CN109679975B - 一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因及其应用 - Google Patents

一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109679975B
CN109679975B CN201910062881.2A CN201910062881A CN109679975B CN 109679975 B CN109679975 B CN 109679975B CN 201910062881 A CN201910062881 A CN 201910062881A CN 109679975 B CN109679975 B CN 109679975B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bzlf1
lmp1
modified
fusion gene
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910062881.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109679975A (zh
Inventor
薛庆节
闫迎春
裴杰
黄烁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JINING MEDICAL UNIVERSITY
Original Assignee
JINING MEDICAL UNIVERSITY
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JINING MEDICAL UNIVERSITY filed Critical JINING MEDICAL UNIVERSITY
Priority to CN201910062881.2A priority Critical patent/CN109679975B/zh
Publication of CN109679975A publication Critical patent/CN109679975A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109679975B publication Critical patent/CN109679975B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开一种改造BZLF1和改造LMP1的融合基因及其应用，融合基因是将去除致癌基因、加入增强子的LMP1与去除庸余序列、加入增强子的BZLF1基因进行融合得到；将改造BZLF1和改造LMP1的融合基因序列引入pMVS穿梭质粒上，然后与BCG感受态细胞电转复苏后获得包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗；本发明构建的融合基因能够同时发挥LMP1和BZLF1基因诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用，从而协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞；本发明得到的转化BCG疫苗在预防结核病的同时，具有杀伤鼻咽癌细胞，很好的预防治疗肿瘤的作用。

Description

一种改造BZLF1和改造LMP1的融合基因及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体说是一种改造BZLF1和改造LMP1的融合基因及其应用。
背景技术
研究表明，EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）的感染与鼻咽癌、胃癌的发生关系密切，即刻早期基因（BZLF1）的表达可诱导病毒从潜伏期进入裂解期，所编码的蛋白是一种转录激活因子，EB病毒感染宿主细胞包括潜伏期和裂解期，在EB病毒阳性肿瘤细胞中，病毒一般处于潜伏期，其潜伏存在及其DNA与宿主细胞整合是导致肿瘤细胞发生的重要原因，人工诱导病毒由潜伏期进入裂解期，导致肿瘤细胞裂解死亡，有望成为治疗EB病毒相关肿瘤的新手段和新方法。将BZLF1重组后，感染EBV阳性肿瘤细胞，可以诱导肿瘤细胞中处于潜伏期的EB病毒进入裂解期，并开启病毒复制基质，导致EB病毒阳性肿瘤细胞裂解死亡，达到特异性杀伤肿瘤细胞的作用，但是现有的即刻早期基因（BZLF1）转录频率低，庸余序列多，影响了BZLF1的表达。
潜伏膜蛋白1（Latent membrane protein l，LMP1）是EB病毒编码的一种癌蛋白，能够组成激活各种信号通路，从而导致细胞生长不受控制，向癌细胞转化和对肿瘤的微环境造成影响，而羧基端功能区是LMP1癌基因的功能区，删除这个区域，LMP1将失去对B细胞转化的能力，对LMP1基因进行改造，去除其在致癌过程中起决定作用的C末端部分氨基酸，使其不再具有致癌性，但是仍然具有良好的免疫原性。
卡介苗（BCG）是由减毒牛型结核杆菌悬浮液制成的活菌苗，具有增强巨噬细胞活性，加强巨噬细胞杀灭肿瘤细胞的能力，活化T淋巴细胞，增强机体细胞免疫的功能，但是目前还未有研究将预防其他癌症的基因与其融合的报道，使卡介苗的功能单一。
如何将去除致癌部分基因、加入增强子的LMP1与去除庸余序列、加入增强子的BZLF1基因融合，并且增强机体的细胞免疫反应，同时发挥LMP1与BZLF1基因诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用，从而协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞是目前亟待解决的问题；此外，将该基因序列在现有疫苗中复制并表达，制备既能够预防、治疗鼻咽癌又具有较高安全性的转化BCG疫苗，达到一次接种预防两种疾病的目的也是我们亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种改造BZLF1和改造LMP1的融合基因及其应用。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种改造BZLF1和改造LMP1的融合基因，是将去除致癌基因、加入增强子的LMP1与去除庸余序列、加入增强子的BZLF1基因进行融合得到；
改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的基因序列为：
atg atggacccaa actcgacttc tgaagatgta aaatttacac ctgacccata ccaggtgccttttgtacaag cttttgacca agctaccaga gtctatcagg acctgggagg gccatcgcaagctcctttgccttgtgtgct gtggccggtg ctgccagagc ctctgccaca aggccagctaactgcctatcatgtttcaac cgctccgact gggtcgtggt tttctgcccc tcagcctgctcctgagaatgcttatcaagc ttatgcagca cctcagctgt tcccagtctc cgacataacccagaatcaacagactaacca agccggggga gaagcacctc aacctggaga caattctactgttcaaacagcagcagcagt ggtgtttgct tgccccgggg ctaaccaagg acaacagcta gcagacattg
