FR2842208A1

FR2842208A1 - Extraits membranaires de klebsiella presentant des proprietes avantageuses, et procede de production de ces extraits

Info

Publication number: FR2842208A1
Application number: FR0208698A
Authority: FR
Inventors: Dominique Rigal; Daniel Masseau
Original assignee: LCO SANTE
Current assignee: LCO SANTE
Priority date: 2002-07-10
Filing date: 2002-07-10
Publication date: 2004-01-16
Anticipated expiration: 2022-07-10
Also published as: WO2004007540A8; AU2003271802A1; FR2842208B1; WO2004007540A1

Abstract

L'invention porte sur des extraits bactériens, en particulier des extraits de Klebsiella, plus particulièrement de Klebsiella pneumoniae, présentant des propriétés avantageuses, notamment, dans plusieurs applications, une activité accrue par rapport aux extraits de Klebsiella déjà connus. Le procédé de production de ces extraits fait aussi partie de la présente invention.

Description

EXTRAITS MEMBRANAIRES DE KLEBSIELLA PRESENTANT DES
PROPRIETES AVANTAGEUSES, ET PROCEDE DE PRODUCTION DE
CES EXTRAITS L'invention porte sur des extraits bactériens, en particulier des extraits de Klebsiella, plus particulièrement de Klebsiella pneumoniae, présentant des propriétés avantageuses, notamment, dans plusieurs applications, une activité accrue par rapport aux extraits de Klebsiella déjà connus. Le procédé de production de ces extraits fait aussi partie de la présente invention.

Un médicament constitué d'extraits de Klebsiella pneumoniae, le RU 41740, est commercialisé sous la marque Biostim par les Laboratoires Cassenne (France). Ce médicament est composé d'extraits glycoprotéiques obtenus à partir d'une souche de Klebsiella pneumoniae (souche 01 K2 NCTC 5055). Il est obtenu après lyse des parois bactériennes, extraction organique, centrifugation et ultrafiltration.

Il comprend : - des glyco-conjugués, en quantité supérieure à 60% ; - des acides aminés ; et - des lipides.

La partie glyco-conjuguée est divisée en 3 fractions : P1, F1, F2.

P1, d'origine capsulaire, représente environ 50 % du RU 41740, et a un poids moléculaire moyen de 95 kD, F1 est d'origine membranaire et représente environ 20 % du RU 41740, et a un poids moléculaire moyen de 350 kD F2 semble être une partie de P1.

Le RU 41740 ne provoque pas d'effet pyrogène, comme en atteste la négativité du test au Limulus effectué avec ce composé.

Le RU 41740 possède une activité immunomodulatrice. Son activité chez l'homme a été démontrée, notamment pour stimuler les défenses de l'hôte dans le cas de bronchites chroniques (Fietta, Bersani et al. 1988), ou pour éviter des réactions d'hypersensibilité retardée chez des patients atteints de lymphomes (Lang, Gastaut et al. 1986). Plus récemment, des essais chez la souris ont montré qu'une administration parentérale de RU 41740 est efficace pour prévenir la formation d'abcès intra-abdominaux suite à une infection (Finlay-Jones, Boyden et al. 1993), et qu'une administration orale du RU 41740 protégeait les souris vis-à-vis d'infections expérimentales, principalement contre des bactéries Gram-négatives (Nimier, Wolff et al. 1999). Au niveau cellulaire, Garin et al ont montré l'effet du RU 41740 sur la modulation de molécules impliquées dans la présentation de l'antigène (HLA-DR et HLA-DQ), la capture d'endotoxine (CD14) et l'activation (CD23) à la surface des monocytes (Garin, Bernaud et al. 1996). Par ailleurs, Estaquier et al. ont montré que le RU 41740 prolonge la survie des monocytes en culture, en limitant leur apoptose (Estaquier, Bloy et al. 1998) Le Biostim est actuellement principalement prescrit pour stimuler les défenses immunitaires chez l'enfant atteint d'une infection respiratoire.

En outre, la demanderesse a récemment mis en évidence deux autres propriétés avantageuses du RU 41740. L'ajout de RU 41740 au milieu de culture de cellules dendritiques immatures obtenues in vitro à partir de monocytes permet leur maturation. Cette propriété du RU 41740, décrite dans la demande de brevet n FR 0100275, présente un grand intérêt dans le domaine de la thérapie cellulaire.

