FR3077490A1 - Nouvelles compositions vaccinales pour lutter contre le cancer du sein, et procede de preparation - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte au développement de nouvelles préparations vaccinales pour prévenir et/ou lutter contre le cancer du sein.
Description
NOUVELLES COMPOSITIONS VACCINALES POUR LUTTER CONTRE LE CANCER DU SEIN, ET PROCÉDÉ DE PRÉPARATION
DESCRIPTION
Domaine de l’invention
La présente invention a pour objet le développement de préparations vaccinales pour prévenir et/ou lutter contre le cancer du sein, utilisant essentiellement deux approches : (i) une souche de HCMV ayant des propriétés oncogènes in vitro, et (ii) une lignée cellulaire de cancer du sein après infection de cellules épithéliales mammaires humaines par la souche (i).
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
État de la technique
Le cancer du sein est un problème majeur de santé publique. Le cancer du sein est le premier cancer féminin (89 cas pour 100 000) et, malgré une amélioration du pronostic, la première cause de mortalité dans la population féminine. Environ 110 000 femmes sont traitées chaque année contre le cancer du sein en France. Environ 5% des cancers du sein ont une origine génétique tandis que 95% des cas (formes dites sporadiques ou nonhéréditaires) ont des origines environnementales. Les facteurs pouvant être impliqués dans l’apparition du cancer du sein sporadique sont les traitements hormonaux, l’obésité, une première grossesse tardive, et l’absence d’allaitement.
Parmi les facteurs environnementaux impliqués dans l’apparition de certains cancers humains, les virus jouent un rôle, soit directement par la production de protéines virales favorisant la transformation cellulaire (cancer du col de l’utérus et papillomavirus), soit par un état d’inflammation chronique (cancer du foie et virus de l’hépatite C). Récemment, il a été évoqué un rôle oncomodulateur pour le cytomégalovirus humain (Michaelis et al., Neoplasia, 11 : 1 -9, 2009) [1 ]. En effet à côté d’un rôle direct d’un virus dans la transformation cellulaire, le virus pourrait infecter le tissu tumoral et agir comme cofacteur en amplifiant les mécanismes impliqués dans l’oncogenèse, un paradigme appelé oncomodulation. Le rôle du HCMV a été évoqué dans un certain nombre de cancers, notamment des cancers du cerveau (glioblastome, médulloblastome), colon, prostate et foie (Cobbs et al., Cancer Res., 62 : 3347-3350, 2002) [2], Une augmentation sérique des IgG anti-HCMV ainsi que la détection d’antigènes viraux et de séquences du génome du HCMV dans des biopsies d’adénocarcinome du sein ont été mis en évidence (Taher et al., PLoS One, 8 : e56795, 2013) [3], Enfin le HCMV est isolé du lait en post-partum et pourrait par ce biais infecter les cellules épithéliales mammaires humaines (HMECs) tapissant les canaux galactophores. Récemment des traitements antiviraux dirigés contre le HCMV se sont montrés efficaces pour combattre le glioblastome avec un ralentissement du développement de la tumeur, indiquant que le HCMV pourrait avoir un rôle favorisant dans le développement du cancer (Soderberg-Naucler et al., N. Eng. J. Med., 369: 2066-2067, 2013) [4], Cependant, bien que des protéines et de l’ADN viral aient été mis en évidence dans des biopsies de tumeurs tels que le glioblastome et le cancer du sein, un rôle de causalité n’a pas pu être prouvé jusqu’à présent.
Ainsi les approches vaccinales actuellement développées pour combattre le cancer du sein, mais non encore commercialisées, se basent sur des vaccins à bases d’épitopes cellulaires cancéreux notamment de type HER2 pour initier une réponse immunitaire sans se soucier de l’existence ou non d’un agent étiologique à l’origine de l’apparition de ces cancers. En revanche, il n’existe pas à ce jour de traitement pour combattre le cancer du sein comme pour combattre certaines souches de papillomavirus oncogènes à l’origine du cancer du col de l’utérus. En effet, dans les années 1970-1990, il a été montré que certaines souches de papillomavirus étaient oncogènes et à l’origine du cancer du col de l’utérus (Zur Hausen, Virology,
392 : 1-10, 2009) [5], Ces souches pouvaient transformer des kératinocytes in vitro obtenant ainsi une lignée cellulaire de cancer du col de l’utérus dérivée de ces kératinocytes transformés lesquelles donnaient des tumeurs chez des souris injectées. Finalement des vaccins pour combattre le papillomavirus et le cancer du col de l’utérus ont été mis au point (Gardasil® et Cervarix®) à partir des virus oncogènes et certaines protéines virales oncogènes (Michels et Zur Hausen, Lancet, 374 : 268-270, 2009) [6],
Il existe donc un besoin majeur de santé publique de mettre au point un vaccin pour combattre le cancer du sein s’inscrivant dans cette filiation et palliant les inconvénients des traitements actuellement utilisés.
Description de l’invention
Les Inventeurs ont très récemment mis en évidence qu’une souche de cytomégalovirus humain (HCMV) est capable de transformer des cellules épithéliales mammaires, induisant des cellules cancéreuses mammaires qui injectées à la souris entraînent l’apparition de tumeur de type adénocarcinome mammaire triple négatif. Les Inventeurs ont ainsi mis en évidence que certaines souches de HCMV ont un potentiel transformant et peuvent induire l’apparition de tumeurs de type adénocarcinome mammaire montrant ainsi pour la première fois que la détection d’ADN et/ou de protéines virales du HCMV dans les biopsies de tumeur de cancer du sein n’est pas que l’expression d’une infection virale opportuniste mais d’une infection « transformante » par le HCMV.
