FR2885911A1 - Glucuronane lyase pour le clivage de polysaccharides constitues par ou contenant des glucuronanes, procede de preparation et utilisation notamment dans le domaine phytosanitaire - Google Patents
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Abstract
La présente invention a trait à une substance enzymatique clivant les structures (1->4)-beta-D-polyglucuroniques homopolymères ou contenues dans un polysaccharide, la souche qui la produit, son procédé de préparation et son utilisation dans le domaine phytosanitaire et dans celui de la production d'oligoglucuronanes, l'activité de glucuronane lyase de cette substance étant, à l'état purifié,(a) supérieure ou égale à 50 U/mg vis-à-vis d'un premier substrat de référence (RPa) constitué par un acide (1->4)-beta-D-polyglucuronique de masse moléculaire moyenne supérieure à 50 kDa, ayant un taux moyen d'acétylation de 50 à 65 %,(b) supérieure ou égale à 30 U/mg vis-à-vis d'un second substrat de référence (RPb) constitué par un acide (1->4)-beta-D-polyglucuronique de masse moléculaire moyenne supérieure à 50 kDa, ayant un taux moyen d'acétylation de 68 à 80 %.
Description
DOMAINE DE L'INVENTION
Glucuronane lyase pour le clivage de polysaccharides constitues par ou contenant des glucuronanes, procédé de préparation et utilisation notamment dans le domaine phytosanitaire La présente invention concerne le clivage par voie enzymatique de polysaccharides constitués par des glucuronanes ou contenant des fragments glucuronanes. Lesdits glucuronanes comprennent les acides polyglucuroniques, leurs sels et leurs esters (i. e. les polyglucuronates) ainsi que leurs dérivés notamment les éthers. Elle vise plus précisément :
l'utilisation d'une substance enzymatique pour le clivage des glucuronanes à enchaînement beta (1-4), notamment en vue de la production à grande échelle (i) d'oligoglucuronanes à partir de glucuronanes homopolymères et/ou (ii) d'oligosaccharides à partir de polysaccharides contenant des fragments glucuronanes, les souches produisant de façon efficace ladite substance enzymatique, ladite substance enzymatique en tant que produit industriel nouveau, un procédé de préparation de ladite substance enzymatique, et l'utilisation (i) de ladite substance enzymatique et (ii) desdits oligoglucuronanes et/ou oligosaccharides, notamment dans le domaine phytosanitaire.
Glucuronane lyase pour le clivage de polysaccharides constitues par ou contenant des glucuronanes, procédé de préparation et utilisation notamment dans le domaine phytosanitaire La présente invention concerne le clivage par voie enzymatique de polysaccharides constitués par des glucuronanes ou contenant des fragments glucuronanes. Lesdits glucuronanes comprennent les acides polyglucuroniques, leurs sels et leurs esters (i. e. les polyglucuronates) ainsi que leurs dérivés notamment les éthers. Elle vise plus précisément :
l'utilisation d'une substance enzymatique pour le clivage des glucuronanes à enchaînement beta (1-4), notamment en vue de la production à grande échelle (i) d'oligoglucuronanes à partir de glucuronanes homopolymères et/ou (ii) d'oligosaccharides à partir de polysaccharides contenant des fragments glucuronanes, les souches produisant de façon efficace ladite substance enzymatique, ladite substance enzymatique en tant que produit industriel nouveau, un procédé de préparation de ladite substance enzymatique, et l'utilisation (i) de ladite substance enzymatique et (ii) desdits oligoglucuronanes et/ou oligosaccharides, notamment dans le domaine phytosanitaire.
ART ANTERIEUR
On sait que l'on a déjà décrit, dans les documents WO 9 /18174 A et FR 2781673 A, l'obtention de glucuronanes comprenant (i) les acides Dpolyglucuroniques à enchaînement beta (1-4) et ayant une masse moléculaire moyenne comprise entre 5 et 700 kDa, d'une part, et leurs dérivés acétylés, d'autre part, par culture sur un milieu nutritif approprié d'un souche de Sinorhizobium meliloti (ancienne nomenclature : Rhizobium meliloti), à savoir la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472, et (il) leurs sels, leurs dérivés esters, leurs dérivés éthers et leurs autre dérivés acylés obtenus par hémisynthèse à partir desdits acides D-polyglucuroniques.
On sait également de l'article de G. de RUITER et al., Carbohyd. Polym., 1992; 18:1-7, préparer des oligoglucuronanes ayant une masse moléculaire moyenne comprise entre 5,5 et 10 kDa à partir de moisissures appartenant à l'ordre des mucorales.
On sait en outre de la publication FR 2781673 A précitée que le clivage de certains acides D-polyglucuroniques à enchaînement (3(1-4) peut être réalisé au moyen d'une glucuronane lyase d'origine bactér; enne, et plus précisément au moyen de la glucuronane lyase produite par la même souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472, qui fournissait déjà le (1 4)-beta -Dglucuronane homopolymère partiellement 0-acétylé en C2 et/Du C3. Or, il se trouve que cette glucuronane lyase n'est pas particulièrement efficace :
elle ne clive pas les acides D-polyglucuroniques à enchaînement (3(1-4) qui sont essentiellement 2,3-di-O-acétylés, elle n'agit pratiquement pas sur les acides D-polyglucuroniques à enchaînement beta (1-4) qui sont essentiellement mono-3-0acétylés et elle donne une trop faible quantité d'acides oligopolyglucuroniques ayant un degré de polymérisation (dp) a lant de dp2 (dimère) à dp 15 (pentadécamère) quand le substrat qu'elle clive est constitué d'acides D-polyglucuroniques à enchaînement (3(1-4) non acétylés tant en C2 qu'en C3 de l'hétérocycle glucuronique.
De L. DANTAS et al., Carbohydr. Res., 19.94 : 265 ; 303-310, on sait qu'une cellulase commerciale, la cellulase de Trichoderma reesei
société dite NOVO NORDISK), présente une activité glucu-onane lyase (qui a été révélée par le spectre de RMN H réalisé sur les produits de dégradation résultant du clivage d'un glucuronane désacétylé) et a été testée sur des oligoglucuronanes à enchaînement (3(1-4). Or cette glucuronane lyase contenue dans ladite cellulase commerciale n'agit pas sur les glucuronanes majoritairement 2,3-di-O-acétylés, de plus elle est pratiquement inactive sur les glucuronanes majoritairement mono-3-0acétylés.Les auteurs de cet article indiquent qu'ils doutent qu'elle soit utile pour cliver les glucuronanes de masse moléculaire supérieure à 50 kDa, dès lors qu'ils ont constaté que son activité enzymatique sur les oligoglucuronanes désacétylés est faible.
WO 01/00025 A propose l'utilisation dans le domaine phytosanitaire de substances oligoglucuroniques à enchaînement beta (1-4) et ayant un degré de polymérisation inférieur à dp30 (de préférence compris entre dp2 et dp 15, et mieux une valeur de dp4 ou dp8), en tant que produits (i)
et/ou de la xyloglucane endotransglycolase ", et (ii) fertilisants.
En outre, WO 01/00025 A suggère pour cliver le glucuronane, qui comporte au moins 50 % d'unités glucuroniques O-acétylées en C2 et/ou C3 et est obtenu à partir de la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 selon l'enseignement de WO 93/18174 A, d'utiliser (voir page 8, lignes 2328) une glucuronane lyase extraite de pancréas d'ormeaux, une glucuronane lyase d'origine fongique (celle de la cellulase de l'article -précité de L. DANTAS et al.) et la glucuronane lyase citée ci-dessus produite par ladite souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472. Or ces substances enzymatiques ne sont pas particulièrement efficaces.
Enfin il est signalé pour information que FR 2605185 A préconise d'utiliser des oligosaccharides, qui ne proviennent pas de structures
améliorer ou accélérer la croissance des plantes.
On sait que l'on a déjà décrit, dans les documents WO 9 /18174 A et FR 2781673 A, l'obtention de glucuronanes comprenant (i) les acides Dpolyglucuroniques à enchaînement beta (1-4) et ayant une masse moléculaire moyenne comprise entre 5 et 700 kDa, d'une part, et leurs dérivés acétylés, d'autre part, par culture sur un milieu nutritif approprié d'un souche de Sinorhizobium meliloti (ancienne nomenclature : Rhizobium meliloti), à savoir la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472, et (il) leurs sels, leurs dérivés esters, leurs dérivés éthers et leurs autre dérivés acylés obtenus par hémisynthèse à partir desdits acides D-polyglucuroniques.
On sait également de l'article de G. de RUITER et al., Carbohyd. Polym., 1992; 18:1-7, préparer des oligoglucuronanes ayant une masse moléculaire moyenne comprise entre 5,5 et 10 kDa à partir de moisissures appartenant à l'ordre des mucorales.
On sait en outre de la publication FR 2781673 A précitée que le clivage de certains acides D-polyglucuroniques à enchaînement (3(1-4) peut être réalisé au moyen d'une glucuronane lyase d'origine bactér; enne, et plus précisément au moyen de la glucuronane lyase produite par la même souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472, qui fournissait déjà le (1 4)-beta -Dglucuronane homopolymère partiellement 0-acétylé en C2 et/Du C3. Or, il se trouve que cette glucuronane lyase n'est pas particulièrement efficace :
elle ne clive pas les acides D-polyglucuroniques à enchaînement (3(1-4) qui sont essentiellement 2,3-di-O-acétylés, elle n'agit pratiquement pas sur les acides D-polyglucuroniques à enchaînement beta (1-4) qui sont essentiellement mono-3-0acétylés et elle donne une trop faible quantité d'acides oligopolyglucuroniques ayant un degré de polymérisation (dp) a lant de dp2 (dimère) à dp 15 (pentadécamère) quand le substrat qu'elle clive est constitué d'acides D-polyglucuroniques à enchaînement (3(1-4) non acétylés tant en C2 qu'en C3 de l'hétérocycle glucuronique.