Des modifications substantielles apportées au procédé de production du RU 41740, notamment dans le but d'améliorer la qualité sanitaire du produit, ont conduit la demanderesse à un nouveau produit, désigné sous le nom LCOS 1013 . De façon inattendue, la demanderesse a mis en

évidence que ce nouvel extrait bactérien analogue du RU 41740, présente par rapport à ce dernier, outre une plus grande sécurité sanitaire, une efficacité accrue dans plusieurs des indications mentionnées ci-dessus. Le LCOS 1013 présente notamment une activité deux fois supérieure à celle du RU 41740 dans l'application mentionnée ci-dessus, à savoir la maturation des cellules dendritiques. Ces résultats montrent que de nouveaux extraits bactériens, notamment de Klebsiella, peuvent être employés avantageusement dans plusieurs nouvelles applications. Ces extraits bactériens, ainsi que leur procédé de production, sont l'objet de la présente invention.

En particulier, le LCOS 1013 est composé d'extraits glycoprotéiques obtenus à partir de la souche 01 K2 NCTC 5055 de Klebsiella pneumoniae.

Il est obtenu par un procédé comportant des étapes de lyse des parois bactériennes, extraction organique, centrifugation et ultrafiltration, comme décrit à l'exemple 1. Par rapport au procédé de préparation du RU 41740, le protocole de préparation du LCOS 1013 présente l'avantage de ne pas utiliser de mercurothiolate. Ce composé possède, outre ses propriétés d'agent lytique, des propriétés antiseptiques. Son élimination du protocole de préparation du LCOS 1013 entraîne donc la nécessité d'effectuer la production en conditions d'asepsie stricte, afin de protéger le produit de toute contamination bactérienne. Par ailleurs, le protocole de préparation du LCOS 1013 présente par rapport au procédé de préparation du RU 41740, une étape supplémentaire de tamisage moléculaire avec concentration (stade 6 de l'exemple 1), entre l'étape de lyse et les étapes de lyophilisation et extractions. Cette étape est effectuée par exemple par filtration tangentielle, avec un seuil de coupure de 40 à 60 kDa.

Les modifications du procédé de préparation du LCOS 1013 par rapport à celui du RU 41740 conduisent à des différences de composition entre ces deux extraits. En effet, l'étude comparative entre le RU 41740 et le nouvel

extrait de Klebsiella pneumoniae LCOS 1013 fait apparaître des différences au niveau structural et au niveau activité.

L'analyse électrophorétique en SDS-PAGE de ces deux principes actifs révèle une différence de composition de par le nombre de bandes détectées après coloration au bleu de Coomassie et de par l'intensité relative de chacune des bandes présentes dans le RU 41740 et le LCOS 1013 (exemple 2).

L'activité immunologique de ces deux principes actifs est également différente. Le test d'immunonéphélométrie montre que LCOS 1013 a une réactivité différente du RU 41740 lorsque ces deux produits sont mis en réaction vis-à-vis d'un immunsérum anti-RU 41740, ce qui signifie que la composition antigénique de ces deux produits est différente, à concentration équivalente (exemple 3).

Les analyses ci-dessus démontrent donc que le LCOS 1013 est un produit différent du RU 41740.

Les inventeurs ont ensuite comparé l'activité de ces deux produits en tant qu'agents de maturation des cellules dendritiques (exemple 8).

La demanderesse a aussi comparé l'activité du LCOS 1013 et du RU 41740 dans la maturation des cellules dendritiques obtenues à partir de monocytes (MODC) in vitro. Là encore, le LCOS 1013 s'est révélé nettement plus efficace que le RU 41740, puisque (exemple 8).

Tous ces résultats, présentés plus en détail dans les exemples ci-dessous, montrent bien que l'activité du LCOS 1013 est supérieure à celle du RU 41740 dans plusieurs applications possibles des extraits bactériens, notamment obtenus à partir de Klebsiella pneumoniae. La biocompatibilité et la bonne tolérance connues du RU 41740 permettent d'envisager une utilisation avantageuse de ces composés pour la fabrication de médicaments destinés à soigner diverses pathologies, d'autant plus que

certaines des différences entre les protocoles des production du LCOS 1013 par rapport au RU 41740 rendent le nouveau composé a priori plus performant sur le plan sanitaire, puisque son protocole de fabrication ne nécessite pas l'utilisation d'antiseptique au cours de la lyse.

L'invention porte donc en premier lieu sur un procédé de préparation d'extraits bactériens à partir de germes capsulés, comportant les étapes suivantes : a) culture des bactéries, b) lyse des bactéries, c) premier tamisage moléculaire, avec concentration, d) lyophilisation du concentrat e) extractions par des solvants organiques, f) remise en solution, g) centrifugation, h) deuxième tamisage moléculaire, i) filtration j) lyophilisation Dans une réalisation préférée du procédé ci-dessus, les bactéries sont des Klebsielles, de préférence des Klebsiella pneumoniae.