Les Inventeurs ont donc eu pour projet la mise au point d’un vaccin contre certaines souches de cytomégalovirus humains (HCMV) oncogènes qui sont considérés comme étant à l’origine de certains types de cancer du sein. A terme, la vaccination préventive de la jeune fille contre les souches oncogènes de HCMV pourra être envisagée. Ce vaccin pourra être utilisé à titre prophylactique afin de diminuer le risque de développer certains cancers du sein, mais également à titre « thérapeutique » chez des patientes chez lesquelles un cancer du sein aura été détecté afin de ralentir la progression de la maladie. Cette vaccination thérapeutique ou prophylactique diminuera significativement le coût du traitement du cancer du sein du fait d’une diminution des traitements « agressifs » de type radiothérapie et/ou chimiothérapie et/ou chirurgicaux, actuellement utilisés pour traiter les formes les plus graves de cancer du sein avec les effets secondaires indésirables bien connus (alopécie, diarrhée, etc...). Un avantage écologique se manifestera également du fait d’une moindre production de déchets radioactifs liés à la radiothérapie.
Pour ce faire, les Inventeurs ont isolé la souche virale HCMV-DB (GenBank : KT959235), qui est hautement macrophage-tropique, déclenche un phénotype M2 et augmente l’expression du proto-oncogène Bcl-3 dans les macrophages infectés in vitro (Khan et al., J. Immunol., 182 : 7784-7794, 2009) [7], Ils ont ensuite utilisé cette souche virale pour infecter des cellules épithéliales mammaires humaines (HMEC) et ont observé l’activation de voies moléculaires impliquées dans la carcinogenèse (c-Myc, Fos, Ras). Ils ont ainsi obtenu une lignée cellulaire épithéliale mammaire transformée après infection des cellules HMEC par la souche HCMV-DB, la lignée cellulaire oncogène CS, laquelle donne des tumeurs de type adénocarcinome mammaire chez des souris injectées.
Les Inventeurs proposent dès lors le développement de préparations vaccinales pour prévenir et/ou lutter contre le cancer du sein, utilisant essentiellement : (i) une souche de HCMV ayant des propriétés oncogènes in vitro, en particulier la souche HCMV-DB, et (ii) une lignée cellulaire de cancer du sein après infection de cellules épithéliales mammaires humaines par la souche (i), en particulier la lignée cellulaire CS.
Ainsi c’est un objectif de la présente invention de mettre au point des compositions vaccinales utilisant essentiellement 4 approches à partir des souches (i) et (ii) ci-dessus ou d’éléments dérivés de ces dernières : Composition vaccinale 1 : il s’agit d’un vaccin cellulaire préparé à partir d’une émulsion contenant un lysat de cellules cancéreuses de la lignée (ii), en particulier de la lignée cellulaire CS, et administrée avec un adjuvant approprié par exemple choisi dans le groupe constitué de : sels minéraux (l’hydroxyde d’aluminium, le phosphate d’aluminium, le phosphate de potassium et le phosphate de calcium), adjuvants huileux à type d’émulsions, particules adjuvantes, adjuvants microbiens (BCG....), motifs CpG (ou CpG ODN) non-méthylés, et certaines cytokines (GM-CSF). De préférence, préalablement à la lyse cellulaire, les cellules de la lignée cellulaire (ii) sont cotransfectées par lipofection, selon une méthode bien connue de l’Homme du métier, avec un ADNc exprimant la molécule costimulatrice CD80 et un ADNc exprimant la molécule CCL21. En effet, des études cliniques sur les vaccins à base de cellules tumorales sont basées sur le concept que des cellules tumorales allogéniques ou autologues expriment de nombreux antigènes tumoraux associés à la tumeur (ATTs), et leur inoculation avec des adjuvants et/ou des cytokines peut activer la réponse immunitaire. De plus, comme les cellules tumorales ne sont pas très immunogènes, les cellules tumorales incluses dans la préparation vaccinale peuvent être transfectées avec des vecteurs qui contiennent des gènes qui expriment des protéines fortement immuno-stimulatrices telles que B7.1 (CD80) et CCL21. En effet les cellules présentatrices d’antigènes (CPAs) expriment B7.1 qui fixe le CD28 sur les cellules effectrices T menant à leur activation. Le signal chemotactique généré par la cytokine CCL21 permet le recrutement de lymphocytes T natifs au site d’injection, pouvant de ce fait amplifier la réponse immunitaire. Des cytokines telles que le GMCSF peuvent être ajoutées à la préparation vaccinale afin de stimuler les CPAs. L’avantage d’utiliser un extrait cellulaire tumoral total est qu’un grand nombre d’ATTs sont présents et de ce fait peuvent minimiser le risque d’échappement immunitaire. De plus, étant donné que l’ensemble des protéines sont présentes, il n’y a pas de restriction HLA sur les patients amenés à recevoir le vaccin.
Composition vaccinale 2 : il s’agit d’un vaccin viral inactivé préparé à partir de la souche HCMV oncogène (i), en particulier de la souche oncogène HCMV-DB, inactivé par des méthodes bien connues de l’Homme du métier [e.g. inactivation par la chaleur, par les UV, par l’action de la betapropriolactone, de la formaline (solution aqueuse de 33-49% de formaldéhyde et de 9-16% d’alcool méthylique), etc....].
Composition vaccinale 3 : il s’agit d’un vaccin à base de pseudoparticules virales (VLPs), en particulier de corps denses viraux (CDs), dérivés de la souche oncogène HCMV (i), en particulier de la souche oncogène HCMVDB. Les CDs sont des particules virales non réplicatives enveloppées obtenues pendant la réplication du HCMV en culture cellulaire. Ces structures sont des candidats prometteurs pour un vaccin car ils contiennent à la fois les glycoprotéines d’enveloppe et de grande quantité de la protéine pp65, deux cibles d’une réponse immunitaire efficace antivirale. Les CDs sont dépourvus de matériel génétique, non oncogènes, immunogènes, mais incapables d’établir une infection latente chez la personne vaccinée, apportant ainsi une sécurité sanitaire certaine. Les CDs, utilisés avec ou sans adjuvant, sont capables d’induire des anticorps neutralisants et une réponse cellulaire T anti-HCMV après immunisation de la souris, incluant la souris transgénique HLA-A2.K(b), en absence d’expression génique virale. La technique de fabrication de vaccins à base de pseudoparticules virales (VLP), structures virales proches de celles des corps denses (CDs) qui en dérivent, a notamment permis la mise au point du vaccin anti-papillomavirus à l’origine du cancer du col de de l’utérus (e.g. vaccin Gardasil® contre le papillomavirus).