gtgttccaca gcctgcacca gtggctgccc cggcacgacg cacacggaaaccacaacagccagaatcgct ggaggaatgc gattctgaac tagaaataaa gcgatacaagaatcgggtggcttccagaaa atgccgggcc aagtttaagc aactgctgca gcactaccgtgaggtggctgctgccaaatc atctgaaaat gacaggctgc gcctcctgtt gaagcagatgtgcccaagcctggatgttga ctccattatc cgccggacac cagatgtttt acacgaggat ctcttaaatttctaa atgga acacgacctt gagaggggcc caccgggccc gcgacggccc cctcgaggac cccccctctcctcttcccta ggccttgctc tccttctcct cctcttggcg ctactgtttt ggctgtacat cgttatgagtgactggactg gaggagccct ccttgtcctc tattcctttg ctctcatgct tataattata attttgatcatctttatctt cagaagagac cttctctgtc cacttggagc cctttgtata ctcctactga tgatcaccctcctgctcatc gctctctgga atttgcacgg acaggcattg taccttggaa ttgtgctgtt catcttcgggtgcttacttg tcttaggtct ctggatctac ttattggaga ttctctggcg acttggtgcc accatctggcagcttttggc cttcttccta gccttcttcc tagacctcat cctgctcatt attgctctct atctacaacaaaactggtgg actctattgg ttgatctcct ttggctcctc ctgtttctgg cgattttaat ctggatgtattaccatggac aacgacacag tgatgaacac caccacgatg actccctccc gcaccctcaa caagctaccgatgattctgg ccatgaatct gactctaact ccaacgaggg cagacaccac ctgctcgtga gtggagccggcgacggaccc ccactctgct ctcaaaacct aggcgcacct ggaggtggtc ctgacaatgg cccacaggaccctgacaaca ctgatgacaa tggcccacag gaccctgaca acactgatga caatggccca catgacccgctgcctcagga ccctgacaac actgatgaca atggcccaca ggaccctgac aacactgatg acaatggcccacatgacccg ctgcctcata gccctagcga ctctgctgga aatgatggag gccctccaca attgacggaagaggttgaaa acaaaggagg tgaccagggc ccgcctttga tgacagacgg aggcggcggt catagtcatgattccggcca tggcggcggt gatccacacc ttcctacgct gcttttgggt tcttctggtt ccggtggagatgatgacgac ccccacggcc cagttcagct aagctactat gactaa。
本发明还包括一种改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的构建方法：包括以下步骤：
Figure 867812DEST_PATH_IMAGE001
将去除庸余序列、加入增强子的BZLF1基因以上游引物P1和下游引物P2进行扩增，电泳纯化，得到BZLF1*DNA片段；
去除庸余序列、加入增强子的BZLF1基因序列为：
atg atggacccaa actcgacttc tgaagatgta aaatttacac ctgacccata ccaggtgccttttgtacaag cttttgacca agctaccaga gtctatcagg acctgggagg gccatcgcaagctcctttgccttgtgtgct gtggccggtg ctgccagagc ctctgccaca aggccagctaactgcctatcatgtttcaac cgctccgact gggtcgtggt tttctgcccc tcagcctgctcctgagaatgcttatcaagc ttatgcagca cctcagctgt tcccagtctc cgacataacccagaatcaacagactaacca agccggggga gaagcacctc aacctggaga caattctactgttcaaacagcagcagcagt ggtgtttgct tgccccgggg ctaaccaagg acaacagcta gcagacattg
gtgttccaca gcctgcacca gtggctgccc cggcacgacg cacacggaaaccacaacagccagaatcgct ggaggaatgc gattctgaac tagaaataaa gcgatacaagaatcgggtggcttccagaaa atgccgggcc aagtttaagc aactgctgca gcactaccgtgaggtggctgctgccaaatc atctgaaaat gacaggctgc gcctcctgtt gaagcagatgtgcccaagcctggatgttga ctccattatc cgccggacac cagatgtttt acacgaggat ctcttaaatttctaa；
上游引物P1：5′-GGAATTC atg atg gac cca aac tcg a-3′；其中GAATTC为EcoRI酶切位点
下游引物P2：5′-GCT GCC GCC ACC GCC GCT TCC GCC ACC GCC GCT TCC ACC GCCACC gaa att taa gag atc ctc -3′；
Figure 325469DEST_PATH_IMAGE002
将去除致癌基因、加入增强子的LMP1基因以上游引物P3和下游引物P4进行扩增，电泳纯化，得到LMP1*DNA片段；
去除致癌基因、加入增强子的LMP1基因序列为：
