CN112080455B - 表达分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法 - Google Patents

表达分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种表达分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法，该重组乳酸乳球菌，其蛋白序列中具有分泌表达抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的融合序列，该融合序列具有SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。重组乳酸乳球菌分泌的单链抗体能够与猪传染性胃肠炎病毒特异性结合，可用于阻断猪传染性胃肠炎病毒的感染，以及对仔猪感染病毒提供保护作用。

Description

表达分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌 及其制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种表达分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法。
背景技术
传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis，TGE)，一旦猪场中有猪感染了TGEV，很快各年龄段的猪都会感染。目前疫苗接种是预防本病发生的途径之一，但是已研制出的PED灭活和弱毒疫苗效果并不理想。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种表达分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法，该重组乳酸乳球菌分泌的单链抗体能够与猪传染性胃肠炎病毒特异性结合，可用于阻断猪传染性胃肠炎病毒的感染，以及对仔猪感染病毒提供保护作用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种重组乳酸乳球菌，其蛋白序列中具有分泌表达抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的融合序列，该融合序列具有SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
所述的重组乳酸乳球菌，具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，该核苷酸序列中进一步包含内切酶位点Nco I、Hind III，其中Nco I为CCATGG，Hind III为AAGCTT。
所述的重组乳酸乳球菌分泌的单链抗体具有与猪传染性胃肠炎病毒结合的活性，以及中和猪传染性胃肠炎病毒感染细胞的作用。
本发明涉及一种制备上述携带分泌表达抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的融合序列的重组乳酸乳球菌的方法，通过将合成密码子优化的单链抗体序列Seq ID No.1和合成分泌信号肽和硫氧还蛋白的序列Seq ID No.2的基因酶切克隆到乳酸乳球菌载体pNZ8148中构建得到重组质粒pNZ8148-TZZ 19，通过电转化入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞，经培养分离纯化获得分泌表达单链抗体TZZ 19。
本发明涉及上述携带分泌表达抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的应用，具体为制备用于仔猪传染性胃肠炎病的仔猪口服药物。
所述的仔猪口服药物，优选为每天两次口服的20mL浓度为109cfu/mL的分泌表达单链抗体TZZ 19的重组乳酸乳球菌。
技术效果
本发明整体解决了现有技术缺乏对于猪传染性胃肠炎病毒引起的腹泻的治疗药物，本发明采用乳酸乳球菌分泌针对猪传染性胃肠炎病毒的单链抗体，分泌的单链抗体对病毒感染具有中和作用；并且乳酸乳球菌口服后能够在肠道靶向分泌单链抗体。
与现有技术相比，本发明单链抗体通过乳酸乳球菌进行分泌表达，分泌的单链抗体具有活性，对猪传染性胃肠炎病毒的感染具有中和作用，对仔猪感染传染性胃肠炎病毒具有预防作用；乳酸乳球菌口服后使单链抗体在肠道靶向持续表达，减少了单链抗体口服后被胃酸和胃蛋白酶破坏。
附图说明
图1为pNZ8148-TZZ 19的质粒结构图；
图2为pNZ8148-TZZ 19双酶切产物电泳图；
图中：M为2000bp DNA ladder marker；1为pNZ8148-TZZ 19经Nco I和Hind III的酶切电泳图基因PCR产物；
图3为western-blot检测分泌表达的单链抗体TZZ 19示意图；
图4为Nisin诱导时间与TZZ 19分泌量的关系示意图；
图5为重组乳酸乳球菌分泌表达单链抗体TZZ 19的定量示意图；
图6为分泌的单链抗体TZZ 19与猪传染性胃肠炎病毒的结合能力示意图；
图7为分泌的单链抗体TZZ 19对猪传染性胃肠炎病毒的体外中和效果示意图。
图8为重组乳酸乳球菌口服后分泌的单链抗体TZZ 19在仔猪空肠的分布情况示意图。
图9为仔猪口服重组乳酸乳球菌后体重的变化情况示意图。
图10为仔猪口服重组乳酸乳球菌后粪便中病毒粒子载量变化情况；
图11为仔猪口服重组乳酸乳球菌后仔猪存活率的变化情况。
具体实施方式
实施例1
本实施例涉及一种构建分泌表达抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌的方法，具体包括：