Composition vaccinale 4 : il s’agit d’un vaccin à base de protéine virale recombinante ou d’ADN complémentaire (ADNc) viral d’intérêt. Ayant identifié un gène du HCMV comme potentiellement oncogène, la protéine recombinante virale correspondante est produite par une technique de clonage plasmidique comme cela a été déjà réalisé pour certains vaccins dirigés contre le virus de l’hépatite B (e.g. vaccin Engerix-B® contre le virus de l’hépatite B). A titre d’exemple non limitatif, la protéine virale d’intérêt provenant de la souche HCMV (i), en particulier de la souche HCMV-DB, par une technique de clonage (e.g. de type Bac-to-Bac) est choisie dans le groupe constitué des protéines codées par les gènes RL1, UL33, UL54, UL100, UL112, UL122, UL123, US1/US2, US34A/TRS1. De plus des plasmides recombinants exprimant les ADNc sens et antisens des RNA4.9 et ARN 5.0, en particulier de la souche HCMV-DB, sont produits.
Les différents compositions vaccinales (vaccin cellulaire, vaccin viral inactivé, vaccin viral recombinant et CDs) induisent une immunité et empêchent l’apparition de tumeur ou réduisent l’apparition et/ou le développement d’une tumeur de type cancer du sein chez des souris (souris NSG) injectées avec des lignées cellulaires humaines de cancer du sein. Le niveau de protection induit par les différentes compositions vaccinales peut varier, l’approche à base de CDs pouvant se révéler la plus efficace non seulement en induisant une immunité anti-cancer du sein, mais encore en optimisant cette immunité comme cela a été montré pour d’autres vaccins.
Les Inventeurs ont donc mis au point un procédé de préparation in vitro d’une lignée cellulaire de cellules épithéliales mammaires humaines immortalisées, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) Infection et transformation de cellules épithéliales mammaires humaines avec une souche de HCMV oncogène ;
b) culture des cellules épithéliales mammaires humaines immortalisées obtenues à l’étape a).
Par « souche HCMV oncogène » au sens de la présente invention, on entend une souche de HCMV qui entraîne l’apparition de colonies en agar mou lorsque les cellules épithéliales mammaires humaines sont infectées par cette souche. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, la souche de HCMV oncogène est la souche HCMV-DB ayant la référence GenBank KT959235.
Les Inventeurs ont ainsi obtenu une lignée cellulaire de cellules épithéliales mammaires humaines immortalisées via le procédé décrit cidessus. Ladite lignée cellulaire est caractérisée par l’absence de récepteurs aux oestrogènes, à la progestérone, et de HER2, et par un phénotype de type « basal-like », avec des caractéristiques de transition épithéliomésenchymateuse (EMT).
La présente invention a pour objet la préparation d’une composition vaccinale destinée à prévenir ou traiter le cancer du sein, ledit procédé comprenant l’inactivation de la souche HCMV oncogène, de préférence de la souche oncogène HCMV-DB.
Selon un mode particulier du procédé de préparation selon l’invention, l’inactivation est réalisée sur un surnageant de culture de cellules préalablement infectées par la souche de HCMV oncogène, de préférence par la souche oncogène HCMV-DB, par exemple une culture de fibroblastes pulmonaires d’embryons humains (cellules MRC5). L’inactivation est réalisée de préférence par une solution de formaldéhyde, la chaleur ou les UV.
La présente invention a également pour objet la préparation d’une composition vaccinale destinée à prévenir ou traiter le cancer du sein, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
a) lyse des cellules de la lignée cellulaire de cellules épithéliales mammaires humaines immortalisées par une souche HCMV oncogène, de préférence la souche oncogène HCMV-DB (par exemple selon le procédé ci-dessus) ;
b) préparation d’une émulsion contenant le lysat cellulaire obtenu à l’étape a), et un adjuvant « approprié »
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, l’adjuvant est par exemple choisi dans le groupe constitué de : sels minéraux (l’hydroxyde d’aluminium, le phosphate d’aluminium, le phosphate de potassium et le phosphate de calcium), adjuvants huileux à type d’émulsions, particules adjuvantes, adjuvants microbiens (BCG....), motifs CpG (ou CpG ODN) non-méthylés, et certaines cytokines (GM-CSF).
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, la lyse cellulaire est réalisée par des méthodes bien connues de l’Homme du métier. Par exemple il s’agit de la congélation-décongélation, de la sonication, de la centrifugation, de la lyse chimique, de la lyse enzymatique, etc....
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, préalablement à l’étape de lyse cellulaire, la lignée cellulaire de cellules épithéliales mammaires humaines immortalisées par une souche HCMV oncogène, de préférence la souche oncogène HCMV-DB (par exemple selon le procédé ci-dessus), est co-transfectée avec un ADNc exprimant la molécule costimulatrice CD80 et un ADNc exprimant la molécule CCL21. La cotransfection peut être réalisée par exemple par lipofection, par le phosphate de calcium, par électroporation, par des liposomes, par des agents polycationiques hautement branchés, et par « gene gun». De préférence, la cotransfection est réalisée par lipofection.
La présente invention a également pour objet la préparation d’une composition vaccinale destinée à prévenir ou traiter le cancer du sein, ledit procédé comprenant la préparation de corps denses viraux dérivés d’une souche HCMV oncogène, de préférence la souche oncogène HCMV-DB.