De L. DANTAS et al., Carbohydr. Res., 19.94 : 265 ; 303-310, on sait qu'une cellulase commerciale, la cellulase de Trichoderma reesei
société dite NOVO NORDISK), présente une activité glucu-onane lyase (qui a été révélée par le spectre de RMN H réalisé sur les produits de dégradation résultant du clivage d'un glucuronane désacétylé) et a été testée sur des oligoglucuronanes à enchaînement (3(1-4). Or cette glucuronane lyase contenue dans ladite cellulase commerciale n'agit pas sur les glucuronanes majoritairement 2,3-di-O-acétylés, de plus elle est pratiquement inactive sur les glucuronanes majoritairement mono-3-0acétylés.Les auteurs de cet article indiquent qu'ils doutent qu'elle soit utile pour cliver les glucuronanes de masse moléculaire supérieure à 50 kDa, dès lors qu'ils ont constaté que son activité enzymatique sur les oligoglucuronanes désacétylés est faible.
WO 01/00025 A propose l'utilisation dans le domaine phytosanitaire de substances oligoglucuroniques à enchaînement beta (1-4) et ayant un degré de polymérisation inférieur à dp30 (de préférence compris entre dp2 et dp 15, et mieux une valeur de dp4 ou dp8), en tant que produits (i)
et/ou de la xyloglucane endotransglycolase ", et (ii) fertilisants.
En outre, WO 01/00025 A suggère pour cliver le glucuronane, qui comporte au moins 50 % d'unités glucuroniques O-acétylées en C2 et/ou C3 et est obtenu à partir de la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 selon l'enseignement de WO 93/18174 A, d'utiliser (voir page 8, lignes 2328) une glucuronane lyase extraite de pancréas d'ormeaux, une glucuronane lyase d'origine fongique (celle de la cellulase de l'article -précité de L. DANTAS et al.) et la glucuronane lyase citée ci-dessus produite par ladite souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472. Or ces substances enzymatiques ne sont pas particulièrement efficaces.
Enfin il est signalé pour information que FR 2605185 A préconise d'utiliser des oligosaccharides, qui ne proviennent pas de structures
améliorer ou accélérer la croissance des plantes.
B UT DE L'INVENTION
On ne connaît pas encore de substances enzymatiques qui soient (i) capables de cliver les structures 2,3-di-O-acétylées de (1 4)-beta -Dglucuronanes, et (ii) plus efficaces que la meilleure glucuronane lyase déjà connue, celle qui est produite par ladite souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 précitée.
Aussi, un des buts de l'invention est de satisfaire ce besoin en fournissant de nouvelles substances enzymatiques permettant de résoudre plus efficacement le problème technique du clivage des structures (1 4)-beta D-glucuronanes homopolymères ou incluses dans des polysaccharides, que ces structures soient O-acétylées ou non en C2 et/ou C3.
Selon un autre but de l'invention, on se propose de fournir une substance enzymatique ayant une activité de glucuronane lyase capable d'agir relativement rapidement et/ou à faible dose afin de lutter contre les microorganismes pathogènes, en particulier les microorganismes phytopathogènes, lesdits microorganismes étant détruits par le biais du
contenus dans ladite paroi, Enfin selon encore un autre but de l'invention, on se propose de fournir un nouveau mode d'accès à des produits intéressants dans le domaine de l'agriculture et en particulier le domaine phytosanitaire, qui sont des oligoglucuronanes ou, respectivement, des oligosaccha:-ides, par le clivage de structures glucuronanes homopolymères ou, respectivement, de structures glucuronanes contenues dans des polysaccharides, au moyen de ladite substance enzymatique ayant l'activité de glucuronane lyase.
A la différence de l'enseignement de l'art antérieur précité (notamment
tant que moyens phytosanitaires ou fertilisants, la présente invention recommande, d'une part, l'utilisation d'une substance enzymatique ayant une activité de glucuronane lyase en tant que moyen phytosanitaire pour lutter contre les microorganismes ayant une enveloppe polysaccharidique comportant des motifs glucuronanes à enchaînement p(l-4) et, d'autre part l'utilisation de ladite substance enzymatique pour l'obtention, à partir de structures glucuronanes à enchaînement beta (1-4), d'oligoglucuronanes efficaces dans le domaine agricole, notamment en tant qu'agents phytosanitaires et/ou fertilisants qui favorisent ou améliorent la croissance des plantes.
On ne connaît pas encore de substances enzymatiques qui soient (i) capables de cliver les structures 2,3-di-O-acétylées de (1 4)-beta -Dglucuronanes, et (ii) plus efficaces que la meilleure glucuronane lyase déjà connue, celle qui est produite par ladite souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 précitée.
Aussi, un des buts de l'invention est de satisfaire ce besoin en fournissant de nouvelles substances enzymatiques permettant de résoudre plus efficacement le problème technique du clivage des structures (1 4)-beta D-glucuronanes homopolymères ou incluses dans des polysaccharides, que ces structures soient O-acétylées ou non en C2 et/ou C3.
Selon un autre but de l'invention, on se propose de fournir une substance enzymatique ayant une activité de glucuronane lyase capable d'agir relativement rapidement et/ou à faible dose afin de lutter contre les microorganismes pathogènes, en particulier les microorganismes phytopathogènes, lesdits microorganismes étant détruits par le biais du
contenus dans ladite paroi, Enfin selon encore un autre but de l'invention, on se propose de fournir un nouveau mode d'accès à des produits intéressants dans le domaine de l'agriculture et en particulier le domaine phytosanitaire, qui sont des oligoglucuronanes ou, respectivement, des oligosaccha:-ides, par le clivage de structures glucuronanes homopolymères ou, respectivement, de structures glucuronanes contenues dans des polysaccharides, au moyen de ladite substance enzymatique ayant l'activité de glucuronane lyase.
A la différence de l'enseignement de l'art antérieur précité (notamment
tant que moyens phytosanitaires ou fertilisants, la présente invention recommande, d'une part, l'utilisation d'une substance enzymatique ayant une activité de glucuronane lyase en tant que moyen phytosanitaire pour lutter contre les microorganismes ayant une enveloppe polysaccharidique comportant des motifs glucuronanes à enchaînement p(l-4) et, d'autre part l'utilisation de ladite substance enzymatique pour l'obtention, à partir de structures glucuronanes à enchaînement beta (1-4), d'oligoglucuronanes efficaces dans le domaine agricole, notamment en tant qu'agents phytosanitaires et/ou fertilisants qui favorisent ou améliorent la croissance des plantes.
OBJET DE L'INVENTION
Pour satisfaire ce besoin, la présente invention met en u̇vre une nouvelle solution technique pour résoudre le problème du clivage des
sont constitués de composés homopolymères polyglucuroniques à enchaînement beta (1-4) ou (ii) comprennent des fragments polyglucuroniques à enchaînement (3(1-4). Cette solution technique met en u̇vre une nouvelle glucuronane lyase.
Selon un premier aspect de l'invention, on fournit une nouvelle utilisation d'une substance enzymatique pour cliver les polysaccharides de la famille des acides polyglucuroniques/polyglucuronates, qui sont (i) des glucuronanes homopolymères à enchaînement beta (1-4), ou (ii) des polymères contenant un ou plusieurs fragments glucuronanes à enchaînement (3(1-4), ladite utilisation étant caractérisée en ce que l'on fait appel à une substance enzymatique dont l'activité glucuronane lyase spécifique, qui se traduit par une (3-élimination fournissant, selon le mécanisme schématique :
Pour satisfaire ce besoin, la présente invention met en u̇vre une nouvelle solution technique pour résoudre le problème du clivage des
sont constitués de composés homopolymères polyglucuroniques à enchaînement beta (1-4) ou (ii) comprennent des fragments polyglucuroniques à enchaînement (3(1-4). Cette solution technique met en u̇vre une nouvelle glucuronane lyase.
Selon un premier aspect de l'invention, on fournit une nouvelle utilisation d'une substance enzymatique pour cliver les polysaccharides de la famille des acides polyglucuroniques/polyglucuronates, qui sont (i) des glucuronanes homopolymères à enchaînement beta (1-4), ou (ii) des polymères contenant un ou plusieurs fragments glucuronanes à enchaînement (3(1-4), ladite utilisation étant caractérisée en ce que l'on fait appel à une substance enzymatique dont l'activité glucuronane lyase spécifique, qui se traduit par une (3-élimination fournissant, selon le mécanisme schématique :
(A),
où le symbole représente une liaison avec un reste ose, et R est H ou un groupe acyle, notamment COCH3, un mélange d'oligoglucuronanes, quand le polysaccharide de départ est un glucuronane homopolymère, ou un mélange d'oligosaccharides, quand le polysaccharide de départ est un polymère contenant un ou plusieurs fragments glucuronanes, chacun desdits oligoglucuronanes et oligosaccharides présentant essentiellement, au niveau de chaque extrémité terminale non réductrice, un hétérocycle éthyléniquement insaturé de structure acide 4-déoxy-(hex-4-ène)pyran:)syluronique est à l'état purifié :(a) supérieure ou égale à 50 U/mg vis-à-vis d'un premier substrat de référence (RPa) constitué par un acide D-polyglucuronique à enchaînement (3(1-4) ayant une masse moléculaire moyenne supérieure à 50 kDa et un taux moyen d'acétylation de 50 à 65 %, et (b) supérieure ou égale à 30 U/mg vis-à-vis d'un second substrat de référence (RPb) constitué par un acide D-polyglucuronique à enchaînement (3(1-4) ayant une masse moléculaire moyenne supérieure à 50 kDa et un taux moyen d'acétylation de 68 à 80 %.
La composition (ou répartition) en résidus (restes, cycles ou unités) glucuroniques 3-0-acétylés, 2-0-acétylés, 2,3-di-O-acétylés et non acétylés des produits de référence RPa et RPb typiques est donnée plus loin.
Un troisième produit de référence (RPc) est également utilisable dans l'appréciation de l'activité de glucuronane lyase de ladi:e substance enzymatique. Il s'agit d'un glucuronane de masse moléculaire moyenne supérieure à 50 kDa qui est totalement désacétylé et est obtenu par traitement de RPa et/ou RPb au moyen d'un alcali fort, tel que NaOH ou KOH.
Selon un second aspect de l'invention, on préconise, en tant que produit industriel nouveau, une substance enzymatique capable de cliver les structures glucuronanes à enchaînement (3(1-4), caractérisée en ce qu'elle a à l'état purifié une activité enzymatique de glucuronane lyase : (a) supérieure ou égale à 50 U/mg vis-à-vis dudit premier substrat de référence (RPa), (b) supérieure ou égale à 30 U/mg vis-à-vis dudit seconc substrat de référence (RPb), et (c) supérieure ou égale à 100 U/mg vis-à-vis dudit troisième substrat de référence (RPc), ladite substance enzymatique étant composée d'une cu plusieurs glucuronane lyases.