①设计带有分泌信号肽USP45、分泌增强信号肽LEISSTCDA和硫氧还蛋白A基因(trxA)的序列，在5’端加上Nco I酶切位点，在3’端加上EcoR I，并且在trxA基因两端加上Kpn I，得到Seq ID No.1序列；将抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体TZZ 19序列用CodonOptimWiz软件优化密码子，在5’端加上EcoR I，在3’端加上6×His序列和Hind III，得到Seq ID No.2序列。将设计的Seq ID No.1和Seq ID No.2序列交由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
②分别将合成的Seq ID No.1序列、合成的Seq ID No.2序列依次连入pNZ8148，转化MC1061F-感受态细胞，得到携带Seq ID No.3序列的重组质粒pNZ8148-USP45-LEISSTCDA-trxA-TZZ 19(简写为pNZ8148-TZZ 19)，如图1所示。琼脂糖凝胶电泳结果发现分泌表达抗猪传染性胃肠炎病毒的融合序列都插入了pNZ8148，大小约1200bp，如图2所示。
③从-80℃取出乳酸乳球菌电转化感受态细胞NZ9000，加入10μL连接产物，冰上放置10min后转移至电极杯。设置电击参数：电压为2.5kv，电阻为200Ω，电容为25μF。电转后加入1mL预热的SGM17B复苏培养基，30℃静置培养1.5h后涂布至带氯霉素抗性的SGM17B平板，30℃培养2天。从平板上挑取单菌落，得到重组携带抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌。
实施例2
本实施例涉及对重组乳酸乳球菌分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的鉴定，具体包括：
i)将过夜培养的重组乳酸乳球菌按1:25接种至2管10mL带氯霉素的SGM17B培养基，培养至OD600达到0.4。其中一管加入终浓度为10ng/mL的Nisin，继续培养5-8h。
ii)提取重组乳酸乳球菌分泌的单链抗体，方法为：离心诱导后的菌液，收集培养基上清；上清中加入1％(v/v)的2％脱氧胆酸钠，静置30min；加入丙酮，4℃静置2h；12，000×g离心30min，将沉淀用预冷的丙酮洗涤两次，离心取沉淀；将沉淀悬浮于蛋白上样缓冲液或PBS。通过western-blot和间接ELISA检测分泌至培养基上清的单链抗体TZZ 19。将未被Nisin诱导的重组乳酸乳球菌的培养基上清提取物作为阴性对照。
western-blot结果显示，Nisin诱导5h后在培养基中能检测到分泌的单链抗体TZZ19，而未诱导的重组重组乳酸乳球菌培养基上清中未检测到单链抗体TZZ 19，说明单链抗体TZZ-19在重组乳酸乳球菌中经Nisin诱导成功表达并分泌，并且蛋白表达受到Nisin的严格调控，如图3所示。为了得到更多分泌的单链抗体TZZ 19，检测了诱导持续时间对表达量的影响。ELISA结果显示，重组乳酸乳球菌在Nisin诱导后2-10h大量分泌单链抗体TZZ 19，单链抗体TZZ 19最大分泌量出现在诱导后的8-10h。10-20h单链抗体TZZ 19的分泌基本保持稳定，20h后分泌量开始下降，如图4所示。将10μL诱导8h的培养基上清和已知浓度的从大肠杆菌纯化的TZZ 19通过western-blot转印至NC膜，通过光密度比较对分泌的单链抗体TZZ 19进行定量。结果发现重组乳酸乳球菌在诱导8h后TZZ 19分泌量约为4.7μg/mL，如图5所示。
间接ELISA检测分泌的单链抗体TZZ 19与TGEV全病毒抗原的结合能力，将TGEV全病毒抗原稀释至20ug/mL，每孔加入100uL稀释液，4℃包被过夜。第二天每孔加入5％的脱脂乳，室温封闭2h。将提取的培养基上清浓缩20倍后连续4倍稀释，加入ELISA板。结果发现，从重组乳酸乳球菌纯化的单链抗体TZZ 19能与相应抗原结合，OD450值的高低与单链抗体的浓度有关，而导入pNZ8148质粒的重组乳酸乳球菌上清提取物不会与抗原结合，如图6所示。以上结果说明重组乳酸乳球菌能分泌猪源单链抗体TZZ 19，并且分泌的单链抗体TZZ 19正确折叠，保留了原有的生物学活性。
实施例3
本实施例涉及重组乳酸乳球菌分泌的单链抗体对传染性胃肠炎病毒的中和作用，具体通过空斑减少中和实验测定重组乳酸乳球菌分泌的单链抗体对传染性胃肠炎病毒的中和作用，方法如下：
将从重组乳酸乳球菌纯化的单链抗体TZZ 19连续两倍稀释，将各稀释度的单链抗体TZZ 19分别与等体积的1000TCID50/mL TGEV混合，将混合物孵育1h。将本实验室保存的不与TGEV反应的单链抗体ZW 88作为阴性对照。1h后将TGEV-单链抗体TZZ 19混合物加入24孔板，37℃培养1h。将24孔板中的混合液替换为含有1％琼脂的DMEM固体培养基，培养36-48h。使用结晶紫染色，记录空斑数量，计算空斑减少率：[1-(单链抗体TZZ 19处理后空斑平均数量/阴性单链抗体处理后空斑平均数量)]×100％。使用空斑减少中和实验分析重组乳酸乳球菌分泌的TZZ 19对TGEV的中和效果，病毒感染后48h后计算每个单链抗体稀释度中TGEV的空斑数量。结果显示从乳酸乳球菌纯化的TZZ 19在1：80稀释度就完全中和病毒感染，半数中和指数在1:320-1:640之间，如图7所示。
实施例4
本实施例涉及分泌单链抗体TZZ 19的重组乳酸乳球菌在肠道的定殖，以及单链抗体在肠道的分泌情况检测，方法如下：
