WO2005005467A2 - Compose adjuvant de l'immunite comportant une sequence adenivirale ef - Google Patents

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    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • New adjuvant immunity compound compositions containing it and methods using said adjuvant compound
  • the present invention relates to the field of immunity adjuvant compounds, that is to say compounds capable of inducing an increase in the immune response against an antigen, in order to increase the effectiveness of the stimulation of the immune response by an immunogenic composition, or also to increase the preventive or therapeutic effectiveness of a vaccine composition.
  • the immunity adjuvant compounds or compositions are useful for improving the conditions for stimulating an immune response against antigens.
  • the immunity adjuvant compounds or compositions are used to increase the quantity of antibodies produced against a given antigen, or to increase the quantity of effector T cells produced, whether they are T cells helper (T helper) or T-cytotoxic cells.
  • T helper T cells helper
  • T-cytotoxic cells T cells helper cells helper cells
  • the association of an antigen with an immunity adjuvant compound or composition in addition to increasing the level of the immune response, by greater production of antibodies or effector T cells specific for the antigen also makes it possible to reduce the quantity of antigen included in an immunogenic or vaccine composition, and, if necessary, to reduce the frequency of injection of said immunogenic or vaccine composition.
  • an immunity adjuvant with the antigen of interest is in particular required when the immunogenicity properties of this antigen of interest, when administered without an adjuvant, are insufficient to stimulate an immune response. effective given the immunization objectives pursued.
  • the immunity adjuvant compounds or compositions induce a better immune response against a antigen of interest in separate ways.
  • Certain adjuvants of immunity act on the immune system by inducing a more efficient production of antibodies against the antigen of interest, for example by activating macrophages, dendritic cells, B cells and T cells, or by improving the conditions under which the antigen of interest is presented to the various immuno-competent cells.
  • Compounds or adjuvants of immunity can increase the immune response by prolonging the duration of release of the antigen of interest, by increasing the quantity of antigen absorbed by the cells presenting the antigen, by positively regulating the antigen processing by these cells, by stimulating the release of cytokines, by stimulating isotypic switching and the maturation of B cells and / or by eliminating immunosuppressive cells.
  • T Helper helper T lymphocytes
  • T-cytotoxic lymphocytes (“CTL” or “CD8 + ” cells) are of great interest for the development of immunogenic compositions or effective vaccine compositions.
  • the cells of the immune system which prepare antigens by fragmenting them into peptides, then by presenting these peptides, in association with the molecules of the major histocompatibility complex (MHC) of class I or class II, are essentially the macrophages and the cells. dendritic.
  • the dendritic cells are capable of priming the antigens, then of presenting the peptides resulting from the coating of the antigens to the naive T cells. Dendritic cells activate T cells more effectively than any other cell presenting the antigen.
  • Dendritic cells are generally present in the body at locations exposed to foreign antigens, such as the skin, liver, intestine, blood and lymphoid tissue. Overall, dendritic cells are classified according to whether they are at an immature stage or at a mature stage. Mature dendritic cells are able to efficiently capture and process antigens by endocytosis, and also to express high levels of co-stimulatory molecules, such as the CD40, CD80 and CD86 molecules, as well as the Complex molecules. Major in Histocompatibility (CMH) HLA-DPv.
  • CMH Histocompatibility
  • dendritic cells express the CD83 marker and secrete high levels of various cytokines and chemokines which act as aids in the activation of T cells. Besides their role in activating naive T cells, dendritic cells mature can also influence the balance of the Th1 / Th2 immune response. Various studies have indicated that dendritic cells preferentially activate Th1-type responses, presumably due to the secretion of IL-12 by activated dendritic cells. (acatonia et al., 1995, J. Immunol., vol. 154: 5071; Hilkens et al., 1997, blood, vol. 90: 1920).
  • dendritic cells can induce the generation of clones of Th1 or Th2 cells.
  • the important role played by dendritic cells in the presentation of the antigen and the activation of T cells has aroused great interest with a view to using or activating dendritic cells in immunotherapy.
  • the activation or obtaining of mature dendritic cells is of particular importance in the field of vaccines and immunotherapy for cancers.
  • nucleic acids containing CpG type oligonucleotide sequences are capable of inducing the maturation of dendritic cells.
  • a new family of adjuvant immunity compounds has been characterized, of the peptide type, which activate dendritic cells and induce the maturation of immature dendritic cells.
  • the adjuvanting immunity compounds according to the invention are derived from the head domain (knob) of the "fiber" protein of the capsid of an adenovirus.
  • the subject of the invention is an adjuvant immunity compound consisting of: - a polypeptide (i) comprising an amino acid sequence of 30 amino acids in length contained in the “head” domain of the “fiber” protein ”Of the capsid of an adenovirus, said amino acid sequence comprising the chain of amino acids forming the double-layered structure ⁇ designated“ EF ”contained in said“ head ”domain; or - a peptide (ii) analog of said polypeptide (i) whose amino acid sequence comprises, with respect to the sequence of said polypeptide (i), at least one substitution or at least one deletion of an amino acid, said peptide analog retaining said structure in double ⁇ sheet designated "EF".
  • a polypeptide (i) comprising an amino acid sequence of 30 amino acids in length contained in the “head” domain of the “fiber” protein ”Of the capsid of an adenovirus, said amino acid sequence comprising the chain of amino acids forming the double-layered structure ⁇ designated“ EF ”con
  • the invention also relates to an adjuvanting composition of immunity comprising an adjuvanting compound as defined above, in association with at least one physiologically compatible excipient. It also relates to an immunogenic composition as well as to a vaccine composition comprising an adjuvant compound as defined above, in combination with at least one antigen of interest.
  • the invention also relates to a method for the in vitro maturation of immature human or animal dendritic cells, characterized in that it comprises the following steps: a) cultivating in vitro a population of cells enriched in immature human or animal dendritic cells , in an appropriate culture medium; and b) incubating the cells cultivated in step a) with an adjuvant compound or an adjuvant composition as defined above, for a time sufficient to induce the maturation of the dendritic cells.
  • the invention also relates to a population of cells enriched in mature dendritic cells, capable of being obtained by the above maturation process.
  • the subject of the invention is also an adjuvant composition of immunity, characterized in that it comprises a population of mature dendritic cells obtained according to the above process of maturation.
  • the invention also relates to a method for stimulating T cells specific for the antigen in vitro, characterized in that it comprises the following steps: a) obtaining a population of cells enriched in mature dendritic cells by the maturation process above; b) bringing the population of cells enriched in mature dendritic cells obtained in step a) into contact with a population of cells enriched in T cells originating from the same individual, man or animal. DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 1 diagram of the structure of the fiber protein in virions of adenovirus serotype 5, respectively wild ( Figure 1A) and viruses devoid of the "head” domain ( Figure 1B).
  • the fiber protein of the adenovirus comprises three structural domains, starting from the N-terminal end to the C-terminal end: The “tail” which is linked non-covalently to the "penton base”part; the “stem” and the “head” domain binding to the CAR receptor, which is responsible for the attachment of adenovirus to permissive cells.
  • the wild-type adenovirus Ad5 serotype has “fibers” comprising a long “stem” having 22 repeats of the ⁇ -sheet motif.
  • the “stem” of the fiber protein is shorter, with seven repeats of the ⁇ -leaf motif and ends with a trimerization pattern followed by an "opal” stop codon.
  • Figure 2 Effect of adenovirus capsid components on the phenotype of dendritic cells.
  • the dendritic cells were cultured in the culture medium alone (NS; unstimulated dendritic cells), or in the presence of the purified proteins of the adenovirus Ad5 (1 ⁇ g per 10 6 cells), or of LPS (1 ⁇ g / ml) ; then were characterized for their expression of the marker CD11c and markers of specific maturation of the dendritic cells.
  • Figure 2A Dendritic cells cultured with Hx and Pb (fiber-bound penton base) isolated from HeLa cells infected with the Ad5 adenovirus.
  • Hx and Pb fiber-bound penton base
  • the dendritic cells were incubated in the absence of "unstimulated dendritic cells, NS" or in the presence of 1 ⁇ g of protein Fi or protein of the head domain (FIG. 3A), where the dendritic cells were incubated with determined quantities of proteins Fi and Hx (respectively 1 ⁇ g) and various concentrations of head proteins (in a range from 0.5 to 0.02 ⁇ g) ( Figures 3B, 3C). Dendritic cells and culture supernatants were collected and tested as indicated below. For FIG. 1A, the dendritic cells were characterized for the expression of the CD11c marker and the maturation markers. The percentages of CD11c + cells and the average immunofluorescence (MFI) values for the maturation markers were represented.
  • MFI average immunofluorescence
  • FIG. 4 proof of a direct interaction between the head domain protein and dendritic cells, and proof of the need for the head domain in the maturation of dendritic cells induced by the Ad5 adenovirus.
  • dendritic cells purified using magnetic beads coated with anti-CD11c antibodies were stimulated with 0.5 ⁇ g of protein from the head domain; dendritic cells purified unstimulated (NS) were used as controls.
  • NS dendritic cells purified unstimulated
  • MFI average immunofluorescence
  • the histograms show the average immunofluorescence (ivIFI) values for the markers of CD11c + cell maturation.
  • the results presented are representative of two independent tests.
  • Figure 5 absence of expression of the CAR receptor on dendritic cells and low permissiveness of dendritic cells vis-à-vis infection with adenovirus serotype 5.
  • Immature dendritic cells isolated before stimulation were incubated with ascites fluid containing monoclonaur antibodies. anti-CAR (bold line), or with unrelated ascites fluid (gray line).
  • the dendritic cells were analyzed by flow cytometry (FACS).
  • the HeLa and CHO cells were used as positive and negative controls respectively.
  • Figure ⁇ mapping of the region of the head domain of the fiber involved in the maturation of dendritic cells.
  • Figure 6A schematic representation of the conformational structure of the head domain of the adenovirus Ad5 fiber protein (Xia et al., 1994). This diagram shows the different regions A to J having a ⁇ sheet structure as well as the respective link loops AB, CD, DG, GH, Hl and IJ. The upper line indicates the numbering of the amino acids, starting from the N-terminal methionine residue of the complete fiber protein of the adenovirus Ad5. The head domain regions of the fiber protein interacting with the CAR receptor are shown as solid black boxes on the bottom line of the figure.
  • FIG. 6B is a linear representation of the different deletion mutants of the head domain of the fiber protein of the adenovirus Ad5.
  • the header domain sequence is indicated by solid boxes; deleted regions are indicated as thin lines.
  • stimulating cells with purified allogenic TCD4 + cells were used, respectively, unstimulated dendritic cells (NS), dendritic cells stimulated with headless domain extracts (MS; “mock - stimulated "), or dendritic cells stimulated with the wild head domain protein (" k ⁇ ob T ”) or with deletion mutants of the head domain of the fiber protein.
  • NS unstimulated dendritic cells
  • MS headless domain extracts
  • dendritic cells stimulated with the wild head domain protein (“ k ⁇ ob T ”
  • the results presented are averages of three separate trials.
  • FIG. 7 the dendritic cells stimulated with the head domain of the fiber protein of the adenovirus ⁇ d ⁇ stimulates in vivo TCD8 + cells specific for the antigenic peptide GP33 derived from the glycoprotein of LCiWiV.
  • Figure TA illustrates the rejection of donor cells by recipient mice vaccinated with dendritic cells.
  • B6 mouse splenocytes labeled with CFSE (5-6-carboxyflu ⁇ rescei ⁇ diacetate succinimidyl ester) were loaded with the peptide GP33, then the treated splenocytes were transfused into recipient B6 mice which were previously immunized with, respectively, (i ) dendritic cells stimulated with the head domain of the fiber protein (respectively 2.5 ⁇ 10 5 , 9 ⁇ 10 4 and 3 ⁇ 10 4 cells), loaded with GP33 or (ii) with dendritic cells loaded with GP33 (2.5 ⁇ 10 5 cells) stimulated with Pb or Hx, or non-stimulated (NS), or (iii) with dendritic cells loaded with NP366 (2.5 x 10 5 ) stimulated with the leader domain of the fiber protein, or (iv) with the GP33 peptide in emulsion in incomplete Freund's adjuvant (IFA).
  • IFA incomplete Freund's adjuvant
  • FIG. 7B represents the secretion of IFN- ⁇ ex vivo by the same mice as for FIG. 7A.
  • Freshly isolated spleen cells and peripheral blood lymphocytes (PBL) were incubated for 20 hours with the peptide GP33; evaluation of the number of specific cells of GP33 secreting IFN- ⁇ by an Elispot IFN-y test :; the results are expressed in SFC ("spot forming colony") / 10 5 CD8 + T cells (test average carried out in triplicate + SD). Each spot corresponds to a cell secreting IFN- ⁇ .
  • FIG. 1 represents the secretion of IFN- ⁇ ex vivo by the same mice as for FIG. 7A.
  • Freshly isolated spleen cells and peripheral blood lymphocytes (PBL) were incubated for 20 hours with the peptide GP33; evaluation of the number of specific cells of GP33 secreting IFN- ⁇ by an Elispot IFN-y test :; the results are expressed in SFC ("spot forming colon
  • FIG. 7C illustrates the cytolytic activity of effector cells derived from mice vaccinated with dendritic cells (3 ⁇ 10 4 cells) and not stimulated or stimulated with the leader domain of the fiber protein of the adenovirus Ad5.
  • the spleen cells were incubated with the target cells EL4 labeled with 51 Cr and then loaded with the peptide GP33 or the peptide NP366, in a chromium release test only the activated ones specific to GP33 will lyse targets ( 51 Cr).
  • the head domain of the capsid fiber protein of an adenovirus is capable of interacting directly with immature dendritic cells and of causing their activation and their maturation in mature dendritic cells.
  • Adenoviruses appear as icosahedral particles 70 to 100 nanometers in diameter, depending on the serotype.
  • the viral capsid comprises two major constituent elements, respectively, (i) the hexon (Hx) which forms the faces and the penton (Pn) located at the 12 vertices.
  • the base of the penton (or penton-base) is associated with the fiber protein, which is a spicular projection emanating from the base of the penton, consisting of a trimer of polypeptide IV.
  • Fiber is a protein of 581 to 587 amino acid residues for long-fiber adenovirus species, such as species C and A, and 319 to 325 amino acid residues for the shortest fiber, such as adenoviruses of serotypes 3 and 7, belonging to species B.
  • the fibers are all formed from three distinct structural domains, respectively the tail, the stem and the head.
  • the tail fits into the penton-base.
  • the stem consists of the periodic repetition of a pattern of fifteen residues, each forming a ⁇ -sheet structure. The number of repeats of the unitary pattern defines the length of the stem, which is variable between the fibers of different species of adenovirus.
  • the head which is formed of a trimer of a polypeptide sequence of 180 to 200 amino acid residues.
  • each head monomer associates a skeleton of eight anti-parallel ⁇ sheets linked together by loops whose conformation varies considerably according to the serotypes.
  • a polypeptide consisting of a fragment of the head domain of the fiber protein of a adenovirus, said fragment comprising the amino acid sequence forming the anti-parallel ⁇ double-sheet structure designated “EF” induces the activation and maturation of immature dendritic cells.
  • a peptide fragment of the head domain of the fiber protein of an adenovirus comprising the amino acid sequence delimiting the antiparallel ⁇ -sheet and deleted in other peptide regions of the head domain, like for example the anti-parallel ⁇ sheet "Hl"
  • a polypeptide consisting of the head domain of the fiber protein and which comprises the deletion of the amino acid sequence forming the antiparallel ⁇ -sheet structure has lost the activation and maturation properties immature dendritic cells of the complete head domain.
  • a polypeptide consisting of the head domain and comprising the deletion of two amino acids in the F region of the ⁇ antiparallel EF sheet does not have the activation and maturation properties of immature dendritic cells which are observed with a polypeptide comprising the complete amino acid sequence of the head domain.
  • the results obtained by the applicant show that a polypeptide consisting of a peptide fragment of the head domain of the fiber protein of an adenovirus, and which comprises the amino acid sequence forming the double-layered structure ⁇ antiparallel EF, said polypeptide not comprising the amino acid sequences forming other ⁇ -sheet structures contained in the head domain, is capable of inducing the activation and the maturation of immature dendritic cells.
  • the results obtained by the applicant show that the activation and maturation properties of immature dendritic cells of the head domain of the fiber protein of an adenovirus are carried by a small peptide region of said head domain, the amino acid regions forming the double-layered structure ⁇ EF.
  • the leader domain of the fiber protein of all adenoviruses has a common structure consisting of a succession of ⁇ sheets linked together by peptide loops, similar to those of the leader domain of adenovirus serotype 5 (Ad5) shown in the Figure 6A.
  • Ad5 adenovirus serotype 5
  • the applicant has also shown that, at least from the point of view of the activation and maturation properties of immature dendritic cells, this structural identity of the head domain of all the adenoviruses also implies a functional identity.
  • an adenoviral vector comprising chimeric fiber proteins consisting of a tail and a stem originating from an adenovirus of serotype 5 and a head domain originating from an adenovirus of serotype 3 is also capable of inducing the activation and maturation of immature dendritic cells.
  • the above results have enabled the applicants to define a new family of adjuvanting immunity compounds, derived from the head domain of the fiber protein of an adenovirus, this new family of adjuvanting immunity compounds constituting a first object of the invention.
  • the subject of the invention is an adjuvanting immunity compound consisting of: - a polypeptide (i) comprising an amino acid sequence of 30 amino acids in length contained in the “head” domain of the protein t fiber 5> de the capsid of an adenovirus, said amino acid sequence comprising the chain of amino acids forming the double-layered structure ⁇ designated "EF s> contained in said" head "domain; or - a peptide (ii) analog of said polypeptide (i) whose amino acid sequence comprises, with respect to the sequence of said polypeptide (i), at least one substitution or at least one deletion of an amino acid, said analog peptide retaining said structure in double ⁇ sheet designated "EF".
  • an adjuvant compound corresponding to the above definition induces the maturation of immature dendritic cells.
  • an adjuvant compound above induces the expression by the dendritic cells of the class I and class II molecules of the MHC, as well as markers specific for the mature dendritic cells, such as the markers CD40, CD80 and CD86.
  • Dendritic cells stimulated by an adjuvant compound as defined above induce the proliferation of allogeneic CD4 + T lymphocytes in mixed lymphocyte reaction (MLR) tests and also induces the secretion of IL-12 and TNF ⁇ in a dose dependent manner .
  • An adjuvant compound according to the invention acts directly on immature dendritic cells without attachment to the CAR receptor.
  • said polypeptide (i) has an amino acid sequence of at least 30 amino acids in length since the polypeptide (i) comprising in all cases a amino acid sequence of 30 amino acids in length containing the amino acid sequence forming the ⁇ EF sheet of the head domain of the fiber protein of an adenovirus, which carries the function of maturation of immature dendritic cells.
  • the amino acid sequence of the ⁇ EF sheet can comprise, with respect to the amino acid sequence of the ⁇ EF sheet of the head domain of the adenovirus fiber protein from which it is derived, a or several substitutions of an amino acid.
  • the amino acid substitution (s) in the sequence of the ⁇ EF sheet are such that they do not modify said ⁇ -sheet structure.
  • the amino acid sequence forming the ⁇ EF sheet of an analogous peptide (ii) is identical to the amino acid sequence of the ⁇ EF sheet of the parent polypeptide (i).
  • the chain of amino acids forming the double-sheet structure ⁇ EF is located approximately at the center of the amino acid sequence of said polypeptide.
  • the amino acid sequence of the ⁇ EF sheet of the head domain of the fiber protein of the adenovirus of serotype 5 has a length of 8 amino acids.