Selon un troisième aspect de l'invention, on prévoit un procédé pour la préparation d'une telle substance enzymatique, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend une opération de sélection selon laquelle :
on cultive une souche à tester, susceptible de produire au moins une glucuronase lyase, sur un milieu nutritif minimal spécifique de ladite souche à tester, ledit milieu nutritif contenant du glucuro lane, en tant que source unique de carbone, notamment à une teneur de l'ordre de 0,4 % p/v ; on recueille ladite souche, si elle se développe sur ledit milieu nutritif minimal et est apte à métaboliser un glucuronane par clivage selon le mécanisme de (3-élimination donné plus haut et détectable, sur les produits de dégradation, par spectrophotométrie à 235 nm Cette opération de sélection peut également être dénommée, par la personne du métier; indifféremment méthode, procédé ou processus de sélection.
Selon un autre aspect de l'invention, on recommande une composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle contient, en associai ion avec un excipient physiologiquement acceptable, une dose phytosanitairement efficace d'au moins une substance enzymatique telle que visée ci-dessus.
Les produits de dégradation de structures glucuronanes homopolymères ou, respectivement, incluses dans un polysaccharide, sont utiles en agriculture notamment en tant qu'agents phytosanitaires et/ou fertilisants, pour améliorer ou favoriser la croissance des plantes.
Selon enfin un autre aspect de l'invention, on fournit une nouvelle souche fongique produisant la substance enzymatique ayc.nt l'activité recherchée de glucuronane lyase. Cette souche est la souche Trichoderma CNCM 1-3400 (qui a été déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, située à Paris, 25 rue du Docteur Roux). ABREVIATIONS Par commodité, dans la description qui suit, on a utilisé les abréviations et acronymes présentés ci-après :
BCA : acide bicinchoninique BSA : albumine bovine sérique ChS : chondroitines sulfates dp : degré de polymérisation, dp2 désigne le produit dimère, dp3 le trimère, etc.
PU : glucuronane de masse moléculaire supérieure à 50 kDa OU : oligoglucuronane de masse moléculaire inférieure ou égale à 50 kDa RC : milieu complet pour Rhizobium (et Sinorhizobium) RMN 'H: résonance magnétique nucléaire du proton RPa : produit de référence partiellement 0-acétylé en C2 et/ou C3, ayant une masse moléculaire supérieure à 50 kDa et ayant un tAc moyen de 50 à 65 %, un produit RPa typique (désigné par commodité RPal) présente la répartition moyenne suivante pour un taux d'acétylation de 56 % :
taux de résidus 3-0-acétylés : 26 %, taux de résidus 2-0-acétylés : 16 %, taux de résidus 2,3-di-O-acétylés : 7 %, et taux de résidus non acétylés : 50 %, (remarque : la somme des taux des résidus acétylés, qui est de 49 % et non de 50 %, résulte des erreurs normales d'analyse) RPb : produit de référence hautement 0-acétylé en C2 et/ou C3, ayant une masse moléculaire supérieure à 50 kDa, et ayant un tAc moyen de 68 à 80 %, un produit RPb typique (désigné par commodité RPbl) présente la répartition suivante pour un taux d'acétylation de 71 %:
taux de résidus 3-0-acétylés : 19 %, taux de résidus 2-0-acétylés : 10 %, taux de résidus 2,3-di-O-acétylés : 21 %, et taux de résidus non acétylés : 50 %, RPc : produit de référence totalement désacétylé, obtenu à partir de RPa ou RPb par traitement avec un alcali for: (NaOH ou KOH, à pH 12, à 50 [deg]C, pendant environ 12h), et ayant une masse moléculaire supérieure à 50 kDa tAc : taux d'acétylation ; si w est le pourcentage de cycles non acétylés du glucuronane, x celui de cycles 3-0-acétylés, y celui de cycles 2-0-acétylés et z celui de cycles 2,3-di-O-acétylés, on a :
tAc = x + y + 2z TCM : milieu complet pour Trichoderma TMM : milieu minimal pour Trichoderma TSM: milieu sélectif pour Trichoderma U : unité d'activité enzymatique glucuronane lyase, la valeur 1U est classiquement définie comme étant l'activité nécessaire pour une augmentation de l'absorbance de 1 par minute à une longueur d'onde de 235 nm.
où le symbole représente une liaison avec un reste ose, et R est H ou un groupe acyle, notamment COCH3, un mélange d'oligoglucuronanes, quand le polysaccharide de départ est un glucuronane homopolymère, ou un mélange d'oligosaccharides, quand le polysaccharide de départ est un polymère contenant un ou plusieurs fragments glucuronanes, chacun desdits oligoglucuronanes et oligosaccharides présentant essentiellement, au niveau de chaque extrémité terminale non réductrice, un hétérocycle éthyléniquement insaturé de structure acide 4-déoxy-(hex-4-ène)pyran:)syluronique est à l'état purifié :(a) supérieure ou égale à 50 U/mg vis-à-vis d'un premier substrat de référence (RPa) constitué par un acide D-polyglucuronique à enchaînement (3(1-4) ayant une masse moléculaire moyenne supérieure à 50 kDa et un taux moyen d'acétylation de 50 à 65 %, et (b) supérieure ou égale à 30 U/mg vis-à-vis d'un second substrat de référence (RPb) constitué par un acide D-polyglucuronique à enchaînement (3(1-4) ayant une masse moléculaire moyenne supérieure à 50 kDa et un taux moyen d'acétylation de 68 à 80 %.
La composition (ou répartition) en résidus (restes, cycles ou unités) glucuroniques 3-0-acétylés, 2-0-acétylés, 2,3-di-O-acétylés et non acétylés des produits de référence RPa et RPb typiques est donnée plus loin.
Un troisième produit de référence (RPc) est également utilisable dans l'appréciation de l'activité de glucuronane lyase de ladi:e substance enzymatique. Il s'agit d'un glucuronane de masse moléculaire moyenne supérieure à 50 kDa qui est totalement désacétylé et est obtenu par traitement de RPa et/ou RPb au moyen d'un alcali fort, tel que NaOH ou KOH.
Selon un second aspect de l'invention, on préconise, en tant que produit industriel nouveau, une substance enzymatique capable de cliver les structures glucuronanes à enchaînement (3(1-4), caractérisée en ce qu'elle a à l'état purifié une activité enzymatique de glucuronane lyase : (a) supérieure ou égale à 50 U/mg vis-à-vis dudit premier substrat de référence (RPa), (b) supérieure ou égale à 30 U/mg vis-à-vis dudit seconc substrat de référence (RPb), et (c) supérieure ou égale à 100 U/mg vis-à-vis dudit troisième substrat de référence (RPc), ladite substance enzymatique étant composée d'une cu plusieurs glucuronane lyases.
Selon un troisième aspect de l'invention, on prévoit un procédé pour la préparation d'une telle substance enzymatique, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend une opération de sélection selon laquelle :
on cultive une souche à tester, susceptible de produire au moins une glucuronase lyase, sur un milieu nutritif minimal spécifique de ladite souche à tester, ledit milieu nutritif contenant du glucuro lane, en tant que source unique de carbone, notamment à une teneur de l'ordre de 0,4 % p/v ; on recueille ladite souche, si elle se développe sur ledit milieu nutritif minimal et est apte à métaboliser un glucuronane par clivage selon le mécanisme de (3-élimination donné plus haut et détectable, sur les produits de dégradation, par spectrophotométrie à 235 nm Cette opération de sélection peut également être dénommée, par la personne du métier; indifféremment méthode, procédé ou processus de sélection.
Selon un autre aspect de l'invention, on recommande une composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle contient, en associai ion avec un excipient physiologiquement acceptable, une dose phytosanitairement efficace d'au moins une substance enzymatique telle que visée ci-dessus.
Les produits de dégradation de structures glucuronanes homopolymères ou, respectivement, incluses dans un polysaccharide, sont utiles en agriculture notamment en tant qu'agents phytosanitaires et/ou fertilisants, pour améliorer ou favoriser la croissance des plantes.
Selon enfin un autre aspect de l'invention, on fournit une nouvelle souche fongique produisant la substance enzymatique ayc.nt l'activité recherchée de glucuronane lyase. Cette souche est la souche Trichoderma CNCM 1-3400 (qui a été déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, située à Paris, 25 rue du Docteur Roux). ABREVIATIONS Par commodité, dans la description qui suit, on a utilisé les abréviations et acronymes présentés ci-après :
BCA : acide bicinchoninique BSA : albumine bovine sérique ChS : chondroitines sulfates dp : degré de polymérisation, dp2 désigne le produit dimère, dp3 le trimère, etc.
PU : glucuronane de masse moléculaire supérieure à 50 kDa OU : oligoglucuronane de masse moléculaire inférieure ou égale à 50 kDa RC : milieu complet pour Rhizobium (et Sinorhizobium) RMN 'H: résonance magnétique nucléaire du proton RPa : produit de référence partiellement 0-acétylé en C2 et/ou C3, ayant une masse moléculaire supérieure à 50 kDa et ayant un tAc moyen de 50 à 65 %, un produit RPa typique (désigné par commodité RPal) présente la répartition moyenne suivante pour un taux d'acétylation de 56 % :
taux de résidus 3-0-acétylés : 26 %, taux de résidus 2-0-acétylés : 16 %, taux de résidus 2,3-di-O-acétylés : 7 %, et taux de résidus non acétylés : 50 %, (remarque : la somme des taux des résidus acétylés, qui est de 49 % et non de 50 %, résulte des erreurs normales d'analyse) RPb : produit de référence hautement 0-acétylé en C2 et/ou C3, ayant une masse moléculaire supérieure à 50 kDa, et ayant un tAc moyen de 68 à 80 %, un produit RPb typique (désigné par commodité RPbl) présente la répartition suivante pour un taux d'acétylation de 71 %:
taux de résidus 3-0-acétylés : 19 %, taux de résidus 2-0-acétylés : 10 %, taux de résidus 2,3-di-O-acétylés : 21 %, et taux de résidus non acétylés : 50 %, RPc : produit de référence totalement désacétylé, obtenu à partir de RPa ou RPb par traitement avec un alcali for: (NaOH ou KOH, à pH 12, à 50 [deg]C, pendant environ 12h), et ayant une masse moléculaire supérieure à 50 kDa tAc : taux d'acétylation ; si w est le pourcentage de cycles non acétylés du glucuronane, x celui de cycles 3-0-acétylés, y celui de cycles 2-0-acétylés et z celui de cycles 2,3-di-O-acétylés, on a :
tAc = x + y + 2z TCM : milieu complet pour Trichoderma TMM : milieu minimal pour Trichoderma TSM: milieu sélectif pour Trichoderma U : unité d'activité enzymatique glucuronane lyase, la valeur 1U est classiquement définie comme étant l'activité nécessaire pour une augmentation de l'absorbance de 1 par minute à une longueur d'onde de 235 nm.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Comme indiqué plus haut, la substance enzymatique selon l'invention clive les glucuronanes à enchaînement beta (1-4) ayant un dp supérieur ou égal à 3. Les substrats que l'on se propose de cliver sont, d'une part, des (1 4)(3-D-glucuronanes homopolymères et, d'autre part, des polysaccharides
enzymatique desdits glucuronanes homopolymères conduit à des oligoglucuronanes, celle desdits polysaccharides à des oligosaccharides.