Dans les procédés de l'invention, la culture des bactéries est effectuée de préférence à pH inférieur à 6,7, par exemple à pH 6,5.

Dans une réalisation préférée des procédés ci-dessus, au moins 90% des bactéries sont lysées à l'issue de l'étape b). En outre, dans ce nouveau procédé, l'étape de lyse des bactéries a une durée comprise préférentiellement entre 4 et 8 jours, par exemple de 6 jours. De manière encore préférée, la lyse des bactéries est effectuée sans ajout d'agent lysant comportant un composant antiseptique. Ceci permet d'une part, une production moins polluante pour l'environnement et, d'autre part, d'assurer

une plus grande sécurité sanitaire du produit, puisqu'il ne risque pas de conserver des traces d'un dérivé antiseptique.

Dans une réalisation particulière des procédés de l'invention, le pH de la culture issue de l'étape a) est ramené à une valeur inférieure à 6, par exemple à pH 5,8 0,1 avant l'ajout des agents lysants.

L'étape de premier tamisage moléculaire, avec concentration (étape c) est une étape importante dans le procédé de l'invention. De façon préférée, cette étape conduit à une concentration d'un facteur compris entre 1,5 et 3 de la suspension bactérienne lysée issue de l'étape b), par exemple à une concentration d'un facteur 2.

Cette étape c) conduit à l'élimination des petites molécules non liées, avec un seuil de coupure situé de préférence à 20 kDa, 70 kDa, ou 100 kDa et, de manière encore préférée, à 50 kDa ou autour de cette valeur. Des exemples de cartouches utilisables pour cela sont des cartouches de type CARBOSEP d'un seuil de coupure d'environ de 40 à 60 kDa.

Dans une réalisation particulière du procédé de l'invention, l'étape e) comporte une extraction par une cétone et une extraction alcoolique. Par exemple, l'étape e) comporte une extraction par l'acétone et une extraction par le méthanol, le volume utilisé pour chacun de ces solvants étant proportionnel à la masse de lyophilisât issu de l'étape d), de telle façon que
10 x masse de lyophilisât (en kg) # volume de solvant (en I) # 20 x masse de lyophilisât (en kg) Dans une réalisation préférée des procédés de l'invention, et toujours dans le soucis d'une bonne qualité sanitaire des produits obtenus, l'étape f) de remise en solution du produit issu de l'étape e) est effectuée sans ajout d'une substance comportant d'un composant antiseptique.

L'invention porte également sur tout produit susceptible d'être obtenu par un procédé tel que décrit ci-dessus.

Une composition pharmaceutique comportant un produit tel que décrit au paragraphe précédent, et destinée à favoriser la maturation des cellules dendritiques (in vitro ou in vivo), fait également partie de la présente invention.

La présente invention porte aussi sur un produit susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape c) d'un procédé tel que ceux décrits ci-dessus. Un tel produit présentera certes une pureté moins grande que le LCOS 1013, mais il pourra être utilisé avantageusement par exemple dans la fabrication d'une composition cosmétique ou d'une composition destinée à un usage vétérinaire. De telles compositions pharmaceutiques ou vétérinaires sont également partie intégrante de la présente invention.

Les exemples et figures présentés ci-dessous illustrent certaines des différences entre le RU 41740 et le LCOS 1013, notamment du point de vue de leur composition, de leurs propriétés immunologiques. Ces exemples et figures sont présentés à titre illustratif et non limitatif, et permettront de mettre en évidence certains avantages et caractéristiques de la présente invention.

Légende des figures Figure 1 : Schéma récapitulatif des étapes de fabrication du LCOS 1013.

Figure 2 : Profils électrophorétiques des différents produits mentionnées à l'exemple 2. L'électrophorèse est réalisée en SDS-PAGE, sur gel de polyacrylamide 8-16% Tris-Glycine, 1,5mm, 15 puits.