  • this amino acid sequence begins at the amino acid residue at position 479 and ends at the amino acid residue located at position 486 of the complete fiber protein of serotype 5 adenovirus
  • an adjuvant compound consisting of a polypeptide (i) having the minimum length of 30 amino acids
  • the amino acid sequence of the ⁇ EF sheet, of 8 amino acids is preceded, at the N-terminal end, by a sequence of 11 amino acids in length corresponding to a part of the DE loop and is followed, on the C-terminal side, by a sequence of 11 amino acids in length comprising a part of the FG loop.
  • the amino acid sequence of the ⁇ EF sheet contained in an adjuvant polypeptide (i) according to the invention is located "approximately" in the center of the amino acid sequence of the polypeptide (i) when the sequences located respectively on the N- side terminal and C-terminal side of the sequence of the ⁇ EF sheet do not have an identical length.
  • the length of the sequences located respectively on the N-terminal side and on the C-terminal side of the amino acid sequence of the ⁇ EF sheet can differ by a length of up to 20 amino acids, one relative to to the other.
  • said polypeptide (i) comprises, from the N-terminal end to the C-terminal end, the amino acid sequences of the DE loop , the ⁇ EF sheet and the FG loop.
  • said adjuvant compound consists of the polypeptide whose amino acid sequence begins at amino acid residue at position 463 and ends at amino acid residue at position 515 of the complete fiber protein sequence.
  • an adjuvant compound according to the invention of the polypeptide type (i) has a length of at least 30 amino acids, and of at most 195 amino acids and very preferably of at most 180 amino acids. .
  • an adjuvant compound according to the invention of the polypeptide type (i) has a length of at least 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190 or 195 amino acids in length.
  • an adjuvanting immunity compound consisting of a polypeptide (i) as defined above
  • the sequence of said polypeptide (i) with a length of "n” amino acids, consists into a sequence of “n” consecutive amino acids of a corresponding sequence contained in the head domain of the fiber protein of the adenovirus considered.
  • the polypeptide (i), with a length of "n” amino acids comprises a sequence of "" consecutive amino acids of the head domain and comprising the sequence of the ⁇ EF sheet as well as one or more two additional amino acid sequences, the total length of the additional amino acid sequences being "n - x" amino acids, located at the N-terminus and / or at the C-terminus of the sequence head domain of "x" amino acids. It should be understood that “n” is an integer between 30 and 195 and that "x" is an integer between 30 and "nx”.
  • the additional sequence or sequences may consist of sequences of peptides detectable by specific antibodies of such a peptide, which could therefore be used as a marker.
  • the additional sequences can consist of sequences allowing easier purification of the adjuvant compound after its synthesis, whether by chemical synthesis or by synthesis by genetic recombination.
  • the additional sequences are chosen from polyhistidine sequences, for example sequences comprising from 4 to 10, and preferably 6, histidine residues.
  • an adjuvant compound according to the invention of the polypeptide type comprises an amino acid sequence of the head domain of the fiber protein of an adenovirus which comprises, from the N-terminal end towards the C-terminus, the ⁇ -D sheet.
  • an adjuvant component according to the invention, of the polypeptide type (i), comprises an amino acid sequence of the head domain which comprises, from the end
  • an adjuvant compound of the polypeptide type (i) comprises, the N-terminal end towards the C-terminal end, respectively the ⁇ D sheet, the DE peptide loop, the ⁇ EF sheet, the FG peptide loop and the ⁇ G sheet.
  • such a polypeptide (i) comprises the amino acid sequence starting at the amino acid at position 454 and ending at the amino acid at position 521 of complete fiber protein.
  • the polypeptide (i) or the analogous peptide (ii) also comprises, in addition to the amino acid sequence of the fiber head domain, also the last repeat subunit of the fiber rod.
  • Such a peptide adjuvant compound according to the invention comprising the last repeating subunit of the fiber rod is capable of possessing great structural stability and of blocking the part of the head domain in its native conformation and in the form of a trimer. peptide.
  • a peptide adjuvant compound of the invention which comprises a polypeptide (i) derived from the fiber protein of adenovirus of serotype 5
  • said polypeptide (i) comprises the acid sequence amino acids starting at the amino acid residue at position 380 and ending at the amino acid residue at position 581 of the amino acid sequence of the complete fiber protein.
  • the polypeptide (i) comprises part of the head domain of the fiber protein of an adenovirus which is a human adenovirus.
  • the human adenovirus is chosen from adenoviruses of subgroup B, which comprises adenoviruses Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34 and Ad35, or from adenoviruses of subgroup C, which comprises adenovirus Ad1, Ad2, Ad5 and Ad6.
  • the human adenovirus is chosen from the group consisting of adenoviruses of serotypes 12 18, 31, 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 4, 40 and 41.
  • an adjuvant peptide according to the invention derives from the head domain of the fiber protein.
  • the complete fiber proteins of the adenoviruses Ad5, Ad3 and Ad12 are represented as the amino acid sequences SEQ ID No 1, SEQ ID No 2 and SEQ id No 3, respectively.
  • the leader domain of the adenovirus Ad5 fiber protein begins at the amino acid residue at position 400 of the sequence SEQ ID No. 1.
  • the head domain of the adenovirus Ad3 fiber protein begins at the amino acid residue at position 132 of the sequence SEQ ID No. 2.
  • the leader domain of the adenovirus Ad12 fiber protein begins at the amino acid residue at position 409 of the sequence SEQ ID No. 3.
  • the polypeptide (i) comprises an amino acid sequence chosen from the following sequences: - the sequence starting with acid amino at position 463 and ending with amino acid at position 515 of the sequence SEQ ID No. 1 - the sequence starting with amino acid at position 195 and ending with amino acid at position 247 of the sequence SEQ ID N ° 2. - the sequence starting with amino acid in position 472 and ending with amino acid in position 535 of the sequence SEQ ID N ° 3.
  • a particular embodiment of the adjuvant compound according to the invention consists of a peptide (ii) analogous to the polypeptide (i) defined above, the amino acid sequence of which comprises, with respect to the sequence of said polypeptide (i), at least one substitution or at least one deletion of an amino acid é, said analog peptide retaining the double-sheet structure ⁇ EF.
  • the substitution (s) or deletion (s) of an amino acid with respect to the sequence of the polypeptide
  • the adjuvant analog peptide (ii) comprises 2,3,4,5,6,7,8,9 or 10 substitutions or deletions of an amino acid, relative to the amino acid sequence of the polypeptide (i ) parent.
  • said adjuvant compound is characterized in that the polypeptide (i) or the analogous peptide (ii) consists of a cyclic polypeptide.
  • the adjuvant peptides (ii) which include in their sequence one or more amino acid differences compared to the corresponding sequence contained in the head domain of the natural fiber protein of the adenovirus considered, nevertheless has adjuvant properties, that is ie properties of inducing the maturation of immature dendritic cells, of the same order of magnitude as the parent polypeptide (i) from which it derives.
  • the invention relates to adjuvant peptides derived from the head domain of the fiber protein of an adenovirus which has the same adjuvant activity as the adjuvant peptides specifically described in the present description.
  • an adjuvant compound according to the invention of inducing the maturation of immature dendritic cells can be easily verified by those skilled in the art, for example by determining the level of expression MHC class I or class II molecules, or the level of expression of a specific marker for the maturation of dendritic cells, such as the molecules CD40, CD80 and CD86.
  • an adjuvant compound according to the invention to stimulate the production of IL-12 and TNF ⁇ by dendritic cells.
  • an amino acid contained in the sequence of the parent polypeptide (i) is substituted by an amino acid of the same amino acid class, among the classes of acid amino acids (D, E), basic (K, R, H), non-polar (A, V, L, I, P, M, F, W) or even uncharged polar amino acids (G, S, T, Y , N, Q).
  • the “percentage identity” between two amino acid sequences is determined by comparing the two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the amino acid sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example “gaps”) with respect to the reference sequence (which does not include these additions or deletions) so to obtain an optimal alignment between the two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of positions at which an identical amino acid residue is observed for the two sequences compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two amino acid residues by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred in order to obtain the percentage of amino acid identity of the two sequences between them.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out by computer using known algorithms.
  • a peptide adjuvant compound according to the invention can be synthesized by conventional methods of synthetic chemistry, either homogeneous chemical syntheses in solution or in solid phase.
  • a person skilled in the art can use the polypeptide synthesis techniques in solution described by HOUBEN WEIL (1974).
  • a peptide adjuvant compound according to the invention can also be chemically synthesized in the liquid or solid phase by successive couplings of the different amino acid residues (from the N-terminal end to the C-terminal end in liquid phase, or the C-terminal end towards the N-terminal end in solid phase).
  • Those skilled in the art can in particular use the solid phase peptide synthesis technique described by Merrifield (1965a; 1965b).
  • a peptide adjuvant compound according to the invention can be synthesized by genetic recombination, for example according to a production process comprising the following steps: (a) preparing an expression vector into which a nucleic acid encoding the peptide adjuvant compound of the invention has been inserted, said vector also comprising the regulatory sequences necessary for the expression of said nucleic acid in a chosen host cell; (b) transfecting a host cell with the recombinant vector obtained in step (a); (c) culturing the host cell transfected in step b) in an appropriate culture medium; (d) recovering the culture supernatant from the transfected cells or the cell lysate of said cells, for example by sonication or by osmotic shock; and (e) separating or purifying, from said culture medium, or from the cell lysate pellet, the recombinant peptide adjuvant compound of the invention.
  • a recombinant peptide adjuvant compound of the invention can in particular refer to the techniques for preparation of the recombinant vectors, for cell transfection and for purification which are described in the examples. Most preferably, a baculovirus type vector is used to infect Sf9 cells, as described in the examples.
  • a person skilled in the art can advantageously implement techniques of purification described by iVlolinier-Frenkel (2002), by
  • any of the adjuvant peptide compounds according to the invention can be used in combination with an antigen against which an immune response is sought.
  • a peptide adjuvant compound according to the invention can be combined, with a view to inducing an immune response, in humans or animals, either with a peptide antigen or with a carbohydrate type antigen, for example a carbohydrate type antigen identical or similar, from the point of view of its antigenic recognition, to an antigen specifically expressed by tumor cells.
  • the peptide adjuvant compound according to the invention can be combined with any type of antigen against which an immune response is sought.
  • a peptide adjuvant compound of the invention is chemically coupled to one or more antigens against which an immune response is sought, in the form of an adjuvant peptide / antigen peptide conjugate or also in the form of 'an adjuvant peptide-carbohydrate antigen conjugate.
  • the present invention also relates to an immunogenic conjugate consisting of an adjuvant peptide compound according to the invention, which is covalently linked to an antigen against which an immune response is sought.
  • the subject of the invention is also an adjuvant composition of immunity comprising a peptide adjuvant compound as defined above in the present description, in association with at least one physiologically compatible excipient.
  • the adjuvant compound and the antigen are linked directly to each other covalently, for example via a peptide bond - CO-NH-.
  • a peptide conjugate is preferred in which the adjuvant compound and the antigen are separated from each other, within said conjugate, by a spacer chain.
  • the adjuvant compound and the antigen are separated from each other, within said conjugate, by a spacer chain chosen from SMCC or SIAB, which are all both of the bifunctional compounds.
  • SIAB described by Hermanson GT (1996, Bioconjugate techniques, San Diego: Académie Press, pp 239-242), is the compound of formula (I) below:
  • the SIAB compound comprises two reactive groups, respectively an iodoacetate group and a Sulfo-NHS ester group, these groups reacting respectively on amino and sulfhydryl groups.
  • the SMCC compound which is described by Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2 (1): 37-46), is the compound of formula (II) below:
  • the immunogenic conjugate comprises a spacer chain consisting of a linear spacer peptide.
  • a linear spacer peptide preferably having from 3 to 30 amino acids in length, advantageously from 5 to 20 amino acids in length and most preferably from 7 to 15 amino acids in length will be chosen.
  • the linear spacer peptide is essentially, if not exclusively, made up of positively or negatively charged amino acids at pH 7.0 in order to increase the overall hydrophilicity of said immunogenic peptide conjugate.
  • the spacer peptide is characterized in that it consists of a poly (lysine) chain consisting of 3 to 30 lysine residues, advantageously from 5 to 20 and very preferably from 7 to 15 length lysine residues.
  • the adjuvant compound and the antigen are separated from each other, within said peptide conjugate, by a spacer chain consisting of a spacer peptide branched, preferably an oligodendrimeric poly (lysine) structure, as described for example by Basak et al. (1995).
  • said peptide conjugate can comprise several copies respectively of the adjuvant compound and / or of the antigen per molecule of conjugate, advantageously from 2 to 8 copies of the adjuvant compound and / or the antigen, preferably at most 4 of the adjuvant compound and / or the antigen, per conjugate molecule.
  • the present invention also relates to a peptide adjuvant compound as defined above in the description, for its use as an adjuvant active ingredient of an immunogenic composition or of a vaccine composition.
  • immunogenic composition a composition containing a peptide adjuvant compound as defined above in association with at least one antigen against which a cell-mediated immune response is sought, in order to produce specific antibodies against said antigen
  • vaccine composition a composition containing an adjuvant peptide compound as defined above, in combination with at least one antigen against which a cell-mediated immune response is sought in order to prevent or in order to treat a disease, in particular a disease caused by a pathogenic agent of viral, fungal or bacterial type or even a tumor.
  • the invention also relates to the use of an adjuvant compound peptide as defined above for the manufacture of an immunogenic or vaccine composition.
  • an immunogenic composition or a vaccine composition comprising a peptide adjuvant compound as defined above, in combination with at least one antigen.
  • the antigen can be used in the form of a mixture with the adjuvant peptide compound of the invention.
  • the adjuvant peptide compound and the antigen included in a vaccine composition or in an immunogenic composition of the invention are in the form of an immunogenic conjugate as defined above.
  • dendritic cells stimulated with a peptide adjuvant compound according to the invention and loaded with a determined antigen in this case the peptide GP33 of LGMV S was capable of inducing, in the animal, a cytotoxic immune response by stimulation of CD8 + T cells specific for the GP33 antigen. It has been shown in particular that mature dendritic cells stimulated by a peptide adjuvant compound according to the invention and presenting the antigen of interest to the cells of the immune system were capable of inducing an immune response of the cytotoxic type. causing the rejection of splenocytes having on their surface the antigen of interest.
  • an immunogenic composition or in a vaccine composition according to the invention any type of antigen can be used since, in all cases, and whatever the antigen or antigens, the adequate peptide of the invention will exercise its activity activation of dendritic cells.
  • an immunogenic composition or a vaccine composition according to the invention comprises an amount ranging from 10 nanograms to 1 milligram of a peptide adjuvant compound as defined above, preferably from 100 nanograms to 100 micrograms of said adjuvant peptide compound, and most preferably from 100 nanograms to 10 micrograms of said adjuvant peptide compound.
  • antigens capable of being included in an immunogenic composition or in a vaccine composition according to the invention in combination with a peptide adjuvant compound, mention may be made of bacterial antigens derived in particular from B. pertussis,
  • the antigens can also be viral antigens such as antigens derived from poliovirus viruses, adenovirus, para influenza virus, respiratory syncytial virus, influenza virus, encephal ⁇ myélitis virus, Newcastle disease virus, pox virus, virus
  • the antigens may also consist of antigens originating from any allergen, such as allergens derived from extracts of flower or grass pollen, allergens purified from household dust, etc.
  • allergens derived from extracts of flower or grass pollen, allergens purified from household dust, etc.
  • viral antigens of interest there are also cited the antigens derived from papillomavirus proteins, in particular human papillomaviruses, and in particular the proteins L1, E6 and E7, in particular strains HPV-16.
  • Other illustrative viral antigens consist of antigens derived from proteins of the human immunodeficiency virus (HIV), in particular HIV-1, and most preferably derived from the ENV protein of the HIV-1 virus.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • antigens of interest capable of being included in an immunogenic composition or in a vaccine composition according to the invention consist of tumor antigens, that is to say antigens expressed by cancer cells, whether these antigens are peptide or carbohydrate in nature.
  • the immunogenic compositions or the vaccine compositions according to the invention find their use in particular in the treatment, both curative and preventive, of cancers, in particular of cancers induced by viruses such as for example ATL (acute T leukemia) caused by the HTLV1 virus, or cervical cancer caused by the papillomaviruses, or burkitt lymphoma or Kaposi's sarcoma caused by viruses of the Herpes family, respectively Epstein-barr (EBV) and HHV8, as well as in the treatment of AIDS or to prevent or treat allergic inflammatory reactions.
  • ATL acute T leukemia
  • cervical cancer caused by the papillomaviruses
  • burkitt lymphoma or Kaposi's sarcoma caused by viruses of the
  • the subject of the invention is also a method for immunizing a man or an animal, more specifically a mammal, against an antigen of interest, said method comprising a step during which one administers to humans or animals an immunogenic composition or a vaccine composition as defined above.
  • an immunogenic composition or a vaccine composition according to the invention which is in a form suitable for systemic or mucosal administration, for example intranasally, sufficient to be therapeutically effective for a subject in need of such treatment.
  • An immunogenic composition or a vaccine composition according to the invention is in solid or liquid form, in particular in the form of an oil-in-water emulsion in which the antigen or antigens of interest is (are) scattered.
  • an immunogenic composition or a vaccine composition according to the invention in the form of an oil-in-water emulsion, a person skilled in the art can use an SPT type emulsion as described on page 147 of the book “Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach ”, [M. POWELL, M. Newman Ed., Plénum Press, (1995)] as well as the emulsion MF59 described on page 183 of the same work.
  • physiologically compatible excipient within the meaning of the invention is meant a liquid or solid bulking agent, a diluent or any other substance which is not physiologically active and which is of great safety for the patient and which can be used for systemic administration. or local, for example on the mucous membranes, of an immunogenic composition or a vaccine composition according to the invention.
  • physiologically acceptable excipients are described in detail including the 4 lem edition "2002" of the Pharmacopoeia
  • the invention also relates to a process for the in vitro maturation of human or animal immature dendritic cells in which immature dendritic cells are stimulated with a peptide adjuvant compound as defined in the present description.
  • a further subject of the invention is therefore a process for the in vitro maturation of human or animal immature dendritic cells, characterized in that it comprises the following steps: (a) cultivating in vitro a population of cells enriched in human immature dendritic cells or animal, in an appropriate culture medium; (b) incubating the cells cultivated in step (a) with a peptide adjuvant component or even with an adjuvant composition as defined in the present description, for a time sufficient to induce the maturation of the dendritic cells.
  • the population of cells enriched in immature human or animal dendritic cells used in step a) of the process can be obtained from a sample of bone marrow or a sample of human or animal blood, according to well-defined techniques.
  • step b) of the above maturation process the immature dendritic cells are incubated with a final concentration of the peptide adjuvant compound ranging from 10 nanograms per ml to 1 ⁇ g / ml, preferably ranging from 50 nanograms per ml to 1 mcg / ml.
  • step b) of the maturation process the immature dendritic cells are incubated for a period ranging from 1 h to 48 hours, with the final concentration selected for the adjuvant peptide compound.
  • the invention also relates to a population of cells enriched in mature dendritic cells loaded with an adjuvant compound or with an adjuvant composition as defined above.
  • An adjuvant compound according to the invention can therefore be detected, for example using an antibody directed specifically against this adjuvant compound, either in the cytoplasm or on the membrane surface of these dendritic cells which are capable of being obtained by the maturation process as defined above.
  • the mature dendritic cells obtained according to the above maturation process are characterized in that they simultaneously express the molecules of classes I and class II of the MHC as well as the specific markers of the dendritic mature cells CD40 CD80 and CD86.
