WO2002055676A2 - Procede de maturation des cellules dendritiques et d'activation des macrophages avec le ru 41740 - Google Patents

Procede de maturation des cellules dendritiques et d'activation des macrophages avec le ru 41740 Download PDF

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Abstract

L'invention porte sur des procédés de maturation de cellules dendritiques par leur mise en présence de RU 41740 ou d'un composé analogue du RU 41740. La maturation des cellules dendritiques au contact du RU41740 peut être attestée tant par leurs propriétés fonctionnelles que par leurs propriétés phénotypiques.

Description


  



   PROCEDE DE MATURATION DES CELLULES DENDRITIQUES ET
D'ACTIVATION DES MACROPHAGES AVEC LE RU 41740
DESCRIPTION
La présente invention se situe dans le domaine de la thérapie cellulaire.



  Elle a pour objet un procédé capable de générer des cellules dendritiques matures et/ou des macrophages activés de mammifères à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques.



  Les cellules dendritiques jouent un rôle critique dans l'émergence de la réponse immunitaire antitumorale, anti-infectieuse et auto-immune. En effet, les cellules dendritiques sont les seules cellules capables d'induire une réponse primaire à partir des lymphocytes T. Elles ont donc un rôle clef dans l'initiation de la réponse immunitaire. Une telle fonction est à rapprocher de nombreuses propriétés morphologiques et des molécules de surface des cellules dendritiques. En effet, grâce à de larges expansions de leur membrane cytoplasmique, les cellules dendritiques ont une surface de contact avec leur environnement particulièrement importante. De plus, elles possèdent à leur surface de très nombreux antigènes d'histocompatibilité de classe I et de classe Il qui permettent la présentation antigénique.



  Après sa prise en charge par la cellule dendritique, l'antigène subit un   apprêtement   (processing en anglais) avant d'être présenté au lymphocyte T. L'apprêtement (remaniement), qui nécessite un métabolisme cellulaire actif, comporte quatre étapes : la captation de l'antigène, sa dégradation enzymatique en petits fragments peptidiques dans un compartiment intracellulaire, l'association de ces fragments aux molécules de classe Il du CMH, et la migration des complexes peptides molécules de classe Il à la surface de la cellule présentatrice de l'antigène   (CPA)    pour la présentation au récepteur des cellules T (RcT) du lymphocyte T auxiliaire (Th). La première étape (captation), qui est indépendante de la température, s'effectue par l'intermédiaire de récepteurs non spécifiques ou par d'autres mécanismes encore mal connus.

   Plus les molécules sont de taille importante, mieux elles sont captées. La deuxième étape, qui est dépendante de la température (elle est bloquée à 4 degrés), est   l'internalisation    de l'antigène dans les phagosomes qui, ensuite, fusionnent avec les lysosomes (organites   intracytoplasmiques    riches en protéases), donnant ainsi naissance aux endosomes à pH acide. La protéolyse de l'antigène en fragments peptidiques s'effectue, dans ces vésicules, sous l'action, notamment, des cathepsines B, puis D. Cette étape peut être bloquée par les ions ammonium, qui inhibent la liaison phagosome-lysosome, ou par la chloroquine, qui élève le pH des lysosomes.

   La troisième étape est un processus complexe encore mal connu dans ses détails, qui aboutit à l'association entre la molécule de classe Il du CMH, et certains fragments particuliers de l'antigène dégradé constitués généralement de neuf à vingtcinq acides aminés. La quatrième étape implique la migration du complexe molécule de classe   11-peptide    (dite forme C3) à la surface de la CPA. Le complexe ainsi formé peut alors interagir avec le RcT approprié à la surface du lymphocyte Th sous réserve que les molécules du Complexe
Majeur d'Histocompatibilité   (CMH)    du lymphocyte appartiennent au même haplotype que celles de la cellule présentatrice (restriction allogénique).



  Les cellules dendritiques sont par ailleurs très riches en molécules de   costimulation    de la réponse immunitaire, telles que les molécules   CD80,   
CD86, CD40 qui activent respectivement les molécules CD28, CTLA-4 et
CD40L des lymphocytes T en initiant la réponse immunitaire. Elles possèdent aussi de très nombreuses molécules de l'adhésion, comme la molécule CD54 ou la molécule CD11a/CD18, ce qui facilite la coopération entre les cellules dendritiques et les cellules T. Une autre caractéristique particulière des cellules dendritiques est de déployer des fonctions différentes en fonction de leur stade de différenciation.

   Ainsi, la capture de l'antigène et sa transformation sont les deux fonctions principales de la cellule dendritique immature, tandis que ses capacités à présenter l'antigène pour stimuler les cellules T augmentent au fur et à mesure que les cellules dendritiques migrent dans les tissus et les ganglions lymphatiques. Ce changement de fonctionnalité correspond à une maturation de la cellule dendritique. Ainsi, le passage de la cellule dendritique immature à la cellule dendritique mature représente une étape fondamentale dans l'initiation de la réponse immunitaire. Cette maturation peut être facilement suivie grâce à l'évolution des marqueurs de surface durant ce processus. Les marqueurs de surface caractéristiques des différents stades de maturation des cellules dendritiques sont résumés dans le tableau ci-après.
EMI3.1     


<tb>



   <SEP> Type <SEP> cellulaire <SEP> Marqueurs <SEP> de <SEP> surface
<tb> Monocytes <SEP> CD14++, <SEP> DR+, <SEP> CD86+, <SEP> CD16+/-, <SEP> CD54+, <SEP> CD40+
<tb> Cellule <SEP> dendritique <SEP> immature <SEP> CD14-, <SEP> CD16-, <SEP> CD80+/-, <SEP> CD83-, <SEP> CD86+,
<tb>  <SEP> CD1a+, <SEP> CD54+, <SEP> DQ+, <SEP> DR++
<tb> Cellule <SEP> dendritique <SEP> mature <SEP> CD14-, <SEP> CD83++, <SEP> CD86++, <SEP> CD80++,
<tb>  <SEP> DR+++, <SEP> DQ++, <SEP> CD40++, <SEP> CD54++, <SEP> CD1a-.
<tb> 



  Tableau 1
L'isolement des cellules dendritiques du sang périphérique est très difficile puisque moins de 1 % des globules blancs appartiennent à cette catégorie.
De la même façon, l'extraction à partir des tissus est impossible chez l'homme et fort complexe chez l'animal. C'est pourquoi une avance importante a été réalisée lorsque   l'on    a pu générer des cellules dendritiques à partir de précurseurs hématopoïétiques et des monocytes en présence de différentes cytokines. La production de cellules dendritiques à partir de monocytes peut se faire en présence de GM-CSF et   d'IL-4    pour obtenir des cellules dendritiques immatures, qui matureront après contact avec du   TNF-a    ou avec d'autres agents tels que le CD40ligand, le LPS ou des milieux conditionnés à partir de macrophages.

   Ces derniers agents sont des substances toxiques ou complexes. De même, l'activation des macrophages in vivo est complexe et difficilement contrôlable. C'est pourquoi l'activation ex vivo représente un moyen approprié pour des études expérimentales et des. applications thérapeutiques.



  Les macrophages activés sont des cellules que l'on rencontre dans les tissus après une activation du processus inflammatoire par des inducteurs spécifiques ou non spécifiques. Ces cellules interviennent dans l'élimination des agents toxiques, pathogènes ou des cellules altérées ou cancéreuses.



  Le RU 41740, commercialisé sous la marque Biostim par les Laboratoires
Cassenne (France), est un médicament composé d'extraits   glycoprotéiques    obtenus à partir d'une souche   de Klebsiella pneumoniae K2O,    (souche   01 K2    NCTC 5055). II est obtenu après lyse des parois bactériennes, extraction organique, centrifugation et ultrafiltration.



  II se compose de :-80 % de glycoprotéines  - d'acides aminés, de lipides et d'acides nucléiques.



  La partie   glycoprotéique    est divisée en 3 fractions :   P1,      F1,    F2.



     P1,    d'origine capsulaire, représente environ 50 % du RU 41740, et a un poids moléculaire moyen de 95 kD, 
F1 est d'origine membranaire et représente environ 20 % du RU 41740, et a un poids moléculaire moyen de 350 kD
F2 semble être une partie de P1.



  Le RU 4170 ne provoque pas d'effet pyrogène, comme en atteste la négativité du test au Limulus effectué avec ce composé.



  La présente invention décrit un nouveau procédé de maturation des cellules dendritiques en utilisant, comme agent inducteur de cette maturation, le RU 41740 ou un analogue de celui-ci tel que défini ci-après.



  Parmi les agents permettant la maturation des cellules dendritiques, le   TNF-a    est celui dont l'activité a été le mieux caractérisée.



  Malheureusement, cette   lymphokine    est très toxique et peut déclencher des réponses extrêmement violentes in vivo, ce qui présente un obstacle majeur à son utilisation en thérapie cellulaire. Le LPS est un autre composé capable d'induire la maturation des cellules dendritiques. Il présente aussi une toxicité importante et induit un effet pyrogène puissant, ce qui est attesté par la positivité du test au Limulus effectué avec le LPS.



  Il produit en outre des résultats variables suivant le lot utilisé. Le LPS présente enfin l'inconvénient de se dégrader très rapidement. Quant au ligand du CD40 (CD40L), il oriente la différenciation des cellules dendritiques de façon variable selon la concentration et la période d'incubation, ce qui le rend difficilement utilisable en thérapie cellulaire.



  Comme cela est illustré dans les exemples expérimentaux ci-après, le RU 41740 permet d'induire la maturation des cellules dendritiques avec une efficacité comparable ou supérieure aux agents de référence cités cidessus. Il présente en outre plusieurs avantages importants par rapport à ces agents. En particulier, le RU 41740, commercialisé sous la marque
Biostim, est utilisé depuis 1982 comme médicament pour stimuler le système immunitaire lors d'infections chroniques (bronchite chronique, otite, rhinite,...), à titre curatif ou préventif. Sa parfaite tolérance par l'organisme a été démontrée. De plus, le RU 41740 est un composé extrêmement stable, et les inventeurs ont montré qu'il induisait la maturation des cellules dendritiques de façon très reproductible et dépendante de la dose utilisée.



  Dans une perspective de thérapie cellulaire nécessitant des cellules dendritiques matures, le RU 41740 est donc particulièrement intéressant, de par son innocuité et sa simplicité d'utilisation liée à sa stabilité et à la reproductibilité des résultats obtenus.



  L'utilisation de tout composé analogue du RU 41740 et présentant des propriétés comparables à celui-ci, dans des procédés tels que ceux décrits ci-dessous, entre bien évidemment dans le cadre de la présente invention.



  Dans la suite, on appellera   analogue du RU 41740   un composé comportant 60 à 90 % de glycoprotéines, et capable d'induire, lors de sa mise en contact de cellules dendritiques immatures, à des concentrations inférieures ou égales à 1   mg/ml,    une augmentation significative de l'expression des molécules CD40, CD83, CD86 et HLA-DR et une diminution très marquée de l'expression des molécules CD14 et CD1a par lesdites cellules dendritiques. Des exemples d'analogues du RU 41740 sont le LCOS 1013 et le LCOS 1014, dont les procédés de fabrication sont décrits à l'exemple 10. Dans la suite du texte, et sauf indication contraire, le terme   RU 41740   désignera aussi bien le RU 41740 proprement dit, constituant le principe actif du Biostim, qu'un analogue de celui-ci.



