CA2531208A1 - Compose adjuvant de l'immunite comportant une sequence adenivirale ef - Google Patents

Abstract

L~invention concerne un composé peptidique adjuvant de l~immunité consistant en : - un polypeptide (i) comprenant une séquence d~acides aminés de 30 acid es aminés de longueur contenue dans le domaine « tête » de la protéine « fibre » de la capside d~un adénovirus, ladite séquence d~acides aminés comprenant l~enchaînement d~acides aminés formant la structure en double feuillet .beta . désignée « EF » contenue dans ledit domaine « tête » ; ou - un peptide (ii) analogue dudit polypeptide (i) dont la séquence en acides aminés comporte, p ar rapport à la séquence dudit polypeptide (i), au moins une substitution ou au moins une délétion d~un acide aminé, ledit peptide analogue conservant ladit e structure en double feuillet .beta. désignée « EF ».

Description

DEMANDES OU BREVETS VOLUMINEUX
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Nouveau composé adjuvant de l'immunité, compositions le contenant et procédés mettant en aeuvre ledit composé adjuvant S D~MAINE DE L'INVENTI~N
La présente invention se rapporte au domaine des composés adjuvants de l'immunité, c'est-à-dire des composés capables d'induire une augmentation de la réponse immunitaire à l'encontre d'un antigène, afin d'augmenter l'efficacité de la stimulation de la réponse immunitaire par une composition immunogène, ou encore d'augmenter l'efficacité
préventive ou thérapeutique d'une composition vaccinale.
ETAT DE LA TECHNIQUE
~e manière générale, les composés ou compositions ayant une fonction d'adjuvant de l'immunité sont utiles pour améliorer les conditions de stimulation d'une réponse immunitaire à l'enc~ntre des antigènes.
classiquement, les composés ou les compositions adjuvants de l'immunité sont utilisés pour augmenter la quantité d'anticorps produits à
l'encontre d'un antigène déterminé, ou pour augmenter la quantité des cellules T effectrices produites, qu'il s'agisse de cellules T auxiliaires («
T
helper ») ou de cellules T-cytotoxiques.
En général, l'association d'un antigène avec pan composé ou une c~mposition adjuvant de l'immunité, outre le fait d'accroitre le niveau de la rép~nse immunitaire, par une plus grande production d'anticorps ou de

2~ ccll~.~les T effectrices spécifiq~a~~ de l'antigéne, permet également de rèd~aire la quantité d'antigéne incluse dans une composition ir~~munog~r~~:
ou vaccinale, et, le cas échéant, de réduire la fréq~aenccs d'injection de Isuite composition immunogène osa vaccinale.
L'association d'un adjuvant de l'immunité avec l'antigéne d'intérèt est en particulier requise lorsque les propriétés d'immunogénicité de cet antigène d'intérét, lorsqu'il est administré sans adjuvant, sont insufFisantes pour stimuler une réponse immunitaire efficace compte-tenu des objectifs d'immunisation poursuivis.
aelon leur nature, les composés ou compositions adjuvants de ~~ l'immunité induisent une meilleure réponse immunitaire à l'encontre d'un antigène d'intérët selon des voies distinctes. Certains adjuvants de l'immunité agissent sur le système immunitaire en induisant une production plus efficace d'anticorps à l'encontre de l'antigène d'intérët, par exemple en activant les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules B et les cellules T, ou en améliorant les conditions dans lesquelles l'antigène d'intérët est présenté aux différentes cellules immuno-compétentes.
Les composés ou compositions adjuvants de l'immunité peuvent augmenter la réponse immunitaire en prolongeant la durée de libération de l'antigène d'intérët, en augmentant la quantité d'antigène absorbée par les cellules présentatrices de l'antigène, en régulant positivement l'apprëtement de l'antigène (cc Antigen Processing >a) par ces cellules, en stimulant la libération des cyfiokines, en stimulant la commutation isotypique (ce Isotypic switching ») et la maturation des cellules B et/ou en éliminant les cellules immuno-suppressives.
Parmi les différents composés ~~a compositions adjuvants de l'immunité, ceux: qui permettent une meilleure présentation du ou des antigènes d'intérëfi auzc cellules immuno-compétentes, et fiout particulièrement aux lymphocytes T auxiliaires (cellules cc T Helper » ou c< C~4.+) >a ou aux lymphocytes T-cytotoxiques (cellules cc CTL » ou ce CD~+ »), revëtent un grand intérët pour la mise au point de compositions immunogènes ou de compositions vaccinales efficaces.
Les cellules du système immunitaire qui apprëtent les antigènes en les fragmentant en peptides, puis en présentant ces peptides, en association 2~ ~~~c les m~léc~alps aléa compl~;~ae majeur d'histoc~rnpatibilité (Cié9il-I) aie classe I osa de classe II, s~nt essentïellernent les r~aacro~ahage~ et les cellules dendrïtiq~aes. Les cellules dendritiques sont capables d'apprèter les antigènes, pais de ~arc.~ser~ter les pe~ati~âes issus de l'apprëtemr~nt cles antigènes auzé cellules T naïves. Les cellules r9enc~rifiiq~aes activent les cellules T de manière plus efficace que n'importe quelle autre cellule présentatrice de l'antigène. Elles sont de plus requises pour l'activation initiale des cellules T naïves, que ce soit in vifro ou in vivo.
Les cellules dendritiques sont généralement présentes, dans l'organisme, è des localisations exposées aux antigènes étrangers, tels ~5 gue la lae2~~a, le foie, l'intestin, le sang et les tissas lymph~ïc~es.

3 Globalement, les cellules dendritiques sont classées selon quelles sont à
un stade immature ou à un stade mature. Les cellules dendritiques matures sont capables de capter les antigènes par endocytose et de les appréter de manière efficace, et également d'exprimer de hauts niveaux de molécules co-stimulatrices, telles que les molécules CD40, CD80 et CD86, ainsi que les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité
(CMH) HLA-DR. De plus, les cellules dendritiques matures expriment le marqueur CD83 et sécrètent de hauts niveaux de diverses cytokines et chimiokines qui agissent en tant qu'auxiliaires à l'activation des cellules T.
~utre leur rôle d'activation des cellules T naïves, les cellules dendritiques matures peuvent également influencer l'équilibre de la réponse immunitaire Th1/Th2. Diverses éfiudes ont indiqué que les cellules dendritiques activent préférentiellement les réponses de type Thl, vraisemblablement grâce à la sécrétion d'IL-12 par les cellules dendritiques activées. (Macatonia et al., 1995, J. Immunol., vo1.154 :5071 ; Hilhens et al., 1997, blond, vo1.90 : 1920). Toutefois, de nombreux travaux ont montré que les cellules dendritiques peuvent induire indifféremment la génération de clones de cellules Th1 ou Th2.
(Ruth et al., 1996, Scand. J. Immunol., vo1.43 :646).
Le rôle important joué par les cellules dendritiques dans la présenfiati~n de l'antigène et l'activation des cellules T a suscité un grand inférât en vue d'utiliser ou d'activer des cellules dendritiques en immunothérapie. L'activation ou l'obtention de cellules dendritiques m~fi~are.~ re~éfi pan infiérét p~rkic~alièr~men~k imporkant dans le domaine dPs vaccins ek de l'in~munoth~rapie des cancers.
Dans l'c~tat de I~a fiechniq~ae, pan a n1~ntré q~ae les acides n~acléia~saes coni~enanfi des séquences d'cligorl~aclc~ctides dP t~,?pe Cp~ Pfiaient capables d'induire la n~at~arafii~n des cellules dendrifiiq~aes. I~écemr~~ent, on a aussi utilisé des cellules dendritiques autolcgues obtenues à parkir de patienfis cancéreux dans le cadre d'immunothérapie des cancers, comme cela est décrit notamment dans la demande PCT publiée sous le N~W~ 98/23728. II a aussi été montré que des composés chimiques contenant un système cyclique choisi parmi les systèmes cycliques du type imida~~g~ain~line, imida~~apyridine, cycl~allzylimida~~~ayridine,

4 imidazonaphthyridine ou imidazotétrahydronaphthyridine, étaient capables d'induire ire v~fro la maturation de cellules dendritiques immatures, comme cela est décrit dans le brevet US N°6,558, 951.
II existe un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux composés adjuvants de l'immunité capables d'activer les cellules dendritiques et d'induire leur maturation, en vue d'obtenir une réponse immunitaire de haut niveau à l'encontre d'un antigène d'intérët, que ce soit par la production d'une grande quantité d'anticorps spécifiques de cet antigëne d'intérêt, ou que ce soit par la stimulation de la prolifération de cellules T auxiliaires ou de cellules T-cytotoxiques spécifiques de cet antigène d'intérêt.
S~MMAIRE DE L'IN1/ENTI~N
Selon la présente invention, il a été caractérisé une nouvelle famille de composés adjuvants de l'immunité, du type peptide, qui activent les cellules dendritiques et induisent la maturation de cellules dendritiques immatures.
Les composés adjuvants de l'immunité selon l'invention sont dérivés du domaine tête ( hnob ») de la protéine ee fibre >a (<c fiber protein ») de la capside d'un adénovirus.
Plus précisément, l'invention a pour objet un composé adjuvant de l'immunité consistant en - un p~lypeptide (i) comprenant une séquence d'acides aminés de ~0 acides aminés de I~ngueur c~ntenue dans le domaine « tête a2 de la '~~ ~ar~atPin~ ~c fibre ~~ de la c~p~i~3e d'an ~déno~ir~as9 I~c~ite ség~aence d'dcid~~ ~rr~in~s com~ar~n~mt l'~nchainon~~ct râ'~uidc~s ~r~~inc~~ f~rm~nt la str~sct~are en d~~able feuillet ~i désignée eQ EF ~~ c~nten~ae dans I~c~it al~r~n~ine ~~ tëte ~~ ; ou - un peptide (ü) anal~gue d~ac~it pol~ppeptir3e (i) c~~nt la sé~,~aenr~e en acides aminés comporte, par rapport à la séquence dudit polypeptide (i), au moins une substitution ou au m~ins une déléti~n d'un acide aminé, ledit peptide analogue conservant ladite structure en double feuillet ~i désignée ec EF ».

L'invention concerne aussi une composition adjuvante de l'immunité comprenant un composé adjuvant tel que défïni ci-dessus, en association avec au moins un excipient physiologiquement compatible.
Elle a également trait à une composition immunogène ainsi qu'à

5 une composition vaccinale comprenant un composé adjuvant tel que défini ci-dessus, en association avec au moins un antigène d'intérêt.
L'invention est également relative à un procédé pour la maturation in vitr~ des cellules dendritiques immatures humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) cultiver in vifro une population de cellules enrichies en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, dans un milieu de culture approprié ; et b) incuber les cellules cultivées à l'étape a) avec un composé
adjuvant ou une composition adjuvante telles que définies ci-dessus, pendant une durée suffisance à induire la maturation des cellules dendritiques.
L'invention concerne aussi une population de cellules enrichie en cellules dendritiques matures, susceptibles d'ètre obtenues par le procédé de maturation ci-dessus.
L'invention a également pour objet une composition adjuvante de l'immunité, caractérisée en ce qu'elle comprend une population de cellules dendritiques matures obtenues selon le procédé de maturation ci-dessus.
L'invention est également relative à un procédé pour stimuler é~
~~i~'~~ des cellules T spécifiques de l'antïgéne, caractérisé en ce gu'il c~rnprend les ~t~pc~s ~ui~~:nte a) oE~tenir une p~~Zulatiran de cellules enrichies en cellules ~len~3ritïq~aes m~t~ar~~s ~a~r le ~arccéa9é rie m~tur~ti~an ci-~less~as ;
b) ~rettre en c~nt~ct I~ p~pulati~n râe cellules enrichies en cellules dendritiques matures obtenues à l'étape a) avec une population de cellules enrichies en cellules T provenanfi du méme individu, homme ou animal.

6 DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : schéma de la structure de la protéine fibre chez des virions d'adénovirus de sérotype 5, respectivement sauvages (figure 1A) et des virus dépourvus du domaine ee tâte » (figure 1 B).
La protéine fibre de l'adénovirus comprend trois domaines structurels, en partant de l'extrémité N-terminale jusqu'à l'extrémité G-terminale : La « queue » qui est liée de manière non-covalence à la partie e< penton base »; la ee fiige » et le domaine <e tâte » se liant au récepteur GAR, qui est responsable de l'attachement de l'adénovirus aux cellules permissives. L'adénovirus sauvage de sérotype Ad5 p~ssède des e< fibres » comprenant une longue e< tige » possédant ~2 répétitions du motif en feuillet (i. Avec le vecteur mutant dépourvu du domaine « tëte utilisé selon l'invention (AdE1 ° D lcnob, voir figure 4G), la <c tige » de la protéine fibre est plus courte, avec sept répétitions du motif en feuillet (3 et se terminent par un motif de trimérisati~n suivi d'an codon stop ce opale ».
Figure ~ : effet des composants de capside de l'adénovirus sur le phénotype des cellules dendritiques.
Les cellules dendritiques ont été cultivées dans le milieu de culture seul (NS ; cellules dendritiques non stimulées), ou en présence des protéines purifiées de l'adénovirus Ad5 (1 Ng par 106 cellules), ou de LPS
(1 iag~ml) ; puis ont été caractérisées pour leur ezcpression du marqueur G~11c et des marqueurs de maturation spécifique des cellules 2~ d ~n~3ritiq~aes.
Figure ~~ : c~ll~al~s d~ndritiq~aes c~alti~é~s ~~ar~c I~~~ et I~b (penton base lié à la fibre) isralées à partir e1e cellules HeLa infectées par l'adeneavlrus ~~150 Figure G~ : cellules denc~ritiq~aes cultivées avec des pr~téines recombinantes F9a~, Pb ou Fi purifiées à partir de cellules ~fg infectées par un baculovirus, ~u avec une protéine Pn (penton) purifiée à partir de cellules HeLa infectées par l'adénovirus AdS.
Les valeurs d'intensité moyenne de fluorescence (MFI) sont apparentes sur les différents panneauae de la figure ~A et apparaissent