Puits 1, 6, 11 : Marqueurs (200 kDa à 6 kDa) Puits 2 et 3 : RU 41740 PA lot N 457 Puits 4 et 5 : LCOS 1014 (Stade atomisé) Puits 7 et 8 : LCOS 1012 (Stade 11 du LCOS 1013) Puits 9 et 10 : LCOS 1013 (Stade lyophilisé)

Exemple 1 : Procédé de fabrication du LCOS 1013 A. PRESENTATION GENERALE DU LCOS 1013 Comme le RU 41740, le LCOS 1013 est constitué par un ensemble de substances extraites à partir d'un lysat de culture de Klebsiella pneumoniae. Son mode de fabrication repose sur la succession d'étapes ou stades, dont le schéma général est présenté ci-dessous. Des milieux utilisables pour les cultures, ainsi qu'une présentation indicative du déroulement de chaque étape, sont décrits plus en détail après ce diagramme.

La technique de fabrication décrite ci-après, à titre purement illustratif, correspond à une unité opératoire basée sur un volume de culture bactérienne obtenue dans un fermenteur de 600 litres.

B. DESCRIPTION DE DIFFÉRENTS MILIEUX UTILISABLES POUR
LA CULTURE DES BACTERIES
La culture des bactéries, en vue de produire du LCOS 1013 suivant la succession d'étapes précisées ci-dessus, peut être effectuée en utilisant les milieux de culture contenant les composants suivants : Bouillon Nutritif - Peptone Papaïnique de Soja 4 +/- 2 g/l - Autolysat de levure 4 +/- 2 g/l - Chlorure de Sodium 5 +/- 2 g/l - Hydroxyde de Sodium qsp pour pH 7,4 0,2 Boite de Roux - Chlorure de Sodium 5 +/- 2 g/l - Glucose anhydre 5 +/- 2 g/l - Autolysat de levure 12 +/- 3 g/l

- Peptone Papaïnique de Soja 5 +/- 2 g/1 - Gélose 30 +/- 4 g/l - Hydroxyde de Sodium qsp pour pH 7,5 0,1 - Phosphate Dipotassique 4 +/- 2 g/l - Phosphate Monopotassique 0,5 à 0,8 g/l Milieu de préculture - Peptone Papaïnique de Soja 20+/- 2 g/l - Autolysat de levure 10+/- 2 g/l - Chlorure de Sodium 5 +/- 2 g/l - Phosphate Dipotassique 3,5 +/- 1 g/l - Phosphate Monopotassique 1 à 2 g/l Milieu de culture pour fermenteur - Autolysat de levure de boulangerie 10 +/- 2 g/l - Chlorure de Sodium 5+/- 2 g/l - Peptone Papaïnique de Soja 20+/- 2 g/l - Phosphate Dipotassique 3,5+/- 1 g/l - Phosphate Monopotassique 1 à 2 g/l C. DESCRIPTION DETAILLÉE DES DIFFÉRENTS STADES DE
PRODUCTION DU LCOS 1013 STADE 1 : Préparation de l'inoculum Ce stade a pour but de réaliser, sur milieu gélosé en boîte de Roux, la culture de Klebsiella pneumoniae nécessaire à l'inoculation d'une préculture en milieu liquide, à partir d'un cryotube ou d'un lyophilisât issu de la banque de travail.

La banque de travail est réalisée par exemple à partir d'une souche de Klebsiella pneumoniae de l'Institut Pasteur de référence CIP 52. 145.

Pour cela, la souche est revivifiée en réalisant une suspension bactérienne dans le bouillon nutritif, à partir duquel on ensemence des boîtes de Roux, qui sont ensuite incubées à 37 C 0,5 pendant 20 à 24 heures.

STADE 2 : Précultures A partir de l'inoculum préparé au stade 1, une préculture est effectuée en flacon de 3 litres, destinée à ensemencer un fermenteur de 35 #, lui-même destiné dans un deuxième temps à ensemencer un fermenteur de 600 #.

La première préculture est réalisée dans le milieu de préculture décrit cidessus, auquel on ajoute une solution stérile de glucose, à raison de 30 10 g de glucose pour 3 titres. La deuxième préculture, de 35 litres, est effectuée dans le milieu de culture pour fermenteur décrit plus haut, auquel on ajoute 400 100 g de glucose.

Des flacons satellites contenant respectivement une solution stérile d'hydroxyde de sodium 10 N, une solution stérile d'acide orthophosphorique dilué au , et une solution stérile d'anti-mousse, peuvent être utilisés pour la deuxième préculture, en fermenteur, afin notamment de maintenir le pH aux alentours de 6,5, pendant toute la durée de la préculture, soit environ 5 heures à environ 37 C, sous agitation.

STADE 3 : Culture en fermenteur L'objet de cette étape est de réaliser en fermenteur, dans des conditions définies, une culture bactérienne de teneur supérieure ou égale à 109

germes /ml, pour permettre l'extraction ultérieure d'une quantité de produit satisfaisante.