Cette dépolymérisation enzymatique est avantageusement mise en u̇vre au moyen d'une substance enzymatique ayant une activité de glucuronane lyase, d'origine fongique, qui provient de préférence d'une souche de Trichoderma, et mieux de la souche Trichoderma CNCM 1-3400.
Par structure glucuronane, on entend ici la structure de formule 1 à enchaînement beta (1-4) :
dans laquelle R est H ou acyle, notamment acétyle, et n est 0 ou un nombre entier ayant pour valeur 1 à 2500. (Quand n = 0, on a affaire au OU dimère ; quand n = 1, on a affaire au OU trimère, quand n = 2, on a affaire au OU tétramère ; quand n = 2498, on a affaire à un PU ayant un dp de 2500.) Sous le terme générique de "glucuronanes", qui englobe les OU et PU éventuellement acétylés, sont également inclus les dérivés éthers résultant de l'éthérification des groupes hydroxyle de la structure I, ainsi que les sels et les esters résultant de la salification ou, respectivement, de l'estérification de tout groupe acide carboxylique en C6 de l'unité glucuroniqle.Tous ces dérivés et les produits acylés, où les groupes R = acyle sont différents du groupe acétyle, peuvent être préparés selon une méthode connue en soi par application de mécanismes réactionnels classiques, comme indiqué dans WO 93/18174 A précité ou dans l'article de E. PETIT et al., J. Biomacromol., 2004 : 5(2) ;445-452, avant ou après clivage des structures
glucuronane lyase selon l'invention.
Si un dérivé ester, éther ou acylé (où R est différent de COCH3) de la structure PU de formule 1 ne peut pas être clivé par la substance enzymatique d'activité glucuronane lyase selon l'invention, il suffit (a) de transformer ledit dérivé en glucuronane éventuellement acétylé, (beta ) de cliver ce dernier, puis (y) de restaurer selon une méthode connue en soi le ou les substituants ester, éther ou acyle du dérivé de départ.
Parmi l'ensemble des "glucuronanes", on distingue les PU qui ont une masse moléculaire supérieure à 50 kDa, d'une part, et les OU qui ont une masse moléculaire inférieure ou égale à 50 kDa. Pour les essais rapportés plus loin, on s'intéressera aux OU ayant une masse moléculaire inférieure ou égale à 5kDa, et notamment aux produits ayant un dp inférieur ou égal à 15.
Les substrats Parmi les polysaccharides clivables par la substance enzymatique selon l'invention, on peut notamment citer les PU et les OU homopolymères, d'une part, et les polysaccharides mixtes comprenant dans leur molécule un ou plusieurs fragments PU ou OU dans leur rr.olécules.
Parmi les PU homopolymères de structure I, les plus intéressants (en raison de leur mode d'obtention et du grand nombre d'études qui leur ont été consacrées) sont ceux excrétés par la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 dans son milieu de culture selon WO 93/18174 A ; conviennent également les OU (voire les PU) présents ou produits au niveau des parois de certaines souches fongiques appartenant au genre des mucorales (voir l'article de G. de RUITER et al. précité).
Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 est variable selon les conditions opératoires. Comme explicité par P. MICHAUD et al., Lett. Appl. Microbiol., 1995; 20: 110-112, la présence d'ion Mg2+ induisant une augmentation du nombre de groupes acétyle dans la molécule et dans les unités glucuroniques. Par exemple l'ajout de 0,8 g/L/24 heures de MgS04,7H20 dans le milieu de culture de la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 conduit à un tAc supérieur à celui résultant de l'ajout de 0,2 g/L de MgS04.7H20 (milieu standard), avec un taux élevé d'unités glucuroniques 2,3-di-O-acétylées.
La variation des conditions de culture permet donc de déf nir trois PU,
par traitement supplémentaire (RPc) à partir de la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 :
RPa précité, dit "glucuronane natif' ou "glucuronane standard", RPb précité, dit "glucuronane hautement acétylé", qui est produit en milieu complet additionné d'ions Mg2+, et RPc précité, dit "glucuronane désacétylé" (0 % d'acétylation) obtenu par désacétylation alcaline (NaOH ou KOH, à pH 12, à 50 [deg]C , pendant 12 h) de RPa ou RPb.
D'autres polysaccharides ou oligosaccharides d'origines diverses sont susceptibles de contenir dans leur molécule la structure I. On peut notamment citer, en tant que substrats de glucuronane lyases, les polymères qui suivent.
Ulvane L'ulvane est un polysaccharide hydrosoluble extrait d'une algue comestible (Ulva sp.) de structure xylorhamnoglucuronane sulfaté (voir notamment B. RAY et al., Carbohyd. Res., 1995; 274: 251-261; et M. LAHAYE Carbohyd. Res. 1998; 314: 1-12) composé essentiellement de
(1,].
Celluloses oxydées Les celluloses oxydées sont des produits du type acides polyglucuroniques ou co-polyglucuroniques obtenus par oxydation régiosélective en position C6 de la cellulose à l'aide de 2,2,6,6tetraméthylpipéridine-1-oxyde et d'un hypochlorite de métal alcalin (voir FR 2831171 A).
Chondroitines sulfates Les ChS sont des composés abondants de la matrice extracellulaire des cartilages articulaires. Ils sont extraits industriellement à partir de trachées de boeuf. Ils sont constitués d'une région de liaison au protéoglycane (liaison par une sérine) et d'une unité de répétition. Cette dernière est
galactosamine (GalpNac), et en C-2 du résidu GlcpA. Les trois principaux types de ChS sont les ChS A, ChS B (dermatan sulfate) et ChS C. Glucuronanes modifiés chimiquement Font partie de ce groupe les polymères qui résultent des (1 4)-beta -Dglucuronanes (acétylés ou non), comme indiqué plus haut, par modifi- cations chimiques du type éthérification, estérification, phosphorylation ou sulfatation (voir PETIT et al.précité).
Préparation de la substance enzymatique et de la souche productrice Le procédé de préparation de la substance enzymatique comprend, en premier lieu, la sélection d'une souche productrice. Dans cette optique, on cultive la souche à tester, susceptible de fournir l'activité glucuronane lyase souhaitée, sur un milieu nutritif minimal contenant du glucuronane (notamment une teneur de l'ordre de 0,4 % p/v) en tant que seule source de carbone.
En pratique, on cultive la souche à tester sur un milieu nutritif spécifique de l'espèce de ladite souche, ledit milieu nutritif étant dépourvu de glucuronane en tant que source de carbone, puis on cultive cette souche sur le milieu nutritif minimal précité.
On recueille la souche à tester qui est apte à métaboliser le substrat glucuronane selon la (3-élimination précitée, qui est détectable par analyse spectrophotométrique des produits de dégradation à 235 nm.
De façon avantageuse, on retient les souches qui produisent une substance enzymatique ayant une activité spécifique glucuronane lyase qui, à l'état purifié, est : (a) supérieure ou égale à 50 U/mg, de préférence supérieure ou égale à 350 U/mg, vis-à-vis de RPa, (b) supérieure ou égale à 30 U/mg, de préférence supérieure ou égale à 150 U/mg, vis-à-vis de RPb, et (c) supérieure ou égale à 100 U/mg, de préférence supérieure ou égale à 500 U/mg, vis-à-vis de RPc.
Le mode de purification de la substance enzymatique selon l'invention comprend avantageusement la mise en u̇vre d'au moins une chromatographie liquide basse pression. (Si nécessaire, les composants de la substance enzymatique purifiée peuvent être ensuite séparés selon une méthode connue en soi). Dans bien des cas, ladite purification ne sera pas nécessaire, il suffira d'utiliser le milieu de culture de la souche productrice en tant que matière contenant ladite substance enzymatique d'activité glucuronane lyase.
Une souche produisant une substance enzymatique qui après purification a une activité enzymatique spécifique inférieure à (i) 50 U/mg vis-à-vis de RPa, (ii) 30 U/mg vis-à-vis de RPb et (iii) 100 U/mg vis-à-vis de RPc, est réputée non pratique sur le plan industriel (a) pour le clivage des glucuronanes à enchaînement (3(1-4) et (b) son utilisation dans le domaine phytosanitaire.
La substance enzymatique selon l'invention peut être composée d'une ou plusieurs glucuronane lyases provenant d'un seul microorganisme ou de plusieurs microorganismes. Les bactéries donnent en général une seule glucuronane lyase, et les moisissures donnent souvent deux glucuronane lyases voire même plus de deux glucuronane lyases.
La substance enzymatique préférée selon l'invention est celle produite par la souche Trichoderma CNCM 1-3400. Elle se distingue par son activité spécifique (exprimée en U/mg de protéine) de la substance enzymatique produite par la souche précitée Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472, eu égard aux résultats consignés dans le tableau 1 ci-après.
Comme indiqué plus haut, la substance enzymatique selon l'invention clive les glucuronanes à enchaînement beta (1-4) ayant un dp supérieur ou égal à 3. Les substrats que l'on se propose de cliver sont, d'une part, des (1 4)(3-D-glucuronanes homopolymères et, d'autre part, des polysaccharides
enzymatique desdits glucuronanes homopolymères conduit à des oligoglucuronanes, celle desdits polysaccharides à des oligosaccharides.