  • the present invention also relates to an adjuvant cellular composition of immunity, characterized in that it consists of a population of mature dendritic cells charged (i) with a adjuvant compound or with an adjuvant composition as defined above, and (ii) loaded with the antigen of interest capable of being obtained by the above maturation process.
  • a dose of adjuvant cellular composition of immunity as defined above, for administration to patients comprises a number of mature dendritic cells ranging from 10 6 to
  • the mature dendritic cells are preferably suspended in a saline liquid medium necessary for their survival for a few hours, preferably at least three hours. Most preferably, the mature dendritic cells are suspended in an appropriate culture medium comprising all of the nutrients allowing their long-term survival, for example for several days, preferably for at least 2 days.
  • the invention also relates to a method for manufacturing an immunogenic cell composition, characterized in that it comprises the following steps: a) cultivating in vitro a population of cells enriched in immature human or animal dendritic cells, in a medium of appropriate culture; b) incubating the cells cultivated in step a) with an adjuvant peptide compound or else with an adjuvant composition as defined above, for a time sufficient to induce the maturation of the dendritic cells; c) adding to the cells cultivated in step b) at least one antigen of interest against which an immune response is sought.
  • step c) of incubation of the dendritic cells with at least one antigen of interest can either be simultaneous with step b) in which the adjuvant peptide compound is incubated with the cells, or at otherwise be after step b).
  • steps b) and c) are carried out simultaneously.
  • a subject of the invention is also a method for manufacturing an immunogenic cell composition, characterized in that it comprises the following steps: a) cultivating in vitro a population of cells enriched in human or animal dendritic cells in an appropriate culture medium; b) incubate the cells cultivated in step a) with an immunogenic conjugate as defined above, for a time sufficient to induce the maturation of the dendritic cells.
  • the final concentration added to the dendritic cells is variable depending on the nature and the molecular weight of the antigen of interest considered.
  • LCMV peptide GP33 is added to dendritic cells.
  • a person skilled in the art can adapt the final concentration which must be added in step c) (first method), or the final concentration of immunogenic conjugates which must be added in step b) the method (second method), thanks to its general technical knowledge concerning the loading of dendritic cells with an antigen of interest.
  • the general conditions of the methods for manufacturing an immunogenic cell composition above are also identical to those used for the method of maturation of dendritic cells which has been described previously.
  • the invention also relates to an immunogenic cell composition, characterized in that it comprises a population of mature dendritic cells loaded with the antigen of interest obtained by the methods for its manufacture which are described above.
  • the mature dendritic cells loaded with the antigen of interest are characterized in that they express the class I and class II molecules of the MHC, as well as the specific markers of the mature dendritic cells CD40, CD80 and CD86.
  • the invention also relates to a method for immunizing a human or animal body against an antigen of interest, which method comprises a step during which administers to the individual an adjuvant cellular composition as defined above, before, simultaneously, or after a step of administration of the antigen of interest.
  • the subject of the invention is also a method for immunizing a human or animal body against an antigen of interest, which method comprises a step during which an immunogenic cell composition according to the invention is administered to the individual.
  • the present invention is further illustrated by the following examples:
  • A. MATERIAL AND ETHQDES A.1 Preparation of adenoviruses (Ad) and capsid proteins of adenovirus (Ad), including adjuvant peptide compounds according to the invention.
  • the Ad5E1 adenovirus is a serotype 5 adenovirus defective for replication and deleted in both the early regions E1 and E3.
  • the Ad5 E1 ° adenovirus carries wild type fiber proteins (WT) (iVlolinier-Frenkel et al., 2002).
  • WT wild type fiber proteins
  • the Ad5E1 ° ⁇ knob adenovirus, a deletion mutant for the fiber protein is derived from the Ad5E1 ° adenovirus by the insertion of a stop codon.
  • FIG. 1 shows the schematic structure of the fibers of the adenoviruses Ad5E1 ° and Ad5E1 ° ⁇ knob.
  • the Ad5E1 ° and Ad5E1 ° ⁇ knob virions were isolated by isopycnic ultracentrifugation in a continuous cesium chloride gradient (Molinier-Frankel et al., 2002).
  • the Hexon capsid proteins (abbreviated as “Hx”) and the penton capsomers (abbreviated as “Pn”, for the penton base + fiber combination) were isolated from HeLa cells infected with the adenovirus.
  • the penton-base proteins (also designated “Pb”), fiber (also designated “Fi”) and head domain of the wild type 5 adenovirus fiber were isolated in the form of recombinant proteins from infected Sf9 cells.
  • Ad5 fiber proteins were also analyzed, carrying deletions of variable length in the head domain (Santis et al., 1999), respectively the mutant proteins designated FÎ ⁇ 402-480, Fi ⁇ HI, Fi ⁇ EF and FÎ ⁇ LT485 - 486 on Figure 6B. These mutated fiber proteins were produced as recombinant proteins in Sf9 cells.
  • the adenovirus proteins were purified according to a protocol described by Molinier-Frenkel et al. (2002), Karayan et al. (1994) and Novelli et al. (1991).
  • the adenovirus proteins were purified by a process comprising the following three steps: (i) precipitation with ammonium sulfate, (ii) high performance anion exchange liquid chromatography and (iii) concentration-ultrafiltration step using concentration membranes having a cutoff threshold of 100 kDa.
  • the protein samples were analyzed by conventional techniques of SDS 1% -polyacrylarnide gel electrophoresis (Molinier-Frenkel et al., 2002) and immuno-imprinting (Karayan et al., 1994).
  • A.2- Obtaining and culture of dendritic cells. The method was adapted from the technique described by Mayordomo et al. (1995). C57BU6 (H2 b ) mouse bone marrow cells (Harlan, Gannat, France) deleted in lymphocytes were cultured overnight in a complete culture medium (RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) , 2 mM L- glutamine, 50 ⁇ iWl-mercaptoethanol, 100 U / ml of penicillin, 100 ⁇ g / ml of streptomycin).
  • FCS fetal calf serum
  • the non-adherent cells were removed and resuspended in complete culture medium in the presence of 2000 U / ml of recombinant GM-CSF (rGM-CSF, R & D System, Mineapolis, Minnesota) and 100 U / ml of Recombinant IL4 (rlL4, R & D System).
  • the culture medium was replaced on day 4.
  • aliquots of the non-adherent cells were resuspended at the density of 3 ⁇ 10 6 / ml in PBS buffer containing 1% FCS.
  • the cells were then incubated for one hour at 37 ° C (i) without (unstimulated dendritic cells; NS-DG), or (ii) with capsid components of AdS, or (iii) with corresponding chromatographic fractions obtained from extracts of Sf9 cells infected with an empty baculovirus vector (dendritic cells stimulated by the empty vector; MS-DC), as indicated in the legends of the figures.
  • the cell concentration was adjusted to 3 ⁇ 10 5 cells per ml with complete medium supplemented with GM-CSF. Control cells were incubated with 1 ⁇ g / ml of LPS from Eco // (sigma).
  • the cells were recovered and analyzed by flow cytometry techniques, mixed lymphocyte reactions (MLRs) and immunization techniques. On Day 8, the culture supernatants were collected.
  • the dendritic cells were purified using magnetic beads conjugated with a mouse anti-CD11c monoclonal antibody (Miltenyi Biotech). The dendritic cells were washed in PBS buffer containing 1% FCS.
  • anti-FCII / IIIR antibody 24G2; Pharmingen
  • the cells were incubated with various combinations of the following monoclonal antibodies (all marketed by Pharmingen): anti-lA b (AF6-120.1) and anti-CD40 (3/23), conjugated to PE anti-CD11c (HL3) and anti-CD80 (16-10A1) conjugated to FITC, anti-H2-D b (28-8-6) and anti-CD86 (GL1) biotinylated + streptavidin-PerCP (Becton Dickinson).
  • Anti-fiber-tail mouse monoclonal antibodies have also been used (4D2.5; HONG et al., 1997).
  • dendritic cells on Day 6 cells of the CHO line (ATCC No. CCL-61) and cells of the Hela line CCL-2 ATCc CCI2 and CHO were labeled with a monoclonal antibody originating anti-CAR ascites E1.1, as well as with control ascites.
  • Counter staining was performed using biotinylated rat anti-mouse IgG and a streptavidin-PE conjugate.
  • the flow cytometry analyzes were carried out on a F ⁇ CSCalibur device (Becton Dickinson).
  • dendritic cells on Day 8 were distributed in increasing doses in culture wells and co-cultured for 4 days with aiiquot fractions of purified CD4 + splenocytes (2 x 10 5 cells / well) allogeneic (Balb / c, H2 d ).
  • the proliferation of CD4 + T cells was measured by incorporation of 3 H-thymidine (1 ⁇ Ci / well) during the last 18 hours of the co-culture step.
  • the cell culture supernatants Day 8 dendritics were tested using the ELISA kits IL12p70 and TNF ⁇ (Pharmingen).
  • mice were immunized subcutaneously (sc) in the flank with 2.5 ⁇ 10 5 mature dendritic cells in the presence of the various capsid components of the adenovirus and then loaded with GP33 or NP366 (10 ⁇ M). Ten days later, the mice received an intravenous injection of 3 ⁇ 10 7 syngeneic splenocytes labeled with the fluorescent dye 5-6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE; Molecular Probes) as described by OEHEN et al. (1997).
  • CFSE fluorescent dye 5-6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
  • the percentage of CFSE + donor cells in recipient splenocytes or peripheral blood lymphocytes (PBLs) was determined using flow cytometry analysis (FACS). Rejection of donor cells was calculated using the following formula: ratio of% CFSE + cells in immunized mice /% CFSE + cells in naive mice] x 100.
  • A.8 T ⁇ sfe ELlSPOT-IFt Nitrocellulose microplates (Millipore) were coated with an anti-mouse IFN ⁇ rat antibody (R4-6A2; Pharmingen), then the wells were washed and saturated with complete medium. Aiquots of freshly isolated splenocytes (10 6 cells / well), or freshly isolated peripheral blood lymphocytes (PBLs) (2 x 10 5 cells / well), in triplicates, were added to the culture wells in complete medium containing 30 U / ml of recombinant human IL2 (hrlL2, Boehringer) and 10 "6 M of peptides GP33 or NP366.
  • PBLs peripheral blood lymphocytes
  • the cells secreting IFN ⁇ form spots there (SFC).
  • SFC spot there
  • the cells are counted according to the technique described by Molinier -Frenkel et al. (2002) The values obtained with the NP366 peptide were subtracted from the average of the values of the triplicate tests obtained with the GP33 peptide.
  • EL-4 labeled with 51 Cr (10 -4 ⁇ Ci per cell) which were incubated with the peptide GP33 or NP366. After a culture of five hours at 37 ° C., the culture supernatants were collected and the radioactivity was measured using a device of the Top-Count type (Packard Instruments). In the control samples, the target EL4 cells were incubated with the medium alone in order to determine the level of spontaneous release of 51 Cr, and with 2% of alkyltrimethylammonium bromide (Sigma) in order to determine the total release of 51 Cr.
  • EXAMPLE 1 Effect of the capsid components isolated from the adenovirus serotype 5 (Ad5) on the phenotype of the cendendium cells. Immature dendritic cells were incubated with penton (Pn) or hexon (Hx) capsomeres which were purified from HeLa cells infected with Ad5. The majority of dendritic cells stimulated with Hx exhibited a low level of mature phenotype, compared to unstimulated dendritic cells (NS-DC), with low expression of the class II molecules of CivIH, and the molecules CD40, CD80 (B7.1 ) and CD86 (B.7.2), as shown in Figure 2A.
  • Pn penton
  • Hx hexon
  • the dendritic cells stimulated with the penton (Pn) massively expressed a mature phenotype, similar to the phenotype observed for the dendritic cells stimulated by LPS, with a high level of expression of the different markers, as illustrated in FIG. 2A.
  • the adenovirus Pn capsomer consists of two structural entities, respectively penton base (Pb) and fiber (Fi)
  • Pb penton base
  • Fi fiber
  • the complete recombinant proteins Pn and Hx were used as control samples.
  • the results obtained indicate that the protein Fi is sufficient to reproduce the entire stimulating effect produced by the capsomers Pn, while the protein Pb alone does not induce any detectable effect on the maturation of the dendritic cells, as illustrated in the figure.
  • E3CAMPLE 2 Role of the head domain of the fibr ⁇ in the maturation of the dendritic cells by the adenovirus and by the fiber protein.
  • the adenovirus fiber comprises three structural domains, respectively, from its N-terminal end to its C-terminal end, the tail ("tail") the rod ("schaft") and the head ("Knob”).
  • the head domain was expressed in the form of a recombinant protein, according to the techniques described by NOVELLI et al. (1991) and by Hong et al. (1997).
  • the dendritic cells which were incubated with the head domain of the fiber expressed a mature phenotype, similar to that observed with the dendritic cells stimulated with the complete fiber protein Fi, as illustrated in FIG. 3A.
  • Dendritic cells stimulated with the head domain of the fiber are capable of strongly inducing the proliferation of allogeneic CD4 + T cells in a mixed lymphocyte reaction (MLR) assay as illustrated in FIG. 3B.
  • MLR mixed lymphocyte reaction
  • the degree of maturation of the dendritic cells varies according to the increasing concentrations of protein of the head domain of the fiber (FIG. 3B).
  • the dendritic cells stimulated by the head domain stimulating allogeneic CD4 4 T cells more effectively than the non-stimulated control dendritic cells (NS) or the dendritic cells stimulated with the Hx protein.
  • NS non-stimulated control dendritic cells
  • the mixed lymphocyte reaction (MLR) value for the 0.2 ⁇ g dose of head protein was similar to the value obtained with a 1 ⁇ g dose of fiber protein. This result is compatible with the fact that the amount of head protein present in a sample of 0.2 ⁇ g of head protein roughly corresponds to the amount of head protein contained in a sample of 1 ⁇ g of fiber protein.
  • the head protein also induced the secretion of IL-12 and TNF ⁇ in a dose-dependent manner, as illustrated in FIG. 3C.
  • the head domain was capable of directly targeting dendritic cells and inducing their maturation, without the participation of intermediate cells.
  • CD11c + cells were purified using magnetic beads coated with anti-CD11c antibodies, the purified CD11c + cells having been used for maturation tests.
  • the unstimulated dendritic cells are capable of increasing the expression of MHC molecules and of eostimulatory molecules, the dendritic cells stimulated with the head domain express a significantly more mature phenotype than the control cells (FIG. 3A).
  • the recombinant protein Fi has been shown to be able to bind to immature dendritic cells, with 63% of cells positive on day 6 of culture (FIG. 3B).
  • the cell-linked Fi protein was detected using an anti-tail monoclonal antibody, which implies that the epitope contained in the tail was accessible, and which suggests that attachment of the Fi protein to the cell surface was carried out via the head domain.
  • the dendritic cells expressed a significantly less mature phenotype than after incubation with the Ad5E1 ° vector.
  • the head domain of the fiber is the stimulating factor. common of all active viral components, and that the head domain carries the majority of the determinants responsible for the stimulation of murine dendritic cells observed with the Ad5 virions, the complete capsomer Pn, the complete fiber protein, and the recombinant protein of the head domain the insulated fiber.
  • EXAMPLE 3 Absence of attachment of the head domain of the adenovirus fiber protein to the CAR receptor.
  • dendritic cells do not express the CAR receptor.
  • the expression of this crucial protein for binding the head domain to differentiated dendritic cells was analyzed by flow cytometry (FACS) under the culture conditions used in the present work.
  • FACS flow cytometry
  • HeLa cells which are known to express about 10,000-30,000 CAR cell molecules, and cells of the CHO line were used as the negative control as a positive control. No CAR expression could be detected above the background noise of control ascites on immature dendritic cells collected before stimulation, despite highly specific staining of HeLa cells, as illustrated in FIG. 5A.
  • Tests have been performed to determine whether the mechanism of stimulation of dendritic cells by the head domain involves effective penetration of the adenovirus and expression of this gene.
  • An adenoviral vector of serotype 5 encoding an “Enhanced Green Fluorescent Protein” (EGFP) protein with two infection index values (MOI) 10,000 and 30,000 was used.
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • MOI infection index
  • FIG. 4C an MOI index of 10,000 viral particles per cell in fact induces efficient maturation of the dendritic cells.
  • significant expression of the fluorescent protein EGFP by dendritic cells was observed only at the dose of 30,000 particles per cell (FIG. 4C), which indicates a low degree of permissiveness to infection, by dentritic cell adenovirus.
  • EXAMPLE 4 Mapping of the region of the domain® head of the fiber protein responsible for the maturation of dendritic cells.
  • the induction of the maturation of the dendritic cells was tested with four mutants of adenovirus Ad5 fiber protein carrying deletions in the head domain (FIGS. 6A and 6B).
  • the deletion present in the recombinant fiber protein ⁇ 402-481 covers the AB peptide loop, the ⁇ B and C sheets, the CD peptide loop as well as the N-terminal part of the DG peptide mouth.
  • the mutated recombinant fiber protein Fi ⁇ HI is only devoid of the Hl peptide loop.
  • Fi ⁇ EF and F ⁇ LT485-486 carry deletions in the short region of the double anti-parallel ⁇ EF sheet (Fi ⁇ EF), or a deletion of the two amino acid residues I485 and T486 which form the sheet ⁇ F (FÎ ⁇ LT485-486) (see KJrky et al., 2000 and Xia et al 1993).
  • the mutated Fi proteins Fi ⁇ EF and Fi ⁇ LT 485-486 are in the form of trimeric fibers, while the mutated Fi proteins FÎ ⁇ 402-481 and ⁇ Hi are deficient in the trimerization of the fiber (see Santis et al., 1999).
  • WT wild head domain
  • MLR mixed lymphocyte reaction
  • the three other mutated fiber proteins did not induce maturation of the dendritic cells, which suggests that the region in double antiparallel ⁇ -sheet EF, and more specifically the short ⁇ -sheet F , is essential for the maturing effect of dendritic cells.
  • the dendritic cells stimulated with the head domain of the fiber protein were compared with dendritic cells stimulated with other components of the adenovirus, for their effectiveness in inducing CD8 + T cell response specific to the GP33 peptide derived from the LCMV glycoprotein, which is restricted to haplotype D b .
  • the fluorescent vital dye CFSE was used to easily follow the presence of adoptively transferred splenocytes by flow cytometry analysis and by monitoring their elimination by specific CD8 + T cells induced by dendritic cell immunization. As illustrated in FIG. 7A, the population of spleen cells labeled with CFSE and loaded with the peptide GP33 decreased in 24 hours in the blood of all the mice immunized with the dendritic cells stimulated by the proteins Pb, Hx, or the protein of the head domain of the fiber and brought into contact with the peptide GP33.
  • mice treated with dendritic cells stimulated with the head domain of the fiber significantly faster cell rejection was observed in mice treated with dendritic cells stimulated with the head domain of the fiber, with a rejection rate similar to that observed in mice immunized with the peptide GP33 emulsified in l Freund's incomplete adjuvant (IFA).
  • the rejection curve of the cells in mice immunized with the dendritic cells stimulated with the head domain of the fiber is loaded with the peptide NP366 is identical to the curve observed in the mice immunized with the dendritic cells loaded with the peptide GP33 and put in presence of Pb or Hx, or even unstimulated. As illustrated in FIG.
  • mature dendritic cells with the head domain of the fiber are ten times more effective in inducing rejection of syngeneic splenocytes than dendritic cells stimulated by the other components of adenovirus, as suggested by comparison of the effects obtained by immunizing with 3 ⁇ 10 4 dendritic cells stimulated by the head domain, to be compared with the effects obtained after immunization with 2.5 ⁇ 10 5 dendritic cells stimulated with Hx and Pb.
