preheated to 37 ° C. and then incubated at 37 ° C., 5% CO 2.
  • a specific program such as U14, T20 and T22 AMAXA
  • the cells are harvested to be fixed with 1% paraformaldehyde (Prolabo). For this, the entire culture is centrifuged for 5 min at 1000 rpm. After removal of the supernatant, the cells are washed in 4 ml of 1x PBS and then centrifuged again. The cell pellet is then taken up in 1 ml of 1% paraformaldehyde. The cells thus fixed are then analyzed with a cytometer (Cytomics FC 500, Beckman Coulter) The nucleoporation conditions described above make it possible to transfect pig mast cells with a transfection efficiency of between 30 to 50% while obtaining good cell viability , greater than 50% • ⁇
  • the cells transferred to a 4 mm electroporation cuvette, are incubated for 5 min in ice before being electroporated at a voltage between 150 V and 400 V with a capacitance of 500 or 960 ⁇ F (Geneuterer II, Biorad) After electroporation, the cells are again incubated for 5 min in ice to finally be transferred to 5 ml of complete culture medium and incubated at 37 ° C., 5% CO 2.
  • the process of selecting cells which have integrated the transgene stably uses the same technique as described above using the resistance conferred by the integration of the plasmid on a selection agent.
  • recombinant and deleted retro-viral vectors can be used for replication.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus
  • the retro-viral vector carrying the gene of interest to be expressed or integrated into the porcine mast cell is first produced using the packaging cell such as GP-293 (Clontech protocol ref PT 3132-1), which possesses the genetic elements for the production of the vector (gag and po ⁇ ) with the exception of the gene for the production of the pseudotyped envelope protein (env-VSV-G).
  • the packaging cells are co-transfected with the plasmid coding for the envelope gene VSV-G and a retro-viral plasmid coding for the gene of interest under the control of a promoter with or without a selection gene.
  • GP-293 cells are cultured 48 hours to 72 hours before transfection in order to be in the exponential growth phase.
  • the culture medium is changed with fresh medium (15-20 ml for 10 6 cells), then 1 to 2 ml of solution containing the mixture of the plasmid VSV-G (5 to 20 ⁇ g for 10 6 cells ) and the plasmid carrying the gene of interest (10 to 30 ⁇ g for 1 Q 6 cells), in pH7 calcium phosphate buffer are added dropwise to the culture medium (1 to 2 ml (Promega)
  • the cells are then incubated again for 16 to 24 hours at 37 ° C or preferably at a temperature between 32 and 35 ° C.
  • the culture medium is changed again with fresh medium.
  • the cells are incubated for an additional 48 hours at 32-35 ° C.
  • the culture supernatant containing the neoformed retro-viral vectors is harvested.
  • Part of the packaging cell infection supernatant is aliquoted and frozen at -80 ° C, the other part is mixed with the mast cell culture medium in exponential growth phase.
  • the mast cells in culture are centrifuged and resuspended in a medium containing 50% of fresh medium and 50% of infection supernatant.
  • Mast cells are incubated for 24 hours at 32-35 ° C, then the medium is changed again with fresh medium.
  • the populations of transfected cells are then selected by adding to the culture medium the cytotoxic agent (Hygromycin, puromycin, G418,
  • the selection agent can be removed from the culture medium while retaining the expression of the gene of interest.
  • the retroviral vector produced in this way does not replicate in the host mast cell and therefore there is no production of replicative vectors.
  • vectors for which the expression is subjected to an induction of the promoter regulating the expression of the gene of interest by a compound added at the desired time in the culture medium are also possible.
  • porcine c-kit gene was isolated by 3'-RACE using as RNA source, total RNA isolated from a culture of pig liver mast cells according to the procedure previously published (Piu et al, CR Acad. Sci. Paris, 316, 772-779, 1993).
  • RNA into cDNA was carried out according to the protocol of the kit 573 'RACE (Roche), using as an primer an oligodT called OligodT anchor primer of sequence SEQ ID N ° 8 5' gac cac gcg tat cga tgt cga ctt ttt ttt ttt ttt ttv 3 ' .
  • OligodT anchor primer of sequence SEQ ID N ° 8 5' gac cac gcg tat cga tgt cga ctt ttttttttttttttttv 3 ' .
  • the cDNA is then amplified by PCR using the protocol of the Expand High fidelity System kit (Roche).
  • the PCR was carried out on 1 ⁇ l of cDNA, with the primer sense C15203 hybridizing specifically in the 5 ′ non-coding region of the porcine c-kit gene (nucleotides 24 to 42 relative to the published porcine c-kit sequence , GenBank ref AJ223228) of sequence SEQ ID N ° 9 5 gga att ce cga gag cag gaa cgt gga aag gag 3 and the antisense primer named PCR anchor primer of sequence SEQ ID N ° 10 5 gac cac gcg tat cga tgt cga c 3 ' hybridizing specifically in 3' at the level of the oligo dT primer.
  • cycle 1 15 sec denaturation at 94 ° C, 45 sec hybridization at 55 ° C and 4 min elongation at 68 ° C
  • cycle 2 15 sec denaturation at 94 ° C, 45 sec hybridization at 60 ° C and 4 min elongation at 68 ° C
  • the PCR product obtained is purified on 1% TBE1x agarose gel, using the Quiaquick gel extraction kit (Quiagen).
  • a second PCR is carried out on 1/30 th of the purified PCR product, by applying 25 thermal cycles (15 sec of denaturation at 94 ° C, 45 sec of hybridization at 60 ° C and 4 min of elongation at 68 ° C).
  • the PCR product is again purified to clone it into a pGEMTeasy vector according to the pGEM-T Easy vector System protocol (Promega).
  • the pig gene sequence is then partially determined by sequencing.
  • the nucleotide sequence obtained is the sequence SEQ IDN ° 1.
  • the deduced protein sequence is the sequence SEQ IDN ° 2.
  • This sequence SEQ ID No. 1 shows differences compared to the sequence published under the reference AJ 223228.
  • the partial sequence of the porcine gene coding for 3-OST is available in an EST bank (GenBank accession number BF075483). Alignment of this sequence with the human sequence shows that about 650 bp of the 3 'coding region is missing.
  • porcine 3-OST gene was identified by combining RT-PCR and 3'-RACE using as RNA source, porcine RNA isolated according to the protocol of the Trizol kit (Invitrogen)
  • RNA into cDNA was carried out according to the protocol of the First Strand Synthesis Sytem kit (Invitrogen), using as primer a mixture of the oligonucleotides BS02 and BS03 of respective sequences SEQ ID N ° 11 5 ' -GCA GCA GCC ACG TCG GG-3 'and SEQ ID N ° 12 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC-3'.
  • the amplified fragment of 277 bp was cloned into the vector pCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit) and then sequenced. The sequence of this fragment was used to generate 2 primers BS21 and BS22 to isolate, by 3'-RACE, the entire 3 'region.
  • the 3 ′ region of the gene coding for 3-OST was then amplified by 2 successive PCRs.
  • the first PCR was carried out on 2 ⁇ l of cDNA, obtained previously, with the sense primer BS21 of sequence SEQ ID No. 16 5'-GCA CGC CCA GAT CGA CGC C-3 'and an antisense primer CDSIII.
  • 30 thermal cycles were applied (10 sec of denaturation at 94 ° C, 30 sec of hybridization at 60 ° C and 120 sec of elongation at 68 ° C).
  • the second PCR was then carried out under the same conditions as the first PCR with - 1 ⁇ l of product resulting from the first PCR using the primer sense BS22 of sequence SEQ ID No. 17 5'-CAA ACT CCT CAA TAA ACT GCA CG-3 'and the anti-sense primer CDSIII.
  • RNA The source of RNA is the same as in the previous step. 2 ⁇ g of RNA were reverse transcribed into cDNA according to the protocol of the First kit
  • the gene coding for 3-OST was then amplified by PCR in two stages. The first PCR made it possible to amplify the gene including a portion of the 3 ′ non-coding sequence of the gene, the second PCR then made it possible to amplify the coding sequence using primers compatible with the Gateway system (Invitrogen)
  • the first PCR was carried out on 2 ⁇ l of cDNA with a BS10 sense primer of sequence 5'-AGG CCC GTG ACA CCC ATG AGT-3 'hybridizing specifically in the 5' non-coding region of the porcine 3-OST gene and an antisense BS30 primer of sequence 5'-CAC CTA GTG TAC ACC ACA ATT TAC-3 'hybridizing specifically in 3' at the UTR. 35 thermal cycles were applied (10 sec denaturation at 98 ° C, 30 sec hybridization at 64 ° C and 150 sec elongation at 68 ° C)
  • a second PCR is then carried out on 1 ⁇ l of the PCR product in order to specifically amplify the coding phase.
  • the sense primer BS31 of sequence SEQ SD M ° 1S 5 ' GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTC AGC ATG GCC GCG CTG CTC 3' and the antisense primer BS32 of sequence SEQ ID N ° 19 5 ' GGG ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGG TTT AGT GCC AGT CAA ATG TTC TGC C 3' .
  • the PCR program used is identical to that used for the first PCR.
  • the 1 kb PCR product was then cloned according to the procedure of the Gateway cloning technology kit, Invitrogen in the episomal vector pE-IRES-neo2.
  • the sequence of the porcine gene has been verified by sequencing.
  • the nucleotide sequence obtained is the sequence SEQ IDN ° 4.
  • the deduced protein sequence is the sequence SEQ IDN ° 5.
  • EXAMPLE 6 Identification of the complete coding sequence of the porcine 6-OST gene
  • the partial sequence of the porcine gene (nucleotide 682 to 910 of the human sequence) coding for 6-OST is available in an EST bank (GenBank accession number BE235545)
  • the complete coding sequence of the 6-OST gene was identified by combining two RT-PCR experiments with 5 'and 3'-RACE experiments using, as the RNA source, porcine RNA isolated from Trizol kit protocol (Invitrogen)
  • Reverse transcription of 80 ng of total RNA into cDNA was carried out according to the protocol of the First Strand Synthesis Sytem kit (Invitrogen), using as an primer an oligonucleotide dT24.
  • the amplified fragment of 537 bp was cloned into the vector pCR- Blunt II TOPO (Invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit) then sequence.
  • the amplified fragment of 718 bp was cloned into the vector pCR- Blunt II TOPO (Invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit) then sequence.
  • the sequence of this fragment was used to generate two primers 386-24, 386-26 used for 5'-RACE.
  • 1 ⁇ l of porcine liver RNA was reverse transcribed into cDNA according to the protocol of the First Strand Synthesis Sytem kit from Invitrogen, using as oligodT CDS-C of sequence SEQ ID N ° 24 5'-ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG T 30 VC-3 '.
  • the 3 ′ region of the gene coding for 6-OST was then amplified by 2 successive PCRs.
  • the first PCR was carried out on 2 ⁇ l of cDNA, obtained previously, with the sense primer 386-19 of sequence SEQ ID No. 25 5'-GGA CCT CTT CCA GCA GCG-3 'and the antisense primer CDS-C with Advantage 2 polymerase micx (Clontech). 24 thermal cycles were applied (7 sec of denaturation at 98 ° C, 10 sec of hybridization at 62 ° C and 2 min of elongation at 68 ° C) A second PCR was then performed on 2 ⁇ l of product from the first PCR using the sense primer 386-20 of sequence SEQ ID No.
  • porcine liver RNA was reverse transcribed into cDNA according to the protocol of the First Strand Synthesis Sytem kit from Invitrogen, using as oligonucleotide 386-28 of sequence SEQ ID N ° 27 5'- CCA GGC TCA GCC CCG G-3 '.
  • the 5 ′ region of the gene coding for 6-OST was then amplified by 2 successive PCRs.
  • the first PCR was carried out on 2 ⁇ l of grafted cDNA, with the okib58 sense primer of sequence SEQ ID No. 29 5'-GGC AAT GTC GAC CTC CCT ACA AC-3 'hybridizing to the okib57 primer and 386-24 anti-sense primer sequence SEQ ID No. 30_ 5'-TCA GCC CCG GGC CCG CG-3 'according to the protocol of the Advantage 2 polymerase mix kit. 24 thermal cycles were applied (10 sec denaturation at 98 ° C, 10 sec hybridization at 64 ° C and 2 min elongation at 72 ° C).
  • a second PCR was then carried out on 0.5 ⁇ l of product resulting from the first PCR using the primer meaning okib59 of sequence SEQ ID No. 31_5'- CTC CCT ACA ACC CGA ATT CCT AC-3 'and the primer anti-sense 386-26 of sequence SEQ ID No. 32_5'-GCC CGC GTA CTG GTA GAG G-3 '.
  • the amplified fragment of 170 bp was sequenced. This experiment made it possible to identify the 5 ′ region coding for 6-OST and approximately 14 bp of the non-coding region.
  • RNA The source of RNA is the same as in the previous step. 2 ⁇ g of RNA were reverse transcribed into cDNA according to the protocol of the kit First Strand Synthesis Sytem, using as primer the oligonucleotide dT CDSIII. The codan gene for 6-OST was then amplified by PCR using primers compatible with the Gateway system (Invitrogen). The PCR was carried out on 2 ⁇ l of cDNA with a sense primer 386-33 of sequence SEQ ID No.