  Un   analogue du RU 41740   est défini ici comme un composé d'extraits   glycoprotéiques    obtenus à partir d'une souche de Klebsiella (par exemple, la souche O1 K2 NC TC 5055 de Klebsiella pneumoniae), par au moins les étapes suivantes : 'culture de la souche       lyse des parois bactériennes  'extraction organique 'centrifugation       ultrafiltration séchage
L'exemple 10 ci-dessous présente deux procédés de productions d'analogues du RU 41740, désignés sous les références LCOS 1013 et
LCOS 1014.



  La structure chimique d'un analogue du RU 41740 est majoritairement composée de : hydrate de carbone   = 70% 12          protéines = 20%       6.



  Des lipides, nucléosides et acides aminés sont présents à l'état de traces.



  Le RU 41470 ou un analogue de celui-ci présentent un taux d'endotoxines bactériennes indétectable (à 10 pg/ml).



  Le RU 41740 est actif dans tous les procédés utilisant les monocytes, des précurseurs des monocytes, ou les cellules souches hématopoïétiques chez l'homme et l'animal. De plus, le RU 41740 permet d'obtenir en même temps des macrophages activés à partir des mêmes cellules de départ.



  La maturation des cellules dendritiques par leur mise en présence de RU 41740 peut être attestée par leurs propriétés phénotypiques ou par leurs propriétés fonctionnelles.



  Ainsi, l'invention porte sur un procédé d'obtention de cellules dendritiques matures (Monocyte Dendritic Cells, ou MODC) ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui-ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation fonctionnelle des cellules dendritiques, attestée par leur capacité à : - déclencher in vitro une réponse primaire contre un antigène infectieux ou tumoral mis en contact avec les cellules dendritiques préalablement et/ou au cours de leur culture avec les lymphocytes T ;

   - induire la prolifération de lymphocytes T en culture mixte autologue ou allogénique.



  Les exemples 6,7 9,11 et 12 sont une illustration de ce procédé.



  L'invention porte également sur un procédé d'obtention de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui-ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation phénotypique des cellules dendritiques, attestée par une augmentation significative de l'expression des molécules CD40, CD83, CD86, et HLA-DR et une diminution très marquée de l'expression des molécules CD14 et   CD1a    par lesdites cellules dendritiques.



  Les exemples 1 à 3 sont une illustration de ce procédé.



  Par ailleurs, les propriétés physico-chimiques naturelles du RU 41740 permettent d'y adsorber des molécules, en particulier des molécules antigéniques. Ceci permet donc de réaliser de façon simple un couplage non covalent entre le RU41740 et des molécules antigéniques. Il sera alors possible d'obtenir des cellules dendritiques matures spécifiques des antigènes adsorbés au RU   41740    ou à un analogue de celui-ci, en incubant des cellules dendritiques immatures avec un produit de couplage entre le RU 41740 ou son analogue et les molécules antigéniques choisies.



  Le couplage entre le RU 41740 ou un analogue de celui-ci et les molécules antigéniques peut être réalisé par n'importe quel procédé connu de l'homme du métier. De façon préférée, les antigènes seront adsorbés à la surface du RU 41740 ou de son analogue, mais d'autres moyens de couplage (liaison covalente, affinité, etc...) peuvent aussi être envisagés.



  Le procédé de couplage le plus simple, par adsorption à la surface du
RU41740, présente en outre l'avantage de permettre un couplage avec des molécules antigéniques essentiellement non protéiques.



  Le produit de couplage entre le RU 41470 ou un analogue de celui-ci et des molécules antigéniques, pour induire la maturation de cellules dendritiques ou l'activation de macrophages, fait partie de la présente invention. Dans une réalisation préférée des produits de couplage de l'invention, le couplage est assuré par une liaison non covalente. Un produit de couplage particulier est celui du RU41740 ou d'un analogue de celui-ci, avec une molécule antigénique de nature essentiellement non protéique.



  L'invention porte aussi sur un procédé d'obtention de cellules dendritiques matures présentant des antigènes choisis, à partir de monocytes, précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un analogue de celui-ci, couplé à des molécules comportant lesdits antigènes.



  Dans une réalisation préférée de l'invention, les procédés décrits ci-dessus permettent d'obtenir des cellules dendritiques matures ou des macrophages activés par la mise en contact de monocytes, précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques avec le RU 41740, couplé ou non à des molécules antigéniques.



  Dans une mise en oeuvre préférée des procédés de l'invention, le RU 41740 est ajouté au milieu de culture des cellules à une concentration finale comprise entre 1 ng/ml et 1 mg/ml, préférentiellement entre 100 ng/ml et 10   Ng/ml.    



  Dans une autre mise en oeuvre préférée des procédés de l'invention, les monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec un analogue du RU 41740 obtenu à partir de la souche O1 K2 NCTC 5055 de
Klebsiella   pneumoniae.    Un tel analogue est par exemple le LCOS 1013 ou le LCOS 1014, qui est ajouté au milieu de culture des cellules à une concentration finale comprise de préférence entre 1 ng/ml et 1 mg/ml, et, de manière encore préférée, entre 100 ng/ml et 50   ug/ml.   



  Dans les procédés de l'invention, la durée d'incubation des monocytes, précurseurs des monocytes, ou des cellules souches hématopoïétiques en présence de RU 41740 ou d'un composé analogue de-celui-ci est préférentiellement de 1 à 15 jours.



  La thérapie cellulaire est une approche récente consistant à administrer à un patient des cellules modifiées ex vivo de façon à leur conférer des propriétés susceptibles d'avoir un effet bénéfique pour le patient. Les propriétés naturelles des cellules dendritiques en font un excellent candidat pour des approches de thérapie cellulaire dans plusieurs domaines de pathologie, de par leur capacité à induire une réponse immunitaire primaire à partir des lymphocytes T. En particulier, l'immunothérapie anti-tumorale par administration de cellules dendritiques présentant un ou plusieurs antigènes tumoraux, est une approche de thérapie cellulaire particulièrement prometteuse.

   Le principe de cette approche est de présenter au système immunitaire des antigènes tumoraux, de façon particulièrement efficace, afin de stimuler une réponse contre les cellules présentant ces antigènes. Cette approche est illustrée dans l'exemple 6 ciaprès.



  L'exemple 7 présenté ci-après démontre que l'administration de cellules dendritiques présentant des antigènes de micro-organismes permet d'obtenir une immunisation primaire vis-à-vis de ces micro-organismes, et peut donc être utilisée dans la lutte anti-infectieuse. 



  Une autre approche de thérapie cellulaire utilisant des cellules dendritiques consiste à orienter les cellules dendritiques vers une réaction de tolérance de l'hôte vis-à-vis d'antigènes particuliers. Ceci peut être utile par exemple pour induire une tolérance vis-à-vis   d'alloantigènes    lors d'une greffe allogénique, d'autoantigènes lors d'une maladie autoimmune, ou d'allergènes lors d'une maladie allergique.



  En effet, les cellules dendritiques, dans certaines conditions de culture, peuvent provoquer une réaction d'anergie, c'est-à-dire l'inactivation fonctionnelle des lymphocytes T au lieu de leur activation. La culture des cellules dendritiques en présence d'immunosuppresseurs comme la cyclosporine ou l'histamine, entraîne une modification des antigènes de membrane, qui va induire une réponse de tolérance et non une réponse cytotoxique. Cette constatation pourrait avoir des implications importantes dans le cadre des greffes d'organes d'une part, et des traitements des maladies auto-immunes d'autre part, comme la polyarthrite rhumatoïde, la myasthénie, le diabète   insulinodépendant, la sclérose    en plaques, l'eczéma, le psoriasis, etc. et les maladies allergiques.

   L'exemple 8 illustre cette approche en montrant l'influence de la   cyclosporine    A en présence de RU 41740 sur la maturation des cellules dendritiques.



  Quel que soit le type de pathologie concerné, la thérapie cellulaire peut être réalisée en administrant au patient humain ou animal des cellules   autologues,    homologues ou xénologues après leur modification ex vivo.



  La présente invention porte ainsi sur un procédé   têt que    ceux décrits cidessus, dans lequel les cellules dendritiques sont traitées ex vivo et administrées après maturation à un patient, humain ou animal, de façon autologue, homologue ou xénologue, pour la prophylaxie, l'atténuation ou le traitement de maladies cancéreuses, infectieuses, allergiques, ou autoimmunes.



  L'utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition comprenant des cellules dendritiques matures et/ou des macrophages activés et/ou des cellules de Langerhans de la peau, entre aussi dans le cadre de la présente invention.



  Les inventeurs ont montré que le RU 41740 permettait d'induire in vitro la maturation des cellules de Langerhans (exemple 4). Cette propriété pourrait donc être avantageusement utilisée pour favoriser une réponse immunitaire au niveau de la peau ou des muqueuses, par administration topique d'une composition comportant du RU 41740. Des exemples d'indication d'une telle composition sont notamment les gingivites et les parodontites. L'utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour une administration topique ou systémique, fait donc également partie de cette invention.



  Dans un autre aspect de l'invention, le RU 41740 ou un analogue de celuici est couplé à un ou plusieurs antigènes d'intérêts, puis administré directement in vivo pour induire la production par l'organisme de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes. Dans cette réalisation de l'invention, le RU 41740 ou son analogue sert en fait de vecteur pour les antigènes   d'intérêt,    et permet la présentation de ces antigènes au système immunitaire d'une façon telle qu'il induit la production de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes.



  L'invention porte donc sur un procédé tel que ceux décrits ci-dessus, dans lequel les cellules dendritiques matures ou les macrophages activés sont produits directement in vivo.



  L'utilisation d'un produit de couplage entre le RU 41470 ou un analogue de celui-ci et un ou plusieurs antigènes, pour la préparation d'une composition apte à induire la production de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes, entre aussi dans le cadre de cette invention. 



  Les cellules dendritiques matures obtenues par des procédés tels que ceux décrits ci-dessus peuvent être utilisées dans le traitement de divers types de pathologies, notamment en immunothérapie anti-tumorale, dans la lutte anti-infectieuse, ou pour augmenter la tolérance de l'organisme vis-à-vis de certains antigènes particuliers. Dans une mise en oeuvre préférée de l'invention, les cellules dendritiques obtenues par un procédé tel que décrit ci-dessus sont utilisées dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire antitumorale.



  De même, l'utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé de la présente invention, dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire contre une infection par un microorganisme, est partie intégrante de l'invention.



  Dans une autre réalisation préférée de l'invention, les cellules dendritiques obtenues par un procédé tel que décrit ci-dessus sont incubées en présence d'un immunosuppresseur, et utilisées dans la fabrication d'une composition apte à modifier la réponse immunitaire dans le sens d'une tolérance.



  Les cellules dendritiques matures produites par les procédés de l'invention peuvent aussi être utilisées pour identifier des antigènes mineurs d'histocompatibilité. Cette technique consiste à récupérer les monocytes en les faisant différencier en cellules dendritiques matures, puis en les utilisant comme des cellules stimulantes dans une réaction de culture mixte lymphocytaire entre individus de la même famille HLA compatible. Ce système permet de détecter des disparités concernant les antigènes mineurs d'histocompatibilité et de pouvoir approfondir la compatibilité ou les incompatibilités entre personnes d'une même famille, ce qui présente des avantages certains dans le domaine des greffes de tissus et d'organes en intra familial ou même extra familial.

   L'utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé de l'invention, pour la détection et/ou la caractérisation des antigènes d'histocompatibilité, fait aussi partie de la présente invention.



  Les exemples et figures présentés ci-dessous à titre non limitatif permettront de mettre en évidence certains avantages et caractéristiques de la présente invention.