Cette dépolymérisation enzymatique est avantageusement mise en u̇vre au moyen d'une substance enzymatique ayant une activité de glucuronane lyase, d'origine fongique, qui provient de préférence d'une souche de Trichoderma, et mieux de la souche Trichoderma CNCM 1-3400.
Par structure glucuronane, on entend ici la structure de formule 1 à enchaînement beta (1-4) :
dans laquelle R est H ou acyle, notamment acétyle, et n est 0 ou un nombre entier ayant pour valeur 1 à 2500. (Quand n = 0, on a affaire au OU dimère ; quand n = 1, on a affaire au OU trimère, quand n = 2, on a affaire au OU tétramère ; quand n = 2498, on a affaire à un PU ayant un dp de 2500.) Sous le terme générique de "glucuronanes", qui englobe les OU et PU éventuellement acétylés, sont également inclus les dérivés éthers résultant de l'éthérification des groupes hydroxyle de la structure I, ainsi que les sels et les esters résultant de la salification ou, respectivement, de l'estérification de tout groupe acide carboxylique en C6 de l'unité glucuroniqle.Tous ces dérivés et les produits acylés, où les groupes R = acyle sont différents du groupe acétyle, peuvent être préparés selon une méthode connue en soi par application de mécanismes réactionnels classiques, comme indiqué dans WO 93/18174 A précité ou dans l'article de E. PETIT et al., J. Biomacromol., 2004 : 5(2) ;445-452, avant ou après clivage des structures
glucuronane lyase selon l'invention.
Si un dérivé ester, éther ou acylé (où R est différent de COCH3) de la structure PU de formule 1 ne peut pas être clivé par la substance enzymatique d'activité glucuronane lyase selon l'invention, il suffit (a) de transformer ledit dérivé en glucuronane éventuellement acétylé, (beta ) de cliver ce dernier, puis (y) de restaurer selon une méthode connue en soi le ou les substituants ester, éther ou acyle du dérivé de départ.
Parmi l'ensemble des "glucuronanes", on distingue les PU qui ont une masse moléculaire supérieure à 50 kDa, d'une part, et les OU qui ont une masse moléculaire inférieure ou égale à 50 kDa. Pour les essais rapportés plus loin, on s'intéressera aux OU ayant une masse moléculaire inférieure ou égale à 5kDa, et notamment aux produits ayant un dp inférieur ou égal à 15.
Les substrats Parmi les polysaccharides clivables par la substance enzymatique selon l'invention, on peut notamment citer les PU et les OU homopolymères, d'une part, et les polysaccharides mixtes comprenant dans leur molécule un ou plusieurs fragments PU ou OU dans leur rr.olécules.
Parmi les PU homopolymères de structure I, les plus intéressants (en raison de leur mode d'obtention et du grand nombre d'études qui leur ont été consacrées) sont ceux excrétés par la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 dans son milieu de culture selon WO 93/18174 A ; conviennent également les OU (voire les PU) présents ou produits au niveau des parois de certaines souches fongiques appartenant au genre des mucorales (voir l'article de G. de RUITER et al. précité).
Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 est variable selon les conditions opératoires. Comme explicité par P. MICHAUD et al., Lett. Appl. Microbiol., 1995; 20: 110-112, la présence d'ion Mg2+ induisant une augmentation du nombre de groupes acétyle dans la molécule et dans les unités glucuroniques. Par exemple l'ajout de 0,8 g/L/24 heures de MgS04,7H20 dans le milieu de culture de la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 conduit à un tAc supérieur à celui résultant de l'ajout de 0,2 g/L de MgS04.7H20 (milieu standard), avec un taux élevé d'unités glucuroniques 2,3-di-O-acétylées.
La variation des conditions de culture permet donc de déf nir trois PU,
par traitement supplémentaire (RPc) à partir de la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 :
RPa précité, dit "glucuronane natif' ou "glucuronane standard", RPb précité, dit "glucuronane hautement acétylé", qui est produit en milieu complet additionné d'ions Mg2+, et RPc précité, dit "glucuronane désacétylé" (0 % d'acétylation) obtenu par désacétylation alcaline (NaOH ou KOH, à pH 12, à 50 [deg]C , pendant 12 h) de RPa ou RPb.
D'autres polysaccharides ou oligosaccharides d'origines diverses sont susceptibles de contenir dans leur molécule la structure I. On peut notamment citer, en tant que substrats de glucuronane lyases, les polymères qui suivent.
Ulvane L'ulvane est un polysaccharide hydrosoluble extrait d'une algue comestible (Ulva sp.) de structure xylorhamnoglucuronane sulfaté (voir notamment B. RAY et al., Carbohyd. Res., 1995; 274: 251-261; et M. LAHAYE Carbohyd. Res. 1998; 314: 1-12) composé essentiellement de
(1,].
Celluloses oxydées Les celluloses oxydées sont des produits du type acides polyglucuroniques ou co-polyglucuroniques obtenus par oxydation régiosélective en position C6 de la cellulose à l'aide de 2,2,6,6tetraméthylpipéridine-1-oxyde et d'un hypochlorite de métal alcalin (voir FR 2831171 A).
Chondroitines sulfates Les ChS sont des composés abondants de la matrice extracellulaire des cartilages articulaires. Ils sont extraits industriellement à partir de trachées de boeuf. Ils sont constitués d'une région de liaison au protéoglycane (liaison par une sérine) et d'une unité de répétition. Cette dernière est
galactosamine (GalpNac), et en C-2 du résidu GlcpA. Les trois principaux types de ChS sont les ChS A, ChS B (dermatan sulfate) et ChS C. Glucuronanes modifiés chimiquement Font partie de ce groupe les polymères qui résultent des (1 4)-beta -Dglucuronanes (acétylés ou non), comme indiqué plus haut, par modifi- cations chimiques du type éthérification, estérification, phosphorylation ou sulfatation (voir PETIT et al.précité).
Préparation de la substance enzymatique et de la souche productrice Le procédé de préparation de la substance enzymatique comprend, en premier lieu, la sélection d'une souche productrice. Dans cette optique, on cultive la souche à tester, susceptible de fournir l'activité glucuronane lyase souhaitée, sur un milieu nutritif minimal contenant du glucuronane (notamment une teneur de l'ordre de 0,4 % p/v) en tant que seule source de carbone.
En pratique, on cultive la souche à tester sur un milieu nutritif spécifique de l'espèce de ladite souche, ledit milieu nutritif étant dépourvu de glucuronane en tant que source de carbone, puis on cultive cette souche sur le milieu nutritif minimal précité.
On recueille la souche à tester qui est apte à métaboliser le substrat glucuronane selon la (3-élimination précitée, qui est détectable par analyse spectrophotométrique des produits de dégradation à 235 nm.
De façon avantageuse, on retient les souches qui produisent une substance enzymatique ayant une activité spécifique glucuronane lyase qui, à l'état purifié, est : (a) supérieure ou égale à 50 U/mg, de préférence supérieure ou égale à 350 U/mg, vis-à-vis de RPa, (b) supérieure ou égale à 30 U/mg, de préférence supérieure ou égale à 150 U/mg, vis-à-vis de RPb, et (c) supérieure ou égale à 100 U/mg, de préférence supérieure ou égale à 500 U/mg, vis-à-vis de RPc.
Le mode de purification de la substance enzymatique selon l'invention comprend avantageusement la mise en u̇vre d'au moins une chromatographie liquide basse pression. (Si nécessaire, les composants de la substance enzymatique purifiée peuvent être ensuite séparés selon une méthode connue en soi). Dans bien des cas, ladite purification ne sera pas nécessaire, il suffira d'utiliser le milieu de culture de la souche productrice en tant que matière contenant ladite substance enzymatique d'activité glucuronane lyase.
Une souche produisant une substance enzymatique qui après purification a une activité enzymatique spécifique inférieure à (i) 50 U/mg vis-à-vis de RPa, (ii) 30 U/mg vis-à-vis de RPb et (iii) 100 U/mg vis-à-vis de RPc, est réputée non pratique sur le plan industriel (a) pour le clivage des glucuronanes à enchaînement (3(1-4) et (b) son utilisation dans le domaine phytosanitaire.
La substance enzymatique selon l'invention peut être composée d'une ou plusieurs glucuronane lyases provenant d'un seul microorganisme ou de plusieurs microorganismes. Les bactéries donnent en général une seule glucuronane lyase, et les moisissures donnent souvent deux glucuronane lyases voire même plus de deux glucuronane lyases.
La substance enzymatique préférée selon l'invention est celle produite par la souche Trichoderma CNCM 1-3400. Elle se distingue par son activité spécifique (exprimée en U/mg de protéine) de la substance enzymatique produite par la souche précitée Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472, eu égard aux résultats consignés dans le tableau 1 ci-après.
Tableau 1
Utilisation phytosanitaire L'activité antifongique des glucuronane lyases a été testée sur deux souches modèles de champignon phytopathogène : Botryotinia fuckeliana CECT 2850 et Rhizoctonia solani CECT 2813 (Colleccion Española de Cultivos Tipo, Université de Valence, Campus de Burjasot, Espagne). Voir essai 4 ci-après.
Par ailleurs, on préconise une autre utilisation de la substance enzymatique selon l'invention. Cette utilisation comprend la production à l'échelle industrielle d'oligoglucuronanes de degré de polymérisation inférieur ou égal à 15, et mieux d'oligoglucuronanes ce degré de polymérisation inférieur ou égal à 8, pour l'usage desdits oligoglucuronanes notamment en agriculture en tant qu'agents phytosanitaires et/o fertilisants.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation et d'essais. Bien entendu, l'ensemble de ces éléments n'est pas limitatif mais est donné à titre d'illustration.
Exemple 1 Préparation de RPa On cultive la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 4C472 à 30 [deg]C dans un bioréacteur de 20 L contenant 15 L de RC additionné de 1 % (p/v) de saccharose (milieu RCS). On prélève 1,5 L de milieu RCS inoculé avec la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472, puis incube pendant 20 h à 30 [deg]C au moyen d'un agitateur rotatif opérant à 100 tours/min.
Après 72 à 96 h de culture, les bouillons sont centrifugés à 33 900 g pendant 40 min à 20 [deg]C et on recueille l'ensemble des surnageants. Les polysaccharides présents dans les bouillons dépourvus de cellules sont précipités par addition de 3 volumes d'isopropanol et recueillis par centrifugation à 33 900 g pendant 40 min à 20 [deg]C. Après lyophilisation, les granules de glucuronanes sont dissous (4 g/L) dans H2O et on répète deux fois la précipitation à l'isopropanol.
On obtient le produit RPa annoncé, qui est ici le produit RPal précité. Exemple 2 Préparation de RPb On procède comme indiqué à l'exemple 1, avec la différence que l'on incorpore au début dans le bioréacteur 0,2 % p/v ou 0.08 % p/v/24 heures de MgS04.7H20 pour l'obtention infime du produit RPb hautement acétylé attendu, qui est ici le produit RPb précité.
Exemple 3 Préparation de RPc On procède à la désacétylation de RPa, obtenu selon l'exemple 1, par traitement avec KOH (2M) à 50 [deg]C (pH 12) pendant 12 h. Le produit brut obtenu est purifié comme indiqué à l'exemple 1.
Exemple 4 Sélection de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 Cette souche a été isolée en deux étapes : (1[deg]) sélection sur milieu sélectif pour les champignons filamenteux appartenant à la famille des Trichoderma, à savoir TSM, et (2[deg]) sélection des souches précédemment isolées sur un milieu minimal, à savoir TMM additionné de C,3 % p/v de glucuronane (ou d'un autre polysaccharide comportant le motif glucuronane dans leur structure) en tant que seule source de carbone.
La souche Trichoderma CNCM 1-3400, qui a été ainsi sélectionnée, est ensuite incubée à 25 [deg]C puis maintenue à 4 [deg]C sur gélose de pomme de terre (milieu PDA, disponible au près de la société dite BIOKAR DIAGNOSTICS, France). La substance enzymatique qu'elle excrète comprend deux glucuronane lyases.
Exemple 5 Expression des activités glucuronane lyase Les glucuronane lyases exprimées par la souche Trichoderma CNCM 1-3400 sont des enzymes induits par la présence de glucuronane dans le milieu de culture. Leur production est réalisée en deux étapes.
La première étape consiste à inoculer un volume de milieu TCM stérile additionné de glucose (0.3 % p/v) avec un morceau de mycélium de 7 mm de diamètre prélevé sur gélose PDT. Après incubation 48 heures à 25 [deg]C sous une agitation de 100 tours/min, le mycélium est récupéré stérilement par centrifugation (3000 tours/min, pendant 10 min, à 4[deg]C) et lavé deux fois avec du milieu TMM stérile.
Au début de la seconde étape, le mycélium est transféré dans 10 volumes de milieu TMM stérile additionné de glucuronane (0.4 % p/v). Après 96 heures d'incubation à 25 [deg]C sous agitation à 100 tours/min, le mycélium est éliminé du milieu par filtration sous vide sur verre fritté (N[deg] 0 puis N[deg]3), puis sur filtre en acétate de cellulose de 0,22 Microm. L'extrait extracellulaire ainsi obtenu est alors concentré 40 fois par filtration tangentielle sur une membrane de 10 kDa en polysulfone, et ensuite conservé par congélation à -80[deg]C.
Utilisation phytosanitaire L'activité antifongique des glucuronane lyases a été testée sur deux souches modèles de champignon phytopathogène : Botryotinia fuckeliana CECT 2850 et Rhizoctonia solani CECT 2813 (Colleccion Española de Cultivos Tipo, Université de Valence, Campus de Burjasot, Espagne). Voir essai 4 ci-après.
Par ailleurs, on préconise une autre utilisation de la substance enzymatique selon l'invention. Cette utilisation comprend la production à l'échelle industrielle d'oligoglucuronanes de degré de polymérisation inférieur ou égal à 15, et mieux d'oligoglucuronanes ce degré de polymérisation inférieur ou égal à 8, pour l'usage desdits oligoglucuronanes notamment en agriculture en tant qu'agents phytosanitaires et/o fertilisants.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation et d'essais. Bien entendu, l'ensemble de ces éléments n'est pas limitatif mais est donné à titre d'illustration.
Exemple 1 Préparation de RPa On cultive la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 4C472 à 30 [deg]C dans un bioréacteur de 20 L contenant 15 L de RC additionné de 1 % (p/v) de saccharose (milieu RCS). On prélève 1,5 L de milieu RCS inoculé avec la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472, puis incube pendant 20 h à 30 [deg]C au moyen d'un agitateur rotatif opérant à 100 tours/min.
Après 72 à 96 h de culture, les bouillons sont centrifugés à 33 900 g pendant 40 min à 20 [deg]C et on recueille l'ensemble des surnageants. Les polysaccharides présents dans les bouillons dépourvus de cellules sont précipités par addition de 3 volumes d'isopropanol et recueillis par centrifugation à 33 900 g pendant 40 min à 20 [deg]C. Après lyophilisation, les granules de glucuronanes sont dissous (4 g/L) dans H2O et on répète deux fois la précipitation à l'isopropanol.
On obtient le produit RPa annoncé, qui est ici le produit RPal précité. Exemple 2 Préparation de RPb On procède comme indiqué à l'exemple 1, avec la différence que l'on incorpore au début dans le bioréacteur 0,2 % p/v ou 0.08 % p/v/24 heures de MgS04.7H20 pour l'obtention infime du produit RPb hautement acétylé attendu, qui est ici le produit RPb précité.
Exemple 3 Préparation de RPc On procède à la désacétylation de RPa, obtenu selon l'exemple 1, par traitement avec KOH (2M) à 50 [deg]C (pH 12) pendant 12 h. Le produit brut obtenu est purifié comme indiqué à l'exemple 1.
Exemple 4 Sélection de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 Cette souche a été isolée en deux étapes : (1[deg]) sélection sur milieu sélectif pour les champignons filamenteux appartenant à la famille des Trichoderma, à savoir TSM, et (2[deg]) sélection des souches précédemment isolées sur un milieu minimal, à savoir TMM additionné de C,3 % p/v de glucuronane (ou d'un autre polysaccharide comportant le motif glucuronane dans leur structure) en tant que seule source de carbone.
La souche Trichoderma CNCM 1-3400, qui a été ainsi sélectionnée, est ensuite incubée à 25 [deg]C puis maintenue à 4 [deg]C sur gélose de pomme de terre (milieu PDA, disponible au près de la société dite BIOKAR DIAGNOSTICS, France). La substance enzymatique qu'elle excrète comprend deux glucuronane lyases.
Exemple 5 Expression des activités glucuronane lyase Les glucuronane lyases exprimées par la souche Trichoderma CNCM 1-3400 sont des enzymes induits par la présence de glucuronane dans le milieu de culture. Leur production est réalisée en deux étapes.
La première étape consiste à inoculer un volume de milieu TCM stérile additionné de glucose (0.3 % p/v) avec un morceau de mycélium de 7 mm de diamètre prélevé sur gélose PDT. Après incubation 48 heures à 25 [deg]C sous une agitation de 100 tours/min, le mycélium est récupéré stérilement par centrifugation (3000 tours/min, pendant 10 min, à 4[deg]C) et lavé deux fois avec du milieu TMM stérile.
Au début de la seconde étape, le mycélium est transféré dans 10 volumes de milieu TMM stérile additionné de glucuronane (0.4 % p/v). Après 96 heures d'incubation à 25 [deg]C sous agitation à 100 tours/min, le mycélium est éliminé du milieu par filtration sous vide sur verre fritté (N[deg] 0 puis N[deg]3), puis sur filtre en acétate de cellulose de 0,22 Microm. L'extrait extracellulaire ainsi obtenu est alors concentré 40 fois par filtration tangentielle sur une membrane de 10 kDa en polysulfone, et ensuite conservé par congélation à -80[deg]C.
Trichoderma CNCM 1-3400 d'activité glucuronar e lyase
Exemple 6 Purification de la substance enzymatique de la souche La purification de la substance enzymatique de l'exemple 5 est réalisée comme indiqué ci-après. On décongèle et dissout dans un milieu approprié le produit obtenu à l'exemple 5.On procède ensuite à au moins une chromatographie basse pression (SEC et échange d'anions) pour obtenir le produit purifié attendu.
Le clivage des PU, tels que RPc, par cette substance enzymatique purifiée obtenue selon l'exemple 6 est illustré par les tableaux II et III fournis ci-après.
La glucuronane lyase de la souche Sinorhizobium mehloti NCIMB 40472 est purifiée pour comparaison selon la technique de l'exemple 6.
Essai 1 Mesure des activités de glucuronane lyase Les activités glucuronane lyase sont quantifiées par spectrophotométrie en mesurant l'augmentation de l'absorbance à 235 nm. Le mélange réactionnel est composé de 1 ml de glucuronane à 0.2 % (p/v) dans un tampon acétate de potassium (50 mM, à pH 5,5) additionné de 10 Microl d'extrait enzymatique ou d'enzyme pur (5 à 10 fil). Dans ces conditions, les extraits extracellulaires (fraction non purifiée) de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 ont une activité spécifique de 5 U/mg de protéines, selon la méthode de dosage au BCA (SMITH et al., Anal. Biochem., 19 5; 150: 7685). L'augmentation d'absorbance à 235 nm est caractéristique de ladite beta élimination enzymatique.
Essai 2 Caractérisation des glucuronane lyases exprimées Deux glucuronane lyases ont été détectées sur les extraits extracellulaires de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 en utilisant la technique de l'électrophorèse SDS-PAGE en conditions non dénaturantes. Les activités de ces protéines sont identifiées lorsque le gel de séparation utilisé dans cette technique est additionné de glucuronane à hauteur de 0.4 % (p/v).
Après migration des protéines sous l'influence d'un champ électrique (200 V), le gel est renaturé par 3 bains successifs dans un tampcn acétate de potassium (50 mM, à pH 5,5) et les activités de glucuronane lyase détectées par précipitation du glucuronane au chlorure de cétylpyridinium (10 % p/v). Les deux activités de glucuronane lyase apparaissent alors chacune comme un spot translucide sur fond blanc. Leurs masses molaires ont été déterminées à 18,6 et 27 kDa.
L'activité détectée sur les extraits cellulaires est majoritairement due à la protéine de 27 kDa.
Dans ce qui suit, par "glucuronane lyases" ou "glucuronane lyases fongiques" on entend, sauf indication contraire, l'extrait ou le milieu de culture de Trichoderma CNCM 1-3400 contenant les deux enzymes précités.
Essai 3 Production d'oligoglucuronanes Les glucuronane lyases selon l'invention permettent l'obtention de larges gammes de motifs OU à enchaînement beta (1-4) de dp et de degré de substitutions variés par dépolymérisation enzymatique ((3-élimination) des 3 familles de PU, les RPa, RPb et RPc. L'activité apparaît comme très spécifique. Elle est particulièrement augmentée par rapport aux glucuronane lyases bactériennes, et en particulier par rapport à la glucuronane lyase de Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472.
Les PU sont dégradés par les glucuronane lyases fongiques selon deux techniques : (a) après purification ou (b) en cours de synthèse.
Dans tous les cas ils peuvent être purifiés à l'état de mélanges d'oligosaccharides de degrés de polymérisation moyens ou à l'état d'oligosaccharides purs. Les techniques de purification mises en u̇vre sont : la chromatographie d'exclusion stérique sur support Biogel P2 et/ou P6 et la chromatographie échangeuse d'anions (DEAE Sépharose).
(a) Dégradation des glucuronanes purifiés.
Les glucuronanes sont dans ce cas purifiés après fermentation par ultrafiltration tangentielle sur membrane de 100 kDa ou précipitation alcoolique (3 volumes d'isopropanol pour un volume de moût de fermentation débarrassé de la biomasse). Ils sont incubés dans l'eau en présence de l'extrait enzymatique à raison de 20 U/g de glucuronane pendant 72 heures à 25 [deg]C. Dans ces conditions :
la dégradation de RPc conduit à un mélange d'OU insaturés et désacétylés de dp moyen 3.
la dégradation de RPa conduit à un mélange d'OU de dp moyen 6,5. Le taux global d'estérification de ces oligosaccharides est de l'ordre de 45 % ; la désacétylation de ce mélange par action de NaOH (pH 12; 50 [deg]C; 12 h) permet l'obtention d'un mélange d'OU désacétylés de dp moyen 6,5 ; et la dégradation de RPb conduit à un mélange de formes polysaccharidiques de faibles masses molaires présentant un tAc de 75 %.
(b) Dégradation des glucuronanes en cours de synthèse Les glucuronane lyases de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 sont utilisables, pour la préparation d'OU insaturés, par dégradatior. des PU au cours de leur excrétion par la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 cultivée en bioréacteur dans un milieu RC supplémenté saccharose.
Dans le cas de conditions de culture standard, a substance enzymatique d'activité glucuronane lyase est ajoutée stérilement au moût de fermentation à raison de 33 U/L de culture bactérienne. Deux conditions expérimentales sont utilisées : (1[deg]) ajout des glucuronane lyases dès le début de biosynthèse de l'exopolymère, (2[deg]) ajout des glucuronane lyases en fin de production (75 heures de fermentation) en présence de NaN3 à 2,5 mM et incubation 72 heures à 30 [deg]C.
Dans les deux conditions les glucuronane lyases conduisent essentiellement à la production d'un seul type d'OU désacéty é et insaturé de dp3.
En fonction des durées d'incubation dans le cas d'un ajout d'extrait à 72 heures de fermentation, il est possible d'orienter la production vers un mélange d'OU insaturés de dp moyen supérieur à 3.
Dans le cas de conditions de culture conduisant à la production de RPb, l'enzyme est ajoutée stérilement au moût de fermentation à raison de 33 U/L de culture bactérienne. Deux conditions expérimentales sont utilisées : (1) ajout des glucuronane lyases dès le début de la bi synthèse de l'exopolymère, (2) ajout des glucuronane lyases en fin de production (75 heures de fermentation) en présence de NaN3 à 2,5 mM et incubation 72 heures à 30 [deg]C.
Les conditions d'ajout de glucuronane lyases en fin de processus de fermentation conduisent à la formation de formes de failles masses molaires (MM>5 kDa.) insaturés et acétylés. L'ajout de l'extrait enzymatique en phase initiale de production de glucuronane conduit à un mélange de formes polysaccharidiques de faibles masse moléculaires acétylés et insaturés (MM>5 kDa).
Essai 4 Utilisation des glucuronane lyases comme antifongiques Les souches phytopathogènes : Botryotinia fuckeliana CECT 2850 et Rhizoctonia solani CECT 2813 ont été maintenues en gélose PDA à 4[deg]C.
500 Microl (2,3 mg/ml de protéines) d'extrait extracellulaire de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 préparé comme décrit à l'exemple 5, filtrés stérilement sur filtres 0,22 Microm sont additionnés à 25 ml de gélose PDA en surfusion à 45 [deg]C. Dans un autre essai, cet extrait est remplacé par 500 MicroL d'un concentré extracellulaire de la souche Trichoderma CNCM 1-3400, cultivée sur TMM glucose (0.4 % p/v), et ajusté à la même concentration protéique que celle de l'extrait précédent. 500 Microl d'eau stérile sont inclus dans 25 ml de gélose PDA dans les mêmes conditions pour constituer un témoin. Après solidification de l'agar, des disques de mycélium de 7 mm de diamètre, obtenus sur des cultures de souches phytopathogène modèles en croissance, sont déposés au centre de chaque boite de Pétri. Les milieux sont incubés 4 jours à 25 [deg]C.La croissance de chaque souche phytopathogène est évaluée par mesure du diamètre du mycélium. L'expérimentation est répétée trois fois. Le degré d'inhibition (I %) est exprimé par la relation :
1 % = 100-(A/B x 100) où A est le diamètre de la colonie incubée avec un extrait de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 et B celui du contrôle.
Dans les conditions testées, 100 % et 42 % d'inhibition de croissance ont été constatés après 84 heures de croissance pour respectivement les souches : Botryotinia fuckeliana CECT 2850 et Rhizoctonia solani CECT 2813, lorsque la gélose est additionnée de glucuronane lyases. Cet effet n'est pas visualisé pour les géloses additionnées d'un extrait obtenu par culture de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 sur milieu additionné de glucose.
Exemple 6 Purification de la substance enzymatique de la souche La purification de la substance enzymatique de l'exemple 5 est réalisée comme indiqué ci-après. On décongèle et dissout dans un milieu approprié le produit obtenu à l'exemple 5.On procède ensuite à au moins une chromatographie basse pression (SEC et échange d'anions) pour obtenir le produit purifié attendu.
Le clivage des PU, tels que RPc, par cette substance enzymatique purifiée obtenue selon l'exemple 6 est illustré par les tableaux II et III fournis ci-après.
La glucuronane lyase de la souche Sinorhizobium mehloti NCIMB 40472 est purifiée pour comparaison selon la technique de l'exemple 6.
Essai 1 Mesure des activités de glucuronane lyase Les activités glucuronane lyase sont quantifiées par spectrophotométrie en mesurant l'augmentation de l'absorbance à 235 nm. Le mélange réactionnel est composé de 1 ml de glucuronane à 0.2 % (p/v) dans un tampon acétate de potassium (50 mM, à pH 5,5) additionné de 10 Microl d'extrait enzymatique ou d'enzyme pur (5 à 10 fil). Dans ces conditions, les extraits extracellulaires (fraction non purifiée) de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 ont une activité spécifique de 5 U/mg de protéines, selon la méthode de dosage au BCA (SMITH et al., Anal. Biochem., 19 5; 150: 7685). L'augmentation d'absorbance à 235 nm est caractéristique de ladite beta élimination enzymatique.
Essai 2 Caractérisation des glucuronane lyases exprimées Deux glucuronane lyases ont été détectées sur les extraits extracellulaires de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 en utilisant la technique de l'électrophorèse SDS-PAGE en conditions non dénaturantes. Les activités de ces protéines sont identifiées lorsque le gel de séparation utilisé dans cette technique est additionné de glucuronane à hauteur de 0.4 % (p/v).
Après migration des protéines sous l'influence d'un champ électrique (200 V), le gel est renaturé par 3 bains successifs dans un tampcn acétate de potassium (50 mM, à pH 5,5) et les activités de glucuronane lyase détectées par précipitation du glucuronane au chlorure de cétylpyridinium (10 % p/v). Les deux activités de glucuronane lyase apparaissent alors chacune comme un spot translucide sur fond blanc. Leurs masses molaires ont été déterminées à 18,6 et 27 kDa.
L'activité détectée sur les extraits cellulaires est majoritairement due à la protéine de 27 kDa.
Dans ce qui suit, par "glucuronane lyases" ou "glucuronane lyases fongiques" on entend, sauf indication contraire, l'extrait ou le milieu de culture de Trichoderma CNCM 1-3400 contenant les deux enzymes précités.
Essai 3 Production d'oligoglucuronanes Les glucuronane lyases selon l'invention permettent l'obtention de larges gammes de motifs OU à enchaînement beta (1-4) de dp et de degré de substitutions variés par dépolymérisation enzymatique ((3-élimination) des 3 familles de PU, les RPa, RPb et RPc. L'activité apparaît comme très spécifique. Elle est particulièrement augmentée par rapport aux glucuronane lyases bactériennes, et en particulier par rapport à la glucuronane lyase de Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472.
Les PU sont dégradés par les glucuronane lyases fongiques selon deux techniques : (a) après purification ou (b) en cours de synthèse.
Dans tous les cas ils peuvent être purifiés à l'état de mélanges d'oligosaccharides de degrés de polymérisation moyens ou à l'état d'oligosaccharides purs. Les techniques de purification mises en u̇vre sont : la chromatographie d'exclusion stérique sur support Biogel P2 et/ou P6 et la chromatographie échangeuse d'anions (DEAE Sépharose).
(a) Dégradation des glucuronanes purifiés.