  • the 1 kb PCR product was then cloned according to the procedure of the Gateway cloning technology kit, Invitrogen in the episomal vector pE-IRES-neo2.
  • the sequence of the porcine gene has been verified by sequencing.
  • the nucleotide sequence obtained is the sequence SEQ ID No. 6.
  • the deduced protein sequence is the sequence SEQ ID No. 7.
  • mast cells In order to obtain pig mast cells whose growth would be independent of SCF in the long term, mast cells can be transformed with the mutated c-kit gene.
  • the c-kit gene preferably porcine, carrying a point mutation responsible for the modification of valine 556 into glycine (gene noted c-kit G556 ), this mutation is analogous to the c-kit mutants G559 in mice and c-kit G560 in humans.
  • the c-kit gene deleted at the level of amino acids TQLPYDH 570 to 576 in mice this deletion is analogous to amino acids 573 to 579, in humans 574-580.
  • murine, human, bovine genes or any other gene having at least 80% homology with the porcine gene can be used. In this case, it is then also possible to use a point mutation responsible for the modification of aspartic acid to valine 814 or 816 respectively in mice and in humans.
  • the mast cells are transfected by one of the methods described in Example 4, preferably nucleoporation, with an integrative vector in which the coding phase of the mutated c-kit gene is cloned under the control of a strong viral promoter (CMV, RSV) or cellular (EF1 ⁇ ).
  • CMV strong viral promoter
  • EF1 ⁇ cellular EF1 ⁇
  • this vector can also carry a gene coding for resistance to an antibiotic (geneticin, hygromycin, puromycin, etc.)
  • the cells 48 hours after transfection, the cells are counted, centrifuged and seeded at 2.10 5 C / ml in the complete culture medium supplemented with the selection antibiotic. Cells are grown in the presence of selection for 2 to 3 weeks, which makes it possible to eliminate the cells which are not stably transfected. After this selection period, the cells are amplified.
  • the cells are then genetically analyzed by PCR and RT-PCR in order to verify the integration of the mutated c-kit gene and its expression.
  • the independence of these cells from SCF is demonstrated by comparing the growth of cells transfected with the mutated c-kit gene in a medium without SCF with the growth of cells transfected with the empty vector in a medium with and without SCF.
  • a variant of this protocol consists in using a vector carrying only the mutated c-kit gene.
  • the cells are selected 48 hours after transfection without using a selection agent but by seeding the cells at 2.10 5 C / ml in a medium devoid of SCF. Untransfected cells are not able to grow in a medium lacking SCF unlike transfected cells.
  • EXAMPLE 8 Transfection of the lines according to the invention with the porcine 3QST gene.
  • the mast cells are transfected by the nucleoporation method described in Example 4, with an integrative plasmid in which the coding phase of the 3-OST gene has been cloned under the control of a strong viral promoter (CMV, RSV) or cell (EF1 ⁇ )
  • CMV, RSV strong viral promoter
  • EF1 ⁇ cell
  • this plasmid carries a gene coding for resistance to an antibiotic (geneticin, hygromycin, puromycin, etc.).
  • the cells 48 hours after transfection, the cells are counted, centrifuged and seeded at 2.10 5 C / ml in the complete culture medium supplemented with the selection antibiotic.
  • the cells are cultured in the presence of selection for 2 to 3 weeks, which makes it possible to eliminate the cells which are not stably transfected. After this selection period, the cells are amplified.
  • These cells are genetically analyzed by PCR and RT-PCR in order to verify the integration of the mutated c-kit gene and its expression.
  • 3-OST The functionality of 3-OST is demonstrated by HPLC analyzes of heparin produced by mast cells compared with that produced by untransfected mast cells. Analyzes of the biological activity of the product make it possible to confirm the increase in the biological activity with respect to factor Xa and lia.
  • Table 2 HPLC analysis of the disaccharides obtained from the cultures isolated after 15 weeks.

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Abstract

La présente demande a pour objet un procédé d'obtention de cultures ou de lignées de mastocytes. Elle est en outre relative à un procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture de cultures ou lignées de mastocytes.

Description

Procédé d'obtention de lignées de mastocytes à partir de tissus de porcs et procédé de production de molécules de type héparine
La présente demande a pour objet un procédé d'obtention de cultures ou de lignées de mastocytes. Elle est en outre relative à un procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture de cultures ou lignées de mastocytes.
Les mastocytes sont des cellules du système immunitaire, dérivés de précurseurs hématopoïétiques, qui interviennent dans la réponse inflammatoire, notamment dans les phénomènes d'allergie et d'hypersensibilité. Ils sont localisés dans le tissu conjonctif, notamment au niveau de la peau, des muqueuses intestinales et respiratoires.
Les mastocytes se présentent sous la forme de cellules arrondies d'un diamètre compris entre environ 5 à 25μm et possèdent un noyau arrondi, unique, central ou excentré. Ils sont aussi caractérisés par la présence de nombreuses granulations cytoplasmiques méta-chromatiques.
Ces granules renferment diverses espèces moléculaires ayant une activité proinflammatoire telles que l'histamine, la sérotonine, des protéoglycanes tels que l'héparine ou le chondroïtine sulfate, des enzymes, des cytokines et des facteurs chimioattractants des éosinophiles et des neutrophiles. Ces espèces sont libérées lors de l'activation mastocytaire.
Après activation, une réponse secondaire se met en place durant laquelle a lieu la synthèse des médiateurs tels que les leucotriènes, les prostaglandines, le PAF (platelet activating factor), des interleukines (IL4, IL5, IL6, IL10, IL12 et IL 13), des cytokines (TGF beta, IFN gamma, GM-CSF) et des chimiokines (MCP-1 ,IL8, RANTES). L'ensemble de ces espèces participe au déclenchement d'un processus inflammatoire et à la mise en place d'une réponse immunitaire spécifique dépendante des lymphocytes T. Des cultures de mastocytes ont été déjà obtenues chez l'homme et la souris, mais l'état de la technique ne fournit pas de description de telles cultures établies ou de lignées chez le porc.
Razin et al (J. Biol. Chem., 257, 7229-7236, 1982) décrivent l'obtention de mastocytes de souris en utilisant des milieux de culture contenant de l'IL3.
Wang et al (Cire. Res., 84, 74-83, 1999) décrivent l'isolement de mastocytes séreux obtenus à partir de cavités pleurales et péritonéales de rat. Diverses espèces moléculaires sont produites mais uniquement quand les mastocytes sont co-cultivés avec des cellules de muscle lisse aortique de rat. La demande W099/26983 décrit des travaux proches, et est très peu précise quant à l'application à d'autres espèces.
Des lignées cellulaires ont été établies chez la souris (Montgomery et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11327-11331 , 1992 et demande WO90/14418) mais à partir de mastocytomes. Ces tumeurs sont extrêmement rares chez le porc.
Chez l'homme l'obtention de cultures de mastocytes s'est révélée difficile. Elle a tout d'abord été permise par l'utilisation de système de co-culture avec des fibroblastes (Ishizaka et al, Current Opinion in Immunology, 5, 937-943, 1993).
D'autres auteurs sont ensuite parvenus à obtenir des mastocytes à partir de cellules intestinales et à maintenir ces cellules en culture pendant environ 6 mois en présence de SCF (Bischoff et al, J. Immunol., 159, 5560-5567, 1997).
Quant elle a été mesurée, les auteurs de ces différents articles n'ont reporté qu'une faible production de composés de type héparine.
Chez le porc Emery et al (Expérimental Hematology, 24, 927-935, 1996) ont maintenu, durant 7 semaines, des cultures de cellules obtenues à partir de moelle osseuse. Néanmoins il apparaît que les cultures obtenues sont des mélanges de divers types cellulaires et non des cultures homogènes ou des lignées de mastocytes. De plus ces cultures contiennent des cellules non-différenciées en cultures homogènes de mastocytes.
Ashraf et al (Veterinary Parasitology; 29, 134-158, 1988) ont isolé des mastocytes de porcs à partir de la muqueuse intestinale sans maintenir de cultures amplifiables. En outre la caractérisation des mastocytes isolés révèle l'absence d'héparine.
L'héparine appartient à la famille des glycosaminoglycanes (GAG), qui regroupe les polysaccharides linéaires contenant une répétition d'une séquence disaccharidique se composant d'un sucre aminé (D-glucosamine ou galactosamine) et d'un acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique). Dans le cas de l'héparine, qui appartient, avec l'héparane sulfate, à la sous-famille des glucosaminoglycanes le sucre aminé est la D-glucosamine. L'acide uronique est soit l'acide glucuronique (GIc), soit l'acide iduronique (Ido). La glucosamine peut être N-acétylée, N-sulfatée et O-suIfatée.
Conventionnellement, on désigne sous le terme "héparine" des polysaccharides hautement sulfatés dans lesquels plus de 80% des résidus glucosamine sont N- sulfatés et le nombre de O-sulfate est plus important que celui des N-sulfates. Le rapport sulfate/carboxylate est généralement supérieur à 2 pour l'héparine.
Cependant, la structure de l'héparine est en fait très hétérogène, et il existe des chaînes pouvant contenir des rapports très différents.
Comme tous les GAGs, l'héparine est synthétisée sous forme d'un protéoglycane essentiellement par les mastocytes.
La première étape de la synthèse de l'héparine est la formation du noyau protéique serglycine, constitué d'une répétition de résidus serine et glycine.
L'élongation de la chaîne d'héparine se fait par ajout d'un tétrasaccharide, puis par ajouts successifs de glucosamines et d'acides uroniques, régulièrement alternés.
Le protéoglycane ainsi formé subit de nombreuses transformations séquentielles:
N-déacétylation, N-sulfatation, épimérisation de l'acide D-glucuronique, et
O-sulfatation.
Toutefois, cette maturation complète n'a lieu que sur une partie du protéoglycane, ce qui génère une grande variabilité structurale de l'héparine, responsable de son hétérogénéité.
Les chaînes de polysaccharides sont ensuite clivées de la serglycine par une endoglucuronidase. Ces chaînes ont alors un poids moléculaire entre 5000 et 30.000 Da. Elles forment des complexes avec les protéases basiques et sont ainsi stockées dans les granules des mastocytes. L'héparine est excrétée uniquement lors de la dégranulation des mastocytes.
L'héparine joue un rôle biologique important, notamment dans l'hémostase, et est très largement utilisée en thérapeutique, en particulier en tant qu'agent anticoagulant et antithrombotique.
La majeure partie de l'héparine utilisée est isolée à partir de la muqueuse intestinale du porc, d'où elle est extraite par protéolyse, suivie de purification sur résine échangeuse d'anions (pour revue sur les différents procédés de préparation de l'héparine, cf. DUCLOS, « L'Héparine : fabrication, structure, propriétés, analyse »; Ed. Masson, Paris, 1984).
L'analyse de la composition en disaccharides de l'héparine de porc après dépolymérisation et chromatographie permet de différencier l'héparine des autres glycosaminoglycanes. On distingue notamment huit principaux disaccharides (figure 6). Les disaccharides sulfatés, ls, Ils, Ils, IVs, sont proportionnellement les plus abondants avec majoritairement le ls dont la quantité est supérieure à 40%, et préférablement supérieure à 50%. Par ordre d'abondance viennent ensuite les disaccharides Ils, llls et IVs. Le ratio entre les disaccharides ls et Ils est compris entre 3 et 8.
On peut observer une hétérogénéité dans la composition de l'héparine entre les lots issus de lots d'animaux d'origines différentes. Cette hétérogénéité est susceptible d'engendrer des variabilités dans l'activité biologique.
De plus l'utilisation d'animaux comme source d'héparine constitue un risque du fait de la présence éventuelle de virus susceptibles d'être transmis à l'homme. En outre, l'approvisionnement en matière première peut se révéler irrégulier.
-La présente invention propose de pallier ces inconvénients et de s'affranchir des problèmes d'approvisionnement en termes de quantité et de qualité, en utilisant une source de matière première plus facilement contrôlable. La demanderesse a montré qu'il était possible de produire en quantité importante à partir de cultures de mastocytes, de l'héparine possédant des propriétés comparables à celles de l'héparine extraite du mucus intestinal porcin et reproductibles.
La demanderesse a en outre mis en évidence que les gènes codant trois protéines d'importance pour la production de molécules de type héparine ou l'indépendance des mastocytes vis à vis de facteurs de croissance, présentaient chez le porc des séquences différentes de celles d'autres espèces.
La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de cultures ou de lignées de mastocytes comprenant la mise en culture d'une population de cellules souches de moelle osseuse de jeunes porcs ou de fœtus, dans un milieu comprenant au moins environ 0,2 ng/ml d'interleukine- 3 (IL-3) préférentiellement porcine (préférentiellement au moins 0,5 ng/ml, encore plus préférentiellement au moins 2 ng/ml), au moins environ 8 ng/ml de Stem Cell Factor (SCF) préférentiellement porcin (préférentiellement au moins 20 ng/ml, encore plus préférentiellement au moins 80 ng/ml) et au moins environ 0,1 ng/ml d'interleukine-4 ( IL-4) préférentiellement porcine (préférentiellement au moins 0,5 ng/ml, encore plus préférentiellement au moins 1 ng/ml), 10 ng/ml d'interleukine-6
(IL-6) préférentiellement porcine (préférentiellement au moins 50 ng/ml, encore plus préférentiellement au moins 100 ng/ml) et/ou 1 ng/ml de G-CSF préférentiellement porcin (préférentiellement au moins 5 ng/ml, encore plus préférentiellement au moins 10 ng/ml).
