CN102016586A - 源自zebra蛋白的合成肽用于eb病毒(ebv)再激活的体外诊断的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了源自ZEBRA蛋白的多肽，或者所述多肽的变体或同种型用于体外和离体筛选受试者的生物学样品中EBV病毒再激活的用途，所述受试者受到与EBV感染相关的病理学状态影响。

Description

源自ZEBRA蛋白的合成肽用于EB病毒(EBV)再激活的体外诊断的用途
本发明涉及源自ZEBRA蛋白的合成肽用于EB病毒(EBV)再激活的体外诊断的用途。本发明特别涉及用于测定IgG抗体水平以便诊断EBV再激活的方法。
EB病毒(EBV)是在人B淋巴细胞中建立潜伏感染，有效地将所述细胞转化为类淋巴母细胞系(LCLs)的γ-疱疹病毒，并且牵涉传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金病、鼻咽癌(NPC)和免疫受损个体中的淋巴组织增生性疾病的病因学(Epstein MA和Crawford DH，2005；Klein G，2005；Cohen JI，2005)。
虽然原发感染常常伴随有自限性的临床病患期，但长期潜伏是无症状的。在激活后，病毒基因的转录从潜伏期转换成裂解期，这导致增强的复制和病毒产生。该病毒能够采取4个潜伏程序(潜伏期0、I、II和III)。
在健康个体中，潜伏性EBV感染看起来主要局限于静止的记忆B细胞(Babcock等人，1998)。在这些细胞中一致检测出的仅有的EBV基因产物是(i)潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A/2B，(ii)EBNAs(EB核抗原)，这限定了目前称为潜伏期的基因表达模式(Thorley-Lawson等人，1996)。
在伯基特淋巴瘤活组织检查中，仅EB病毒核抗原1(EBNA1)被表达(潜伏期I)。在霍奇金病、NPC和T细胞淋巴瘤中，EBNA1以及潜伏膜蛋白家族的三个成员(LMP1、LMP2A和LMP2B)的各种组合被表达(潜伏期II)。在急性传染性单核细胞增多症期间，在免疫受损个体中的淋巴组织增生性综合征之中以及在体外建立的LCLs之中，所有6种核抗原(EBNA1-6)都被表达(潜伏期III)。此外，所有3种LMPs都被表达。被EBV感染的细胞系要么对于病毒颗粒而言是完全非生产性的，要么包含小亚群的已从感染的潜伏阶段自发转换入裂解周期的细胞。
转换的机制未充分了解，但在病毒基因表达中首先可检测的变化之一是EBV立即早期基因BZLF1的激活，所述BZLF1编码裂解转换反式激活蛋白ZEBRA(Flemington等人，1991)。然后，ZEBRA，与BRLF1基因的蛋白质产物一起，起始裂解周期级联(Feederle等人，2000)。
EBV-阳性的成人(免疫学上健康的或免疫抑制的)呈现出相同水平的EBV病毒裂解性复制(Hong等人，2005；Montone等人，1996)。病毒的这种活跃复制可能是终生持续所需的。
尽管免疫活性个体可以限制被EBV感染的细胞的增殖，并且常常展现出标准化的血清学特性谱，但是具有先天性或获得性免疫缺陷的个体对于与EBV相关的淋巴组织增生是高度易感的。
ZEBRA蛋白(SEQ ID NO 6)是转录因子并且包含3个功能结构域，所述3个功能结构域由反式激活蛋白结构域(氨基末端部分)、DNA结合结构域和二聚化结构域(在该蛋白质的羧基末端部分处)组成。
ZEBRA是高度免疫原性蛋白质，并且包含许多可能被抗体识别的表位。
某些研究公开了ZEBRA蛋白用于检测EBV再激活的用途：
Drouet等人(Drouet等人，1999)公开了ZEBRA蛋白用于霍奇金病检测的用途。ZEBRA允许以剂量依赖性方式检测患者血清中针对ZEBRA的抗体。
Touge等人(Touge等人，2006)和Tedeschi等人(Tedeschi等人，2006)分别公开了使用ZEBRA以检测罹患葡萄膜炎或白血病的患者中的EBV再激活。
Dardari等人(Dardari等人，2001)公开了使用ZEBRA以及p54和p138蛋白以用于增强EBV再激活。
尽管所有前述文件公开了使用ZEBRA蛋白来检测EBV再激活的方法，但是这些文献中没有一个提及ZEBRA的片段可以用于提供用于检测EBV再激活的方法。
在ZEBRA表位中，已鉴定出了2种包含ZEBRA的主要免疫原性区域的主要多肽，P130 ZEBRA和P125 ZEBRA。P130 ZEBRA相应于ZEBRA蛋白的氨基酸157-195，而P125相应于ZEBRA蛋白的氨基酸59-93。
在感染过程期间产生的抗体之中，在称为EBV再激活的特定过程期间检测出针对ZEBRA蛋白而产生的抗体(Maréchal等人，1993；Joab等人，1991；Brousset等人，AIDS 1994)。