Selon un mode particulier de réalisation de l’invention, les corps denses (CDs) sont isolés par centrifugation sur gradient de glycérol-tartrate d’un surnageant de culture de cellules préalablement infectées par la souche HCMV oncogène, par exemple une culture de fibroblastes pulmonaires d’embryons humains (cellules MRC5). Les CDs peuvent également être récupérés à partir de cultures cellulaires traitées avec du 2bromo-5,6-dichloro-1-beta-d-ribofuranosyl benzimidazole riboside (BDCRB) et purifiés par filtration de flux tangentiel (tangential flux filtration ou TFF) ou gradient de sédimentation de tartrate de glycérol tel que décrit par Schneider-Ohrum étal. (J Virol., 90(22) :10133-10144, 2016) [11],
La présente invention a également pour objet la préparation d’une composition vaccinale destinée à prévenir ou traiter le cancer du sein, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
a) Identification d’un gène oncogène d’intérêt d’une souche oncogène de HCMV, de préférence de la souche oncogène HCMV-DB ;
b) Clonage dudit gène dans un vecteur plasmidique approprié ;
c) Transformation d’une cellule animale avec le vecteur d’expression de l’étape b) et mise en culture ;
d) Transfection de cellules d’insecte avec l’ADN de baculovirus bacmid recombinant comprenant le gène d’intérêt extrait des cellules de l’étape c) et mise en culture ;
e) Purification du baculovirus recombinant à partir des surnageants de transfection de l’étape d) et amplification ;
f) Isolement de la protéine d’intérêt exprimée à l’étape e) et mélange avec un adjuvant approprié ;
ledit gène d’intérêt oncogène étant le gène UL100.
Selon un mode particulier de la présente invention, le vecteur plasmidique est le vecteur pFastBac.
La présente invention a également pour objet la préparation d’une composition vaccinale destinée à prévenir ou traiter le cancer du sein, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
a) Identification d’un gène oncogène d’intérêt d’une souche oncogène de HCMV, de préférence de la souche oncogène HCMV-DB ;
b) Clonage dudit gène dans un vecteur plasmidique approprié ;
c) Transformation d’une cellule animale avec le vecteur d’expression de l’étape b) et mise en culture ;
d) Isolement de la protéine d’intérêt exprimée à l’étape c) et mélange avec un adjuvant approprié ;
e) Isolement du plasmide de l’étape c) exprimant l’ADNc sens ou antisens correspondant à l’ARN sens ou antisens, et mélange avec un adjuvant approprié ;
ledit gène d’intérêt oncogène étant le gène RNA4.9.
Selon un mode particulier de la présente invention, le vecteur plasmidique est le vecteur pcDNA3.1.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, l’adjuvant est par exemple choisi dans le groupe constitué de : sels minéraux (l’hydroxyde d’aluminium, le phosphate d’aluminium, le phosphate de potassium et le phosphate de calcium), adjuvants huileux à type d’émulsions, particules adjuvantes, adjuvants microbiens (BCG....), motifs CpG (ou CpG ODN) non-méthylés, et certaines cytokines (GM-CSF).
Brève description des figures
La figure 1 représente la réplication de la souche HCMV-DB dans les cellules HMEC avec marquage de la pp65 du HCMV par immunofluorescence (flèche). Panel de droite : réplication de HCMV-DB dans les cellules MRC5.
La figure 2 représente l’activation/phosphorylation de STAT3 (phospho-STAT3 ou P-STAT3) dans les cellules HMECs infectées par la souche HCMV-DB (NI, non infectées).
La figure 3 représente l’augmentation de l’activité télomérasique dans les cellules HMEC infectées par la souche HCMV-DB (à J1, J3 et J5).
La figure 4 représente les cellules HMEC infectées par HCMV-DB formant des colonies en milieu soft-agar (flèche) au 9ème jour après infection.
La figure 5 représente (A) des cellules HMECs non infectées, (B) l’apparition de cellules CS après infection des cellules HMECs par la souche HCMV-DB, (C) la prolifération autonome de la lignée CS en culture avant injection aux souris, (D) 4 panels de gauche « HMECs » : contrôles négatifs de HMECs non infectées (Mock Infected, Ml), HMECs infectées avec une souche de virus d’Epstein-Barr (EBV), de virus de l’herpès (HSV-1) ou de virus varicelle zona (VZV) à une MOI de 1 ; 4 panels de droite « clonosphères dérivées de HMECs » : différents clichés de cellules CS se répliquant de manière autonome en absence d’adhérence ; dernier panel de droite : lignée cellulaire de cancer du sein MCF-7.
La figure 6 représente le phénotype basal-like/myoépithélial de la lignée CS.
La figure 7 représente le suivi d’apparition de tumeurs de type adénocarcinome mammaire dans un modèle murin de xénogreffe après injection en sous-cutané dans les souris NSG (A) de clonosphères de la lignée cellulaire CS (B) de cellules HMECs non infectées.
La figure 8 représente la croissance tumorale de la ligne CS dans les souris xénogreffées (durée de l’étude : 43 jours). 2 millions de cellules CS : Clonosphère-I (♦) et Clonosphère-ll () ; 5 millions de cellules HMEC non infectées : HMEC-UI (À) ; 2 millions de cellules MCF-7 (·) ; 2 millions de cellules MDA-MB-231 (À), ont été injectées dans les coussins mammaires de souris NSG. La taille de tumeurs a été mesurée. Les résultats proviennent de deux expériences indépendantes impliquant 5 souris par groupe.
La figure 9 représente la détection de la séquence de HCMV-DB RNA4.9 dans les cellules CS (clonosphères) par PCR quantitative. HCMVDB : stock viral HCMV-DB (pur ·, dilué au 1/2 , dilué au 1/4 ▲) ; HMEC : HMEC non infectées (x) ; HMEC + HCMV-DB : lysat de cellules HMEC infectées par HCMV-DB (Δ) ; cellules CS (clonosphères ) ; NTC : contrôle négatif (-).