atgga acacgacctt gagaggggcc caccgggccc gcgacggccc cctcgaggaccccccctctc ctcttcccta ggccttgctc tccttctcct cctcttggcg ctactgtttt ggctgtacatcgttatgagt gactggactg gaggagccct ccttgtcctc tattcctttg ctctcatgct tataattataattttgatca tctttatctt cagaagagac cttctctgtc cacttggagc cctttgtata ctcctactgatgatcaccct cctgctcatc gctctctgga atttgcacgg acaggcattg taccttggaa ttgtgctgttcatcttcggg tgcttacttg tcttaggtct ctggatctac ttattggaga ttctctggcg acttggtgccaccatctggc agcttttggc cttcttccta gccttcttcc tagacctcat cctgctcatt attgctctctatctacaaca aaactggtgg actctattgg ttgatctcct ttggctcctc ctgtttctgg cgattttaatctggatgtat taccatggac aacgacacag tgatgaacac caccacgatg actccctccc gcaccctcaacaagctaccg atgattctgg ccatgaatct gactctaact ccaacgaggg cagacaccac ctgctcgtgagtggagccgg cgacggaccc ccactctgct ctcaaaacct aggcgcacct ggaggtggtc ctgacaatggcccacaggac cctgacaaca ctgatgacaa tggcccacag gaccctgaca acactgatga caatggcccacatgacccgc tgcctcagga ccctgacaac actgatgaca atggcccaca ggaccctgac aacactgatgacaatggccc acatgacccg ctgcctcata gccctagcga ctctgctgga aatgatggag gccctccacaattgacggaa gaggttgaaa acaaaggagg tgaccagggc ccgcctttga tgacagacgg aggcggcggtcatagtcatg attccggcca tggcggcggt gatccacacc ttcctacgct gcttttgggt tcttctggttccggtggaga tgatgacgac ccccacggcc cagttcagct aagctactat gactaa；
上游引物P3：5′-GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC GGCAGC ATG GAA CAC GAC CTT GAG AGG-3′；
下游引物P4：5′-CGC GTC GAC TTA GTC ATA GTA GCT TAG CTG-3′；其中GTC GAC为Sal 1酶切位点；
Figure 985121DEST_PATH_IMAGE003
以步骤
Figure 943850DEST_PATH_IMAGE001
所得BZLF1*DNA片段和步骤
Figure 441565DEST_PATH_IMAGE002
所得LMP1*DNA片段为模板，以上游引物P1和下游引物P4进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段；
反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5min共30个循环，最后72 ℃延伸8 min；
Figure 335703DEST_PATH_IMAGE004
将步骤
Figure 217071DEST_PATH_IMAGE003
所得融合基因片段冷却至20~30℃，加入Taq酶、dATP，放入PCR仪中在72℃下延伸45分钟，将其顺利与pMVS穿梭质粒连接，产物进行电泳检测后，进行纯化，得到改造BZLF1和改造LMP1的融合基因。
本发明还包括一种改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗，是由改造BZLF1和改造LMP1的融合基因序列引入pMVS穿梭质粒上，然后与BCG感受态细胞电转复苏后获得。
优选的，包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗，将包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗通过卡那霉素抗性筛选，得到稳定的无卡那霉素抗性的BCG疫苗。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明将去除致癌基因、加入增强子的LMP1与去除庸余序列、加入增强子的BZLF1基因进行融合，构建的融合基因能够同时发挥LMP1和BZLF1基因诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用，从而协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞；另一方面，本发明将融合基因连接在pMVS穿梭质粒上，并在BCG及其子代中复制和表达，得到了既能预防鼻咽癌发生又具有较高安全性的转化BCG疫苗；该转化BCG疫苗能够分泌EB病毒LMP1（去除致癌部分）与BZLF1的融合蛋白，有效的激活机体免疫系统，产生特异性抗体和有效的细胞免疫应答，在预防结核病的同时，具有杀伤鼻咽癌细胞，很好的预防治疗肿瘤的作用。
本发明优选的转化BCG疫苗无抗生素抗性，在制备过程中为了能够筛选出成功导入穿梭质粒pMVS卡介苗菌体，而人为的在pMVS质粒载体中加入了卡那霉素抗性，但是疫苗在用于临床治疗和预防鼻咽癌的过程中，人为引进的卡那霉素抗性可能会使疫苗使用者产生卡那霉素耐药性，使用QuikChange（Agilent, Beijing, China）定点突变试剂盒，将卡那霉素抗性位点突变，并通过将结核分枝杆菌菌体在无抗性的米氏培养基中传3代，选择在能在无抗性的米氏培养基上生长，而在卡那霉素抗性培养基上不生长的菌株，得到稳定的无卡那霉素抗性的BCG疫苗，从而避免了患者在治疗过程中出现卡那霉素耐药性。
附图说明
图1为对EB病毒阳性肿瘤的预防作用实验中各组的肿瘤生长趋势示意图；
图2为对EB病毒阳性肿瘤的预防作用实验中各组的肿瘤大小示意图；
图3为对EB病毒阳性肿瘤的治疗作用实验中各组的肿瘤体积示意图；
图4为对EB病毒阳性肿瘤的治疗作用实验中各组的肿瘤重量示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例
一、一种改造BZLF1和改造LMP1的融合基因，是将去除致癌基因、加入增强子的LMP1与去除庸余序列、加入增强子的BZLF1基因进行融合得到；
改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的基因序列为：
atg atggacccaa actcgacttc tgaagatgta aaatttacac ctgacccata ccaggtgccttttgtacaag cttttgacca agctaccaga gtctatcagg acctgggagg gccatcgcaagctcctttgccttgtgtgct gtggccggtg ctgccagagc ctctgccaca aggccagctaactgcctatcatgtttcaac cgctccgact gggtcgtggt tttctgcccc tcagcctgctcctgagaatgcttatcaagc ttatgcagca cctcagctgt tcccagtctc cgacataacccagaatcaacagactaacca agccggggga gaagcacctc aacctggaga caattctactgttcaaacagcagcagcagt ggtgtttgct tgccccgggg ctaaccaagg acaacagcta gcagacattg