取6只10日龄仔猪连续三天口服10mL浓度为1010cfu/mL的分泌单链抗体TZZ 19的重组乳酸乳球菌，每天两次。在口服分泌单链抗体TZZ 19的重组乳酸乳球菌后第4、6和9天处死仔猪，采集空肠组织，用PBS清洗，去除肠道内食物残渣和粪便。取1cm肠道组织，载玻片刮下肠道黏膜后用1mL PBS悬浮，western-blot法检测分泌的单链抗体，一抗为抗His标签单克隆抗体，二抗为HRP标记山羊抗小鼠二抗。结果发现重组乳酸乳球菌口服第4、6和9天后，在肠道黏膜中均能检测到分泌的单链抗体TZZ 19，如图8所示。
实施例5
本实施例涉及重组乳酸乳球菌分泌的单链抗体对仔猪感染传染性胃肠炎病毒的预防作用，具体通过预先给仔猪口服分泌单链抗体TZZ 19的重组乳酸乳球菌，然后感染传染性胃肠炎病毒，观察重组乳酸乳球菌的保护效果，具体方法包括：
将10日龄仔猪分为三组，每组4头。第一组为pNZ8148-TZZ处理组，攻毒前三天仔猪每天两次口服20mL浓度为109cfu/mL的分泌单链抗体TZZ 19的重组乳酸乳球菌，实验当天每头仔猪攻入106TCID50/猪TGEV。第二组为pNZ8148处理组，攻毒前三天仔猪每天两次口服20mL浓度为109cfu/mL的乳酸乳球菌，当天攻入相同量TGEV。第三组为pNZ8148-TZZ对照组，实验前三天仔猪每天两次口服20mL浓度为109cfu/mL的单链抗体TZZ 19的重组乳酸乳球菌，当天每头仔猪口服PBS。
每天观察仔猪体重变化，绘制体重变化曲线。攻毒后每天收集仔猪的粪便，将粪便离心后的上清保存在-80℃，使用qPCR测定病毒基因组的拷贝数。
结果发现pNZ8148-TZZ处理组和pNZ8148处理组仔猪体重相比pNZ8148-TZZ对照组显著降低(p<0.05)，其中pNZ8148处理组在感染后第5天体重下降了44％，pNZ8148-TZZ处理组体重下降了18.0±9.1％，pNZ8148-TZZ处理组仔猪体重显著高于pNZ8148处理组，如图9所示。粪便病毒定量结果表明，pNZ8148处理组的病毒载量在感染后1-3天显著升高，在感染后第2天为最高病毒载量。pNZ8148-TZZ处理组攻毒后粪便病毒载量出现先升高后降低的趋势，并且最高病毒载量为6.6±0.5log10 cfu/mL，显著低于pNZ8148处理组的最高病毒载量，如图10所示。从图8可以看出，pNZ8148处理组仔猪在攻毒后第5天全部死亡，死亡率为100％，而pNZ8148-TZZ处理组仔猪在攻毒后仅有一半仔猪死亡，死亡率为50％，显著低于pNZ8148处理组(p<0.05)，如图11所示。以上结果说明口服分泌单链抗体TZZ 19的重组乳酸乳球菌对仔猪感染TGEV能提供保护作用，表现为仔猪存活率提高，病毒滴度和体重变化显著低于pNZ8148处理组(p<0.05)所示。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 表达分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法
<130> fnc157e
<141> 2020-09-14
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 504
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggcatga aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt ctacagtgat actttctgct 60
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<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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1 5 10 15
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20 25 30
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Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile
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Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala
115 120 125
Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu
130 135 140
Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met Ser Ser Gly Asp
145 150 155 160
Asp Asp Asp Lys Gly Thr Glu Phe Met Ala Glu Glu Lys Leu Val Glu
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
180 185 190
Val Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Ala Val Asn Trp Val Arg
195 200 205
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Gly Ile Asp Ser Asp
210 215 220
Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe
225 230 235 240
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Thr
245 250 255
Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Val Ser Tyr