V
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : PRÉPARATION DE LA LIGNÉE CELLULAIRE CS
Isolement de la souche oncogène HCMV-DB
Une souche virale HCMV ayant des propriétés oncogènes in vitro a été isolée à partir d’un prélèvement effectué sur le col de l’utérus d’une jeune femme enceinte âgée de 30 ans ensemencé sur des cellules MRC5 [7, précité]. Les fibroblastes humains MRC5 ont été cultivés en milieu MEM avec 10% FBS, pénicilline (100 Ul/ml), et streptomycine (100g/ml). Les cellules MRC5 ont été infectées avec l’isolat HCMV-DB lorsque la monocouche a été confluente, et le virus a été collecté lorsque les effets cytopathiques ont été de 90%. Seuls des cycles de réplication virale très limités (2-3 cycles) ont été autorisés dans les cellules MRC5 avant que les surnageants ne soient clarifiés par centrifugation et stockés à -80°C jusqu’à utilisation. Les titres viraux ont été déterminés par essai de formation de plaques dans les fibroblastes humains MRC5 comme décrit dans (Arrode et al., J. Virol., 76 : 142-150, 2002) [8] et la quantification du titre viral dans les surnageants de culture cellulaire a également été réalisée par PCR en temps réel comme décrit dans (Coaquette et al., Clin. Infect. Dis., 39 : 155161,2004) [9],
La souche HCMV isolée a été caractérisée phénotypiquement par un tropisme macrophagique élevé [7, précité] et par un séquençage complet de son génome par une technique de séquençage à haut débit montrant qu’il s’agit d’une nouvelle souche HCMV référencée sous GenBank : KT959235 ; et ci-après dénommée HCMV-DB. Elle déclenche un phénotype M2 et augmente l’expression du proto-oncogène Bcl-3 dans les macrophages infectés in vitro [7, précité]. Cet isolat primaire possède le génome complet du HCMV, au contraire de beaucoup de souches HCMV utilisées en laboratoire qui ont perdu le fragment ULb’ lequel est indispensable au tropisme épithélial et donc à l’infection de cellules HMECs.
Préparation de la lignée cellulaire CS
La souche HCMV-DB a par la suite été utilisée pour infecter des cellules épithéliales mammaires humaines (HMEC) et les transformer en activant les voies moléculaires impliquées dans la carcinogenèse (c-Myc, Fos, Ras).
Pour ce faire, les cellules HMECs ont été infectées à une multiplicité d’infection (MOI) de 1. La souche HCMV inactivée par la chaleur à 95°C pendant 10 minutes ou traitée avec les UV (1200 microJ/cm2 pour 15 minutes) a été utilisée comme contrôle. Les titres viraux ont été déterminés par essai de formation de plaques dans les fibroblastes humains MRC5. Aucun autre virus n’a été détecté (HSV-1, HSV-2, virus varicellezona, virus d’Epstein-Barr, adénovirus, virus BK) dans les stocks de HCMVDB en utilisant un criblage par PCR. Suite à l’infection des HMECs par HCMV-DB, la réplication virale a été évaluée par détection de IE1, IE2, US28, pp65 et pp85 par Western blot et de l’antigène IE1 (clone E13, Argene-Biosoft, Varihes, France) en utilisant la microscopie par immunofluorescence (Nikon Eclipse E400, Kanagawa, Japon) et par l’apparition d’un effet cytopathique (CPE) dans les cultures au jour 20 après infection avec les HMECs infectées qui sont devenues plus rondes et nonadhérentes. Les cellules non-adhérentes ont été récoltées et distribuées dans des plaques à 6 puits où une prolifération cellulaire non-adhérente autonome a été observée.
Un cycle répétitif complet du HCMV-DB dans les cellules HMEC avec détection de transcrits et protéines virales précoces et tardives a été observé en utilisant des techniques de western-blotting et de RT-PCR. De manière remarquable, il a été observé une réplication virale optimale lors de l’infection des cellules HMEC avec la souche HCMV-DB, plutôt qu’avec les autres souches testées (isolat clinique TB40-E, ou de laboratoire AD169) (figure 1). En outre, il est à noter que certaines souches cliniques de HCMV ont un tropisme préférentiel pour les monocytes/macrophages et pourraient jouer un rôle dans le développement de l’apparition de macrophages associés aux tumeurs : TAM (Tumor Associated Macrophage), un marqueur de mauvais pronostic dans les adénocarcinomes mammaires et les glioblastomes. C’est le cas de la souche HCMV-DB qui a priori présente actuellement le plus fort tropisme pour les macrophages [7, précité]. Or les cancers du sein ont un pronostic d’autant plus mauvais que la quantité de macrophages présents dans la tumeur (TAM) est élevée.
Les résultats ont montré que non seulement la souche HCMV-DB infecte productivement les cellules HMECs, mais également modifie l’environnement cellulaire pour favoriser la transformation. Après infection des cellules HMECs avec différentes souches de HCMV (DB, AD169, TB40E, TB40F), une augmentation de la phosphorylation de STAT3 a été observée (figure 2) et de l’expression de la protéine cycline D1 ainsi qu’une prolifération cellulaire accrue mesurée par l’expression de l’antigène nucléaire Ki67. Une augmentation de l’expression de la protéine Myc a été observée par analyse western-blot. Ces données sont en accord avec l’induction de l’expression de proto-oncogène c-Myc, c-Fos et c-Jun dans les cellules humaines embryonnaires de poumon infectées par le HCMV. La phosphorylation d’Akt est augmentée dans les cellules infectées par la souche HCMV-DB de même que l’expression de la survivine. La souche HCMV-DB qui induit l’activation de STAT3 (forme phosphorylée), entraîne également une augmentation de l’activité télomérasique dans les cellules HMEC infectées (figure 3) qui peut peut-être s’expliquer par la découverte récente du rôle de la STAT3 comme activateur de la sous-unité catalytique de la télomérase (Chung et al., PLoS One, 8 : e83971, 2013) [10], Cela a favorisé l’immortalisation cellulaire, et favorisé la formation de colonies cellulaires en absence d’adhérence par la technique d’agar mou ou « soft agar » lorsque des cellules HMEC infectées par le HCMV ont été ensemencées, indiquant le pouvoir oncogène de cette souche virale (figure 4C, cf. flèche). Aucune formation de colonies pour les HMECs non-infectées (figure 4A) ou infectées avec du virus inactivé aux UV (figure 4B), par la chaleur ou préalablement traitées au ganciclovir, n’a été observée. De même du surnageant de cultures virales filtré pour éliminer tout virus infectieux et ensuite ajouté aux cellules HMECs n’a pas donné lieu à l’apparition de colonies. L’ensemble de ces données indiquent que du virus infectieux est nécessaire pour observer une transformation des HMECs.