  Légende des figures
La figure 1 représente l'évolution des marqueurs cellulaires au cours de la différenciation des monocytes en cellules dendritiques à JO (courbes en pointillés = marqueurs monocytaires avant traitement), J6 (courbes en traits fins = cellules dendritiques immatures), et J8 (courbes en traits gras = cellules dendritiques matures), après ajout du RU 41740 à 25   pg/ml    à partir   de J6.   



  La figure 2 illustre la génération de lignées T cytotoxiques spécifiques du peptide de la thyrocalcitonine. En abscisse est indiqué le ratio effecteur/cible utilisé, tandis qu'en ordonnée est indiqué le pourcentage de lyse des cellules cibles.



  La figure 3 démontre la présentation de la toxine tétanique par les cellules dendritiques dérivées de monocytes humains cultivés en présence de GM
CSF,   IL-4    et RU 41740. L'ordonnée indique l'incorporation de thymidine tritiée, mesurée en coups par minutes (cpm).



  La figure 4 illustre l'influence de la   cyclosporine    A (CsA) sur la maturation des cellules dendritiques dérivées de monocytes cultivés en présence de
GM-CSF,   d'IL-4    et de RU 41740. Les courbes, obtenues en cytométrie de flux, montrent l'expression du CD83 en absence de CsA (4A) et en présence de CsA à 5   pg/ml    (4B). Les figures 4C et 4D montrent les mêmes courbes pour un autre marqueur des cellules dendritiques, l'antigène DC
Lamp. Les courbes en pointillé ont été obtenues avec un anticorps primaire anti-KLH, non pertinent pour les cellules dendritiques. 



  La figure 5 montre l'orientation de la réponse immune vers une réponse immune de type Th2 par des cellules dendritiques dérivées de monocytes et traitées par la cyclosporine A (CsA). L'ordonnée représente respectivement la sécrétion   d'IL-12    (figure 5A) et le rapport de sécrétion de cytokines   IFN-y/IL-10 (Th1/Th2)    (Figure 5B) par des cellules dendritiques dérivées de monocytes cultivées en présence de GM-CSF,   IL-4    et RU 41740, et traitées par la cylosporine A à 5   Hg/ml    (colonne noires) ou non (colonnes blanches). Trois expériences sont représentées pour chaque condition.

   Les résultats sont présentés en pourcentage par rapport aux cellules monocytaires non traitées par   la cyclosporine, dont les    mesures ont été ramenées à 100.



  La figure 6 montre les résultats de réactions mixtes lymphocytaires allogéniques, réalisées avec des cellules dendritiques obtenues à partir de monocytes purifiés de trois donneurs différents. Deux types de cellules dendritiques ont été comparés, dont la maturation a été induite soit par le   TNF-a    (200 U/ml), soit par   le LCOS 1013    (25   pg/ml)    (courbe notée   LCOS  ), pendant 48 heures. L'axe horizontal correspond au nombre de cellules dendritiques irradiées déposées dans chaque puits, pour une quantité constante de   105    lymphocytes T par puits. La prolifération des lymphocytes T, stimulée par les cellules dendritiques, est déterminée après 4 jours de culture par incorporation de thymidine tritiée (axe vertical).



  La figure 7 montre les résultats de réactions mixtes lymphocytaires   autologues,    réalisées avec des cellules dendritiques obtenues à partir de monocytes purifiés de trois donneurs différents. Deux types de cellules dendritiques ont été comparés, dont la maturation a été induite soit par le
TNF-a (200 u/ml), soit par le LCOS 1013 (25   llg/ml)    (courbe notée   LCOS  ), pendant 48 heures. L'axe horizontal correspond au nombre de cellules dendritiques irradiées déposées dans chaque puits, pour une quantité constante de   105    lymphocytes T par puits. La prolifération des lymphocytes T, stimulée par les cellules dendritiques, est déterminée après 5 jours de culture par incorporation de thymidine tritiée (axe vertical).



  La figure 8 montre les résultats de réactions mixtes lymphocytaires   allogéniques    et   autologues,    réalisées avec des cellules dendritiques dont la maturation a été induite soit par   le TNF-a    (200   u/ml),    soit par le LCOS 1013 à 5,10 ou 25   Hg/ml    (courbes notée   LCO  ), pendant 48 heures. Les graphes ont été obtenus de la même façon que les graphes des figures 6 et 7, respectivement.



  L'ensemble des techniques de culture cellulaire, de marquage de cellules, de phénotypage par fluorométrie,   etc...,    ainsi que les réactifs (anticorps, toxine tétanique,...) utilisés dans les expériences décrites dans les exemples suivants, ont été détaillés dans un article de Karine Duperrier et a/., Journal of Immunological Methods 238 (2000), p. 119-131.



  Exemple 1 : Procédé de production des cellules dendritiques à partir des monocytes humains avec le RU 41740
Le sang périphérique est prélevé chez le sujet concerné. Ce sang est ensuite centrifugé 20 minutes à 200   g    de façon à diminuer la contamination des cellules du sang périphérique par les plaquettes. La partie supérieure contenant la plupart des plaquettes et le plasma est éliminée soigneusement avant de purifier les   cellules mononuclées en les    centrifugeant sur un gradient de séparation de   Ficoll dont la    densité est de 1,077. La couche de   cellules mononuclées    est récupérée puis lavée deux fois dans un tampon PBS et déposée sur un gradient contenant 4 densités discontinues de   Percoll    pour isoler les monocytes.

   Ce gradient est constitué par des dilutions d'une solution isotonique de percoll à raison de 75 %   (6,    5   ml),    50.5 % (15   ml),    40 % (3,5   ml)    et 30 % (3 ml) dans un milieu de Dulbecco sans magnésium ni calcium et contenant 5 % de sérum humain. 75 à 100 millions de cellules sont ainsi déposées sur chaque tube et centrifugées à 1000 g pendant 25 minutes à   4 C.    Les cellules de faible densité, principalement les monocytes, sont récoltées à l'interface entre la dilution 40 % et 50.5 %, et lavées deux fois dans du PBS.

   Elles sont ensuite   resuspendues    dans un milieu de culture, puis déposées dans des plaques à culture contenant 6 puits à une densité de 5 x 106 cellules par puits dans un volume final de 3 ml et laissées adhérer pendant 1 heure à   37 C.    On peut substituer cette étape d'adhérence par une purification complémentaire des monocytes en utilisant un système de purification négatif utilisant un mélange d'anticorps monoclonaux associant un anti
CD3, CD7, CD19, CD45A, CD56 et   anti-IgG    à l'aide d'un. système de microbilles de type Macs (Miltenyi Biotec). Cette purification complémentaire permet d'obtenir des concentrations de monocytes ayant une pureté supérieure à 90 %.



  Les cellules sont ensuite mises en culture dans des puits de culture à   37 C    sous 5 % de   C02.    Le milieu qui comporte du   RPMI,    contient 200   UI/ml    de
GM-CSF humain recombinant, 500   UI/ml de IL-4    humaine recombinante dans un volume final de 6 ml. Au jour 3 et au jour 5, les cultures sont renouvelées en éliminant 3 ml et en ajoutant 3 ml de milieu frais avec les cytokines. Au 6ème jour, les cellules sont transférées dans des pots en
Teflon et cultivées à une densité de 5 x   105 cellules    par pots sous 3 ml en présence de RU 41740 à différentes concentrations ou de   TNF-a    humain recombinant à raison de 200   UI/ml    pendant 2 jours.

   Les cellules sont récoltées au 8ème jour, lavées et cultivées en l'absence de stimulation pendant 3 jours supplémentaires.



  Au terme de la culture, la qualité de la maturation est évaluée par l'expression des molécules CD80,83,86,14,1a, HLA-DR à la surface des cellules. Les marquages révèlent que plus de 80 % des monocytes viables ont maturé en cellules dendritiques caractérisées par le phénotype suivant : CD83+, CD86++, CD80++, HLA-DR+++,   CD1a-,    CD14-, 
CD40+++, CD54++, ce qui les place dans le groupe des cellules dendritiques tissulaires très différenciées.



  La figure   n  1    montre en effet que les molécules HLA-DR, HLA-DQ, CD40,
CD54, CD80, et CD86 sont présentes sur la majorité des cellules à J8, après ajout du RU 41740 à 25   pg/ml,    alors que la molécule CD14 n'est quasiment plus exprimée.



  Afin d'étudier l'action du RU 41740 sur la maturation des cellules dendritiques (DC), différentes concentrations de la molécule ont été testées et comparées à l'action du TNF.



  Les 3 expériences suivantes (a, b, c) ont été réalisées à partir de monocytes d'un même donneur. a) Les concentrations de RU 41740 testées ici sont 0.1 Ng/ml, 1pg/ml, et   10, ug/ml.   



  Le tableau 2 présente les résultats obtenus, en ce qui concerne le pourcentage de cellules marquées et l'intensité moyenne de fluorescence   (IFM).    
EMI19.1     


<tb>



   <SEP> JO <SEP> J6 <SEP> J8
<tb>  <SEP> Cellules <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-alpha
<tb>  <SEP> Monocytes <SEP> dendritiques
<tb>  <SEP> indifférenciées
<tb>  <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM
<tb> HLA-DR <SEP> 98,9 <SEP> 275 <SEP> 98,3 <SEP> 552 <SEP> 98,7 <SEP> 978 <SEP> 99,1 <SEP> 1164 <SEP> 98,9 <SEP> 1195 <SEP> 98,9 <SEP> 1225
<tb> CD <SEP> 40 <SEP> 97,8 <SEP> 128 <SEP> 97,5 <SEP> 464 <SEP> 98, <SEP> 3 <SEP> 1340 <SEP> 98 <SEP> 1205 <SEP> 98,2 <SEP> 1328 <SEP> 98,4 <SEP> 1603
<tb> CD54 <SEP> 98,6 <SEP> 41 <SEP> 95,6 <SEP> 85 <SEP> 96,4 <SEP> 220 <SEP> 96 <SEP> 210 <SEP> 95, <SEP> 6 <SEP> 282 <SEP> 97,4 <SEP> 295
<tb> CD86 <SEP> 96,5 <SEP> 52 <SEP> 69,9 <SEP> 77 <SEP> 98,8 <SEP> 310 <SEP> 98,5 <SEP> 290 <SEP> 98 <SEP> 303 <SEP> 98,8 <SEP> 326
<tb> CD83 <SEP> 0,

  2 <SEP> 325 <SEP> 5,5 <SEP> 119 <SEP> 82,1 <SEP> 156 <SEP> 76,1 <SEP> 165 <SEP> 84,7 <SEP> 184 <SEP> 84,5 <SEP> 173
<tb> HLA-DQ <SEP> 24, <SEP> 2 <SEP> 48 <SEP> 63,2 <SEP> 61 <SEP> 86,4 <SEP> 160 <SEP> 88,8 <SEP> 153 <SEP> 84,1 <SEP> 174 <SEP> 84, <SEP> 3 <SEP> 157
<tb> CD <SEP> 80 <SEP> 0,1 <SEP> 46 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 112 <SEP> 60,5 <SEP> 173 <SEP> 50,1 <SEP> 187 <SEP> 70 <SEP> 250 <SEP> 62, <SEP> 1 <SEP> 129
<tb> CD <SEP> 14 <SEP> 96,2 <SEP> 5395 <SEP> 1,9 <SEP> 199 <SEP> 1,55 <SEP> nd <SEP> 0, <SEP> 97 <SEP> nd <SEP> 1,06 <SEP> nd <SEP> 0,87 <SEP> nd
<tb> 
Tableau 2 : Pourcentage (%) de cellules marquées et intensité moyenne de fluorescence   (IFM)    du marqueur considéré.