gtgttccaca gcctgcacca gtggctgccc cggcacgacg cacacggaaaccacaacagccagaatcgct ggaggaatgc gattctgaac tagaaataaa gcgatacaagaatcgggtggcttccagaaa atgccgggcc aagtttaagc aactgctgca gcactaccgtgaggtggctgctgccaaatc atctgaaaat gacaggctgc gcctcctgtt gaagcagatgtgcccaagcctggatgttga ctccattatc cgccggacac cagatgtttt acacgaggat ctcttaaatttctaa atgga acacgacctt gagaggggcc caccgggccc gcgacggccc cctcgaggac cccccctctcctcttcccta ggccttgctc tccttctcct cctcttggcg ctactgtttt ggctgtacat cgttatgagtgactggactg gaggagccct ccttgtcctc tattcctttg ctctcatgct tataattata attttgatcatctttatctt cagaagagac cttctctgtc cacttggagc cctttgtata ctcctactga tgatcaccctcctgctcatc gctctctgga atttgcacgg acaggcattg taccttggaa ttgtgctgtt catcttcgggtgcttacttg tcttaggtct ctggatctac ttattggaga ttctctggcg acttggtgcc accatctggcagcttttggc cttcttccta gccttcttcc tagacctcat cctgctcatt attgctctct atctacaacaaaactggtgg actctattgg ttgatctcct ttggctcctc ctgtttctgg cgattttaat ctggatgtattaccatggac aacgacacag tgatgaacac caccacgatg actccctccc gcaccctcaa caagctaccgatgattctgg ccatgaatct gactctaact ccaacgaggg cagacaccac ctgctcgtga gtggagccggcgacggaccc ccactctgct ctcaaaacct aggcgcacct ggaggtggtc ctgacaatgg cccacaggaccctgacaaca ctgatgacaa tggcccacag gaccctgaca acactgatga caatggccca catgacccgctgcctcagga ccctgacaac actgatgaca atggcccaca ggaccctgac aacactgatg acaatggcccacatgacccg ctgcctcata gccctagcga ctctgctgga aatgatggag gccctccaca attgacggaagaggttgaaa acaaaggagg tgaccagggc ccgcctttga tgacagacgg aggcggcggt catagtcatgattccggcca tggcggcggt gatccacacc ttcctacgct gcttttgggt tcttctggtt ccggtggagatgatgacgac ccccacggcc cagttcagct aagctactat gactaa。
二、一种改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的构建方法，包括以下步骤：
Figure 979491DEST_PATH_IMAGE001
将去除庸余序列、加入增强子的BZLF1基因以上游引物P1和下游引物P2进行扩增，电泳纯化，得到BZLF1*DNA片段；电泳采用1%琼脂糖凝胶；
去除庸余序列、加入增强子的BZLF1基因序列为：
atg atggacccaa actcgacttc tgaagatgta aaatttacac ctgacccata ccaggtgccttttgtacaag cttttgacca agctaccaga gtctatcagg acctgggagg gccatcgcaagctcctttgccttgtgtgct gtggccggtg ctgccagagc ctctgccaca aggccagctaactgcctatcatgtttcaac cgctccgact gggtcgtggt tttctgcccc tcagcctgctcctgagaatgcttatcaagc ttatgcagca cctcagctgt tcccagtctc cgacataacccagaatcaacagactaacca agccggggga gaagcacctc aacctggaga caattctactgttcaaacagcagcagcagt ggtgtttgct tgccccgggg ctaaccaagg acaacagcta gcagacattg
gtgttccaca gcctgcacca gtggctgccc cggcacgacg cacacggaaaccacaacagccagaatcgct ggaggaatgc gattctgaac tagaaataaa gcgatacaagaatcgggtggcttccagaaa atgccgggcc aagtttaagc aactgctgca gcactaccgtgaggtggctgctgccaaatc atctgaaaat gacaggctgc gcctcctgtt gaagcagatgtgcccaagcctggatgttga ctccattatc cgccggacac cagatgtttt acacgaggat ctcttaaatttctaa；
上游引物P1：5′-GGAATTC atg atg gac cca aac tcg a-3′；其中GAATTC为EcoRI酶切位点；
下游引物P2：5′-GCT GCC GCC ACC GCC GCT TCC GCC ACC GCC GCT TCC ACC GCCACC gaa att taa gag atc ctc-3′；
Figure 20128DEST_PATH_IMAGE002
将去除致癌基因、加入增强子的LMP1基因以上游引物P3和下游引物P4进行扩增，电泳纯化，得到LMP1*DNA片段；电泳采用1%琼脂糖凝胶；
去除致癌基因、加入增强子的LMP1基因序列为：
atgga acacgacctt gagaggggcc caccgggccc gcgacggccc cctcgaggaccccccctctc ctcttcccta ggccttgctc tccttctcct cctcttggcg ctactgtttt ggctgtacatcgttatgagt gactggactg gaggagccct ccttgtcctc tattcctttg ctctcatgct tataattataattttgatca tctttatctt cagaagagac cttctctgtc cacttggagc cctttgtata ctcctactgatgatcaccct cctgctcatc gctctctgga atttgcacgg acaggcattg taccttggaa ttgtgctgttcatcttcggg tgcttacttg tcttaggtct ctggatctac ttattggaga ttctctggcg acttggtgccaccatctggc agcttttggc cttcttccta gccttcttcc tagacctcat cctgctcatt attgctctctatctacaaca aaactggtgg actctattgg ttgatctcct ttggctcctc ctgtttctgg cgattttaatctggatgtat