7 PCT/FR2004/050308 en ordonnées sur la figure 1 B. Les résultats présentés sont représentatifs de trois essais indépendants.
Figure 3 : effet dose-dépendant de la protéine téta de fadénovirus Ad5 sur la maturation des cellules dendritiques.
Les cellules dendritiques ont été incubées en l'absence e< cellules dendritiques non stimulées, NS » ou en présence de 1 Ng de protéine Fi ou de protéine du domaine tête (figure 3A), oû les cellules dendritiques ont été incubées avec des quantités déterminées de protéines Fi et Hx (respectivement 1 pg) et des concentrations variées de protéines téta (dans une gamme allant de 0,5 à 0,02Ng) (figures 3B, 3C).
Les cellules dendritiques et les surnageants de culture ont été
reeueillis et testés comme indiqué ci-dessous. Pour la figure 1A, les cellules dendritiques ont été caractérisées pour l'expression du marqueur CD1lc et les marqueurs de maturation. Les pourcentages de cellules DDllc+ et les valeurs moyennes d'immunofluorescence (MFI) pour les marqueurs de maturati~n ~nt été représentées.
Pour la figure ~~, des nombres cr~issants de cellules dendritiques ont été utilisées comme canules stimulantes, avec des cellules T ~D4+
allogéniques purifiées. Les valeurs de proliférati~n cellulaire, testée par incorporation de 3H-thymidine, est exprimée en cpm (moyenne de trois essais ; m ~ SD).
Pour la figure ~~, les quantités de IL1~ p70 et de TNFe ont été
déterminées par une technique ELI~A à partir de surnageant de culture des cellules dendritiques, et les résultats ont été e~aprimés en 2~ n~nogr~mme per 106 c~ll~ales. Les données s~nt reprPsentatives d'~~a nr~ain~ tr~is essais indépendants et les valeurs, ale ~âé~,~i~tiori standard ( aD), situées dans la fourchette de 1 ~~9~ des valeurs mo~~ennes, ne suant ~a~s représpr~tées.
Figure ~~ : preuve d'une interaction directe entre I~ protéine du domaine téta et les cellules dendritiques, et preuve de la nécessité du domaine tëte dans la maturation des cellules dendritiques induites par l'adénovirus AdS.
Pour la figure 4A, des cellules dendritiques purifiées à l'aide de billes magnétiques recouverkes d'anticorps anti-CD11 c ont été stimulées 3~ ae~c~c ~,~~ag de pr~téine du d~maine téta ; des cellules dendritig~aes

8 purifiées non stimulées (NS) ont été utilisées comme témoins. En abscisse, on a représenté les pourcentages de cellules CDllc+ et les valeurs moyennes d'immunofluorescence (MFI) pour les marqueurs de maturation.
Pour la figure 4B, les cellules dendritiques ont été stimulées avec 1 pg de protéine Fi (protéine fibre complète), puis incubées avec des anticorps monoclonaux de souris anti-domaine queue de la protéine fibre (anti-Fi-tail). Le pourcentage de cellules fluorescentes ayant fixé la protéine fibre a ëté déterminé après soustraction de la fixation non spécifique d'anticorps monoclonaux anti-Fi sur des cellules dendritiques non stimulées (NS-DC).
Pour la figure 4C, les cellules dendritiques n'ont pas été stimulées (NS), ou ont été stimulées avec, respectivement, soit le virus Ad5E1 °
portant une protéine fibre sauvage (WT-Fi-Carrying Ad5E1°) ou avec le vecteur Ad5E1°D Icnob dépourvu du domaine téta, à raison de 1x104 particule par cellule. Sur les hist~o~rammes, s~nt représentées les valeurs moyennes d'immunoflu~rescence (fi~Fl) pour les marqueurs de maturation des cellules CDllc+. Les rësultats prësentës sont représentatifs de deux essais indépendants.
Figure 5 : absence d'expression du récepteur CAR sur les cellules dendritiques et faible permissivité des cellules dendritiques vis-à-vis de l'infection par fadénovirus de sérotype 5 .
Des cellules dendritiques immatures isolées avant toute stimulation ont été incubées avec du liquide d'ascite contenant des 2~ anticorps m~noclon~~a~~ anti-~'~F~ (ligne Pn gras), ~~a avec pan lig~aide d°ascite n~n appsren-&è (li~n~ en gris).
Les cell~al~s dendriticl~a~s ~nt été analysées par cytométrie de fl~a~~
(F~~S). LP, cellules I-IeLü et CHC ~~n$ cté ~a~~ilis~~°e resppchie~ement comme térrn~ins positifs et ncgatifs.
Figure ~ : cartographie de la région du d~maine tâte de la Vibre impliquée dans la maturation des cellules dendritiques.
Figure 6A : représentation schématique de la structure conformationnelle du domaine tâte de la protéine fibre de l'adénovirus Ad5 (fia et al., 199.).

9 Ce diagramme montre les différentes régions A à J ayant une structure de feuillet [3 ainsi que les boucles de liaison respectives AB, CD, DG, GH, HI et IJ.
Sur la ligne supérieure on a indiqué la numérotation des acides aminés, en partant du résidu méthionine N-terminale de la protéine fibre complète de l'adénovirus AdS. Les régions du domaine tëte de la protéine fibre interagissant avec le récepteur CAR sont représentées sous la forme de boites noires pleines sur la ligne inférieure de la figure.
La figure 6B est une représentation linéaire des différents mutants de délétion du d~maine tâte de la protéine fibre de l'adénovirus AdS. La séquence du domaine téta est indiquée par des boites pleines ; les régions délétées sont indiquées sous la forme de lignes fines.
Pour la figure 6C , on a utilisé, c~mme cellules stimulantes vis-à
vis de cellules TCD4+ allogéniques purifiées, respectivement, des cellules dendritiques non stimulées (NS), des cellules dendritiques stimulées avec des eactraits sans téta domaine (plis ; cc mocl~-stimulated ~a), ou des cellules dendritiques stimulées a~rec la pr~téine du domaine tâte sauvage (ee Ion~b ~T ») ou avec des mutants de déléti~n du domaine tâte de la protéine fibre. Les résultats présentés c~nsistent en des moyennes de trois essais séparés . Dans les résultats présentés, on peut noter que seul 0,5 Ng de protéine du domaine tëte ont été
utilisées, é comparer avec 2 ug de protéine mutante .
Figure ~' : les cellules dendritiques stimulées avec le domaine téta de la protéine fibre de l'adénovirus ~.d5 stimule irr viv~ des cellules ~~ TCI?~+ sp~~cifiq~ac~ la~aur le peptide antigénig~ae GP~~ dérive de la qlyc~2prct~in~ du L~i~'~.
La figure ~G~ ïllustre le rejet de cellules donneuses par des souris rece~Peuses~ q~acein~es avec les eell~ales dendritiq~~es . Des slalc~n~ac~~es de s~uris B5 marqués avec le CFSE (5-~-carbca~vyflucarescein di~c~t~te succinimid~pl ester) ont été chargés avec le peptide ~âi~~~, puis les splénocytes traités ont été transfusés dans des souris receveuses B6 qui ont été préalablement immunisées avec, respectivement, (i) des cellules dendritiques stimulées avec le domaine tâte de la protéine fibre (respectivement 2,5 ~ 105, g~ 1 O4 et 3~1 O4 cellules), chargées avec GP33 osa (ü) avec des cellules dendritiques chargées avec GP~3 (~,5 ~z X05 cellules) stimulées avec Pb ou Hx, ou non stimulées (NS), ou (iii) avec des cellules dendritiques chargées avec NP366 (2,5 x 105) stimulées avec le domaine tâte de la protéine fibre, ou (iv) avec le peptide GP33 en émulsion dans de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA).
5 Le niveau de rejet, exprimé en pourcentage, a été calculé dans le sang et dans la rate à différents moments après le transfert cellulaire adoptif.
La figure 7B représente la sécrétion d'IFNry ex vivo par les mêmes souris que pour la figure 7A . Des cellules de rate et des lymphocytes du

10 sang périphérique (PBL) fraichement isolés ont été incubés pendant 20 heures avec le peptide GP33; évaluation du nombre des cellules spécifiques du GP33 sécrétant de l'IFNry par un test Elispot IFN-y:; les résultats sont exprimés en SFC ('°spot forming colony")/105 cellules T
CD3+( moyenne de test réalisé en triple ~ SD). Chaque spot correspond à une cellule sécrétant l'IFNry.
La figure 7~ illustre l'activité cytolytique de cellules efFectrices dérivées de souris vaccinées avec des cellules dendritiques (3 ~a 104.
cellules) et non stimulées ou stimulées avec le domaine tâte de la protéine fibre de fadénovirus AdS. Aprés une stimulation de 4 jours i~
vifro avec le peptide GP33, les cellules de rate ont été incubées avec les cellules cibles EL4 marquées au S~Cr puis chargées avec le peptide GP33 ou le peptide NP366, dans un test de relarguage de chrome seules les activées spécifiques du GP33 lyseront les cibles (~~ Gr).
J ~~ ~ E~9'fI~i'~
Sel~n l'in~,~enti~n, ~n ~ montré que le d~maine téta de la Protéine filare dc c~~aeicle d'an adén~~ir~as est capable d'interagir directement ~~~ec des cellules dendritig~aes immatures cet de prcw~q~aer leur ~mtivati~n et leur maturation en cellules dendritiques matures.
Les adénovirus se présentent comme des par(:icules de forme icosaédrique de 70 à 100 nanomètres de diamètre, selon le sérotype. La capside virale comprend deux éléments constitutifs majeurs, respectivement, (i) l'hexon (Hx) qui forme les faces et le penton (Pn) ~5 situé a~a~~ 12 sommets.

11 La base du penton (ou penton-base) est associée à la protéine fibre, qui est une projection spiculaire émanant de la base du penton, constituée d'un trimère de polypeptide IV. La fibre est une protéine de 581 à 587 résidus d'acides aminés pour les espèces d'adénovirus à
S fibres longues, comme les espèces C et A, et de 319 à 325 résidus d'acides aminés pour les fibres les plus courtes comme celles des adénovirus de sérotypes 3 et 7, appartenant à l'espèce B.
Les fibres sont toutes formées de trois domaines structuraux distincts, respectivement la queue, la tige et la tëte. La queue s'insère dans le penton-base. La tige est constituée de la répétition périodique d'un motif d'une quinzaine de résidus formant chacun une structure en feuillet ~3 . Le nombre des répétitions du motif unitaire définit la longueur de la tige, qui est variable entre les fibres des différentes espèces d'adénovirus. A l'extrémité C-terminale de la fibre se trouve une zone renflée, la tâte, qui est formée d'un trimère d'une séquence polypeptidique de 180 à 200 résidus d'acides aminés. Comme cela est représenté sur la figure 6~4, chaque monomère de tâte ~sssocie un squelette de huit feuillets ~ anti-parallèles reliés entre eue par des boucles dont la conformation varie c~nsidérablement selon les sérotypes.
Certains auteurs avaient démontré que l'adénovirus humain était capable de faire maturer les cellules dendritiques humaines et marines in ~ifro (I~ea et al., 99 ; Hirshowitz et al., 2000 ; i'~orelli et al., 2000 ;
F~ouard et al., 2000). Toutefois, ces observations forkuites de l'acti~sité des ~~ e~~.ck~~~ars ~dén~a~rir~u~ star la m~tiére e~t star les cellules dendritia~~a~s ne perrnetkaient pas d'identifier c~~aelle e~k~i~k la vcaie~ c1'~cti~a~ti~n e~k de maturati~an des cellc~les dendritiques. Ainsi, ces résultats ~antérie~ars ne ~aerniettaier~t lacs de déterr~~iner ~abjecti~emect g~ael était le n~éc~r~isme mt~léc~alaire d'activati~n et de niaturati~n des cellules dendritiques induit par l'adénovirus ni, a forkiori, le c~nstituant ou la combinaison de constituants de l'adénovirus susceptible d'en constituer le ou les agents) causals, notamment parmi les douze polypeptides majeurs constitutifs de la particule virale.
~n a désormais montré selon l'invention qu'un polypeptide constitué d'an fragment a~~a domaine tète de la protéine fibre d'an

12 adénovirus, ledit fragment comprenant la séquence d'acides aminés formant la structure en double feuillet ~ anti-parallèle désignée <c EF »
induit l'activation et la maturation de cellules dendritiques immatures.
Plus précisément, on a montré selon l'invention qu'un fragment peptidique du domaine téta de la protéine fibre d'un adénovirus comprenant la séquence d'acides aminés délimitant le feuilletai anti parallèle EF et délété dans d'autres régions peptidiques du domaine tâte, comme par exemple le feuillet ~i anti-parallèle <c HI », possède des propriétés d'activation et de maturation des cellules dendritiques immatures identiques à celles observées pour un polypeptide comprenant la séquence complète du domaine tâte de la protéine fibre dudit adénovirus.
En revanche, il a aussi été montré qu'un polypeptide constitué du domaine tâte de la protéine fibre et qui comprend la délétion de la séquence d'acides aminés formant la structure en feuillet (3 antiparallèle EF a perdu les propriétés d'activation et de maturati~n des cellules dendritiques immatures du domaine tète complet. Encore plus précisément, il a été montré qu'un polypeptide constitué du domaine tète et comprenant la déléti~n de deux acides aminés dans la région F du feuillet ~ antiparallèle EF ne possède pas les propriétés d'activation et de maturation des cellules dendritiques immatures qui sont observées avec un p~lypeptide comprenant la séquence d'acides aminés complète du domaine tète.
Ainsi, les résultats obtenus par le demandeur montrent qu'un 2~ pol~laeptide cons~,i~~~aé d'un fragment ~aeptidïq~ae d~a a~om~ine téta de la ~arotéine fibre d'ua ~dérmvir~a~, et quai crampread la séa~u~nc~ d'~ci~9~s aminés f~rmant la str~act~are ~n double fe~aill~t ~ antiparallèle EF, I~c~it ~ol~~aeptide ne cor~~prenent: pds les séquences d'acides aminés formant d'autres structures en feuillet ~ c~nten~aes dans Ire domaine téta, est capable d'induire l'activation ét la maturation des cellules dendritiques immatures.
Les résultats obtenus par le demandeur montrent que les propriétés d'activation et de maturation des cellules dendritiques immatures du domaine téta de la pr~téine fibre d'un adénovirus sont