  Ces résultats sont exprimés avec une marge d'erreur de +/-2,5 %.



  Après 8 jours de culture, l'expression de la molécule CD14 a disparu (pourcentage inférieur à 1,5 %), quelles que soient les conditions de culture.



  L'intensité moyenne de fluorescence (IFM) des marquages des molécules
HLA-DR, CD40, CD54 et CD86 apparaît plus faible en présence des doses de RU 41740 utilisées qu'en présence du   TNF-a.    



  En revanche, les molécules CD83 et HLA-DQ sont légèrement plus exprimées en présence d'une concentration de RU 41740 de 10   ug/ml    qu'avec   le TNF-a.   



  De plus, l'IFM de la molécule CD80 apparaît toujours supérieure en présence de RU 41740.



  D'après ces résultats, on voit que le RU 41740 induit la maturation des cellules dendritiques, même à de faibles concentrations.   L'IFM    des différents marqueurs apparaît cependant augmentée pour les plus fortes concentrations de RU 41740 testées, avoisinant les résultats obtenus en présence de   TNF-a.   



  L'action du RU 41740 sur les cellules dendritiques à de plus fortes concentrations a donc été investiguée dans une deuxième série d'expériences. b) Les concentrations de RU 41740 testées pour cela sont 5 g/ml,   lOpg/mI,    et   50Ng/ml.   



  Les résultats sont présentés dans le tableau   n 3.   



     L'IFM    des différentes molécules d'adhésion, de   costimulation,    molécules
HLA de classe Il apparaît augmentée de façon dépendante de la concentration de RU 41740 ajoutée au milieu de culture. La molécule
CD40 présente toujours une   IFM    inférieure en présence de RU 41740 par rapport à la concentration obtenue en présence de TNF-alpha.



  Le CD83, qui est le marqueur spécifique de la maturation, a un pourcentage et une intensité de fluorescence qui augmentent également en fonction de la quantité de RU 41740.



  La molécule HLA-DQ présente un maximum d'expression avec 10   ug/ml    de
RU 41740. 
EMI21.1     


<tb>



   <SEP> JO <SEP> J6 <SEP> J8
<tb>  <SEP> Monocytes <SEP> Cellules <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF
<tb>  <SEP> dendritiques <SEP> 5Ng/ml <SEP> 10pg/mi <SEP> 50pg/ml <SEP> alpha
<tb>  <SEP> indifférenciées <SEP> 200 <SEP> UI/ml
<tb>  <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM
<tb> HLA-DR <SEP> 99,2 <SEP> 275 <SEP> 98,3 <SEP> 552 <SEP> 98,9 <SEP> 1207 <SEP> 99, <SEP> 1 <SEP> nd <SEP> 99,3 <SEP> nd <SEP> 99,1 <SEP> 946
<tb> CD <SEP> 40 <SEP> 97,8 <SEP> 128 <SEP> 97,5 <SEP> 464 <SEP> 99,8 <SEP> 1417 <SEP> 99, <SEP> 4 <SEP> 1441 <SEP> 99,8 <SEP> 1507 <SEP> 99, <SEP> 6 <SEP> 1728
<tb> CD54 <SEP> 98,6 <SEP> 41 <SEP> 95,6 <SEP> 85 <SEP> 97,1 <SEP> 195 <SEP> 97 <SEP> 216 <SEP> 98,2 <SEP> 255 <SEP> 95,6 <SEP> 255
<tb> CD86 <SEP> 96, <SEP> 5 <SEP> 52 <SEP> 69, <SEP> 9 <SEP> 77 <SEP> 98,

  9 <SEP> 267 <SEP> 98, <SEP> 7 <SEP> 271 <SEP> 99, <SEP> 7 <SEP> 248 <SEP> 99,5 <SEP> 273
<tb> CD83 <SEP> 0,2 <SEP> 325 <SEP> 5,5 <SEP> 119 <SEP> 67,9 <SEP> 132 <SEP> 74, <SEP> 6 <SEP> 147 <SEP> 84,8 <SEP> 159 <SEP> 89,5 <SEP> 196
<tb> HLA-DQ <SEP> 24,2 <SEP> 48 <SEP> 63,2 <SEP> 61 <SEP> 68,5 <SEP> 189 <SEP> 85,9 <SEP> 191 <SEP> 80, <SEP> 3 <SEP> 143 <SEP> 84,2 <SEP> 183
<tb> CD <SEP> 80 <SEP> 0,1 <SEP> 46 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 112 <SEP> 63 <SEP> 86, <SEP> 7 <SEP> 64,6 <SEP> 101 <SEP> 76,1 <SEP> 95, <SEP> 8 <SEP> 70,5 <SEP> 93, <SEP> 5
<tb> CD <SEP> 14 <SEP> 96,2 <SEP> 5395 <SEP> 1,9 <SEP> 199 <SEP> 0,47 <SEP> nc <SEP> 1,1 <SEP> n <SEP> 0,66 <SEP> nd <SEP> 0, <SEP> 61 <SEP> nd
<tb> CD <SEP> 1 <SEP> a <SEP> 2, <SEP> 52 <SEP> nd <SEP> 1,55 <SEP> nd <SEP> 2, <SEP> 9 <SEP> nd <SEP> 0, <SEP> 21 <SEP> nd
<tb>    Tableau n 3    :

   Pourcentage (%) de cellules marquées et intensité moyenne de fluorescence   (IFM)    de ce marqueur  (nd = non déterminable).



  Ces résultats comportent une marge d'erreur de +/-2,5 %.



  Avec une concentration plus importante (50 pg/ml) de RU 41740, par rapport à l'expérience du tableau 2,   l'IFM    des molécules CD40 et CD54 a augmenté, alors que d'autres IFM ont diminué (molécules CD86 et HLA
DQ). Quelques marqueurs, comme le CD80 et CD54, sont exprimés avec la même intensité après une maturation avec 50   lug/ml    de RU 41740 ou avec le   TNF-a.   



  Des concentrations de RU 41740 encadrant 50  g/ml ont alors été testées, dans une troisième série d'expériences. c) Les concentrations de RU 41740 testées sont 25  g/ml, 50 pg/ml, et 100   , ug/ml.   



  Les résultats sont présentés dans   le tableau n 4.   
EMI22.1     


<tb>



   <SEP> JO <SEP> J6 <SEP> J8
<tb>  <SEP> Monocytes <SEP> Cellules <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-alpha
<tb>  <SEP> dendritiques <SEP> 25Ng/ml <SEP> 50Ng/ml <SEP> 1OOpg/ml <SEP> 200 <SEP> UI/ml
<tb>  <SEP> indifférenciées
<tb>  <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM
<tb> HLA-DR <SEP> 99,2 <SEP> 275 <SEP> 98, <SEP> 3 <SEP> 552 <SEP> 98, <SEP> 5 <SEP> 630 <SEP> 97,5 <SEP> 823 <SEP> 99,4 <SEP> 682 <SEP> 99,4 <SEP> 694
<tb> CD <SEP> 40 <SEP> 97,8 <SEP> 128 <SEP> 97, <SEP> 5 <SEP> 464 <SEP> 99,7 <SEP> 1592 <SEP> 99,1 <SEP> 1958 <SEP> 99, <SEP> 8 <SEP> 2088 <SEP> 99, <SEP> 3 <SEP> 1480
<tb> CD54 <SEP> 98, <SEP> 6 <SEP> 41 <SEP> 95, <SEP> 6 <SEP> 85 <SEP> 98, <SEP> 5 <SEP> 280 <SEP> 97,2 <SEP> 321 <SEP> 98,9 <SEP> 361 <SEP> 98,2 <SEP> 249
<tb> CD86 <SEP> 96,5 <SEP> 52 <SEP> 69,

  9 <SEP> 77 <SEP> 99, <SEP> 3 <SEP> 284 <SEP> 98,3 <SEP> 291 <SEP> 99,6 <SEP> 295 <SEP> 99, <SEP> 5 <SEP> 284
<tb> CD83 <SEP> 0,2 <SEP> 325 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 119 <SEP> 86, <SEP> 6 <SEP> 192 <SEP> 91,2 <SEP> 227 <SEP> 92,8 <SEP> 213 <SEP> 89 <SEP> 166
<tb> HLA-DQ <SEP> 24, <SEP> 2 <SEP> 48 <SEP> 63,2 <SEP> 61 <SEP> 79 <SEP> 109 <SEP> 84, <SEP> 8 <SEP> 123 <SEP> 78, <SEP> 8 <SEP> 118 <SEP> nd <SEP> nd
<tb> CD <SEP> 80 <SEP> 0,1 <SEP> 46 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 112 <SEP> 74 <SEP> 128 <SEP> 82, <SEP> 4 <SEP> 165 <SEP> 90, <SEP> 8 <SEP> 196 <SEP> nd <SEP> nd
<tb> CD <SEP> 14 <SEP> 96,2 <SEP> 5395 <SEP> 1,9 <SEP> 199 <SEP> 1,03 <SEP> nd <SEP> 4,07 <SEP> nd <SEP> 1,75 <SEP> nd <SEP> 3, <SEP> 27 <SEP> nd
<tb>    Tableau n 4    : Pourcentage (%) de cellules marquées et intensité moyenne de fluorescence (IFM) de ce marqueur  (nd = non déterminable).



  Ces résultats comportent une marge d'erreur de +/-2,5 %. 



  Les molécules CD40, CD54, CD86 et HLA-DR sont présentes sur plus de 97 % des cellules avec les trois concentrations. RU 41740. Leurs IFM sont comparables à celles obtenues avec du TNF-a, pour une concentration de 25 pg/ml de RU 41740. Cependant, dans cette expérience, elles continuent d'augmenter avec des concentrations supérieures de RU 41740.



  Le CD 83 est présent sur un pourcentage très élevé de cellules à 100 pg/ml et à 50   ug/ml,    supérieur aux résultats obtenus avec du   TNF-a.    Son   IFM apparaît plus    importante avec 50   pg/ml.   



  A   100      ug/ml    de RU 41740, les intensités de fluorescence des molécules
HLA-classe Il ont tendance à diminuer, ce qui peut suggérer que cette concentration est une concentration limite de RU 41740.



  L'ensemble des expériences suggère que la dose optimale de RU 41740 se situe entre 10 et 50   pg/ml.   



  Exemple 2 : Procédé de production des cellules dendritiques à partir des cellules souches   CD34+    hématopoïétiques humaines avec le RU 41740
Conditions expérimentales :
Purification : Après ficoll, les CD34+ représentaient 4.2 % des cellules mono nucléées (CMN).



  Après purification par sélection positive avec le procédé MAC System (Miltenyi Biotec) avec des billes recouvertes d'un anticorps anti CD34,90 % des cellules sont CD34+.



  Mise en culture : -milieu de culture : RPMI contenant 10 % de SVF, 2 % de pénicilline/streptomycine, 1   %    de glutamin, et 1 % de bicarbonate de sodium.



  Culture dans des puits de 2 mi avec 5.105 cellules par puits. 



  - cytokines présentes dans le milieu de culture : de JO à J5 : SCF à 25   ng/ml,    GM-CSF à 100 ng/ml et soit du TNF-a à 2.5 ng/ml, soit du RU 41740 à 6.25ng/ml, de J5 à J14 : GM-CSF à 100   ng/ml.   