早在该病毒自身于1964年被发现之前，血清学已成为在诊断EBV感染中的重要帮助。EBV感染产生针对结构和非结构的各种抗原的广泛多样的抗体(Henle W和Henle G，1981)。
在感染过程中，针对不同EBV抗原的抗体的水平将会上升并随后下降，这提供了关于感染阶段的有价值的信息。患者免疫系统方面的个体差别意味着，在给定时间处没有人将会产生完全相同的抗体谱。但是，在感染过程期间的抗体产生的顺序是足够一致的，从而提供有用的诊断信息。
在与EBV相关的病理学状态的血清学诊断期间以及在对于形成与EBV相关的病理学状态具有易感性的患者(免疫抑制的患者和受到与EBV感染相关的瘤形成影响的患者)的随访期间，抗-ZEBRA抗体的出现是重要事件。
某些工作已描述了P130和P125，以及其免疫原性特性的用途，它们作为关于EBV感染检测和在与EBV感染相关的病理学状态进展期间的诊断和预后标志物。
WO96/21155公开了用于测定在原发EBV感染期间P130 ZEBRA蛋白的存在或不存在的方法。该文献仅记述了在该疾病的最初步骤期间使用P130，但不是在该病患的随后反弹例如EBV再激活期间使用P130。
Dardari等人(Dardari等人，2007)描述了P125和P130 ZEBRA蛋白在鼻咽癌(NPC)期间的预后意义。这篇文章证实了，在具有NPC的患者(无论其年龄如何)中，针对P125的抗体比针对P130的抗体更多地存在。然而，这篇文章并未描述其他EBV蛋白作为预后标志物的用途。
WO00/55622记述了包含特别是P100 ZEBRA蛋白的药物组合物，其用于预防EBV病毒感染，和用于预防病理学状态例如伯基特淋巴瘤、霍奇金病和鼻咽癌的形成。
迄今为止，还没有这样的方法，其允许有效和快速地检测被EBV病毒感染的健康患者或者受到与EBV感染相关的病理学状态影响的患者中的EBV再激活。
本发明基于下述出人意料的观察结果：针对P100 ZEBRA蛋白的IgG抗体比针对P130或来自EBV病毒的任何其他蛋白质(例如EBNA、VCA和EA蛋白)的抗体更快速地出现。特别地，本发明人已令人惊讶地发现，P100 ZEBRA多肽是能够用于检测在EBV再激活期间产生的抗体的非常有效的免疫原性多肽。
本发明的目的是提供用于检测患者中在与EBV再激活相关的病理学状态期间的针对EBV ZEBRA蛋白的IgG抗体的方法。
本发明涉及至少一种源自ZEBRA蛋白的多肽用于体外和离体筛选受试者的生物学样品中EBV病毒再激活的用途，所述受试者受到与EBV感染相关的病理学状态影响，所述多肽至少包含由SEQ ID NO 1所示的下述氨基酸序列。
在本发明中，由SEQ ID NO 1所示的所使用的多肽通过下述序列来定义：-X1-P-X2-P-X3-P-X4-，其中：
-X1可以表示除了脯氨酸之外的氨基酸，或者任意2个连续氨基酸至任意19个连续氨基酸的序列，其中最后一个氨基酸不是脯氨酸，
-X2和X3可以彼此独立地表示除了脯氨酸之外的选自已知氨基酸的氨基酸，
-X4可以表示除了脯氨酸之外的氨基酸，或者任意2个连续氨基酸至任意12个连续氨基酸的序列，其中第一个氨基酸不是脯氨酸。
根据本发明，氨基酸选自20种天然氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。根据本发明，每种氨基酸也可以选自非标准氨基酸：硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸和瓜氨酸。非标准氨基酸通常通过对标准氨基酸进行修饰而形成。根据本发明，氨基酸还可以相应于高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸和羟脯氨酸。
本发明还涉及至少一种多肽的变体或同种型的用途，所述至少一种多肽的特征在于它包含由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。
当所述多肽相应于氨基酸序列SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7(其相应于其中N-末端处的24个氨基酸已被删除的SEQ ID NO 6)时，本发明不涉及这种多肽用于体外和离体筛选受试者的生物学样品中EBV病毒再激活的用途。
本发明的一个实施方案涉及源自ZEBRA蛋白的多肽用于体外和离体筛选受试者的生物学样品中EBV病毒再激活的用途，所述受试者受到与EBV感染相关的病理学状态影响，所述多肽至少包含下述氨基酸序列：-X1-P-X2-P-X3-P-X4-，其中：
X1是-A1-A2-A3，其中A1选自F、Y、W，A2选自S、T、Y，并且A3选自G、A、V、L、I，
X2选自Q、N、E、D，
X3选自G、A、V、L、I，
X4是-B1-B2-B3-B4-，其中B1选自E、D、N、Q，B2选自N、Q、D、E，B3选自G、A、V、L、I，并且B4选自F、Y、W、X1、X2、X3。