Ainsi le milieu d'obtention contient une combinaison d'IL4, d'ILδ et de G-CSF séparément, deux à deux ou tous les trois ensemble dans un milieu contenant de l'IL3 et du SCF.
Bien que ces différents facteurs soient préférentiellement d'origine porcine, c'est à dire que leur séquence est déduite de celle du facteur correspondant chez le porc, il est possible de remplacer au moins l'un d'entre eux par un facteur d'une autre origine.
Ainsi l'interleukine 4 (IL-4) bien que préférentiellement d'origine porcine, peut aussi être d'origine murine ou humaine. Selon un mode de mise en œuvre de ce procédé les porcs dont sont issues les cellules souches ont entre environ 2 jours et environ 6 semaines. Néanmoins le procédé peut être appliqué à des cellules issues d'embryons ou de porcs plus âgés. De manière avantageuse les cellules sont maintenues dans le milieu pendant au moins environ 30 jours.
La présente invention a en outre pour objet des cultures et des lignées de mastocytes porcins susceptibles d'être obtenues par ledit procédé. On entend par mastocytes dés cellules qui, entre autres caractéristiques, présentent des granules cytoplasmiques métachromatiques contenant des molécules de type héparine et des protéases telles que de la tryptase, et expriment à leurs surfaces des récepteurs tels que le récepteur au SCF nommé c- kit ou encore le récepteur des IgE. Le terme « culture » désigne ici, de manière générale, une cellule ou un ensemble de cellules cultivées in vitro. Une culture développée directement à partir d'un prélèvement cellulaire ou tissulaire effectué sur un animal est dénommée « culture primaire ». Le terme « lignée » est employé à partir du moment où au moins un passage, et généralement plusieurs passages consécutifs en sous-culture ont été effectués avec succès, et désigne toute culture qui en est issue (SCHAEFFER, In Vitro Cellularand Developmental Biology, 26, 91-101, 1990).
La présente invention a en outre pour objet des cultures ou lignées de mastocytes porcins caractérisées en ce qu'elles produisent des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disaccharides Ils et llls proche de celui de l'héparine porcine. On entend par molécules de type héparine des polysaccharides hautement sulfatés dans lesquels plus de 80% des résidus glucosamine sont N-sulfatés et le nombre de O-sulfate est plus important que celui des N-sulfates. De manière avantageuse de telles cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disaccharides Ils et llls compris entre 0,5 et 5 (préférentiellement entrel et 2,5, encore plus préférentiellement entre 1 ,3 et 1 ,9) et/ou des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disaccharides ls et Ils compris entre environ 3 et 8 (préférentiellement entre 4 et 7 encore plus préférentiellement entre 5 et 7 ).
Des cultures établies ou lignées de mastocytes porcins selon la présente invention peuvent aussi être caractérisées en ce qu'elles produisent, au moins 0,1 μg de molécules de type héparine/106 cellules (préférentiellement au moins 1 μg, encore plus préférentiellement au moins 10 μg).
De manière avantageuse de telles cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine dans lesquelles les quantités en disaccharides ls sont supérieures aux quantités en disaccharides Ils, les quantités en disaccharides Ils sont supérieures aux quantités en disaccharides llls, et les quantités en disaccharides llls sont supérieures aux quantités en disaccharides IVs,
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux de telles cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine présentant des rapports entre les disaccharides ls, Ils, llls et IVs proches de ceux de l'héparine.
De manière avantageuse de telles cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine comprenant au moins 30% de disaccharides ls (préférentiellement au moins 40%, encore plus préférentiellement au moins 50%). De manière avantageuse de telles cultures ou lignées produisent, des molécules de type héparine présentant une activité anti-Xa supérieure à au moins 10 Ul/mg (préférentiellement au moins 20 Ul/mg) et/ou présentant une activité anti-lla supérieure à au moins 10 Ul/mg (préférentiellement au moins 20 Ul/mg).
Selon un mode de mise en œuvre préférentiel de l'invention de telles lignées sont les lignées de mastocytes porcins déposées auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France, le 09 Avril 2003 respectivement sous les n° 1-3010, I- 3011 , 1-3012, 1-3013, 1-3014. Ces lignées, déposées auprès de la CNC , présentent l'avantage d'avoir été obtenues à partir de porcs répondant à des exigences sanitaires en adéquation avec un usage des produits dérivés de leurs cellules en thérapeutique humaine. Ces porcs sont issus d'élevages protégés, indemnes d'organismes pathogènes spécifiques (IOPS) du porc.
Des acides nucléiques, comprenant des gènes codant pour des facteurs susceptibles d'améliorer les caractéristiques des cultures et lignées selon la présente invention peuvent être introduits dans ces cellules. Le terme acide nucléique est employé pour désigner un ADN ou un ARN. Avantageusement if est un ADN complémentaire ou génomique.
De tels facteurs peuvent permettre soit de favoriser la croissance des cellules soit de moduler la composition des molécules biologiques qu'elles produisent, et en particulier la composition des molécules de type héparine.
Ils peuvent être des gènes codants pour des protéines immortalisantes telles que l'antigène T du virus simien 40 (SV40), les protéine E6 et E7 du virus humain papilloma HPV, les protéines E1A de l'adénovirus, les protéines EBNA2 du virus d'Epstein-Barr ou encore les protéines Tax du virus HTLV-1. L'acide nucléique codant pour la sous-unité catalytique de la télomérase, TERT, peut aussi être utilisé comme gène immortalisant.
On utilisera préférentiellement l'AgT du virus SV-40, la séquence de l'ADN complémentaire de cet antigène est disponible dans GenBank sous la référence NC_001669..
Ils peuvent encore être des gènes codant pour des protéines permettant aux cellules de proliférer comme par exemple le G-CSF, le SCF et les interleukines (IL-3, IL-4 et IL-6).
Récemment, l'étude de mastocytomes murin et humain a permis d'identifier des mutations ou délétions du gène c-kit responsables de l'activation constitutive du récepteur c-kit. L'expression du gène c-kit muté au niveau du V814 dans des mastocytes immatures IC2 induit la transformation de ces cellules à savoir l'acquisition d'une croissance indépendante du SCF et d'un potentiel tumorigène (Pia et al, Blood, 87(8), 3117-3123, 1996). Un acide nucléique comprenant un tel gène muté peut être introduit dans ces cellules.
Ils peuvent être des gènes codant pour des protéines comme la ser/gly ou des enzymes agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine. Une telle enzyme peut être une O-sulfatase, telle qu'une 3-O-sulfatase. ou encore une 6-0 sulfatase.
Avantageusement une telle enzyme est la 3 O-sulfatase-1 (3-OST-1), préférentiellement la 3 O-sulfatase-1 porcine.
Les acides nucléiques comprenant ces gènes peuvent être introduits dans ces cellules par toute méthode connue de l'homme du métier et en particulier par transfection, par nucléoporation ou par électroporation. Des vecteurs rétroviraux portant ces gènes peuvent aussi être utilisés pour transfecter ces cellules.
Dans le cadre de la présente invention la demanderesse a mis en évidence que l'introduction d'un acide nucléique codant une 3-OST, et en particulier la 3-OST-1 , permet de moduler la composition des molécules de type héparine des mastocytes, quel que soit le type de mastocyte d'origine porcine. La demanderesse n'entend donc pas limiter cet objet de son invention aux mastocytes obtenus par le procédé décrit ci dessus. Aussi la présente demande a pour objet tout mastocyte d'origine porcine dans lequel un acide nucléique codant une 3-OSTa été introduit.
La demanderesse a en outre déterminé les séquences de trois protéines d'origine porcine pouvant être utilisées pour la mise en œuvre de la présente invention et des séquences nucléotidiques codant ces protéines.
Ainsi la présente demande a pour objet une protéine d'origine porcine de type c-kit caractérisée en ce qu'elle présente une extrémité C-terminale ayant la séquence SEQ ID N°3. Une telle protéine peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 99% avec la séquence SEQ ID N°2. De manière préférentielle une telle protéine présente une glutamine (Q) en position 40 et/ou une lysine (K) en position 173. La présente invention a en outre pour objet un polynucléotide ou un acide nucléique, comprenant une séquence codant une protéine d'origine porcine de type c-kit. Un tel acide nucléique peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 99% avec la séquence SEQ ID N°1. L'obtention de la séquence complète du c-kit porcin n'était pas évidente au vu de l'état de la technique.
La présente demande a de plus pour objet une protéine d'origine porcine présentant une activité 3 -O-sulfatase. Une telle protéine peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 95%, préférentiellement d'au moins 97%, et encore plus préférentiellement d'au moins 99%, d'identité en acides aminés avec une protéine de séquence SEQ ID N°5.
La présente invention a en outre pour objet un polynucléotide ou un acide nucléique, comprenant une séquence codant une protéine d'origine porcine présentant une activité 3-OST. Un tel acide nucléique peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 95%, préférentiellement d'au moins 97%, et encore plus préférentiellement d'au moins 99%, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°4.
L'obtention de la séquence de la 3-OST porcine n'était pas évidente au vu de l'état de la technique. La 3-OST porcine isolée est susceptible de présenter des propriétés inattendues, et en particulier de présenter une meilleure activité dans les mastocytes porcins par rapport aux 3-OSTd'autres espèces connues de l'homme du métier
La présente demande a encore pour objet une protéine d'origine porcine présentant une activité 6-O-sulfatase. Une telle protéine peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 90%, préférentiellement d'au moins 95%, et encore plus préférentiellement d'au moins 99%, d'identité en acides aminés avec une protéine de séquence SEQ ID N°7. La présente invention a en outre pour objet un polynucléotide ou un acide nucléique, comprenant une séquence codant une protéine d'origine porcine présentant une activité 6-OST. Un tel acide nucléique peut comprendre une séquence présentant une identité d'au moins 95% préférentiellement d'au moins 97%, et encore plus préférentiellement d'au moins 99%, .d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°6.
L'obtention de la séquence de la 6-OST porcine n'était pas évidente au vu de l'état de la technique. La 6-OST porcine isolée est susceptible de présenter des propriétés inattendues, et en particulier de présenter une meilleure activité dans les mastocytes porcins par rapport aux 3-OSTd'autres espèces connues de l'homme du métier
En outre la présente demande a pour objet des acides nucléiques s'hybridant en conditions de forte stringence avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°1, SEQ ID N°4 ou de séquence SEQ ID N°6.
Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucleotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor , Madison, WISCONSIN. A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1.4.9 de mars 1996, BLAST 2.0.4 de février 1998 et BLAST 2.0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F Altschul et al, J. Mol. Biol. 1990 215 : 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25 : 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence « requête » de référence, à l'aide de l'algorithme d'AltschuI et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.
Par « conditions d'hybridation de forte stringence » au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes :
1- Pré-hybridation des membranes et:
-Mélanger : 40μl ADN sperme de saumon (10mg/ml)+ 40 μl ADN placentaire humain (10mg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace le mélange.
- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.
- Incubation à 42°C pendant 5 à 6 heures, avec rotation. 2- Compétition de la sonde marquée :
- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 μl ADN Cot I, selon la quantité de répétitions.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 95°C.
- Incuber à 65°C pendant 2 à 5 heures. 3- Hybridation :
- Oter le mix de pré hybridation.
- Mélanger 40 μl ADN sperme de saumon + 40 μl ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace. - Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée.
- Incuber 15 à 20 heures à 42°C, avec rotation. 4- Lavages : - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.
- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1% à 65°C.
- 2 fois 15 minutes à 65°C SSC 1X et SDS 0,1% à 65°C. Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.
Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985, "Nucleic acid hybridization : a practical approach", Hames and Higgins Ed.,
IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de F.AUSUBEL et al (1989, Current
Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley
Interscience, N.Y).
Les protéines objets de la présente invention peuvent être obtenues par tous moyens connus de l'homme du métier. Elles sont néanmoins avantageusement obtenues par expression des acides nucléiques tels que décrits ci-dessus, codant pour ces protéines, éventuellement insérés dans des vecteurs d'expression, dans des cellules avantageusement choisies, suivie éventuellement par une extraction et une purification qui peut être totale ou partielle.
L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'invention. Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprendra un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants :
a) un acide nucléique codant pour une protéine ayant au moins 60% d'identité en acides aminés avec une séquence SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°7 ou un fragment peptidique ou un variant de cette dernière ; b) un acide nucléique comprenant un acide nucléique ayant une séquence SEQ ID N°1, SEQ ID N°4 ou SEQ ID N°6, ou un fragment ou un variant de ce dernier ; c) un acide nucléique ayant au moins 60% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique ayant une séquence SEQ ID N°4 ou SEQ ID N°6 ou un fragment ou un variant de ce dernier ; d) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID N°1 , SEQ ID N°4 ou
SEQ ID N°6, ou un fragment ou un variant de ce dernier.
Par « vecteur » au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.