Etant donné que les HMECs infectées par la souche de HCMV-DB entraînent une transformation in vitro de ces cellules avec formation de colonies en agar mou - ce qui n’avait jamais été montré jusqu’à présent pour une souche HCMV - la question s’est posée de savoir s’il était possible d’observer des cellules transformées et se répliquant de manière autonome en culture cellulaire. Après 20 jours d’infection des cellules HMECs avec la souche HCMV-DB, une prolifération cellulaire incontrôlée et autonome de type transformation cellulaire maligne a été observée en culture cellulaire (figure 5B). Ces cellules transformées ont été collectées, appelées cellules CS, et repiquées en culture cellulaire. Leur réplication autonome et incontrôlée a été confirmée avec actuellement plus de 120 passages in vitro réalisés (figure 5C). Ces cellules présentent les caractéristiques de cellules d’adénocarcinome mammaire de type basal/myoépithélial habituellement observées dans les adénocarcinomes triples négatifs : E-cadhérine négatif, vimentine positif, snail positif (figure 6). Ladite lignée cellulaire CS est caractérisée par l’absence de récepteurs aux oestrogènes, à la progestérone, et de HER2, et par un phénotype de type « basal-like », avec des caractéristiques de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT).
Ainsi une nouvelle lignée cellulaire épithéliale mammaire transformée après infection des cellules HMEC par la souche HCMV-DB, la lignée cellulaire CS, a été obtenue.
Potentiel oncogène de la lignée cellulaire CS
Après injection en sous-cutané de la lignée cellulaire CS (clonosphères CS) dans les souris NSG (NOD SCID gamma), l’apparition très rapide de tumeurs de type adénocarcinome mammaire a été observée dans ce modèle murin de xénogreffe (figure 7B) ainsi qu’une augmentation de taille tumorale extrêmement rapide, beaucoup plus que les autres lignées cellulaires mammaires testées (MDA-MD231, MCF7) (figure 8). Les résultats préliminaires ont indiqué qu’il s’agissait d’une tumeur de type adénocarcinome mammaire triple négatif : récepteurs aux œstrogènes négatifs, récepteurs à la progestérone négatifs, HER2 négatif, qui ne nécessite dont pas la présence d’œstrogènes pour se développer ; ce qui confirme son caractère non hormono-dépendant.
La présence de la séquence RNA4.9 de HCMV-DB a été confirmée dans les clonosphères CS en utilisant la technique de PCR qualitative et quantitative (Figure 9). Pour ce faire, l’ADN viral et cellulaire a été isolé en utilisant QIAamp DNA minikit (Qiagen, Valencia, CA), puis amplifié par PCR quantitative en utilisant un instrument Stratagene Mx et les primers HCMV RNA4.9 suivants: Forward primer 5’ GTGAACCGATACGGGTGGAG 3’ (SEQ ID NO : 1) et Reverse Primer 5’ CATTTGAACAGAGAAAGGTGG 3’ (SEQ ID NO : 2.
L’ensemble des résultats indiquent que les voies moléculaires clé impliquées dans l’oncogenèse sont activées dans les cellules HMEC infectées par HCMV-DB ; ce qui conduit in fine à la transformation des HMEC et favoriserait l’apparition et/ou le développement du cancer du sein chez les patients.
EXEMPLE 2 : PRÉPARATION DE COMPOSITIONS VACCINALES
Les compositions vaccinales sont obtenues selon quatre approches différentes à partir de la souche HCMV-DB ou de la lignée cellulaire CS ou de composants dérivés de celles-ci.
Composition vaccinale à partir de lysât de cellules cancéreuses CS
La lignée cellulaire CS provenant de cellules HMECs transformées suite à l’infection par la souche HCMV-DB comme précédemment décrit est utilisée. Comme les cellules tumorales ne sont pas très immunogènes, les cellules tumorales incluses dans la préparation vaccinale peuvent être transfectées avec des vecteurs qui contiennent des gènes qui expriment des protéines fortement immuno-stimulatrices telles que B7.1 (CD80) et CCL21.
Les cellules CS sont donc cotransfectées par lipofection, selon une méthode bien connue de l’Homme du métier, avec un ADNc exprimant la molécule costimulatrice CD80 et un ADNc exprimant la molécule CCL21. Une émulsion contenant le lysat cellulaire CS cotransfecté (CSCD80/CCL21 ) (50 ou 100 pg) est préparée et administrée avec du GM-CSF.
Cette préparation vaccinale consistera à terme en un vaccin thérapeutique, pouvant notamment être testé chez des femmes ayant un cancer du sein métastasé triple négatif.
Composition vaccinale à partir de la souche HCMV-DB inactivée
Le vaccin inactivé est préparé à partir d’un surnageant de culture de MRC5 infectées par la souche HCMV-DB comme précédemment décrit.