  Dédoublement des cultures   :-les    cellules sont homogénéisées dans le puits, puis 1 ml est prélevé et déposé dans un nouveau puits. 1 ml de milieu de culture est ensuite ajouté dans le nouveau puits et dans l'ancien, ainsi que du GM-CSF en fonction du milieu ajouté.



  Marqueurs :   CD34-CD45-CD14-HLA-D. R-CD40-CD54-CD83-      CD86-CD1a.   



  Un anticorps primaire anti-KLH marqué à la fluorescence, a été utilisé comme contrôle pour soustraire la fluorescence non spécifique des signaux obtenus.



     # Résultats :    
EMI25.1     


<tb>  <SEP> J8 <SEP> J12 <SEP> J14
<tb>  <SEP> TNF-a <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-a <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-a <SEP> RU <SEP> 41740
<tb> CD14 <SEP> 40 <SEP> 37 <SEP> 63,2 <SEP> 47,4 <SEP> 54,1 <SEP> 52,5
<tb> CD34 <SEP> 0,7 <SEP> 17
<tb> CD45 <SEP> 96 <SEP> 96
<tb> CD83 <SEP> 0,5 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 1,3 <SEP> 1,3 <SEP> 0,8 <SEP> 1
<tb> CD86 <SEP> 13 <SEP> 11 <SEP> 7,4 <SEP> 10,8 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 4,7
<tb> CD1a <SEP> 87 <SEP> 17 <SEP> 8,4 <SEP> 17,5 <SEP> 10,3 <SEP> 28, <SEP> 9
<tb> CD40 <SEP> 44 <SEP> 38 <SEP> 64,3 <SEP> 59,4
<tb> CD54 <SEP> 33 <SEP> 56 <SEP> 61,8 <SEP> 57,9
<tb> HLA <SEP> DR <SEP> 88 <SEP> 80 <SEP> 80, <SEP> 3 <SEP> 65, <SEP> 3 <SEP> 69,9 <SEP> 69, <SEP> 54
<tb> HLA <SEP> DQ <SEP> 54, <SEP> 1 <SEP> 52, <SEP> 3
<tb> CD80 <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> 16
<tb>    Tableau n 5    :

   pourcentage de cellules exprimant un marqueur cellulaire à différents temps de culture.



  Le CD1a est plus exprimé avec le RU 41740 (17.5% de cellules à J12) qu'avec le   TNF-a,    à l'inverse du CD14, qui est plus exprimé avec   le TNF-a    à la surface cellulaire.



  Les niveaux d'expression en présence de RU 41740 du CD40, CD54 ou
HLA-DR sont quasiment identiques aux niveaux d'expressions en présence de   TNF-a.   



  Le CD83 n'est pas exprimé quelles que soient les conditions. 



  Exemple 3 : Procédé de production des cellules dendritiques à partir des cellules CD34+ du sang de cordon humain avec le RU
41740
Les conditions expérimentales sont similaires à l'exemple 2, hormis le fait que les cellules sont issues de sang de cordon :
Purification : Après ficoll, les cellules CD34+ représentent 0.83 % des cellules mononucléées (CMN).



  Après purification par sélection positive, on obtient 18.1 % de CD34+.



  2.106 cellules ont été obtenues.



  Dédoublement : à J6, J7, J8,   J10    et   J12      *    Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau n  6. 
EMI27.1     





  J7 <SEP> J9 <SEP> J10 <SEP> J12 <SEP> J13 <SEP> J14
<tb> TNF-&alpha; <SEP> RU <SEP> 414740 <SEP> TNF-&alpha; <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-&alpha; <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-&alpha; <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-&alpha; <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-&alpha; <SEP> RU <SEP> 41740
<tb> (200 <SEP> Ul/min) <SEP> (10 <SEP>  g/ml)
<tb> CD14 <SEP> 32 <SEP> 20,39 <SEP> 59,6 <SEP> 43,52 <SEP> 60 <SEP> 50,05 <SEP> 66,77 <SEP> 59,23 <SEP> 57,73 <SEP> 52,28 <SEP> 46,77 <SEP> 30,88
<tb> CD34 <SEP> 19,79 <SEP> 19,92 <SEP> 2,53 <SEP> 2,94 <SEP> 2,26 <SEP> 2,08 <SEP> 0,69 <SEP> 1,25 <SEP> 0,45 <SEP> 0,61 <SEP> 0,38 <SEP> 0,57
<tb> CD45 <SEP> 99,84 <SEP> 97,57 <SEP> 99,96 <SEP> 99,76 <SEP> 99,97 <SEP> 99,86 <SEP> 99,85 <SEP> 99,92 <SEP> 99,69 <SEP> 99,82 <SEP> 99,93 <SEP> 99,91
<tb> CD16 <SEP> 2,24 <SEP> 3,68 <SEP> 2,16 <SEP> 2,78 <SEP> 2,11 <SEP> 4,89
<tb> CD83 <SEP> 1,09 <SEP> 0,39 <SEP> 4,

  24 <SEP> 4,9 <SEP> 2,46 <SEP> 1,19 <SEP> 0,71 <SEP> 1,35 <SEP> 3,19 <SEP> 3,41 <SEP> 1,22 <SEP> 0,83
<tb> CD86 <SEP> 11,61 <SEP> 11,97 <SEP> 22,23 <SEP> 13,69 <SEP> 9,23 <SEP> 7,48 <SEP> 13,94 <SEP> 11,91 <SEP> 12,78 <SEP> 17,1 <SEP> 19,33 <SEP> 10,56
<tb> CD1a <SEP> 4,41 <SEP> 13,95 <SEP> 23,75 <SEP> 20,32 <SEP> 20,63 <SEP> 22,68 <SEP> 27,9 <SEP> 20,14 <SEP> 36,13 <SEP> 23,67 <SEP> 34,2 <SEP> 16,63
<tb> CD40 <SEP> 75,91 <SEP> 55,23 <SEP> 63,35 <SEP> 56,02 <SEP> 64,56 <SEP> 41,47
<tb> CD54 <SEP> 74,66 <SEP> 65,62 <SEP> 61,7 <SEP> 58,57 <SEP> 64,4 <SEP> 41,69
<tb> HLA <SEP> DR <SEP> 81,34 <SEP> 73,8 <SEP> 73,04 <SEP> 63,28 <SEP> 57,84 <SEP> 37,69
<tb>    Tableau n  6
POURCENTAGE DE CELLULES MARQUEES cellules CD34+ de sang de cordon mises en culture jusqu'à J6 avec du GM-CSF, SCF et du RU 41740 (10  g/ml) ou du
TNF-&alpha;

   (200 U?ml), puis de J6 à J14 avec du GM-CSF    
Dans les deux protocoles de culture, l'expression des molécules de surface évolue avec les mêmes tendances : - augmentation du CD14 jusqu'à J12 puis diminution - diminution puis disparition de la molécule CD34 à J12 - très faible expression du CD83 et CD16 qui reste stable.



  Le CD1a est exprimé précocement à J7 sur les cellules avec le RU 41740 puis se stabilise autour de 23   %    à J14, ce qui révèle une cinétique plus rapide avec le RU 41740 qu'avec   le TNF-a.   



  Après J12, les molécules CD40, CD54 et HLA-DR sont moins exprimées en présence de RU 41740 qu'en présence de   TNF-a.   



  Exemple 4 : Procédé de différenciation des cellules de Langerhans.



  Les cellules souches sont obtenues après un passage à travers un gradient de   ficoll    du sang de cordon. Les cellules mononuclées CD34+ sont purifiées par sélection positive avec un anticorps monoclonal anti
CD34 (Immu 133.3,   Immunotech    Marseille, France). Après purification, les cellules sont à plus de 90% CD34+.



  Ces cellules CD 34+ sont ensuite cultivées en présence de GM-CSF (100 ng/ml), et de TNF-a (2.5ng/ml) ou de RU 41740 (10   lig/ml)    durant 12 jours dans un milieu RPMI-SVF 10 %-pénicilline streptomycine 2 %, glutamin 1 %-bicarbonate de sodium 1 % et 10 mM d'HEPES. Au terme de la culture à J12, les cellules sont marquées avec les anticorps anti
CD1a, CD14, Lag, E-Cadherin, DR et DQ de façon à identifier les cellules de Langerhans qui sont Lag+,   CD1a+,    CD14-, DR+ et DQ+.



  Les résultats, présentés dans le tableau   n  7,    montrent une meilleure efficacité du RU 41740 par rapport au   TNF-a    pour la différenciation des cellules de Langerhans. 
EMI29.1     





   <SEP> TNF-a <SEP> RU <SEP> 41740
<tb> CD1a+ <SEP> DR+ <SEP> 8 <SEP> % <SEP> 17 <SEP> %
<tb> Lag+ <SEP> DR+ <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> %
<tb> 
Tableau n  7
Exemple 5 : Procédé de production des cellules dendritiques matures à partir des   cellules mononuclées    de chien avec le RU
41740
Un élutriateur est un appareil qui permet de soumettre des cellules à deux forces opposées, l'une centrifuge et l'autre centripète, en milieu liquide.



  Ceci permet de séparer les cellules suivant leur taille et leur densité, tout en les maintenant dans leur milieu physiologique. Ce procédé est particulièrement avantageux pour séparer les cellules de chien (monocytes/lympocytes) qui forment des agrégats dans des gradients de type   ficoll.   



  MILIEU D'ELUTRIATION :
PBS   1X-SVF    2%-EDTA 0. 01%
PREPARATION DES CELLULES MONONUCLEES :
La poche de sang est prélevée sur CPD (citrate phosphate dextrose), le sang est dilué avec du chlorure de sodium, centrifugé à 800 tr/min pendant 15 min sans frein pour éliminer un maximum de plaquettes.



  On réalise un   ficoll    à 1600 tr/min pendant 25 min sans frein.



  Les CMN sont récupérées, et lavées deux fois au PBS (la première pour déplaquetter).



  La concentration cellulaire est de 5. 106 cellules/ml dans du PBS ou dans le milieu d'élutriation. 



  PROTOCOLE D'OBTENTION DES MONOCYTES :
Débit : 25 ml/min (réglage à la pompe selon la droite de calibration)
Faire varier la vitesse de centrifugation : chargement des cellules à 3200 tr/min à 300 ml 3000 tr/min à 250 mi 2700 tr/min à 200   ml    2500 tr/min à 200 ml 2300 tr/min à 200   ml    2100 tr/min à 200   ml   
Rotor off à 200 ml
RESULTATS
La fraction obtenue à 2700 tr/min contient des monocytes avec une pureté supérieure à   80 %.   



  CULTURE
Les monocytes de chien sont cultivés de la même façon que les monocytes humains et avec les mêmes facteurs de différenciation humains : GM-CSF,
TNF ou RU 41740. En revanche,   l'IL4    est spécifique de l'espèce canine.



  Les cellules dendritiques ainsi obtenues possèdent la même morphologie avec des dendrites, mais les marqueurs de surface ne sont pas comparables à ceux de l'homme bien qu'elles soient CD14-, DR+ et DQ+, car nous ne disposons pas des anticorps spécifiques dans cette espèce.



  Le RU 41740 a les mêmes effets que   le TNFa.   



  Exemple 6 : Utilisation des cellules dendritiques matures dans l'émergence d'une réponse antitumorale.



  La thyrocalcitonine est un antigène tumoral relativement peu immunogène s'exprimant fortement dans les cancers médullaires de la thyroïde. Dans le système utilisé, les inventeurs ont pu faire produire des clones lymphocytaires T dirigés contre la thyrocalcitonine. II s'agit de clones cytotoxiques susceptibles d'avoir une activité antitumorale dans les cancers à thyrocalcitonine.