260 265 270
Cys Trp Arg Tyr Gly Ala Thr Cys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Val Met
275 280 285
Asp Leu Trp Gly Pro Gly Val Glu Val Val Val Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ser Gln Thr Val Ile
305 310 315 320
Gln Glu Pro Ala Met Ser Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
325 330 335
Cys Ala Phe Ser Ser Gly Ser Val Thr Thr Ser Asn Tyr Pro Ser Trp
340 345 350
Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Arg Pro Arg Gln Leu Ile Tyr Ser Thr
355 360 365
Asn Asn Arg Pro Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ala Ile Ser
370 375 380
Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu
385 390 395 400
Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Leu Tyr Gly Ser Ser Ala Val Pro Phe Gly
405 410 415
Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu His His His His His His
420 425 430

Claims (8)

1.一种重组乳酸乳球菌，其特征在于，该重组乳酸乳球菌分泌的抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体TZZ19的融合序列的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述的重组乳酸乳球菌分泌的单链抗体TZZ19具有与猪传染性胃肠炎病毒结合的活性，以及中和猪传染性胃肠炎病毒感染细胞的作用。
2.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征是，所述的重组乳酸乳球菌，具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，该核苷酸序列中进一步包含内切酶位点NcoI、HindIII，其中Nco I为CCATGG，HindIII为AAGCTT。
3.一种制备权利要求1或2所述的重组乳酸乳球菌的方法，其特征在于，通过将合成密码子优化的单链抗体序列Seq ID No.2和合成分泌信号肽和硫氧还蛋白的序列Seq IDNo.1的基因酶切克隆到乳酸乳球菌载体pNZ8148中构建得到重组质粒pNZ8148-TZZ 19，通过电转化入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞，经培养分离纯化获得分泌表达单链抗体TZZ19。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，具体包括：
①设计带有分泌信号肽USP45、分泌增强信号肽LEISSTCDA和硫氧还蛋白A基因trxA的序列，在5’端加上Nco I酶切位点，在3’端加上EcoRI，并且在trxA基因两端加上Kpn I，得到Seq ID No.1序列；将抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体TZZ 19的核苷酸序列用CodonOptimWiz软件优化密码子，在5’端加上EcoRI，在3’端加上6×His序列和HindIII，得到SeqID No.2序列；
②分别将合成的Seq ID No.1序列、合成的Seq ID No.2序列依次连入pNZ8148，转化MC1061F-感受态细胞，得到携带Seq ID No.3序列的重组质粒pNZ8148-USP45-LEISSTCDA-trxA-TZZ 19，即pNZ8148-TZZ 19；
③从-80℃取出乳酸乳球菌电转化感受态细胞NZ9000，加入10μL连接产物，冰上放置10min后转移至电极杯，经电转和培养后得到重组携带抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的电转，电击参数为：电压为2.5kv，电阻为200Ω，电容为25μF。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的培养是指：电转后加入1mL预热的SGM17B复苏培养基，30℃静置培养1.5h后涂布至带氯霉素抗性的SGM17B平板，30℃培养2天后从平板上挑取单菌落，即得到重组携带抗猪传染性胃肠炎病毒单链抗体的重组乳酸乳球菌。
7.一种根据权利要求1～6中任一所述重组乳酸乳球菌的应用，其特征在于，具体为制备用于仔猪传染性胃肠炎病的仔猪口服药物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的仔猪口服药物，为每天两次口服的20mL浓度为109cfu/mL的分泌表达单链抗体TZZ 19的重组乳酸乳球菌。
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