taccatggac aacgacacag tgatgaacac caccacgatg actccctccc gcaccctcaacaagctaccg atgattctgg ccatgaatct gactctaact ccaacgaggg cagacaccac ctgctcgtgagtggagccgg cgacggaccc ccactctgct ctcaaaacct aggcgcacct ggaggtggtc ctgacaatggcccacaggac cctgacaaca ctgatgacaa tggcccacag gaccctgaca acactgatga caatggcccacatgacccgc tgcctcagga ccctgacaac actgatgaca atggcccaca ggaccctgac aacactgatgacaatggccc acatgacccg ctgcctcata gccctagcga ctctgctgga aatgatggag gccctccacaattgacggaa gaggttgaaa acaaaggagg tgaccagggc ccgcctttga tgacagacgg aggcggcggtcatagtcatg attccggcca tggcggcggt gatccacacc ttcctacgct gcttttgggt tcttctggttccggtggaga tgatgacgac ccccacggcc cagttcagct aagctactat gactaa；
上游引物P3：5′-GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC GGCAGC ATG GAA CAC GAC CTT GAG AGG-3′；
下游引物P4：5′-CGC GTC GAC TTA GTC ATA GTA GCT TAG CTG -3′；其中GTC GAC为Sal 1酶切位点；
Figure 678642DEST_PATH_IMAGE003
以步骤
Figure 424138DEST_PATH_IMAGE001
所得BZLF1*DNA片段和步骤
Figure 459090DEST_PATH_IMAGE002
所得LMP1*DNA片段为模板，以上游引物P1和下游引物P4进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段；
反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5min共30个循环，最后72 ℃延伸8 min；
Figure 495179DEST_PATH_IMAGE004
将步骤
Figure 449228DEST_PATH_IMAGE003
所得融合基因片段冷却至20~30℃，加入Taq酶0.4μl、dATP（50 mol/L）2μl，放入PCR仪中在72℃下延伸45分钟，将其顺利与pMVS穿梭质粒连接，（pMVS穿梭质粒相当于载体），产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测后，进行纯化，纯化采用U-NIQ-5PCR产物纯化试剂盒（上海生工产品）进行，得到改造BZLF1和改造LMP1的融合基因ZLP1。
三、一种包含上述改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗，是由改造BZLF1和改造LMP1的融合基因序列引入pMVS穿梭质粒上，然后与BCG感受态细胞电转复苏后获得，具体步骤包括：
感受态BCG的制备：BCG在Middlebrook7H9培养基35℃摇床培养（转速为200rpm），待培养液OD600为0.6时将BCG菌液加入离心管中，冰浴2hr，将BCG菌液加入离心管中，在冰盒中预冷2hr，4℃离心，10000rpm×2min，丢弃上清液；用原始体积的0.1，预冷的浓度为10%甘油重悬菌体，重复上述操作6次，弃上清，加入原始体积的0.02的10%甘油重悬菌体，即得到BCG感受态细菌；
取5×106个BCG感受态细菌，然后将纯化的pMVS-ZLP1质粒用电穿孔法转化BCG，电穿参数为：0.4cm的电穿孔杯，电压2.5 KV电容25μF，电阻1000Ω，作用时间11.6毫秒，37℃下培养10小时后取100μl涂布在含50ug/ml卡那霉素的Middlebrook7H10固体培养基的离心试管内斜面上，37℃继续培养直至发现克隆；3~4周后挑选阳性克隆，先进行抗酸染色初步鉴定，然后在含60mlMiddlebrook7H9培养基的离心试管里摇床生长。
pMVS-ZLP1质粒的构建步骤：
首先，质粒pMV261购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心（北京），将合成后的BCG-Ag85B信号肽基因克隆到pMV261载体并测序鉴定，信号肽基因及质粒pMV261分别用BamH和EcoRI双酶切，pMV261载体酶切后加入小牛肠碱性磷酸酶1U，于37℃去磷酸化处理1h，经酚：氯仿（1：1）抽提、无水乙醇沉淀、70%乙醇洗涤，溶于TE中。然后加入5μL（等量）的Ligation Solution Ι,T4DNA连接酶1µL,纯水补足至总体积10µL，于16℃进行连接反应30min（或4℃过夜反应）,构建重组质粒pMVS；将质粒pMVS用EcorI和SalI进行双酶切，再将EB病毒融合基因序列ZLP1插入至pMVS中，得到重组质粒：pMVS-ZLP1；
四、无卡那霉素抗性、包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗的制备
将包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗通过卡那霉素抗性筛选，得到稳定的无卡那霉素抗性的包含融合基因的BCG疫苗，具体的筛选步骤为：
人为引进的卡那霉素抗性可能会使疫苗使用者产生卡那霉素耐药性，使用QuikChange（Agilent, Beijing, China）定点突变试剂盒，将卡那霉素抗性位点突变，并通过将结核分枝杆菌菌体在无抗性的米氏培养基中传3代，选择在能在无抗性的米氏培养基上生长，而在卡那霉素抗性培养基上不生长的菌株，得到稳定的无卡那霉素抗性的BCG疫苗，从而避免了患者在治疗过程中出现卡那霉素耐药性。
五、包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗（以下简称rBCG）对EB病毒阳性肿瘤的预防作用
对实验小鼠C57BL/6（鼠源性瘤）在进行肿瘤接种前30d，连续3次进行疫苗接种，中间间隔10d，免疫时采用右肋腹侧皮下注射的方式进行，设PBS组、BCG组、含空载体pMVS的BCG组、pMVS-ZLP1质粒组、含目的基因的rBCG组，每组5只。在最后一次免疫后10天接种肿瘤细胞。在接种肿瘤细胞后40天断颈处死小鼠，手术剥离肿瘤并测定各种数据。肿瘤细胞接种后，观察其生长情况，当可触及时，记成瘤时间，如表1所示；每间隔1天测量其垂直长径及短径，计算其体积，记录其生长趋势，得到图1，肿瘤体积公式为：垂直长径x（垂直短径）2 x0.5，第30天（按接种肿瘤起）处死小鼠，称取瘤重，各组的肿瘤大小示意图如图2所示。
表1 各组免疫小鼠皮下接种肿瘤细胞的成瘤时间
组别 平均成瘤时间(d)
PBS对照组 6.82士1.01
pMV261-ZLP1组 8.12士1.07
BCG对照组 11.90士1.39
pMV261+BCG对照组 11.98士1.07
rBCG组 19.92士1.12*
注：*表示与对照组相比，差异显著（p≤0.05）