Selon un mode de réalisation, le vecteur d'expression comprend, outre un acide nucléique conforme à l'invention, des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants :
(1) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique à insérer, tels que des promoteurs et des enhanceurs ;
(2) la séquence codante comprise dans l'acide nucléique conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits aux (1) ; et
(3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées. En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection.
Des cellules comprenant de tels acide nucléiques et/ou exprimant de telles protéines constituent d'autres objets de la présente invention. La présente demande est de plus relative à un procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture de cultures ou lignées de mastocytes porcins tels que décrits ci-dessus.
Les mastocytes, obtenus selon l'invention dans un milieu contenant de l'IL-3, du SCF et de l'IL-4, présentent une structure disaccharidique meilleure que ceux obtenus dans un milieu ne contenant que de l'IL-3 et du SCF. La demanderesse a aussi montré que l'ajout d'IL-4 au milieu de culture permet d'obtenir à partir des mastocytes des molécules de type héparine présentant des caractéristiques plus proches de l'héparine porcine par rapport à celles obtenues en utilisant des cellules obtenues dans un milieu ne contenant que de l'IL-3 et du SCF ou contenant de l'IL-3 du SCF et de l'IL-6 ou de l'IL-3 du SCF et du G-CSF.
Aussi, la présente demande est de plus relative à un procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture, dans un milieu adapté, de cultures ou lignées de mastocytes porcins dans un milieu de culture comprenant au moins environ 0,1 ng/ml de IL-4 (préférentiellement au moins environ 0,5 ng/ml, encore plus préférentiellement au moins environ 1 ng/ml).
Des mastocytes peuvent aussi être modifiés afin de surexprimer de l'IL4. Ainsi un autre objet de la présente demande est un procédé de production de molécules de type héparine comprenant l'obtention de cultures ou lignées de mastocytes porcins transfectées par un acide nucléique codant pour l'IL4, et la mise en culture des ces cellules dans un milieu de culture adapté. De tels mastocytes constituent en eux-même un objet de la présente demande. Ils peuvent être obtenus par toute méthode connue de l'homme du métier et en particulier par transfection, par nucléoporation ou par électroporation d'un acide nucléique comprenant un gène codant pour l'IL-4. Des vecteurs rétroviraux portant ces gènes peuvent aussi être utilisés pour transfecter ces cellules. La séquence de l'ADN complémentaire de l'IL-4 a été décrite par Bailey et al (Biochim.Biophys.Acta. 1171(3), 328-330, 1993).
Les cellules, lignées et cultures selon la présente invention peuvent être maintenues en culture dans les conditions dans lesquelles elles ont été obtenues. Elles peuvent aussi être maintenues en culture dans des milieux comprenant des quantités réduites de SCF, de GM-CSF, d'IL-3, d'IL-4 et/ou d'IL-6. Elles seront néanmoins préférentiellement maintenues dans un milieu contenant de l'IL-4.
Ces mastocytes seront de préférence cultivés dans un milieu de culture défini (MEM /DMEM, RPMI, IMDM, ...) supplémenté en facteurs de croissance, utilisés en combinaison ou de façon individuelle.
Les milieux peuvent également être supplémentés avec du sérum bovin, à une concentration comprise entre 0,5% et 20% (v/v).
L'addition de sérum bovin dans les milieux de culture peut être remplacée par l'utilisation d'un milieu de culture sans sérum tel que AIMV (INVITROGEN) de façon à réduire la concentration protéique du milieu et les risques associés à l'utilisation de composés d'origine animale (KAMBE et al., J. Immunol. Methods, 240, 101-10, 2000). L'indépendance des cellules vis-à-vis de l'ajout de sérum et/ou de l'utilisation de facteurs de croissance, peut être obtenue par mutation du phénotype cellulaire par l'action d'agents transformants et/ou immortalisants (TSUJIMURA, Pathology International, 46, 933-8, 1996 ; PIAO et BERNSTEIN, Blood, 87(8), 3117-23, 1996).
Les mastocytes peuvent être cultivés en utilisant les techniques développées pour la culture en masse de cellules eucaryotes, comme décrit par exemple par GRIFFITHS et al. (Animal Cell Biology, Eds. Spier et Griffiths, Académie Press, Londres, vol.3, 179-220, 1986). On peut utiliser des bioréacteurs de capacité supérieure à plusieurs m3 comme décrit par PHILIPS et al. (Large Scale Mammalian Cell Culture, Eds. Feder et Tolbert, Académie Press, Orlando, U.S.A., 1985), ou par MIZRAHI (Process Biochem, Août, 9-12, 1983). La culture peut également être réalisée en suspension ou sur micro-support selon la technique décrite par VAN WEZEL (Nature, 216, 64-65, 1967). On peut également utiliser des systèmes de culture en lots (batch), qui sont fréquemment utilisés pour les cultures de cellules eucaryotes, du fait de leur plus grande simplicité de mise en œuvre à l'échelle industrielle (VOGEL et TODARO, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd édition, Noyés Publication, Westwood, New Jersey, U.S.A., 1997). Les densités cellulaires obtenues avec ces systèmes sont généralement comprises entre 106 et 5 x 106 cellules/ml.
La productivité des cultures en batch peut être avantageusement augmentée en prélevant une partie des cellules du bioréacteur (70% à 90%) pour les opérations d'extraction des GAGs et d'isolement de l'héparine et en conservant les cellules restantes au sein du même bioréacteur pour initier une nouvelle culture. Dans ce mode de culture dit en batch répété on peut de plus distinguer les paramètres optimum de la phase de croissance cellulaire, de ceux permettant une plus grande accumulation de GAGs et d'héparine au sein des cellules.
Des systèmes de culture en continu de type perfusés, avec ou sans rétention cellulaire peuvent également être utilisés (VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102(2), 275-278, 1987 ; CHAUBARD et al., Gen. Eng. News, 20, 18-48, 2000). Dans le cadre de la présente invention on peut notamment utiliser des systèmes de culture perfusés permettant la rétention des cellules à l'intérieur du réacteur, et aboutissant à une croissance et une production supérieure à celle pouvant être obtenue en batch. La rétention peut être effectuée par l'intermédiaire de systèmes de rétention de type filtre tournant (spin-filter), fibres creuses ou matrice solide (WANG et al., Cytotechnology, 9, 41-49, 1992 ; VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102(2), 275-278, 1987) Les densités cellulaires obtenues sont généralement comprises entre 107 et 5 x 107 cellules/ml. La culture en bio-réacteurs permet, par l'utilisation de capteurs de mesure en ligne, un meilleur contrôle des paramètres physico-chimiques de la croissance cellulaire : pH, p02, Red/Ox, substrats de croissance tels que vitamines, acides aminés, substrats carbonés (par exemple glucose, fructose, galactose), métabolites tels que lactate ou ammoniaque, etc.
Il peut être envisagé d'augmenter quantitativement et qualitativement le contenu en molécules de type héparine des mastocytes suite à un traitement avec le sodium butyrate (Nakamura et al (Biochim.Biophys.Acta. 627, 60-70, 1980).
Après 3 à 14 jours de culture, de préférence après 3 à 5 jours, les cellules sont récoltées et séparées du milieu de culture, généralement par centrifugation ou filtration.
Différents systèmes de centrifugation peuvent être utilisés, on citera par exemple ceux décrits par VOGEL et TODARO (Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd Edition, Noyés Publication, Westwood, New Jersey, U.S.A.). Alternativement ou en combinaison avec la centrifugation, on peut effectuer la séparation par microfiltration tangentielle, à l'aide de membranes dont la porosité est inférieure au diamètre moyen des cellules (5 à 20μm) tout en permettant le passage des autres composés en solution/suspension. La vitesse du flux tangentiel et la pression appliquée sur la membrane sera choisie de façon à générer peu de force de cisaillement (nombre de Reynolds inférieur à 5000 sec"1) afin de réduire le colmatage des membranes et préserver l'intégrité des cellules pendant l'opération de séparation.
Différentes membranes peuvent être utilisées, par exemple, des membranes spirales (AMICON, MILLIPORE), des membranes planes ou des fibres creuses (AMICON, MILLIPORE, SARTORIUS, PALL, GF).
On peut aussi choisir des membranes dont la porosité, la charge ou le greffage permet d'effectuer une séparation et une première purification vis-à-vis d'éventuels contaminants pouvant être présents dans le milieu de culture, tels que protéines cellulaires, ADN, virus ou autres macromolécules.
L'utilisation de membranes de porosité plus réduite peut aussi être envisagée dans le cas où l'héparine aurait été libérée du contenu intracellulaire, par dégranulation ou lyse de tout ou partie des mastocytes, et est présente dans le milieu de culture au moment de l'étape de séparation. Dans ce cas, la séparation des cellules est combinée à une étape ultrafiltration sur une ou plusieurs membranes dont l'agencement et la porosité permet de concentrer l'héparine et de la séparer des autres espèces présentes dans le milieu, en fonction de la taille et du poids moléculaire, et éventuellement de la charge électrique ou des propriétés biologiques.
Dans le cadre de ce mode de mise en œuvre, le seuil de coupure des membranes est de préférence compris entre 1000 et 5 Kda. On peut utiliser des systèmes de membranes similaires à ceux employés pour la micro-filtration, par exemple, membranes spirales, membranes planes ou fibres creuses. On peut avantageusement utiliser des membranes permettant d'effectuer une séparation et une purification de l'héparine, du fait de leurs propriétés de charge ou du greffage de ligands présentant une affinité pour l'héparine (par exemple anticorps, ATIII, lectine).
Toutefois, on préférera généralement utiliser des méthodes de production et de récolte des cellules permettant de conserver l'héparine dans le contenu intracellulaire. La récupération de l'héparine à partir des mastocytes peut aussi se faire après dégranulation ou lyse des cellules.
La dégranulation peut être provoquée par la fixation de ligands spécifiques sur les récepteurs présents à la surface des mastocytes, par exemple la fixation d'agents de type allergène (tels que fragment Fc des IgE ou analogues de ce fragment) sur les récepteurs IgE des mastocytes.
D'autres agents peuvent aussi induire une dégranulation des mastocytes. Ces agents peuvent être classés en plusieurs catégories telles que les agents cytotoxiques, les enzymes, les polysaccharides, les lectines, les anaphylatoxines, les composés basiques (composé 48/80, substance P, etc), le calcium (ionophore A23187, ionomycine, etc). [D. Lagunoff and T . W. Martin. 1983. Agents that release histamine from mast cells. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 23:331-51]. L'utilisation d'agent de dégranulation peut être effectuée de façon répétée sur les mêmes cellules maintenues en culture. Dans ce mode de production la productivité est augmentée de façon significative par la simplification du procédé de récolte à partir du surnageant et par le maintien en culture des cellules. Dans le cas particulier de l'ionophore A23187, la dégranulation des mastocytes peut être induite par exemple par traitement de 2.106 cellules/ml de mastocytes avec l' ionophore A23187 à des concentrations comprises entre 1 à 100 μg/ml et des temps d'action variant de 1 minute à 4 heures.
La lyse des mastocytes, peut être induite, par exemple, par choc osmotique en utilisant des solutions hypotoniques ou hypertoniques, par choc thermique (congélation/décongélation), par choc mécanique (par exemple sonication ou variation de pression), par action d'agents chimiques (NaOH, THESIT™, NP40™, TWEEN 20™, BRIJ-58™, TRITON X™-100,...) ou par lyse enzymatique (papaïne, trypsine,...) ou par combinaison de deux ou plusieurs de ces méthodes.
Pour extraire et purifier l'héparine à partir du lysat cellulaire, séparer les chaînes polysaccharidiques du noyau serglycine, et séparer les chaînes d'héparine des autres GAGs présents dans le milieu d'extraction, on pourra utiliser des méthodes similaires à celles utilisées dans le cadre de l'extraction et la purification d'héparine à partir de tissus animaux, qui sont connues en elles-mêmes, et décrites dans des ouvrages généraux, tels que le manuel de DUCLOS, cité ci- dessus).
A titre d'exemples non-limitatifs, pour séparer l'héparine des acides nucléiques et des protéines cellulaires, et la solubiliser, c'est à dire rompre les liaisons avec le noyau serglycine :
- on peut soumettre le lysat cellulaire à une ou plusieurs digestions enzymatiques (pronase, trypsine, papaïne, etc..) ; - les liaisons héparine-protéine peuvent être hydrolysées en milieu alcalin, en présence de sulfates ou de chlorures ;
- on peut également effectuer un traitement en milieu acide (par exemple par de l'acide trichloracétique à froid) pour détruire les acides nucléiques et les protéines provenant des cellules, complété par l'utilisation d'une solution ionique qui permet de dissocier les interactions GAGs- protéines.
On peut également effectuer une extraction par la guanidine, après hydrolyse enzymatique ; pour purifier l'héparine solubilisée, on peut par exemple la précipiter par l'acétate de potassium, par un ammonium quaternaire, par l'acétone, etc.
Ces étapes de purification peuvent avantageusement être complétées ou remplacées par une ou plusieurs étapes de chromatographie, notamment de chromatographie d'échange d'anions.
La présente invention a également pour objet les préparations d'héparine susceptibles d'être obtenues à partir de cultures de mastocytes en mettant en œuvre un procédé selon l'invention.