  La figure 2 illustre la génération de lignées T cytotoxiques spécifiques du peptide de la thyrocalcitonine.



  Des cellules dendritiques dérivées de monocytes après culture en présence de GM-CSF,   IL-4    et RU 41740, sont incubées avec le peptide de la   thyrocalcitonine,    puis mises en culture en présence de lymphocytes T autologues afin d'induire l'activation de lymphocytes T spécifiques du peptide.



  Après plusieurs stimulations des lymphocytes T à l'aide de cellules dendritiques puis de cellules EBV incubées avec le peptide, des lignées de cellules T cytotoxiques   (H10    et B7) capables de lyser spécifiquement des cellules EBV cibles incubées avec le peptide de la   thyrocalcitonine,    ont pu être générées.



  Exemple 7 : Utilisation des DC matures dans les activités antiinfectieuses
En utilisant l'anatoxine tétanique comme antigène présenté par les MODC (Monocyte Dentritic Cells), il a été possible de générer des lignées cytotoxiques anti-anatoxines tétaniques, ce qui démontre à l'évidence que ce système permet d'avoir une immunisation primaire vis-à-vis d'antigènes de type infectieux.



  La figure 3 représente une réponse secondaire des lignées anti-toxine tétanique par les cellules dendritiques dérivées de monocytes humains cultivés en présence de GM-CSF,   IL-4    et RU 41740. 



  Exemple 8 : Utilisation des cellules dendritiques matures dans l'induction d'une réponse de tolérance.



  Les cellules dendritiques, dans certaines conditions de culture, peuvent provoquer une réaction d'anergie. La culture de ces cellules en présence d'immunosuppresseurs comme la cyclosporine ou l'histamine, entraîne une modification des antigènes de membrane qui va induire une réponse de tolérance et non une réponse cytotoxique. De cette façon, il est donc possible d'éduquer les cellules dendritiques pour les orienter vers une réaction de tolérance.



  A titre d'exemple nous donnons l'influence de la Cyclosporine A (CsA) sur la maturation des cellules dendritiques.



  Des monocytes purifiés ont été cultivés en présence de GM-CSF et   d'IL-4    pendant 6 jours et en présence de RU 41740 pendant 2 jours de plus, dans un milieu contenant 10% de sérum humain type AB.   1     g/ml ou 5  g/ml de
CsA ont été ajoutés ou non dès le début de la culture.

   L'expression des molécules HLA-DR, CD83, CD86, CD80, CD40 et CD1a a été analysée par cytométrie en flux (tableau n  8).
EMI32.1     

  <SEP> sans <SEP> CsA <SEP> CsA <SEP> (1 <SEP> pg/ml) <SEP> CsA <SEP> (5pg/ml)
<tb>  <SEP> % <SEP> SD <SEP> IFM <SEP> % <SEP> SD <SEP> IFM <SEP> % <SEP> SD <SEP> IFM
<tb> HLA-DR <SEP> 99 <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 1605 <SEP> 98.8 <SEP> 0. <SEP> 9 <SEP> 1504 <SEP> 99.2 <SEP> 0. <SEP> 7 <SEP> 1101
<tb> CD40 <SEP> 98.9 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 6 <SEP> 1697 <SEP> 98.4 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 1314 <SEP> 99 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 6 <SEP> 1278
<tb> CD86 <SEP> 97.7 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 8 <SEP> 373 <SEP> 98.6 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 2 <SEP> 318 <SEP> 96.4 <SEP> ¯ <SEP> 3. <SEP> 3 <SEP> 253
<tb> CD83 <SEP> 77.1 <SEP> ¯ <SEP> 8. <SEP> 5 <SEP> 169 <SEP> 64.2 <SEP> 20 <SEP> 170 <SEP> 49.9 <SEP> ¯ <SEP> 6.

   <SEP> 2 <SEP> 132
<tb> CD80 <SEP> 78.1 <SEP> ¯ <SEP> 5. <SEP> 6 <SEP> 216 <SEP> 68.9 <SEP> ¯ <SEP> 2. <SEP> 6 <SEP> 162 <SEP> 58.3 <SEP> 17 <SEP> 143
<tb> CD1a <SEP> 14. <SEP> 3 <SEP> ¯ <SEP> 9. <SEP> 5 <SEP> 45. <SEP> 5 <SEP> 27 <SEP> ¯ <SEP> 7 <SEP> 74 <SEP> 25.9 <SEP> 6.5 <SEP> 78
<tb> 
Tableau   n  8    
Cette étude démontre que la cyclosporine provoque une diminution nette de l'expression des molécules CD83 et CD80 ainsi qu'une augmentation de l'expression du CD1a. Une analyse graphique (figure 4) révèle en réalité l'existence de deux populations cellulaires, l'une CD83+ et l'autre
CD83-qui est douée de propriétés immunorégulatrices.



  En effet les cellules dendritiques en présence de CsA (CsA-MODC) sont capables d'orienter la réponse des lymphocytes T vers une réponse de type TH2 qui favorise une réaction commune suppressive.



  La figure 5 illustre cette polarisation de la réponse immune vers une réponse de type Th2 par des cellules dendritiques dérivées de monocytes et traitées par la cyclosporine A.



  Les cellules dendritiques dérivées de monocytes cultivées en présence de
GM-CSF,   IL-4    et RU 41740, et traitées par   la cylosporine    A, sécrètent moins   d'IL-12    que les cellules dendritiques non traitées (figure 5A).



  De plus, le rapport de sécrétion de cytokines   IFN-y/IL-10 (Th1/Th2)    par des cellules T est diminué lorsque les cellules T sont stimulées par des cellules dendritiques traitées par cyclosporine A (Figure 5B).



  Exemple 9 : Utilisation des DC matures pour induire une culture mixte lymphocytaire allogénique ou autologue.



  En présence de MODC matures, les lymphocytes T allogéniques, au 6ème et même au 8ème jour, sont doués d'une prolifération extrêmement importante, très largement supérieure à ce que   l'on    constate avec l'utilisation des lymphocytes T allogéniques et des monocytes   allogéniques. Il    en est de même pour une culture mixte   autologue.   



  Des cultures mixtes lymphocytaires autologues ont donc été induites par des cellules dérivées de monocytes   (MODCs)    générées en présence de
GM-CSF (200   UI/ml), d'IL-4    (500   UI/ml)    et de RU 41740 (10   pg/ml)    
Dix mille   MODCs,    irradiées à 30 Grays, sont cultivées avec différentes sous-populations lymphocytaires triées soit par billes magnétiques   Dynal    (CD4+ et CD8+), soit avec le module de tri du FACS   Calibur (CD8   
CD28-, et   CD8bri9h', CD28+    autos). Dans le tableau 8, les valeurs indiquées représentent l'incorporation de Thymidine tritiée après culture mixte autologue, sauf (**).

   Les expériences sont réalisées en triplicate, sauf (*), en duplicate. 
EMI35.1     





  Condition <SEP> Valeurs <SEP> Test <SEP> Student <SEP> par <SEP> rapport <SEP> Condition <SEP> Moyenne <SEP> Ecart-type
<tb> au <SEP> contrôle <SEP> nägatif
<tb> p=
<tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 7898 <SEP> 10720 <SEP> 8613 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 9077 <SEP> 692
<tb> (35.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> (35.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos)
<tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> allos) <SEP> + <SEP> 119066 <SEP> 193392 <SEP> 206319 <SEP> 3,827E-03 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> allos) <SEP> + <SEP> 172926 <SEP> 22198
<tb> (35.000 <SEP> CD4+) <SEP> allos) <SEP> (**) <SEP> (35.000 <SEP> CD4+ <SEP> allos) <SEP> (**)
<tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 37808 <SEP> 45223 <SEP> 42027 <SEP> 1,458E-04 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 41686 <SEP> 1753
<tb> (35.000 <SEP> CD28- <SEP> autos)

   <SEP> (35.000 <SEP> CD8bright <SEP> CD28autos)
<tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 32990 <SEP> 54800 <SEP> 2,394E-02 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 43895 <SEP> 7711
<tb> (35.000 <SEP> CD28+ <SEP> autos) <SEP> (35.000 <SEP> CD8bright
<tb> CD28+ <SEP> autos)(*)
<tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 13985 <SEP> 12941 <SEP> 13573 <SEP> 3,978E-03 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 13500 <SEP> 248
<tb> (100.000 <SEP> CD8+ <SEP> autos) <SEP> (100.000 <SEP> CD8+ <SEP> autos)
<tb> (*)
<tb>    Tableau n  9    
Exemple 10 : Procédés de production du LCOS 1013 et du LCOS
1014.



  A. PRESENTATION GENERALE DU LCOS 1013
Le LCOS 1013 est un analogue du RU 41740, constitué par un ensemble de substances extraites à partir d'un lysat de culture de Klebsiella pneumoniae. Son mode de fabrication repose sur la succession d'étapes ou stades, dont le schéma général est présenté ci-dessous. Des milieux utilisables pour les cultures, ainsi qu'une présentation indicative du déroulement de chaque étape, sont décrits plus en détail après ce diagramme.



  La technique de fabrication décrite ci-après, à titre purement illustratif, correspond à une unité opératoire basée sur un volume de culture bactérienne obtenue dans un fermenteur de 600 litres. 
EMI37.1     


<tb>



   <SEP> STADE <SEP> 1 <SEP> : <SEP> Préparation <SEP> de <SEP> l'inoculum
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 2 <SEP> : <SEP> Préculture
<tb>  <SEP> v
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 3 <SEP> : <SEP> Culture <SEP> en <SEP> fermenteur
<tb>  <SEP> v
<tb> STADE <SEP> 4 <SEP> : <SEP> Fin <SEP> de <SEP> culture <SEP> et <SEP> addition <SEP> des <SEP> agents <SEP> lysants
<tb>  <SEP> y
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 5 <SEP> : <SEP> Lyse
<tb> STADE <SEP> 6 <SEP> : <SEP> Tamisage <SEP> moléculaire <SEP> avec <SEP> Concentration
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 7 <SEP> Lyophilisation <SEP> du <SEP> lysat
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 8 <SEP> : <SEP> Extraction <SEP> par <SEP> l'acétone
<tb>  <SEP> i
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 9 <SEP> : <SEP> Extraction <SEP> par <SEP> le <SEP> méthanol
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 10 <SEP> :

   <SEP> Remise <SEP> en <SEP> solution
<tb>  <SEP> r
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 11 <SEP> Centrifugation
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 12 <SEP> : <SEP> Ultrafiltration
<tb>  <SEP> 
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 13 <SEP> : <SEP> Filtration
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 14 <SEP> : <SEP> Lyophilisation
<tb>  <SEP> STADE <SEP> 15 <SEP> : <SEP> Mélange
<tb>  
 B.