Pour cela, la suspension de germes contenue dans le fermenteur de 35 # est transférée dans un fermenteur de 600 litres contenant le milieu de culture en fermenteur décrit plus haut, auquel on a ajouté 5 kg de glucose. Comme pour la préculture de 35 litres, des cuves satellites contenant respectivement une solution stérile d'hydroxyde de sodium 10 N et une solution stérile d'acide orthophosphorique dilué au '/2 sont utilisées pour la régulation du pH aux alentours de 6,5, ainsi qu'une cuve satellite contenant une solution stérile d'anti-mousse. La culture est réalisée pendant environ 7 heures, à 37 C 1 C, sous agitation.

STADE 4 : Fin de culture et addition des agents lysants Ce stade a pour but d'inactiver la culture par l'action d'agents lysants et chauffage de 55 à 75 C pendant une durée supérieure ou égale à 40 minutes. Pour cela, les agents lysants utilisés sont les suivants : - solution stérile de polysorbate 80, - solution stérile d'EDTA, - solution stérile de chlorydrate de lysozyme.

En fin de culture, le pH est amené à 5,8 0,3 à l'aide d'une solution stérile d'acide orthophosphorique, puis les agents lysants ci-dessus sont transférés dans la culture.

Le contenu du fermenteur est ensuite porté à la température de 65 C 10 C et maintenu pendant au moins 40 minutes à cette température sous agitation.

Le biolysat obtenu est alors transféré dans une cuve de lyse industrielle (préchauffée à 65 C 10 C), et maintenu à cette température pendant au moins 20 minutes, avant d'être ramené à 37 C 2 C.

STADE 5 : Lyse L'étape de lyse consiste à rompre la paroi des bactéries par voie enzymatique, ce qui entraîne la libération des constituants cytoplasmiques des cellules microbiennes. Elle est effectuée en maintenant la suspension prélysée du stade précédent, à 37 C 2 C, dans la cuve de lyse au moins pendant 6 jours STADE 6 : Tamisage moléculaire et concentration Dans cette étape, le volume de lysat brut est réduit de moitié pour diminuer la quantité à traiter aux stades suivants. La concentration s'effectue par exemple sur un ultrafiltre équipe de cartouche filtrante de type CARBOSEP d'un seuil de coupure de 20 à 100 kDa, éliminant ainsi les petites molécules non liées.

STADE 7 : Lyophilisation du lysat Afin d'obtenir le lysat brut issu du stade 6 sous forme solide permettant les extractions ultérieures aux solvants, une opération de lyophilisation est réalisée immédiatement après le stade de concentration. On obtient ainsi une poudre brune, collante au toucher.

STADE 8 : par l'acétone: Le lysat de LCOS 1013 lyophilisé, issu du stade 7, contient des lipides que l'on élimine partiellement par l'extraction solide-liquide, en utilisant de l'acétone à température ambiante. Le produit est récupéré par centrifugation, puis séché.

STADE 9 : Extraction par le méthanol : Après extraction à l'acétone, le produit obtenu au stade 8 contient encore des lipides résiduels et des pigments que l'on élimine par extraction solideliquide, en utilisant du méthanol à température ambiante.

Le produit est récupéré par centrifugation, puis séché.

STADE 10 : Remiseen solution "L'extrait méthanol" issu du stade 9 est remis en solution aqueuse, pour permettre l'isolement ultérieur du produit par centrifugation et ultrafiltration.

STADE 11 : Centrifugation L'extrait brut en suspension issu du stade 10 contient des protéines dénaturées et des matières insolubles dans l'eau que l'on élimine par centrifugation.

Le produit centrifugé est d'aspect légèrement colloïdal et de couleur beige à brun.

STADE 12 : Ultrafiltration Ce stade représente l'étape essentielle de l'isolement du produit.

Le produit issu du stade 11contient des substances de différentes tailles moléculaires : sels minéraux, protéines, glycoprotéines, etc...

Les macromolécules de PM # 300000 constituant le produit sont isolées par ultrafiltration sur une membrane de seuil de coupure de 300 KD.

Le produit, une fois introduit dans la cuve de l'appareil, est véhiculé en permanence au moyen d'une pompe, dans un circuit fermé comportant un ultrafiltre. Le milieu est maintenu homogène au moyen d'une agitation. La pression créée par la pompe sur la membrane filtrante, oblige une partie du soluté à traverser cette membrane (perméat).

La partie retenue (rétentat), reste en circulation. Sachant que l'on opère à volume constant, la perte de volume est compensée en permanence par l'apport d'un même volume d'eau.

En fin d'opération la solution ultrafiltrée.

L'ultrafiltrat obtenu est une solution liquide translucide légèrement jaune.

STADE 13 : Filtration La clarification du surnageant de centrifugation obtenu au stade 11 est affinée par filtration sur membrane de rétention nominale de 1,2 m.

On obtient ainsi une "solution de glycoprotéines" opalescente, de couleur beige clair à crème.

STADE 14 : Lyophilisation Afin de permettre une bonne conservation du produit, la solution issue du stade 13 est ensuite lyophilisée, par un procédé comportant une étape de congélation, puis la lyophilisation proprement dite.

Les glycoprotéines lyophilisées ont l'aspect d'une poudre floconneuse de couleur blanche à crème, hygroscopique.

STADE 15 : Mélange Cette dernière étape a pour but d'homogénéiser les glycoprotéines lyophilisées issues du stade 14.

L'atomisation peut se substituer avantageusement à la lyophilisation et au mélange (LCOS 1014).

Exemple 2 : analyse du profil électrophorétique du nouvel extrait de Klebsiella pneumoniae LCOS 1013.

L'objectif de ces expériences est de comparer le profil électrophorétique du stade lyophilisé du nouvel extrait de Klebsiella pneumoniae (LCOS 1013) et du RU 41740, l'électrophorèse étant réalisé sur gel SDS-PAGE.

1) Matériels et réactifs - Gel de polyacrylamide 8 - 16 % Tris-Glycine, 1,5 mm, 15 puits (NOVEX, réf. : EC60485) ; - Marqueurs standards (NOVEX, réf. : LC5677) ; - Tris-Glycine SDS sample buffer (2x) (NOVEX, réf. : LC2676) ; - Tris-Glycine SDS running buffer (1 Ox) (NOVEX, réf. : LC2675) ; - Solution de séchage (NOVEX, réf. : LC4025) ; - Générateur LKB 2303 Multidrive XL (2WL57).

2) Produits testés Les produits testés sont le RU 41740 (puits 2 et 3), le LCOS 1013 (puits 9 et 10), ainsi que des produits intermédiaires de la fabrication du LCOS 1013, à savoir le LCOS1012 (correspondant au produit obtenu à l'issue du stade 11 du procédé décrit dans l'exemple 1) (puits 7 et 8) et le LCOS1014 (stade atomisé) (puits 4 et 5).

3) Résultats Le profil électrophorétique comparé des différents produits est montré à la figure 2.

La comparaison du puits correspondant au RU 41740 (puits 2 et 3) et des puits correspondants au LCOS 1013 (puits 9 et 10) permet de constater les différences suivantes entre les deux produits : - Le RU 41740 présente un triplet de bandes comprises entre 97,4 et
66,3 Kd, triplet qui se réduit en un doublet pour le LCOS 1013 ; - Le RU 41740 présente un second triplet de bandes comprises entre
55,4 et 36,5 Kd, triplet qui est également présent dans le LCOS 1013 mais dont les deux premières bandes ont une intensité inférieure dans le LCOS 1013 par rapport aux bandes du même triplet dans le RU
41740.

Afin d'affiner et de quantifier cette analyse, l'ensemble des pistes du gel ont été scannées puis analysées par le logiciel ONE-SCAN.

Pour chacune des bandes de chaque piste sont calculés les paramètres suivants : - % du RF ; - amplitude ; - intensité (Int OD) ; - % de l'intensité relative (% Int OD).

L'analyse des données concernant les pistes 3 (RU 41740 lot n 457) et 10 (LCOS 1013) figure dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous.

Tableau 1 : Analyse densitométrique des bandes de poids moléculaire 97,4 Kd / 66,3 Kd et 55,4 Kd / 36,5 Kd apparaissant sur le gel de la figure 2.

TRIPLET 2 TRIPLET 1

"#" ### ### -~~~ oO 3 3 C3 C3 3 , 3 - I 3:n! 3:00 00 -00 ........... ;::: ................ ;::: ............ ;::: .., ............. ;::;: .., ............ ;::;: ............. ;::;: .., - "'tJ co - 0 0 co - Oco - Oco - C) 0 CL CD m OOo.;:o 000.;0:;' 0.;:0:;' 000.;:0:;' OOmg. 00(Dg. CDO<DQ. OOo. aoO- Ooë'Q.o ####? 0 ####? 0 ####- ) ####-<0 )# m 3 O ooeooo 00 00 00 00 00 w --....1 CD -CD --4 -0> -01 (à -5! W GJ - W S o S v# "'c..> N N N U1 Pli --4 -4 C) 00 w OD ..J O) -....10 ~ ~ ~ ~ 0, 3 , 3 3:g! 5: W - o 5::n! 3:g! 00 0 0 C: co- co- co- Oco- \ S1 CL 0 0 a- 000- 0 0 CL 0 0.;:0:;' ôôm m m 000 000 s - 0 0 00 00 00 00 00 e..> 0 --....1 --0) --0> -01 -01 CD CD CD C) 0000) 5gë Co -rj -0 oggé .PU7'p" Co w CD OD cn - CD - CD -4 -> Co ID01- i Se.

CD CD cri (O OD ID 0> 01 -....I oo tj p6 OD

Tableau 2 : Analyse densitométrique des bandes de poids moléculaire inférieur à 36,5 Kd apparaissant sur le gel de la figure 2.

PISTE <SEP> N <SEP> 3 <SEP> PISTE <SEP> N <SEP> 10
<tb> RU <SEP> 41740 <SEP> LOT <SEP> N <SEP> 457 <SEP> LCOS <SEP> 1013
<tb> Bande <SEP> n <SEP> 19 <SEP> Bande <SEP> n <SEP> 21
<tb> % <SEP> Rf <SEP> 79,9 <SEP> % <SEP> Rf <SEP> 77,4
<tb> Amplitude <SEP> 0,206 <SEP> Amplitude <SEP> 0,139
<tb> Int <SEP> OD <SEP> 1,085 <SEP> Int <SEP> OD <SEP> 0,575
<tb> % <SEP> lnt <SEP> OD <SEP> 23 <SEP> % <SEP> Int <SEP> OD <SEP> 15,6
<tb> Bande <SEP> n <SEP> 20 <SEP> Bande <SEP> n <SEP> 22
<tb> % <SEP> Rf <SEP> 82,2 <SEP> % <SEP> Rf <SEP> 79,6
<tb> Amplitude <SEP> 0,217 <SEP> Amplitude <SEP> 0,164
<tb> Int <SEP> OD <SEP> 0,803 <SEP> Int <SEP> OD <SEP> 0,715
<tb> % <SEP> Int <SEP> OD <SEP> 17 <SEP> % <SEP> Int <SEP> OD <SEP> 19,4
<tb> Bande <SEP> n <SEP> 21 <SEP> Bande <SEP> n <SEP> 23 <SEP>
<tb> % <SEP> Rf <SEP> 87,9 <SEP> % <SEP> Rf <SEP> 85,1
<tb> Amplitude <SEP> 0,0924 <SEP> Amplitude <SEP> 0,0628
<tb> Int <SEP> OD <SEP> 0,4715 <SEP> Int <SEP> OD <SEP> 0,337
<tb> % <SEP> Int <SEP> OD <SEP> 10 <SEP> % <SEP> Int <SEP> OD <SEP> 9,2
<tb> Bande <SEP> n <SEP> 22 <SEP> Bande <SEP> n <SEP> 24
<tb> % <SEP> Rf <SEP> 92,1 <SEP> % <SEP> Rf <SEP> 90
<tb> Amplitude <SEP> 0,181 <SEP> Amplitude <SEP> 0,193
<tb> Int <SEP> OD <SEP> 0,703 <SEP> Int <SEP> OD <SEP> 1,082
<tb> % <SEP> Int <SEP> OD <SEP> 14,9 <SEP> % <SEP> Int <SEP> OD <SEP> 29,4
<tb>
Une dissymétrie dans la migration du gel fait que les pourcentages Rf de chacun des marqueurs en piste 6 sont supérieurs aux pourcentages Rf de chacun des marqueurs déposés en piste 11 d'environ 3 %. Cette dissymétrie a été prise en compte pour établir une correspondance entre les bandes des pistes considérées, c'est-à-dire la piste 3 (RU 41740) et la piste 10 (LCOS 1013). Ainsi, par exemple, la bande n 13 de la piste 3 (pourcentage Rf = 52,8) et la bande n 15 de la piste 10 (pourcentage Rf = 49,8) correspondent toutes les deux à la première bande du premier triplet.

Le tableau 1 résume les résultats obtenus pour les bandes de poids moléculaire compris entre 97,4 KDa et 55,4 KDa : a) TRIPLET 1 :
L'analyse de l'intensité relative de chacune des bandes composant ce triplet montre que : - la première bande de ce triplet présente dans le RU 41740 est quasiment inexistante dans le LCOS 1013 ; - la deuxième bande de ce triplet est présente dans le RU 41740 avec une intensité 2 fois moindre par rapport à celle présente dans le
LCOS 1013; - la troisième bande de ce triplet est présente dans le RU 41740 avec une intensité 2 fois supérieure à celle présente dans le LCOS 1013. b) TRIPLET 2 :
L'analyse de l'intensité relative de chacune des bandes composant ce triplet montre que les deux premières bandes composant ce triplet sont pratiquement inexistantes dans le LCOS 1013 en comparaison avec les deux premières bandes du triplet 2 du RU 41740.

Le tableau 2, qui concerne les bandes de poids moléculaire inférieur à 36,5 KDa, révèle qu'aucune différence significative n'apparaît entre les bandes correspondant au LCOS 1013 et au RU 41740.

Les profils électrophorétiques du RU 41740 et du LCOS 1013 présentent donc plusieurs différences, ce qui indique que la composition de ces deux produits est différente.

Exemple 3 : Comparaison de l'activité immunologique du LCOS 1013 et du RU 41740.

L'objectif de ces expériences est de mesurer la similitude antigénique entre les deux produits.

Pour cela, la réactivité d'anticorps produits contre le RU 41740 a été mesurée de façon comparative vis-à-vis du RU 41740 et du LCOS 1013.

Cette réactivé a été mesurée en mesurant la lumière diffusée par un précipité formé au cours de la réaction antigène-anticorps en milieu liquide, suivant la technique.

Selon cette technique, la réactivité observée vis-à-vis d'un produit B identique à un produit A contre lequel les anticorps ont été obtenus doit être supérieure ou égale à 75 % de la réactivité observée vis-à-vis du produit A ; dansle cas contraire, cela traduit une composition chimique et/ou structurale différente entre les deux produits.

Matériel et réactifs - Néphélomètre ICS référencé 2 WF 19 ; - Carte M33 ; - Sérum anti-SB4 à 6 % ; - Référence SB5, pentes = 0,995 RS 02 dosages = 0,956 RS 02 Résultats Les résultats obtenus à concentration égale et sur produit sec (teneur en eau de 4,0 %) montrent que la réactivité des anticorps anti-RU 41740, vis- à-vis du LCOS 1013, est seulement de 33 % par rapport à leur réactivité vis-à-vis du RU 41740. Ceci traduit une différence de structure antigénique significative entre les deux produits.

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Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'extraits bactériens à partir de germes capsulés, comportant les étapes suivantes : a) culture des bactéries, b) lyse des bactéries, c) premier tamisage moléculaire, avec concentration, d) lyophilisation du concentrat e) extractions par des solvants organiques, f) remise en solution, g) centrifugation, h) deuxième tamisage moléculaire, i) filtration, j) lyophilisation
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries sont des Klebsielles, de préférence des Klebsiella pneumoniae.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la culture des bactéries est effectuée à pH inférieur à 6,7.
4. Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que au moins 90% des bactéries sont lysées à l'issue de l'étape b).
5. Procédé selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape de lyse des bactéries a une durée comprise entre 4 et 8 jours.
6. Procédé selon les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la lyse des bactéries est effectuée sans ajout d'agent lysant comportant un composant antiseptique.

<Desc/Clms Page number 23>
7. Procédé selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le pH de la culture issue de l'étape a) est ramené à une valeur inférieure à 6 avant l'ajout des agents lysants.
8. Procédé selon les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape c) conduit à une concentration d'un facteur compris entre 1,5 et 3 de la suspension bactérienne lysée issue de l'étape b), et de préférence d'un facteur 2.
9. Procédé selon les revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'étape c) conduit à l'élimination des petites molécules non liées, avec un seuil de coupure à 20 kDa, 50 kDa, 70 kDa, ou 100 kDa.
10. Procédé selon les revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'étape e) comporte une extraction par une cétone et une extraction alcoolique.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape e) comporte une extraction par l'acétone et une extraction par le méthanol, le volume utilisé pour chacun de ces solvants étant proportionnel à la masse de lyophilisât issu de l'étape d).
12. Produit susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Composition pharmaceutique comportant un produit selon la revendication 12, et destinée à favoriser la maturation des cellules dendritiques.
14. Produit susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape c) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
15. Composition cosmétique comportant un produit selon la revendication

14.

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16. Composition destinée à un usage vétérinaire, caractérisée en ce qu'elle comporte un produit selon la revendication 14.