由图1可以看出，在接种12天时各组的肿瘤细胞开始生长，其中接种14天时肿瘤体积开始不同，在22天时PBS组肿瘤体积最大，依次为pMVS-ZLP1质粒组、BCG组、含空载体pMVS的BCG组，肿瘤最小的为rBCG组，并且rBCG组的肿瘤在14天至22天增加的体积不大，可见，本发明的包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗对肿瘤细胞具有很好的预防作用。
由图2可以看出，接种包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗后，EB病毒阳性肿瘤体积增加较小，可以看出本发明的包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗对肿瘤细胞具有很好的预防作用。
六、包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗（以下简称rBCG）对小鼠肿瘤的治疗作用
5组小鼠接种EB病毒阳性肿瘤细胞，分别于接种GT39肿瘤细胞后第9d和15d进行免疫。BCG 组、pMVS-ZLP1质粒组、含空载体pMVS的BCG组和含目的基因的rBCG组各组在接种后13d，平均肿瘤体积分别为0.38±0.16(cm3)、0.72±0.14(cm3)、0.42±0.11(cm3)和0.21±0.18(cm3)，均小于PBS对照组平均瘤体积 0.8±0.25(cm3)(P<0.05)，如图3所示，在肿瘤细胞接种28天后处死小鼠剥离肿瘤，称量肿瘤的重量，如图4所示，经计算得出rBCG 组肿瘤体积和瘤重与PBS对照组相比显著减小（P<0.05），上述研究表明rBCG对EB病毒阳性肿瘤细胞治疗作用显著，BCG 组、转空载体BCG组（pMV261+BCG）对肿瘤细胞早期有治疗作用，晚期不明显。
序列表
<110> 济宁医学院
<120> 一种改造BZLF1 和改造LMP1 的融合基因及其应用
<130> 20190123A-1
<141> 2019-01-23
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1899
<212> DNA
<213> 人类疱疹病毒4型(Human herpesvirus 6)
<400> 1
atgatggacc caaactcgac ttctgaagat gtaaaattta cacctgaccc ataccaggtg 60
ccttttgtac aagcttttga ccaagctacc agagtctatc aggacctggg agggccatcg 120
caagctcctt tgccttgtgt gctgtggccg gtgctgccag agcctctgcc acaaggccag 180
ctaactgcct atcatgtttc aaccgctccg actgggtcgt ggttttctgc ccctcagcct 240
gctcctgaga atgcttatca agcttatgca gcacctcagc tgttcccagt ctccgacata 300
acccagaatc aacagactaa ccaagccggg ggagaagcac ctcaacctgg agacaattct 360
actgttcaaa cagcagcagc agtggtgttt gcttgccccg gggctaacca aggacaacag 420
ctagcagaca ttggtgttcc acagcctgca ccagtggctg ccccggcacg acgcacacgg 480
aaaccacaac agccagaatc gctggaggaa tgcgattctg aactagaaat aaagcgatac 540
aagaatcggg tggcttccag aaaatgccgg gccaagttta agcaactgct gcagcactac 600
cgtgaggtgg ctgctgccaa atcatctgaa aatgacaggc tgcgcctcct gttgaagcag 660
atgtgcccaa gcctggatgt tgactccatt atccgccgga caccagatgt tttacacgag 720
gatctcttaa atttctaaat ggaacacgac cttgagaggg gcccaccggg cccgcgacgg 780
ccccctcgag gaccccccct ctcctcttcc ctaggccttg ctctccttct cctcctcttg 840
gcgctactgt tttggctgta catcgttatg agtgactgga ctggaggagc cctccttgtc 900
ctctattcct ttgctctcat gcttataatt ataattttga tcatctttat cttcagaaga 960
gaccttctct gtccacttgg agccctttgt atactcctac tgatgatcac cctcctgctc 1020
atcgctctct ggaatttgca cggacaggca ttgtaccttg gaattgtgct gttcatcttc 1080
gggtgcttac ttgtcttagg tctctggatc tacttattgg agattctctg gcgacttggt 1140
gccaccatct ggcagctttt ggccttcttc ctagccttct tcctagacct catcctgctc 1200
attattgctc tctatctaca acaaaactgg tggactctat tggttgatct cctttggctc 1260
ctcctgtttc tggcgatttt aatctggatg tattaccatg gacaacgaca cagtgatgaa 1320
caccaccacg atgactccct cccgcaccct caacaagcta ccgatgattc tggccatgaa 1380
tctgactcta actccaacga gggcagacac cacctgctcg tgagtggagc cggcgacgga 1440
cccccactct gctctcaaaa cctaggcgca cctggaggtg gtcctgacaa tggcccacag 1500
gaccctgaca acactgatga caatggccca caggaccctg acaacactga tgacaatggc 1560
ccacatgacc cgctgcctca ggaccctgac aacactgatg acaatggccc acaggaccct 1620
gacaacactg atgacaatgg cccacatgac ccgctgcctc atagccctag cgactctgct 1680
ggaaatgatg gaggccctcc acaattgacg gaagaggttg aaaacaaagg aggtgaccag 1740
ggcccgcctt tgatgacaga cggaggcggc ggtcatagtc atgattccgg ccatggcggc 1800
ggtgatccac accttcctac gctgcttttg ggttcttctg gttccggtgg agatgatgac 1860
gacccccacg gcccagttca gctaagctac tatgactaa 1899
<210> 2
<211> 738
<212> DNA
<213> 人类疱疹病毒4型(Human herpesvirus 6)
<400> 2
atgatggacc caaactcgac ttctgaagat gtaaaattta cacctgaccc ataccaggtg 60