   DESCRIPTION DE DIFFÉRENTS MILIEUX UTILISABLES POUR
 LA CULTURE DES BACTERIES
La culture des bactéries, en vue de produire du LCOS 1013 suivant la succession d'étapes précisées ci-dessus, peut être effectuée en utilisant les milieux de culture contenant les composants suivants :
Bouillon Nutritif
Peptone   Papaïnique    de Soja 4   +/-2      g/1   
Autolysat de levure 4   +/-2      g/1   
Chlorure de Sodium 5   +/-2      g/l   
Hydroxyde de Sodium qsp pour pH 7,4       0,

  2
Boite de Roux
Chlorure de Sodium 5   +/-2      g/1   
Glucose anhydre 5   +/-2      g/1   
Autolysat de levure 12 +/-3   g/1   
Peptone   Papaïnique    de Soja 5 +/-2   g/1   
Gélose 30 +/-4   g/1   
Hydroxyde de Sodium qsp pour pH 7,5       0,2
Phosphate Dipotassique 4 +/-2 g/l
Phosphate Monopotassique 0,5 à 0,9   g/1   
Milieu de préculture
Peptone   Papaïnique    de Soja 20+/-3   g/1   
Autolysat de levure 10+/-2   g/1   
Chlorure de Sodium 5 +/-2   g/1   
Phosphate Dipotassique 3,

  5 +/-1   g/1   
Phosphate Monopotassique 1 à 2   g/1   
Milieu de culture pour fermenteur
Autolysat de levure de boulangerie 10 +/-2   g/1   
Chlorure de Sodium 5+/-2   g/l   
Peptone   Papaïnique    de Soja 20+/-3   g/1   
Phosphate Dipotassique 3,5+/-1 gel
Phosphate Monopotassique 1 à 2   g/1    
C. DESCRIPTION DETAILLÉE DES DIFFÉRENTS STADES DE
PRODUCTION DU LCOS 1013
STADE 1 : Préparation de l'inoculum
Ce stade a pour but de réaliser, sur milieu gélosé en boîte de Roux, la culture de Klebsiella pneumoniae nécessaire à l'inoculation d'une   préculture    en milieu liquide, à partir d'un cryotube ou d'un lyophilisat issu de la banque de travail.



  La banque de travail est réalisée par exemple à partir d'une souche de
Klebsiella pneumoniae de l'Institut Pasteur de référence   CIP    52.145.



  Pour cela, la souche est revivifiée en réalisant une suspension bactérienne dans le bouillon nutritif, à partir duquel on ensemence des boîtes de Roux, qui sont ensuite incubées à   37 C          0,5 pendant 20 à 24 heures.



  STADE 2 : Précultures
A partir de   l'inoculum    préparé au stade 1, une   préculture    est effectuée en flacon de 3 litres, destinée à ensemencer un fermenteur de   35 I, lui-même    destiné dans un deuxième temps à ensemencer un fermenteur de 600   I.   



  La première préculture est réalisée dans le milieu de préculture décrit cidessus, auquel on ajoute une solution stérile de glucose, à raison de 30g de glucose pour 3 litres. La deuxième préculture, de 35 litres, est effectuée dans le milieu de culture pour fermenteur décrit plus haut, auquel on ajoute 400 g de glucose.



  Des flacons satellites contenant respectivement une solution stérile d'hydroxyde de sodium 10 N, une solution stérile d'acide orthophosphorique   dilué au 1/2,    et une solution stérile d'anti-mousse, peuvent être utilisés pour la deuxième   préculture,    en fermenteur, afin notamment de maintenir le pH aux alentours de 6,5, pendant toute la durée de la préculture, soit environ 5 heures à environ   37 C,    sous agitation. 



  STADE 3 : Culture en fermenteur
L'objet de cette étape est de réaliser en fermenteur, dans des conditions définies, une culture bactérienne de teneur supérieure ou égale à 1,7.10'    germes/ml,    pour permettre l'extraction ultérieure d'une quantité de produit satisfaisante.



  Pour cela, la suspension de germes contenue dans le fermenteur de 35 1 est transférée dans un fermenteur de 600 litres contenant le milieu de culture en fermenteur décrit plus haut, auquel on a ajouté 5 kg de glucose.



  Comme pour   la préculture    de 35 litres, des cuves satellites contenant respectivement une solution stérile d'hydroxyde de   sodium 10    N et une solution stérile d'acide orthophosphorique dilué au 1/2 sont utilisées pour la régulation du pH aux alentours de 6,5, ainsi qu'une cuve satellite contenant une solution stérile d'anti-mousse. La culture est réalisée pendant environ 7 heures, à   37 C            1 C,    sous agitation.



  STADE 4 : Fin de culture et addition des agents lysants
Ce stade a pour but d'inactiver la culture par l'action d'agents lysants et chauffage de 55 à   75 C    pendant une durée supérieure ou égale à 40 minutes. Pour cela, les agents   lysants    utilisés sont les suivants : solution stérile de polysorbate 80, solution stérile d'EDTA, solution stérile de chlorydrate de lysozyme.



  En fin de culture, le pH est amené à 5,8       0,3 à l'aide d'une solution stérile d'acide orthophosphorique, puis les agents lysants ci-dessus sont transférés dans la culture.



  Le contenu du fermenteur est ensuite porté à la température de   65 C      10 C    et maintenu pendant au moins 40 minutes à cette température sous agitation. 



  Le biolysat obtenu est alors transféré dans une cuve de lyse industrielle (préchauffée à   65 C            10 C),    et maintenu à cette température pendant au moins 20 minutes, avant d'être ramené à   37 C            2 C.   



  STADE 5 : Lyse
L'étape de lyse consiste à rompre la paroi des bactéries par voie enzymatique, ce qui entraîne la libération des constituants cytoplasmiques des cellules microbiennes. Elle est effectuée en maintenant la suspension prélysée du stade précédent, à   37 C            2 C,    dans la cuve de lyse au moins pendant 6 jours
STADE 6 : Tamisage moléculaire et concentration
Dans cette étape, le volume de lysat brut est réduit de moitié pour diminuer la quantité à traiter aux stades suivants. La concentration s'effectue par exemple sur un ultrafiltre équipé de cartouche filtrante de type CARBOSEP d'un seuil de coupure    < 100    KD, éliminant ainsi les petites molécules non liées.



  STADE 7 : Lyophilisation du lysat
Afin d'obtenir le lysat brut issu du stade 6 sous forme solide permettant les extractions ultérieures aux solvants, une opération de lyophilisation est réalisée immédiatement après le stade de concentration. On obtient ainsi une poudre brune, collante au toucher.



  STADE 8 : Extraction par l'acétone :
Le lysat de LCOS 1013 lyophilisé, issu du stade 7, contient des lipides que l'on élimine partiellement par l'extraction solide-liquide, en utilisant de l'acétone à température ambiante.



  Le volume d'acétone utilisé est proportionnel à la masse de lyophilisat. Ce volume est obtenu selon le calcul suivant : 10 x masse mise en oeuvre    <     V   solvant  <     20 x masse mise en oeuvre, avec de préférence (V solvant/masse mise en   oeuvre)-15.   



  Le produit est récupéré par centrifugation, puis séché.



  STADE 9 : Extraction par le méthanol :
Après extraction à l'acétone, le produit obtenu au stade 8 contient encore des lipides résiduels et des pigments que l'on élimine par extraction solideliquide, en utilisant du méthanol à température ambiante.



  Le volume de méthanol utilisé est proportionnel à la masse de lyophilisat.



  Ce volume est obtenu selon le calcul suivant : 10 x masse mise en oeuvre    <     V   solvant  <  20 x masse    mise en oeuvre, avec de préférence (V solvant/masse mise en   oeuvre)-15.   



  Le produit est récupéré par centrifugation, puis séché.



  STADE 10 : Remise en solution "L'extrait méthanol"issu du stade 9 est remis en solution aqueuse, pour permettre l'isolement ultérieur du produit par centrifugation et ultrafiltration.



  STADE 11 : Centrifugation
L'extrait brut en suspension issu du stade 10 contient des protéines dénaturées et des matières insolubles dans l'eau que l'on élimine par centrifugation entre 14000 et 18000 g.



  Le produit centrifugé est d'aspect légèrement colloïdal et de couleur beige à brun.



  STADE 12 : Ultrafiltration
Ce stade représente l'étape essentielle de l'isolement du produit.



  Le produit issu du stade 11 contient des substances de différentes tailles moléculaires : sels minéraux, protéines,   glycoprotéines,    etc... 



  Les macromolécules de PM   :    300000 constituant le produit sont isolées par ultrafiltration sur une membrane de seuil de coupure de 300 KD.



  Le produit, une fois introduit dans la cuve de l'appareil, est véhiculé en permanence au moyen d'une pompe, dans un circuit fermé comportant un ultrafiltre. Le milieu est maintenu homogène au moyen d'une agitation. La pression créée par la pompe sur la membrane filtrante, oblige une partie du soluté à traverser cette membrane (perméat).



  La partie retenue (rétentat), reste en circulation. Sachant que   l'on    opère à volume constant, la perte de volume est compensée en permanence par l'apport d'un même volume d'eau.



  En fin d'opération la solution est ultrafiltrée.



  L'ultrafiltrat obtenu est une solution liquide translucide légèrement jaune.



  STADE 13 : Filtration
La clarification du surnageant de centrifugation obtenu au stade 11 est affinée par filtration sur membrane de rétention nominale de 1,2 um.



  On obtient ainsi une"solution de glycoprotéines"opalescente, de couleur beige clair à crème.



  STADE 14 : Lyophilisation
Afin de permettre une bonne conservation du produit, la solution issue du stade 13 est ensuite lyophilisée, par un procédé comportant une étape de congélation, puis la lyophilisation proprement dite.



  Les   glycoprotéines lyophilisées    ont l'aspect d'une poudre floconneuse de couleur blanche à crème, hygroscopique.



  STADE 15 : Mélange
Cette dernière étape a pour but d'homogénéiser les glycoprotéines lyophilisées issues du stade 14. 



  L'atomisation peut se substituer avantageusement à la lyophilisation et au mélange (LCOS 1014).



  Exemple 11 : Etude de l'effet de la molécule LCOS 1013 sur la maturation des cellules dendritiques dérivées de monocytes humains.



  L'effet du LCOS 1013 sur la maturation des cellules dendritiques générées à partir de monocytes humains, a été étudié sur des cellules provenant de 3 donneurs différents, par comparaison avec le   TNF-a.   



   A. Protocole - Les monocytes purifiés (plus de 90%) ont été mis en culture dans du milieu   RPMI    contenant 10% de sérum humain AB, en présence de facteurs de croissance GM-CSF (200U/ml) et 11-4 (500U/ml) pendant 6 jours afin d'induire la différenciation des monocytes en cellules dendritiques immatures. La maturation des cellules a été induite par addition de   TNF-a      (200U/ml)    ou du composé LCOS 1013 (25   pg/ml)    pendant 48H.



     - Le    phénotype des cellules ainsi générées (après 8 jours de culture) a été examiné par cytométrie en flux. L'expression du marqueur spécifique de maturation des cellules dendritiques (CD83), des molécules de costimulation CD80, CD86, CD40, de la molécule d'adhésion CD54, de la molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classe Il HLA-DR, a été analysée. L'expression de la molécule   CD1a,    marqueur spécifique des cellules de Langerhans, cellules dendritiques immatures, a également été testée.



     - Les    propriétés fonctionnelles des cellules ont été étudiées à l'aide de réactions mixtes lymphocytaires (MLR). Pour ce faire, une gamme de concentrations de cellules dendritiques a été mise en présence d'une concentration définie de lymphocytes T allogéniques (réaction mixte allogénique) ou de lymphocytes T autologues (réaction mixte autologue), pendant 4 et 5 jours respectivement. La prolifération des lymphocytes T a été déterminée par incorporation de thymidine tritiée. Les protocoles expérimentaux de ces réactions mixtes lymphocytaires sont décrits plus en détail dans l'article de K. Duperrier et al. mentionné plus haut.