相应于P125 ZEBRA多肽的多肽如SEQ ID NO 4所示。P125多肽包含在ZEBRA蛋白中，并且相应于ZEBRA蛋白的氨基酸59-93。
当多肽SEQ ID NO 1是P125 ZEBRA多肽时，X1、X2、X3和X4被定义为例如：
X1：GQLTAYHVSTAPTGSWFSA，如SEQ ID NO 2所示，和
X4：ENAYQAYAPQLF，如SEQ ID NO 3所示，
X2：Q，和
X3：A。
在本发明的另一个特别的实施方案中，多肽-X1-P-X2-P-X3-P-X4-相应于P100 ZEBRA多肽，如SEQ ID NO 5所示。P100 ZEBRA多肽相应于ZEBRA蛋白的氨基酸75-86。因此，所使用的多肽的氨基酸序列为-F-S-A-P-Q-P-A-P-E-N-A-Y-。
根据本发明，还可以修饰至少包含由SEQ ID NO 1所示的下述氨基酸序列的源自ZEBRA蛋白的多肽，以便嫁接允许检测或锚定所述源自ZEBRA蛋白的多肽的分子或化合物。
例如，此类分子或化合物可以是生物素、链霉抗生物素蛋白、蛋白质标签、荧光分子……，所述分子或化合物是技术人员常用的。
因此，根据本发明的另一种特定多肽如氨基酸序列SEQ ID NO 8(-F-S-A-P-Q-P-A-P-E-N-A-Y-G-S-K-)所示，其相应于其中在P100序列的C-末端处添加有肽G-S-K的P100多肽(SEQ ID NO 5)。
根据本发明，术语“多肽”和“肽”意指蛋白质的片段，其由至少2个氨基酸构成。扩展开来，“ZEBRA蛋白的多肽”意指ZEBRA蛋白的片段，其由至少SEQ ID NO 1构成。
根据本发明，“变体”被定义为不同于参照多肽但保留了基本特性的多肽。变体和参照多肽共享相似的氨基酸序列，具有例如90％的氨基酸同一性，优选地95％的氨基酸同一性，和更优选地99％的氨基酸同一性。
根据本发明，“同种型”被定义为具有基本的保守特性的不同于参照多肽的多肽，所述同种型由由于相同基因的可变剪接而产生的基因产物所编码，或者由由于其序列已趋异的几种同源基因的表达而产生的产物所编码。
本发明的使用使得能够测定在来自受试者的生物学样品中针对上述ZEBRA多肽的IgG抗体的存在或不存在。
在一个实施方案中，本发明还涉及至少一种源自ZEBRA蛋白的多肽用于体外和离体筛选受试者的生物学样品中EBV病毒再激活的用途，所述受试者受到与EBV感染相关的病理学状态影响，其中与EBV感染相关的病理学状态选自：对于免疫受损宿主而言特异的肿瘤、免疫活性宿主的肿瘤和与EBV有关的病毒综合征。
本发明的生物学样品是体液，优选地血液或血浆。体液任选地可以是唾液、尿液或淋巴液。本发明中可以考虑任何其他体液。
根据本发明，与EBV感染相关的病理学状态被定义为这样的病理学状态，在其期间EBV病毒存在于病毒宿主细胞中。
三个不同步骤呈现出EBV病毒感染：原发感染、潜伏阶段和再激活。根据本发明，与EBV感染相关的病理学状态优选地描述病毒再激活，但不排除潜伏阶段。然而，本发明不涵盖相应于EBV病毒原发感染的病理学状态。
受到与EBV感染相关的病理学状态影响的受试者形成本领域技术人员众所周知的该病患的特征性症状。该病患的特征性症状通过该病患的病理生理学和临床知识来确定(Henle W和Henle G，1981)。
在本发明中，术语“病理学状态”、“病患”、“疾病”和“恶性”一律用于定义损害机体功能的生物体的异常状态。
在本发明中所描述的病理学状态涉及EBV感染。更具体而言，它们涉及与免疫系统病症(导致对机会感染的易感性)相关的病理学状态。
-在本发明中定义的对于免疫受损宿主而言特异的肿瘤包括B-细胞淋巴组织增生性疾病和平滑肌细胞瘤。
-在本发明中定义的免疫活性宿主的肿瘤包括与单核细胞和上皮细胞的感染相关的病理学状态，例如霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤，以及非B-细胞例如T-细胞和NK-细胞淋巴瘤，以及鼻咽癌(NPC)。
本发明公开了用于体外和离体测定至少一种抗体的存在或量的方法，所述抗体特异性地识别多肽-X1-P-X2-P-X3-P-X4-(SEQ ID NO 1)或者所述多肽的变体或同种型，其中
-X1可以表示除了脯氨酸之外的氨基酸，或者任意2个连续氨基酸至任意19个连续氨基酸的序列，其中最后一个氨基酸不是脯氨酸，
-X2和X3可以彼此独立地表示除了脯氨酸之外的选自已知氨基酸的氨基酸，
-X4可以表示除了脯氨酸之外的氨基酸，或者任意2个连续氨基酸至任意12个连续氨基酸的序列，其中第一个氨基酸不是脯氨酸，
所述抗体可能存在于受到与EBV感染相关的病理学状态影响的受试者的生物学样品中。
根据本发明，该方法不涉及体外和离体测定至少一种特异性地识别P125 ZEBRA多肽(SEQ ID NO 4)或者多肽SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7的抗体的存在或量。
在一个优选的实施方案中，本发明公开了上述的用于体外和离体测定至少一种抗体的存在或量的方法，其中所述抗体特异性地识别多肽SEQ ID NO 1，其中：
X1是-A1-A2-A3，其中A1选自F、Y、W，A2选自S、T、Y，并且A3选自G、A、V、L、I，
X2选自Q、N、E、D，
X3选自G、A、V、L、I，
X4是-B1-B2-B3-B4-，其中B1选自E、D、N、Q，B2选自N、Q、D、E，B3选自G、A、V、L、I，并且B4选自F、Y、W、X1、X2、X3。
在一个优选的实施方案中，本发明公开了上述的用于体外和离体测定至少一种抗体的存在或量的方法，其中所述抗体特异性地识别多肽SEQ ID NO 5，其相应于P100 ZEBRA多肽。
根据本发明，至少一种抗体的存在的测定表明，如果可以在生物学样品中检测出抗体，那么该抗体被视为存在于该生物学样品中。相反地，如果通过本发明的方法不能检测出所述抗体，那么该抗体被视为不存在于该生物学样品中。
在本发明中，抗体被定义为由B-细胞产生的所有免疫分子：免疫球蛋白质(Ig)。因而，根据本发明，可以检测所有可溶性和不溶性免疫球蛋白质，例如IgG、IgM、IgA和IgD。根据本发明，优选地检测IgG抗体。
关于至少一种抗体的量的定量的测定，在本发明中是指测量所述抗体的数量。
使用传统定量方案来测量抗体的量，其中将抗体的量与至少两种对照样品相比较。这些对照样品体现为至少阴性样品和阳性对照样品。与抗体数量的测量相关的值在对照阴性样品中是零，而与抗体数量的测量相关的值在对照阳性样品中是正的。
因此，如果该抗体在该生物学样品中不存在，那么定量的值是零。另一方面，如果该抗体存在，那么定量的值大于零。
抗体的存在或量可以通过本领域常用的任何常规方案来测定。
根据本发明的方法，多肽被可能存在于受试者的生物学样品中的至少一种抗体特异性地识别。当抗体存在时，该识别被说成是特异性的，这意味着所述抗体仅与所述多肽或者所述多肽的变体或同种型相互作用，但不与另一种多肽相互作用。
本发明描述了允许在生物学样品中检测特异性地识别作为序列SEQ ID NO 1的肽的IgG抗体的方法。
在一个有利的实施方案中，本发明涉及用于在生物学样品中检测特异性地识别相应于SEQ ID NO 5的多肽或者其变体或同种型的抗体的方法。
在一个特定的实施方案中，本发明中所公开的方法包括至少两个步骤：
a.使来自患者的生物学样品与至少一种多肽相接触，所述至少一种多肽优选地为选自下列的多肽：SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 5，以及其变体和同种型。
b.检测所述多肽和可能存在于所述生物学样品中的抗体之间的免疫复合物的形成。
任选地，额外的步骤可以加入到该方法中。通过将所形成的免疫复合物的量与对照样品的所形成的免疫复合物的已知量相比较，该额外的步骤使得能够定量所形成的免疫复合物的量。这种定量可以根据常规方案来进行，例如将所形成的免疫复合物的值与已知免疫复合物的值相比较，所述已知免疫复合物的值定义了标准曲线。
根据本发明的方法不涉及体外和离体测定至少一种特异性地识别P125 ZEBRA多肽(SEQ ID NO 4)或者多肽SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7的抗体的存在或量。
术语“免疫复合物”(也称为“抗原-抗体复合物”)描述了由于表位(抗原)与针对该表位的抗体之间的相互作用而导致的结果。本发明中所涉及的所述抗原相应于作为氨基酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 5的前述多肽以及其变体或同种型。
用单克隆或多克隆抗体来进行所述免疫复合物的检测，所述单克隆或多克隆抗体特异性地识别可能存在于受试者的生物学样品中的所述抗体。这种识别是直接的。
在检测操作程序过程中，用于检测的抗体通常用标志物进行标记。用于标记抗体的标志物选自本领域技术人员常用的标志物，并且特别地选自放射性同位素标志物、酶、荧光试剂、发光试剂、磁性颗粒……。所形成的免疫复合物的这种检测用现有技术中已知的常规方法来进行，例如ELISA、免疫组织化学和细胞化学、免疫沉淀法、Western印迹和任何其他免疫学方法。优选的本发明的方法为ELISA和免疫层析。
本发明的方法在于使受试者的生物学样品与本发明的多肽相接触组成，所述生物学样品可能包含至少一种抗体，本发明的多肽即由氨基酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 5所示的多肽，以及其变体或同种型。
当受试者的所述生物学样品包含能够识别所述多肽的抗体时，可以形成免疫复合物。
这种免疫复合物通过使用特异性地识别生物学样品中所包含的抗体的抗体(也称为检测抗体)来检测。任选地，可以通过将所形成的免疫复合物的量与对照复合物的量相比较来定量这种免疫复合物。通过使用已知量的特异性地识别本发明的多肽的抗体而获得这些对照复合物。
因此，本发明的方法使得能够测定生物学样品是否包含针对本发明中所描述的多肽的抗体。那些抗体的存在允许测定，该生物学样品所来自的个体受到与EBV病毒再激活相关的病理学状态影响。
在一个优选的实施方案中，本发明公开了用于体外和离体测定至少一种抗体的存在或量的方法，其中将多肽固定在支持物上，优选地固定在微量滴定板上。
在一个优选的实施方案中，本发明描述了用于测定可能与上述多肽特异性地杂交的抗体的存在的方法，其中所述方法为ELISA测试。因此，将用于捕获生物学样品中所包含的抗体的多肽固定在支持物中。本领域技术人员常用的支持物是珠、平板……。更特别地，本发明中所使用的多肽优选地附着在微量滴定板的底部。
在一个优选的实施方案中，在本发明的方法中所描述的抗体的检测相应于可能存在于受试者的生物学样品中的抗体的Fc片段。
根据本发明，检测抗体可以与受试者的生物学样品中所包含的抗体的Fc链相互作用。
此外，本发明还公开了用于体外和离体测定受试者中EBV再激活的ELISA试剂盒，其包含固定在允许酶联免疫吸附测定法(ELISA)的支持物上的至少一种选自SEQ ID NO 1(其中X1选自除了脯氨酸之外的氨基酸，或者包含至少2-19个氨基酸的氨基酸序列，其中最后一个氨基酸不是脯氨酸；X2和X3彼此独立地相应于除了脯氨酸之外的氨基酸，其中第一个氨基酸不是脯氨酸；并且X4选自除了脯氨酸之外的氨基酸，或者包含至少2-12个氨基酸的氨基酸序列)或SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 8的多肽，以及其变体和同种型，所述支持物是本领域中所使用的常见支持物，例如珠、ELISA平板、微量滴定板……。
本发明中所公开的ELISA试剂盒还可以包含允许检测免疫复合物形成的材料。因而，前述试剂盒可以任选地包含，例如，识别人抗体的免疫球蛋白恒定链(Fc片段)的检测抗体。所述检测抗体用本领域常用的试剂进行标记，例如放射性同位素标志物、酶、荧光试剂、磁性颗粒……。
下面的实施例1-5和图1-2举例说明本发明。
图1表示P125 ZEBRA多肽以及其多肽P98、P99、P100和P101的氨基酸序列比对。编号基于ZEBRA全长蛋白质的编号。
图2表示具有EBV再激活的8位患者的血清学反应性特性谱。源自P125 ZEBRA多肽的多肽P98、P99、P100和P101已包被在微量滴定板上。通过测量405nm处的吸光度来测定免疫反应性。X轴分别表示P98(59-70)、P99(67-78)、P100(75-86)和P101(83-95)。Y轴表示在纳米下的相对吸光度。圆圈表示每位患者。
实施例1：与P98、P99和P101多肽相比较的P100反应性。
背景：
在先前的专利申请中，发明人已证实，源自P130 ZEBRA的肽对于测定患者中的EBV原发感染来说是有效的，和源自P125 ZEBRA的肽对于测定罹患鼻咽癌的患者中的EBV再激活来说是有效的。
为了简化免疫学测试并降低肽生产的成本，发明人分析了源自P125 ZEBRA的肽的免疫原性。从P125 ZEBRA肽产生了4种多肽，即P98、P99、P100和P101多肽。P98-P101和P125之间的序列比对显示在图1中。
通过ELISA测试而测试了来自具有EBV裂解周期的激活的患者的血清，以便测定P98-P101反应性。这些患者被视为受到EBV活动性感染影响，因为可以在它们的血清中检测出针对ZEBRA全长蛋白质的抗体。
ELISA：
以下述方式用抗原包被微量滴定板的孔：
-以100ng/100μl的比例(在50nM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6中稀释)将肽施加到每个孔中。
-使平板置于37℃下温育过夜。
-平板用磷酸盐-0.1％ Tween缓冲液(PBST)pH 7.4洗涤3次。
-以100μl/孔的比例将经稀释的血清施加到孔中。
-使血清在37℃下温育1小时，随后用PBST进行3次洗涤，
-添加100μl 抗-人IgG/过氧化物酶缀合物。根据制造商的说明书，稀释IgG/过氧化物酶缀合物(在PBST中)。
-使IgG/过氧化物酶在37℃下温育30分钟，随后用PBST进行洗涤。
-使用四甲基联苯胺(0.5％)和过氧化氢(0.05％)在柠檬酸盐缓冲液pH 4中的溶液(100μl/孔)进行过氧化物酶的可视化。反应持续时间为10分钟，避光。
-通过在每个孔中添加1N硫酸溶液来终止反应。
-在分光光度计中进行读数，并且在450nm处测量吸光度(A450)。
P98-P101多肽的免疫反应性在图2中指出。
说明：
根据上述ELISA来测试来自每位患者的血清。包含多肽P98、P99或P101的所有微量滴定孔都具有低水平的与8种测试血清的反应性(405nm处的吸光度低于0.5)。相反地，所有测试血清都具有高的与P100多肽的亲和力，并且呈现出相比于P98-P99和P101而言增加至7倍的吸光度。
因此，在P125 ZEBRA多肽中，仅P100多肽具有有效的对于抗-ZEBRA全长蛋白质的反应性。
实施例2：相比于EA、VCA和EBNA这些EBV抗原而言的P100的反应性。
背景：
在移植方案中，患者用免疫抑制疗法进行处理，以便促进植活并且使移植物排斥降到最低。
然而，在这些处理期间，由于免疫系统的效力降低，某些有着潜伏性EBV感染的患者具有EBV反应。
因此，EBV再激活随访在处于风险中的患者之中是必不可少的。
常用的体外诊断基于检测针对VCA、EA和EBNA这些EBV病毒蛋白质的抗体。
EBV病毒的再激活(或继发感染)通过针对一些下述的抗体的存在来定义：
-VCA(＞1∶320)，和
-EA(＞1∶40)。
这些抗体的存在可以与针对EBNA的抗体(＞1∶10)的存在(或预先存在，当已可能建立之时)同时检测到。
相反地，潜伏感染通过下述来定义：
-不存在抗-VCA IgM，以及
-不存在
-抗-EA IgG(＜1∶10)，
-抗-VCA IgG(＜1∶10)，和
-抗-EBNA IgG(＜1∶10)。
为了简化EBV再激活诊断并降低EBV再激活诊断的成本，在受到或未受到与EBV再激活相关的病理学状态影响的患者中评价抗-P100抗体的存在，并且与先前所使用的标志物(EBNA、EA和VCA)相比较。此外，还产生了抗-P100抗体的存在和患者的病理学状态之间的相关性。
患者：
测试了来自包括19位具有EBV再激活的患者(1-19)的患者组的血清，并且评价了针对EBV病毒的免疫原性肽的抗体的存在。
将血清在PBS(1M NaCl)-5％胎牛血清-0.1％ Tween缓冲液(PBSST)中稀释至1/100。
在来自下述的血清中进行抗-P100抗体和抗-ZEBRA抗体(其识别全长融合蛋白GST-ZEBRA)的检测：
-具有EBV再激活的移植患者(患者#1至#15)，
-具有EBV再激活的健康患者(#16至#19)，和
-具有潜伏感染的健康献血者(#20至#22)。
该测试用实施例1中所描述的ELISA来进行。
每种血清稀释物一式两份地进行测试，一方面针对肽抗原，和另一方面针对不含抗原的杯状凹孔(对照孔)。
因此，对于吸光度所采用的最终值是由于包含抗原的孔的平均吸光度和对照孔的平均吸光度(ΔA)之间的差异而产生的值。下表1阐明了22份不同血清的该测定法。
表1：在来自移植患者(具有EBV再激活)的血清中针对源自ZEBRA的多肽P100和GST ZEBRA的抗体的检测：(+)标明阳性反应性，(-)标明阴性反应性。
Figure BPA00001251216800151
说明：
在包括15位具有EBV再激活的移植患者的本组中，在使用ELISA P100 ZEBRA多肽的情况下，13位患者具有显著的反应性。仅2位患者(患者#5和患者#14)对于抗-EBV P100 ZEBRA抗体的存在具有阴性应答，尽管存在有抗-VCA、抗-EBNA和抗-EA抗体(其指示了EBV再激活)。
因此，通过使用P100 ZEBRA多肽来进行的EBV再激活检测给出了令人满意的结果，具有87％的效能。
由受到EBV再激活影响的健康患者提供的血清的P100 ZEBRA反应性给出了相似的结果，因为所有3位经测试的患者都是阳性的。
作为对照，健康献血者(具有EBV潜伏感染)具有不与P100 ZEBRA多肽反应的血清。
因此，P100 ZEBRA多肽可以容易地用于有效地在患者中检测EBV再激活，无论在或不在移植后。P100 ZEBRA肽是特异性的，因为它不与源于EBV阴性患者或源于具有EBV潜伏感染的患者的血清交叉反应。
实施例3：相比于抗-VCA、抗-EA和抗-EBNA抗体而言的抗-P100抗体的 动力学研究
背景：
EBV再激活的快速检测是快速管理患者的重要步骤。
迄今为止，仅研究了血清中EA抗体、VCA抗体和EBNA抗体的上升。众所周知，IgG检测在IgM检测之后。
因此，本发明人比较了抗-EA、抗-VCA和抗-EBNA抗体以及抗-P100ZEBRA抗体的动力学。
ZEBRA ELISA相应于实施例1中所描述的ELISA。
测试了2位患者，并且它们相应于2位进行移植的患者。在第0天(相应于移植方案开始时的那天)时收集血清样品。
在手术后，从10到120或210天依次反复地收集血清样品。
在120天(患者#1)或210天(患者#2)期间，评价抗-EA、VCA、EBNA和P100 ZEBRA IgG的存在。
结果在下表2中指出。
表2：两位移植患者的EBV活动性感染随访。(+)标明阳性反应性，(-)标明阴性反应性。
Figure BPA00001251216800171
说明：
患者#1：这位患者在手术前具有活动性EBV感染，因为在第0天时，显著检测出针对P130的IgM。
在手术后，用P100ZEBRA多肽在第20天时显著检测出EBV活动性感染，但用VCA多肽在第40天时才显著检测出EBV活动性感染。实际上，在第10天时，抗-VCA IgG抗体滴度对于诊断EBV活动性感染而言不是显著的，因为该值接近于阴性阈值。
在这个案例中，在通常采用的检测抗-EA、抗-EBNA和抗-VCA抗体前10天，P100 ZEBRA多肽给出了关于EBV活动性感染的显著结果。
患者#2：这位患者是在手术前无活动性EBV感染的患者，因为在第0天时，无法检测出针对P130的IgM抗体。
在手术后，用P100 ZEBRA多肽在第55天时显著检测出EBV活动性感染，但用VCA多肽在第90天时才显著检测出EBV活动性感染。实际上，在第55天时，抗-VCA IgG抗体滴度对于诊断EBV活动性感染而言不是显著的，因为该值接近于阴性阈值。
在这个病例中，在通常采用的检测抗-EA、抗-EBNA和抗-VCA抗体前30天，P100 ZEBRA多肽给出了关于EBV活动性感染的显著结果。
关于在两位移植患者手术后的随访的这些结果证实了相比于针对VCA、EA和EBNA的抗体而言抗-P100 ZEBRA抗体的检测的早实现。
实施例4：相比于EA、VCA、EBNA这些EBV抗原和P125而言的P100的 反应性。
测试了来自包括5位具有EBV再激活的患者(1-5)的组的血清，并且评价了针对EBV病毒的免疫原性肽的抗体的存在。
将血清在PBS(1M NaCl)-5％胎牛血清-0.1％ Tween缓冲液(PBSST)中稀释至1/100。
在来自下述的血清中进行抗-P100抗体和抗-P125抗体的检测：
-具有EBV再激活的患者(患者#1至#5)，和
-具有潜伏感染的健康献血者(#6)。
结果呈现在下表3中。
表3：在来自患者(具有EBV再激活)的血清中针对源自ZEBRA的多肽P100和源自ZEBRA的多肽P125的抗体的检测。(+)标明阳性反应性，(-)标明阴性反应性。
Figure BPA00001251216800191
说明：
在包括5位具有EBV再激活的患者的本组中，在使用ELISA P100ZEBRA多肽和P125 ZEBRA的情况下，所有患者都具有显著的反应性。
作为对照，健康献血者(具有EBV潜伏感染)具有不与P100 ZEBRA多肽显著反应的血清。
此外，P100 ZEBRA多肽允许比用P125多肽进行的检测明显更重大的EBV再激活检测(对于患者1的1.3x至对于患者4的2x)。
P100 ZEBRA肽是特异性的，因为它不与源于EBV阴性患者或源于具有EBV潜伏感染的患者的血清交叉反应。
因此，对于EBV再激活的检测来说，P100比P125更有效。
实施例5：使用经修饰的P100多肽(mP100；SEQ ID NO 8)的ELISA。
包括mP100多肽的该ELISA是下述的：
mP100在C-末端处是生物素化的。
包被：
将mP100多肽在PBS中或者在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(140mM K2CO3，240mM CaHCO3，pH9.5)中以终浓度20、10、5、2.5、1.25、0.62、0.31、0.155、0.0775μg/ml进行稀释。
使100μl每种稀释物沉积在平板的孔上，所述孔用链霉抗生物素蛋白进行包被。使平板在湿润的气氛中在4-8℃下温育过夜。
洗涤：
在每个孔中添加PBS-0.05％ Tween，并且将孔洗涤3次。
饱和(封闭)
添加300μl/孔的PBS-0.05％ Tween-2％ BSA，并且使平板在37℃下温育1小时。
测试：
使经稀释的血清沉积在孔中，并且使平板在37℃下温育1小时30分钟。
作为对照，一式两份地将100μl的在PBS-0.05％ Tween-BSA(1％)-SVF(5％)中稀释1000倍的抗-P125单克隆抗体(1.45mg/ml)添加到孔中。
洗涤：
在每个孔中添加将PBS-0.05％ Tween，并且将孔洗涤3次。
二抗(山羊抗小鼠IgG(H+L)-碱性磷酸酶(AP))：
IgG在PBS-0.05％ Tween-BSA(1％)-SVF(5％)中作1/2000稀释(0.5％)。将100μl稀释物添加到每个孔中。使平板在37℃下温育1小时30分钟。
洗涤：
在每个孔中添加将PBS-0.05％ Tween，并且将孔洗涤3次。
揭示(pNPP)：
在二乙醇胺缓冲液(0.097M二乙醇胺，1μM MgCl2，pH 9.5)中准备pNPP(5mg/ml)。使用100μl/孔的二乙醇胺溶液。在黑暗中在30-90分钟期间进行显色。通过添加50μl的3N NaOH/孔来终止反应。
OD：
平板在405nm和620nm(参照)处进行读数。
用经修饰的P100肽获得了与在实施例1-4中用P100多肽所获得的那些相似的结果。
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Figure IPA00001251216300031