  • analysis of CFSE + cells in the spleens of recipient mice, 10 days after the adoptive transfer provided even more significant results. 5% of CFSE + cells persisted in mice immunized with domain-stimulated dendritic cells.
  • CFSE + cells represent 72% and 60% of initial CFSE + cells respectively in im mice equipped with dendritic cells stimulated respectively by the proteins Pb and Hx.
  • Ten days after the adoptive transfer of the splenocytes labeled with CFSE (which corresponds to Day 20 after immunization with dendritic cells), the number of CD8 + T cells secreting IFNy was determined by carrying out ELISPOT tests ex vivo. As illustrated in FIG.

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Abstract

L’invention concerne un composé peptidique adjuvant de l’immunité consistant en : - un polypeptide (i) comprenant une séquence d’acides aminés de 30 acides aminés de longueur contenue dans le domaine « tête » de la protéine « fibre » de la capside d’un adénovirus, ladite séquence d’acides aminés comprenant l’enchaînement d’acides aminés formant la structure en double feuillet β désignée « EF » contenue dans ledit domaine « tête » ; ou - un peptide (ii) analogue dudit polypeptide (i) dont la séquence en acides aminés comporte, par rapport à la séquence dudit polypeptide (i), au moins une substitution ou au moins une délétion d’un acide aminé, ledit peptide analogue conservant ladite structure en double feuillet β désignée « EF ».

Description

Nouveau composé adjuvant de l'immunité, compositions le contenant et procédés mettant en œuvre ledit composé adjuvant
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine des composés adjuvants de l'immunité, c'est-à-dire des composés capables d'induire une augmentation de la réponse immunitaire à rencontre d'un antigène, afin d'augmenter l'efficacité de la stimulation de la réponse immunitaire par une composition immunogène, ou encore d'augmenter l'efficacité préventive ou thérapeutique d'une composition vaccinale.
ETAT DE LA TECHNIQUE De manière générale, les composés ou compositions ayant une fonction d'adjuvant de l'immunité sont utiles pour améliorer les conditions de stimulation d'une réponse immunitaire à encontre des antigènes. Classiquement, les composés ou les compositions adjuvants de l'immunité sont utilisés pour augmenter la quantité d'anticorps produits à encontre d'un antigène déterminé, ou pour augmenter la quantité des cellules T effectrices produites, qu'il s'agisse de cellules T auxiliaires (« T helper ») ou de cellules T-cytotoxiques. En général, l'association d'un antigène avec un composé ou une composition adjuvant de l'immunité, outre le fait d'accroître le niveau de la réponse immunitaire, par une plus grande production d'anticorps ou de cellules T effectrices spécifiques de l'antigène, permet également de réduire la quantité d'antigène incluse dans une composition immunogène ou vaccinale, et, le cas échéant, de réduire la fréquence d'injection de ladite composition immunogène ou vaccinale. L'association d'un adjuvant de l'immunité avec l'antigène d'intérêt est en particulier requise lorsque les propriétés d'immunogénicité de cet antigène d'intérêt, lorsqu'il est administré sans adjuvant, sont insuffisantes pour stimuler une réponse immunitaire efficace compte-tenu des objectifs d'immunisation poursuivis. Selon leur nature, les composés ou compositions adjuvants de l'immunité induisent une meilleure réponse immunitaire à encontre d'un antigène d'intérêt selon des voies distinctes. Certains adjuvants de l'immunité agissent sur le système immunitaire en induisant une production plus efficace d'anticorps à rencontre de l'antigène d'intérêt, par exemple en activant les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules B et les cellules T, ou en améliorant les conditions dans lesquelles l'antigène d'intérêt est présenté aux différentes cellules immuno-compétentes. Les composés ou compositions adjuvants de l'immunité peuvent augmenter la réponse immunitaire en prolongeant la durée de libération de l'antigène d'intérêt, en augmentant la quantité d'antigène absorbée par les cellules présentatrices de l'antigène, en régulant positivement l'apprêtement de l'antigène (« Antigen Processing ») par ces cellules, en stimulant la libération des cytokines, en stimulant la commutation isotypique (« Isotypic switching ») et la maturation des cellules B et/ou en éliminant les cellules immuno-suppressives. Parmi les différents composés ou compositions adjuvants de l'immunité, ceux qui permettent une meilleure présentation du ou des antigènes d'intérêt aux cellules immuno-compétentes, et tout particulièrement aux lymphocytes T auxiliaires (cellules « T Helper » ou « CD4+) » ou aux lymphocytes T-cytotoxiques (cellules « CTL » ou « CD8+ »), revêtent un grand intérêt pour la mise au point de compositions immunogènes ou de compositions vaccinales efficaces. Les cellules du système immunitaire qui apprêtent les antigènes en les fragmentant en peptides, puis en présentant ces peptides, en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I ou de classe II, sont essentiellement les macrophages et les cellules dendritiques. Les cellules dendritiques sont capables d'apprêter les antigènes, puis de présenter les peptides issus de l'apprêtement des antigènes aux cellules T naïves. Les cellules dendritiques activent les cellules T de manière plus efficace que n'importe quelle autre cellule présentatrice de l'antigène. Elles sont de plus requises pour l'activation initiale des cellules T naïves, que ce soit in vitro ou in vivo. Les cellules dendritiques sont généralement présentes, dans l'organisme, à des localisations exposées aux antigènes étrangers, tels que la peau, le foie, l'intestin, le sang et les tissus lymphoïdes. Globalement, les cellules dendritiques sont classées selon quelles sont à un stade immature ou à un stade mature. Les cellules dendritiques matures sont capables de capter les antigènes par endocytose et de les apprêter de manière efficace, et également d'exprimer de hauts niveaux de molécules co-stimulatrices, telles que les molécules CD40, CD80 et CD86, ainsi que les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) HLA-DPv. De plus, les cellules dendritiques matures expriment le marqueur CD83 et sécrètent de hauts niveaux de diverses cytokines et chimiokines qui agissent en tant qu'auxiliaires à l'activation des cellules T. Outre leur rôle d'activation des cellules T naïves, les cellules dendritiques matures peuvent également influencer l'équilibre de la réponse immunitaire Th1/Th2. Diverses études ont indiqué que les cellules dendritiques activent préférentiellement les réponses de type Th1, vraisemblablement grâce à la sécrétion d'IL-12 par les cellules dendritiques activées. ( acatonia et al., 1995, J. Immunol., vol.154 :5071 ; Hilkens et al., 1997, blood, vol.90 : 1920). Toutefois, de nombreux travaux ont montré que les cellules dendritiques peuvent induire indifféremment la génération de clones de cellules Th1 ou Th2. (Roth et al., 1996, Scand. J. Immunol., vol.43 :646). Le rôle important joué par les cellules dendritiques dans la présentation de l'antigène et l'activation des cellules T a suscité un grand intérêt en vue d'utiliser ou d'activer des cellules dendritiques en immunothérapie. L'activation ou l'obtention de cellules dendritiques matures revêt un intérêt particulièrement important dans le domaine des vaccins et de l'immunothérapie des cancers. Dans l'état de la technique, on a montré que les acides nucléiques contenant des séquences d'oligonucléotides de type CpG étaient capables d'induire la maturation des cellules dendritiques. Récemment, on a aussi utilisé des cellules dendritiques autologues obtenues à partir de patients cancéreux dans le cadre d'immunothérapie des cancers, comme cela est décrit notamment dans la demande PCT publiée sous le N°WO 98/23728. Il a aussi été montré que des composés chimiques contenant un système cyclique choisi parmi les systèmes cycliques du type imida∑oquinoline, imida∑opyridine, cycloalkylirriida∑opyridine, imidazonaphthyridine ou imidazotétrahydronaphthyridine, étaient capables d'induire in vitro la maturation de cellules dendritiques immatures, comme cela est décrit dans le brevet US N°6,558, 951. Il existe un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux composés adjuvants de l'immunité capables d'activer les cellules dendritiques et d'induire leur maturation, en vue d'obtenir une réponse immunitaire de haut niveau à rencontre d'un antigène d'intérêt, que ce soit par la production d'une grande quantité d'anticorps spécifiques de cet antigène d'intérêt, ou que ce soit par la stimulation de la prolifération de cellules T auxiliaires ou de cellules T-cytotoxiques spécifiques de cet antigène d'intérêt.
SOMMAIRE DE L'INVENTION Selon la présente invention, il a été caractérisé une nouvelle famille de composés adjuvants de l'immunité, du type peptide, qui activent les cellules dendritiques et induisent la maturation de cellules dendritiques immatures. Les composés adjuvants de l'immunité selon l'invention sont dérivés du domaine tête ( knob ») de la protéine « fibre » (« fiber protein ») de la capside d'un adénovirus. Plus précisément, l'invention a pour objet un composé adjuvant de l'immunité consistant en : - un polypeptide (i) comprenant une séquence d'acides aminés de 30 acides aminés de longueur contenue dans le domaine « tête » de la protéine « fibre » de la capside d'un adénovirus, ladite séquence d'acides aminés comprenant l'enchaînement d'acides aminés formant la structure en double feuillet β désignée « EF » contenue dans ledit domaine « tête » ; ou - un peptide (ii) analogue dudit polypeptide (i) dont la séquence en acides aminés comporte, par rapport à la séquence dudit polypeptide (i), au moins une substitution ou au moins une délétion d'un acide aminé, ledit peptide analogue conservant ladite structure en double feuillet β désignée « EF ». L'invention concerne aussi une composition adjuvante de l'immunité comprenant un composé adjuvant tel que défini ci-dessus, en association avec au moins un excipient physiologiquement compatible. Elle a également trait à une composition immunogène ainsi qu'à une composition vaccinale comprenant un composé adjuvant tel que défini ci-dessus, en association avec au moins un antigène d'intérêt. L'invention est également relative à un procédé pour la maturation in vitro des cellules dendritiques immatures humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver in vitro une population de cellules enrichies en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, dans un milieu de culture approprié ; et b) incuber les cellules cultivées à l'étape a) avec un composé adjuvant ou une composition adjuvante telles que définies ci-dessus, pendant une durée suffisante à induire la maturation des cellules dendritiques. L'invention concerne aussi une population de cellules enrichie en cellules dendritiques matures, susceptibles d'être obtenues par le procédé de maturation ci-dessus. L'invention a également pour objet une composition adjuvante de l'immunité, caractérisée en ce qu'elle comprend une population de cellules dendritiques matures obtenues selon le procédé de maturation ci-dessus. L'invention est également relative à un procédé pour stimuler in vitro des cellules T spécifiques de l'antigène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtenir une population de cellules enrichies en cellules dendritiques matures par le procédé de maturation ci-dessus ; b) mettre en contact la population de cellules enrichies en cellules dendritiques matures obtenues à l'étape a) avec une population de cellules enrichies en cellules T provenant du même individu, homme ou animal. DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : schéma de la structure de la protéine fibre chez des virions d'adénovirus de sérotype 5, respectivement sauvages (figure 1A) et des virus dépourvus du domaine « tête » (figure 1B). La protéine fibre de l'adénovirus comprend trois domaines structurels, en partant de l'extrémité N-terminale jusqu'à l'extrémité C- terminale : La « queue » qui est liée de manière non-covalente à la partie « penton base »; la « tige » et le domaine « tête » se liant au récepteur CAR, qui est responsable de l'attachement de l'adénovirus aux cellules permissives. L'adénovirus sauvage de sérotype Ad5 possède des « fibres » comprenant une longue « tige » possédant 22 répétitions du motif en feuillet β. Avec le vecteur mutant dépourvu du domaine « tête » utilisé selon l'invention (AdE1° Δ knob, voir figure 4C), la « tige » de la protéine fibre est plus courte, avec sept répétitions du motif en feuillet β et se terminent par un motif de trimérisation suivi d'un codon stop « opale ». Figure 2 : effet des composants de capside de l'adénovirus sur le phénotype des cellules dendritiques. Les cellules dendritiques ont été cultivées dans le milieu de culture seul (NS ; cellules dendritiques non stimulées), ou en présence des protéines purifiées de l'adénovirus Ad5 (1 μg par 106 cellules), ou de LPS (1 μg/ml) ; puis ont été caractérisées pour leur expression du marqueur CD11c et des marqueurs de maturation spécifique des cellules dendritiques. Figure 2A : cellules dendritiques cultivées avec Hx et Pb (penton base lié à la fibre) isolées à partir de cellules HeLa infectées par l'adénovirus Ad5. Figure 2B : cellules dendritiques cultivées avec des protéines recombinantes Hx, Pb ou Fi purifiées à partir de cellules Sf9 infectées par un baculovirus, ou avec une protéine Pn (penton) purifiée à partir de cellules HeLa infectées par l'adénovirus Ad5. Les valeurs d'intensité moyenne de fluorescence (MFI) sont apparentes sur les différents panneaux de la figure 2A et apparaissent en ordonnées sur la figure 1B. Les résultats présentés sont représentatifs de trois essais indépendants. Figure 3 : effet dose-dépendant de la protéine tête de l'adénovirus Ad5 sur la maturation des cellules dendritiques. Les cellules dendritiques ont été incubées en l'absence « cellules dendritiques non stimulées, NS » ou en présence de 1μg de protéine Fi ou de protéine du domaine tête (figure 3A), où les cellules dendritiques ont été incubées avec des quantités déterminées de protéines Fi et Hx (respectivement 1 μg) et des concentrations variées de protéines tête (dans une gamme allant de 0,5 à 0,02μg) (figures 3B, 3C). Les cellules dendritiques et les surnageants de culture ont été recueillis et testés comme indiqué ci-dessous. Pour la figure 1A, les cellules dendritiques ont été caractérisées pour l'expression du marqueur CD11c et les marqueurs de maturation. Les pourcentages de cellules CD11c+ et les valeurs moyennes d'immunofluorescence (MFI) pour les marqueurs de maturation ont été représentées. Pour la figure 3B, des nombres croissants de cellules dendritiques ont été utilisées comme cellules stimulantes, avec des cellules T CD4+ allogéniques purifiées. Les valeurs de prolifération cellulaire, testée par incorporation de 3H-thymidine, est exprimée en cpm (moyenne de trois essais ; m ± SD). Pour la figure 3C, les quantités de IL12 p70 et de TNFα ont été déterminées par une technique ELISÂ à partir de surnageant de culture des cellules dendritiques, et les résultats ont été exprimés en nanogramme par 10e cellules. Les données sont représentatives d'au moins trois essais indépendants et les valeurs de déviation standard (SD), situées dans la fourchette de 15% des valeurs moyennes, ne sont pas représentées. Figure 4 : preuve d'une interaction directe entre la protéine du domaine tête et les cellules dendritiques, et preuve de la nécessité du domaine tête dans la maturation des cellules dendritiques induites par l'adénovirus Ad5. Pour la figure 4A, des cellules dendritiques purifiées à l'aide de billes magnétiques recouvertes d'anticorps anti-CD11c ont été stimulées avec 0,5μg de protéine du domaine tête ; des cellules dendritiques purifiées non stimulées (NS) ont été utilisées comme témoins. En abscisse, on a représenté les pourcentages de cellules CD11c+ et les valeurs moyennes d'immunofluorescence (MFI) pour les marqueurs de maturation. Pour la figure 4B, les cellules dendritiques ont été stimulées avec
1 μg de protéine Fi (protéine fibre complète), puis incubées avec des anticorps monoclonaux de souris anti-domaine queue de la protéine fibre (anti-Fi-tail). Le pourcentage de cellules fluorescentes ayant fixé la protéine fibre a été déterminé après soustraction de la fixation non spécifique d'anticorps monoclonaux anti-Fi sur des cellules dendritiques non stimulées (NS-DC). Pour la figure 4C, les cellules dendritiques n'ont pas été stimulées (NS), ou ont été stimulées avec, respectivement, soit le virus Ad5E1 ° portant une protéine fibre sauvage (WT-Fi-Carrying Ad5E1°) ou avec le vecteur Ad5E1°Δ knob dépourvu du domaine tête, à raison de 1x104 particule par cellule. Sur les histogrammes, sont représentées les valeurs moyennes d'immunofluorescence (ivIFI) pour les marqueurs de maturation des cellules CD11c+. Les résultats présentés sont représentatifs de deux essais indépendants. Figure 5 : absence d'expression du récepteur CAR sur les cellules dendritiques et faible permissivité des cellules dendritiques vis-à-vis de l'infection par l'adénovirus de sérotype 5 . Des cellules dendritiques immatures isolées avant toute stimulation ont été incubées avec du liquide d'ascite contenant des anticorps monoclonaur. anti-CAR (ligne en gras), ou avec un liquide d'ascite non apparenté (ligne en gris). Les cellules dendritiques ont été analysées par cytométrie de flux (FACS). Les cellules HeLa et CHO ont été utilisées respectivement comme témoins positifs et négatifs. Figure β : cartographie de la région du domaine tête de la fibre impliquée dans la maturation des cellules dendritiques. Figure 6A : représentation schématique de la structure conformationnelle du domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus Ad5 (Xia et al., 1994). Ce diagramme montre les différentes régions A à J ayant une structure de feuillet β ainsi que les boucles de liaison respectives AB, CD, DG, GH, Hl et IJ. Sur la ligne supérieure on a indiqué la numérotation des acides aminés, en partant du résidu méthionine N-terminale de la protéine fibre complète de l'adénovirus Ad5. Les régions du domaine tête de la protéine fibre interagissant avec le récepteur CAR sont représentées sous la forme de boîtes noires pleines sur la ligne inférieure de la figure. La figure 6B est une représentation linéaire des différents mutants de delétion du domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus Ad5. La séquence du domaine tête est indiquée par des boîtes pleines ; les régions délétées sont indiquées sous la forme de lignes fines. Pour la figure 6C , on a utilisé, comme cellules stimulantes vis-à- vis de cellules TCD4+ allogéniques purifiées, respectivement, des cellules dendritiques non stimulées (NS), des cellules dendritiques stimulées avec des extraits sans tête domaine (MS ; « mock- stimulated »), ou des cellules dendritiques stimulées avec la protéine du domaine tête sauvage (« kπob T ») ou avec des mutants de delétion du domaine tête de la protéine fibre. Les résultats présentés consistent en des moyennes de trois essais séparés . Dans les résultats présentés, on peut noter que seul 0,5 μg de protéine du domaine tête ont été utilisées, à comparer avec 2 μg de protéine mutante . Figure 7 : les cellules dendritiques stimulées avec le domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus Âdδ stimule in vivo des cellules TCD8+ spécifiques pour le peptide antigénique GP33 dérivé de la glycoprotéine du LCiWiV. La figure TA illustre le rejet de cellules donneuses par des souris receveuses vaccinées avec les cellules dendritiques . Des splénocytes de souris B6 marqués avec le CFSE (5-6-carboxyfluαresceiπ diacétate succinimidyl ester) ont été chargés avec le peptide GP33, puis les splénocytes traités ont été transfusés dans des souris receveuses B6 qui ont été préalablement immunisées avec, respectivement, (i) des cellules dendritiques stimulées avec le domaine tête de la protéine fibre (respectivement 2,5 x 105, 9x 104 et 3x104 cellules), chargées avec GP33 ou (ii) avec des cellules dendritiques chargées avec GP33 (2,5 x 105 cellules) stimulées avec Pb ou Hx, ou non stimulées (NS), ou (iii) avec des cellules dendritiques chargées avec NP366 (2,5 x 105) stimulées avec le domaine tête de la protéine fibre, ou (iv) avec le peptide GP33 en émulsion dans de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA). Le niveau de rejet, exprimé en pourcentage, a été calculé dans le sang et dans la rate à différents moments après le transfert cellulaire adoptif. La figure 7B représente la sécrétion d'IFN-γ ex vivo par les mêmes souris que pour la figure 7A . Des cellules de rate et des lymphocytes du sang périphérique (PBL) fraîchement isolés ont été incubés pendant 20 heures avec le peptide GP33; évaluation du nombre des cellules spécifiques du GP33 sécrétant de l'IFN-γ par un test Elispot IFN-y:; les résultats sont exprimés en SFC ("spot forming colony")/105 cellules T CD8+( moyenne de test réalisé en triple + SD). Chaque spot correspond à une cellule sécrétant l'IFN-y. La figure 7C illustre l'activité cytolytique de cellules effectrices dérivées de souris vaccinées avec des cellules dendritiques (3 x 104 cellules) et non stimulées ou stimulées avec le domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus Ad5. Après une stimulation de 4 jours in vitro avec le peptide GP33, les cellules de rate ont été incubées avec les cellules cibles EL4 marquées au 51Cr puis chargées avec le peptide GP33 ou le peptide NP366, dans un test de relarguage de chrome seules les activées spécifiques du GP33 lyseront les cibles (51 Cr).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'IiWENTIOM
Selon l'invention, on a montré que le domaine tête de la protéine fibre de capside d'un adénovirus est capable d'interagir directement avec des cellules dendritiques immatures et de provoquer leur activation et leur maturation en cellules dendritiques matures. Les adénovirus se présentent comme des particules de forme icosaédrique de 70 à 100 nanomètres de diamètre, selon le sérotype. La capside virale comprend deux éléments constitutifs majeurs, respectivement, (i) l'hexon (Hx) qui forme les faces et le penton (Pn) situé aux 12 sommets. La base du penton (ou penton-base) est associée à la protéine fibre, qui est une projection spiculaire émanant de la base du penton, constituée d'un trimère de polypeptide IV. La fibre est une protéine de 581 à 587 résidus d'acides aminés pour les espèces d'adénovirus à fibres longues, comme les espèces C et A, et de 319 à 325 résidus d'acides aminés pour les fibres les plus courtes comme celles des adénovirus de sérotypes 3 et 7, appartenant à l'espèce B. Les fibres sont toutes formées de trois domaines structuraux distincts, respectivement la queue, la tige et la tête. La queue s'insère dans le penton-base. La tige est constituée de la répétition périodique d'un motif d'une quinzaine de résidus formant chacun une structure en feuillet β . Le nombre des répétitions du motif unitaire définit la longueur de la tige, qui est variable entre les fibres des différentes espèces d'adénovirus. A l'extrémité C-terminale de la fibre se trouve une zone renflée, la tête, qui est formée d'un trimère d'une séquence polypeptidique de 180 à 200 résidus d'acides aminés. Comme cela est représenté sur la figure 6Â, chaque monomère de tête associe un squelette de huit feuillets β anti-parallèles reliés entre eux par des boucles dont la conformation varie considérablement selon les sérotypes. Certains auteurs avaient démontré que l'adénovirus humain était capable de faire maturer les cellules dendritiques humaines et murines in vitro (Rea et al., 99 ; Hirshowitz et al., 2000 ; Morelli et al., 2000 ; Rouard et al., 2000). Toutefois, ces observations fortuites de l'activité des vecteurs adénoviraux sur la matière et sur les cellules dendritiques ne permettaient pas d'identifier quelle était la voie d'activation et de maturation des cellules dendritiques. Ainsi, ces résultats antérieurs ne permettaient pas de déterminer objectivement quel était le mécanisme moléculaire d'activation et de maturation des cellules dendritiques induit par l'adénovirus ni, a fortiori, le constituant ou la combinaison de constituants de l'adénovirus susceptible d'en constituer le ou les agent(s) causals, notamment parmi les douze polypeptides majeurs constitutifs de la particule virale. On a désormais montré selon l'invention qu'un polypeptide constitué d'un fragment du domaine tête de la protéine fibre d'un adénovirus, ledit fragment comprenant la séquence d'acides aminés formant la structure en double feuillet β anti-parallèle désignée « EF » induit l'activation et la maturation de cellules dendritiques immatures. Plus précisément, on a montré selon l'invention qu'un fragment peptidique du domaine tête de la protéine fibre d'un adénovirus comprenant la séquence d'acides aminés délimitant le feuilletβ antiparallèle EF et délété dans d'autres régions peptidiques du domaine tête, comme par exemple le feuillet β anti-parallèle « Hl », possède des propriétés d'activation et de maturation des cellules dendritiques immatures identiques à celles observées pour un polypeptide comprenant la séquence complète du domaine tête de la protéine fibre dudit adénovirus. En revanche, il a aussi été montré qu'un polypeptide constitué du domaine tête de la protéine fibre et qui comprend la delétion de la séquence d'acides aminés formant la structure en feuillet β antiparallèle EF a perdu les propriétés d'activation et de maturation des cellules dendritiques immatures du domaine tête complet. Encore plus précisément, il a été montré qu'un polypeptide constitué du domaine tête et comprenant la delétion de deux acides aminés dans la région F du feuillet β antiparallèle EF ne possède pas les propriétés d'activation et de maturation des cellules dendritiques immatures qui sont observées avec un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés complète du domaine tête. Ainsi, les résultats obtenus par le demandeur montrent qu'un polypeptide constitué d'un fragment peptidique du domaine tête de la protéine fibre d'un adénovirus, et qui comprend la séquence d'acides aminés formant la structure en double feuillet β antiparallèlë EF, ledit polypeptide ne comprenant pas les séquences d'acides aminés formant d'autres structures en feuillet β contenues dans le domaine tête, est capable d'induire l'activation et la maturation des cellules dendritiques immatures. Les résultats obtenus par le demandeur montrent que les propriétés d'activation et de maturation des cellules dendritiques immatures du domaine tête de la protéine fibre d'un adénovirus sont portées par une petite région peptidique dudit domaine tête, les régions d'acides aminés formant la structure en double feuillet β EF. Le domaine tête de la protéine fibre de tous les adénovirus possède une structure commune constituée d'une succession de feuillets β reliés entre eux par des boucles peptidiques, similaires à celles du domaine tête de l'adénovirus de sérotype 5 (Ad5) représentée sur la figure 6A. Le demandeur a aussi montré que, au moins du point de vue des propriétés d'activation et de maturation des cellules dendritiques immatures, cette identité de structure du domaine tête de l'ensemble des adénovirus impliquait aussi une identité de fonction. Ainsi, on a montré selon l'invention qu'un vecteur adénoviral comprenant des protéines fibres chimères constituées d'une queue et d'une tige provenant d'un adénovirus de sérotype 5 et un domaine tête provenant d'un adénovirus de sérotype 3 est capable également d'induire l'activation et la maturation des cellules dendritiques immatures. Les résultats ci-dessus ont permis aux demandeurs de définir une famille nouvelle de composés adjuvants de l'immunité, dérivée du domaine tête de la protéine fibre d'un adénovirus, cette nouvelle famille de composés adjuvants de l'immunité constituant un premier objet de l'invention . L'invention a pour objet un composé adjuvant de l'immunité consistant en : - un polypeptide (i) comprenant une séquence d'acides aminés de 30 acides aminés de longueur contenue dans le domaine « tête » de la protéine t fibre 5> de la capside d'un adénovirus, ladite séquence d'acides aminés comprenant l'enchaînement d'acides aminés formant la structure en double feuillet β désignée « EF s> contenue dans ledit domaine « tête » ; ou - un peptide (ii) analogue dudit polypeptide (i) dont la séquence en acides aminés comporte, par rapport à la séquence dudit polypeptide (i), au moins une substitution ou au moins une delétion d'un acide aminé, ledit peptide analogue conservant ladite structure en double feuillet β désignée « EF ». On a montré dans les exemples qu'un composé adjuvant répondant à la définition ci-dessus induit la maturation des cellules dendritiques immatures. En particulier, un composé adjuvant ci- dessus induit l'expression par les cellules dendritiques des molécules de classe I et de classe II du CMH, ainsi que des marqueurs spécifiques des cellules dendritiques matures, tels que les marqueurs CD40, CD80 et CD86. Les cellules dendritiques stimulées par un composé adjuvant tel que défini ci-dessus induisent la prolifération de lymphocytes T CD4+ allogéniques dans des essais de réaction lymphocytaire mixte (MLR) et induit également la sécrétion d'IL-12 et de TNFα de manière dose dépendante. Un composé adjuvant selon l'invention agit directement sur les cellules dendritiques immatures sans fixation sur le récepteur CAR. Pour les composés adjuvants de l'invention constitués d'un polypeptide (i), ledit polypeptide (i) a une séquence d'acides aminés d'au moins 30 acides aminés de longueur puisque le polypeptide (i) comprenant dans tous les cas une séquence d'acides aminés de 30 acides aminés de longueur contenant la séquence d'acides aminés formant le feuillet β EF du domaine tête de la protéine fibre d'un adénovirus, qui porte la fonction de maturation des cellules dendritiques immatures. Pour les composés adjuvants de l'immunité constituée d'un peptide (ii) analogue du polypeptide (i), ledit peptide (ii) analogue possède une structure très proche du polypeptide (i) et conserve la caractéristique structurelle essentielle de contenir une séquence d'acides aminés formant la structure en double feuillet β antiparallèle EF. Dans un peptide (ii) analogue, la séquence d'acides aminés du feuillet β EF peut comprendre, par rapport à la séquence d'acides aminés du feuillet β EF du domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus dont elle dérive, une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé. Toutefois, la ou les substituions d'acides aminés dans la séquence du feuille β EF sont telles qu'elles ne modifient pas ladite structure en feuillet β. Toutefois, de manière tout à fait préférée, la séquence d'acides aminés formant le feuillet β EF d'un peptide (ii) analogue est identique à la séquence d'acides aminés du feuillet β EF du polypeptide (i) parent. Selon un aspect préféré d'un composé adjuvant selon l'invention, l'enchaînement d'acides aminés formant la structure en double feuillet β EF est localisée approximativement au centre de la séquence d'acides aminés dudit polypeptide. Par exemple, la séquence d'acides aminés du feuillet β EF du domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus de sérotype 5 a une longueur de 8 acides aminés. Comme cela est montré sur la figure 6A, cette séquence d'acides aminés débute au résidu d'acide aminé en position 479 et se termine au résidu d'acide aminé localisé en position 486 de la protéine fibre complète de l'adénovirus de sérotype 5. Pour un composé adjuvant constitué d'un polypeptide (i) ayant la longueur minimale de 30 acides aminés, la séquence d'acides aminés du feuillet β EF, de 8 acides aminés, est précédée, à l'extrémité N-terminale, d'une séquence de 11 acides aminés de longueur correspondant à une partie de la boucle DE et est suivie, du côté C-terminal, d'une séquence de 11 acides aminés de longueur comprenant une partie de la boucle FG. La séquence d'acides aminés du feuillet β EF contenue dans un polypeptide (i) adjuvant selon l'invention est localisée « approximativement » au centre de la séquence d'acides aminés du polypeptide (i) lorsque les séquences localisées respectivement du côté N-terminal et du côté C-terminal de la séquence du feuillet β EF n'ont pas une longueur identique. Par exemple, la longueur des séquences localisées respectivement du côté N-terminal et du côté C-terminal de la séquence d'acides aminés du feuillet β EF peuvent différer d'une longueur allant jusqu'à 20 acides aminés, l'une par rapport à l'autre. Selon un autre aspect préféré d'un polypeptide (i) adjuvant selon l'invention, ledit polypeptide (i) comprend, de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale, les séquences d'acides aminés de la boucle DE, du feuillet β EF et de la boucle FG. A titre illustratif, pour un polypeptide (i) de ce type dérivé de la protéine fibre de l'adénovirus de sérotype 5, ledit composé adjuvant est constitué du polypeptide dont la séquence en acides aminés débute au résidu d'acide aminé en position 463 et se termine au résidu d'acide aminé en position 515 de la séquence de la protéine fibre complète. Pour ce composé adjuvant, la séquence d'acides aminés du feuillet β EF est localisée « approximativement » au centre de la séquence d'acides aminés du polypeptide (i), bien que la séquence d'acides aminés de la boucle FG, à l'extrémité C-terminale, possède une longueur de 12 résidus d'acides aminés supérieure à celle de la boucle DE localisée à l'extrémité N-terminale. De manière générale, un composé adjuvant selon l'invention du type polypeptide (i) a une longueur d'au moins 30 acides aminés, et d'au plus 195 acides aminés et de manière tout à fait préférée d'au plus 180 acides aminés. Ainsi, un composé adjuvant selon l'invention du type polypeptide (i) a une longueur d'au moins 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190 ou 195 acides aminés de longueur. Selon un premier mode de réalisation préféré d'un composé adjuvant de l'immunité consistant en un polypeptide (i) tel que défini ci- dessus, la séquence dudit polypeptide (i), d'une longueur de « n » acides aminés, consiste en une séquence de « n » acides aminés consécutifs d'une séquence correspondante contenue dans le domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus considéré. Il y a donc identité en acides aminés entre la séquence du composé adjuvant du type polypeptide (i) et la séquence de la partie correspondante du domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus considéré. Selon un second mode de réalisation préféré, le polypeptide (i), d'une longueur de « n » acides aminés, comprend une séquence de « » acides aminés consécutifs du domaine tête et comprenant la séquence du feuillet β EF ainsi qu'une ou deux séquences d'acides aminés additionnelles, la longueur totale des séquences d'acides aminés additionnelles étant de « n - x » acides aminés, localisées à l'extrémité N-terminale et/ou à l'extrémité C-terminale de la séquence du domaine tête de « x » acides aminés. Il doit être compris que « n » est un nombre entier compris entre 30 et 195 et que « x » est un nombre entier compris entre 30 et « n-x ». Dans un composé adjuvant du type polypeptide (i), la ou les séquences additionnelles, autres que la séquence partielle du domaine tête de la protéine fibre qui comprend la séquence du feuillet β EF, peuvent consister en des séquences de peptides détectables par des anticorps spécifiques d'un tel peptide, qui pourra donc être utilisé comme marqueur. Selon un autre aspect, les séquences additionnelles peuvent consister en des séquences permettant une purification plus aisée du composé adjuvant après sa synthèse, que ce soit par synthèse chimique ou par synthèse par recombinaison génétique. A titre illustratif d'un tel aspect, les séquences additionnelles sont choisies parmi des séquences de polyhistidine, par exemple des séquences comprenant de 4 à 10, et de préférence 6, résidus d'histidine. Ces séquences peuvent aussi consister en des peptides ou polypeptides destinés à faciliter la purification du composé adjuvant, telle que la GST. De manière tout à fait préférée, la séquence de « x » acides aminés additionnelle est localisée du côté C-terminale de la séquence du domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus considéré. Selon un autre mode de réalisation, un composé adjuvant selon l'invention du type polypeptide (i) comprend une séquence d'acides aminés du domaine tête de la protéine fibre d'un adénovirus qui comprend, de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale, le feuillet β D. La boucle peptidique DE, le feuillet β EF et la boucle peptidique FG du domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus considéré. Pour le domaine tête de l'adénovirus de sérotype 5, un tel polypeptide (î) possède une séquence d'acides aminés débutant à l'acide aminé en position 454 et se termine à l'acide aminé en position 515 de la protéine fibre complète, comme cela est représenté sur la figure 6A. Selon encore un autre mode de réalisation préféré, un composant adjuvant selon l'invention, du type polypeptide (i), comprend une séquence d'acides aminés du domaine tête qui comprend, de l'extrémité
N-terminale, vers l'extrémité C-terminale, respectivement la boucle peptidique DE, le feuillet β EF, la boucle peptidique FG et le feuillet β G. A titre illustratif, pour le domaine tête de l'adénovirus de sérotype 5, un tel polypeptide (i) comprend la séquence débutant à l'acide aminé en position 463 et se terminant à l'acide aminé en position 521 de la protéine fibre complète, comme cela est représenté sur la figure 6. Selon encore un autre mode de réalisation préféré, un composé adjuvant du type polypeptide (i) comprend, de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale, respectivement le feuillet β D, la boucle peptidique DE, le feuillet β EF, la boucle peptidique FG et le feuillet βG. A titre illustratif, pour le domaine tête de l'adénovirus de sérotype 5, un tel polypeptide (i) comprend la séquence d'acides aminés débutant à l'acide aminé en position 454 et se terminant à l'acide aminé en position 521 de la protéine fibre complète. Selon encore un autre mode de réalisation particulier d'un composé peptidique adjuvant de l'invention, le polypeptide (i) ou le peptide (ii) analogue comprend également, en plus de la séquence d'acides aminés du domaine tête de fibre, également la dernière sous- unité de répétition de la tige de fibre. Un tel composé adjuvant peptidique selon l'invention comprenant la dernière sous-unité de répétition de la tige de fibre est susceptible de posséder une grande stabilité de structure et de bloquer la partie du domaine tête dans sa conformation native et sous forme d'un trimère peptidique. A titre illustratif de ce mode de réalisation particulier d'un composé adjuvant peptidique de l'invention qui comprend un polypeptide (i) dérivé de la protéine fibre de l'adénovirus de sérotype 5, ledit polypeptide (i) comprend la séquence d'acides aminés débutant au résidu d'acide aminé en position 380 et se terminant au résidu d'acide aminé en position 581 de la séquence d'acides aminés de la protéine fibre complète. Selon une caractéristique préférée d'un composé adjuvant selon l'invention, le polypeptide (i) comprend une partie du domaine tête de la protéine fibre d'un adénovirus qui est un adénovirus humain. Avantageusement, l'adénovirus humain est choisi parmi les adénovirus du sous-groupe B, qui comprend les adénovirus Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21 , Ad34 et Ad35, ou parmi les adénovirus du sous-groupe C, qui comprend les adénovirus Ad1 , Ad2, Ad5 et Ad6. Préférentiellement, l'adénovirus humain est choisi dans le groupe constitué des adénovirus des sérotypes 12 18, 31, 3, 7, 11 , 14, 16, 21 , 34, 35, 1 , 2, 5, 6, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 4, 40 et 41. De préférence, un peptide adjuvant selon l'invention dérive du domaine tête de la protéine fibre d'un adénovirus choisi parmi Ad5, Ad3 etAd12. Les protéines fibres complètes des adénovirus Ad5, Ad3 et Ad12 sont représentées comme les séquences d'acides aminés SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2 et SEQ id N°3, respectivement. Le domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus Ad5 débute au résidu d'acide aminé en position 400 de la séquence SEQ ID N°1. Le domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus Ad3 débute au résidu d'acide aminé en position 132 de la séquence SEQ ID N°2. Le domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus Ad12 débute au résidu d'acide aminé en position 409 de la séquence SEQ ID N°3. Les structures cristallines des protéines fibres des adénovirus
Ad5, Ad3 et Ad12 ont été décrites par Xia et al. (1994), Dumort et al. (2001) et Bewley et al. (1999), respectivement. Selon encore un autre aspect préféré d'un composé adjuvant selon l'invention, celui-ci est caractérisé en ce que le polypeptide (i) comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences suivantes : - la séquence débutant à l'acide aminé en position 463 et se terminant à l'acide aminé en position 515 de la séquence SEQ ID N° 1 - la séquence débutant à l'acide aminé en position 195 et se terminant à l'acide aminé en position 247 de la séquence SEQ ID N° 2. - la séquence débutant à l'acide aminé en position 472 et se terminant à l'acide aminé en position 535 de la séquence SEQ ID N° 3. Comme cela a déjà été décrit précédemment, un mode de réalisation particulier du composé adjuvant selon l'invention, consiste en un peptide (ii) analogue du polypeptide (i) défini ci-dessus, dont la séquence en acides aminés comporte, par rapport à la séquence dudit polypeptide (i), au moins une substitution ou au moins une delétion d'un acide aminé, ledit peptide analogue conservant la structure double feuillet β EF. De manière tout à fait préférée, la ou les substitution(s) ou délétion(s) d'un acide aminé, par rapport à la séquence du polypeptide
(i) est (sont) localisée(s) dans la partie du peptide (ii) analogue dérivée de la séquence du domaine tête de la protéine fibre d'adénovirus contenue dans le polypeptide (i) parent. De préférence, le peptide analogue (ii) adjuvant comprend 2,3,4,5,6,7,8,9 ou 10 substitutions ou délétions d'un acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide (i) parent. Selon encore un autre mode de réalisation d'un composé adjuvant de l'immunité selon l'invention, ledit composé adjuvant est caractérisé en ce que le polypeptide (i) ou le peptide analogue (ii) consiste en un polypeptide cyclique. Les peptides (ii) adjuvants qui comprennent dans leur séquence une ou plusieurs différences en acides aminés par rapport à la séquence correspondante contenue dans le domaine tête de la protéine fibre naturelle de l'adénovirus considéré, possède néanmoins des propriétés adjuvantes, c'est-à-dire des propriétés d'induire la maturation des cellules dendritiques immatures, du même ordre de grandeur que le polypeptide (i) parent dont il dérive. De manière générale, l'invention est relative à des peptides adjuvants dérivés du domaine tête de la protéine fibre d'un adénovirus qui possède la même activité adjuvante que les peptides adjuvants spécifiquement décrits dans la présente description. Comme cela est montré dans les exemples, la propriété d'un composé adjuvant selon l'invention d'induire la maturation des cellules dendritiques immatures peut être aisément vérifiée par l'homme de l'art, par exemple en déterminant le niveau d'expression des molécules du CMH de classe I ou de classe II, ou encore le niveau d'expression de marqueur spécifique de la maturation de cellules dendritiques, telles que les molécules CD40, CD80 et CD86. Les autres tests décrits dans les exemples peuvent également être utilisés par l'homme de l'art pour vérifier la capacité adjuvante de maturation des cellules dendritiques d'un composé selon l'invention, tel que : (i) la capacité du composé adjuvant à stimuler des cellules dendritiques immatures à induire une réaction lymphocytaire mixte en présence de cellules TCD4+ allogéniques ; (ii) la capacité des cellules dendritiques stimulées avec un composé adjuvant de l'invention, et chargées avec un antigène, à induire une réponse immunitaire par l'induction de la prolifération de cellules
TCD8+ spécifiques dudit antigène, et encore plus spécifiquement des cellules TCD8+ sécrétant de l'interféron gamma. (iii) La capacité d'un composé adjuvant selon l'invention à stimuler la production d'IL-12 et de TNFα par les cellules dendritiques. De préférence, dans la séquence d'un peptide analogue (ii), un acide aminé contenu dans la séquence du polypeptide (i) parent est substitué par un acide aminé de la même classe d'acide aminé, parmi les classes des acides aminés acides (D, E), basiques (K, R, H), non polaires (A, V, L, I, P, M, F, W) ou encore des acides aminés polaires non chargés (G, S, T, Y, N, Q). De préférence, la partie du peptide (ii) analogue dérivée de la séquence du domaine tête du polypeptide (i) parent d'une longueur de (x) acides aminés, à une identité en acides aminés avec la séquence correspondante de longueur (x) du polypeptide (i) parent d'au moins 80%, avantageusement d'au moins 95% et de manière tout à fait préférée d'au moins 98%. Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides aminés, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence d'acides aminés dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un résidu d'acide aminé identique est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux résidus d'acide aminé par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en acides aminés des deux séquences entre elles. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus. De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp (2) ALIGNMENT = « full » ; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers » (4) OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = « no » (6) KTUP (word size) = « default » ; (7) WINDOW LENGTH = « default » ; (8) SCORE TYPE = « percent » ; (9) TOPDIAG = « default » ; (10) PAIRGAP = « default » ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none » ; (12) MATRIX = « default » ; (13) GAP OPEN = « default » ; (14) END GAPS = « default » ; (15) GAP EXTENSION = « default » ; (16) GAP DISTANCES = « default » ; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ». Un composé adjuvant peptidique selon l'invention peut être synthétisé par des méthodes classiques de chimie de synthèse, soit des synthèses chimiques homogènes en solution ou en phase solide. A titre illustratif, l'homme de l'art peut utiliser les techniques de synthèse polypeptide en solution décrite par HOUBEN WEIL (1974). Un composé adjuvant peptidique selon l'invention peut être également synthétisé chimiquement en phase liquide ou solide par des couplages successifs des différents résidus d'acides aminés (de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale en phase liquide, ou de l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale en phase solide) . L'homme de l'art peut notamment utiliser la technique de synthèse peptidique en phase solide décrite par Merrifield (1965a ; 1965b). Selon un autre aspect, un composé adjuvant peptidique selon l'invention peut être synthétisé par recombinaison génétique, par exemple selon un procédé de production comprenant les étapes suivantes : (a) préparer un vecteur d'expression dans lequel a été inséré un acide nucléique codant le composé adjuvant peptidique de l'invention, ledit vecteur comprenant également les séquences régulatrices nécessaires à l'expression dudit acide nucléique dans une cellule hôte choisie ; (b) transfecter une cellule hôte avec le vecteur recombinant obtenu à l'étape (a) ; ( c) cultiver la cellule hôte transfectée à l'étape b) dans un milieu de culture approprié ; (d) récupérer le surnageant de culture des cellules transfectées ou le lysat cellulaire desdites cellules, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; et (e) séparer ou purifier, à partir dudit milieu de culture, ou à partir du culot de lysat cellulaire, le composé adjuvant peptidique recombinant de l'invention. Pour produire un composé adjuvant peptidique recombinant de l'invention, l'homme de l'art peut notamment se référer aux techniques de préparation des vecteurs recombinants, de transfection cellulaire et de purification qui sont décrites dans les exemples. De manière tout à fait préférée, on utilise un vecteur de type baculovirus pour infecter des cellules Sf9, comme cela est décrit dans les exemples. Pour purifier un composé peptidique adjuvant de l'immunité selon l'invention qui a été produit par des cellules hôtes transfectées ou infectées par un vecteur recombinant codant ledit composé adjuvant peptidique, l'homme de l'art peut avantageusement mettre en csuvre des techniques de purification décrites par iVlolinier-Frenkel (2002), par
Karayan et al. (1994) ou par Novelli et al. (1991). Comme cela a déjà été mentionné précédemment dans la présente description, du fait que les cellules dendritiques matures favorisent le développement des réponses immunitaires, les réponses immunitaires à médiation cellulaire l'un quelconque des composés peptidiques adjuvant selon l'invention peut être utilisé en association avec un antigène à rencontre duquel une réponse immunitaire est recherchée. Un composé adjuvant peptidique selon l'invention peut être associé, en vue d'induire une réponse immunitaire, chez l'homme ou l'animal, indifféremment avec un antigène peptidique ou avec un antigène du type carbohydrate, par exemple un antigène du type carbohydrate identique ou similaire, du point de vue de sa reconnaissance antigénique, à un antigène spécifiquement exprimé par des cellules tumorales. Par définition, le composé adjuvant peptidique selon l'invention peut être associé avec tout type d'antigène à encontre duquel une réponse immunitaire est recherchée. Selon un mode de réalisation particulier, un composé adjuvant peptidique de l'invention est couplé chimiquement à un ou plusieurs antigènes à encontre desquels une réponse immunitaire est recherchée, sous la forme d'un conjugué peptide adjuvant/peptide antigène ou encore sous la forme d'un conjugué peptide adjuvant- antigène carbohydrate. Ainsi, la présente invention a également pour objet un conjugué immunogène constitué d'un composé peptidique adjuvant selon l'invention, qui est lié de manière covalente à un antigène à rencontre duquel une réponse immunitaire est recherchée. L'invention a également pour objet une composition adjuvante de l'immunité comprenant un composé adjuvant peptidique tel que défini ci- dessus dans la présente description, en association avec au moins un excipient physiologiquement compatible. Dans un mode de réalisation particulier du conjugué immunogène de l'invention, le composé adjuvant et l'antigène sont liés directement entre eux de manière covalente, par exemple via une liaison peptidique- CO-NH-. Cependant, afin d'introduire une certaine flexibilité dans la structure du conjugué immunogène, et notamment de permettre une mobilité dans l'espace du composé adjuvant et de l'antigène, l'un par rapport à l'autre au sein du conjugué immunogène, on préfère un conjugué peptidique dans lequel le composé adjuvant et l'antigène sont séparés l'un de l'autre, au sein dudit conjugué, par une chaîne espaceur. Selon un premier mode de réalisation préféré d'un conjugué immunogène, le composé adjuvant et l'antigène sont séparés l'un de l'autre, au sein dudit conjugué, par une chaîne espaceur choisie parmi le SMCC ou le SIAB, qui sont tous les deux des composés bifonctionnels. Le composé SIAB, décrit par Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego : Académie Press, pp 239-242), est le composé de formule (I) suivante :
Figure imgf000026_0001
(I)
Le composé SIAB comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe iodoacétate et un groupe ester Sulfo-NHS, ces groupes réagissant respectivement sur des groupes amino et sulfhydryl. Le composé SMCC, qui est décrit par Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1) : 37-46), est le composé de formule (II) suivante :
Figure imgf000026_0002
(Il) Le composé SMCC comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe ester Sulfo-NHS et un groupe maléimide, qui réagissent respectivement avec un groupe amino et un groupe sulfhydryl. Selon un second mode de réalisation préféré, le conjugué immunogène comprend une chaîne espaceur constituée d'un peptide espaceur linéaire . On choisira de préférence un peptide espaceur linéaire ayant de 3 à 30 acides aminés de longueur, avantageusement de 5 à 20 acides aminés de longueur et de manière tout à fait préférée de 7 à 15 acides aminés de longueur. Préférentiellement, le peptide espaceur linéaire est essentiellement, voire exclusivement, constitué d'acides aminés chargés positivement ou négativement à pH 7,0 afin d'accroître l'hydrophilicité globale dudit conjugué peptidique immunogène. On comprend que l'on devra éviter d'utiliser des peptides espaceurs constitués d'acides aminés hydrophobes. De manière préférentielle, le peptide espaceur est caractérisé en ce qu'il est constitué d'une chaîne de poly-(lysine ) constituée de 3 à 30 résidus lysine, avantageusement de 5 à 20 et de manière tout à fait préférée de 7 à 15 résidus lysine de longueur. Selon encore un autre mode de réalisation d'un conjugué immunogène selon l'invention, le composé adjuvant et l'antigène sont séparés l'un de l'autre, au sein dudit conjugué peptidique, par une chaîne espaceur constituée d'un peptide espaceur ramifié, de préférence une structure oligodendrimérique de poly(lysine), telle que décrite par exemple par Basak et al. (1995). Dans ce dernier mode de réalisation d'un conjugué immunogène selon l'invention, ledit conjugué peptidique peut comprendre plusieurs copies respectivement du composé adjuvant et/ou de l'antigène par molécule de conjugué, avantageusement de 2 à 8 copies du composé adjuvant et/ou de l'antigène, de préférence au plus 4 du composé adjuvant et/ou de l'antigène, par molécule de conjugué. La présente invention a encore pour objet un composé adjuvant peptidique tel que défini précédemment dans la description, pour son utilisation en tant que principe actif adjuvant d'une composition immunogène ou d'une composition vaccinale. Par « composition immunogène", on entend selon l'invention, une composition contenant un composé adjuvant peptidique tel que défini ci- dessus en association avec au moins un antigène à encontre duquel une réponse immunitaire à médiation cellulaire est recherchée, dans le but de produire des anticorps spécifiques à encontre dudit antigène. Par « composition vaccinale », on entend selon l'invention une composition contenant un composé peptidique adjuvant tel que défini ci- dessus, en association avec au moins un antigène à encontre duquel une réponse immunitaire à médiation cellulaire est recherchée en vue de prévenir ou en vue de traiter une maladie, en particulier une maladie provoquée par un agent pathogène de type viral, fongique ou bactérien ou encore une tumeur. L'invention est également relative à l'utilisation d'un composé adjuvant peptidique tel que défini ci-dessus pour la fabrication d'une composition immunogène ou vaccinale. Elle concerne aussi une composition immunogène ou une composition vaccinale comprenant un composé adjuvant peptidique tel que défini ci-dessus, en association avec au moins un antigène . Dans une composition immunogène ou dans une composition vaccinale de l'invention, l'antigène peut être utilisé sous la forme d'un mélange avec le composé peptidique adjuvant de l'invention. Selon un autre mode de réalisation, le composé adjuvant peptidique et l'antigène inclus dans une composition vaccinale ou dans une composition immunogène de l'invention se présentent sous la forme d'un conjugué immunogène tel que défini ci-dessus. Dans les exemples, on a montré que des cellules dendritiques stimulées avec un composé adjuvant peptidique selon l'invention et chargé avec un antigène déterminé, en l'occurrence le peptide GP33 du LGMVS était capable d'induire, che∑ l'animal, une réponse immunitaire cytotoxique par stimulation de cellules T CD8+ spécifiques de l'antigène GP33. On a montré en particulier que des cellules dendritiques matures stimulées par un composé adjuvant peptidique selon l'invention et présentant l'antigène d'intérêt aux cellules du système immunitaire étaient capables d'induire une réponse immunitaire de type cytotoxique provoquant le rejet de splénocytes présentant à leur surface l'antigène d'intérêt. Dans une composition immunogène ou dans une composition vaccinale selon l'invention, tout type d'antigène peut être utilisé puisque, dans tous les cas, et quel que soit l'antigène ou les antigènes, le peptide adéquat de l'invention exercera son activité d'activation des cellules dendritiques. De préférence, une composition immunogène ou une composition vaccinale selon l'invention comprend une quantité allant de 10 nanogrammes à 1 milligramme d'un composé adjuvant peptidique tel que défini ci-dessus, de préférence de 100 nanogrammes à 100 microgrammes dudit composé peptidique adjuvant, et de manière tout à fait préférée de 100 nanogrammes à 10 microgrammes dudit composé peptidique adjuvant. Parmi les antigènes susceptibles d'être inclus dans une composition immunogène ou dans une composition vaccinale selon l'invention, en association avec un composé adjuvant peptidique, on peut citer les antigènes bactériens dérivés notamment de B. pertussis,
Leptospira pomona, S. paratyphi AB, C. diphtheriae, C. tetani, C. botulinum, C. perfringens, C. feseri, B. anthracis, P. pestis, P. multociάa,
V. cholerea, Neisseria meningitidis, N. gonorrheae, Hemophilus influenzae, Treponema pollidum. Les antigènes peuvent être également des antigènes viraux tels que des antigènes dérivés des virus poliovirus, adénovirus, virus du para influen∑a, virus respiratoires syncytiaux, virus de l'influenza, virus de l'encéphalαmyélitis, virus de la maladie de Newcastle, pox virus, virus
Les antigènes peuvent également consister en des antigènes provenant d'un allergène quelconque, tels que des allergènes dérivés d'extraits de pollen de fleur ou d'herbe, des allergènes purifiés à partir de poussière domestique, etc.. Parmi les antigènes viraux d'intérêt, on cite aussi les antigènes dérivés des protéines des papillomavirus, notamment des papillomavirus humains, et en particulier les protéines L1 , E6 et E7, notamment des souches HPV-16. D'autres antigènes viraux illustratifs consistent en des antigènes dérivés des protéines du virus de l'immunodéficience humaine (VIH), en particulier du VIH-1, et de manière tout à fait préférée dérivés de la protéine ENV du virus VIH-1. D'autres antigènes d'intérêt susceptibles d'être inclus dans une composition immunogène ou dans une composition vaccinale selon l'invention consistent en des antigènes tumoraux, c'est-à-dire des antigènes exprimés par des cellules cancéreuses, que ces antigènes soient de nature peptidique ou de nature carbohydrate. Comme on l'a compris, les compositions immunogènes ou les compositions vaccinales selon l'invention trouvent leur emploi notamment dans le traitement, tant curatif que préventif, des cancers, notamment des cancers induits par des virus comme par exemple l'ATL(acute T leukemia) provoqués par le virus HTLV1, ou le cancer du col utérin provoqué par les papillomavirus, ou encore le lymphome de burkitt ou le sarcome de Kaposi provoqué par des virus de la famille Herpès, respectivement Epstein-barr (EBV) et le HHV8, ainsi que dans le traitement du SIDA ou encore pour prévenir ou traiter des réactions inflammatoires allergiques. Selon encore un autre aspect, l'invention a encore pour objet une méthode pour immuniser un homme ou un animal, plus spécifiquement un mammifère, à encontre d'un antigène d'intérêt , ladite méthode comprenant une étape au cours de laquelle on administre à l'homme ou à l'animal une composition immunogène ou une composition vaccinale telle que définie ci-dessus. On administre à l'homme ou à l'animal, par exemple aux patients, une composition immunogène ou une composition vaccinale selon l'invention qui se présente sous une forme adaptée à l'administration systémique ou mucosale, par exemple par voie intranasale, en quantité suffisante pour être efficace sur le plan thérapeutique, à un sujet ayant besoin d'un tel traitement. Une composition immunogène ou une composition vaccinale selon l'invention se présente sous forme solide ou liquide, en particulier sous la forme d'une émulsion huile-dans-l'eau dans lequel l'antigène ou les antigènes d'intérêt est(sont) dispersés. Pour formuler une composition immunogène ou une composition vaccinale selon l'invention sous la forme d'une émulsion huile-dans-l'eau, l'homme de l'art pourra utiliser une émulsion du type SPT telle que décrite à la page 147 de l'ouvrage « Vaccin Design, The subunit and adjuvant approach », [ M.POWELL, M. Newman Ed., Plénum Press, (1995)] ainsi que l'émulsion MF59 décrite à la page 183 du même ouvrage. Par « excipient physiologiquement compatible » au sens de l'invention, on entend un agent de charge liquide ou solide, un diluant ou tout autre substance non-physiologiquement active et présentant une grande inoccuité pour le patient qui peut être utilisée pour l'administration systémique ou locale, par exemple sur les muqueuses, d'une composition immunogène ou une composition vaccinale selon l'invention. De tels excipients physiologiquement compatibles sont décrits en détail notamment dans la 4lème édition « 2002 » de la Pharmacopée
Européenne ainsi que dans l'édition USP 26-NF21 publiée en Novembre 2002. Selon encore un autre aspect, l'invention est également relative à un procédé pour la maturation in vitro des cellules dendritiques immatures humaines ou animales dans lequel des cellules dendritiques immatures sont stimulées avec un composé adjuvant peptidique tel que défini dans la présente description. L'invention a donc encore pour objet un procédé pour la maturation in vitro des cellules dendritiques immatures humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) cultiver in vitro une population de cellules enrichies en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, dans un milieu de culture approprié ; (b) incuber les cellules cultivées à l'étape (a) avec un composant adjuvant peptidique ou encore avec une composition adjuvante telle que définie dans la présente description, pendant une durée suffisante à induire la maturation des cellules dendritiques. La population de cellules enrichies en cellules dendritiques immatures humaines ou animales utilisée à l'étape a) du procédé peut être obtenue à partir d'un échantillon de moelle osseuse ou encore un échantillon de sang humain ou animal, selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, comme par exemple la technique décrite par Mayordomo et al. (1995). Pour purifier et cultiver des cellules dendritiques, l'homme de l'art peut également se référer à la technique décrite par Steinam et Young (1991). L'homme de l'art peut également se référer aux nombreuses références bibliographiques concernant la purification et la culture des cellules dendritiques qui sont décrites dans la demande PCT publiée sous le n°WO 98/23728, et plus spécifiquement aux pages 1 à 3. Pour obtenir une population de cellules enrichies en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, l'homme de l'art peut également se référer à la technique décrite dans les exemples. A l'étape b) du procédé de maturation ci-dessus, les cellules dendritiques immatures sont incubées avec une concentration finale du composé adjuvant peptidique allant de 10 nanogrammes par ml à 1 μg/ml, de préférence allant de 50 nanogrammes par ml à 1 μg/ml. A l'étape b) du procédé de maturation, les cellules dendritiques immatures sont incubées pendant une durée allant de 1 h à 48 heures, avec la concentration finale sélectionnée du composé adjuvant peptidique. L'invention est également relative à une population de cellules enrichies en cellules dendritiques matures chargées avec un composé adjuvant ou avec une composition adjuvante telles que définies ci- dessus. Un composé adjuvant selon l'invention peut donc être détecté, par exemple à l'aide d'un anticorps dirigé spécifiquement contre ce composé adjuvant, indifféremment dans le cytoplasme ou à la surface membranaire de ces cellules dendritiques qui sont susceptibles d'être obtenues par le procédé de maturation tel que défini ci-dessus. Les cellules dendritiques matures obtenues selon le procédé de maturation ci-dessus sont caractérisées en ce qu'elles expriment simultanément les molécules de classes I et de classe II du CMH ainsi que les marqueurs spécifiques des cellules dendritiques matures CD40 CD80 et CD86. La présente invention a aussi pour objet une composition cellulaire adjuvante de l'immunité, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une population de cellules dendritiques matures chargées (i) avec un composé adjuvant ou avec une composition adjuvante telles que définies ci-dessus, et (ii) chargées avec l'antigène d'intérêt susceptibles d'être obtenues par le procédé de maturation ci-dessus. De préférence, une dose de composition cellulaire adjuvante de l'immunité telle que définie ci-dessus, pour l'administration aux patients, comprend un nombre de cellules dendritiques matures allant de 106 à
109 cellules dendritiques matures syngéniques, avantageusement de 107 à 109 cellules syngéniques. Dans une composition cellulaire adjuvante selon l'invention, les cellules dendritiques matures sont de préférence en suspension dans un milieu liquide salin nécessaire à leur survie pendant quelques heures, de préférence au moins trois heures. De manière tout à fait préférée, les cellules dendritiques matures sont en suspension dans un milieu de culture approprié comprenant la totalité des éléments nutritifs permettant leur survie à long terme, par exemple pendant plusieurs jours, de préférence pendant au moins 2 jours. L'invention est également relative à un procédé pour fabriquer une composition cellulaire immunogène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : ' a) cultiver in vitro une population de cellules enrichies en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, dans un milieu de culture approprié; b) incuber les cellules cultivées à l'étape a) avec un composé peptidique adjuvant ou encore avec une composition adjuvante telle que défini© précédemment, pendant une durée suffisante pour induire la maturation des cellules dendritiques ; c) ajouter aux cellules cultivées à l'étape b) au moins un antigène d'intérêt à rencontre duquel une réponse immunitaire est recherchés. Selon le procédé ci-dessus, l'étape c) d'incubation des cellules dendritiques avec au moins un antigène d'intérêt peut indifférement être simultané à l'étape b) dans laquelle le composé peptidique adjuvant est incubé avec les cellules, ou au contraire être postérieur à l'étape b). Toutefois, et de manière tout à fait préférée, les étapes b) et c) sont réalisées de manière simultanée. L'invention a également pour objet un procédé pour fabriquer une composition cellulaire immunogène caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver in vitro une population de cellules enrichies en cellules dendritiques humaines ou animales dans un milieu de culture approprié; b) incuber les cellules cultivées à l'étape a) avec un conjugué immunogène tel que défini précédemment, pendant une durée suffisante pour induire la maturation des cellules dendritiques. Dans les procédés pour fabriquer une composition cellulaire immunogène ci-dessus, la concentration finale ajoutée aux cellules dendritiques est variable selon la nature et le poids moléculaire de l'antigène d'intérêt considéré. Par exemple, le peptide GP33 du LCMV est ajouté aux cellules dendritiques. Pour chaque antigène d'intérêt considéré, l'homme de l'art pourra adapter la concentration finale qui doit être ajoutée à l'étape c) (premier procédé), ou la concentration finale de conjugués immunogènes qui doit être ajoutée à l'étape b) du procédé (second procédé), grâce à ses connaissances techniques générales concernant le chargement de cellules dendritiques avec un antigène d'intérêt. Les conditions générales des procédés de fabrication d'une composition cellulaire immunogène ci-dessus sont par ailleurs identiques à celles utilisées pour le procédé de maturation de cellules dendritiques qui a été décrit précédemment. L'homme de l'art peut également se référer aux exemples du présent brevet dans lesquels sont donnés tous les détails de préparation d'une composition cellulaire immunogène selon l'invention. L'invention a également pour objet une composition cellulaire immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend une population de cellules dendritiques matures chargées avec l'antigène d'intérêt obtenu par les procédés pour sa fabrication qui sont décrits ci-dessus. Les cellules dendritiques matures chargées avec l'antigène d'intérêt sont caractérisées en ce qu'elles expriment les molécules de classe I et de classe II du CMH, ainsi que les marqueurs spécifiques des cellules dendritiques matures CD40, CD80 et CD86. De plus, ces cellules présentent à leur surface des fragments peptidiques de l'antigène d'intérêt à encontre duquel une réponse immunitaire est recherchée L'invention est également relative à une méthode pour immuniser un organisme humain ou animal à encontre d'un antigène d'intérêt, laquelle méthode comprend une étape au cours de laquelle on administre à l'individu une composition cellulaire adjuvante telle que définie ci-dessus, préalablement, simultanément, ou postérieurement à une étape d'administration de l'antigène d'intérêt. L'invention a également pour objet une méthode pour immuniser un organisme humain ou animal à encontre d'un antigène d'intérêt, laquelle méthode comprend une étape au cours de laquelle on administre à l'individu une composition cellulaire immunogène selon l'invention. La présente invention est en outre illustrée par les exemples suivants :
E EϋPLES :
A. MATERIEL ET ϋETHQDES A.1 Préparation des adénovirus (Ad) et des protéines de capside d'adénovirus (Ad), y compris des composés peptidiques adjuvants selon l'invention. L'adénovirus Ad5E1 est un adénovirus de sérotype 5 défectif pour la réplicatioπ et délété à la fois dans les régions précoces E1 et E3. L'adénovirus Ad5 E1 ° porte des protéines fibres de type sauvage (WT) (iVlolinier-Frenkel et al., 2002). L'adénovirus Ad5E1°Δ knob, mutant de delétion pour la protéine fibre, est dérivé de l'adénovirus Ad5E1° par l'insertion d'un codon stop
"opale » dans le gène codant la fibre, en aval du signal de trimérisalion extrinsèque contenu dans la tige de la fibre (Magnusson et al., 2001 ; Hong et al., 2003). La fibre résultante est dépourvue de la totalité du domaine tête (« knobless ») et contient seulement le domaine queue ainsi que les sept motifs répétés de l'extrémité N-terminale de la tige, c'est-à-dire les résidus d'acides aminés 1 à 157 de la protéine fibre. La figure 1 présente la structure schématique des fibres des adénovirus Ad5E1° et Ad5E1°Δ knob. Les virions Ad5E1° et Ad5E1°Δ knob ont été isolés par ultracentrifugation isopycnique dans un gradient continu de chlorure de césium (Molinier-Frankel et al., 2002). Les protéines de capside Hexon (désignés de manière abrégée « Hx ») et les capsomères de penton (désignés de manière abrégée « Pn », pour la combinaison penton base + fibre ) ont été isolés à partir de cellules HeLa infectées avec l'adénovirus de sérotype 5 sauvage WT Ad5. Les protéines penton-base (aussi désignées « Pb »), fibre (aussi désignées « Fi ») et domaine tête de la fibre de l'adénovirus sauvage de sérotype 5 ont été isolées sous la forme de protéines recombinantes à partir de cellules Sf9 infectées par un baculovirus. On a également analysé quatre protéines fibres de l'adénovirus Ad5 mutées, portant des délétions de longueur variable dans le domaine tête (Santis et al., 1999), respectivement les protéines mutantes désignées FÎΔ402-480, FiΔHI, FiΔEF et FÎΔLT485 - 486 sur la figure 6B. Ces protéines fibres mutées ont été produites sous la forme de protéines recombinantes dans les cellules Sf9. Les protéines d'adénovirus ont été purifiées selon un protocole décrit par Molinier-Frenkel et al. (2002), Karayan et al. (1994) et Novelli et al. (1991). Brièvement, les protéines d'adénovirus ont été purifiées par un procédé comprenant les trois étapes suivantes : (i) précipitation au sulfate d'ammonium, (ii) chromatographie liquide haute performance à échange d'anions et (iii) étape de concentration-ultrafiltration à l'aide de membranes de concentration ayant un seuil de coupure de 100 kDa. Les échantillons de protéines ont été analysés par les techniques classiques d'électrophorèse sur gel de SDS 1 %-polyacrylarnide (Molinier-Frenkel et al., 2002) et d'immuno-empreinîe (Karayan et al., 1994). On a testé la présence possible d'endotoxines dans les préparations de protéine et d'adénovirus, en utilisant le test de lysat d'amoebocyte du Limulus palyphemus (E-TOXATE® ; sigma), en utilisant comme témoin standard le lipopolysaccharide (LPS) de E coli du sérotype 055 : B5. La concentration d'endotoxine dans les différents lots de protéines n'a jamais dépassé 30 pg/ml aux doses utilisées pour la stimulation des cellules dendritiques. A cette concentation, les échantillons de protéine Hx n'ont jamais induit la maturation des cellules dendritiques à un niveau supérieur au bruit de fond des cellules dendritiques non stimulées (voir figure 2). Les virions d'adénovirus purifiés sur gradient de CsCI étaient totalement exempts de contamination détectable par l'endotoxine.
A.2- Obtention et culture des cellules dendritiques. Le procédé a été adapté à partir de la technique décrite par Mayordomo et al. (1995). Des cellules de moelle osseuse de souris C57BU6 (H2b), (Harlan, Gannat, France) délétées en lymphocytes ont été cultivées pendant une nuit dans un milieu de culture complet (RPMI 1640 additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FCS), 2 mM L- glutamine, 50 μiWl-mercaptoéthanol, 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine ). Les cellules non adhérentes ont été prélevées et remises en suspension dans du milieu de culture complet en présence de 2000 U/ml de GM-CSF recombinant (rGM-CSF, R & D System, Mineapolis, Minnesota) et 100 U/ml d'IL4 recombinante (rlL4, R & D System). Le milieu de culture a été remplacé au jour 4. Au jour 6, des fractions aliquotes des cellules non adhérentes ont été remises en suspension à la densité de 3x106/ml dans du tampon PBS contenant 1% de FCS. Les cellules ont ensuite été incubées pendant une heure à 37°C (i) sans (cellules dendritiques non stimulées ; NS-DG), ou (ii) avec des composants de capside d'AdS, ou (iii) avec des fractions chromatographiques correspondantes obtenues à partir des extraits de cellules Sf9 infectées avec un vecteur de baculovirus vide (cellules dendritiques stimulées par le vecteur vide ; MS-DC), comme cela est indiqué dans les légendes des figures. Après une heure d'incubation, la concentration cellulaire a été ajustée à 3 x 105 cellules par ml avec du milieu complet additionné de GM-CSF. Des cellules témoins ont été incubées avec 1 μg/ml de LPS de Eco// (sigma). Au Jour 8, les cellules ont été récupérées et analysées par des techniques de cytométrie de flux, de réactions mixtes lymphocytaires (MLRs) et des techniques d'immunisation. Au Jour 8, les surnageants de culture ont été recueillis. Pour les expériences décrites et illustrées dans la figure 4A, les cellules dendritiques ont été purifiées en utilisant des billes magnétiques conjuguées avec un anticorps monoclonal anti-CD11c de souris (Miltenyi Biotech). Les cellules dendritiques ont été lavées dans du tampon PBS contenant 1 % de FCS. Après incubation avec un anticorps anti- FCII/IIIR(2.4G2 ; Pharmingen), les cellules ont été incubées avec des combinaisons variées des anticorps monoclonaux suivants (tous commercialisés par Pharmingen) : anti-l-Ab (AF6-120.1) et anti- CD40(3/23), conjugués à PE anti-CD11c (HL3) et anti-CD80(16-10A1 ) conjugués à FITC, anti-H2-Db(28-8-6) et anti-CD86(GL1) biotinylés + streptavidine-PerCP (Becton Dickinson). On a aussi utilisé les anticorps monoclonaux de souris anti-fibre-queue (4D2.5 ; HONG et al., 1997). Pour la coloration du récepteur CAR, des cellules dendritiques au Jour 6, des cellules de la lignée CHO (ATCC N°CCL-61) et des cellules de la lignée Hela CCL-2 ATCc CCI2 et CHO ont été marquées avec un anticorps monoclonal provenant d'ascite E1.1 anti-CAR, ainsi qu'avec un ascite témoin. Une contre coloration a été réalisée en utilisant des IgG anti-souris de rats biotinylé et un conjugué streptavidine-PE. Les analyses en cytométrie de flux ont été réalisées sur un appareil FÂCSCalibur (Becton Dickinson).
A.S Tggfe fonckionns s in rite® Pour les réactions mixtes lymphocytaires (MLRs), des cellules dendritiques au Jour 8 ont été distribuées à des doses croissantes dans des puits de culture et co-cultivées pendant 4 jours avec des fractions aiiquotes de splénocytes purifiés CD4+ (2 x 105 cellules/puits) allogéniques (Balb/c, H2d). La prolifération des cellules T CD4+ a été mesurée par incorporation de 3H-thymidine (1μCi/puits) pendant les dernières 18 heures de l'étape de co-culture. Pour la mesure de la production d'IL12 et de TNFσ, les surnageants de culture des cellules dendritiques au Jour 8 ont été testés en utilisant les kits ELISA IL12p70 et TNFα (Pharmingen).
A.4 Peptides Le peptide 33-41 de la glycoprotéine du LCMV (KAVYNFATM), et le peptide 366-374 de la nucléoprotéine du virus de l'influenza (ASNENMETM), qui sont désignés de manière abrégée respectivement GP33 et NP366, sont commercialisés par la Société NEOSYSTEM (Strasbourg, France).
A.5 Essais d'immunisation et tests de rejet des splénocytes marqués au CFSE. Des souris C57BL/6 ont été immunisées de manière sous-cutanée (s.c.) dans le flanc avec 2,5x105 cellules dendritiques matures en présence des différents composants de capside de l'adénovirus puis chargées avec GP33 ou NP366 (lO^M). Dix jours après, les souris ont reçu une injection intraveineuse de 3x107splénocytes syngéniques marqués avec le colorant fluorescent 5-6-carboxyfluorescein diacétate succinimidyl ester (CFSE ; Molecular Probes) comme décrit par OEHEN et al. (1997). Le pourcentage de cellules donneuses CFSE+ au sein des splénocytes ou des lymphocytes du sang périphérique (PBLs) receveur a été déterminé en utilisant une analyse de cytométrie de flux (FACS). Le rejet des cellules du donneur a été calculé en utilisant la formule suivante : ratio du % de cellules CFSE+ dans les souris immunisées/ % de cellules CFSE+ chez les souris naïves] x 100.
A.8 T©sfe ELlSPOT-IFt . Des microplaques de nitrocellulose (Millipore) ont été recouvertes avec un anticorps de rat anti-IFNy de souris (R4-6A2 ; Pharmingen), puis les puits ont été lavés et saturés avec du milieu complet. Des fractions aiiquotes de splénocytes fraîchement isolés (106 cellules/puits), ou de lymphocytes du sang périphérique (PBLs) fraîchement isolés (2 x 105 cellules/puits), en triplicats, ont été ajoutés aux puits de culture dans du milieu complet contenant 30 U/ml de IL2 recombinant humaine (hrlL2, Boehringer) et 10"6 M des peptides GP33 ou NP366. Après une culture de 20 heures à 37°C, les cellules sécrétant de l'IFN^y forment des spots (SFC). Les cellules sont comptées selon la technique décrite par Molinier-Frenkel et al. (2002). Les valeurs obtenues avec le peptide NP366 ont été soustraites de la moyenne des valeurs des tests en triplicats obtenus avec le peptide GP33.
A.7 Tests de cytotoxicité Des splénocytes de souris immunisées avec les cellules dendritiques ont été cultivés pendant 4 jours avec 10"6 M de peptide
GP33. Ces cellules ont ensuite été testées en duplicat à différentes quantités de cellules effectrices pour une quantité fixe de cellules cibles
EL-4 marquées au 51Cr (10-4 μCi par cellule) qui ont été incubées avec le peptide GP33 ou NP366. Après une culture de cinq heures à 37°C, les surnageants de culture ont été recueillis et la radioactivité a été mesurée à l'aide d'un appareil du type Top-Count (Packard Instruments). Dans les échantillons témoins, les cellules EL4 cibles ont été incubées avec le milieu seul afin de déterminer le niveau de relarguage spontané de 51Cr, et avec 2% de bromure d'alkyltriméthylammonium (Sigma) afin de déterminer le relarguage total de 51Cr.
B. RESULTATS
EXEMPLE 1 : Effet des composants de capside isolés d® l'adénovirus de sérotype 5 (Ad5) sur le phénotwse des cellules cϋendriUoiHΦS. Des cellules dendritiques immatures ont été incubées avec les capsomères penton (Pn) ou hexon (Hx) qui ont été purifiées à partir de cellules HeLa infectées avec Ad5. La majorité des cellules dendritiques stimulées avec Hx présentait un faible niveau de phénotype mature, comparé aux cellules dendritiques non stimulées (NS-DC), avec une faible expression des molécules de classe II du CivIH, et les molécules CD40, CD80 (B7.1) et CD86 (B.7.2) , comme cela est montré sur la figure 2A. Au contraire, les cellules dendritiques stimulées avec le penton (Pn) ont exprimé massivement un phénotype mature , similaire au phénotype observé pour les cellules dendritiques stimulées par le LPS, avec un haut niveau d'expression des différents marqueurs, comme cela est illustré sur la figure 2A. Du fait que le capsomère Pn d'adénovirus est constitué de deux entités structurelles, respectivement le penton base (Pb) et la fibre (Fi), les expériences suivantes ont été mises au point afin de déterminer laquelle de ces deux protéines constitutives, respectivement Pb ou Fi était responsable de la maturation des cellules dendritiques. Les cellules dendritiques ont été ensuite stimulées avec des protéines recombinantes Pb ou Fi isolées à partir des extraits de cellules d'insectes Sf9 infectées. Les protéines recombinantes complètes Pn et Hx ont été utilisées en tant qu'échantillons témoins. Les résultats obtenus indiquent que la protéine Fi suffit à reproduire la totalité de l'effet stimulant produit par les capsomères Pn, alors que la protéine Pb seule n'induit aucun effet détectable sur la maturation des cellules dendritiques, comme cela est illustré sur la figure
E3CEMPLE 2 : Rôle du domaine tête de la fibr© dans la maturation des cellules dendritiques par l'adénovirus et par la protéine fibre. Comme cela est mentionné ci-dessus, la fibre d'adénovirus comprend trois domaine structurels, respectivement, de son extrémité N- terminale vers son extrémité C-terminale, la queue (« tail ») la tige (« schaft ») et la tête (« knob »). Le domaine tête a été exprimé sous la forme d'une protéine recombinante, selon les techniques décrites par NOVELLI et al. (1991 ) et par Hong et al. (1997). Les cellules dendritiques qui ont été incubées avec le domaine tête de la fibre ont exprimées un phénotype mature, similaire à celui observé avec les cellules dendritiques stimulées avec la protéine fibre Fi complète, comme cela illustré sur la figure 3A. Les cellules dendritiques stimulées avec le domaine tête de la fibre sont capables d'induire fortement la prolifération de cellules T CD4+ allogéniques dans un essai de réaction lymphocytaire mixte (MLR) comme cela est illustré sur la figure 3B. De plus, le degré de maturation des cellules dendritiques varie en fonction des concentrations croissantes de protéine du domaine tête de la fibre (figure 3B). A la dose maximale de protéines de domaine tête utilisée (0,5 μg), les cellules dendritiques stimulées par le domaine tête stimulant des cellules T CD44 allogéniques plus efficacement que les cellules dendritiques témoins non stimulées (NS) ou les cellules dendritiques stimulées avec la protéine Hx. Cependant, aucun effet détectable n'a été obtenu avec la dose de 0,02 μg de protéine tête. De manière intéressante, la valeur de réaction lymphocytaire mixte (MLR) pour la dose de 0,2 μg de protéine tête était similaire à la valeur obtenue avec une dose de 1 μg de protéine fibre. Ce résultat est compatible avec le fait que la quantité de protéine de tête présente dans un échantillon de 0,2μg de protéine tête correspond grossièrement à la quantité de protéine tête contenue dans un échantillon de 1μg de protéine fibre. La protéine tête a induit également la sécrétion d'IL-12 et de TNFα de manière dose-dépendante, comme cela est illustré sur la figure 3C. On a ensuite cherché à savoir si le domaine tête était capable de cibler directement les cellules dendritiques et d'induire leur maturation, sans la participation de cellules intermédiaires. Dans ce but, des cellules CD11c+ ont été purifiées en utilisant des billes magnétiques recouvertes d'anticorps anti-CD11c, les cellules CD11c+ purifiées ayant été utilisées pour des tests de maturation. Bien que les cellules dendritiques non stimulées soient capables d'augmenter l'expression des molécules du CMH et des molécules eo-stimulatrices, les cellules dendritiques stimulées avec le domaine tête expriment un phénotype significativement plus mature que les cellules témoins (figure 3A). De plus, on a montré que la protéine Fi recombinanle était capable de se fixer sur les cellules dendritiques immatures, avec 63% de cellules positives au jour 6 de culture (figure 3B). Dans cette expérience, la protéine Fi liée aux cellules a été détectée en utilisant un anticorps monoclonal anti-queue, ce qui implique que l'épitope contenu dans la queue était accessible, et ce qui suggère que attachement de la protéine Fi à la surface cellulaire s'est réalisée via le domaine tête. Ces résultats suggèrent fortement que les cellules dendritiques constituent les cibles directes du domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus. Afin de déterminer si l'effet du virion Ad5 sur l'activation des cellules dendritiques était aussi directement réalisé par l'intermédiaire du domaine tête de la fibre, on a réalisé des expériences comparatives en utilisant (ii) le vecteur Ad5E1°, un vecteur Ad5 portant des projections de fibre Fi sauvage (WT) ou (ii) le vecteur Ad5E1 °Δ knob, un vecteur Ad5 dépourvu du domaine tête. Lors de l'incubation avec le vecteur Ad5E1 °, on a observé une augmentation de l'expression des marqueurs de maturation des cellules dendritiques (figure 3C), comme cela était attendu au vu des observations antérieures de Hirsho itz et al. (2000) et de Morelli et al. (2000). En utilisant des doses identiques des particules du vecteur Ad5E1°Δ knob, on a montré que les cellules dendritiques exprimaient un phénotype significativement moins mature qu'après incubation avec le vecteur Ad5E1° Ces résultats confirment que le domaine tête de la fibre est le facteur stimulant commun de tous les composants viraux actifs, et que le domaine tête porte la majorité des déterminants responsables de la stimulation des cellules dendritiques murines observées avec les virions Ad5, le capsomère complet Pn, la protéine fibre complète, et la protéine recombinante du domaine tête de la fibre isolée.
EXEMPLE 3 : Absence de fixation du domaine tête de la protéine fibre d'adénovirus au récepteur CAR. Dans la littérature, on a largement montré que les cellules dendritiques n'expriment pas le récepteur CAR. Cependant, on a analysé, par cytométrie de flux (FACS) l'expression de cette protéine cruciale pour la fixation du domaine tête sur les cellules dendritiques différenciées, dans les conditions de culture utilisées dans le présent travail. On a utilisé, comme témoin positif, des cellules HeLa qui sont connues pour exprimer environ de 10.000 à 30.000 molécules CAR cellule, et des cellules de la lignée CHO en tant que témoin négatif. On n'a pu détecter aucune expression de CAR au-dessus du bruit de fond des ascites témoins sur les cellules dendritiques immatures recueillies avant stimulation, en dépit d'une coloration hautement spécifique des cellules HeLa, comme cela est illustré sur la figure 5A. On a réalisé des tests afin de déterminer si le mécanisme de stimulation des cellules dendritiques par le domaine tête impliquait une pénétration effective de l'adénovirus et une expression de ce gène. On a utilisé un vecteur adénoviral de sérotype 5 codant une protéine « Enhanced Green Fluorescent Protein » (EGFP) à deux valeurs d'indice d'infection (MOI) 10.000 et 30.000. Comme cela est illustré sur la figure 4C, un indice MOI de 10 000 particules virales par cellule induit en effet une maturation efficace des cellules dendritiques. Cependant, une expression significative de la protéine fluorescente EGFP par les cellules dendritiques n'a été observée qu' à la dose de 30 000 particules par cellule (figure 4C) ce qui indique un faible degré de permissivité à l'infection , par l'adénovirus des cellules dentritiques.
EXEMPLE 4- Cartographie de la région du domain® tête de la protéine fibre responsable û© la maturation d©s cellules dendritiques. On a testé l'induction de la maturation des cellules dendritiques avec quatre mutants de protéine fibre de l'adénovirus Ad5 portant des délétions dans le domaine tête (figures 6A et 6B). La delétion présente dans la protéine fibre recombinante Δ402-481 recouvre la boucle peptidique AB, les feuillets β B et C, la boucle peptidique CD ainsi que la partie N-terminale de la bouche peptidique DG. La protéine fibre recombinante mutée FiΔHI est seulement dépourvue de la boucle peptidique Hl. Deux autres protéines Fi mutées recombinanlss, respectivement FiΔEF et FÏΔLT485-486, portent des délétions dans la région courte du double feuillet β anti-parallèle EF (FiΔEF), ou une delétion des deux résidus d'acides aminés I485 et T486 qui forment le feuillet βF (FÎΔLT485-486) (voir KJrky et al., 2000 et Xia et al 1993). Les protéines Fi mutées FiΔEF et FiΔLT 485-486 se présentent sous la forme de fibres trimériques, alors que les protéine Fi mutées FÎΔ402-481 et ΔHi sont déficientes pour la trimérisation de la fibre (voir Santis ét al. , 1999). On a comparé l'activité de maturation des cellules dendritiques du domaine tête sauvage (WT) et des protéines fibres mutantes décrites dans la figure 6B, dans un test de réaction lymphocytaire mixte (MLR). On a utilisé quatre fois moins de domaine tête sauvage (WT) que de protéine fibre mutée, pour stimuler les cellules dendritiques, afin d'avoir dans tous les essais approximativement la même quantité de domaine tête. Comme cela est illustré sur la figure 6C, le mutant FiΔHi a conservé la totalité de l'activité de maturation des cellules dendritiques portées par le domaine tête sauvage, ce qui implique que la boucle peptidique Hi distale ainsi que la structure sous forme de trimère du domaine tête ne sont pas requis pour l'induction de la maturation des cellules dendritiques. Les trois autres protéines fibre mutées, respectivement FiΔ402- 481, FiΔEF et FiΔLT 485-486 n'ont pas induit de maturation des cellules dendritiques, ce qui suggère que la région en double feuillet β antiparallèle EF, et plus spécifiquement le feuillet β court F, est indispensable pour l'effet de maturation des cellules dendritiques. Pour une évaluation de l'effet in vivo, on a comparé les cellules dendritiques stimulées avec le domaine tête de la protéine fibre avec des cellules dendritiques stimulées avec d'autres composants de l'adénovirus, pour leur efficacité dans l'induction d'une réponse cellulaire T CD8+ spécifique du peptide GP33 dérivé de la glycoprotéine du LCMV, qui est restreint à l'haplotype Db. On a utilisé le colorant vital fluorescent CFSE afin de suivre facilement la présence des splénocytes transférés de manière adoptive par analyse de cytométrie de flux et par contrôle de leur élimination par les cellules T CD8+ spécifiques induites par l'immunisation par les cellules dendritiques. Comme cela est illustré sur la figure 7A, la population de cellules de rate marquées au CFSE et chargées avec le peptide GP33 a diminué en 24 heures dans le sang de toutes les souris immunisées avec les cellules dendritiques stimulées par les protéines Pb, Hx, ou la protéine du domaine tête de la fibre et mis en contact avec le peptide GP33. Cependant, un rejet des cellules significativement plus rapide a été observé chez les souris traitées avec les cellules dendritiques stimulées avec le domaine tête de la fibre, avec une vitesse de rejet similaire à celle observée chez les souris immunisées avec le peptide GP33 émulsifié dans de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA). La courbe de rejet des cellules chez les souris immunisées avec les cellules dendritiques stimulées avec le domaine tête de la fibre est chargée avec le peptide NP366 est identique à la courbe observée chez les souris immunisées avec les cellules dendritiques chargées avec le peptide GP33 et mise en présence de Pb ou Hx, ou encore non-stimulées. Comme cela est illustré sur la figure 7A, les cellules dendritiques matures avec le domaine tête de la fibre sont dix fois plus efficaces pour induire le rejet des splénocytes syngéniques que les cellules dendritiques stimulées par les autres composants d'adénovirus, comme cela est suggéré par la comparaison des effets obtenus en immunisant avec 3x104 cellules dendritiques stimulées par le domaine tête, à comparer avec les effets obtenus après l'immunisation avec 2,5 x 105 cellules dendritiques stimulées avec Hx et Pb. Comme cela est illustré sur la figure 7A, l'analyse des cellules CFSE+ dans les rates des souris receveuses, 10 jours après le transfert adoptif, ont fourni des résultats encore plus significatifs 5% des cellules CFSE+ ont persisté chez les souris immunisées avec des cellules dendritiques stimulées par le domaine tête de la fibre, alors que les cellules CFSE+ représentent respectivement 72% et 60% des cellules CFSE+ initiales chez les souris immunisées avec des cellules dendritiques stimulées respectivement par les protéines Pb et Hx. Dix jours après le transfert adoptif des splénocytes marqués au CFSE (ce qui correspond au Jour 20 après l'immunisation par les cellules dendritiques), on a déterminé le nombre de cellules T CD8+ sécrétant l'IFNy en réalisant des tests ELISPOT ex vivo. Comme cela est illustré sur la figure 7B, on n'a pas observé d'induction significative de cellules T spécifiques du peptide GP33 chez les souris immunisées avec les cellules dendritiques stimulées avec les protéines x ou Pb, puis chargées avec le peptide GP33 et, ni chez les souris immunisées avec les cellules dendritiques stimulées avec le domaine tête de la fibre et chargées avec le peptide NP366. En revanche, on a détecté un nombre significatif de cellules T sécrétant l'IFNy à la fois dans la rate et dans le sang des souris immunisées avec des cellules dendritiques maturees avec le domaine tête de la fibre et chargées avec le peptide GP33. De manière intéressante, il existe une corrélation entre l'induction de la réponse cellulaire T spécifique du peptide GP33 et le nombre de cellules dendritiques stimulées par le domaine tête de la fibre qui ont été utilisées pour l'immunisation. En particulier, on n'a détecté aucune réponse après immunisation avec 3 x 104 cellules dendritiques stimulées avec le domaine tête et chargées avec le peptide GP33, en dépit de l'observation du rejet des cellules CFSE+. On a ensuite testé l'activité cytotoxique de cellules de rate restimulées in vitro, mais on n'a observé aucune activité cytolytique spécifique chez les souris immunisées avec 3 x 104 cellules dendritiques non stimulées (NS-DC). En revanche, comme cela est illustré sur la figure 7C, on a montré que les cellules effectrices obtenues avec les cellules dendritiques stimulées par le domaine tête de la fibre étaient capables de lyser les cellules EL4 chargées avec le peptide GP33 avec une grande efficacité.
CONCLUSIONS Les résultats présentés dans les exemples montrent que l'effet du domaine têt© de la protéine fibre sur la maturation des cellules dendritiques dépend de l'intégrité et de la structure ûu feuillet β F (résidu d'acide aminé en position 485 et 486 de la protéine de fibre complète), mais ne dépend pas d'autres structures du domaine tête, telle que la bouche peptidique Hl. De plus, les résultats des exemples montrent que l'activité de maturation des cellules dendritiques induite par le domaine tête de la protéine fibre de l'adénovirus ne requiert pas que le domaine tête se présente sous la forme d'une structure trimérique. Le demandeur a également montré que bien que ces résultats ne soient pas présentés dans les exemples ci-dessus, une activité de maturation par stimulation des cellules dendritiques avec un vecteur d'adénovirus portant des fibres chimères constituées d'une partie queue et d'une partie tige de l'adénovirus de sérotype 5 et du domaine tête de l'adénovirus de sérotype 3. Ces derniers résultats montrent que les molécules de surface des cellules dendritiques sont capables de reconnaître des domaines tête d'adénovirus qui sont pourtant distants d'un point de vue phylogénétique. Ces résultats montrent aussi que l'interaction entre le domaine tête d'un adénovirus et la surface embryonnaire des cellules dendritiques implique vraisemblablement des structures peptidiques secondaires conservées, plutôt que ces résidus d'acides aminés individuels conservés dans le domaine tête.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Composé peptidique adjuvant de l'immunité consistant en : - un polypeptide (i) comprenant une séquence d'acides aminés de 30 acides aminés de longueur contenue dans le domaine « tête » de la protéine « fibre » de la capside d'un adénovirus, ladite séquence d'acides aminés comprenant l'enchaînement d'acides aminés formant la structure en double feuillet β désignée « EF » contenue dans ledit domaine « tête » ; ou - un peptide (ii) analogue dudit polypeptide (i) dont la séquence en acides aminés comporte, par rapport à la séquence dudit polypeptide (i), au moins une substitution ou au moins une delétion d'un acide aminé, ledit peptide analogue conservant ladite structure en double feuillet β désignée « EF ».
2. Composé peptidique adjuvant selon la revendication 1 , caractérisé en ce que, pour le polypeptide (i), l'enchaînement d'acides aminés formant la structure en double feuillet β désignée «E F » contenue dans le domaine « tête » de la protéine « fibre » de la capside d'un adénovirus est localisé approximativement au centre de la séquence d'acides aminés dudit polypeptide.
3. Composé peptidique adjuvant selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce la longueur du polypeptide (i) est d'au plus 195 acides aminés.
4. Composé peptidique adjuvant selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, pour le polypeptide (i), l'adénovirus est un adénovirus humain.
5. Composé peptidique adjuvant selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'adénovirus humain est choisi parmi les adénovirus des sous- groupes B ou C.
6. Composé peptidique adjuvant la revendication 4, caractérisé en ce que l'adénovirus humain est choisi dans le groupe constitué des adénovirus des sérotypes 12, 18, 31, 3, 7, 11 , 14, 16, 21, 34, 35, 1, 2, 5,
6. 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 4, 40 et 41.
7. Composé peptidique adjuvant selon la revendication 4, caractérisé en ce que le polypeptide (i) comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences suivantes : - la séquence débutant à l'acide aminé en position 463 et se terminant à l'acide aminé en position 515 de la séquence SEQ ID N° 1. - la séquence débutant à l'acide aminé en position 195 et se terminant à l'acide aminé en position 247 de la séquence SEQ ID N° 2. - la séquence débutant à l'acide aminé en position 472 et se terminant à l'acide aminé en position 535 de la séquence SEQ ID N° 3..
8. Composé peptidique adjuvant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide analogue (ii) comprend de 2 à 10 substitutions ou délétions d'un acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés dudit polypeptide (i).
9. Composé adjuvant selon l'une des revendications 1 ou 8, caractérisé en ce que le polypeptide (i) ou le peptide analogue (ii) consiste en un polypeptide cyclique.
10. Composition adjuvante de l'immunité comprenant un composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9, en association avec au moins un excipient physiologiquement compatible.
11. Conjugué immunogène constitué d'un composé peptidique adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9, lié de manière covalente à un antigène à encontre duquel une réponse immunitaire est recherchée.
12. Composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9, ou conjugué immunogène selon la revendication 11 , pour son utilisation en tant que principe actif adjuvant d'une composition immunogène ou d'une composition vaccinale.
13. Utilisation d'un composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9, ou d'un conjugué immunogène selon la revendication 11, pour la fabrication d'une composition immunogène ou vaccinale.
14. Composition immunogène comprenant un composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9, en association avec au moins un antigène.
15. Composition vaccinale comprenant un composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9, en association avec au moins un antigène.
16. Procédé pour la maturation in vitro des cellules dendritiques immatures humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver in vitro une population de cellules enrichie en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, dans un milieu de culture approprié ; b) incuber les cellules cultivées à l'étape a) avec un composant adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9 ou avec une composition adjuvante selon la revendication 10, pendant une durée suffisante pour induire la maturation des cellules dendritiques.
17. Population de cellules enrichie en cellules dendritiques matures, chargées avec un composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9 ou avec une composition adjuvante selon la revendication 10.
18. Composition cellulaire adjuvante de l'immunité caractérisée en ce qu'elle comprend une population de cellules enrichie en cellules dendritiques matures selon la revendication 17.
19. Procédé pour fabriquer une composition cellulaire immunogène, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver in vitro une population de cellules enrichie en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, dans un milieu de culture approprié ; b) incuber les cellules cultivées à l'étape a) avec un composé peptidique adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9 ou avec une composition adjuvante selon la revendication 10, pendant une durée suffisante pour induire la maturation des cellules dendritiques ; c) ajouter aux cellules cultivées à l'étape b) au moins un antigène à rencontre duquel une réponse immunitaire est recherchée.
20. Procédé pour fabriquer une composition cellulaire immunogène, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver in vitro une population de cellules enrichie en cellules dendritiques immatures humaines ou animales, dans un milieu de culture approprié ; b) incuber les cellules cultivées à l'étape a) avec un conjugué immunogène selon la revendication 11 , pendant une durée suffisante pour induire la maturation des cellules dendritiques.
21. Composition cellulaire immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend une population de cellules dendritiques matures chargées (i) avec un composé adjuvant selon l'une des revendications 1 à 9 ou avec une composition adjuvante selon la revendication 10, et (ii) chargées avec l'antigène d'intérêt.
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