Ainsi les cellules MRC5 sont infectées par HCMV-DB et incubées à 37°C pendant 4-5 jours. Quand la souche cellulaire montre 100% d’effet cytopathogène, le surnageant de culture des cellules infectées est recueilli et les débris cellulaires ôtés par une centrifugation à 6500 g à 4°C pendant 20 minutes. Le volume total de stock viral est quantifié et inactivé en le mélangeant à de la formaline (formaldéhyde) à 37% à un ratio de 1/4000, excepté le fait que l’inactivation est maintenue à 4°C pendant une semaine sous agitation. Afin de confirmer l’absence d’infectivité résiduelle, 100 pl du virus traité à la formaline est utilisé pour infecter des cellules MRC5, lesquelles sont maintenues en culture pendant 7 jours pour s’assurer de l’absence d’effet cytopathogène. Le stock viral inactivé est culoté et purifié par ultracentrifugation. L’absence d’infectivité de la préparation virale inactivée ainsi obtenue est confirmée par un test de type plaque-formit units. La concentration en protéines virales du stock viral inactivé servant de base à la vaccination est déterminée en utilisant un kit Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL), en utilisant la BSA comme standard. Le MF59 est utilisé comme adjuvant émulsionnant « submicron oil-in-water », et est composé de 5% de squalène, 0,5% de Tween80, et de 0,5% de Span 85 (Sugma, Saint-Louis, MO).
Composition vaccinale à partir de corps denses (CDs) dérivés de la souche virale HCMV-DB
Préparation des CDs
Les corps denses (CDs) sont des particules virales non réplicatives enveloppées obtenues pendant la réplication du HCMV en culture cellulaire.
Les CDs sont isolés par centrifugation sur gradient de glycéroltartrate à partir de surnageant de cultures de cellules MRC5 infectées par le HCMV-DB, resuspendu dans du PBS et congelé à -70°C jusqu’à utilisation. Les préparations de CDs sont quantifiées par standardisation en fonction de leur concentration en pp65. Pour ceci, des dilutions sérielles des CDs sont mises à migrer dans un gel SDS-PAGE à 10% en parallèle d’un stock d’albumine bovine sérique (BSA) à 10 mg/ml (68 kDa) et coloré au bleu de Coomassie. En comparant l’intensité des bandes en utilisant le logiciel TINA (Raytest, Straubenhardt, Allemagne), la concentration en pp65 par microlite de concentration de CDs est calculée.
Centrifugation sur gradient de sucrose
Le matériel en CDs (4 pg) est dilué dans 1,4 ml de PBS, et déposé sur un gradient de sucrose de 10% à 66% (wt/wt), et centrifugé à l’aide d’un rotor TH641 pendant 2,5h à 29000 tpm à 20°C. 17 fractions de 0,6 ml sont collectées à la surface du gradient et précipitées dans l’acide trichloroacétique (ATA) pendant 2,5h dans de la glace. Les culots protéiques sont resuspendus dans du tampon Laemmli et séparés dans un gel de SDS à 10%. Après transfert sur membrane de nitrocellulose, les blots sont incubés avec un anticorps monoclonal anti-pp65 (p65-33) ainsi qu’avec un anticorps IgG anti-souris couplé à la peroxydase (dilué au 1 :10000, Dako, Hambourg, Allemagne), suivi d’une détection par chimioluminescence (ECL Plus, Amersham, Arlington Heigths, IL).
Microscope électronigue à transmission (MET)
Les CDs sont dilués dans du PBS à une concentration finale de 1 pg/μΙ. Une coloration négative de l’échantillon est réalisée selon la procédure de la goutte unique. Après l’adsorption des échantillons sur le film, ils sont lavés 5 fois avec de l’eau distillée ; la coloration négative à base de 5% (wt/vol) d’heptamolybdate d’ammonium (pH 7.0) contenant 1% (wt/vol) de tréhalose est ensuite ajoutée. La microscopie électronique à transmission (MET) est ensuite réalisée avec un équipement Zeiss EM 900 à 80 kV, et les images sont enregistrées sur un film Kodak EM, type 4489, à des grossissements de 12000 à 50000 fois.
Composition vaccinale à base de protéine virale et d’ARN viral recombinants
La composition vaccinale est obtenue à partir d’une protéine virale recombinante d’intérêt. Ayant identifié un gène du HCMV comme potentiellement oncogène, la protéine recombinante virale correspondante est produite par une technique de clonage plasmidique comme cela a été déjà réalisé pour certains vaccins dirigés contre le virus de l’hépatite B (e.g. vaccin Engerix-B® contre le virus de l’hépatite B).
En pratique, un gène viral a été identifié, UL100, qui code pour la glycoprotéine d’enveloppe gM dans les cellules CS transformées suite à l’infection des HMECs in vitro par la souche HCMV-DB oncogène. La protéine gM UL100 de la souche HCMV-DB est produite par une technique de clonage type Bac-to-Bac, un système d’expression à base de baculovirus, comme décrit ci-dessous.
Des cellules d’insectes « spodoptera frugiperda » (Sf9) sont maintenues en culture en suspension dans un milieu sans sérum et les baculovirus recombinants exprimant le gène UL100 de la souche HCMV-DB sont générés en utilisant un système d’expression de type Invitrogen Bacto-Bac. La séquence HCMV UL100 gM est optimisée pour les cellules d’insecte, synthétisée, et clonée dans pFastBacl (Invitrogen), en aval du promoteur polyhedrine d’Autographa californica multinuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) (GeneArt, Regensburg, Allemagne). Brièvement, l’ADN de baculovirus bacmid est généré par recombinaison homologue spécifique de site suivant la transformation du plasmide de transfert basé sur pFastBacl qui contient le gène UL100 de HCMB-DB dans des cellules compétentes de type E. coli DHIOBac (Invitrogen) qui contient le génome AcMNPV. L’ADN bacmid recombinant est extrait d’E. coli et transfecté dans les cellules Sf9 en utilisant le réactif CelIFectin (Invitrogen). Les surnageants de transfection sont recueillis et le baculovirus recombinant (rBV) est purifié et amplifié. Le titre des stocks de rBV est déterminé en utilisant le kit BacPack baculovirus rapid Titer (Clontech, Mountain View, CA). Des titres élevés de protéines recombinantes UL100 gM provenant de la souche HCMV-DB sont ainsi obtenus.