ccttttgtac aagcttttga ccaagctacc agagtctatc aggacctggg agggccatcg 120
caagctcctt tgccttgtgt gctgtggccg gtgctgccag agcctctgcc acaaggccag 180
ctaactgcct atcatgtttc aaccgctccg actgggtcgt ggttttctgc ccctcagcct 240
gctcctgaga atgcttatca agcttatgca gcacctcagc tgttcccagt ctccgacata 300
acccagaatc aacagactaa ccaagccggg ggagaagcac ctcaacctgg agacaattct 360
actgttcaaa cagcagcagc agtggtgttt gcttgccccg gggctaacca aggacaacag 420
ctagcagaca ttggtgttcc acagcctgca ccagtggctg ccccggcacg acgcacacgg 480
aaaccacaac agccagaatc gctggaggaa tgcgattctg aactagaaat aaagcgatac 540
aagaatcggg tggcttccag aaaatgccgg gccaagttta agcaactgct gcagcactac 600
cgtgaggtgg ctgctgccaa atcatctgaa aatgacaggc tgcgcctcct gttgaagcag 660
atgtgcccaa gcctggatgt tgactccatt atccgccgga caccagatgt tttacacgag 720
gatctcttaa atttctaa 738
<210> 3
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人类疱疹病毒4型(Human herpesvirus 6)
<400> 3
atggaacacg accttgagag gggcccaccg ggcccgcgac ggccccctcg aggacccccc 60
ctctcctctt ccctaggcct tgctctcctt ctcctcctct tggcgctact gttttggctg 120
tacatcgtta tgagtgactg gactggagga gccctccttg tcctctattc ctttgctctc 180
atgcttataa ttataatttt gatcatcttt atcttcagaa gagaccttct ctgtccactt 240
ggagcccttt gtatactcct actgatgatc accctcctgc tcatcgctct ctggaatttg 300
cacggacagg cattgtacct tggaattgtg ctgttcatct tcgggtgctt acttgtctta 360
ggtctctgga tctacttatt ggagattctc tggcgacttg gtgccaccat ctggcagctt 420
ttggccttct tcctagcctt cttcctagac ctcatcctgc tcattattgc tctctatcta 480
caacaaaact ggtggactct attggttgat ctcctttggc tcctcctgtt tctggcgatt 540
ttaatctgga tgtattacca tggacaacga cacagtgatg aacaccacca cgatgactcc 600
ctcccgcacc ctcaacaagc taccgatgat tctggccatg aatctgactc taactccaac 660
gagggcagac accacctgct cgtgagtgga gccggcgacg gacccccact ctgctctcaa 720
aacctaggcg cacctggagg tggtcctgac aatggcccac aggaccctga caacactgat 780
gacaatggcc cacaggaccc tgacaacact gatgacaatg gcccacatga cccgctgcct 840
caggaccctg acaacactga tgacaatggc ccacaggacc ctgacaacac tgatgacaat 900
ggcccacatg acccgctgcc tcatagccct agcgactctg ctggaaatga tggaggccct 960
ccacaattga cggaagaggt tgaaaacaaa ggaggtgacc agggcccgcc tttgatgaca 1020
gacggaggcg gcggtcatag tcatgattcc ggccatggcg gcggtgatcc acaccttcct 1080
acgctgcttt tgggttcttc tggttccggt ggagatgatg acgaccccca cggcccagtt 1140
cagctaagct actatgacta a 1161

Claims (2)

1.一种包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗，其特征在于：是由改造BZLF1和改造LMP1的融合基因序列引入pMVS穿梭质粒上，然后与BCG感受态细胞电转复苏后获得；
其中改造BZLF1和改造LMP1的融合基因是将去除致癌基因、加入增强子的LMP1与去除庸余序列、加入增强子的BZLF1基因进行融合得到；
改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗，其特征在于：将包含改造BZLF1和改造LMP1的融合基因的BCG疫苗通过卡那霉素抗性筛选，得到稳定的无卡那霉素抗性的BCG疫苗。
CN201910062881.2A 2019-01-23 2019-01-23 一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因及其应用 Active CN109679975B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910062881.2A CN109679975B (zh) 2019-01-23 2019-01-23 一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910062881.2A CN109679975B (zh) 2019-01-23 2019-01-23 一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109679975A CN109679975A (zh) 2019-04-26
CN109679975B true CN109679975B (zh) 2020-12-08

Family

ID=66193916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910062881.2A Active CN109679975B (zh) 2019-01-23 2019-01-23 一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109679975B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5716845A (en) * 1995-07-20 1998-02-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Immortalized lymphocytes for production of viral-free proteins