Les préparations d'héparine conformes à l'invention, qui possèdent des propriétés biologiques comparables à celles des préparations d'héparine obtenues dans l'art antérieur à partir de tissus animaux, peuvent être utilisées dans toutes les applications usuelles de l'héparine.
Les figures 1 A à 1 H illustrent le marquage anti-tryptase des mastocytes obtenus après 3 semaines de culture, respectivement dans les conditions C1 à C8. Les pics ombrés et clairs correspondent respectivement aux témoins(sans anticorps) et aux cellules obtenues dans les conditions C1 à C8.
Les figures 2 A à 2H illustrent le marquage des récepteurs IgE des mastocytes obtenus après 5 semaines de culture, respectivement dans les conditions C1 à C8. Les pics hachurés, ombrés et clairs correspondent respectivement à des cellules non-marquées (cellules porcines non-mastocytaires), à des cellules témoins et aux cellules obtenues dans les conditions C1 à C8. Les figures 3 A à 3H illustrent le marquage anti-tryptase des mastocytes obtenus après 7 semaines de culture, respectivement dans les conditions C1 à C8. Les pics ombrés et clairs correspondent respectivement aux témoins et aux cellules obtenues dans les conditions C1 à C8.
Les figures 4 A à 4H illustrent le marquage FGF des mastocytes obtenus après 8 semaines de culture, respectivement dans les conditions C1 à C8. Les pics ombrés et clairs correspondent respectivement aux témoins et aux cellules obtenues dans les conditions C1 à C8.
La figure 5 illustre la croissance des cultures dans les différentes conditions C1 à C8 dans les 7 premières semaines de culture.
La figure 6 représente les structures chimiques des disaccharides ls, Ils llls et IVs correspondant aux disaccharides N sulfatés de l'héparine, ainsi que les disaccharides homologues acétylés la lia, llla et.lva.
La figure 7 illustre la croissance en réacteur des mastocytes obtenus dans les conditions C1 , C7 et C8.
La présente invention est illustrée par les exemples de mise en œuvre qui suivent. Ces exemples sont purement illustratifs et ne doivent pas être considérés comme limitatifs.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Isolement de populations de mastocytes à partir de moelle osseuse de jeunes porcs et obtention de lignées
Les animaux utilisés pour les prélèvements sont issus d'élevages protégés, indemnes d'organismes pathogènes spécifiques (IOPS) du porc (MERIAL SA Lyon France) Le sternum de porcelets âgés de quatre et six semaines, respectivement PI et PHI sont prélevé aseptiquememt puis transporté dans un container stérile au laboratoire pour être décontaminé et rincé par successivement une solution d'eau de javel pure diluée au 1/100 en tampon PBS (Phosphate Buffer Saline pH 7.4) puis en PBS. Les sternum sont ensuite coupés, puis la moelle osseuse est aspirée à l'aide d'une seringue pour être ensuite dilué en PBS. La suspension médullaire est tamisée sur une compresse stérile ; diluée dans 40 ml de PBS puis centrifugée 10 minutes à 400 g. Le culot cellulaire est repris dans 5 ml de PBS puis purifié sur 5ml de Ficoll (Dutscher) (1100gx10'). L'anneau contenant les cellules médullaires est récupéré puis rincé deux fois en PBS ( 14ml, 400gx10min) puis repris dans 2 ml de PBS pour être comptée, environ 1x 108 cellules totales par sternum.
Après comptage, les cellules sont centrifugées puis reprise à une concentration de 1-3 x106 cellules /ml en plaques de culture 6 puits et 4 ml par puits dans le milieu contentant les composants suivants : MEMD (Invitrogen) Sérum de veau Fetal 15% (PAA Laboratories) Pénicilline (Sigma) 100 Ul/ml, 100μg/ml Streptomycine (Sigma) 2ng/ml r-IL3 porcine (Biotransplant) 80ng/ml r-SCF porcin (Biotransplant). Dés la mise en culture les cellules sont cultivées dans le milieu de cultures décrit ci-dessus supplémenté en cytokines (IL4 recombinante porcine 1 ng/ml R1 D Systems; IL6 recombinante porcine 100ng/ml, R&D Systems; G-CSF humain recombinant 10ng/ml) comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : conditions de culture des cellules
( + milieu avec; - milieu sans cytokine)
Les plaques de cultures sont incubées à 38°C +/- 0.5 ° et sous atmosphère à 5% de C02. Deux fois par semaine et pendant huit semaines, le milieu de chaque puits est renouvelé avec du milieu frais. La caractérisation du phénotype mastocytes des cellules isolées est réalisée dés la semaine 2 puis à intervalles réguliers (semaine 3, semaine 5 et semaine 7)
Des lignées de mastocytes porcins, obtenues dans certaines des conditions indiquées ci-dessus, ont été déposées auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) le 09 avril 2003.
Ces lignées déposées sous les n° 1-3010, 1-3011 , 1-3012, 1-3013, 1-3014 ont été respectivement obtenues dans les conditions C1, C2, C3, C4 et C5 décrites dans le tableau 1.
La confirmation du phénotype mastocyte des cellules dans chaque condition de culture est mise en évidence par la détection en fluorocytometrie de la présence des marqueurs spécifiques tel que récepteur aux IgE, et tryptase. La détection du marquage avec le FGF est aussi réalisée pour la révélation du site de fixation du FGF sur l'héparine des mastocytes.
Marquage de la tryptase
1 ml de suspension cellulaire de chaque condition est prélevé. Chaque échantillon est rincé une fois par centrifugation en tampon PBS, puis les cellules sont resuspendues dans 400μl de tampon PBS contenant 0.5% de BSA ( Bovine Sérum Albumine ) et 0.01 %d 'azide de sodium.
Les cellules sont ensuite perméabilisées à 4°C en solution cytofix/cytoperm (Pharmingen), 200μl par échantillon et incubées 25 minutes. Après deux rinçage en tampon permawash( Pharmingen) les échantillons sont incubés 30 minutes à 4°C avec 1 μg d'anticorps monoclonal murin spécifique de la tryptase (Mouse anti- human Mast cell tryptase; Chemicon) Après trois rinçages en tampon permawash, le marquage est révélé par incubation pendant 25 minutes avec un conjugué anti immunoglobulines de souris marqué au FITC ( FITC-conjugates Affinity pure Goat Anti Mouse IgG ; Jackson Immunoresearch) Des dupliquas d 'échantillons sont réalisés selon la même procédure à l'exception de l'incubation avec l'anticorps anti tryptase afin de pouvoir soustraire lors de l'analyse la fluorescence due à la liaison non spécifique du conjugué marqué FITC.
A la fin de la dernière incubation, les cellules sont rincées deux fois en tampon permawash, puis remise ne suspension en tampon PBS froid additionné de 1% de formaldéhyde (Sigma) L'analyse en cytofluorimétrie est réalisée sur FACS (Faxcalibur Becton Dickinson)
Marquage du récepteur aux IgE
Environ 2x105 cellules de chaque condition sont prélevées, rincées deux fois en PBS puis incubées avec 2μg pour 106 cellules d'IgE canine (Monoclonal Canine IgE; Bethyl) Les échantillons sont incubés 3h30min à 37°C, puis rincée deux fois en PBS. Après remise en suspension en PBS, les échantillons sont ensuite incubés pendant 30 minutes à 4°C avec 5μg pour 106 cellules d'anticorps de chèvre anti IgE canine (Goat anti Dog IgE affinity purified; Bethyl)
Après incubation, les échantillons sont rincés de nouveau deux fois en PBS, puis incubés pendant 30 minutes avec un conjugué anti Ig de chèvre marqué au FITC (Donkey anti Goat/Sheep FITC; Serotec) Après deux rinçages en tampon PBS, les échantillons sont remis en suspension et fixés en tampon additionné de 1% de formaldéhyde. Comme précédemment des dupliquas d 'échantillons sont aussi réalisés en omettant l'incubation avec l'IgE afin de soustraire lors de l'analyse la fluorescence due à la liaison non spécifique du conjugué marqué FITC. Un échantillon de cellules porcines non mastocytaire (IRP) est aussi analysé dans les mêmes conditions afin de confirmer la spécificité du marquage.
Marquage du site de fixation du FGF. Les échantillons de culture cellulaire à analyser sont répartis dans une plaque 96 puits, fond conique, à raison de 0,2.106 par puits puis centrifugés à 1400 trs/mn, 4 mn. Le culot cellulaire est rincé dans 100μl de tampon PBS contenant 5g/l d'albumine bovine puis centrifugé à 1400 trs/mn, 4 mn. Deux rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions.
Les culots cellulaires sont dilué dans un tampon de fixation/perméabilisation Cytofix Cytoperm, (Pharmingen), rincé dans 100μl de tampon Perm/Wash (Pharmingen) puis centrifugé à 1400 trs/mn, 4 mn, 4°C. Trois rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions.
Les culots cellulaires sont dilués dans 100μl de tampon Perm/Wash contenant 172 ng/ml de FGF basic (R&D Systems) et incubés 30 minutes dans la glace. Les cellules sont rincées dans 100μl de tampon Perm/Wash™ puis centrifugées à 1400 trs/mn, 4 mn, 4°C. Trois rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions.
Les culots cellulaires sont dilués dans 100μl de tampon Perm/Wash contenant 1 μg d'anticorps monoclonal de souris anti-FGF basic (R&D Systems) couplé à la biotine et incubés 30 minutes dans la glace. Les cellules sont rincées dans 10Oμl de tampon Perm/Wash puis centrifugées à 1400 trs/mn, 4 mn, 4°C. Trois rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions.
Les culots cellulaires sont dilués dans 100μl de tampon Perm/Wash contenant une solution de streptavidin peridinin chlorophyll-a protein et incubés 20 minutes, dans la glace, à l'obscurité. Les cellules sont rincées dans 100μl de tampon Perm/Wash™ puis centrifugées à 1400 trs/mn, 4 mn, 4°C. Trois rinçages successifs sont réalisés dans les mêmes conditions. Le culot est dilué dans 150μl de tampon PBS froid contenant 5g/l d'albumine bovine, 0,01 % d'azide de sodium, 1% formaldéhyde. La présence du marquage intra cytoplasmique est détectée par cytofluorimétrie. Des dupliquas d 'échantillons sont réalisés selon la même procédure à l'exception de l'incubation avec l'anticorps anti-FGF afin de pouvoir soustraire lors de l'analyse la fluorescence due à la liaison non spécifique du conjugué marqué FITC. Un échantillon de cellules porcines non mastocytaire (IRP) est aussi analysé dans les mêmes conditions afin de confirmer la spécificité du marquage
Les figures 1 , 2, 3 et 4 présentent les résultats de la caractérisation phénotypique des mastocytes obtenus respectivement après 3, 7et 8 semaines de culture.
On observe un marquage positif et spécifique des cellules vis à vis des marqueurs des mastocytes, récepteur IgE, et tryptase ainsi que la détection de la liaison intracellulaire du FGF. La détection réalisée sur les cellules à partir de la troisième semaine de mise en culture est positive pour la présence de tryptase. Les cultures dans les conditions 1à 5 sont homogène, et contiennent 100% de mastocytes, comme révélé par un marquage du récepteur aux IgE à partir de la semaine 5. En semaine 7, les cultures en conditions C1à C5 et C7 sont homogènes à 100%, l'homogénéité des cultures en conditions C6 et C8 est supérieure à 50%.
Analyse en microscopie Electronique
La caractérisation des cellules isolée a aussi été complétée par observation en microscopie électronique. Les cellules présente une morphologie caractéristique des mastocytes avec de nombreuses granulations, avec un gros noyau excentré, un contour irrégulier.
Prolifération cellulaire lors de l'isolement A intervalles réguliers, des échantillons de culture pour chaque condition (C1 à C8) sont prélevés et comptés au microscope après dilution en tampon PBS additionné de 0.4% de bleu trypan.
On observe une diminution de la concentration cellulaire lors des quatre premières semaines de culture (S1 à S4) correspondant à la mort et la lyse des cellules médullaire non stimulées par le SCF et au passage d'une culture hétérogène à une culture essentiellement mastocytaire. Dés la cinquième semaine (S5) on observe une prolifération des cultures corrélée avec un marquage plus intense des marqueurs spécifiques de mastocytes. La prolifération est sensiblement plus importante pour les conditions de culture comprenant de NL4 (figure 5).
Caractérisation du contenu héparine des cultures en HPLC
Après 15 semaines de culture et amplification, des échantillons ont été prélevés pour analyser la composition en protéoglycanes des mastocytes selon le protocole décrit par Linhardt et al (Biomethodes, 9, 183-197, 1997) Les échantillons sont traités de la façon suivante :
Protéolyse : Les échantillons cellulaires, 2x106 cellules, sont centrifugés et rincés deux fois en tampon PBS. Chaque culot est repris dans 100μl d'eau distillée additionnés de 10μl d'alcalase (Novozymes) puis chauffé pendant 5 heures à 60°C sous agitation. Puis les échantillons sont dilués avec 200μl de tampon Tris 10mM pH 7.0 ( Prolabo) 0.5M NaCl (Prolabo) avant d'être centrifugés pendant 10 minutes à 10.000 Trs/min. L'étape de protéolyse permet de libérer le contenu intracellulaire et de dissocier les liaisons protéines-polysaccharides.
Extraction : Le surnageant de chaque échantillon est purifié par échange d'ions sur résine ammonium quaternaire SAX en format plaque 96 puits, 100mg/2ml (Thermohypersil).. Après fixation et lavage en tampon Tris pH7, NaCl 0.5M, les Glyco-aminoglycans (GAGs) sont élues par 500 μl de tampon Tris pH7.0, NaCl 3M.
Dessalage/concentration : Les échantillons sont ensuite dessalés sur colonne de gel perméation (NAP-5, Pharmacia)
Après élution dans un volume de 1 ml, les échantillons sont concentrés par lyophilisation, puis repris dans 130μl d'eau distillée.
Dépolymérisation. Pour l'analyse HPLC, les GAGs sont dépolymérisés par un mélange d'heparinases I, Il et III (Grampian enzymes) Chaque solution d'heparinase est ajustée à 0.5UI/ml en tampon phosphate. La solution d'heparinases I, II, III est préparée en mélangeant 1/3 volume à volume de chaque solution d'heparinase. Pour 100 μl d'échantillon à analyser, on ajoute 15μl du mélange d'heparinase et 10μl de tampon acétate contenant 0.73 ml d'acide acétique 100% (Prolabo) 12.5mg d'albumine bovine (Sigma) et 39.5 mg d'acétate de calcium (Prolabo) pour 30 ml d'eau distillée.
Analyse HPLC.
Les échantillons sont ensuite analysés par HPLC sur colonne Waters spherisorb SAX 5μm, 250x3mm, Thermohypersil. 50 μl d'échantillon sont injectés par analyse, le tampon de la phase mobile est composé de 2.5mM de Sodium Di Hydrogeno Phosphate (Na2HP04, Prolabo) dont le pH est ajusté à 2.9 avec de l'acide ortho-phosphorique(H3P04,Prolabo). L'élution des disaccharides constitutifs des GAGs extraits des échantillons cellulaires est réalisé dans un gradient de 0 à 100% en 50 minutes de tampon Na2HP04 2.5 mM et 1 M de perchlorate (NaCI04, Prolabo) Les disaccharides sont détectés par leur temps de rétention et par rapport à un échantillon d'héparine standard (Aventis) en UV à 234 nM.
L'analyse des cultures cellulaire après 15 semaines de culture révèle la présence en quantités importantes de composés de type héparine dans les cellules, confirmant la nature spécifiquement mastocytaire des cultures isolées. On retrouve en effet les disaccharides majeurs constitutifs de l'héparine tel que décrit par Linhardt et al (Biomethodes, 9, 183-197, 1997). Ces disaccharides sont principalement représentés par le ls, Ils llls et IVs (structures chimiques représentées sur la figure 6) correspondant aux disaccharides N sulfatés de l'héparine. On retrouve aussi les disaccharides homologues acétylés lia, llla et IVa (figure 6).
Le tableau 2 présente les compositions obtenues pour chaque culture. On observe une modulation reproductible de la structure disaccharidique en fonction de la présence ou non d'IL4, cette modulation est majoritairement observée sur le pourcentage des disaccharides Ils et llls. EXEMPLE 2 : Mise en culture des lignées et analyse de la production de molécules de type héparine
Le profil disaccharidique des mastocytes isolée, a été analysé pour trois conditions de milieux de culture (C1, C7 et C8) Les cellules ont été amplifiées en suspension et mises en culture en spinner de 100ml.
Culture cellulaire.
La densité cellulaire initiale est de 2x105 cellules par ml, les cellules sont incubées sous atmosphère de 5% de C02 à 37°C et un comptage à intervalle régulier est effectué au microscope.
Des échantillons des cultures ainsi réalisées sont prélevés lors des comptages pour analyse en HPLC du contenu en polysaccharides de types héparine et mesure de l'activité biologique anti lia et anti Xa. Dans ces conditions, la densité cellulaire maximale est comprise entre 4 et 6.105 cellules/ml avec un temps de doublement en phase exponentielle compris entre
24 et 48 heures.
La figure 7 illustre la croissance des mastocytes au 14éme passage.
Analyse des polysaccharides.
L'analyse en HPLC des échantillons pour trois jours de récolte (J4, J7 et J10) montre pour toutes les cultures un profil de type héparinique des polysaccharides avec un effet de l'IL4 sur le pourcentage relatif des disaccharides Ils et llls. La productivité des cultures est significative, comprise entre 2 et 12 μg pour 106 cellules.
Par comparaison, les cultures de lignées de mastocytes de l'espèce murine tel que les cellules MST décrite par Montgomery et al (Proo.Natl. Acad. Sci., 89, 11327-11331, 1992) ou la lignée humaine de mastocytes HMC1 (Butterfield et al Leuk Res, 12(4),345-355,1988) présentent une productivité de composés de type héparine 20 à 200 fois inférieure aux lignées porcine objets de la présente invention. (Tableaux 3 et 4) Activité biologique des polysaccharides :
L'inactivation des facteurs Xa et lia est caractéristique de l'héparine et permet de la différencier de l'héparane sulfate et du dermatane. La méthode utilisée est celle décrite dans la monographie de la pharmacopée Européénene3ieme édition (1997).
La réaction se déroule en trois étapes :
1 : ATI II + héparine [ ATI II - Héparine]
2 : [ATIII - Héparine] + Facteur en excès [ATIII-Heparine-Facteur] + Facteur résiduel
3 : Facteur résiduel + Substrat chromophore Para-nitroaniline coloré La quantité de Paranitroaniline libérée est inversement proportionnelle à la quantité d'héparine.
La quantité anti-Xa ou Anti-lla est mesurée par rapport à une droite d'étalonnage établie avec le standard SPIM ( Standard International Héparine) La sensibilité de la méthode est de 0.006UI/ml.
L'activité biologique est exprimée en Ul/mg en tenant compte de la quantification des disaccharides obtenue par HPLC.
L'analyse réalisée au 10 jour de récolte après la fin de la phase de croissance révèle une activité biologique anti-Xa et anti-lla comprise entre 10 à 25 Ul/mg.
On remarque que pour ce stade de la culture, que le ratio entre les deux activités est proche de 1 , ce qui est le ratio caractéristique de l'héparine issue de l'extraction à partir de la muqueuse intestinale de porc.
Les résultats obtenus par mesure de l'inactivation des facteurs Xa et lia sont résumés dans le tableau 5.
Tableau 5: mesure de l'inactivation des facteurs Xa et lia
EXEMPLE 3 : Modification génétique des cellules isolées
Les mastocytes peuvent être modifiés génétiquement par l'introduction d'un acide nucléique exogène en utilisant par exemple des techniques de transfection, d'électroporation, de nucléoporation ou d'infection ce qui résultera en l'expression transitoire ou stable de l'acide nucléique introduit. Dans le cas d'une expression stable, l'ADN peut être intégré dans le génome cellulaire ou être maintenu comme épisome.
1 Transfection par nucléoporation et électroporation.
Des cellules transfectées stablement peuvent être obtenues en utilisant la méthode de nucléoporation décrite ci-dessous, en appliquant, 24 à 72 heures après la nucléoporation, une pression de sélection (hygromycine, généticine, blasticidine, puromycine ou zeocine. La résistance à l'agent de sélection est conférée par l'intégration du plasmide porteur du gène d'intérêt et du gène de résistance.
Nucléoporation
Cette méthode, est utilisée préférentiellement car elle permet de cibler l'ADN directement dans le noyau.
1 à 2.106 mastocytes, en phase exponentielle, préférentiellement après 3 ou 4 jours de culture, sont centrifugés à 1000 rpm 5 minutes et repris dans 100 μl de solution de nucléofection (Amaxa, Kit 8351). 2 à 4 μg de pcDNA3.1-eGFP, plasmide codant pour la GFP, sont ensuite ajoutés à la suspension cellulaire. Les cellules sont alors transférées dans la cuvette d'électroporation et soumises à un choc électrique par l'utilisation d'un programme spécifique (comme U14, T20 et T22 AMAXA) Les cellules sont ensuite transférées dans 2 ml de milieu complet préchauffé à 37°C puis incubées à 37°C, 5%C02.
24 à 48 heures après la transfection, les cellules sont récoltées pour être fixées au paraformaldéhyde (Prolabo) 1 %. Pour cela, la totalité de la culture est centrifugée 5 min à 1000 rpm. Après élimination du surnageant, les cellules sont lavées dans 4 ml de PBS 1x puis centrifugées à nouveau. Le culot cellulaire est ensuite repris dans 1 ml de paraformaldéhyde 1 %. Les cellules ainsi fixées sont ensuite analysées au cytomètre (Cytomics FC 500, Beckman Coulter) Les conditions de nucléoporation décrites ci-dessus permettent de transfecter les mastocytes de porc avec une efficacité de transfection comprise entre 30 à 50 % tout en obtenant une bonne viabilité cellulaire, supérieure à 50% •}
Electroporation 1 à 5.106 cellules, en phase exponentielle, sont mises en contact avec 1 à 30 μg d'ADN. Les cellules, transférées dans une cuvette d'électroporation 4 mm, sont incubées 5 min dans la glace avant d'être électroporées à un voltage compris entre 150 V et 400 V avec une capacitance de 500 ou 960 μF (Gène Puiser II, Biorad) Après électroporation, les cellules sont à nouveau incubées 5 min dans la glace pour être finalement transférées dans 5 ml de milieu de culture complet et incubées à 37°C, 5%C02.
Le processus de sélection de cellules ayant intégrées le transgène de façon stable utilise la même technique que décrit ci-dessus en utilisant la résistance conférée par l'intégration du plasmide à un agent de sélection.
2 Transfection par des vecteurs viraux, utilisation de vecteurs retro-viraux pantropiques.
Alternativement aux méthodes de transfection par électroporation et nucléoporation, on peut utiliser des vecteurs retro-viraux recombinants et délétés pour la réplication. On peut par exemple utiliser des vecteurs pseudo typés avec la glycoprotéine d'enveloppe du vesicular stomatitis virus (VSV-G) qui permet la production de vecteurs retro-viraux pantropiques, capable d'infecter des cellules porcines.
Dans ce mode de transfection, le vecteur rétro-viral porteur du gène d'intérêt à exprimer ou intégrer dans le mastocyte porcin est produit dans un premier temps à l'aide du cellule d'empaquetage telle que GP-293 (Clontech protocol ref PT 3132-1), qui possède les éléments génétique pour la production du vecteur (gag et poï) à l'exception du gène pour la production de la protéine d'enveloppe pseudotypée (env- VSV-G).
Lors de la production du vecteur rétro-viral, les cellules d'empaquetage sont co- transfectées avec le plasmide codant pour le gène d'enveloppe VSV-G et un plasmide rétro-viral codant pour le gène d'intérêt sous contrôle d'un promoteur avec ou sans gène de sélection.
Pratiquement, les cellules GP-293 sont mises en culture 48h à 72 heures avant la transfection afin d'être en phase exponentielle de croissance. Le jour de la transfection, le milieu de culture est changé par du milieu frais (15-20 ml pour 106 cellules), puis 1 à 2 ml de solution contenant le mélange du plasmide VSV-G (5 à 20μg pour 106 cellules) et du plasmide porteur du gène d'intérêt (10 à 30 μg pour 1 Q6 cellules), en tampon pH7 phosphate de calcium sont ajoutés goutte à goutte dans le milieu de culture (1 à 2ml (Promega)
Les cellules sont ensuite remises à incuber pendant 16 à 24 heures à 37°C ou preferablement à une température comprise entre 32 et 35°C. Le milieu de culture est changé à nouveau avec du milieu frais. Les cellules sont incubées pendant 48 heures supplémentaires à 32-35 °C. A la fin de la période d'incubation, le surnageant de culture contenant les vecteurs rétro-viraux néo-formés est récolté. Une partie du surnageant d'infection des cellules d'empaquetage est aliquoté et congelé à -80°C, l'autre partie est mélangée au milieu de culture des mastocytes en phase exponentielle de croissance de croissance. En pratique les mastocytes en culture sont centrifugés et resupendus dans un milieu contenant 50% de milieu frais et 50% de surnageant d'infection. Les mastocytes sont mis à incuber pendant 24 heures à 32-35 °C, puis le milieu est changé à nouveau par du milieu frais.
48 à 72 heures après l'infection des mastocytes, des échantillons sont prélevés pour analyser par cytofluorimétrie dans le cas du témoin d'infection avec le gène rapporteur fluorescent GFP (Green Fluorescent Protein) ou par PCR pour les infections avec le gène d'intérêt. Par cytofluorimétrie la mesure de l'efficacité de transfection est supérieure à 20% des cellules totales.
Les populations de cellules transfectés sont ensuite sélectionnées en ajoutant dans le milieu de culture l'agent cytotoxique (Hygromycine, puromycine, G418,
Zeocyne) pour lequel seuls les mastocytes transfectés avec le vecteur retro-viral porteur du gène d'intérêt et du gène de résistance continuent à pousser. Par cette méthode le gène d'intérêt est stablement intégré et s'exprime de manière stable.
Après sélection et clonage des populations, l'agent de sélection peut être enlevé du milieu de culture tout en conservant l'expression du gène d'intérêt. Le vecteur rétroviral produit de cette façon ne se réplique pas dans le mastocyte hôte et il n'y' a donc pas production de vecteurs réplicatifs.
Alternativement, on peut aussi utiliser des vecteurs pour lesquels l'expression est soumise à une induction du promoteur régulant l'expression du gène d'intérêt par un composé ajouté au moment voulu dans le milieu de culture.
EXEMPLE 4 : Isolement du gène c-kit porcin
Le gène c-kit porcin a été isolé par 3'-RACE en utilisant comme source d'ARN, des ARN totaux isolés à partir d'une culture de mastocytes de foie de porc d'après la procédure publiée précédemment (Piu et al, CR Acad. Sci. Paris, 316, 772-779, 1993).
La transcription inverse de 2 μg d'ARN totaux en ADNc a été effectuée en suivant le protocole du kit 573' RACE (Roche), en utilisant comme amorce un oligodT nommé OligodT anchor primer de séquence SEQ ID N°8 5' gac cac gcg tat cga tgt cga ctt ttt ttt ttt ttt ttv 3'. L'ADNc est ensuite amplifié par PCR en utilisant le protocole du kit Expand High fidelity System (Roche).
La PCR a été réalisée sur 1 μl d'ADNc, avec l'amorce sens C15203 s'hybridant spécifiquement dans la région 5' non codante du gène c-kit porcin (nucléotides 24 à 42 par rapport à la séquence c-kit porcin publiée, Réf GenBank AJ223228) de séquence SEQ ID N°9 5 gga att cet cga gag cag gaa cgt gga aag gag 3 et l'amorce anti-sens nommée PCR anchor primer de séquence SEQ ID N°10 5 gac cac gcg tat cga tgt cga c 3' s'hybridant de façon spécifique en 3' au niveau de l'amorce oligo dT. 10 cycles puis 25 cycles PCR ont été appliqués (cycle 1 : 15 sec de dénaturation à 94 °C, 45 sec d'hybridation à 55°C et 4 min d'élongation à 68°C, cycle 2 : 15 sec de dénaturation à 94 °C, 45 sec d'hybridation à 60°C et 4 min d'élongation à 68°C).
Le produit PCR obtenu est purifié sur gel agarose 1 % TBE1x, en utilisant le kit Quiaquick gel extraction kit (Quiagen).
Une seconde PCR, identique à la première est réalisée sur 1/30ιe e du produit PCR purifié, en appliquant 25 cycles thermiques (15 sec de dénaturation à 94 °C, 45 sec d'hybridation à 60°C et 4 min d'élongation à 68°C). A l'issue de la seconde PCR, le produit PCR est à nouveau purifié pour le cloner dans un vecteur pGEMTeasy suivant le protocole pGEM-T Easy vector System (Promega).
La séquence du gène porcin est ensuite partiellement déterminée par séquençage. La séquence nucleotidique obtenue est la séquence SEQ IDN°1. La séquence proteique déduite est la séquence SEQ IDN°2. Cette séquence SEQ ID N°1 montre des différences par rapport à la séquence publiée sous la référence AJ 223228. En effet l'extrémité C terminale présente 9 acides aminés supplémentaires et les différences suivantes dans la séquence nucleotidique ont été observées, conduisant à la modification de deux acides aminés : Modifications(par rapport à la séquence publiée AJ 223228): nt 2371 → g, : H → Q nt 351 a → t nt 523 a → c nt 606 c → t nt 609 g → a nt 635 g → a,: R → K nt 639 c → t nt 663 c → g nt 669 c → a nt 2016 a→ g nt 2865 c → t
EXEMPLE 5: Isolement et séquençage de la séquence 3' codante du gène 3- OST porcin
La séquence partielle du gène porcin codant pour la 3-OST est disponible dans une banque EST (GenBank accession number BF075483). L'alignement de cette séquence avec la séquence humaine montre qu'il manque environ 650 pb de la région codante en 3'.
La portion manquante du gène 3-OST porcin a été identifiée en combinant la RT- PCR et le 3'-RACE en utilisant comme source d'ARN, des ARN de foie de porc isolés d'après le protocole du kit Trizol (Invitrogen)
La transcription inverse de 2 μg d'ARN totaux en ADNc a été effectuée en suivant le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem (Invitrogen), en utilisant comme amorce un mélange des oligonucleotides BS02 et BS03 de séquences respectives SEQ ID N°11 5'-GCA GCA GCC ACG TCG GG-3' et SEQ ID N°12 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC-3'.
2 μl de ces ADNc ont ensuite été amplifiés par PCR en présence d'une amorce sens BS05 de séquence SEQ ID N°13 5'-CGG NGA CCG CCT NAT CAG-3' et d'une amorce anti-sens BS06 de séquence SEQ ID N°14 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC-3' avec la KOD hot start Polymerase (Novagen). Après les 30 cycles thermiques (15 sec de dénaturation à 98°C, 30 sec d'hybridation à 60°C et 30 sec d'élongation à 68°C), le fragment amplifié de 277 pb a été clone dans le vecteur pCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Zéro Blunt TOPO PCR Cloning kit) puis séquence. La séquence de ce fragment a été utilisée pour générer 2 amorces BS21 et BS22 pour isoler, par 3'-RACE, la totalité de la région 3'.
Dans le cadre du 3'-RACE, 1 μl d'ARN porcin de foie a été reverse transcrit en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en utilisant comme amorce l'oligodT CDSIII de séquence SEQ ID N°15 (5'-ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC GAG ATG T30 VN-3').
La région 3' du gène codant pour la 3-OST a été ensuite amplifié par 2 PCR successives. La première PCR a été réalisée sur 2 μl d'ADNc, obtenu précédemment, avec l'amorce sens BS21 de séquence SEQ ID N°16 5'-GCA CGC CCA GAT CGA CGC C-3' et une amorce anti-sens CDSIII. 30 cycles thermiques ont été appliqués (10 sec de dénaturation à 94°C, 30 sec d'hybridation à 60°C et 120 sec d'élongation à 68°C). La seconde PCR a ensuite été réalisée dans les mêmes conditions que la première PCR avec- 1 μl de produit issu de la première PCR en utilisant l'amorce sens BS22 de séquence SEQ ID N°17 5'-CAA ACT CCT CAA TAA ACT GCA CG-3' et l'amorce anti-sens CDSIII.
Le séquencage du produit PCR ainsi obtenu à l'issue du 3'-RACE a permis d'identifier la séquence 3' de la 3-OST porcine ainsi qu'environ 250 pb de la région non codante.
Isolement de la phase codante complète du gène 3-QST porcin.
Afin de cloner la phase codante complète de la 3-OST porcine, une nouvelle expérience de RT-PCR a été réalisée en utilisant les informations obtenues dans la première étape.
La source d'ARN est la même que dans l'étape précédente. 2 μg d'ARN ont été reverse transcrit en ADNc d'après le protocole du kit First
Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en utilisant comme amorce un oligonucléotide dT24. Le gène codant pour la 3-OST a été ensuite amplifié par PCR en deux étapes. La première PCR a permis d'amplifier le gène y compris une portion de la séquence 3' non codante du gène, la seconde PCR a ensuite permis d'amplifier la séquence codante en utilisant des amorces compatibles avec le système Gateway (Invitrogen)
La première PCR a été réalisée sur 2 μl d'ADNc avec une amorce sens BS10 de séquence 5'-AGG CCC GTG ACA CCC ATG AGT-3' s'hybridant spécifiquement dans la région 5' non codante du gène 3-OST porcin et une amorce BS30 anti- sens de séquence 5'-CAC CTA GTG TAC ACC ACA ATT TAC-3' s'hybridant de façon spécifique en 3' au niveau de l'UTR. 35 cycles thermiques ont été appliqués (10 sec de dénaturation à 98°C, 30 sec d'hybridation à 64°C et 150 sec d'élongation à 68°C)
Une seconde PCR est ensuite réalisée sur 1 μl du produit PCR afin d'amplifier spécifiquement la phase codante. Pour cela, nous utilisons l'amorce sens BS31 de séquence SEQ SD M°1S 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTC AGC ATG GCC GCG CTG CTC 3' et l'amorce anti-sens BS32 de séquence SEQ ID N°19 5' GGG ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGG TTT AGT GCC AGT CAA ATG TTC TGC C 3'. Le programme PCR utilisé est identique à celui utilisé pour la première PCR.
Le produit PCR de 1 kb a ensuite été clone d'après la procédure du kit Gateway cloning technology, Invitrogen dans le vecteur épisomal pE-IRES-neo2. La séquence du gène porcin a été vérifiée par séquençage. La séquence nucleotidique obtenue est la séquence SEQ IDN°4. La séquence proteique déduite est la séquence SEQ IDN°5.
EXEMPLE 6: Identification de la séquence complète codante du gène 6-OST porcin La séquence partielle du gène porcin (nucléotide 682 à 910 de la séquence humaine) codant pour la 6-OST est disponible dans une banque EST (GenBank accession number BE235545)
La séquence codante complète du gène 6-OST a été identifiée en combinant deux expériences de RT-PCR avec des expériences de 5' et 3'-RACE en utilisant comme source d'ARN, des ARN de foie de porc isolés d'après le protocole du kit Trizol (Invitrogen)
La transcription inverse de 80 ng d'ARN totaux en ADNc a été effectuée en suivant le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem (Invitrogen), en utilisant comme amorce un oligonucléotide dT24.
2 μl de ces ADNc ont ensuite été amplifiés par PCR en présence d'une amorce sens 386-03 de séquence SEQ ID N°20 5'-AGA TGA CTG GTC GGG CTG C-3' et d'une amorce anti-sens 386-01 de séquence SEQ ID N°21 5'-CAA TGA TRT GGC TCA TGT AGT CC-3' avec la KOD hot start Polymerase (Novagen). Après les 35 cycles thermiques (15 sec de dénaturation à 95°C, 30 sec d'hybridation à 60°C et 2 min d'élongation à 68°C), le fragment amplifié de 537 pb a été clone dans le vecteur pCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Zéro Blunt TOPO PCR Cloning kit) puis séquence.
La séquence de ce fragment a été utilisée pour générer trois amorces 386-05, 386-19 et 386-20 utilisées pour la prochaine PCR et le 3 -RACE.
2 μl des ADNc obtenus précédemment ont été amplifiés par PCR en présence d'une amorce sens 386-07 de séquence SEQ ID N°22 5'-ATG GTT GAG CGC GCC AGC AAG TTC G-3' et de l'amorce anti-sens 386-05 de séquence SEQ ID N°23 5'-GGT TAT TGG CCA GGT TGT AGG GGC-3' avec la KOD hot start Polymerase (Novagen). Après les 30 cycles thermiques (15 sec de dénaturation à 95°C, 30 sec d'hybridation à 60°C et 1 min d'élongation à 68°C), le fragment amplifié de 718 pb a été clone dans le vecteur pCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Zéro Blunt TOPO PCR Cloning kit) puis séquence.
La séquence de ce fragment a été utilisée pour générer deux amorces 386-24, 386-26 utilisées pour le 5'-RACE. Dans le cadre du 3'-RACE, 1 μl d'ARN porcin de foie a été reverse transcript en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en utilisant comme amorce l'oligodT CDS-C de séquence SEQ ID N°24 5'-ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG T30 VC-3'.
La région 3' du gène codant pour la 6-OST a été ensuite amplifié par 2 PCR successives. La première PCR a été réalisée sur 2 μl d'ADNc, obtenu précédemment, avec l'amorce sens 386-19 de séquence SEQ ID N°25 5'-GGA CCT CTT CCA GCA GCG-3' et l'amorce anti-sens CDS-C avec l'Advantage 2 polymerase micx (Clontech). 24 cycles thermiques ont été appliqués (7 sec de dénaturation à 98°C, 10 sec d'hybridation à 62°C et 2 min d'élongation à 68°C) Une seconde PCR a ensuite été réalisée sur 2 μl de produit issu de la première PCR en utilisant l'amorce sens 386-20 de séquence SEQ ID N°26 5'-GCT ATC AGT ACA AGC GGC AGC -3' et l'amorce anti-sens CDS-C. Après les 30 cycles thermiques (7 sec de dénaturation à 95°C, 10 sec d'hybridation à 62°C et 2 min d'élongation à 68°C), le fragment amplifié de 300 pb a été clone dans le vecteur pCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Zéro Blunt TOPO PCR Cloning kit) puis séquence. Cette expérience a permis d'identifier la région 3' codante pour la 6-OST et environ 32 pb de la région non codante.
Dans le cadre du 5'-RACE, 2 μl d'ARN porcin de foie a été reverse transcript en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en utilisant comme amorce l'oligonucléotide 386-28 de séquence SEQ ID N°27 5'- CCA GGC TCA GCC CCG G-3'.
L'oligonucléotide okib57 phosphorylé de séquence_SEQ ID N°28 5'-p GTA GGA ATT CGG GTT GTA GGG AGG TCG ACA TTG CC-3' a été greffé en 5' de l'ADNc par ligation (RNA ligase, Roche).
La région 5' du gène codant pour la 6-OST a été ensuite amplifiée par 2 PCR successives. La première PCR a été réalisée sur 2 μl d'ADNc greffé, avec l'amorce sens okib58 de séquence SEQ ID N°29 5'-GGC AAT GTC GAC CTC CCT ACA AC-3' s'hybridant sur l'amorce okib57 et l'amorce anti-sens 386-24 de séquence SEQ ID N°30_ 5'-TCA GCC CCG GGC CCG CG-3' d'après le protocole du kit Adavantage 2 polymerase mix. 24 cycles thermiques ont été appliqués (10 sec de dénaturation à 98°C, 10 sec d'hybridation à 64°C et 2 min d'élongation à 72°C). Une seconde PCR a ensuite été réalisée sur 0,5 μl de produit issu de la première PCR en utilisant l'amorce sens okib59 de séquence SEQ ID N°31_5'- CTC CCT ACA ACC CGA ATT CCT AC-3' et l'amorce anti-sens 386-26 de séquence SEQ ID N°32_5'-GCC CGC GTA CTG GTA GAG G-3'. Après les 40 cycles thermiques (10 sec de dénaturation à 98°C, 10 sec d'hybridation à 66°C et 2 min d'élongation à 72°C), le fragment amplifié de 170 pb a été séquence. Cette expérience a permis d'identifier la région 5' codante pour la 6-OST et environ 14 pb de la région non codante.
Isolement de la phase codante complète du gène 6-QST porcin.
Afin de cloner la phase codante complète de la 6-OST porcine, une nouvelle expérience de RT-PCR a été réalisée en utilisant les informations obtenues dans la première étape.
La source d'ARN est la même que dans l'étape précédente. 2 μg d'ARN ont été reverse transcript en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem, en utilisant comme amorce l'oligonucléotide dT CDSIII. Le gène codan pour la 6-OST a été ensuite amplifié par PCR en utilisant des amorces compatibles avec le système Gateway (Invitrogen) La PCR a été réalisée sur 2 μl d'ADNc avec une amorce sens 386-33 de séquence SEQ ID N°33_5'-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT AGG ACA ATG GTG ACA CAT GCG GCG GC-3' et une amorce anti-sens 386-34 de séquence SEQ ID Nc34 5'- GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC CTA CCA CTT CTC GAT GAT GTG GCT C-3'. 35 cycles thermiques ont été appliqués (5 sec de dénaturation à 98°C, 20 sec d'hybridation à 66°C et 1 min 30 sec d'élongation à 72°C)
Le produit PCR de 1 kb a ensuite été clone d'après la procédure du kit Gateway cloning technology, Invitrogen dans le vecteur épisomal pE-IRES-neo2. La séquence du gène porcin a été vérifiée par séquençage. La séquence nucleotidique obtenue est la séquence SEQ ID N°6. La séquence proteique déduite est la séquence SEQ ID N°7.
EXEMPLE 7: Transformation des lignées selon l'invention par le gène c-kit porcin
Afin d'obtenir des mastocytes de porc dont la croissance serait indépendante du SCF à long terme, les mastocytes peuvent être transformés avec le gène c-kit muté.
Pour cela, on peut utiliser le gène c-kit préférentiellement porcin portant une mutation ponctuelle responsable de la modification de la valine 556 en glycine (gène noté c-kitG556), cette mutation est analogue aux mutants c-kitG559 chez la souris et c-kitG560 chez l'homme. Alternativement, on peut aussi utiliser le gène c- kit délété au niveau des acides aminés TQLPYDH 570 à 576, chez la souris cette délétion est analogue aux acides aminés 573 à 579, chez l'homme 574-580. De même, du fait de la conservation inter espèce du gène c-kit, les gènes murins, humains, bovins ou tout autre gène possédant au moins 80 % d'homologie avec le gène porcin peuvent être utilisés. Dans ce cas, il est alors aussi possible d'utiliser une mutation ponctuelle responsable de la modification de l'acide aspartique en valine 814 ou 816 respectivement chez la souris et chez l'homme.
Les mastocytes sont transfectés par une des méthodes décrites dans l'exemple 4, préférentiellement la nucléoporation, avec un vecteur integratif dans lequel la phase codante du gène c-kit muté est clone sous le contrôle d'un promoteur fort viral (CMV, RSV) ou cellulaire (EF1α). En plus du gène c-kit muté, ce vecteur peut être aussi porteur d'un gène codant pour une résistance à un antibiotique (généticine, hygromycine, puromycine, etc)
48 heures après la transfection, les cellules sont comptées, centrifugées et ensemencées à 2.105 C/ml dans le milieu de culture complet supplémenté avec l'antibiotique de sélection. Les cellules sont cultivées en présence de sélection pendant 2 à 3 semaines ce qui permet d'éliminer les cellules qui ne sont pas transfectées de manière stable. Après cette période de sélection, les cellules sont amplifiées.
Les cellules sont alors analysées génétiquement par PCR et RT-PCR afin de vérifier l'intégration du gène c-kit muté et son expression. L'indépendance de ces cellules vis à vis du SCF est mise en évidence par la comparaison de la croissance des cellules transfectées avec le gène c-kit muté dans un milieu sans SCF avec la croissance des cellules transfectées avec le vecteur vide dans un milieu avec et sans SCF.
Une variante à ce protocole consiste à utiliser un vecteur portant seulement le gène c-kit muté. Dans ce cas, les cellules sont sélectionnées 48 heures après la transfection sans utilisation d'agent de sélection mais en ensemençant les cellules à 2.105 C/ml dans un milieu dépourvu de SCF. Les cellules non transfectées ne sont pas capables de croître dans un milieu dépourvu en SCF contrairement aux cellules transfectées.
EXEMPLE 8: Transfection des lignées selon l'invention par le gène 3QST porcin.
Afin d'augmenter l'activité biologique des composés de type héparine issus des cultures de mastocytes, il est possible de surexprimer de façon stable le gène codant pour la 3-OST-1 (3 O-sulfatase-1 ) Pour cela, on peut utiliser le gène porcin. Alternativement, il est possible d'utiliser des gènes d'autres espèces codant pour l'expression de l'activité 3-0 Sulfatase et présentant au moins 80% d'homologie avec le gène porcin notamment la 3-OST-1 murine.
Les mastocytes sont transfectés par la méthode de nucléoporation décrite dans l'exemple 4, avec un plasmide integratif dans lequel la phase codante du gène 3- OST a été clonée sous le contrôle d'un promoteur fort viral (CMV, RSV) ou cellulaire (EF1α) En plus du gène 3-OST, ce plasmide porte un gène codant pour une résistance à un antibiotique (généticine, hygromycine, puromycine, etc).
48 heures après la transfection, les cellules sont comptées, centrifugées et ensemencées à 2.105 C/ml dans le milieu de culture complet supplémenté avec l'antibiotique de sélection. Les cellules sont cultivées en présence de sélection pendant 2 à 3 semaines ce qui permet d'éliminer les cellules qui ne sont pastransfectées de manière stable. Après cette période de sélection, les cellules sont amplifiées.
Ces cellules sont analysées génétiquement par PCR et RT-PCR afin de vérifier l'intégration du gène c-kit muté et son expression.
La fonctionnalité de la 3-OST est mise en évidence par des analyses HPLC de l'héparine produite par les mastocytes comparativement avec celle produite par les mastocytes non transfectés. Des analyses de l'activité biologique du produit permettent de confirmer l'augmentation de l'activité biologique vis à vis du facteur Xa et lia .
Tableau 2: Analyse HPLC des disaccharides obtenus à partir des cultures isolés après 15 semaines.
Disaccharides% C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 Référence
Héparine standard
IVs 12.9 8.6 9.9 1 Us 1 10.5 9.8 6.6 7.6 4.1 lia 3.9 4.0 4.7 3 9 3.9 4.1 4.2 2.9 4.0
Nia 0.7 2.2 1.2 2.9 0.9 2.4 0.5 1.6 1.1
Ils 16.3 O.-D 18.2 7.6 16.7 8.0 17.4 8.0 10.6 llls 12.4 23.7 14.0 26.8 12.2 26.2 13.2 24.6 6.4 la 0.3 0.4 0.8 0.5 0.5 0.5 0.4 0.4 1.4 ls 53.6 52.6 51.2 48.2 55.2 49.0 57.7 54.8 55.9
u Ifates/carboxylates 2.36 2.38 2.35 2.31 2.40 2.33 2.46 2.43 2.38
μg/106 cellules 3.3 9.4 0.9 14.3 1.6 9.4 2.3 8.6
Tableau 3: Productivité et profil disaccharidique de lignées de mastocytes en culture pour différentes espèces
Tableau 4 : Profil disaccharidique en cours de culture (JO à J10) condition de culture C1

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention de cultures ou de lignées de mastocytes comprenant la mise en culture d'une population de cellules souches de moelle osseuse de jeunes porcs ou de fœtus, dans un milieu comprenant au moins environ
0,2 ng/ml d'IL-3, au moins environ 8 ng/ml de SCF et au moins environ 0,1 ng/ml d'IL-4, 10 ng/ml d'IL-6 et/ou 1 ng/ml de G-CSF.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les porcs ont entre environ 2 jours et environ 6 semaines.
3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les cellules sont maintenues dans le milieu pendant au moins environ 30 jours.
4. Culture ou lignée de mastocytes porcins susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1 à 3.
5. Culture ou lignée de mastocytes porcins caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine dans lesquelles les quantités en disacharides ls sont supérieures aux quantités en disacharides Ils, les quantités en disacharides Ils sont supérieures aux quantités en disacharides llls, et les quantités en disacharides llls sont supérieures aux quantités en disacharides IVs,
6. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant des rapports entre les disacharides ls, Ils, llls et IVs proches de ceux de l'héparine.
7. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine comprenant au moins 30% de disacharides ls.
8. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disacharides Ils et llls proche de celui de l'héparine.
9. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disacharides Ils et llls compris entre 1 ,3 et 1 ,9.
10. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit, au moins 0,1 μg de molécules de type héparine/106 cellules.
11. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant un rapport entre les disacharides ls et Ils compris entre environ 3 et 8.
12. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant une activité anti-Xa supérieure à au moins 10 Ul/mg.
13. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant une activité anti lia supérieure à au moins 10 Ul/mg.
14. Lignée de mastocytes porcins déposée auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 09 Avril 2003 sous le n° 1-3010
15. Lignée de mastocytes porcins déposée auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 09 Avril 2003 sous le n° 1-3011
16. Lignée de mastocytes porcins déposée auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 09 avril 2003 sous le n° 1-3012
17. Lignée de mastocytes porcins déposée auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 09 avril 2003 sous le n° 1-3013.
18. Lignée de mastocytes porcins déposée auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 09 avril 2003 sous le n° 1-3014
19. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 8 caractérisée en ce qu'elle est comprend un acide nucléique codant une protéineimmortalisante.
20. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 8 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant le c-kit.
21. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant l'antigène T.
22. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant une enzyme agissant sur la sulfatation des de molécules de type héparine.
23. Culture ou lignée selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant une 3-OST.
24. Procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture de cultures ou lignées de mastocytes porcins selon l'une des revendications 4 à 23, ou obtenues selon l'une des revendications 1 à 3.
25. Procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture, dans un milieu adapté, de cultures ou lignées de mastocytes porcins dans un milieu de culture comprenant au moins environ 0,1 ng/ml d'IL-4.
26. Procédé de production de molécules de type héparine comprenant l'obtention de cultures ou lignées de mastocytes porcins surexprimant l'IL4, et la mise en culture des ces cellules dans un milieu de culture adapté.
27. Procédé de production de molécules de type héparine comprenant l'obtention de cultures ou lignées de mastocytes porcins transfectés par un acide nucléique codant pour CIL4, et la mise en culture des ces cellules dans un milieu de culture adapté.
28. Protéine d'origine porcine de type c-kit caractérisée en ce qu'elle présente une extrémité C-terminale ayant la séquence SEQ ID N°3.
29. Protéine selon la revendication 28 caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence présentant une identité d'au moins 99% avec la séquence SEQ
ID N°2.
30. Acide nucléique comprenant une séquence codant une protéine selon l'une des revendications 28 et 29.
31. Acide nucléique selon la revendication 30 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence présentant une identité d'au moins 99% avec la séquence SEQ ID N°1.
32. Protéine d'origine porcine présentant une activité 3 -O-sulfatase.
33. Protéine selon la revendication 32 caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence présentant une identité d'au moins 95% avec la séquence SEQ ID N°4.
34. Acide nucléique comprenant une séquence codant une protéine selon l'une des revendications 32 et 33.
35. Acide nucléique selon la revendication 34 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence présentant une identité d'au moins 95% avec la séquence SEQ ID N°5.
36. Protéine d'origine porcine présentant une activité 6 -O-sulfatase.
37. Protéine selon la revendication 36 caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence présentant une identité d'au moins 90% avec la séquence SEQ
ID N°6.
38. Acide nucléique comprenant une séquence codant une protéine selon l'une des revendications 36 et 37.
39. Acide nucléique selon la revendication 38 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence présentant une identité d'au moins 95% avec la séquence SEQ ID N°7.
40. Cellule comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 30,
31 , 34, 35, 38 et 39.
41. Cellule exprimant une protéine selon l'une des revendications 28, 29, 32, 33, 36 et 37.
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