13 portées par une petite région peptidique dudit domaine tête, les régions d'acides aminés formant la structure en double feuillet (i EF.
Le domaine tête de la protéine fibre de tous les adénovirus possède une structure commune constituée d'une succession de feuillets (3 reliés entre eux par des boucles peptidiques, similaires à celles du domaine tête de fadénovirus de sérotype 5 (Ad5) représentée sur la figure 6A.
Le demandeur a aussi montré que, au moins du point de vue des propriétés d'activation et de maturation des cellules dendritiques immatures, cette identité de structure du domaine tête de l'ensemble des adénovirus impliquait aussi une identité de fonction. Ainsi, on a montré
selon l'invention qu'un vecteur adénoviral comprenant des protéines fibres chimères constituées d'une queue et d'une tige provenant d'un adénovirus de sérotype 5 et un domaine tête provenant d'un adénovirus de sérotype 3 est capable également d'induire l'activation et la mat~arati~n des cellules dendritiqees immatures.
Les résultats ci-dessus ont permis aua~ demandeurs de définir une famille nouvelle de comp~sés adjuvants de l'immunité, dérivée du domaine tête de la protéine fibre d'un adénovirus, cette n~uvelle famille de composés adjuvants de l'immunité constituant un premier objet de l'invention .
L'invention a pour ~bjet un composé adjuvant de l'immunité
consistant en - un polypeptide (i) comprenant une séquence d'acides aminés de 3~
~5 acides aminés ~9e lonc~~~eur c~ant~n~ae dans h a~~amaine s< têts: ~~ de la pr~l~éin~ ~g fibrr~ ~~ de la c~p~id~ d'an ad~n~avir~as, 1~~3it~ ~~q~a~rre~
d'acides arnirrés corn~ar~n~nt l'enchainPment d'aciales aminés formant h str~act~are c~rr double f~uill~k (i désignée ~g EF ~~ c~2nt~nu~ ~âans ladü
domaine Qc ~kéte ~~ ; osa - un peptide (ü) analogue dudit p~lypeptide (i) dont la séquence en acides aminés comporte, par rapport é la séquence dudit polypeptide (i), au moins une substitution ou au moins une délétion d'un acide aminé, ledit peptide analogue conservant ladite structure en double feuillet (i désignée <c EF ».

14 ~n a montré dans les exemples qu'un composé adjuvant répondant à la définition ci-dessus induit la maturation des cellules dendritiques immatures. En particulier, un composé adjuvant ci-dessus induit l'expression par les cellules dendritiques des molécules de classe I et de classe II du CMH, ainsi que des marqueurs spécifiques des cellules dendritiques matures, tels que les marqueurs CD40, CD80 et CD86. Les cellules dendritiques stimulées par un composé adjuvant tel que défini ci-dessus induisent la prolifération de lymphocytes T CD4+ allogéniques dans des essais de réaction lymphocytaire mixte (MLR) et induit également la sécrétion d'IL-12 et de TNFa, de manière dose dépendante. Un composé adjuvant selon l'invention agit directement sur les cellules dendritiques immatures sans fixation sur le récepteur CAR.
Four les composés adjuvants de l'invention constitués d'un polypeptide (i), ledit polypeptide (i) a une séquence d'acides aminés d'au moins 30 acides aminés de I~ngueur puisque le polypeptide (i) c~mprenant dans taus les cas une séquence d'acides aminés de ~0 acides aminés de longueur contenant la séquence d'acides aminés formant le feuillet ~ EF du domaine tâte de la protéine fibre d'un adénovirus, qui porte la fonction de maturatïon des cellules dendritiques immatures.
Pour les comp~sés adjuvants de l'immunité constituée d'un peptide (ü) anal~g~ae du polypeptide (i), ledit peptide (ü) analogue posséda une sl:r~acture trés proche du polypeptide (i) et conserve la ~5 c~r~ctérisiiq~ae str~aci:~arelle essentielle de c~ntenir ~.~ne séquence d'acides aminés i~~rmsnt h structure en d~~able fe~aillev ~ antipar~lléle EF.
~ans pan pepti~3e (ii) analogue, la séq~aene~e d'acides aminés ~3~a feuillet ~ EF peut comprendre, par rapport ~ la sc~quence a~'acides aminés d~a feuillet ~ EF du domaine tâte de la pr~téine fibre de l'adénovirus dont elle dérive, une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé. Toutefois, la ou les substituions d'acides aminés dans la séquence du feuille ~i EF sont telles qu'elles ne modifient pas ladite structure en feuille~k ~.

Toutefois, de manière tout à fait préférée, la séquence d'acides aminés formant le feuillet (3 EF d'un peptide (ü) analogue est identique à
la séquence d'acides aminés du feuillet ~i EF du polypeptide (i) parent.
Selon un aspect préféré d'un composé adjuvant selon l'invention, S l'enchainement d'acides aminés formant la structure en double feuillet ~i EF est localisée approximativement au centre de la séquence d'acides aminés dudit polypeptide.
Par exemple, la séquence d'acides aminés du feuillet (3 EF du domaine tâte de la protéine fibre de l'adénovirus de sérotype 5 a une 10 longueur de 8 acides aminés. Comme cela est montré sur la figure fiA, cette séquence d'acides aminés débute au résidu d'acide aminé en position 479 ci se termine au résidu d'acide aminé localisé en position 486 de la protéine fibre complèfie de l'adénovirus de sér~type 5. Pour un composé adjuvant constitué d'un polypeptide (i) ayant la longueur

15 minimale de 30 acides aminés, la séquence d'acides aminés du feuillet ~3 EF, de 8 acides aminés, est précédée, à l'extrémité I'~-terminale, d'une séquence de ~ ~ acides aminés de longueur c~rrespondant à une partie de la boucle ~E et est suivie, du cétà C-terminal, d'une séquence de ~ ~
acides aminés de longueur c~mprenant une partie de la boucle FG.
La séquence d'acides aminés du feuillet ~ EF c~ntenue dans un p~lypeptide (i) adjuvant selon l'invention est localisée e~ appr~ximativement a> au centre de la séquence d'acides aminés du polypeptide (i) lorsque les séquences localisées respectivement du c~té
I~-terminal et du c~té C-terminal de la séquence du feuillai (~ EF n'~nt 2~ pas une longueur identique. Par e~~emple, la long~ae~ar des séquences Iccalisées res~aectïvement a~~a cété V~~-tern~ïnal et d~a c~àt~ ~-terr~-~inal de la ség~aerrce d'acides ar~~in~s du feuillet ~ EF peuvent différer d'une IQngue~ar allant jus~lu'~~ ~~ acides aminés, l'unr~ par rapl2~rk ~ l'autre.
Selon pan autre aspect préféré d'un polypeptide (i) adjuvant sel~r~
l'invention, ledit polypeptide (i) comprend, de l'ea~trémité I~-terminale vers l'extrémité C-terminale, les séquences d'acides aminés de la boucle ~E, du feuillet ~ EF et de la boucle FG.
A titre illustratif, pour un polypeptide (i) de ce type dérivé de la pr~téine fibre de l'adén~virus de sérotype 5, ledit comp~sé adjuvant est ~5 c~nstitué du p~lypeptide dont lai séquence en acides aminés débute aga

16 résidu d'acide aminé en position 463 et se termine au résidu d'acide aminé en position 515 de la séquence de la protéine fibre complëte. Pour ce composé adjuvant, la séquence d'acides aminés du feuillet (3 EF est localisée c< approximativement a> au centre de la séquence d'acides aminés du polypeptide (i), bien que la séquence d'acides aminés de la boucle FG, à l'extrémité C-terminale, possède une longueur de 12 résidus d'acides aminés supérieure à celle de la boucle DE localisée à
l'extrémité N-terminale.
De manière générale, un composé adjuvant selon l'invention du type polypeptide (i) a une longueur d'au moins 30 acides aminés, et d'au plus 195 acides aminés et de manière tout à fait préférée d'au plus 130 acides aminés.
Ainsi, un composé adjuvant selon l'invention du type polypeptide (i) a une longueur d'au moins 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 30, 35, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 1 ~0, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 150, 165, 170, 175, 130, 135, 190 ou 195 acides aminés de longueur.
Selon un premier mode de réalisation préféré d'un c~mposé
adjuvant de l'immunité consistant en un polypeptide (i) tel que défini ci dessus, la séquence dudit polypeptide (i), d'une I~ngueur de cc n » acides aminés, consiste en une séquence de ce n » acides aminés consécutifs d'une séquence correspondante contenue dans le domaine tâte de la protéine fibre de l'adénovirus c~nsidéré. II y a donc identité en acides aminés entre la séquence du composé adjuvant du type polypeptide (i) et la séquence de la parkie correspondante du d~maine tète de la protéine ~~ fibre de l'adPnc~ir~s cons>idPré.
Selon dan seconr3 nloa~~ de réalïsation préféré, le polyp~ptid~ (i), d'~.~ne I~ngu~~ar de cc n a~ acides aminés, comprend pane séq~aencc ale aciclPS ~n-~inés consécutifs d~a darnair~e té~te et camlarenar~t la séquence d~a feuillet ~ EF ainsi q~a'~ane osa deu~~ séquences d'acides aminés additionnelles, la longueur totale des séquences d'acides aminés additionnelles étant de cc n - x » acides aminés, localisées à l'extrémité
N-terminale et/ou à l'extrémité C-terminale de la séquence du domaine tâte de ce x a> acides aminés. II doifi âtre compris que cc n » est un nombre entier compris entre 30 et 195 et que cc x a~ est un nombre entier compris ~5 entre 30 et cc n-~~ ~~.

17 Dans un composé adjuvant du type polypeptide (i), la ou les séquences additionnelles, autres que la séquence partielle du domaine tâte de la protéine fibre qui comprend la séquence du feuillet (3 EF, peuvent consister en des séquences de peptides détectables par des S anticorps spécifiques d'un tel peptide, qui pourra donc âtre utilisé comme marqueur.
Selon un autre aspect, les séquences additionnelles peuvent consister en des séquences permettant une purification plus aisée du composé adjuvant après sa synthèse, que ce soit par synthèse chimique ou par synthèse par recombinaison génétique. A titre illustratif d'un tel aspect, les séquences additionnelles sont choisies parmi des séquences de polyhistidine, par exemple des séquences comprenant de 4 à 10, et de préférence 6, résidus d'histidine. Ces séquences peuvent aussi consister en des peptides ou polypeptides destinés é faciliter la purification du composé adjuvant, telle que la GST.
De manière haut é fait préférée, la séquence de ~< x aa acides aminés additionnelle est localisée du côté C-terminale de la séquence d~a domaine tâte de la protéine fibre de l'adénovirus considéré.
Selon un autre mode de réalisation, un composé adjuvant selon l'invention du type polypeptide (i) comprend une séquence d'acides aminés du domaine tâte de la protéine fibre d'un adénovirus qui comprend, de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale, le feuillet (~ D. La boucle peptidique DE, le feuillet ~ EF et la boucle peptidique FG du domaine tète de la protéine fibre de l'adénovirus ~~ fonsi~3~réo é~o~ar le a~am,~in~~ tâte ale l'~ol~no~,~iru~ de sfr~atz~pe ~, pan °~el p~I~rp~ptid~ (i) p~ss~a~~ ~ar~~ sèq~a~nce ~â'~ci~â~s aminés ~â~butant ~
l'acide aminé en positï~n q.~4 et se termine ~a l'acide aminé en positi~n ~~~ de la pr~r~:~ine fibre c~aru~lal~~~e, camrne cela est reprfse:nté ~~ar la figure ~~.
Sel~n encore pan astre mode de réalisation préféré, un connposant adjuvant selon l'invention, au type polypeptide (i), comprend une séquence d'acides aminés du domaine tâte qui comprend, de l'extrémité
N-terminale, vers l'extrémité C-terminale, respectivement la boucle peptidique DE, le feuillet (3 EF, la boucle peptidique FG et le feuillet ~i G.
A titre illustratif, pour le domaine téta de l'adénovirus de sérotype ~5 5, pan tel p~lype~a~:i~âe (i) comprend la ség~aence débutant ~ l'acide aminé

18 en position 463 et se terminant à l'acide aminé en position 521 de la protéine fibre complète, comme cela est représenté sur la figure 6.
Selon encore un autre mode de réalisation préféré, un composé
adjuvant du type polypeptide (i) comprend, de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale, respectivement le feuillet ~i D, la boucle peptidique DE, le feuillet (3 EF, la boucle peptidique FG et le feuillet (3G.
A titre illustratif, pour le domaine tâte de l'adénovirus de sérotype 5, un tel polypeptide (i) comprend la séquence d'acides aminés débutant à l'acide aminé en position 454 et se terminant à l'acide aminé en position 521 de la protéine fibre complète.
Selon encore un autre mode de réalisation particulier d'un composé peptidique adjuvant de l'invention, le polypeptide (i) ou le peptide (ü) analogue comprend également, en plus de la séquence d'acides aminés du domaine tète de fibre, également la dernière sous-unité de répétition de la tige de fibre. Un tel composé adjuvant peptidique sel~n l'inventi~n comprenant la dernière s~us-unité de répétiti~n de la tige de fibre est susceptible de posséder une grande stabilité de structure ei de bloquer la partie du domaine tâte dans sa conformation native et sous forme d'un trimère peptidique.
~0 A titre illustratif de ce mode de réalisation particulier d'un composé
adjuvant peptidique de l'invention qui comprend un polypeptide (i) dérivé
de la protéine fibre de l'adén~virus de sérotype 5, ledit polypeptide (i) comprend la séquence d'acides aminés débutant au résidu d'acide aminé en position 350 et se terminant au résidu d'acide aminé en '~S po~i~,ion 55~ ~I~ I~ ~éq~,~~ncP a~'~cides aminés de I~ pr~atéin~ fibre compléta.
Sel~n pane c~aractéristiq~ae pr~;férée d'can conlp~sé adjtavant sel~an l'invention, le ~acl~~aepti~3~; (i) c~arnprenc~ ~~ne ~a~r~ie d~a clon-~~ine téta de I~
~arote~inc~ fiE~re d'an ~dénovirus quai est un adén~vir~as hur~~~in.
30 Avantageusement, l'adénovirus humain est choisi parmi les adénovirus du sous-groupe S, qui comprend les adénovirus Ad3, Adi, Ad1l, Ad14, Adl6, Ad21, Ad34 et Ad35, ou parmi les adénovirus du sous-groupe C, qui comprend les adénovirus Adl, Ad2, Ad5 et Ad6.
Préférentiellement, fadénovirus humain est choisi dans le groupe 35 c~nstit~aé des adén~virus des sérotypes 12 15, 51, ~, ~, ~ 1, 14, 1 ~, 21,

19 34, 35, 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 4, 40 et 41.
De préférence, un peptide adjuvant selon l'invention dérive du domaine tëte de la protéine fibre d'un adénovirus choisi parmi AdS, Ad3 S et Ad 12.
Les protéines fibres complètes des adénovirus AdS, Ad3 et Ad12 sont représentées comme les séquences d'acides aminés SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 et SEQ id N°3, respectivement.
Le domaine tëte de la protéine fibre de l'adénovirus Ad5 débute au résidu d'acide aminé en position 400 de la séquence SEQ ID N°1.
Le domaine tëte de la protéine fibre de l'adénovirus Ad3 débute au résidu d'acide aminé en position 132 de la séquence SEQ ID N°2.
Le domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus Ad12 débute au résidu d'acide aminé en position 409 de la séquence SEQ ID N°3.
Les structures cristallines des protéines fibres des adénovirus AdS, Ad3 et Adl2 ont été décrites par fia et al. (1994), Dumort et al.
(2001 ) et Se~ley et al. (1999), respectivement.
Selon enc~re un autre aspect préféré d'un comp~sé adjuvant selon l'invention, celui-ci est caractérisé en ce que le polypeptide (i) comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences suivantes - la séquence débutant é l'acide aminé en positi~n 463 et se terminant é l'acide aminé en position 515 de la séquence SEQ I~ N° 1 - la séquence débutant é l'acide aminé en positi~n 195 et se terminant 2 '~ ~ -~n~inp en po~iti~an 2q.6 ~3~ la séq~aen~°Q SES II~ f~~°
2.
I ~ cid~
- I~1 ~éq~ac~nce d~b~at~nt ~ l'acide aminé en position Q.7~ et se terminant ~ l'acide aminé en positi~n 535 de la séquence SES I~ i~°
3.
homme cela a déjà été décrit précPdemment, pan rode c3e réalisation particulier du composé adjuvant selon l'ine~ention, consiste en un peptide (ü) analogue du p~lypeptide (i) défini ci-dessus, dont la séquence en acides aminés comporte, par rapport è la séquence dudit polypeptide (i), au moins une substitution ou au moins une délétion d'un acide aminé, ledit peptide analrague c~nservant la structure double ~5 feuillet ~ EF.

De manière tout à fait préférée, la ou les substitutions) ou délétions) d'un acide aminé, par rapport à la séquence du polypeptide (i) est (sont) localisées) dans la partie du peptide (ü) analogue dérivée de la séquence du domaine tête de la protéine fibre d'adénovirus 5 contenue dans le polypeptide (i) parent.
De préférence, le peptide analogue (ü) adjuvant comprend 2,3,4,5,6,7,x,9 ou 10 substitutions ou délétions d'un acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide (i) parent.
Selon encore un autre mode de réalisation d'un composé adjuvant 10 de l'immunité selon l'invention, ledit composé adjuvant est caractérisé en ce que le polypeptide (i) ou le peptide analogue (ü) consiste en un polypeptide cyclique.
Les peptides (ü) adjuvants qui comprennent dans leur séquence une ou plusieurs différences en acides aminés par rapport à la séquence 15 correspondante contenue dans le domaine tête de la protéine fibre naturelle de l'adénovir~as considéré, posséda néanmoins des propriétés adjuvantes, c'est-à-dire des pr~priétés d'induire la maturation des cellules dendritiques immatures, du méme ordre de grandeur que le polypeptide (i) parent dont il dérive.

20 De maniére générale, l'invention est relative à des peptides adjuvants dérivés du domaine tâte de la protéine fibre d'un adénovirus.
qui possède la méme activité adjuvante que les peptides adjuvants spécifiquement décrits dans la présente description.
Comme cela est montré dans les exemples, la propriété d'un ~~ composé adjuvant selon l'inv~n~~ion d'induire la mat~ar~tion aies cellules dendrivig~aes imm~t~are~ peut âtre aisément vérifiiée par l'homme d~~ l'art, par e~~emple en déterminant le niveau d'e~~pressi~ar~ des m~léc~ales du Ci~iH de classe I osa de classe II, ~a~a encore le niveau a~'ez~preeeion ~3e marq~ac~~ar spécifiq~ar~ de la mat~arati~n de cellules dendritic~~aes, telles q~ae les molécules CD40, CD30 et C~3~.
Les autres tests décrits dans les exemples peuvent également être utilisés par l'homme de l'art pour vérifier la capacité adjuvante de maturation des cellules dendritiques d'un composé selon l'invention, tel que

21 (i) la capacité du composé adjuvant à stimuler des cellules dendritiques immatures à induire une réaction lymphocytaire mixte en présence de cellules TCD4'" allogéniques ;
(ü) la capacité des cellules dendritiques stimulées avec un composé adjuvant de l'invention, et chargées avec un antigène, à induire une réponse immunitaire par l'induction de la prolifération de cellules TCD8+ spécifiques dudit antigéne, et encore plus spécifiquement des cellules TCDB+ secrétant de finterFéron gamma.
(iii) La capacité d'un composé adjuvant selon l'invention à stimuler la production d'IL-12 et de TNFa par les cellules dendritiques.
De préférence, dans la séquence d'un peptide analogue (ü), un acide aminé contenu dans la séquence du polypeptide (i) parent est substitué par un acide aminé de la même classe d'acide aminé, parmi les classes des acides aminés acides (D, E), basiques (K, R, H), non polaires (A, ~', L, I, P, i1!1, F, 11V) ou encore des acides aminés polaires n~n chargés (t~, ~, T, Y, I~, Q).
De préférence, la parie du peptide (ü) analogue dérivée de la séquence du domaine téfie du polypeptide (i) parent d'une longueur de (x) acides aminés, à une identité en acides aminés avec la séquence correspondante de longueur (x) du polypeptide (i) parent d'au moins 80%, avantageusement d'au moins 95% et de maniére tout à fait préférée d'au moins 98°/~.
Le <e pourcentage d'identité ~~ entre deus séquences d'acides aminés, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant 2~ les ~l~~a~~ sPc~~a~nce~ alignées a9e maniére ~aptimalp, ~ travers pane fPnétre de crarn~aar~is~n.
La petit de la séq~a~nce c1'acides aminés dans la fenétre de ccn~p~rsis~an p~~at aïnsi c~m~ar~ndre dc~s ad~litic~ns osa des déléti~ans (par ~~~mplc des ~~ gaps ~~) per rappor ~ la séc~u~n~e de référence (quai nce comprend pas ces additions ou ces délétions) de maniére à obtenir pan alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identifié est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un résidu d'acide aminé identique est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions a~a~zq~aelles il y a identité entre les de~aa~ résicl~as d'acide aminé par le

22 nombre total de positions dans la fenétre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en acides aminés des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut âtre réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1 ) CPU MODE = ClustalW mp ;
(2) ALIGNMENT = <c full » ; (3) OUTPUT FORMAT = ce aln wlnumbers » ;
(4) OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = cc no » ;
(6) KTUP (word site) - cc default » ; (7) WINDOW LENGTH -cc default » ; (8) SCORE Tl~PE - cc percent >a ; (9) TOPDIAG -cc default » ; (10) PAIRGAP - cc default » ; (11 ) PHIrLOGENETIC
TREE/TREE Tl°PE = c< none » ; (12) MATRIX = cc default » ; (13) GAP
OPEN = cc default » ; (14.) END GAPS = e< default » ; (15) GAP
E~TEI'~SI~i~:! = ce default a~ ; (16) GAP DISTANCES = cc default ~a ; (1~') TREE 'f ~'PE = ce cladogram ~a et (18) TREE f~I~P DISTANCES = cc hide z>.
Un composé adjuvant peptidique selon l'inventi~n peut âtre synfihétisé par des méthodes classiques de chimie de synthèse, soit des synthèses chimiques homogènes en solution ou en phase solide.
A titre illustratif, l'homme de l'art peut utiliser les techniques de synthèse polypepfiide en solution décrite par HOUEEN l~ëIEIL (1914).
Un composé adjuvant peptidique selon l'invention peut âtre ~~ Pgalement synthétisé ohimiq~aem~;nt Pn ph~~~ liquide eau s~alide par des ora~apl~ge~ ~~aoces~if~ c~ee dit~~reni~ ré~irâ~as ~l'~oio9e~ ~r~-~in~s (~3e l'e~strénlité N-terminale vers l'e~~trémité C-terminale Pn phase lir~~aide, osa de l'eatr~r~iit~~ C-terminale vers l'e~strén-~it~ i'9-terminale en phaee ~~alide) .
L'h~n~rne de l'art peut n~tanlment ~atili~er la teohnic~~ae de synthé~e peptidique en phase solide décrite par ~lerrifiield (1965a ; ~ 9~5b).
aelon un autre aspect, un c~mposé adjuvant peptidique selon l'invention peut âtre synthétisé par recombinaison génétique, par exemple selon un procédé de production comprenant les étapes suivantes

23 (a) préparer un vecteur d'expression dans lequel a été inséré un acide nucléique codant le composé adjuvant peptidique de l'invention, ledit vecteur comprenant également les séquences régulatrices nécessaires à l'expression dudit acide nucléique dans une cellule hôte choisie ;
(b) transfecter une cellule hôte avec le vecteur recombinant obtenu à l'étape (a) ;
c) cultiver la cellule hôte transfectée à l'étape b) dans un milieu de culture approprié ;
(d) récupérer le surnageant de culture des cellules transfectées ou le lysat cellulaire desdites cellules, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; et (e) séparer ou purifier, à partir dudit milieu de culture, ou à parkir du culofi de lysat cellulaire, le composé adjuvant peptidique recombinant de l'invention.
Pour produire un c~mposé adjuvant peptidique rec~mbinant de l'invention, l'homme de fark peut notamment se référer aux techniques de préparation des vecteurs recombinants, de transfection cellulaire et de purification qui sont décrites dans les exemples.
~e maniére tout à fait préférée, on utilise un vecteur de type baculovirus pour infecter des cellules af9, comme cela est décrit dans les exemples.
Pour purifier un comp~sé peptidique adjuvant de l'immunité selon l'invention gui a été produit par des cellules h~tes transfectées ou °~5 infectées par pan ~~ecte~ar recor~rbin~nt codant ledit comp~asé
adj~a~~nt ~a~ptidigu~, l'h~mrr~~ d~~ l'~r~ p~~9t ~~~nt~geu~~m~nt r~n~klr~ en c~~a~r~
~3~~
techniq~ae~ de p~arificatior~ décrites par ~Ic~linier-Fr~nl;~el (~~~~), par C~ara~an et al. (~~I~~) ra~,~ par Y~~ae~Plli et al. (~I~~~).
~~arnrtile cela a d~j~ été r~~enti~nné préc~d~rr~ment dans la présente description, du fait gras les cellules dendritiques matures favorisent le développement des réponses immunitaires, les réponses immunitaires à médiation cellulaire l'un quelconque des composés peptidiques adjuvant selon l'invention peut être utilisé en association avec un antigène à l'encontre duquel une réponse immunitaire est recherchée.

24 Un composé adjuvanfi peptidique selon l'invention peut éfire associé, en vue d'induire une réponse immunitaire, cher l'homme ou l'animal, indifféremment avec un antigène peptidique ou avec un antigène du type carbohydrate, par exemple un antigène du type carbohydrate identïque ou similaire, du point de vue de sa reconnaissance antigénique, à un anfiigène spécifiquemenfi exprimé par des cellules tumorales.
Par définition, le composé adjuvant peptidique selon l'invention peufi étre associé avec tout type d'antigène à l'encontre duquel une réponse immunitaire est recherchée.
Selon un mode de réalisation particulier, un composé adjuvant peptidique de l'invention est couplé chimiquement à un ~u plusieurs antigènes à l'encontre desquels une réponse immunitaire est recherchée, sous la forme d'un conjugué peptide adjuvant/pepfiide antigène ou encore sous la forme d'un conjugué peptide adjuvant-a~ntigène carb~hydrate.
Ainsi, la présente inventi~an a égalemenfi pour objet un conjugué
immunogène constitué d'un composé peptidique adjuvant selon l'invention, qui est lié de manière covalente à un antigène à l'encontre duquel une réponse immunitaire est recherchée.
L'invention a également pour objet une composition adjuvante de l'immunité ce~mprenant un camp~sé adjuvant peptidique tel que défini ci-dessus dans la présente descripfiion, en associafiion avec au moins un e~zcipient physiol~giquement compatible.
Uans pan mca9e c~~ ré~lïsatï~n parbiccalier d~a c~anj~ae~~aé ïmm~an~agéne de l'invention, le camp~~c~ ~aljuv~nt cet l'antia~~n~ ~a~nt li~~
~~ir~cfi~rn~nt entre eu~~ o1e manïére c~a~ralcnt~, par e~~emple via pane liaïs~n peptidiq~ae-~~-f'~ ~l-.
cependant, afin r3'intre~duire une certaine fle~~ibilit~ dans la strucfiure du c~njugué immunogène, efi notammenfi de permettre une mobilité dans l'espace du composé adjuvant et de l'antigène, l'un par rapport à l'autre au sein du conjugué immunogène, on préfère un conjugué peptidique dans lequel le composé adjuvant et l'anfiigène sont séparés l'an de l'autre, au sein dudit conjugué, par une chaine espaceur.

Selon un premier mode de réalisation préféré d'un conjugué
immunogène, le composé adjuvant et l'antigène sont séparés l'un de l'autre, au sein dudit conjugué, par une chaine espaceur choisie parmi le SMCC ou le SIAB, qui sont tous les deux des composés bifonctionnels.
5 Le composé SIAB, décrit par Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego : Academic Press, pp 239-242), est le composé de formule (I) suivante Na+ ~ - 0 O ~~
N-O O
\f 1o (I) Le composé SIAL comprend deus groupes réactifs, respectivement un groupe iodoacétate et un groupe ester Sulfo-NFiS, 15 ces groupes réagissant respectivement sur des groupes amino et sulfhydryl.
Le composé SM~C, qui est décrit par Samoszulc M.K. et al. (1939, Antibody, Immunoconjugates F~adiopharm., 2 1 : 3i-4.6), est le composé
de formule (II) suivante UJa+ ~°
r, Q
rs--o J sO
O -Le composé SMCC comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe ester Sulfo-NHS et un groupe maléimide, qui réagissent respectivement avec un groupe amino et un groupe sulfhydryl.
Selon un second mode de réalisation préféré, le conjugué
immunogène comprend une chaine espaceur constituée d'un peptide espaceur linéaire . On choisira de préférence un peptide espaceur linéaire ayant de 3 à 30 acides aminés de longueur, avantageusement de 5 à 20 acides aminés de longueur et de manière tout à fait préférée de 7 à 15 acides aminés de longueur.
Préférentiellement, le peptide espaceur linéaire est essentiellement, voire exclusivement, constitué d'acides aminés chargés positivement ou négativement à pH 7,0 afin d'accroitre l'hydrophilicité
globale dudit conjugué peptidique immunogène. On comprend que l'on devra éviter d'utiliser des peptides espaceurs constitués d'acides aminés hydrophobes. ~e manière préférentielle, le peptide espaceur est caractérisé en ce qu'il est constitué d'une chaise de poly-(lysine ) constïtuée de 3 à ~0 résidus lysine, avantageusement de 5 ~a ~0 et de manière tout à fait préférée de 7 à 15 résidus lysine de longueur.
Selon encore un autre mode de réalisation d'un conjugué
immunogène selon l'invention, le composé adjuvant et l'antigène sont séparés l'un de l'autre, au sein dudit conjugué peptidique, par une chaise espaceur constituée d'un peptide espa~ceur ramifié, de préférence une structure oligodendrimérique de poly(lysine), telle que décrite par 2~ e~~em~ale per I~~sal1 et ~I. (~~~~).
t~an~ ce dernier r~~ad~; de r~~li~~tiori d'an c~anj~a~u~ ïnin~~,~r~~géne selon l'inventie~n, ledit conjugué pepi:idic~~a~ rapiat c~mprendr~ plusieurs cca~aie~ res~aecti~err~enk d~a composé Qoj~av~nt etl~au de l'antigc~nc~ par moléc~alc~ dry conjugué, ~v~ntage~asernent de ~ à ~ copies d~a cor~~pasé
adjuvant etlou de l'antigène, de préférence aga plus ~ du composé
adjuvant etlou de l'antigène, par molécule de conjugué.
La présente invention a encore pour objet un composé adjuvant peptidique tel que défini précédemment dans la description, pour son utilisation en tant que principe actif adjuvant d'une composition ~5 immun~gène ~~a d'une c~mposition vaccinale.

Par cc composition immunogène", on entend selon l'invention, une composition contenant un composé adjuvant peptidique tel que défini ci-dessus en association avec au moins un antigène à l'encontre duquel une réponse immunitaire à médiation cellulaire est recherchée, dans le but de produire des anticorps spécifiques à l'encontre dudit antigène.
Par cc composition vaccinale », on entend selon l'invention une composition contenant un composé peptidique adjuvant tel que défini ci-dessus, en association avec au moins un antigène à l'encontre duquel une réponse immunitaire à médiation cellulaire est recherchée en vue de prévenir ou en vue de traiter une maladie, en particulier une maladie provoquée par un agent pathogène de type viral, fongique ou bactérien ou encore une tumeur.
L'invention est également relafiive à l'utilisation d'un composé
adjuvant peptidique tel que défini ci-dessus pour la fabrication d'une composition immunogène ou vaccinale.
Elle concerne aussi une composition immunogène ou une c~mposition vaccinale c~mprenant un comp~asé adjuvant peptidique tel que défini ci-dessus, en associafiion avec au moins un antigéne .
~ans une composition immunogène ou dans une composition vaccinale de l'invention, l'antigène peut ëtre utilisé sous la forme d'un mélange avec le composé peptidique adjuvant de l'invention.
selon un autre mode de réalisation, le composé adjuvant peptidique et l'antigène inclus dans une composition vaccinale ou dans une composition immunogène de l'invention se présentent sous la forme 2~ d9~an conj~aq~aé imm~anogén~ iel q~ae défini ci-dessus.
~ans les e~semples, ~n a n~~ntré g~ae d~~s ~ell~al~s dendritîques stimulées avec pan c~n~~a~asé adjuvant peptialique sel~n l'in~,~ention et char~,é avec un antigéne clé~herminé, en l'~acc~arrence le ~aelatic~P ~P33 râpa L~l~'i~, était capable d'induire, cher I'anlmal, pane rép~nse imn~~anit~irc~
cytoto~~ique par stimulation de cellules 'f ~~3'' spécifiques dc: l'antigène GP33.
~n a montré en parkiculier que des cellules dendritiques matures stimulées par un composé adjuvant peptidique selon l'invention et présentant l'antigène d'intérét suas cellules du système immunitaire ~5 étaient ca~aables c~'ind~aire pane rép~nse immunitaire c1e type eyt~to~~igue 2ô
provoquant le rejet de splénocytes présentant à leur surFace l'antigène d' i ntérét.
Dans une composition immunogène ou dans une composition vaccinale selon l'invention, tout type d'antigène peut être utilisé puisque, S dans tous les cas, et quel que soit l'antigène ou les antigènes, le peptide adéquat de l'invention exercera son activité d'activation des cellules dendritiques.
De préférence, une composition immunogène ou une composition vaccinale selon l'invention comprend une quantité allant de 10 nanogrammes à 1 milligramme d'un composé adjuvant peptidique tel que défini ci-dessus, de préférence de 100 nanogrammes à 100 microgrammes dudit composé peptidique adjuvant, et de maniëre tout à
fait préférée de 100 nanogrammes à 10 microgrammes dudit composé
peptidique adjuvant.
Parmi les antigènes susceptibles d'ètre inclus dans une composition immenogène osa dans une composition vaccinale selon l'invention, en association ae.Aec un composé adjuvant peptidique, on peut citer les antigènes bactériens dérivés notamment de ~. perfcassis, Lepfospira p~me~na, S. parafyphi ~1 ~, C. o°iphfheriae, ~. fefani, ~.
b~fulincem, C. perfringens, C. féseri, ~. anfhracis, P. pesfis, P. mulfocida, 1/. ch~lerea, t~lelsserla memngifrd''s, iV. g~n~rrheae, Hem~phil~s infiluen~ae, Trepc~nema pollidum.
Les antigènes peuvent âtre également des antigènes viraux tels que des antigènes dérivés des virus poliovirus, adén~virus, virus du para ~ infl~aen~~, viras respir~te~ires s~nc~~;i~~a~, viras de l'infl~aen~a, viras c~e l'~ncé~ailelc~my~litis, vîr~as de I~ r~~~lacâi~ d~ ~~~~castle, p~a~~ virus, viras r~bbiq~ae.
Les a~ntigèr~~s peuvent hululement consister en des ~ntigér~es prraven~nt d'an allerg~ne q~aelc~nq~ae, tels roue des allergènes d~ri~rés d'e~âtraits de pollen de fleur ou d'herbe, des ~allergènes purifiés à parkir de poussière d~mestique, etc..
Parmi les antigènes viraux d'intérët, on cite aussi les antigènes dérivés des protéines des papillomavirus, notamment des papillomavirus humains, et en particulier les pr~téines L1, E6 et E7, notamment des ~5 souches HP~-1 ~.

D'autres antigènes viraux illustratifs consistent en des antigènes dérivés des protéines du virus de fimmunodéficience humaine (VIN), en particulier du VIH-1, et de manière tout à fait préférée dérivés de la protéine ENV du virus VIH-1.
S D'autres antigènes d'intérët susceptibles d'âtre inclus dans une composition immunogène ou dans une composition vaccinale selon l'invention consistent en des antigènes tumoraux, c'est-à-dire des antigènes exprimés par des cellules cancéreuses, que ces antigènes soient de nature peptidique ou de nature carbohydrate.
Comme on l'a compris, les compositions immunogènes ou les compositions vaccinales selon l'invention trouvent leur emploi notamment dans le traitement, tant curatif que préventif, des cancers, notamment des cancers induits par des virus c~mme par exemple l'ATL(acute T leu4cemia) provoqués par le virus HTLV1, ou le cancer du col utérin provoqué par les papillomavirus, ou encore le lymphome de burkitt ~~a le sarc~me de l~aprasi prou~qué par des virus de la famille Herpès, respectivement Epstein-barr (ESV) et le HHVI~, ainsi que dans le traitement du ~ID~ ~u enc~re pour prévenir ~u traiter des réactions inflammat~ires allergiques.
Selon encore un autre aspect, l'invention a encore pour objet une méthode pour immuniser un homme ou un animal, plus spécifiquement un mammifère, à l'encontre d'un antigène d'intérét , ladite méthode comprenant une étape au cours de laquelle on administre à l'homme ~u à l'animal une composition immunogène ou une ccampositi~n vaccinale ~~ t~~llc~ qur définie ci-~les~~as.
~r~ administre à l'horr~rne raya è l'~nir~lal, par ez~~mple ~~az~ ~a~tic~nts, pane comp~siti~an imm~anogér~e ~~a pane compc2sition vaccinale selon l'inventi~an quai se présente s~~as pane farnle adaptée à l'adnlinistraticrr systémig~ae ~u mucc2sale, par e~semple laar vraie intranasale, en a~~aantité
suffisante pour âtre efficace star le plan thérapeutique, à pan sujet ayant besoin d'un tel traitement. Une composition immunogène ou une composition vaccinale selon l'invention se présente sous forme solide ou liquide, en particulier sous la forme d'une émulsion huile-dans-l'eau dans lequel l'antigène ou les antigènes d'intérét est(sont) dispersés. Pour ~5 f~rmuler pane c~mp~siti~n imrr~~anogène osa une c~mp~siti~n vaccinale selon l'invention sous la forme d'une émulsion huile-dans-l'eau, l'homme de l'art pourra utiliser une émulsion du type SPT telle que décrite à la page 147 de l'ouvrage ec Vaccin Design, The subunit and adjuvant approach », [ M.P~WELL, M. Newman Ed., Plenum Press, (1995)] ainsi 5 que l'émulsion MF59 décrite à la page 1133 du méme ouvrage.
Par <c excipient physiologiquement compatible » au sens de l'invention, on entend un agent de charge liquide ou solide, un diluant ou tout autre substance non-physiologiquement active et présentant une grande inoccuité pour le patient qui peut étre utilisée pour l'administration 10 systémique ou locale, par exemple sur les muqueuses, d'une composition immunogène ou une composition vaccinale selon l'invention.
De tels excipients physiologiquement compatibles sont décrits en détail notamment dans la 4'~"'~ édition ee 2002 » de la Pharmacopée Européenne ainsi que dans l'édition IJSP 26-NF21 publiée en Novembre 15 200.
Sel~n encore un autre aspect, l'invention est également relative à
un procédé pour la maturation ire vüp~ des cellules dendritiques immatures humaines ~u animales dans lequel des cellules dendritiques immatures sont stimulées avec un composé adjuvant peptidique tel que 20 défini dans la présente description.
L'invention a donc encore pour objet un procédé pour la maturation in vitro des cellules dendritiques immatures humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes (a) cultiver in vi~'r~~ une population de cellules enrichies en cellules dendJritiq~aes immat~~res h~am~ines osa animales, dans un milieu de c~alt~are approprié ;
(b) incuber les cellules c~altierees a l'etape (~a) a~9ec un c~mposant adjuv~r~t peptic~iq~ae eau encore avec pane cornpc~ition ~~lj~a~rante telle que définie dans h présente descripti~n, pendant une d~ar~e ~~affis~nte à
30 induire la maturation des cellules dendritiques.
La population de cellules enrichies en cellules dendritiques immatures humaines ou animales utilisée à l'étape a) du procédé peut être obtenue à partir d'un échantillon de moelle osseuse ou encore un échantillon de sang humain ou animal, selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, comme par exemple la technique décrite par Mayordomo et al. (1995).
Pour purifier et cultiver des cellules dendritiques, l'homme de l'art peut également se référer à la technique décrite par Steinam et Young (1991 ). L'homme de l'art peut également se référer aux nombreuses références bibliographiques concernant la purification et la culture des cellules dendritiques qui sont décrites dans la demande PCT publiée sous le n°W~ 98/é3728, et plus spécifiquement aux pages 1 à 3.
Pour obtenir une population de cellules enrichies en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, l'homme de l'art peut également se référer à la technique décrite dans les exemples.
A l'étape b) du procédé de maturation ci-dessus, les cellules dendritiques immatures sont incubées avec une concentration finale du composé adjuvant peptidique allant de 10 nanogrammes par ml à 1 pg/ml, de préférence allant de 50 nanogrammes par ml à 1 Ng/ml.
A l'étape b) du procédé de maturati~n, les cellules dendritiques immatures sont incubées pendant une durée allant de 1 h à 48 heures, avec la concenfiration finale sélectionnée du composé adjuvani peptidique.
L'invention est également relative à une population de cellules enrichies en cellules dendritiques matures chargées avec un composé
adjuvant ou avec une composition adjuvante telles que définies ci-dessus. lJn composé adjuvant selon l'invention peul donc étre détecté, par e~~emple à l'aide d'un anticorps dirigé spécifiquement contre ce 2~ composé adjuvant, indifFéremment dans le c~rtoplasme ou à h starface r~~~n~branair~ de c~a cellulase d~ndritic~~a~s a~ui s~nt s~asc~ptibl~s râ'~tr~
obtenues par le procédé de maturation tel que défini ci-~less~as.
Les, ccsllules der~dritiq~~es nlat~ares ~aL~tenues sel~an le procédé dP
maturation ci-c~ess~as s~nt caractc~risf~es c~n ce ctu'elles e~~prin~ent simultanément les molécules de classes I et de classe II du Ci~9lH ainsi que les marqueurs spécifiques des cellules dendritiques matures CD40 CDI30 et CD86.
La présente invention a aussi pour objet une composition cellulaire adjuvante de l'immunité, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une population de cellules dendritiques matures chargées (i) avec un composé adjuvant ou avec une composition adjuvante telles que définies ci-dessus, et (ü) chargées avec l'antigène d'intërét susceptibles d'âtre obtenues par le procédé de maturation ci-dessus.
De préférence, une dose de composition cellulaire adjuvante de l'immunité telle que définie ci-dessus, pour l'administration aux patients, comprend un nombre de cellules dendritiques matures allant de 106 à
109 cellules dendritiques matures syngéniques, avantageusement de 10' à 109 cellules syngéniques.
~ans une composition cellulaire adjuvante selon l'invention, les cellules dendritiques matures sont de préférence en suspension dans un milieu liquide salin nécessaire à leur survie pendant quelques heures, de préférence au moins trois heures.
De maniére tout à fait préférée, les cellules dendritiques matures sont en suspension dans un milieu de culture approprié comprenant la totalité des éléments nutritifs permettant leur survie à long terme, par ez~empfe pendant plusieurs jours, de préférence pendant au moins ~
jours.
L'invention est également relative à un procédé pour fabriquer une composition cellulaire immunogéne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) cultïver irr vitro une population de cellules enrichïes en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, dans un milieu de culture approprié;
b) incuber les cellules cultivées à l'étape a) avec un composé
~5 p~ptidiqu~ ~dj~av~nt ou encore ~~.~ec une composition adjuvante telle q~ae d~fir~ie préc~~9~~-cmer~t, pendant une râurée ~~.9ivisarate ~aour induïre la maturation des oellu~les dendritiques ;
c) alo~ater a~a~~ cellules cultmees a l'etape b) aga rl~~ms pan antigene d'intérét à l'enc~antre d~aq~a~l pane réponse immunitaire est recherchées ~0 Selon le procédé ci-dessus, l'étape c) d'incubati~n des cellules dendritiques avec au moins un antigéne d'intérét peut indifférement âtre simultané à l'étape b) dans laquelle le composé peptidique adjuvant est incubé avec les cellules, ou au contraire âtre postérieur à l'étape b).
T~utef~is, et de maniére tout à fait préférée, les étapes b) et c) sont ~5 ré2~lisées de maniére sirn~altanée.