CN102016586A (zh) * 2008-03-10 2011-04-13 约瑟夫·傅立叶大学 源自zebra蛋白的合成肽用于eb病毒(ebv)再激活的体外诊断的用途
CN106086051A (zh) * 2016-06-29 2016-11-09 济宁医学院 一种核苷酸序列及其用途
CN106188248A (zh) * 2016-07-26 2016-12-07 兰州雅华生物技术有限公司 一种eb病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测eb病毒抗体的快速检测试剂盒

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2813849A1 (en) * 2013-06-10 2014-12-17 Charité-Universitätsmedizin Berlin (Charité) EBV-specific immune signature as diagnostic markers in Chronic Fatigue Syndrome (CFS)
CN104707135B (zh) * 2013-12-11 2017-11-07 深圳先进技术研究院 重组蛋白疫苗、含编码该重组蛋白疫苗的基因的重组表达载体及其应用
US20150359810A1 (en) * 2014-06-17 2015-12-17 Celgene Corporation Methods for treating epstein-barr virus (ebv) associated cancers using oral formulations of 5-azacytidine
CN108490177B (zh) * 2018-02-08 2020-12-29 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 鼻咽癌抗体检测试剂、其制备方法及鼻咽癌检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5716845A (en) * 1995-07-20 1998-02-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Immortalized lymphocytes for production of viral-free proteins
CN102016586A (zh) * 2008-03-10 2011-04-13 约瑟夫·傅立叶大学 源自zebra蛋白的合成肽用于eb病毒(ebv)再激活的体外诊断的用途
CN106086051A (zh) * 2016-06-29 2016-11-09 济宁医学院 一种核苷酸序列及其用途
CN106188248A (zh) * 2016-07-26 2016-12-07 兰州雅华生物技术有限公司 一种eb病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测eb病毒抗体的快速检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anti-tumour research of recombinant BCG using BZLF1 and hGM-CSF fusion genes;Qing-jie Xue等;《Vaccine》;20170220;第1599-1607页 *
EB病毒诱发人B细胞淋巴瘤的分子病理特性;甘润良等;《生物化学与生物物理学报》;20031015;第925-929页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109679975A (zh) 2019-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3172315B1 (en) Phage resistant lactic acid bacteria
CN111607594A (zh) 一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除猪IRF8基因的细胞系及其构建方法
CN107099496B (zh) 融合表达鸡传染性法氏囊病毒vp2蛋白和沙门菌属外膜蛋白的重组乳酸菌菌株及其用途
CN118222588A (zh) 一种减毒型弓形虫疫苗株及其制备方法和在抗肿瘤中的应用
CN113136372B (zh) 一种重组噬菌体的构建方法
CN117838890A (zh) 一种c型副鸡禽杆菌亚单位疫苗及其应用
CN113717943B (zh) St irf3/irf7 ko细胞系及其构建方法和应用
CN109679975B (zh) 一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因及其应用
CN109468255B (zh) 整合单拷贝功能性f4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用
CN114213505B (zh) 一种适用于特异感染u87-mg细胞的腺相关病毒突变体
CN112342233A (zh) 用于细菌表达DacA时提高c-di-AMP产量的多核苷酸
CN110117608A (zh) 内源Rv2823c编码蛋白在结核杆菌基因插入、敲除、干扰及突变体文库筛选中的应用
CN109504643B (zh) 整合四拷贝功能性f18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用
Vargas et al. Genetic Organization of the Mobilization Region of the Plasm id pHE1 from Halomonas elongata
CN111394294B (zh) 布鲁氏菌A19 bvfA基因缺失株及其构建和应用
CN108610424B (zh) 一种重组蛋白及其在制备猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用
CN114195859B (zh) 一种适用于特异感染u251细胞的腺相关病毒突变体
CN115287244B (zh) 鱼源无乳链球菌internalin基因LRR结构域敲除突变株及其制备方法和应用
WO2019237391A1 (zh) CRISPR/Cas9 靶向敲除人 TXGP1 基因及其特异性 gRNA
CN111394376B (zh) 一种融合基因bfna、重组腺病毒及其制备方法和应用
CN112359060B (zh) 含有靶向突变型kras融合基因的重组载体、融合蛋白及蛋白质复合物及其构建方法和应用
WO2024174425A1 (zh) 传染性法氏囊病毒fj株vp2蛋白及应用
CN112080455B (zh) 表达分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法
CN116656583B (zh) 靶向肿瘤的幽门螺杆菌突变株及抗胃癌外膜囊泡组合物
WO2022121109A1 (zh) 一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant