WO2000055622A1 - Effet de la brefeldine a sur les cellules presentatrices d'antigenes - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method of screening for immunogenic peptides using Bréfeldine A to increase the effect of presentation of said peptides by antigen presenting cells.
- the invention also relates to the immunogenic peptides capable of being obtained by this process, in particular to the peptide PlOO, and to the use of the peptide compound PlOO for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of EBV-induced diseases, especially for the treatment and / or prevention of Burkitt's lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, and / or
- Antigens can be classified into the following two distinct categories:
- Exogenous antigens are integrated into peripheral endosomes, inside which they associate with class II molecules.
- endogenous antigens are either synthesized or released into the cytoplasm before being partially degraded in a manner which is not yet entirely defined. Then, these antigens complex with class I molecules, and are presented on the surface of the CPA.
- Brefeldine which is a specific inhibitor of the presentation of endogenous antigens.
- This substance is an antibiotic molecule inhibiting the preparation and presentation by class I molecules of the HLA system by disrupting the architecture of the tr ⁇ ns-golgi. This molecule thus inhibits the presentation of protein antigens to cytotoxic T lymphocytes.
- Nuchtern et al. (1989) Brefeldin A implicates egress from endoplasmic reticulum in class I restricted antigen presentation. Nature (Lond.) 339: 223, and Yewdell et al. (1989) Brefeldin A specifically inhibits presentation of protein antigens to cytotoxic T lymphocytes. Science 244: 1072.
- Brefeldine suppresses the expression of the invariant chain associated with class II molecules of the HLA system Jaraquameda et al. (1990) An endogenous processing pathway in vaccinia virus-infected cells for presentation of cytoplasmic antigens to class II-restricted T cells. J. Exp. Med.
- the present invention offers a significant technological improvement both in the field of vaccine research (method of screening for immunogenic peptides) and in the field of immunotherapy, in particular in the field of anti-tumor cell therapy.
- This screening process has been implemented in particular in order to search for minimum antigenic motifs making it possible to stimulate all of the immune defenses directed against the Epstein-Barr virus.
- EBV ubiquitous virus of the Herpesvirus family
- EBV enters a latency cycle.
- the virus has co-evolved in humans for millions of years, so more than 95% of the world's population harbors the virus; Strauss et al (1993) Epstein-Barr Virus Infections: Biology, Pathogenesis and Management. Annals of Internai Medicine 1 18: 45-57; and Rickinson et al (1996) Epstein-Barr Virus, p.2397-2436.
- EBV virus in Fields Virology (Third Edition) edited by Fields BN, Knipe DM, Howley PM, et al. Lippincott- Raven Publishers.
- the EBV virus like the other viruses of the Herpes group, has the capacity to persist indefinitely in its infected host. In vivo infection is made from the oropharynx by droplets of saliva. EBV remains latent in B lymphocytes of which it infects 1 to 50 CD 19+ CD23- B lymphocytes CD10- out of 10 6 in peripheral blood, where it remains in the form of episomes; Miyashita et al. (1995) A novel form of EBV latency in normal B cells in vivo. Cell; 80: 593-601.
- the pool of infected B lymphocytes is maintained thanks to the transmission of the episomal viral genome during mitosis, or by infection of circulating B lymphocytes in contact with the epithelium of the infected amygdala, Klein G. EBV strategy in normal and neoplastic B cells. Cell 1994; 77: 791-793. Consequently, the proliferation of B lymphocytes infected with EBV appears to be controlled by cytotoxic T lymphocytes.
- EBV can immortalize B lymphocytes which grow in continuous lines (lymphoblastoid lines: LCL or B / EBV) without exogenous growth factor; the cells are large and form clusters in culture; they express very strongly adhesion and CD23 molecules, the appearance of which is linked to the immortalization of B lymphocytes.
- LCL lymphoblastoid lines
- CD23 CD23
- Examples include Burkitt's lymphoma, Hodgkin's disease, and nasopharyngeal carcinoma., Thorley-Lawson et al (1985) Early events in EBV infection provide a model for B-cell activation. Journal of Experimental Medicine 162: 45-59. In addition, the frequency of lymphomas is 20 to 30 times higher in immunocompromised individuals after transplantation than in the general population. Similarly, in the subject HIV +, the frequency of lymphomas is also greatly increased, Knowles et al. lymphoid neoplasia associated with the AIDS. Annals of Internai Medicine 1988; 108: 744-753 The reactivation of the EBV virus notably involves a 35 kDa protein called ZEBRA.
- ZEBRA After splicing, 3 exons of ZEBRA code (i) for a first domain of 167 aa which includes the tr ⁇ rcs-activator domain, (ii) for a second domain of 34 amino acids (aa) which has homology with the transcription modulators c -fos and c-jun, and (iii) for a third leucine zipper domain of 42 aa capable of dimerization.
- ZEBRA recognizes elements of response present in the promoters of many EBV genes.
- the basic region (C-terminal, aa 157-195) contains 3 regions BRI, BRA, BRB.
- An anti-BRB IgM response (peptide PI 04) is detected in primary infections.
- This region is also the target of cytotoxic T lymphocytes; Elliott et al (1997) Dominant cytotoxic T lymphocyte response to the immediate-early trans-activator protein BZLF1 in the persistent type A or B EBV infection. Journal of Infectious Diseases 176: 1068-72; and Steven et al (1997) Immediate-early and lytic cycle proteins are frequent targets of the EBV-induced cytotoxic T cell response. Journal of Experimental Medicine 185: 1605-1617.
- the peptide PI 25 (aa 59-93) is the target of the IgG antibodies detected during the reactivations.
- the resumption of the lytic cycle is dependent on the tr ⁇ s-activator ZEBRA (also called BZLF1), which alone is sufficient to start the productive cycle; Miller G. (1990) The switch between latency and replication of Epstein-Barr Virus. Journal of Infectious Diseases 161: 833-844; and Mikaelian et al (1993) The DNA binding domain of two bZIP transcription factors, the Epstein-Barr Virus switch gene product EB1 and Jun, is a bipartite nuclear targeting sequence. Journal of Virology 67: 734-742.
- the cellular response is preponderant and controls the proliferation of infected B lymphocytes.
- the elimination of B lymphocytes immortalized by EBV is carried out in two distinct stages: The first phase is mediated by the direct induction by EBV of the production of ⁇ interferon which will decrease the number of B lymphocytes infectable by the virus .
- the second phase which takes place 10 to 15 days after infection, consists in the specific lysis of infected B cells. (lymphoblastoids) by cytotoxic T lymphocytes (or CTL). These are CD8 cells because the recognition of viral antigens is restricted by class I molecules.
- CD4 cytotoxic lymphocytes restricted by class II molecules
- T cells The role of surveillance by T cells of limiting the proliferative potential of cells infected with EBV in vivo is clearly illustrated by the development of lymphomas in immunodeficient subjects. T cells whose recognition is restricted by the products of classes I and II of the major histocompatibility complex are considered to be the keys to such control. Work aimed at identifying the EBV / HLA class I antigen combinations leading to CTL target epitopes has concerned asymptomatic EBV seropositive subjects.
- the lymphocytosis associated with MNI consists of CD4 + and CD8 + T lymphocytes not infected with EBV which represent the body's response to limit infection.
- part of the defense response also calls for cytotoxic T cells and non-EBV natural killer (NK) cells, perhaps by recognizing the EBV lytic cycle antigens; Steven et al (1996) Epitope focusing in the primary cytotoxic T cell response to EBV and its relationship to cell memory. Journal of Experimental Medicine 184: 1801-1813.
- the ultimate goal was to find peptides derived from the ZEBRA protein which are capable of triggering a cytotoxic (CYT) and proliferative (PROL) response. From such peptides, a medicament can be designed for the treatment and prevention of EBV-induced diseases.
- the screening method according to the invention has been successfully implemented to search for the minimum antigenic motifs of the ZEBRA protein.
- the peptide, called PlOO has been identified as having an antigenic motif which is particularly effective in triggering a cytotoxic and proliferative lymphocyte response.
- the process which is the subject of the present invention is not limited to the identification of the minimum antigenic motif (s) of the ZEBRA protein. It can be used for the screening of any peptide originating from any protein of interest capable of being antigenic or even from peptide libraries.
- the present invention relates to a method of screening for immunogenic peptides comprising the following steps:
- APC antigen presenting cells
- CTL cytotoxic T lymphocytes
- Steps a) and b) are interchangeable, so that the CPA can be treated with Bréfeldine A before the loading of one or more peptide (s) likely (s) to be immunogenic (s).
- Bréfeldine A increases the presentation effect of exogenous antigens.
- said CPA are treated with Bréfeldine A at a concentration of between 1 and 100 ⁇ g / ml, preferably 10 ⁇ g / ml.
- “Peptide” is understood to mean, in the context of the invention, a peptide capable of comprising a minimum antigenic motif recognized by a cytotoxic and / or helper T lymphocyte.
- This peptide can be a synthetic peptide, a peptide fragment or a peptide originating from any natural or non-natural source, such as for example from the digestion of one or more protein (s) and / or polypeptides, from a lysate cells digested by proteases, extracts, different fractions obtained by any separation and / or purification technique known to those skilled in the art, in particular by chromatography.
- the synthetic peptides can come from libraries of peptides having undergone or not fractionation by techniques well known to those skilled in the art.
- the preferred sources according to the invention are proteins of interest, capable of being antigenic, which are subjected to a series of digestions in order to obtain different fractions of peptide fragments which may possibly overlap.
- the term “Brefeldine A” is understood to mean the compound as described in Weber HP et al (1971) Structure of brefeldin A; Helv Chim Acta 54 (8): 2763-6, as well as any equivalent chemical compound, ie fulfilling the same function, all analogous, and all derivatives.
- CTL is understood to mean autologous cytotoxic T lymphocytes, that is to say originating from the individual from which the CPA was taken, or heterologous cytotoxic T lymphocytes originating from other individuals.
- CPA we mean autologous or heterologous CPA.
- B-EBV can be used as target cells for the study of cytotoxicity by CD8 + CTL lymphocytes; Purner et al. (1994) EBV transformed B cells, a potentially convenient source of autologous antigen-presenting cells for the propagation of certain human cytotoxic T lymphocytes. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1: 696, and Topalian et al.
- the method according to the invention therefore makes it possible to identify immunogenic peptides which are presented to the effector lymphocytes by the cells presenting the antigen (CPA) in association with the products of the major histocompatibility complex (MHC).
- said sought peptides are presented in association with class I MHC products.
- T lymphocyte effectors preferably of the CD8 type (or cytotoxic or "CTL” or "Cytotoxic T Lymphocytes”).
- CTL cytotoxic or "CTL” or "Cytotoxic T Lymphocytes”
- These cytotoxic effectors are capable of recognizing infected cells (and therefore presenting the antigen) in order to destroy them (cytotoxic appearance).
- Said peptides, as exogenous antigens can associate with MHC II.
- T lymphocyte effectors preferably of the CD4 helper (HTL) type, capable of proliferating (exponential increase in the number of effectors from a single precursor) to amplify and support the anti-infectious defense (for example anti-EBV).
- HTL CD4 helper
- the method according to the invention makes it possible to identify immunogenic peptides as exogenous antigens (stimulate HTL), and to select from these peptides those which stimulate CTL.
- this method allows the identification of exogenous antigens stimulating the CD8 and CD4 compartments of the immune defenses.
- such peptides can be used for the preparation of very effective vaccines which stimulate all of the CD4 and CD8 compartments of the immune system.
- the method according to the invention allows the screening of peptide fragments from any source, in particular from a protein of interest, in which the presence of immunogenic motifs is suspected.
- the method according to the invention can comprise a preliminary step of separation and / or purification of said peptides so as to load fractions of peptides in the CPA.
- Said fractions can come from the digestion of a protein of interest with one or more protease (s).
- the fractions, composed of peptide fragments obtained after digestion of a protein by various proteases, can overlap, so that it is possible to identify and then identify the minimum immunogenic motifs contained in the protein.
- the present invention also relates to the immunogenic peptides capable of being obtained by the method as mentioned above.
- these peptides can be peptides derived from the ZEBRA protein of the EBV virus.
- the PlOO peptide was identified using the method according to the invention.
- another aspect of the present invention relates to a peptide compound derived from the ZEBRA protein of the EBV virus comprising at least the following amino acid sequence:
- Xi is -A 1 -A 2 -A 3 .
- Ai being chosen from F, Y, W, A 2 from S, T, Y, and A 3 from G
- X 2 is selected from Q
- X 3 is selected from G, A, V, L, I, is -B ⁇ -B 2 -B 3 .
- B 4 - Bi being chosen from E, D, N, Q, B 2 from N, Q, D, E, B 3 among G, A, V, L, I, and B 4 among F, Y, W, Xi, X 2 , X 3 , and X 4 , Ai, A 2 , and A 3 , and Bi, B 2 , B 3 and B being chosen independently of each other.
- Xi may be -FSA
- X 2 may be Q
- X 3 may be A
- Xj may be -ENAY-.
- the peptide compound PlOO has the sequence -FSAPQPAPENAY- (SEQ ID No. 2) or an equivalent sequence.
- the proline-rich region appears to be dominant for recognition.
- the other amino acids can be substituted by physico-chemical equivalent amino acids.
- peptide compound means peptides which may contain natural amino acids (all amino acids in the L form), but also amino acids in the D form.
- the said peptide compounds may also contain modified amino acids selected for example from Abu (alpha amino butyric acid), Agm (1-amino-4-guanidino-butane), Aib (alpha isobutyric acid), Har (homo-arginine), hPhe (homo-phenylalanine), Nal (2-napthul-alanine) and Nie (norleucine).
- Abu alpha amino butyric acid
- Agm (1-amino-4-guanidino-butane
- Aib alpha isobutyric acid
- Har homo-arginine
- hPhe homo-phenylalanine
- peptide compounds can also be protected by protective groups known to those skilled in the art reacting at the NH and / or COOH ends of the peptides. Mention may in particular be made of formyl, benzyl, cyclohexyl, dicyclohexylcarboiimide, acetyl, tertbutyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, bromoproprionyl groups. Chemical groups improving the efficacy of the vaccine in vivo can also be coupled to said peptide. Lipids or fatty acids which are covalently attached to peptides to form peptide compounds called lipopeptides are particularly targeted.
- Palmitoic acid is one example among others, Vitiello et al (1995) Development of a lipopeptide-based therapeutic vaccine to treat chronic HBV infection. J. Clin. Invest. 95 341: 349, incorporated in the description by reference.
- the use of a protein carrying said peptides having restriction sites and allowing the delivery of intact peptides to their action sites in the organism is a possible embodiment of the present invention.
- the invention also relates to a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising at least one peptide as defined above in an amount effective for stimulating the immune defenses against EBV and a pharmaceutically acceptable vehicle.
- the pharmaceutical vehicle may be compatible with IV, subcutaneous, oral, or nasal administration. Mention may in particular be made of vehicles of the liposome, nanoparticle, or lipid emulsion type, positively or negatively charged.
- Another possibility of implementing the present invention consists of a combination product comprising at least one peptide compound according to the invention and at least one other peptide compound derived from EBV proteins, in particular from ZEBRA, preferably the peptide compound PI 04 of the sequence SEQ ID n ° 6 for simultaneous, spread, or separate use over time.
- the combination product according to the invention can also comprise at least one peptide compound according to the invention and at least one agent modulating the immune defenses, such as cytokines and / or lymphokines, in particular selected from IL-2,, IL- 6, IL-10, IL-12, IL-15, IF- ⁇ and TNF.
- cytokines and / or lymphokines in particular selected from IL-2,, IL- 6, IL-10, IL-12, IL-15, IF- ⁇ and TNF.
- cytokines and / or lymphokines in particular selected from IL-2, IL- 6, IL-10, IL-12, IL-15, IF- ⁇ and TNF.
- Lymphomas develop after injection into SCID mice of peripheral lymphocytes from healthy EBV + subjects. Rapidly growing tumors carry EBV genomes in replicative form, while less aggressive tumors carry only episomes (representative of an exclusively latent virus); Rochford et al (1995) Differential EBV gene expression in B-cell subsets recovered from lymphomas in SCID mice after transplantation of human peripheral blood lymphocytes. Journal ofVirology 69: 150-155.
- sensitizing T lymphocytes against other EBV antigens or B lymphocyte molecules or to develop cell therapy techniques by injecting sensitized presenting cells in vitro with antigens which can be recognized in vivo by cytotoxic T cells.
- Sensitized autologous dendritic cells were injected into patients and were used to induce tumor regression; Hsu et al (1996) Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells. Nature Medicine 2: 52-58, incorporated into the description by reference.
- the dendritic cells can therefore be injected into a patient for a therapeutic purpose, in particular when he has lymphoma or for the purpose of vaccination, in order to amplify the anti-ZEBRA T responses.
- the present invention also relates to the use of a peptide compound or a combination product according to the invention for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of diseases induced by EBV, in particular EBV-induced cancers.
- said peptide compound and the combination product are intended for the treatment and / or the prevention of Burkitt's lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, and Hodgkin's disease.
- said peptide compound and said combination product are useful for the preparation of a vaccine to stimulate the immune defenses against EBV, in particular to trigger a cytotoxic (CYT) and proliferative (PROL) response.
- the peptide compound and the combination products according to the invention are useful for treating and / or preventing reactivation of EBV in immunocompromised patients, in particular in AIDS patients, who have undergone radiotherapy or in patients treated with immunosuppressants, in particular following an organ transplant or any substance from the human body such as, for example, the spinal cord.
- the peptide compound can also be administered ex vivo, in particular in the context of the preparation of CPA loaded with immunogenic peptides.
- the cells presenting antigens loaded with immunogenic peptides LCL, B / EBV and dendritic cells are more particularly selected.
- the invention relates to the use of a peptide compound or of a combination product mentioned above for the ex vivo preparation of CPA loaded with immunogenic peptide compounds.
- the CPA can be treated with Bréfeldine A, at a concentration of between 1 and 100 ⁇ g / ml, preferably 10 ⁇ g / ml.
- Bréfeldine A is useful for the ex vivo preparation of CPA loaded with immunogenic peptide compounds, so that the effect of presentation of immunogenic peptides loaded in CPA is increased.
- a particular mode of application of the present invention lies in the use of Brefeldine for the ex vivo preparation of CPA loaded with peptide compounds as described above, in particular loaded with PlOO, said CPA being intended for treatment EBV-induced diseases, including the diseases mentioned above.
- Figure 1 Determination of the cytotoxic nature of the CD8 + A6 T clone.
- the autologous B-LCLs are incubated for 1 hour at 37 ° C. in the presence of Bfa (10 ⁇ g / ml) and then for 1 hour with PlOO (10 ⁇ g / ml) or incubated for 1 hour with PlOO at 37 ° C.
- the autologous B-LCLs are incubated for 1 hour in the presence of 10 ⁇ g / ml of Bfa and then pulsed with PlOO or P104 for 1 hour at 37 ° C.
- the autologous B-LCLs are incubated for 1 hour in the presence of 10 ⁇ g / ml of Bfa and then pulsed with PlOO (20 ⁇ g / ml) or P104 (20 ⁇ g / ml) for 1 hour at 37 ° C. and subjected to incubation in the presence of T cells A6 D-
- the T cell A6 recognizes PlOO in a class I context.
- the autologous B-LCLs are treated for 1 h in the presence of 10 ⁇ g / ml of Bfa then pulsed with PlOO (20 ⁇ g / ml) and incubated in the presence of an antibody anti CMHI (W6 / 32) or anti CMH II (L243) for 1 hour then incubated in the presence of T cells
- PlOO an antibody anti CMHI
- L243 anti CMH II
- A- El i specifically recognizes PlOO.
- Autologous B-LCLs are incubated for 1 hour in the presence of PlOO or PI 04 B- Determination of the class II restriction of recognition of PlOO on the surface of the presenting cells.
- B-LCL loaded with PlOO (10 ⁇ g / ml) 1 h at 37 ° C) having a class II molecule with autologous B-LCLs.
- B-LCL 2 Heterologous B-LCL 2: DR7, DR15, DQ602, DQ2; B-LCL heterologous 3: DR4, DR11, DQ301, DQ303
- FIGURE 3 Study of the proliferative nature of the CD4 + C12 T clone
- A- Cl 2 specifically recognizes PlOO.
- Autologous B-LCLs are incubated for 1 hour in the presence of P 100 or P 104.
- B- Determination of the class II restriction of recognition of PlOO on the surface of the presenting cells Use of B-LCL loaded with PlOO (10 ⁇ g / ml) lh at 37 ° C. expressing sharing a class II molecule with autologous B-LCLs.
- Heterologous B-LCL 2 DR7_, DR15, DQ602, DQ2;
- Heterologous B-LCL 3 DR4,
- the peptides described below were synthesized using the Synergy device from Applied Biosystems, and purified to obtain a purity greater than 90%.
- the peptides PlOO and P104 correspond to amino acids 75-88 and 184-195 of the protein ZEBRA (243 amino acids).
- ZEBRA N-terminal region peptide PlOO (75-88) FSAPQPAPENAY (SEQ ID n ° 2) peptide P99 STAPTGSWFSAP (SEQ ID n ° 3) peptide PI 01 ENAYQAYAPQLF (SEQ ID n ° 4)
- PBMC peripheral blood
- VA HLA / A2,24 B 14,62 - DR14,7 - DQ5,2
- d 1.077
- the donors' blood is diluted (1: 1) in Hanks medium and deposited in a gradient, then centrifuged at 800g at room temperature for 20 minutes, finally washed 3 times in Hanks at 150g.
- B-LCL or B / EBV lymphoblastoid lines
- the lymphoblastoid lines were obtained by infecting PBMC with the strain EBV B95 / 8 in the presence of cyclosporine A (20 ⁇ g / ml), then maintained in culture in complete medium: RPMI1640 containing 1% V / V of nonessential amino acids , 1 mM sodium pyruvate, 0.25 mM ⁇ -mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamine, 100 IU / ml penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin, 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B, and 10% V / V of Calf Serum Fetal (SVF)
- B-LCL are treated in the presence of the phorbol ester TPA (20 ng / ml) and sodium butyrate (3 mM ) for 3 days.
- PBMCs 3 X 10 6 PBMCs are cultured in the presence of 10 ⁇ g / ml of PlOO peptide. After 7 days of incubation, the T blasts are separated in a discontinuous Percoll gradient (0 - 90%) then are cloned in limiting dilution in a 96-well plate (0.5 and 1 cell per well) in the presence of heterologous PBMCs (5.10 4 cells / well) previously treated with mitomycin C (25 ⁇ g / ml) for 30 minutes at 37 ° C. and phytohemagglutinin PHA (2 ⁇ g / ml).
- the T clones are transferred into 24-well plates, then cultured in complete medium supplemented with IL-2 (100 IU / ml) and reactivated every 4 weeks in the presence of PHA (2 ⁇ g / ml), of heterologous PBMC and IL-2 (100 IU / ml). The cultures are placed in incubation at 37 ° C, 5% CO2.
- the antigen presenting cells chosen are the following: a) The autologous or allogenic B-LCL cells pulsed with the synthetic peptides (PlOO or P104) for 1 h at 37 ° C. and washed once with the complete medium for rinse unbound peptides, b) Autologous or allogenic B-LCL cells activated (for 3 days) with TPA / BA (phorbol esters: 12-0-tetradecanoylphorbol-13 acetate (TPA) and butyrate (BA)), c ) Autologous B-LCL cells treated for 1 h with chloroquine (0.2 mM) and pulsed with PlOO or activated with TPA / BA.
- TPA 12-0-tetradecanoylphorbol-13 acetate
- BA butyrate
- the CPA (4.10 4 cells / ml) were treated with 25 ⁇ g / ml of mitomycin C, washed 3 times in a complete medium, then incubated in 96-well plates for 3 days in the presence of CD4 + T cell clones (1 2.10 5 cells / well) in 200 ⁇ l of complete medium.
- the cell nuclei were incubated for 16 h with 1 ⁇ Ci of H-Thymidine.
- the cells were then harvested using a "cell harvester" (Inotech EG and G), and the radioactivity incorporated into the DNA was quantified by a ⁇ counter.
- the wells were tested in triplicate and the results are expressed in mean cpm.
- the stimulation index (SI) was calculated as the ratio between the cpm obtained in the presence of the peptide and the cpm obtained without the peptide.
- the recognition of synthetic peptides derived from ZEBRA by human lymphocytes was determined using the lymphocyte proliferation test described above.
- the lymphocyte cells are brought into contact with the peptides and the cells recognizing antigenic motifs proliferate.
- the cells come from memory lymphocytes (previously sensitized to the EBV virus and therefore to the antigenic protein ZEBRA) capable of multiplying and developing an effector role in the anti-EBV defense.
- the cytotoxic activity of the clones was determined according to the method which is the subject of the present invention.
- the process protocol is derived from the 51 Cr test with an E / T ratio of 5/1.
- 1.10 6 target cells were labeled for 16 h with 100 ⁇ Ci 51 Cr in complete RPMI medium, washed twice in complete medium, and resuspended at 5.10 4 cells / ml.
- the target cells are: i) Autologous B-LCL cells (control 1), ii) Autologous B-LCL cells pulsed for 1 h at 37 ° C. with 10 ⁇ g / ml of the peptide capable of being immunogenic which it is desired to identify
- the unbound peptides were rinsed, and the cells were resuspended and adjusted as described above.
- the target cells were co-incubated with the effector cells for 4 h at 37 ° C. in well plates with a round-bottom-well plates. 100 ⁇ l of supernatant were recovered from each well and the radioactivity was measured by a ⁇ counter. All tests were performed in triplicate. The percentage of cytotoxicity was determined by the following formula: lOOx [(experimental release - spontaneous release) / (maximum release - spontaneous release)].
- the target cells were incubated with an anti-MHC I antibody (W6 / 32) or an anti-MHC II antibody (L243).
- an anti-MHC I antibody W6 / 32
- an anti-MHC II antibody L243
- the use of a panel of B-LCL corresponding to one or other of the HLA markers as targets made it possible to determine the HLA restriction of cell recognition of PlOO.
- Human T lymphocyte clones were established from the PBMCs of a donor with primary infection (MNI) carrying anti-ZEBRA (IgM) antibodies, HLA: A2, A24, B14, B62, DR14, DR7, DQ5, DQ2 .
- the donor T cells were activated respectively by synthetic peptides derived from the ZEBRA protein: peptides PlOO and PI 04 (peptides selected by the serological response in example 1 above).
- cloning in limiting dilution is carried out in the presence of heterologous PBMCs treated with mitomycin C and a mitogen (PHA).
- the 2 CD4 clones recognize the peptide PlOO of ZEBRA (N-terminal region: FSAPQPAPENAY (SEQ ID No. 2) both in the context of autologous cells and of selected heterologous cells jointly expressing the HLA DR7 haplotype: recognition of ZEBRA is therefore restricted by the class II molecule of the major histocompatibility complex: DR7.
- a CD8 + CTL clone was also produced. The latter specifically recognizes the N-terminal region mentioned above. This proline-rich region thus appears to be dominant for recognition.
- the peptide PlOO which is therefore capable of triggering a cytotoxic (CYT) and proliferative (PROL) response, highlights an antigenic motif which is particularly interesting from the immune standpoint:
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de criblage de peptides immunogènes mettant en oeuvre la Bréfeldine A pour augmenter l'effet de présentation desdits peptides par les cellules présentatrices d'antigènes. L'invention porte également sur les peptides immunogènes susceptibles d'être obtenus par ce procédé, notamment sur le peptide P100, et sur l'utilisation du composé peptidique P100 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des maladies induites par EBV, notamment pour le traitement et/ou la prévention du lymphome de Burkitt, du carcinome du nasopharynx, et/ou de la maladie de Hodgkin.
Description
EFFET DE LA BREFELDINE A SUR LES CELLULES PRESENTATRICES D ' ANTIGENES
La présente invention concerne un procédé de criblage de peptides immunogènes mettant en œuvre la Bréfeldine A pour augmenter l'effet de présentation desdits peptides par les cellules présentatrices d'antigènes. L'invention porte également sur les peptides immunogènes susceptibles d'être obtenus par ce procédé, notamment sur le peptide PlOO, et sur l'utilisation du composé peptidique PlOO pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des maladies induites par EBV, notamment pour le traitement et/ou la prévention du lymphome de Burkitt, du carcinome du nasopharynx, et/ou de la maladie de
Hodgkin.
Le développement de vaccins pour le traitement de patients atteints d'un cancer ou d'une maladie infectieuse a depuis longtemps fait l'objet de nombreuses recherches. Un problème particulièrement difficile à résoudre réside en l'identification d'antigènes capables de provoquer des réactions immunitaires suffisamment efficaces pour détruire les cellules cancéreuses ou l'agent pathogène. Or, il semble que les antigènes seraient plus efficaces s'ils permettaient de stimuler l'ensemble des éléments composant les défenses immunitaires. En ce sens, il a été montré qu'il est bénéfique de stimuler non seulement les lymphocytes CD8+ mais également les CD4+ pour obtenir une réponse immunitaire anti-tumorale efficace ; Pardoll et al. (1998) The rôle of CD4+ T-cell responses in antitumor immunity, Curr Opin Immunol 10(5) :588-94.
La caractérisation d'antigènes associés aux tumeurs, qui peuvent être présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité (MCH) de classe I et II, représente un enjeu de plus en plus important ; Topalian et al. (1994) MHC Class II restricted tumor antigens and the rôle of CD4+ T-cells in cancer immunotherapy, Curr Opin
Immunol 6(5) -.741-745. Certaines stratégies d'identification d'antigènes impliqués dans la régression des cancers ont été revues dans Rosenberg et al. (1997) Cancer vaccines based on the identification of gènes encoding cancer régression antigens, Immunology Today 18(4): 175- 180. Parmi ces stratégies, on peut citer l'utilisation de lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) pour cribler des librairies d'ADNc dérivé de tumeurs. Après identification d'un gène exprimant une protéine antigénique, les peptides provenant de ladite protéine sont chargées sur une cellule présentatrice d'antigènes (CPA) afin d'identifier le fragment peptidique immunodominant.
On peut classer les antigènes dans les deux catégories distinctes suivantes :
- Les antigènes endogènes présentés aux cellules T par le MHC de classe I,
- et les antigènes exogènes présentés par le MHC de classe II.
Les antigènes exogènes sont intégrés dans les endosomes périphériques, à l'intérieur desquels ils se s'associent aux molécules de classe II. En revanche, les antigènes endogènes sont soit synthétisés, soit libérés dans le cytoplasme avant d'être partiellement dégradés d'une façon non encore tout à fait définie. Ensuite, ces antigènes se complexent avec les molécules de classe I, et sont présentés à la surface des CPA.
A la fin des années 80, les deux substances suivantes étaient utilisées pour étudier les différentes voies conduisant à la présentation des antigènes :
La Bréfeldine, qui est un inhibiteur spécifique de la présentation des antigènes endogènes. Cette substance est une molécule antibiotique inhibant l'apprêtement et la présentation par les molécules de classe I du système HLA en bouleversant l'architecture du trαns-golgi. Cette molécule inhibe ainsi la présentation des antigènes protéiques aux lymphocytes T cytotoxiques Nuchtern et al. (1989) Brefeldin A implicates egress from endoplasmic reticulum in class I restricted antigen présentation. Nature (Lond.) 339: 223 , et Yewdell et al. (1989) Brefeldin A specifically inhibits présentation of
protein antigens to cytotoxic T lymphocytes. Science 244: 1072. Par ailleurs, la Bréfeldine supprime l'expression de la chaîne invariante associée aux molécules de classe II du sytème HLA Jaraquameda et al. (1990) An endogenous processing pathway in vaccinia virus-infected cells for présentation of cytoplasmic antigens to class II-restricted T cells. J. Exp. Med.
172: 947. - La choloroquine, qui est un inhibiteur spécifique de l'apprêtement des antigènes exogènes.
La Bréfeldine est depuis lors tombée dans l'oubli et n'est plus guère utilisée à cet instant. Or, on a trouvé de manière surprenante que la Bréfeldine permet d'augmenter considérablement l'effet de présentation d'antigènes exogènes par les CPA, notamment par les lignées B transformées par EBV. Ainsi, la présente invention offre une amélioration technologique importante à la fois dans le domaine de la recherche vaccinale (procédé de criblage de peptides immunogènes) et dans le domaine de l'immunothérapie, en particulier dans le domaine de la thérapie cellulaire anti-tumorale. Ce procédé de criblage a été mis en oeuvre notamment afin de rechercher des motifs antigéniques minimum permettant de stimuler l'ensemble des défenses immunitaires dirigées contre le virus d'Epstein-Barr.
En effet, EBV, virus ubiquitaire de la famille des Herpesvirus, est un des rares virus humains à être étroitement associé au développement de tumeurs. Après une infection primaire pendant laquelle le virus s'exprime majoritairement par un cycle lytique, EBV rentre dans un cycle de latence. Le virus a co-évolué chez l'homme depuis des millions d'années, ainsi plus de 95% de la population mondiale héberge le virus ; Strauss et al (1993) Epstein- Barr Virus Infections : Biology, Pathogenesis and Management. Annals of Internai Médecine 1 18 : 45- 57 ; et Rickinson et al (1996) Epstein-Barr Virus, p.2397-2436. In Fields Virology (Third Edition) edited by Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M., et al. Lippincott- Raven Publishers.
Le virus EBV, comme les autres virus du groupe Herpès a la capacité de persister indéfiniment chez son hôte infecté. In vivo l'infection se fait à partir de l'oropharynx par des gouttelettes de salive. EBV persiste à l'état latent dans les lymphocytes B dont il infecte 1 à 50 lymphocytes B CD 19+ CD23- sur 106 du sang périphérique, où il reste sous forme d'épisomes ; Miyashita et al. (1995) A novel form of EBV latency in normal B cells in vivo. Cell; 80: 593-601. Le pool de lymphocytes B infectés se maintient grâce à la transmission du génome viral épisomal lors de la mitose, ou par infection des lymphocytes B circulants au contact de l'épithélium de l'amygdale infectée, Klein G. EBV strategy in normal and neoplastic B cells. Cell 1994; 77: 791-793. En conséquence, la prolifération des lymphocytes B infectés par EBV apparaît contrôlée par les lymphocytes T cytotoxiques.
In vitro, EBV peut immortaliser les lymphocytes B qui poussent en lignées continues (lignées lymphoblastoïdes: LCL ou B/EBV) sans facteur de croissance exogène; les cellules sont de grande taille et forment des amas en culture; elles expriment très fortement des molécules d'adhésion et CD23 dont l'apparition est liée à l'immortalisation des lymphocytes B. Le génome viral se maintient à l'état latent sous forme d'épisomes dans les LCL. Le virus EBV est donc associé à des cancers.
On peut citer par exemple le lymphome de Burkitt, les maladies de Hodgkin, et le carcinome du nasopharynx., Thorley-Lawson et al (1985) Early events in EBV infection provide a model for B-cell activation. Journal of Expérimental Medicine 162: 45-59. Par ailleurs, la fréquence des lymphomes est 20 à 30 fois plus importante chez les individus immunodéprimés après transplantation que dans la population générale. De même, chez le sujet HIV+, la fréquence des lymphomes est également très augmentée, Knowles et al. lymphoid neoplasia associated with the AIDS. Annals of Internai Medicine 1988; 108: 744-753
La réactivation du virus EBV met notamment en jeu une protéine à 35 kDa appelée ZEBRA. Après épissage, 3 exons de ZEBRA codent (i) pour un premier domaine de 167 aa qui comprend le domaine trαrcs-activateur, (ii) pour un second domaine de 34 acides aminés (aa) qui a une homologie avec les modulateurs de transcription c-fos et c-jun, et (iii) pour un troisième domaine leucine zipper de 42 aa capable de dimérisation. ZEBRA reconnaît des éléments de réponse présents dans les promoteurs de nombreux gènes de EBV. La région basique (C- terminale, aa 157-195) contient 3 régions BRI, BRA, BRB. Une réponse de type IgM anti-BRB (peptide PI 04) est détectée dans les infections primaires. Cette région est également la cible des lymphocytes T cytotoxiques ; Elliott et al (1997) Dominant cytotoxic T lymphocyte response to the immediate-early trans-activator protein BZLF1 in the persistent type A or B EBV infection. Journal of Infectious Diseases 176: 1068-72 ; et Steven et al (1997) Immediate-early and lytic cycle proteins are fréquent targets of the EBV-induced cytotoxic T cell response. Journal of Expérimental Medicine 185: 1605-1617. De plus, le peptide PI 25 (aa 59-93) est la cible des anticorps IgG détectés au cours des réactivations.
Ainsi, la reprise du cycle lytique est sous la dépendance du trαπs-activateur ZEBRA (appelé également BZLF1), qui seul suffit à enclencher le cycle productif ; Miller G. (1990) The switch between latency and replication of Epstein-Barr Virus. Journal of Infectious Diseases 161 : 833-844 ; et Mikaelian et al (1993) The DNA binding domain of two bZIP transcription factors, the Epstein-Barr Virus switch gène product EB1 and Jun, is a bipartite nuclear targeting séquence. Journal of Virology 67 : 734-742.
La réponse cellulaire est prépondérante et contrôle la prolifération des lymphocytes B infectés. L'élimination des lymphocytes B immortalisés par EBV s'effectue en deux étapes distinctes : La première phase est médiée par l'induction directe par l'EBV de la production d'interféron γ qui va diminuer le nombre de lymphocytes B infectables par le virus. La deuxième phase se situant 10 à 15 jours après l'infection consiste en la lyse spécifique des cellules B infectées
(lymphoblastoïdes) par des lymphocytes T cytotoxiques (ou CTL). Il s'agit de cellules CD8, car la reconnaissance des antigènes viraux est restreinte par les molécules de classe I. Il existe une réponse par des lymphocytes cytotoxiques restreints par les molécules de classe II (CD4), mais du fait de leur durée de vie importante, ces cellules semblent d'avantage participer aux phénomènes de mémoire ; Rickinson et al (1997) Human cytotyoxic T lymphocyte responses to EBV infection. Annual Review of Immunology. 15: 405-431.
Le rôle de la surveillance par les cellules T de la limitation du potentiel prolifératif des cellules infectées par EBV in vivo est clairement illustré par le développement de lymphomes chez les sujets immunodéficients. Les lymphocytes T dont la reconnaissance est restreinte par les produits des classes I et II du complexe majeur d'histocompatibilité sont considérés comme les clés d'un tel contrôle. Les travaux visant à identifier les combinaisons antigène EBV/HLA classe I amenant à des épitopes cibles des CTL ont concerné des sujets asymptomatiques EBV séropositifs.
La lymphocytose associée à la MNI est constituée de lymphocytes T CD4+ et CD8+ non infectées par EBV qui représentent la réponse de l'organisme pour limiter l'infection. Au cours de la primoinfection, une partie de la réaction de défense fait également appel à des cellules cytotoxiques T et des cellules de type natural killer (NK) non spécifiques de EBV, peut-être en reconnaissant les antigènes du cycle lytique de EBV ; Steven et al (1996) Epitope focusing in the primary cytotoxic T cell response to EBV and its relationship to cell memory. Journal of Expérimental Medicine 184: 1801-1813.
De récentes études ont démontré l'existence d'une réponse CTL vis-à-vis des protéines de replication virale. Parmi celles-ci, les CTL reconnaissant ZEBRA figurent sans doute parmi les plus efficaces (haute fréquence des précurseurs CTLp anti-ZEBRA) ; Elliott et al (1997) Dominant cytotoxic T lymphocyte response to the immediate-early trans-activator protein BZLFl in the persistent type A or B EBV infection. Journal of Infectious Diseases 176: 1068-72.
Après avoir défini la réponse anticorps contre certains peptides dérivés de cette protéine (FR 2728904), on a entrepris l'étude de la reconnaissance lymphocytaire de ZEBRA par le système immunitaire de l'hôte.
L'objectif in fine a été de trouver des peptides dérivés de la protéine ZEBRA qui sont capables de déclencher une réponse cytotoxique (CYT) et proliférative (PROL). A partir de tels peptides, on peut concevoir un médicament pour le traitement et la prévention des maladies induites par EBV. A cet effet, le procédé de criblage selon l'invention a été mis en œuvre avec succès pour rechercher les motifs antigéniques minimum de la protéine ZEBRA. Le peptide, dénommé PlOO, a été identifié comme présentant un motif antigénique particulièrement efficace pour déclencher une réponse lymphocytaire cytotoxique et proliférative.
Bien entendu, le procédé, objet de la présente invention, ne se limite pas à l'identification du ou des motif(s) antigénique(s) minimum de la protéine ZEBRA. Il peut être mis en œuvre pour le criblage de tout peptide provenant de n'importe quelle protéine d'intérêt susceptible d'être antigénique ou encore de librairies peptidiques.
La présente invention concerne un procédé de criblage de peptides immunogènes comprenant les étapes suivantes :
a) Chargement d'un ou de plusieurs peptide(s) susceptible(s) d'être immunogène(s) sur des cellules présentatrices d'antigènes (CPA), sélectionnées notamment parmi les lignées lymphoblastoïdes (LCL), les lymphocytes B infectés par EBV (B/EBV), ou les cellules dentritiques,
b) traitement des CPA par la Bréfeldine A,
c) incubation desdites CPA avec des clones de Lymphocytes T cytotoxiques (CTL) provenant de patients atteints d'un cancer ou infectés par un agent pathogène, notamment par un virus,
d) détermination de la lyse spécifique desdites CPA par les CTL, et identification du ou des peptide(s) immunogène(s).
Les étapes a) et b) sont interchangeables, de telle sorte que l'on peut traiter les CPA par la Bréfeldine A avant le chargement d'un ou de plusieurs peptide(s) susceptible(s) d'être immunogène(s). La Bréfeldine A permet d'augmenter l'effet de présentation d'antigènes exogènes. Avantageusement, lesdites CPA sont traitées avec la Bréfeldine A à une concentration comprise entre 1 et 100 μg/ml, de préférence 10 μg/ml.
On entend par « peptide » dans le cadre de l'invention, un peptide susceptible de comprendre un motif antigénique minimum reconnu par un lymphocyte T cytotoxique et/ou helper. Ce peptide peut être un peptide synthétique, un fragment peptidique ou un peptide provenant de n'importe quelle source naturelle ou non, telle que par exemple de la digestion d'une ou plusieurs protéine(s) et/ou polypeptides, d'un lysat de cellules digérées par des protéases, d'extraits, de différentes fractions obtenues par toute technique de séparation et /ou de purification connue de l'homme du métier, en particulier par chromatographie. Les peptides synthétiques peuvent provenir de librairies de peptides ayant subies ou non des fractionnements par les techniques bien connues de l'homme du métier.
Les sources préférées selon l'invention sont des protéines d'intérêts, susceptibles d'être antigéniques, auxquelles on fait subir une série de digestions afin d'obtenir différentes fractions de fragments peptidiques qui peuvent éventuellement se recouper.
On entend par « Bréfeldine A » le composé tel que décrit dans Weber HP et al (1971) Structure of brefeldin A; Helv Chim Acta 54(8):2763-6, ainsi que tout composé chimique équivalent, c'est à dire remplissant la même fonction, tout analogue, et tout dérivé.
On entend par CTL, des lymphocytes T cytotoxiques autologues, c'est à dire provenant de l'individu dans lequel on a prélevé les CPA, ou des lymphocytes T cytotoxiques hétéro logues provenant d'autres individus. On entend par CPA, les CPA autologues ou hétérologues. Les B-EBV peuvent être utilisées comme cellules cibles pour l'étude de la cytotoxicité par les lymphocytes CD8+ CTL ; Purner et al. (1994) EBV transformed B cells, a potentially convenient source of autologous antigen-presenting cells for the propagation of certain human cytotoxic T lymphocytes. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1 : 696, et Topalian et al. (1994) Melanoma-specific CD4+ T lymphocytes recognize human melanoma antigens processed and presented by EBV -transformed B cells. Int. J. Cancer 58: 69, incorporées dans la description par référence. En effet, les B-EBV sont capables de présentation antigénique à la fois dans un contexte classe I et classe IL
Le procédé selon l'invention permet donc d'identifier des peptides immunogéniques qui sont présentés aux lymphocytes effecteurs par les cellules présentant l'antigène (CPA) en association avec les produits du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Dans le cadre de l'invention, lesdits peptides recherchés sont présentés en association avec les produits de classe I du CMH. Une telle association est reconnue par les effecteurs lymphocytaires T, préférentiel lement de type CD8 (ou cytotoxiques ou "CTL" ou "Cytotoxic T Lymphocytes"). Ces effecteurs cytotoxiques sont capables de reconnaître les cellules infectées (et donc présentant l'antigène) pour les détruire (aspect cytotoxique). Lesdits peptides, en tant qu'antigènes exogènes, peuvent s'associer au CMH II. Une telle association est reconnue par des effecteurs lymphocytaires T, préférentiellement de type CD4 helper (HTL), capables de proliférer
(augmentation exponentielle du nombre d'effecteurs à partir d'un précurseur unique) d'amplifier et de soutenir la défense anti-infectieuse (par exemple anti- EBV).
Le procédé selon l'invention permet d'identifier des peptides immunogènes en tant qu'antigènes exogènes (stimulent les HTL), et de sélectionner parmi ces peptides ceux qui stimulent les CTL. Ainsi, ce procédé permet l'identification d'antigènes exogènes stimulant les compartiments CD8 et CD4 des défenses immunitaires. In fine, de tels peptides peuvent être utilisés pour la préparation de vaccins très efficaces qui stimulent l'ensemble des compartiments CD4 et CD8 des défenses immunitaires.
Comme indiqué précédemment, le procédé selon l'invention permet le criblage de fragments peptidiques provenant de n'importe quelle source, en particulier provenant d'une protéine d'intérêt, dans laquelle on soupçonne la présence de motifs immunogéniques.
Ainsi, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape préliminaire de séparation et/ou de purification desdits peptides de manière à charger des fractions de peptides dans les CPA. Lesdites fractions peuvent provenir de la digestion d'une protéine d'intérêt par une ou plusieur(s) protéase(s). Les fractions, composées de fragments peptidiques obtenus après digestion d'une protéine par diverses protéases, peuvent se recouper, de telles sorte qu'il est possible de cerner, puis d'identifier les motifs immunogéniques minimum contenu dans la protéine.
La présente invention a également pour objet les peptides immunogènes susceptibles d'être obtenus par le procédé tel que mentionné ci-dessus. Par exemple, ces peptides peuvent être des peptides dérivés de la protéine ZEBRA du virus EBV.
Le peptide PlOO a été identifié grâce au procédé selon l'invention. Ainsi, un autre aspect de la présente invention concerne un composé peptide dérivé de la protéine ZEBRA du virus EBV comprenant au moins la séquence en acides aminés suivante :
-X1-P-X2-P-X3-P-X4- (SEQ ID n°l) dans laquelle
Xi est -A1-A2-A3. , Ai étant choisi parmi F, Y, W, A2 parmi S, T, Y, et A3 parmi G, A, V, L, I, X2 est sélectionné parmi Q, N, E, D, X3 est sélectionné parmi G, A, V, L, I, est -Bι-B2-B3.B4- , Bi étant choisi parmi E, D, N, Q, B2 parmi N, Q, D, E, B3 parmi G, A, V, L, I, et B4 parmi F, Y, W, Xi, X2, X3, et X4, Ai, A2, et A3, et Bi, B2, B3 et B étant choisis indépendamment les uns des autres.
De préférence, Xi peut-être -F-S-A, X2 peut-être Q, X3 peut-être A, et Xj peut- être -E-N-A-Y-. De manière avantageuse, le composé peptidique PlOO a la séquence -F-S-A-P-Q-P-A-P-E-N-A-Y- (SEQ ID n°2) ou une séquence équivalente.
La région riche en proline apparaît comme dominante pour la reconnaissance. Les autres acides aminés peuvent être substitués par des acides aminés équivalents de point de vue physico-chimique.
On entend par « composé peptide » dans le cadre de l'invention des peptides qui peuvent comporter des acides aminés naturels (ensemble des acides aminés sous la forme L), mais aussi les acides aminés sous la forme D. Lesdits composés peptides peuvent également comporter des acides aminés modifiés sélectionnés par exemple parmi Abu (Acide alpha amino butyrique), Agm (l-amino-4- guanidino-butane), Aib (acide alpha isobutyrique), Har (homo-arginine), hPhe (homo-phénylalanine), Nal (2-napthul-alanine) et Nie (norleucine). Comme
mentionné précédemment, l'homme du métier est tout à fait en mesure de modifié la structure chimique des peptides selon l'invention afin de leur conférer une plus grande résistance sans pour autant altérer leurs propriétés. Ces composés peptides peuvent en outre être protégés par des groupes protecteurs connus par l'homme du métier réagissant aux extrémités NH et/ou COOH des peptides. On peut citer notamment les groupes formyl, benzyl, cyclohexyl, dicyclohexylcarboiimide, acétyl, tertbutyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, bromoproprionyl. Des groupes chimiques améliorant l'efficacité du vaccin in vivo peuvent également être couplés audit peptide. Des lipides ou des acides gras que l'on attache de façon covalente aux peptides pour former des composés peptides appelés lipopeptides sont particulièrement visés. L'acide palmitoïque est un exemple parmi d'autres, Vitiello et al (1995) Development of a lipopeptide-based therapeutic vaccine to treat chronic HBV infection. J. Clin. Invest. 95 341:349, incorporée dans la description par référence. De même, l'utilisation d'une protéine porteuse desdits peptides possédant des sites de restriction et permettant l'acheminement des peptides intactes jusqu'à leurs sites d'action dans l'organisme est un possible mode d'exécution de la présente invention.
L'invention concerne également un composition pharmaceutique comprenant au moins un peptide tel que défini ci-dessus en quantité efficace pour stimuler les défenses immunitaires contre EBV et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Le véhicule pharmaceutique peut être compatible avec une administration IV, subcutanée, orale, ou nasale. On peut citer notamment des véhicules du type liposome, nano-particule, ou émulsion lipidique, chargés positivement ou négativement.
Une autre possibilité de mise en œuvre de la présente invention consiste en un produit de combinaison comprenant au moins un composé peptidique selon l'invention et au moins un autre composé peptidique dérivé des protéines de EBV, en particulier de ZEBRA, de préférence le composé peptidique PI 04 de la
séquence SEQ ID n°6 pour une utilisation simultanée, étalée, ou séparée dans le temps.
Le produit de combinaison selon l'invention peut également comprendre au moins un composé peptidique selon l'invention et au moins un agent modulant les défenses immunitaires, tels que les cytokines et/ou les lymphokines, notamment sélectionné parmi IL-2, , IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IF-γ et TNF. Il peut être constitué par l'ensemble des éléments ci-dessus indiqués, c'est à dire au moins un composé peptidique selon l'invention, au moins un autre composé peptidique dérivé des protéines de EBV, en particulier de ZEBRA, de préférence le composé peptidique PI 04 de la séquence SEQ ID n°6, et au moins un agent modulant les défenses immunitaires, tels que les cytokines et/ou les lymphokines, notamment sélectionné parmi IL-2, IL-6, IL- 10, IL- 12, IL- 15, IF-γ et TNF.
L'importance de la phase de replication de EBV dans le processus menant à la tumeur est illustrée par les observations suivantes:
1) L'apparition de tumeurs associées à EBV est précédée par une augmentation des antigènes de replication ou accompagnée par la réactivation du virus ; Joab et al (1991) Détection of anti-Epstein-Barr Virus transactivator (ZEBRA) antibodies in sera from patients with nasopharyngeal carcinoma. International Journal of Cancer 48 : 647-649
2) Les lymphomes post-transplantation surviennent avec une plus haute incidence a) chez les individus EBV-négatifs, dont la primo-infection implique une multiplication active du virus, b) chez les sujets EBV-positifs en réactivation.
3) Des lymphomes se développent après injection chez la souris SCID, de lymphocytes périphériques de sujets sains EBV+. Les tumeurs à croissance rapide portent des génomes EBV sous forme réplicative, alors que les tumeurs les moins agressives ne portent que des épisomes (représentatifs d'un virus exclusivement latents) ; Rochford et al (1995) Differential EBV gène expression in B-cell subsets
recovered from lymphomas in SCID mice after transplantation of human peripheral blood lymphocytes. Journal ofVirology 69: 150-155.
L'utilisation de lignées de lymphocytes T sensibilisés contre l'EBV in vitro a été développée avec succès vis-à-vis de lignées B EBV+ autologues après greffe de moelle Rooney et al (1994) Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation. Lancet 345: 9-13. Cette modalité immuno-thérapeutique pourrait permettre de restituer la perte spécifique de la défense des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ anti-EBV en raison du traitement immunosuppresseur. Les antigènes latents du virus, cibles de la cytotoxité cellulaire ne sont pas toujours exprimés et l'IL-10 peut être présente pour diminuer l'efficacité de la reconnaissance et de la destruction de la cellule tumorale. Il est néanmoins possible d'envisager de sensibiliser les lymphocytes T contre d'autres antigènes d'EBV ou des molécules des lymphocytes B ou de développer des techniques de thérapie cellulaire en injectant des cellules présentratrices sensibilisées in vitro avec des antigènes qui peuvent être reconnus in vivo par les lymphocytes T cytotoxiques. Des cellules dendritiques autologues sensibilisées ont été injectées à des patients et ont permis d'induire une régression tumorale ; Hsu et al (1996) Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells. Nature Medicine 2: 52-58, incorporée dans la description par référence.
Les cellules dendritiques peuvent donc être injectées chez un patient dans un but thérapeutique notamment lorsqu'il présente un lymphome ou dans un but de vaccination pour amplifier les réponses T anti-ZEBRA.
Ainsi, la présente invention porte également sur l'utilisation d'un composé peptidique ou d'un produit de combinaison selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des maladies induites par EBV, notamment des cancers induits par EBV. De préférence, ledit composé peptidique et le produit de combinaison se destinent aux traitement et/ou à la
prévention du lymphome de Burkitt, du carcinome du nasopharynx, et de la maladie de Hodgkin.
De manière avantageuse, ledit composé peptidique et ledit produit de combinaison sont utiles pour la préparation d'un vaccin pour stimuler les défenses immunitaires contre EBV, en particulier pour déclencher une réponse cytotoxique (CYT) et proliférative (PROL). Le composé peptidique et le produits de combinaison selon l'invention sont utiles pour traiter et/ou prévenir la réactivation de EBV chez des patients immunodéprimés, notamment chez des patients atteints du SIDA, qui ont subi un radiothérapie ou encore chez des patients traités par des immunodépresseurs notamment à la suite d'une transplantation d'organe ou de toute substance provenant du corps humain telle que par exemple la moelle épinière.
Le composé peptidique peut également être administré ex vivo, notamment dans le cadre de la préparation de CPA chargées en peptides immunogènes. Parmi les cellules présentatrices d'antigènes chargés en peptides immunogènes, on sélectionne plus particulièrement les LCL, les B/EBV, et les cellules dendritiques. Ainsi l'invention porte sur l'utilisation d'un composé peptidique ou d'un produit de combinaison mentionnés ci-dessus pour la préparation ex vivo de CPA chargées en composés peptidiques immunogènes.
Conformément à la présente invention, les CPA peuvent être traitées par la Bréfeldine A, à une concentration comprise entre 1 et 100 μg/ml, de préférence 10 μg/ml. Ceci permet d'augmenter l'effet de présentation de peptides immunogènes, notamment des composés peptidiques selon l'invention. La présente invention concerne donc l'utilisation de la Bréfeldine A pour augmenter l'effet de présentation de peptides immunogènes par les CPA. En ce sens, la Bréfeldine A est utile pour la préparation ex vivo de CPA chargées en composés peptidiques immunogènes, de telle sorte que l'effet de présentation de peptides immunogènes chargés dans des CPA est augmenté.
Ainsi, un mode particulier de mise en application de la présente invention réside dans l'utilisation de la Bréfeldine pour la préparation ex vivo de CPA chargées en composés peptidiques tels que décrits ci-dessus, notamment chargées avec PlOO, lesdites CPA étant destinées au traitement des maladies induites par EBV, notamment des maladies mentionnées ci-dessus.
Pour la suite de la description, on se référera aux légendes des figures présentées ci-dessous.
LEGENDES
Figure 1 : Détermination du caractère cytotoxique du clone T CD8+ A6.
A- Effet de la bréfeldine A (Bfa) sur la présentation du peptide PlOO aux lymphocites T A6
Les B-LCL autologues sont incubées lh à 37°C en présence de Bfa (lOμg/ml) puis lh avec PlOO (lOμg/ml) ou incubées lh avec PlOO à 37°C
B- Le lymphocite T A6 reconnaît spécifiquement PlOO. Les B-LCL autologues sont incubées lh en présence de lOμg/ml de Bfa puis puisées avec PlOO ou P104 lh à 37°C
C- Les B-LCL autologues sont incubées lh en présence de lOμg/ml de Bfa puis puisées avec PlOO (20μg/ml) ou P104 (20μg/ml) lh à 37°C et soumises à l'incubation en présence des cellules T A6 D- La cellule T A6 reconnaît PlOO dans un contexte de classe I.Les B-LCL autologues sont traitées lh en présence de lOμg/ml de Bfa puis puisées avec PlOO (20 μg/ml) et incubées en présence d'un anticorps anti CMHI (W6/32) ou anti CMH II (L243) pendant 1 heure puis incubées en présence des cellules T A6 E- Utilisation de B-LCL (traitées par de la Bfa puis puisées aves PlOO (20μg/ml) lh à 37°C possédant une molécule classe I du CMH en commun avec les B-LCL autologues. B-LCL hétérologue 1 : A2, A3, B44, B66 ; B-LCL hétérologue 2: A24, A33, B18, B65
FIGURE 2 : Etude du caractère proliférant du clone T CD4+ Eli
A- El i reconnaît spécifiquement PlOO. Les B-LCL autologues sont incubées lh en présence de PlOO ou PI 04 B- Détermination de la restriction classe II de la reconnaissance de PlOO à la surface des cellules présentatrices.Utilisation de B-LCL( chargées avec PlOO (10 μg/ml) 1 h à 37°C) possédant une molécule classe II avec les B-LCL autologues. B-LCL hétérologue 1 : DR14, DRU, DQ301, DQ5031
B-LCL hétérologue 2 : DR7, DR15, DQ602, DQ2 ; B-LCL hétérologue 3 : DR4, DR11, DQ301, DQ303
C- Les B-LCL autologues ont été incubées en présence de chloroquine (0,2mM) lh à 37°C puis induits ( B-LCL *) 3 jours par TPA (20 μg/ml) + BA (3mM) .
D- Les BLCL autologues ont été incubées en présence de chloroquine (0,2 mM) et chargées avec PlOO (10 μg/ml) 1 h à 37°C.
FIGURE 3 : Etude du caractère proliférant du clone T CD4 + C12
A- Cl 2 reconnaît spécifiquement PlOO. Les B-LCL autologues sont incubées lh en présence de P 100 ou P 104.
B- Détermination de la restriction classe II de la reconnaissance de PlOO à la surface des cellules présentatrices. Utilisation de B-LCL chargées avec PlOO (10 μg/ml) lh à 37°C exprimant partageant une molécule classe II avec les B-LCL autologues. B-LCL hétérologue 1 : DR14, DRU, DQ301, DQ5031
B-LCL hétérologue 2 : DR7_, DR15, DQ602, DQ2 ; B-LCL hétérologue 3 : DR4,
DR11, DQ301, DQ303.
C- Les B-LCL autologues ont été incubées en présence de chloroquine (0,2 mM) lh à 37°C puis induits (B-LCL*) 3 jours par TPA (20μg/ml) + BA (3mM). D-Les BLCL autologues ont été incubées en présence de chloroquine (0,2 mM) et chargées avec le PlOO (lOμg/ml) lh à 37°C).
On se référera également à la section Matériels et méthodes ci-dessous pour la suite de la description.
Matériels et méthodes
- Préparation de peptides dérivés de ZEBRA :
Les peptides décrits ci-dessous ont été synthétisés en utilisant l'appareil Synergy de Applied Biosystems, et purifié pour obtenir une pureté supérieure à 90 %. Les peptides PlOO and P104 correspondent aux acides aminés 75-88 and 184-195 de la protéine ZEBRA (243 acides aminés).
Région N-terminale de ZEBRA : peptide PlOO (75-88) FSAPQPAPENAY (SEQ ID n° 2) peptide P99 STAPTGSWFSAP (SEQ ID n° 3) peptide PI 01 ENAYQAYAPQLF (SEQ ID n° 4)
Région C-terminale de ZEBRA : peptide P 102 LEIKRYKNRV AS (SEQ ID n° 5) peptide PI 04* (184-195) VASRKCRAKFKQ (SEQ ID n° 6)
*Bogedain et al (1995) Spécifie cytotoxic lymphocytes recognize the immediate- early transactivator Zta of Epstein-Barr Virus. Journal of Virology 69 : 4872- 4879.
- Séparation des cellules mononuclées:
Les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) d'un donneur (VA : HLA/ A2,24 B 14,62 - DR14,7 - DQ5,2) au stade d* infection primaire à EBV ont été séparées sur gradient de Ficoll (d = 1,077). Le sang des donneurs est dilué (1:1) en milieu de Hanks et déposé en gradient, puis centrifugé à 800g à température ambiante pendant 20 minutes, enfin lavé 3 fois en Hanks à 150g.
- Obtention des lignées lymphoblastoïdes (B-LCL ou B/EBV)
Les lignées lymphoblastoïdes ont été obtenues en infectant les PBMC par la souche EBV B95/8 en présence de cyclosporine A (20 μg/ml), puis maintenues en culture en milieu complet : RPMI1640 contenant 1% V/V d'acides aminés non essentiels, 1 mM de pyruvate de sodium, 0.25 mM de β-mercaptoéthanol, 2 mM L-Glutamine, 100 Ul/ml pénicilline, 0.1 mg/ml streptomycine, 0.25 μg/ml amphotéricine B, et 10% V/V de Sérum de Veau Foetal (SVF) Afin d'induire le cycle lytique d'EBV et l'expression de ZEBRA, les B-LCL sont traitées en présence de l'ester de phorbol TPA (20 ng/ml) et de butyrate de sodium (3 mM) pendant 3 jours.
- Obtention des clones lymphocytaires T:
3 X 106 PBMC sont mises en culture en présence de 10 μg/ml de peptide PlOO. Après 7 jours d'incubation les blastes T sont séparés en gradient discontinu de Percoll (0 - 90%) puis sont clones en dilution limite en plaque 96-puits (0,5 et 1 cellule par puits) en présence de PBMC hétérologues (5.104 cellules / puits) préalablement traitées à la mitomycine C (25 μg/ml) pendant 30 minutes à 37°C et de phytohémagglutinine PHA (2μg/ml). Après 3 jours les clones T sont transférés en plaques 24-puits, puis cultivés en milieu complet supplémenté en IL-2 (100 UI / ml) et réactivés toutes les 4 semaines en présence de PHA (2 μg/ml), de PBMC hétérologues et d'IL-2 (100 UI / ml). Les cultures sont placées en incubation à 37°C, 5% CO2.
- Analyse des marqueurs membranaires : 2.105 clones de cellules T ont été lavés avec une solution HANKS à la température de la glace, et le culot a été resuspendu dans 20 μl d'anti CD4 conjugué FITC et d'anti-CD8 conjugué avec la Phycoérythrine (Simultest Immunotech, Marseille, France) pendant 30 minutes sur glace. Après lavage, l'expression cellulaire de CD4 and CD8 a été analysé en utilisant un microscope conventionnel à épifluorescence.
EXEMPLE 1 : Test de prolifération lymphocytaire
Les cellules présentatrices d'antigènes (CPA) choisies sont les suivantes : a) Les cellules B-LCL autologues ou allogéniques puisées avec les peptides synthétiques (PlOO ou P104) pendant 1 h à 37°C et lavées une fois avec le milieu complet pour rincer les peptides non liés, b) Les cellules B-LCL autologues ou allogéniques activées (pendant 3 jours) avec TPA/BA (esters de phorbol : 12-0-tetradecanoylphorbol-13 acétate (TPA) et butyrate (BA)), c) Les cellules B-LCL autologues traitées pendant 1 h avec la chloroquine (0.2 mM) et puisées avec PlOO ou activées avec TPA / BA.
Les CPA (4.104 cellules / ml) ont été traitées avec 25 μg/ml de mitomycine C, lavées 3 fois dans un milieu complet, puis incubées dans des plaques-96 puits pendant 3 jours en présence de clones de cellules T CD4+ (1,2.105 cellules/puits) dans 200 μl de milieu complet. Les noyaux des cellules ont été incubés pendant 16 h avec 1 μCi de H-Thymidine. Les cellules ont ensuite été récoltées en utilisant un « cell harvester » (Inotech EG and G), et la radioactivité incorporée dans l'ADN a été quantifiée par un compteur β. Les puits ont été testés en triple et les résultats sont exprimés en cpm moyen. L'index de stimulation (SI) a été calculé comme étant le ratio entre les cpm obtainus en présence du peptide and les cpm obtenus sans le peptide.
Résultats
On a déterminé la reconnaissance de peptides synthétiques dérivés de ZEBRA par les lymphocytes humains (provenant de sujets infectés par EBV) à l'aide du test de prolifération lymphocytaire décrit ci-dessus. Les cellules lymphocytaires sont mises en présence des peptides et les cellules reconnaissant des motifs antigéniques prolifèrent. Les cellules sont issues des lymphocytes mémoires (préalablement sensibilisés au virus EBV et donc à la protéine antigénique
ZEBRA) capables de se multiplier et de développer un rôle effecteur dans la défense anti-EBV.
Les résultats des essais, exprimés en pourcentage de prolifération lymphocytaire par rapport à un témoin, sont résumés dans le tableau suivant:
(% = Δcpm essai/Δtémoin)
De tels résultats mettent en évidence deux motifs antigéniques (peptide PlOO et PI 04) susceptibles de stimuler l'immunité contre EBV et pouvant présenter les caractéristiques d'un immunogène dans un vaccin, seuls ou associés avec d'autres antigènes viraux comme adjuvant.
Exemple 2 : Test de cytotoxicité mettant en oeuvre la Bréfeldine A.
L'activité cytotoxique des clones a été déterminée selon le procédé objet de la présente invention.
Le protocole du procédé dérive du test 51Cr avec un ratio E/T de 5/1. En l'espèce, 1.106 cellules cibles ont été marquées pendant 16 h avec 100 μCi 51Cr dans un milieu RPMI complet, lavées à deux reprises en milieu complet, et resuspendues à 5.104 cellules/ml. Les cellules cibles sont : i) Les cellules B-LCL autologues (contrôle 1),
ii) Les cellules B-LCL autologues puisées pendant 1 h à 37°C avec 10 μg/ml du peptide susceptible d'être immunogène que l'on souhaite identifié
(PlOO dans le cas d'espèce) (contrôle 2), iii) Les cellules B-LCL autologues traitées avec la Bréfeldine A (de préférence 10 μg/ml) pendant 1 h à 37°C, et puisées pendant 1 h à 37°C avec 10 μg/ml du peptide susceptible d'être immunogène que l'on souhaite identifié (PlOO dans le cas d'espèce).
Les peptides non-liés ont été rincés, et les cellules ont été resuspendues et adjustées comme décrit ci-dessus. Les cellules cibles ont été co-incubées avec les cellules effectrices pendant 4 h à 37°C dans des plaques à puits dont le fond est rond (round-bottom-well plates). lOOμl de supernageant ont été récupérés à partir de chaque puits et la radioactivité a été mesurée par un compteur γ. Tous les tests ont été effectués en triple. Le pourcentage de cytotoxicité a été déterminé par la formule suivante : lOOx [(relargage expérimental - relargage spontanné) / (relargage maximum - relargage spontanné)].
Le relargage maximum a été déterminé par la lyse des cellules cibles avec 1% de SDS. Le relargage spontanné a été measuré à partir des cellules cibles dans le milieu sans cellules effectrices.
Les cellules cibles ont été incubées avec un anticorps anti-CMH I (W6/32) ou un anticorps anti-CMH II (L243). L'utilisation d'un panel de B-LCL correspondant à l'un ou l'autre des marqueurs HLA comme cibles a permis de déterminer la restriction HLA de la reconnaissance cellulaire de PlOO.
Résultats :
On a établi des clones lymphocytaires T humains à partir des PBMC d'un donneur avec infection primaire (MNI) porteur d'anticorps anti-ZEBRA (IgM), HLA : A2, A24, B14, B62, DR14, DR7, DQ5, DQ2.
Les lymphocytes T du donneur ont été activés respectivement par des peptides synthétiques dérivant de la protéine ZEBRA : peptides PlOO et PI 04 (peptides sélectionnés par la réponse sérologique à l'exemple 1 ci-dessus). Après séparation des blastes T sur gradient de Percoll, un clonage en dilution limite est effectué en présence de PBMC hétérologues traitées à la mitomycine C et d'un mitogène (PHA).
Ce clonage nous a permis d'obtenir 100 clones, la spécificité des clones a été démontrée (figures 1 et 2 ). Le caractère cytotoxique est mesuré par la lyse de cellules autologues (B/EBV : lymphocytes B autologues transformés par EBV) traitées par TPA et BA induisant le cycle lytique et ainsi l'expression de ZEBRA.
Il ressort de cette expérience que la Bréfeldine augmente considérablement la reconnaissance par les cellules T du peptide PlOO, lorsque celui-ci est chargé sur des lignées B/EBV non induites. Les tests de spécificité sont illustrés sur les figures 1A et 1C, les tests de définition de restriction sur la figure 1E.
Le caractère proliférant de deux clones (El 1 et Cl 2) a été étudié par des tests de réponse lymphoproliférative vis à vis des antigènes présentés par les B/EBV autologues (DR14,7), ou des B/EBV hétérologues (HLA : DR11.14 - DQ3,5 et DR7,15 - DR4,11) (figures 2B et 3B). La prolifération de ces deux clones est abolie après traitement des cellules présentatrices par la chloroquine (antibiotique bloquant la voie d'endocytose d'apprêment antigénique) (figures 2C et 3C). Les tests de spécificité sont illustrés en figure 2A et 3A.
Ainsi, les 2 clones CD4 reconnaissent le peptide PlOO de ZEBRA (région N- terminale: FSAPQPAPENAY (SEQ ID n°2) à la fois dans le contexte des cellules autologues et des cellules hétérologues choisies exprimant en commun l'haplotype HLA DR7: la reconnaissance de ZEBRA est donc restreinte par la molécule de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité : DR7.
Un clone CD8+ CTL a également été produit. Ce dernier reconnaît spécifiquement la région N-terminale mentionnée ci-dessus. Cette région riche en proline apparaît ainsi comme dominante pour la reconnaissance. Le peptide PlOO, qui est donc capables de déclencher une réponse cytotoxique (CYT) et proliférative (PROL), met en exergue un motif antigénique particulièrement intéressant sur le plan immunitaire:
- Réponse IgM forte,
- Réponse lymphocytaire CYT et PROL.
Claims
1. Procédé de criblage de peptides immunogènes comprenant les étapes suivantes : a) chargement d'un ou de plusieurs peptide(s) susceptible(s) d'être immunogène(s) dans des cellules présentatrices d'antigènes (CPA), sélectionnées notamment parmi des lignées lymphoblastoïdes (LCL), les lymphocytes B infectés par EBV (B/EBV) et les cellules dentritiques, b) traitement des CPA par la Bréfeldine A, c) incubation desdites CPA avec des clones de Lymphocytes T cytotoxiques
(CTL) provenant de patients atteints d'un cancer ou infectés par un agent pathogène, notamment par un virus, d) détermination de la lyse spécifique desdites CPA par les CTL, et identification des peptide(s) immunogène(s).
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on traite lesdites CPA par la Bréfeldine A avant le chargement d'un ou de plusieurs peptide(s) susceptible(s) d'être immunogène(s).
3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que les peptides sont des antigènes exogènes stimulant les compartiments CD8 et CD4 des défenses immunitaires.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que les CPA sont traités avec la Bréfeldine A à une concentration comprise entre 1 et 100 μg/ml, de préférence 10 μg/ml.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 comprenant une étape préliminaire de séparation et/ou de purification desdits peptides de manière à charger des fractions de peptides dans les CPA.
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que lesdites fractions proviennent de la digestion par une ou plusieur(s) protéase(s) d'une protéine d'intérêt.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 permettant l'identification de motifs immunogéniques minimum.
8. Peptides immunogènes susceptibles d'être obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 7.
9. Peptides selon la revendication 8 caractérisé en ce qui s'agit de peptides dérivés de la protéine ZEBRA du virus EBV.
10. Composé peptidique dérivé de la protéine ZEBRA du virus EBV caractérisé en ce qu'il comprend au moins la séquence en acides aminés suivante :
-X1-P-X2-P-X3-P-X4- (SEQ ID n°l) dans laquelle Xi est -Aι-A2-A3. , Ai étant choisi parmi F, Y, W, A2 parmi S, T, Y, et A3 parmi G, A, V, L, I,
X2 est sélectionné parmi Q, N, E, D, X3 est sélectionné parmi G, A, V, L, I,
X est -Bι-B2-B3.B4- , Bj étant choisi parmi E, D, N, Q, B2 parmi N, Q, D, E, B3 parmi G, A, V, L, I, et B4 parmi F, Y, W,
Xi, X , X , et X , AI, A2, et A3, et B\, B2, B3 et B étant choisis indépendamment les uns des autres.
1 1. Composé peptidique selon la revendication 10 caractérisé en ce que Xi est -F- S-A.
12. Composé peptidique selon l'une des revendications 10 et 1 1 caractérisé en ce que X2 est Q.
13. Composé peptidique selon l'une des revendications 10 à 12 caractérisé en ce que X3 est A.
14. Composé peptidique selon l'une des revendications 10 à 13 caractérisé en ce X-. est -E-N-A-Y-.
15. Composé peptidique selon l'une des revendications 10 à 14, caractérisé en ce qu'il s'agit du composé peptidique PlOO de séquence -F-S-A-P-Q-P-A-P-E-N-A- Y- (SEQ ID n°2).
16. Composition pharmaceutique comprenant au moins un composé peptidique selon l'une des revendications 10 à 15 en quantité efficace pour stimuler les défenses immunitaires contre EBV et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
17. Composition selon la revendication 16 caractérisée en ce que le véhicule pharmaceutique est compatible avec une administration IV, subcutanée, orale, ou nasale.
18. Composition pharmaceutique selon la revendication 17 caractérisée en ce que le véhicule pharmaceutique est notamment un liposome, une nano-particule, ou une émulsion lipidique, chargé(e) positivement ou négativement.
19. Produit de combinaison comprenant au moins un composé peptidique selon l'une des revendications 10 à 15 et au moins un autre composé peptidique dérivé des protéines de EBV, en particulier de ZEBRA, de préférence le composé peptidique PI 04 de la séquence SEQ ID n°6 pour une utilisation simultanée, étalée, ou séparée dans le temps.
20. Produit de combinaison comprenant au moins un composé peptidique selon l'une des revendications 10 à 15 et au moins un agent modulant les défenses immunitaires, tels que les cytokines et/ou les lymphokines, notamment sélectionné parmi IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IF-γ et TNF, pour une utilisation simultanée, étalée, ou séparée dans le temps.
21. Produit de combinaison comprenant au moins un composé peptidique selon l'une des revendications 10 à 15, au moins un autre composé peptidique dérivé des protéines de EBV, en particulier de ZEBRA, de préférence le composé peptidique PI 04 de la séquence SEQ ID n°6, et au moins un agent modulant les défenses immunitaires, tels que les cytokines et/ou les lymphokines, notamment sélectionné parmi IL-2, IL-6, IL- 10, IL- 12, IL-15, IF-γ et TNF, pour une utilisation simultanée, étalée, ou séparée dans le temps.
22. Utilisation d'un composé peptidique selon l'une des revendications 10 à 15 ou d'un produit de combinaison selon l'une des revendications 19 à 21 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des maladies induites par EBV.
23. Utilisation selon la revendication 22 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des cancers induits par EBV.
24. Utilisation selon la revendication 23 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention du lymphome de Burkitt, du carcinome du nasopharynx, et/ou de la maladie de Hodgkin.
25. Utilisation d'un composé peptidique selon l'une des revendications 10 à 15 ou d'un produit de combinaison selon l'une des revendications 19 à 21 pour la préparation d'un vaccin pour stimuler les défenses immunitaires contre EBV.
26. Utilisation selon l'une des revendications 25 pour traiter et/ou prévenir la réactivation de EBV chez des patients immunodéprimés, notamment chez des patients atteints du SIDA, qui ont subi un radiothérapie ou qui sont traités par des immunodépresseurs notamment à la suite d'une transplantation d'organe.
27. Utilisation d'un composé peptidique selon l'une des revendications 10 à 15 ou d'un produit de combinaison selon l'une des revendications 19 à 21 pour la préparation ex vivo de CPA chargées en composés peptidiques immunogènes.
28. Utilisation selon la revendication 27 pour la préparation de cellules choisies parmi les cellules dendritiques, LCL, B/EBV.
29. Utilisation de la Bréfeldine A pour augmenter l'effet de présentation de peptides immunogènes par les CPA.
30. Utilisation de la Bréfeldine A pour la préparation ex vivo de CPA chargées en composés peptidiques immunogènes, de telle sorte que l'effet de présentation de peptides immunogènes chargés dans des CPA est augmenté.
31. Utilisation selon l'une des revendications 29 et 30 caractérisée en ce que lesdites CPA sont traitées par la Bréfeldine A à une concentration comprise entre 1 et 100 μg/ml, de préférence 10 μg/ml.
32. Utilisation selon l'une des revendications 29 à 31 pour la préparation ex vivo de CPA chargées en composés peptidiques selon l'une des revendications 10 à 15 destinées au traitement des maladies induites par EBV.
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