L'invention a également pour objet un procédé pour fabriquer une composition cellulaire immunogène caractérisé en ce qu'if comprend les étapes suivantes a) cultiver in vitro une population de cellules enrichies en cellules dendrïtiques humaines ou animales dans un milieu de culture approprié;
b) incuber les cellules cultivées â l'étape a) avec un conjugué
immunogène tel que défini précédemment, pendant une durée suffisante pour induire la maturation des cellules dendritiques.
Dans les procédés pour fabriquer une composition cellulaire immunogène ci-dessus, la concentration finale ajoutée aux cellules dendritiques est variable selon la nature et le poids moléculaire de l'antigène d'intérét considéré. Par exemple, le peptide GP33 du LGMV
est ajouté aux cellules dendritiques. Pour chaque antigène d'intérêt considéré, l'homme de l'art pourra adapter la concentration finale qui doit âtre ajoutée à l'étape c) (premier procédé), ou la concentration finale de conjugués immunogénes qui doit être ajoutée à l'étape b) du procédé
(second procédé), gràce à ses connaissances fiechniques générales concernanfi le chargement de cellules dendritiques avec un antigéne d'intérét.
Les conditions générales des procédés de fabrïcation d'une composition cellulaire immunogène ci-dessus sont par ailleurs identiques à celles utilisées pour le procédé de maturation de cellules dendritiques quï a été décrit précédemment.
L'homme de l'art peut également se référer au6~ e~:emples du ~â ~arPsent brevet dans lesquels sont donnés to~,~s les détails de ~aréparation eâ°t~ne comp~sition cr~ll~alaire ïrnrr mn~génrs selon l'ïn~a~:ntiran.
L'invention a égalernent pe~~ar objet pane compositi~ar~ celhaleire ir~~m~ancgéne, caractérisée en eue qu'elle conlprena~ pane ~»~p~a(ation ale cellules dendrïtiquc~s matures chargées avec l'antigéne d'ïntérét ~bten~a par les procédés pour sa fabrïcati~n qui sont décrits ci-dessus.
Les cellules dendritiques matures chargées avec l'antigène d'intérét sont caractérisées en ce qu'elles expriment les molécules de classe I et de classe II du CMH, ainsi que les marqueurs spécifiques des cellules dendrïtiques matures CD4.~, CDgO et C~~6. De plus, ces cellules présentent à leur s~arFace des fragments peptic~iques de l'antigène d'intérêt à l'encontre duquel une réponse immunitaire est recherchée L'invention est également relative à une méthode pour immuniser un organisme humain ou animal à l'encontre d'un antigène d'intérêt, laquelle méthode comprend une étape au cours de laquelle on administre à l'individu une composition cellulaire adjuvante telle que définie ci-dessus, préalablement, simultanément, ou postérieurement à
une étape d'administration de l'antigène d'intérët.
L'invention a également pour objet une méthode pour immuniser un organisme humain ou animal à l'encontre d'un antigène d'intérët, laquelle méthode comprend une étape au cours de laquelle on administre à l'individu une composition cellulaire immunogène selon l'invention.
La présente invention est en outre illustrée par les exemples suivants ~~IuV~'~..~~
A. I~i~'i~E~I~L Vii' E~'~~~~~
A.1 Préparation des adénovirus (Ad) et des protéines de capside d'adénovirus (Ad), y compris des composés peptidiques adjuvants selon l'invention.
L'adénovirus Ad5E1 est un adénovirus de sérotype 5 défectif pour la réplication et délété à la fois dans les régions précoces E1 et Eue.
L'adànovirus Ad5 E1 ° porte des protéines fibres de type sauvage (1~IT) ?a (f~lolini~r-Frenl~~l et al., ~00~).
L'adinncw~r~as ~r35E1~~ Ivncb, mutant c~~ d~l~ti~n polar la pr~a-téinc~
fibre, est dèrivé de l'adén~~ir~as a~d5E1 ° par l'insertion c~'~an col~n st~ala "papale ~a dans le gène cn~da~-~fi I~-~ fibre, en a~°al d~a signal ~3~
trimérieat;i~an e~~firinsèq~ae contenu dans la tige de la fibre (E~iagn~ass~n et al., X001 ;
Hong et al., ~00~).
La fibre résultante est dépourvue de la totalité du domaine tëte (ee lcnobless ») et contient seulement le domaine queue ainsi que les sept motifs répétés de l'extrémité N-terminale de la tige, c'est-à-dire les résidus d'acides aminés 1 à 157 de la protéine fibre.

La figure 1 présente la structure schématique des fibres des adénovirus Ad5E1 ° et Ad5E1 °D knob. Les virions Ad5E1 °
et Ad5E1 °d knob ont été isolés par ultracentrifugation isopycnique dans un gradient continu de chlorure de césium (Molinier-Frankel et al., 2002). Les 5 protéines de capside Hexon (désignés de manière abrégée « Hx ») et les capsomères de penton (désignés de manière abrégée <e Pn », pour la combinaison penton base + fibre ) ont été isolés à partir de cellules HeLa infectées avec l'adénovirus de sérotype 5 sauvage WT AdS.
Les protéines penton-base (aussi désignées « Pb >a), fibre (aussi 10 désignées c< Fi ») et domaine tête de la fibre de fadénovirus sauvage de sérotype 5 ont été isolées sous la forme de protéines recombinantes à
partir de cellules Sf9 infectées par un baculovirus.
On a également analysé quatre protëines fibres de fadénovirus Ad5 mutées, portant des délétions de longueur variable dans le domaine 15 tâte (Sentis et al., 1999), respectivement les protéines mutantes désignées FiA4~0~-450, FiAHI, Fi~EF et Fi~LT4.55 - 456 sur la figure 613.
Oes protéines fibres mutées ont été produites sous la forme de profiéines recombinantes dans les cellules Sf9.
Les pr~téines d'adénovirus ont été purifiées selon un pr~tocole 20 décrit par Molinier-Frenkel et al. (~00~), l~arayan et al. (1994.) et fVovelli et al. (1991 ). Eriévement, les protéines d'adénovirus ont été purifiées par un pr~cédé comprenant les trois étapes suivantes (i) Précipitation au sulfate d'ammonium, (ü) chromatographie liquide haute performance à échange a1'~nions et (iii) ét~p~ de c~ar~c~r~tr~tior~-~altr~filtr~ti~E~ ~ l'aide de r~~~rr~br~n~~
de concentr~ati~an ayant pan secaü ale c~~ap~are de 100 !~~a.
Les ~cll~ntillons ~7~ ~arotéines ont cté analysés Per (es techniques classiques d'c~lec~tr~aphorése star gel de S~S 1~~4~-p~lyacryl~mirâ~
30 (V~iolinier-Frenhel et al., ~00~) et d'immunca-empreinte (l~.arayan et al., 1994.).
On a testé la présence possible d'endotoxines dans les préparations de protéine et d'adénovirus, en utilisant le tesfi de lysat d'amoeb~cyfe du Lir~c~lcas p~ly~hemus (E-TO~AATE~ ; sigma), en utilisant comme témoin standard ie lipopolysaccharide (LPS) de E. c~li du sérotype OS5 : B5.
La concentration d'endotoxine dans les différents lots de protéines n'a jamais dépassé 30 pg/ml aux doses utilisées pour la stimulation des cellules dendritiques. A cette concentation, les échantillons de protéine Hx n'ont jamais induit la maturation des cellules dendritiques à un niveau supérieur au bruit de f~nd des cellules dendritiques non stimulées (voir figure 2). Les virions d'adénovirus purifiés sur gradient de CsCI étaient totalement exempts de contamination détectable par i'endotoxine.

A.2- ~btenti~n et culture des cellules dendritigues.
Le procédé a été adapté à partir de la technique décrite par Mayordomo et al. (1995). ~es cellules de moelle osseuse de souris G57BU6 (H2b), (Harlan, Gannat, France) délétées en lymphocytes ont été cultivées pendant une nuit dans un milieu de culture complet (RPMI
140 additi~nné de 10~/~ de sérum de veau fcastal (FCS), ~ mM L-glutamine, ~0 pai~l-mercaptoéthan~I, 100 U/ml de pénicilline, 100 ~ag/ml de streptomycine ). Les cellules non adhérentes ont été prélevées et remises en suspension dans du milieu de culture complet en présence de 2000 U/ml de ~M-CSF recombinant (r~M-CSF, R ~ System, Mineapolis, Minnesota) et 100 U/ml d'IL4. recombinante (rIL4., R ~
System). Le milieu de culture a été remplacé au jour 4. Au jour 6, des fractions aliquotes des cellules n~n adhérentes ont été remises en suspension à la densité de 3~z10~/ml dans du Campon PSS c~ntenant 1~/~
de F~Sa Les c~ll~al~s ont ensuite été incc,~bées pendant pane heure à ~~'~~
(i) ~~ns (cellules c~~ndriviques non stim~alc~es ; I~~S-~~), ~u (ü) wec des c~mp~sants de capside r9'l~d~, ou (iii) avec des fracti~ns chren-~~t~agra~ahiq~aes cerresporadante~ obtermes ~ ~a~yir des e~a~:r~ite de cellules Sf9 ïr~fect~ee avec un vc~cte~ar de b~cul~avir~as vic~c~ (cellules dendritiques stimulées par le vecteur vide ; f~iS-~~), comme cela est indiqué dans les légendes des figures.
Après une heure d'incubation, la concentration cellulaire a été
ajustée à 3 x 105 cellules par ml avec du milieu complefi additionné de GM-CSF. ~es cellules témoins ont été incubées avec 1 pg/ml de LP r de ~ c~li (sigma).

Au Jour 8, les cellules ont été récupérées et analysées par des techniques de cyrométrie de flux, de réactions mixtes lymphocytaires (MLRs) et des techniques d'immunisation. Au Jour 8, les surnageants de culture ont été recueillis. Pour les expériences décrites et illustrées dans la figure 4A, (es cellules dendritiques ont été purifies en utilisant des billes magnétiques conjuguées avec un anticorps monoclonal anti-CD11c de souris (Mlltenyi Biotech).
Les cellules dendritiques ont été lavées dans du tampon PBS
contenant 1 % de FCS. Aprés incubation avec un anticorps anti FCIIIIIIR(2.4G2 ; Pharmingen), les cellules ont été incubées avec des combinaisons variées des anticorps monoclonaux suivants (tous commercialisés par Pharmingen) : anti-I-Ab (AF6-120.1 ) et anti-CD40(3/23), conjugués é PE anfii-CD11 c (HL3) et asti-CD80(16-1 OA1 conjugués à FITC, anti-H2-Db(28-8-6) et anti-CD86(GL1 ) biotinylés +
streptavidine-PerCP (Bedon Diclcinson). On a aussi utilisé les anticorps monocl~naux de s~uris anti-fibre-queue (4D2.8 ; H~~IG et al., 1907).
Pour la coloration du récepteur CAR, des cellules dendritiques au J~ur 8, des cellules de la lignée CH~ (ATCC hl°CCL-81 ) et des cellules de la lignée Hela CCL-2 ATCc CCI2 et CHC ont été marquées avec un anticorps monoclonal provenant d'ascite E1.1 anti-CAR, ainsi qu'avec un ascite témoin. lJne contre coloration a été réalisée en utilisant des IgG
anti-souris de rats biotinylé et un conjugué streptavïdine-PE. Les analyses en cytométrie de flu~~ ont été réalisées sur un appareil FACSCa~libur (Becton Dichinson).
2~
~.~ T~s~~ ~~~ofi~~~w~c;l~ ~~ e~~~~~'~
I~~~ar les réacti~ns rni~:~kes lymphocytaires (i~lLl~s), ces cellules alena~riti~~ae~ ~~a J~a~ar 8 ~an~k Pté distrila~ar~e~ ~ des a9oses croissantes dans des puits de culture et co-cultivées pendant 4 j~~ars avec des fracti~ns aliquotes de splér~c~cytes purifiés CD~I.'~ (2 ~~ 105 cellules/puits) allogéniques (Balblc, H2d). La prolifération des cellules T CD4+ a été
mesurée par incorporation de 3H-thymidine (1 NCilpuits) pendant les dernières 18 heures de l'étape de co-culture. Pour la mesure de la production d'IL12 et de Tf~Fo, les surnageants de culture des cellules dendritiques au Jour 3 ont été testés en utilisant les kits ELISA IL1~p70 et TNFc~ (Pharmingen).
A.4 Peptides Le peptide 33-41 de la glycoprotéine du LCMV (ItAAVI°NFATM), et le peptide 366-374 de la nucléoprotéine du virus de l'influenza (ASNENMETM), qui sont désignés de manière abrégée respectivement GP33 et NP366, sont commercialisés par la Société NEOSYSTEM
(Strasbourg, France).
A 5 Essais d'immunisation et tests de rejet des splénocytes margués au CFSE.
~es souris C57BLI6 ont été immunisées de manière sous-cutanée (s.c.) dans le flanc avec 2,5x105 cellules dendritiques maturés en présence des difFérents composants de capside de l'adénovirus puis chargées avec GP33 ou NP366 (10'~M). ~ix jours après, les souris ont re~~a une injection intraveineuse de 3~<l0~splénocytes syngéniques marqués avec le colorant fluorescent 5-d-carboxyfluorescein diacétate succinimidyl ester (~FSE ; Molecular Probes) comme décrit par CâEHEN
et al. (1997). Le pourcentage de cellules donneuses CFSE+ au sein des splénocytes ou des lymphocytes du sang périphérique (PBLs) receveur a été déterminé en utilisant une analyse de cylométrie de flux (FACS). Le rejet des cellules du donneur a été calculé en utilisant la formule suivante ratina d~a ~A~ de cellules ~FSE+ dans les souris immunisées/ ~9~ de cellules ~F~E~~ che' les souris r~~ï~es] ~~ °i ~0.
n.~ ~ ~~r~~ EL~~~~~~T-I~~~~~.
~es rnicroplaq~aes dry nitr~cellulose (f~lillipore) ~nt été re~u~erl;es avec un anticorps de rat anti-IFi~y de souris (1~4-6A~ ; Pharminc~en), puis les puits ont été lavés et saturés avec du milieu complet. ~es fractions aliquotes de splénocytes fraichement isolés (106 cellules/puits), ou de lymphocytes du sang périphérique (PBLs) fraîchement isolés (2 x 105 cellules/puits), en triplicata, ont été ajoutés aux puits de culture dans du milieu c~mplet c~ntenant 30 U/ml de IL2 rec~mbinant humaine (hrlL~, Boehringer) et 10-6 M des peptides GP33 ou NP366. Après une culture de 20 heures à 37°C, les cellules secrétant de l'IFN~y forment des spots (SFC). Les cellules sont comptées selon la technique décrite par Molinier-Frenke) et al. (2002). Les valeurs obtenues avec le peptide NP366 ont été soustraites de la moyenne des valeurs des tests en triplicats obtenus avec le peptide GP33.
A.7 Tests de cyto~toxücité
Des splénocytes de souris immunisées avec les cellules dendritiques ont été cultivés pendant 4 jours avec 10'~ M de peptide GP33. Ces cellules ont ensuite été testées en duplicat à différentes quantités de cellules efFectrices pour une quantité fixe de cellules cibles EL-4 marquées au ~~Cr (10~' NCi par cellule) qui ont été incubées avec le peptide GP33 ou NP366. Après une culture de cinq heures à 37°C, les surnageants de culture ont été recueillis et la radioactivité a été mesurée à l'aide d'un appareil du type Top-Count (Packard Instruments). Dans les échantillons témoins, les cellules EL4 cibles ~nt été incubées avec le milieu seul afin de déterminer le ni~,~eau de relarguage spontané de 5~Cr, et avec 2~/~ de br~mure d'alkyltriméthylamm~nium (Sigma) afin de déterminer le relarguage total de 5'Cr.
~. I~ES~LTA'i~
E~~EI'P~.E ~ : Effet ces c~rn~csanfs de capside is~lés de I~adér~~~ir~s de sérc~~~e ~ (d~~ sur le ~hén~~t~e des cellules '~5 ~',r~c~u~~rfi~ei~~W~~~.
Des c~ll~al~~ r~~ndritir~~aes in~rnat~are~ ~nt ~ac~ inc~ab~~s wec Ici caps~rnéres gent~n (Pn) ~ca he~~on (P~~~) qtai ~an~t été purifiées à parlïr de cellules i-IeLe infectées evec ~d~. L~ r~aj~~rif,é des cellules dendritigues, stïmulées avec H~~ présentait un faibli nivc ~~a de pi~én~type met~are, comparé au~~ cellules dendritiques non stimulées (i~S-DC), avec une faible expression des molécules de classe il du CMFI, et les molécules cDa.o, CDSO (B7.1) et cDSS (B.7.2) , c~mme cela est montré sur la figure 2A. Au contraire, les cellules dendritiques stimulées avec le penton (Pn) ont exprimé massivement un phénotype mature , similaire au phén~type observé p~ur les cellules dendritiques stimulées par le LPS, avec un haut niveau d'expression des difFérents marqueurs, comme cela est illustré sur la figure 2A.
Du fait que le capsomère Pn d'adénovirus est constitué de deux entités structurelles, respectivement le penton base (Pb) et la fibre (Fi), S les expériences suivantes ont été mises au point afin de déterminer laquelle de ces deux protéines constitutives, respectivement Pb ou Fi était responsable de la maturation des cellules dendritiques.
Les cellules dendritiques ont été ensuite stimulées avec des protéines recombinantes Pb ou Fi isolées à partir des extraits de cellules 10 d'insectes Sf9 infectées. Les protéines recombinantes complètes Pn et Hx ~nt été utilisées en tant qu'échantillons témoins.
Les résultats obtenus indiquent que la protéine Fi suffit à
reproduïre la totalité de l'efFet stimulant produit par ies capsomères Pn, alors que la protéine Pb seule n'induit aucun effet détectable sur la 15 maturati~n des cellules dendritiques, comme cela est illustré sur la figure ~B.
~~~EiF'~.~ ~ : I~~le dla~ dlcm~.üne téta d~ I~ r bru da~~ I~a rna~aarati~~
des cellules dendritie~ues par l'adén~vir~as et ~aar la ~r~~Eéine fibre.
2Q Domme cela est mentionné ci-dessus, la fibre d'adén~virus comprend trois domaine structurels, respectivement, de son extrémité lu-terminale vers son extrémité C-terminale, la queue (« tail a>) la tige (~e schafit agi) et la tâte (e< knob ~~). Le domaine téie a été exprimé sous la forme d'une pr~téine rec~mbinante, selon les techniques décrites par ~ f~~~~ELLI et al. (~ I~I~~ ) et par Hong efi al. (~ gg d ). Les cellules dendritiques a~ui ~ar~t ~t~ ir~c~,~la~es ~~ec le 7oru~~in~ ié~te de~ la fibre carat e«priri~~~es un phén~vype mature, similaire à celai cabser~é ae~ec les cellules dendriti~,~aes stir~~alées 2~~.pec I~ pr~tPine fibre Fi compléta, comme cela illustré sur la fi~~are ~~.
30 Les cellules dendritiques stimulées a~rec le domaine tâte de la fibre sont capables d'induire f~rtement la prolifération de cellules T C~4+
allogéniques dans un essai de réaction lymphocytaire mixte (Ii~lLR) comme cela est illustré sur la figure 3B. De plus, le degré de maturation des cellules dendritiques varie en f~ncti~n des concentrations ~ cr~aissantes de pr~Eéinr~ d~a domaine tète de la fibre (figure ~B).

A la dose maximale de protéines de domaine téta utilisée (0,5 Ng), les cellules dendritiques stimulées par le domaine tête stimulant des cellules T CD44 allogéniques plus efFicacement que les cellules dendritiques témoins non stimulées (NS) ou les cellules dendritiques stimulées avec la protéine Hx.
Cependant, aucun effet détectable n'a été obtenu avec la dose de 0,02 pg de protéine tête. De manière intéressante, la valeur de réaction lymphocytaire mixte (MLR) pour la dose de 0,2 Ng de protéine tëte était similaire à la valeur obtenue avec une dose de 1 pg de protéine fibre, Ce résultat est compatible avec le fait que la quantité de protéine de tête présente dans un échantillon de 0,2Ng de protéine tête correspond grossièrement à la quantité de protéine tête contenue dans un échantillon de 1 Ng de protéine fïbre. La protéine téta a induit également la sécrétion d'IL-12 et de TNFcx de manière dose-dépendante, comme cela est illustré sur la figure 3C.
~n a ensuite cherché à savoir si le domaine tête était capable de cibler directement les cellules dendritiques et d'induire leur maturation, sans la parl:icipation de cellules infiermédiaires. Dans ce but, des cellules CDllc+ ont été purifiées en utilisant des billes magnétiques recouvertes d'anticorps anti-CD1lc, les cellules CD1lc+ purifiées ayant été utilisées pour des tests de maturation. Bien que les cellules dendritiques non stimulées soient capables d'augmenter l'expression des molécules du CI~Fi et des molécules co-stimulatrices, les cellules dendritiques stimulées avec le domaine tâte ebrpriment un phénotype significativement ~ plus mature q~ae les cellules témains (figure ~~).
Cie plus, ran a r~~ontrc~ q~.ae Is~ pr~atc~ir~~ Fi rec~arnbinanke ctait capable de se fiz~er saar les cellules dendritiques immatures, avec ~~~~~ de cellules p~si~~i~°es aga ~c~cr ~ câe c~alt~are (fiig~are ~CB). Clans cette e~~~a~ri~;r~ce, la protéine Fi liée a~a~~ cellules a été détectée en ~atilïsant pan ~nticor~as monoclonal anti-queue, ce qui implique q~ae l'épitoge contenu dans la queue était accessible, et ce qui suggère que l'attachement de la protéine Fi à la surface cellulaire s'est réalisée via le domaine tâte. Ces résultats suggèrenfi fortement que les cellules dendritiques constituent les cibles directes du domaine tâte de la protéine fibre de l'adénovirus.

Afn de déterminer si l'effet du virion Ad5 sur l'activation des cellules dendritiques était aussi directement réalisé par l'intermédiaire du domaine tëte de la fibre, on a réalisé des expériences comparatives en utilisant (ü) le vecteur Ad5E1 °, un vecteur Ad5 portant des projections de S fibre Fi sauvage (WT) ou (ü) ie vecteur Ad5E1 °~ lenob, un vecteur Ad5 dépourvu du domaine tëte. Lors de l'incubation avec te vecteur Ad5E1 °, on a observé une augmentation de l'expression des marqueurs de maturation des cellules dendritiques (figure 3C), comme cela était attendu au vu des observations antérieures de Hirshowitz et al. (2000) et de Morelli et al. (2000).
En utilisant des doses identiques des particules du vecteur Ad5E1°~ knob, on a montré que les cellules dendritiques exprimaient un phénotype significativement moins mature qu'après incubati~n avec le vecteur Ad5E1 °
Ces résultats ca~nfirment que le domaine tëte de la fibre est le facteur stimulant commun de t~us ies composants viraux. actifs, et que le domaine tâte p~rte la mai~rité des déterminants responsables de la stimulation des cellules dendritiques marines ~bservées avec les viri~ns AdS, le capsemére ccamplet Pn, la pr~téine fibre c~mplète, et la protéine recombinante du d~maine tëte de ia fibre isolée.
EEPLE 3 : Absence de fi~ati~n du d~maine tëte de la ~r~téine ~~re d'adén~virc~s au réce~teaar ~AI~.
~ans la littérature, on a largement m~antré que les cellules 2~ dendrit~ig~aes n'e~~primeni pas le récepte;~ar ~~aF~~.
cependant, can ~ analysé, per cytornétrie ~~e fluzâ (F~~~) l'e~spre~sic~n c~e cet~~ pr~téine cr~aci~ale p~tar la fi~taticn r2~a dc~rrraine téta ~~ar les cc~ll~ale~ ~lendritiq~aes diffi~renciées, d~lns les canditi~an~ de c~al~:ure ~atiliséc~s dans le présent travail.
Cn a utilisé, comme tém~in p~sitif, des cellules FleLa qui s~nt connues pour exprimer environ de 10.000 é 30.000 molécules CAR
cellule, et des cellules de la lignée CH~ en tant que témoin négatif.
On n'a pu détecter aucune expression de CAR au-dessus du bruit de fond des ascites témoins sur les cellules dendritiques immatures recueillies avant stimulation, en dèpit d'une coloration hautement spécifique des cellules HeLa, comme cela est illustré sur la figure 5A.
On a réalisé des tests afin de déterminer si le mécanisme de stimulation des cellules dendritiques par le domaine tâte impliquait une pénétration effective de l'adénovirus et une expression de ce gène. ~n a utilisé un vecteur adénoviral de sérotype 5 codant une protéine Enhanced Green Fluorescent Protein » (EGFP) à deux valeurs d'indice d'infection (MOI) 10.000 et 30.000. Comme cela est illustré sur la figure 4C, un indice M~I de 10 000 particules virales par cellule induit en effet une maturation efficace des cellules dendritiques. Cependant, une expression significative de la protéine fluorescente EGFP par les cellules dendritiques n'a été observée qu' à la dose de 30 000 particules par cellule (figure 4C) ce qui indique un faible degré de permissivité à
l'infection , par l'adénovirus des cellules dentritiques.
E~~EIPD_E ~- Caf~~ra~hie de la région du d~mair~e tète de la ,~r~~~;ine fige re~w~~~s~bV~ ~e la ~~~~ar~ti~r~ d~~ ~~II~I~~
dendritiques.
~n a testé l'induction de la maturation des cellules dendritiques avec quatre mutants de protéine fibre de l'adénovirus Ad5 portant des délétions dans le domaine tète (figures 6A et 6B). La délétion présente dans la protéine fibre recombinante ~4.0~-4.81 rec~uvre la boucle peptidique AP, les feuillets ~ P et C, la boude peptidique C~ ainsi que la partie ~I-terminale de la bouche peptidique ~G. La protéine fibre 2~ recombinante matée Fi~HI est seulement d~:po~arv~ae de la bo~aele pe~atidiq~ac~ FOI. f~e~a~s ~~atre~ prratéincss Fi matées reeonWin~nt~a, rpspectiven ent Fi,~EF et Fi~Li'485-485, partent des déléti~ans dans h région courte cl~a d~a~able feuillet ~ anti-pa~ralléle EF (Fi~EF), osa ~~r~e délétion des cl~u~~ résidus d'acides aminés Iq.85 et 1485 quai f~rm~n~k le feuillet ~F (Fi~Li485-~4~85) (e~~ir Féirl~y et al., X00~ et ~5ia et al., 9993).
Les protéines Fi mutées Fi~EF et Fi~LT 4.85-486 se présentent sous la forme de fibres trimériques, alors que les protéine Fi mutées FiA402-481 et ~Hi sont déficientes pour la trimérisation de la fibre (voir S~antis et al. , 1999).

On a comparé !activité de maturation des ceNules dendritiques du domaïne tâte sauvage (WT) et des protéines fibres mutantes décrites dans la figure 6E, dans un test de réaction lymphocytaire mixte (MLR).
On a utilisé quatre fois moins de domaine tête sauvage (WT) que de protéine fibre mutée, pour stimuler les cellules dendritiques, afin d'avoir dans tous les essais approximativement la méme quantité de domaine tête.
Comme cela est illustré sur la figure 6C, le mutant FidHi a conservé la totalité de l'activité de maturation des cellules dendritiques portées par le domaine tâte sauvage, ce qui implique que la boucle peptidique Hi distale ainsi que la structure sous forme de trimère du domaine tâte ne sont pas requis pour l'induction de la maturation des cellules dendritiques.
Les trois autres protéines fibre mutées, respectivement Fi~402-4~1, Fi~EF et Fi~LT 4~5-4~6 n'ont pas induit de maturation des cellules dendritiques, ce qui suggère que la régi~n en d~uble feuillet ~ anti-parallèle EF, et plus spécifiquement le feuillet ~ cour! F, est indispensable peaur l'effet de maturation des cellules dendritiques.
Pour une évaluation de l'effet in ~riv~, on a comparé les cellules 2Q dendritiques stimulées avec le domaine tâte de la protéine fibre avec des cellules dendritiques stimulées avec d'autres composants de l'adénovirus, pour leur efficacité dans l'induction d'une réponse cellulaire T C~3+ spécifique du peptide OP33 dérivé de la glycoprotc~ine du LCI~1~', qui est restreint é l'haplotype ~b.
On a utilisé le colorant vital fl~a~rescent CF~E afin de s~'ivre f~~il~~,~rn~;nt I~~ pr~~~~nc~ dc~~ ~,pl~noc~~tc~s trdn~f~r~~ d~~ rnanic~r~
adc~ati~re par analyse ~âe cytométrie de fl~a~ et par ~ntr~le de leur élirninati~n par I~~, cellules T CC~3~ spècifiq~ac~s induites par l'irrrn~~anisation par Ips cellules dendritigues.
C~mme cela est illustré sur la figure ~~, la population de cellules de rate marquées au CFSE et chargées avec le peptide GP33 a diminué
en ~4 heures dans le sang de toutes les souris immunisées avec les cellules dendritiques stimulées par les protéines Pb, Hx, ou la protéine du domaine tête de la fibre et mis en contact avec le peptide GP33.

Cependant, un rejet des cellules signil:ICativement plus rapide a été observé chez les souris traitées avec les cellules dendritiques stimulées avec le domaine tête de la fibre, avec une vitesse de rejet similaire à celle observée chez les souris immunisées avec le peptide 5 GP33 émuisifié dans de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA). La courbe de rejet des cellules chez les souris immunisées avec les cellules dendritiques stimulées avec le domaine tëte de la fibre est chargée avec le peptide NP366 est identique à la courbe observée chez les souris immunisées avec les cellules dendritiques chargées avec le peptide 10 GP33 et mise en présence de Pb ou Hx, ou encore non-stimulées.
Comme cela est illustré sur la figure 7A, les cellules dendritiques maturés avec le domaine tête de la fibre sont dix fois plus efficaces pour induire le rejet des splénocytes syngéniques que les celltales dendritiques stimulées par les autres composants d'adénovirus, comme cela est 15 suggéré par la comparaison des effets obtenus en immunisant avec 3x104 cellules dendritiques stimulées par le domaine tête, à comparer avec les efFets obtenus aprés l'immunisatïon avec ~,~ , ~~ ~ fà5 Filiales dendritiques stimulées avec I-Ix et Pb.
Comme cela est illustré sur la figure 7A, l'analyse des cellules 20 CF~E+ dans les rates des souris receveuses, 10 jours après le transfert adoptif, ont fourni des résultats encore plus significatifs 5% des cellules CFSE+ ont persisté chez les souris immunisées avec des cellules dendritiques stimulées par le domaine tête de la fibre, alors que les cellules CF~E+ représentent respectivement '~~°/~ et 60~/~ des cellules ~ ~F~E+ inil:iales cher les souris immunisées avec des cellules d~n~âritiq~aes stin-~ul~~s r~sp~ctiv~mc~nt per les prcatéines Pb ~~t H~s.
Diz~ j~urs aprés le transfert adoptif des splén~cyl;es marqués aga ~F~E (ce qui correspond aga ~~a~ar ~~ aprés l'imrrmnisation pair lee, cellules dendritiques), on a déterr~~ïné le nombre de cc~llulc~s T ~~3%
30 sécrétant l'IF~Iy en réalisant des tests ELISP~T e~ vi~~ca.
Comme cela est illustré sur la figure 7P, on n'a pas observé
d'induction significative de cellules T spécifiques du peptide GP33 chez les souris immunisées avec les cellules dendritiques stimulées avec les pr~téines x ou Pb, puis chargées avec le peptide C~P33 et, ni chez !es souris ïmmunisées avec les cellules dendritiques stimulées avec le domaine tëte de la fibre et chargées avec le peptide NP366.
En revanche, on a détecté un nombre significatif de cellules T
secrétant l'IFNY à la fois dans la rate et dans le sang des souris S immunisées avec des cellules dendritiques maturées avec le domaine tëte de la fibre et chargées avec le peptide GP33.
De manière intéressante, il existe une corrélation entre l'induction de la réponse cellulaire T spécifique du peptide GP33 et le nombre de cellules dendritiques stimulées par le domaine téte de la fibre qui ont été
utilisées pour l'immunisation.
En particulier, on n'a détecté aucune réponse après immunisation avec 3 x 10ø cellules dendritiques stimulées avec le domaine tëte et chargées avec le peptide GP33, en dépit de l'observati~n du rejet des cellules CFSE+.
~n a ensuite testé l'activité cytotoxique de cellules de rate restimulées îe~ vi~r~, mais ~n n'a observé aucune activité cyt~lytique spécifique cher les souris immunisées avec ~ ~z ~ 0~ cellules dendritiques non stimulées (hIS-~C). En revanche, c~mme cela est illustré sur la figure 7G, on a m~ntré que les cellules effectrices obtenues avec les cellules dendritiques stimulées par le domaine tête de la fibre étaient capables de lyser les cellules EL4 chargées avec le peptide GP33 avec une grande efficacité.
~~t'~~~~~~I~i'~S
Les ré~~alt~fi~ pré~Pnfiés clans les e~ze;mples m~nfirent g~ae l'effet a~~a dcarrrair?e teste rie la pr~téine fibre star la r~~~tursfii~ary des ceII~aI~Ls dendritig~aes dépend de l'ir~téc~rité et de la str~act~are d~a feuillet ~ F
~résid~a d'acide arriiné en posü~ien 4~~ et 4~~~ de la protéine de fibre ~~mpléi~e), mais ne dépend pas c7'autres str~act~ares râpa deamaine tëte, telle que la bouche peptidique HI. ~e plus, les résultats des e~~emples montrent que l'activité de maturation des cellules dendritiques induite par le domaine tëte de la protéine fibre de l'adénovirus ne requiert pas que le domaine tëte se présente sous la forme d'une structure trimérique.
Le demandeur a également montré que bien que ces résultats ne ~5 soient pas présentés dans les e~~emples cï-dessus, une activïté de maturation par stimulation des cellules dendritiques avec un vecteur d'adénovirus portant des fibres chimères constituées d'une partie queue et d'une partie tige de l'adénovirus de sérotype 5 et du domaine téta de l'adénovirus de sérotype 3. Ces derniers résultats montrent que les S molécules de surFace des cellules dendritiques sont capables de reconnaitre des domaines tâte d'adénovirus qui sont pourtant distants d'un point de vue phylogénétique.
Ces résultats montrent aussi que l'interaction entre le domaine tâte d'un adénovirus et la sur('ace embryonnaire des cellules dendritiques implique vraisemblablement des structures peptidiques secondaires conservées, plutôt que ces résidus d'acides aminés individuels conservés dans le domaine tâte.

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Claims (15)

1. Composé peptidique adjuvant de l'immunité consistant en:
- un polypeptide (i) comprenant une séquence d'acides aminés de 30 acides aminés de longueur contenue dans le domaine « tête >> de la protéine << fibre » de la capside d'un adénovirus, ladite séquence d'acides aminés comprenant l'enchaînement d'acides aminés formant la structure en double feuillet .beta. désignée « EF » contenue dans ledit domaine « tête » ; ou - un peptide (ii) analogue dudit polypeptide (i) dont la séquence en acides aminés comporte, par rapport à la séquence dudit polypeptide (i), au moins une substitution au au moins une délétion d'un acide aminé, ledit peptide analogue conservant ladite structure en double feuillet .beta. désignée « EF ».

2. Composé peptidique adjuvant selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pour le polypeptide (i), l'enchaînement d'acides aminés formant la structure en double feuillet .beta. désignée « E F » contenue dans le domaine « tête » de la protéine « fibre » de la capside d'un adénovirus est localisé approximativement au centre de la séquence d'acides aminés dudit polypeptide.

3. Composé peptidique adjuvant selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce la longueur du polypeptide (i) est d'au plus 195 acides aminés.

4. Composé peptidique adjuvant selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, pour le polypeptide (i), l'adénovirus est un adénovirus humain.

5. Composé peptidique adjuvant selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'adénovirus humain est choisi parmi les adénovirus des sous-groupes B ou C.

8. Composé peptidique adjuvant la revendication 4, caractérisé en ce que l'adénovirus humain est choisi dans le groupe constitué des adénovirus des sérotypes 12, 18, 31, 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 1, 2, 5,

6, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 4, 40 et 41.

7. Composé peptidique adjuvant selon la revendication 4, caractérisé en ce que le polypeptide (i) comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences suivantes:
- la séquence débutant à l'acide aminé en position 463 et se terminant à l'acide aminé en position 515 de la séquence SEQ ID N o 1.
- la séquence débutant à l'acide aminé en position 195 et se terminant à l'acide aminé en position 247 de la séquence SEQ ID N o 2.
- la séquence débutant à l'acide aminé en position 472 et se terminant à l'acide aminé en position 535 de la séquence SEQ ID N o 3..

8. Composé peptidique adjuvant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide analogue (ii) comprend de 2 à 10 substitutions ou délétions d'un acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés dudit polypeptide (i).

9. Composé adjuvant selon l'une des revendications 1 ou 8, caractérisé
en ce que le polypeptide (i) ou le peptide analogue (ii) consiste en un polypeptide cyclique.

10. Composition adjuvante de l'immunité comprenant un composé
adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9, en association avec au moins un excipient physiologiquement compatible.

11. Conjugué immunogène constitué d'un composé peptidique adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9, lié de manière covalente à un antigène à l'encontre duquel une réponse immunitaire est recherchée.

12. Composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9, ou conjugué
immunogène selon la revendication 11, pour son utilisation en tant que principe actif adjuvant d'une composition immunogène ou d'une composition vaccinale.

13. Utilisation d'un composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à
9, ou d'un conjugué immunogène selon la revendication 11, pour la fabrication d'une composition immunogène ou vaccinale.

14. Composition immunogène comprenant un composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9, en association avec au moins un antigène.

15. Composition vaccinale comprenant un composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9, en association avec au moins un antigène.

15. Procédé pour la maturation in vitro des cellules dendritiques immatures humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) cultiver in vitro une population de cellules enrichie en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, dans un milieu de culture approprié ;
b) incuber les cellules cultivées è l'étape a) avec un composant adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9 ou avec une composition adjuvante selon la revendication 10, pendant une durée suffisante pour induire la maturation des cellules dendritiques.

17. Population de cellules enrichie en cellules dendritiques matures, chargées avec un composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9 ou avec une composition adjuvante selon la revendication 10.

18. Composition cellulaire adjuvante de l'immunité caractérisée en ce qu'elle comprend une population de cellules enrichie en cellules dendritiques matures selon la revendication 17.

19. Procédé pour fabriquer une composition cellulaire immunogène, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) cultiver in vitro une population de cellules enrichie en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, dans un milieu de culture approprié;
b) incuber les cellules cultivées à l'étape a) avec un composé
peptidique adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9 ou avec une composition adjuvante selon la revendication 10, pendant une durée suffisante pour induire la maturation des cellules dendritiques ;
c) ajouter aux cellules cultivées à l'étape b) au moins un antigène à
l'encontre duquel une réponse immunitaire est recherchée.

20. Procédé pour fabriquer une composition cellulaire immunogène, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) cultiver in vitro une population de cellules enrichie en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, dans un milieu de culture approprié;
b) incuber les cellules cultivées à l'étape a) avec un conjugué
immunogène selon la revendication 11, pendant une durée suffisante pour induire la maturation des cellules dendritiques.

21. Composition cellulaire immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend une population de cellules dendritiques matures chargées (i) avec un composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9 ou avec une composition adjuvante selon la revendication 10, et (ii) chargées avec l'antigène d'intérêt.