Figure IPA00001251216300041
Figure IPA00001251216300071

Claims (11)

1.至少一种源自ZEBRA蛋白的多肽用于体外和离体筛选受试者的生物学样品中EBV病毒再激活的用途，所述受试者受到与EBV感染相关的病理学状态影响，所述多肽至少包含下述氨基酸序列：
-X1-P-X2-P-X3-P-X4-(SEQ ID NO 1)，
其中：
X1选自除了脯氨酸之外的氨基酸，或者包含至少2-19个氨基酸的氨基酸序列，其中最后一个氨基酸不是脯氨酸，
X2和X3彼此独立地相应于除了脯氨酸之外的氨基酸，其中第一个氨基酸不是脯氨酸，
X4选自除了脯氨酸之外的氨基酸，或者包含至少2-12个氨基酸的氨基酸序列，
条件是，多肽-X1-P-X2-P-X3-P-X4-不是SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7。
2.根据权利要求1的至少一种源自ZEBRA蛋白的多肽的用途，所述多肽至少包含下述氨基酸序列：-X1-P-X2-P-X3-P-X4-(SEQ ID NO 1)，其中：
X1是-A1-A2-A3，其中A1选自F、Y、W，A2选自S、T、Y，并且A3选自G、A、V、L、I，
X2选自Q、N、E、D，
X3选自G、A、V、L、I，
X4是-B1-B2-B3-B4-，其中B1选自E、D、N、Q，B2选自N、Q、D、E，B3选自G、A、V、L、I，并且B4选自F、Y、W、X1、X2、X3。
3.根据权利要求1或2中任一项的源自ZEBRA蛋白的多肽的用途，其中所述多肽选自特征在于序列-F-S-A-P-Q-P-A-P-E-N-A-Y-(SEQ ID NO 5)的ZEBRA P100片段，和SEQ ID NO 8。
4.根据权利要求1-3中任一项的源自ZEBRA蛋白的多肽的用途，其中所述与EBV感染相关的病理学状态选自：对于免疫受损宿主而言特异的肿瘤、免疫活性宿主的肿瘤和与EBV有关的病毒综合征。
5.用于体外和离体测定至少一种抗体的存在或量的方法，所述抗体特异性地识别至少一种源自ZEBRA蛋白的多肽，所述多肽至少包含下述氨基酸序列：
-X1-P-X2-P-X3-P-X4-(SEQ ID NO 1)，
其中：
X1选自除了脯氨酸之外的氨基酸，或者包含至少2-19个氨基酸的氨基酸序列，其中最后一个氨基酸不是脯氨酸，
X2和X3彼此独立地相应于除了脯氨酸之外的氨基酸，其中第一个氨基酸不是脯氨酸，
X4选自除了脯氨酸之外的氨基酸，或者包含至少2-12个氨基酸的氨基酸序列，
所述抗体可能存在于受到与EBV感染相关的病理学状态影响的受试者的生物学样品中，条件是，多肽-X1-P-X2-P-X3-P-X4-不是SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7。
6.根据权利要求5的用于体外和离体测定至少一种抗体的存在或量的方法，其中所述抗体特异性地识别多肽SEQ ID NO 1，其中：
X1是-A1-A2-A3，其中A1选自F、Y、W，A2选自S、T、Y，并且A3选自G、A、V、L、I，
X2选自Q、N、E、D，
X3选自G、A、V、L、I，
X4是-B1-B2-B3-B4-，其中B1选自E、D、N、Q，B2选自N、Q、D、E，B3选自G、A、V、L、I，并且B4选自F、Y、W、X1、X2、X3。
7.根据权利要求4或5中任一项的用于体外和离体测定至少一种抗体的存在或量的方法，其中所述抗体特异性地识别多肽SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 8。
8.根据权利要求5-7中任一项的用于体外和离体测定至少一种抗体的存在或量的方法，所述方法包括下列步骤：
a.使来自所述患者的生物学样品与所述多肽相接触，
b.检测所述多肽和可能存在于所述生物学样品中的抗体之间的免疫复合物的形成，和
c.任选地，定量所形成的免疫复合物的量。
9.根据权利要求8的方法，其中将多肽固定在支持物上，优选地固定在微量滴定板上。
10.根据权利要求5-9的方法，其中所述检测通过使用能够检测所述抗体的Fc片段的抗体来进行。
11.用于体外和离体测定受试者中EBV再激活的ELISA试剂盒，其包含：
-固定在ELISA平板中的至少一种特征在于下列氨基酸序列的多肽：
·SEQ ID NO 1，其中X1选自除了脯氨酸之外的氨基酸，或者包含至少2-19个氨基酸的氨基酸序列，其中最后一个氨基酸不是脯氨酸；X2和X3彼此独立地相应于除了脯氨酸之外的氨基酸，其中第一个氨基酸不是脯氨酸；并且X4选自除了脯氨酸之外的氨基酸，或者包含至少2-12个氨基酸的氨基酸序列，或
·SEQ ID NO 5，或
·SEQ ID NO 8；以及
-任选地，识别人抗体的Fc片段的抗体。
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