En pratique, un autre gène viral a été identifié, le gène RNA 4.9, qui code pour un ARN non codant de type « non coding long RNA » ou IncRNA, dans les cellules CS transformées suite à l’infection des HMECs in vitro par la souche HCMV-DB oncogène. L’ADN complémentaire sens ou antisens du IncRNA 4.9 de la souche HCMV-DB est produit par une technique de clonage dans un plasmide type pcDNA3.1 comme décrit ci-dessous.
Pour la construction du vecteur utilisant IncRNA 4.9 de la souche HCMV-DB, le IncRNA 4.9 sens ou antisens est amplifié par PCR, et souscloné dans un vecteur type pcDNA3.1 (Invitrogen) avant séquençage. Le plasmide ayant intégré le cDNA correspondant au lncRNA4.9 (pcDNARNA4.9) est utilisé pour la transformation de bactérie E.Coli. Les bactéries transformées sont sélectionnées sur des plaques LB contenant 50-100 pg/ml d’ampicilline (ou de tout autre antibiotique utilisable pour la sélection). Les plasmides ayant intégrés le cDNA correspondant au lncRNA4.9 sont caractérisés par la digestion avec des enzymes de restrictions, puis si positifs, sont séquençés pour s’assurer du bon candidat vaccinal. Les plasmides pcDNA-RNA4.9 sont transfectés dans des cellules épithéliales mammaires humaines et/ou des cellules eucaryotiques type cellules HEK 293 et l’expression du RNA4.9 sens ou antisens est détectée par Northernblot. Des titres élevés de cDNA correspondant au IncRNA 4.9 sens ou antisens provenant de la souche HCMV-DB sont ainsi obtenues. Par ailleurs les surnageants de transfection sont recueillis et le petit peptide correspondant au RNA4.9 est purifié et quantifié. Des titres élevés de petits peptides recombinants RNA4.9 provenant de la souche HCMV-DB sont ainsi obtenus.
EXEMPLE 3 : Test d’efficacité des compositions vaccinales dans un modèle de xénogreffe murin
Le potentiel anti-tumoral des compositions vaccinales est évalué dans le modèle de xénogreffe murin.
En pratique, les souris NSG (laboratoire Charles River) sont injectées sur les empâtements mammaires (« mammary fat pads ») avec 5x106 cellules cancéreuses mammaires (CS, MDA-MB231, MCF-7) dans un volume total de 100 pl de milieu sans sérum complémenté avec du matrigel® (1 :1) (n=120 au total, soit 10 souris par préparation vaccinale et par type cellulaire).
48h après l’injection des cellules cancéreuses mammaires dans les empâtements mammaires, les souris NSG sont vaccinées avec chacune des préparations vaccinales décrites ci-dessus (cf. protocole ci-dessus). Une seconde injection est effectuée 14 jours plus tard selon le même protocole. Des souris NSG injectées avec les cellules cancéreuses mammaires mais non vaccinées sont utilisées comme contrôle (n=20).
L’impact de la vaccination est évalué sur l’apparition de tumeurs au niveau des glandes mammaires ainsi que sur l’apparition éventuelle de métastases (organes lymphoïdes, foie, poumon, rate, système nerveux central). L’état général des souris en expérimentation est contrôlé tous les jours (taille de la tumeur, poids, mobilité). La taille des tumeurs est évaluée 3X par semaine. Le volume tumoral est évalué grâce à la formule approchée V (mm3) = L x I x h/2 (où L=longueur, Margeur, h=hauteur). Les souris sont sacrifiées lorsque la taille de la tumeur (seuil de douleur maximal) est atteinte (2000 mm3) ou lorsque les tumeurs sont nécrosées. Si un animal présente une fourrure altérée, une activité réduite, et/ou des signes de détresse, l’euthanasie est considérée.
En plus des tumeurs, les organes lymphoïdes, le foie, le poumon, la rate et le cerveau sont prélevés à la fin de l’expérience, chez l’animal euthanasié. L’étude immunohistochimique (IHC) des biopsies est effectuée selon le protocole habituel bien connu de l’Homme du métier : marquage HES, marqueurs de prolifération cellulaire (antigène Ki67), marqueurs de cancer du sein (récepteurs à la progestérone et aux œstrogènes, HER2, CK18, CK5/6, vimentine, E-cadhérine, et GATA3). L’état de vascularisation et de nécrose des biopsies tumorales est noté et l’analyse des réponses immunitaires à partir des organes lymphoïdes est effectuée.
Il résulte de l’efficacité des compositions vaccinales, un retard ou une abolition totale de l’apparition des tumeurs contrairement à ce qui se passe chez les souris injectées avec les lignées cellulaires de cancer du sein (CS, 10 MDA-MB231, MCF-7).
Liste de références
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Claims (4)
- REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d’une composition vaccinale destinée à prévenir ou traiter le cancer du sein, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :a) Identification du gène oncogène d’intérêt UL100 d’une souche HCMV oncogène ;b) Clonage dudit gène dans un vecteur plasmidique approprié ;c) Transformation d’une cellule animale avec le vecteur d’expression de l’étape b) et mise en culture ;d) Transfection de cellules d’insecte avec l’ADN de baculovirus bacmid recombinant comprenant le gène d’intérêt extrait des cellules de l’étape c) et mise en culture ;e) Purification du baculovirus recombinant à partir des surnageants de transfection de l’étape d) et amplification ;f) Isolement de la protéine d’intérêt exprimée à l’étape e) et mélange avec un adjuvant approprié.
- 2. Procédé selon la revendication 7, où le vecteur plasmidique est le vecteur pFastBac.
- 3. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, où la souche oncogène de HCMV est la souche oncogène HCMV-DB.
- 4. Composition vaccinale obtenue par l’un des procédés selon les revendications 1 à 3 pour une utilisation dans la prévention ou le traitement du cancer du sein.
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