   B. Résultats
Phénotype des cellules dendritiques
Les tableaux 10 à 12 ci-dessous résument les pourcentages d'expression des différents marqueurs ainsi que l'intensité moyenne de fluorescence (IFM) de chaque marqueur (entre parenthèses).
EMI45.1     

  <SEP> donneur <SEP> CD83 <SEP> CD80 <SEP> CD86 <SEP> CD40 <SEP> CD54 <SEP> HLA-DR <SEP> CD1 <SEP> a
<tb>  <SEP> 1
<tb> TNF-a <SEP> 91 <SEP> % <SEP> 69.7% <SEP> 99.5% <SEP> 99.4% <SEP> 98.4% <SEP> 99.5% <SEP> 13.2%
<tb>  <SEP> (132) <SEP> (85) <SEP> (209) <SEP> (1084) <SEP> (195) <SEP> (803) <SEP> (28)
<tb> LCOS1013 <SEP> 84.6% <SEP> 93.2% <SEP> 99.7% <SEP> 99.7% <SEP> 99.2% <SEP> 99.7% <SEP> 10.8%
<tb>  <SEP> (157) <SEP> (134) <SEP> (214) <SEP> (1270) <SEP> (306) <SEP> (502) <SEP> (20)

  
<tb>    Tableau n"10   
EMI45.2     

  <SEP> donneur <SEP> CD83 <SEP> CD80 <SEP> CD86 <SEP> CD40 <SEP> CD54 <SEP> HLA-DR <SEP> CD1 <SEP> a
<tb>  <SEP> 2
<tb> TNF-a <SEP> 88% <SEP> 55.1 <SEP> % <SEP> 99.1 <SEP> % <SEP> 99.2% <SEP> 97.8% <SEP> 98.6% <SEP> 20.6%
<tb>  <SEP> (221) <SEP> (89) <SEP> (299) <SEP> (1104) <SEP> (355) <SEP> (1108) <SEP> (215)
<tb> LCOS1013 <SEP> 81.4% <SEP> 81.8% <SEP> 98.1 <SEP> % <SEP> 99.3% <SEP> 97.5% <SEP> 98.8% <SEP> 11.1 <SEP> %
<tb>  <SEP> (242) <SEP> (169) <SEP> (298) <SEP> (1441) <SEP> (416) <SEP> (1102) <SEP> (299)
<tb> 
Tableau n  11 
EMI46.1     

  <SEP> donneur <SEP> CD83 <SEP> CD80 <SEP> CD86 <SEP> CD40 <SEP> CD54 <SEP> HLA-DR <SEP> CD1a
<tb>  <SEP> 3
<tb> TNF-a91. <SEP> 8% <SEP> 48.7% <SEP> 98.5% <SEP> 98.7% <SEP> 95.9% <SEP> 98.9% <SEP> neg.
<tb>



   <SEP> (108) <SEP> (65) <SEP> (209) <SEP> (918) <SEP> (154) <SEP> (768)
<tb> LCOS1013 <SEP> 92.3% <SEP> 89.4% <SEP> 98.2% <SEP> 98.7% <SEP> 98.4% <SEP> 97.5% <SEP> neg.
<tb>



   <SEP> (118) <SEP> (104) <SEP> (214) <SEP> (1270) <SEP> (288) <SEP> (588)
<tb>    Tableau n'12   
Les cellules dendritiques générées en présence de la molécule LCOS 1013 présentent un phénotype caractéristique des cellules dendritiques matures, de par l'expression des molécules CD83, des molécules de co-stimulation et d'adhésion, ainsi que la faible expression du   CD1a.   



  II apparaît cependant que le pourcentage d'expression, ainsi que l'IFM de la molécule CD80, sont augmentés en présence de la molécule
LCOS 1013, par rapport au TNF-a, de même que l'IFM des molécules
CD40 et CD54.



  Ces résultats suggèrent un effet différentiel de la molécule LCOS 1013 par rapport au TNF-a, quant à la maturation des cellules dendritiques.



  Fonctions des cellules dendritiques
Les résultats des réactions mixtes lymphocytaires   allogéniques    sont illustrés à la figure 6. Ils montrent que les cellules dendritiques cultivées en présence de LCOS 1013 présentent une capacité allostimulatrice élevée, comparable à celle des cellules générées en présence de   TNF-a.   



  Les résultats des réactions mixtes lymphocytaires autologues sont présentés à la figure 7. De façon remarquable, les cellules dendritiques cultivées en présence de LCOS 1013 présentent une capacité de stimulation des lymphocytes T autologues beaucoup plus importante que les cellules générées en présence de   TNF-a    (au moins 5 fois supérieure).



  C. Conclusion
Les résultats ci-dessus montrent que la molécule LCOS 1013 induit de façon efficace la maturation des cellules dendritiques générées à partir de monocytes humains, aux niveaux phénotypique et fonctionnel.



  Il est intéressant de noter cependant que l'expression de la molécule CD80 est fortement augmentée en présence de LCOS 1013, et que les cellules induisent une forte réponse autologue, par comparaison avec   le TNF-a,    ceci pour les 3 donneurs testés.



  Ceci est en accord avec les résultats présentés par Scheinecker et al.



  (Journal of Immunology, 1998,161 : 3966-3973), qui suggèrent que la molécule CD80 jouerait un rôle essentiel dans l'initiation de la réaction mixte   autologue.   



  Exemple 12 : Etude de l'effet de différentes concentrations de
LCOS 1013 sur la maturation des cellules dendritiques.



  L'effet de différentes concentrations de LCOS 1013 sur la maturation des cellules dendritiques générées à partir de monocytes humains d'un seul donneur, a été étudié, par comparaison avec le   TNF-a.   



  Les concentrations testées pour le LCOS 1013 sont 5,10 et 25   Lg/mI,    et 200 u/ml pour le   TNF-a.   



  Les résultats de l'étude phénotypique sont résumés dans le tableau suivant : 
EMI48.1     

 donneur <SEP> 1 <SEP> HLA-DR <SEP> CD <SEP> 83 <SEP> CD54 <SEP> CD <SEP> 40 <SEP> CD <SEP> 86 <SEP> CD <SEP> 80
<tb>  <SEP> TNF-&alpha; <SEP> 92,12 <SEP> % <SEP> 70,02% <SEP> 87,12% <SEP> 83,44% <SEP> 94,44% <SEP> 0,49%
<tb> (200 <SEP> U/ml) <SEP> 877,54 <SEP> 65,55 <SEP> 137, <SEP> 49 <SEP> 289,54 <SEP> 180,81 <SEP> 95, <SEP> 04
<tb> LCOS1013 <SEP> 81,69% <SEP> 76, <SEP> 35% <SEP> 89,39% <SEP> 75,02% <SEP> 93,33% <SEP> 3,26%
<tb>  <SEP> (5 <SEP> pg/ml) <SEP> 545,30 <SEP> 119, <SEP> 62 <SEP> 229,59 <SEP> 454,18 <SEP> 197 <SEP> 90,79
<tb> LCOS1013 <SEP> 87,17% <SEP> 68,20% <SEP> 90, <SEP> 66% <SEP> 79,99% <SEP> 94, <SEP> 47% <SEP> 2,92%
<tb> (10 <SEP> pg/ml) <SEP> 500,55 <SEP> 93,85 <SEP> 229,17 <SEP> 411,53 <SEP> 184, <SEP> 14 <SEP> 91,01
<tb> LCOS1013 <SEP> 94,52% <SEP> 66,

  35% <SEP> 93, <SEP> 15% <SEP> 91,22% <SEP> 91, <SEP> 07% <SEP> 1,07%
<tb> (25 <SEP> pg/ml) <SEP> 504, <SEP> 84 <SEP> 105,29 <SEP> 237,68 <SEP> 394,41 <SEP> 191, <SEP> 62 <SEP> 99, <SEP> 64
<tb>    Tableau n 13   
La fonctionnalité des cellules obtenues a été étudiée par des réactions mixtes lymphocytaires   allogéniques    et   autologues,    dont les résultats sont présentés à la figure 8.



  Les cellules dendritiques cultivées en présence de LCOS 1013, aux trois concentrations testées, présentent une capacité   allostimulatrice    élevée, comparable à celle des cellules générées en présence de   TNF-a.   



  Là encore, et quelle que soit la concentration de LCOS 1013 utilisée, on observe que les cellules dendritiques cultivées en présence de LCOS 1013 présentent une capacité de stimulation des lymphocytes T autologues beaucoup plus importante que les cellules générées en présence de TNF  a.

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation fonctionnelle des cellules dendritiques, attestée par leur capacité à - déclencher in vitro une réponse primaire contre un antigène infectieux ou tumoral mis en contact avec les cellules dendritiques préalablement et/ou au cours de leur culture avec les lymphocytes T ; - induire la prolifération de lymphocytes T en culture mixte autologue ou allogénique.
2. Procédé d'obtention de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation phénotypique des cellules dendritiques, attestée par une augmentation significative de l'expression des molécules CD40, CD83, CD86, et HLA-DR et une diminution très marquée de l'expression des molécules CD14 et CD1 a par lesdites cellules dendritiques.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec un analogue du RU 41740 obtenu à partir de la souche O1 K2 NCTC 5055 de Klebsiella pneumoniae.
4. Procédé d'obtention de cellules dendritiques matures présentant des antigènes choisis, à partir de monocytes, précurseurs des monocytes, ou cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits précurseurs sont mis en contact avec le RU 41740 ou un analogue de celui-ci, couplé à des molécules comportant lesdits antigènes.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le couplage entre le RU 41740 ou son analogue et les antigènes est non covalent.
6. Procédé selon l'une des revendications 1,2,4 et 5, dans lequel le composé mis au contact des monocytes, précurseurs des monocytes, ou cellules souches hématopoïétiques est le RU 41740, couplé ou non à des molécules antigéniques.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le RU 41740 est ajouté au milieu de culture des monocytes, précurseurs des monocytes, ou cellules souches hématopoïétiques, à une concentration finale comprise entre 1 ng/ml et 1 mg/ml, préférentiellement entre 100 ng/ml et 10 gg/mI.
8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'analogue du RU 41740 est le LCOS 1013 ou le LCOS 1014.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le LCOS 1013 ou le LCOS 1014 est ajouté au milieu de culture des monocytes, précurseurs des monocytes, ou cellules souches hématopoïétiques, à une concentration finale comprise entre 1 ng/ml et 1 mg/ml, préférentiellement entre 100 ng/ml et 50 tg/mI.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel les cellules dendritiques sont traitées ex vivo, pour la préparation d'un médicament destiné à la prophylaxie, l'atténuation ou le traitement de maladies cancéreuses, infectieuses, allergiques ou auto immunes.
11. Utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition comprenant des cellules dendritiques matures et/ou des macrophages activés.
12. Utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour une administration topique, destinée à favoriser la maturation des cellules de Langerhans de la peau.
13. Utilisation d'un produit de couplage entre le RU 41470 ou un analogue de celui-ci et un ou plusieurs antigènes, pour la préparation d'une composition apte à induire la production de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes.
14. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire antitumorale.
15. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire contre une infection par un micro-organisme.
16. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10 et incubées en présence d'un immunosuppresseur, dans la fabrication d'une composition apte à modifier la réponse immunitaire dans le sens d'une tolérance.
17. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, pour la détection et/ou la caractérisation des antigènes d'histocompatibilité.
18. Produit de couplage entre le RU 41740 ou un analogue de celui-ci et des molécules antigéniques, pour induire la maturation de cellules dendritiques ou l'activation de macrophages.
19. Produit de couplage selon la revendication 18, caractérisé en ce que le RU41740 ou son analogue est lié aux molécules antigéniques par des liaisons non covalentes.
20. Produit de couplage selon la revendication 18 ou 19, caractérisé en ce que les molécules antigéniques sont de nature non protéique.
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