Les glucuronanes sont dans ce cas purifiés après fermentation par ultrafiltration tangentielle sur membrane de 100 kDa ou précipitation alcoolique (3 volumes d'isopropanol pour un volume de moût de fermentation débarrassé de la biomasse). Ils sont incubés dans l'eau en présence de l'extrait enzymatique à raison de 20 U/g de glucuronane pendant 72 heures à 25 [deg]C. Dans ces conditions :
la dégradation de RPc conduit à un mélange d'OU insaturés et désacétylés de dp moyen 3.
la dégradation de RPa conduit à un mélange d'OU de dp moyen 6,5. Le taux global d'estérification de ces oligosaccharides est de l'ordre de 45 % ; la désacétylation de ce mélange par action de NaOH (pH 12; 50 [deg]C; 12 h) permet l'obtention d'un mélange d'OU désacétylés de dp moyen 6,5 ; et la dégradation de RPb conduit à un mélange de formes polysaccharidiques de faibles masses molaires présentant un tAc de 75 %.
(b) Dégradation des glucuronanes en cours de synthèse Les glucuronane lyases de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 sont utilisables, pour la préparation d'OU insaturés, par dégradatior. des PU au cours de leur excrétion par la souche Sinorhizobium meliloti NCIMB 40472 cultivée en bioréacteur dans un milieu RC supplémenté saccharose.
Dans le cas de conditions de culture standard, a substance enzymatique d'activité glucuronane lyase est ajoutée stérilement au moût de fermentation à raison de 33 U/L de culture bactérienne. Deux conditions expérimentales sont utilisées : (1[deg]) ajout des glucuronane lyases dès le début de biosynthèse de l'exopolymère, (2[deg]) ajout des glucuronane lyases en fin de production (75 heures de fermentation) en présence de NaN3 à 2,5 mM et incubation 72 heures à 30 [deg]C.
Dans les deux conditions les glucuronane lyases conduisent essentiellement à la production d'un seul type d'OU désacéty é et insaturé de dp3.
En fonction des durées d'incubation dans le cas d'un ajout d'extrait à 72 heures de fermentation, il est possible d'orienter la production vers un mélange d'OU insaturés de dp moyen supérieur à 3.
Dans le cas de conditions de culture conduisant à la production de RPb, l'enzyme est ajoutée stérilement au moût de fermentation à raison de 33 U/L de culture bactérienne. Deux conditions expérimentales sont utilisées : (1) ajout des glucuronane lyases dès le début de la bi synthèse de l'exopolymère, (2) ajout des glucuronane lyases en fin de production (75 heures de fermentation) en présence de NaN3 à 2,5 mM et incubation 72 heures à 30 [deg]C.
Les conditions d'ajout de glucuronane lyases en fin de processus de fermentation conduisent à la formation de formes de failles masses molaires (MM>5 kDa.) insaturés et acétylés. L'ajout de l'extrait enzymatique en phase initiale de production de glucuronane conduit à un mélange de formes polysaccharidiques de faibles masse moléculaires acétylés et insaturés (MM>5 kDa).
Essai 4 Utilisation des glucuronane lyases comme antifongiques Les souches phytopathogènes : Botryotinia fuckeliana CECT 2850 et Rhizoctonia solani CECT 2813 ont été maintenues en gélose PDA à 4[deg]C.
500 Microl (2,3 mg/ml de protéines) d'extrait extracellulaire de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 préparé comme décrit à l'exemple 5, filtrés stérilement sur filtres 0,22 Microm sont additionnés à 25 ml de gélose PDA en surfusion à 45 [deg]C. Dans un autre essai, cet extrait est remplacé par 500 MicroL d'un concentré extracellulaire de la souche Trichoderma CNCM 1-3400, cultivée sur TMM glucose (0.4 % p/v), et ajusté à la même concentration protéique que celle de l'extrait précédent. 500 Microl d'eau stérile sont inclus dans 25 ml de gélose PDA dans les mêmes conditions pour constituer un témoin. Après solidification de l'agar, des disques de mycélium de 7 mm de diamètre, obtenus sur des cultures de souches phytopathogène modèles en croissance, sont déposés au centre de chaque boite de Pétri. Les milieux sont incubés 4 jours à 25 [deg]C.La croissance de chaque souche phytopathogène est évaluée par mesure du diamètre du mycélium. L'expérimentation est répétée trois fois. Le degré d'inhibition (I %) est exprimé par la relation :
1 % = 100-(A/B x 100) où A est le diamètre de la colonie incubée avec un extrait de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 et B celui du contrôle.
Dans les conditions testées, 100 % et 42 % d'inhibition de croissance ont été constatés après 84 heures de croissance pour respectivement les souches : Botryotinia fuckeliana CECT 2850 et Rhizoctonia solani CECT 2813, lorsque la gélose est additionnée de glucuronane lyases. Cet effet n'est pas visualisé pour les géloses additionnées d'un extrait obtenu par culture de la souche Trichoderma CNCM 1-3400 sur milieu additionné de glucose.
Tableau II
Tableau III
Rapports molaires des OU obtenus par clivage de RPc au moyen de la glucuronane lyase de l'exemple 6
Masse des OU de dpl, dp2 et dp3 obtenus par purification par chromatographie d'échange d'anions sur DEAE-sépharose en fonction de la durée d'incubation
Rapports molaires des OU obtenus par clivage de RPc au moyen de la glucuronane lyase de l'exemple 6
Masse des OU de dpl, dp2 et dp3 obtenus par purification par chromatographie d'échange d'anions sur DEAE-sépharose en fonction de la durée d'incubation
Claims (13)
1. Utilisation d'une substance enzymatique pour cliver les polysaccharides de la famille des acides polyglucuroniques/polyglucuronates, qui sont
(i) des glucuronanes homopolymères à enchaînement beta (1-4), ou
(ii) des polymères contenant un ou plusieurs fragments glucuronanes à enchaînement (3(1-4), ladite utilisation étant caractérisée en ce que l'on fait appel à une substance enzymatique dont l'activité glucuronane lyase spécifique, qui se traduit par une (3-élimination fournissant, selon le mécanisme schématique :
où le symbole représente une liaison avec un reste ose, et R est H ou un groupe acyle, notamment COCH3, un mélange d'oligoglucuronanes, quand le polysaccharide de départ est un glucuronane homopolymère, ou un mélange d'oligosaccharides, quand le polysaccharide de départ est un polymère contenant un ou plusieurs fragments glucuronanes, chacun desdits oligoglucuronanes et oligosaccharides présentant essentiellement, au niveau de chaque extrémité terminale non réductrice, un hétérocycle éthyléniquement insaturé de structure acide 4-déoxy-(hex-4-ène)pyranc syluronique
(A), est à l'état purifié :
(a) supérieure ou égale à 50 U/mg vis-à-vis d'un premier substrat de référence (RPa) constitué par un acide D-polyglucuronique à enchaînement beta (1-4) ayant une masse moléculaire moyenne supérieure à 50 k Da et ayant un taux moyen d'acétylation de 50 à 65 %, et
(b) supérieure ou égale à 30 U/mg vis-à-vis d'un second substrat de référence (RPb) constitué par un acide D-polyglucuronique à enchaînement beta (1-4) ayant une masse moléculaire moyenne supérieure à 50 kDa et ayant un taux moyen d'acétylation de 68 à 80 %.
2. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que ladite substance enzymatique est une glucuronane lyase d'origine fongique, qui provient notamment d'une souche choisie parmi l'ensemble des Trichoderma, en particulier de la souche Trichoderma CNCM 1-3400.
3. Utilisation suivant la revendication 2, caractérisée en ce que ladite substance enzymatique est la glucuronane lyase de 27 kDa provenant de la souche Trichoderma CNCM 1-3400.
4. Souche fongique apte à fournir ladite substance enzymatique, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche Trichoderma CNCM 1-3400.
5. Substance enzymatique capable de cliver les composés glucuronanes à enchaînement beta (1-4) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle a à l'état purifié une activité enzymatique de glucuronane lyase :
(a) supérieure ou égale à 50 U/mg vis-à-vis dudit premier substrat de référence (RPa),
(b) supérieure ou égale à 30 U/mg vis-à-vis dudit second substrat de référence (RPb), et
(c) supérieure ou égale à 100 U/mg vis-à-vis d'un troisième substrat de référence (RPc) constitué par un acide D-polyglucuronique à enchaînement P(l-4) ayant une masse moléculaire moyenne supérieure à 50 kDa, qui est totalement désacétylé et est obtenu à partir de RPa ou RPb par traitement avec un alcali (notamment avec NaOH ou KOH, à 50 [deg]C et à pF 12), ladite substance enzymatique étant composée d'une ou plusieurs glucuronane lyases.
6. Substance enzymatique suivant la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est d'origine fongique et provient notamment d'une souche de Trichoderma, en particulier de la souche Trichoderma CNCM 1-3400, l'activité glucuronane lyase de la substance enzymatique purifiée provenant de ladite souche Trichoderma CNCM 1-3400 étant supérieure à :
(a) 350 U/mg vis-à-vis de RPa,
(b) 150 U/mg vis-à-vis de RPb, et
(c) 500 U/mg vis-à-vis de RPc.
7. Substance enzymatique suivant la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi l'ensemble constitué par
(a) l'enzyme de 27 kDa provenant de la souche Trichoderma CNCM 1-3400, (beta ) l'enzyme de 18,6 kDa provenant de la souche Trichoderma CNCM 1-3400, et
(y) leurs mélanges.
8. Procédé pour la préparation d'une substance enzymatique suivant l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend une opération de sélection selon laquelle, on cultive une souche à tester, susceptible de produire au moins une glucuronase lyase, sur un milieu nutritif minimal spécifique de ladite souche à tester, ledit milieu nutritif contenant du glucuronane, en tant que source unique de carbone, notamment à une teneur de l'ordre de 0,4 % p/v ; on recueille ladite souche si elle se développe sur ledit milieu nutritif minimal et est apte à métaboliser un glucuronane par clivage selon le mécanisme de P-élimination donné dans la revendication 1 et détectable par spectrophotométrie à 235 nm.
9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte, avant la culture sur ledit milieu nutritif minimal, la culture de ladite souche à tester sur un milieu nutritif spécifique de ladite souche à tester et contenant une source de carbone dépourvue de glucuronane.
10. Procédé suivant la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il comprend la purification de la substance enzymatique, produite par la souche sélectionnée, par chromatographie liquide basse pression.
11. Procédé suivant la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que ladite opération de sélection consiste à retenir une souche qui fournit, à l'état purifié, une activité de glucuronane lyase :
(a) supérieure ou égale à 50 U/mg vis-à-vis dudit premier substrat de référence (RPa),
(b) supérieure ou égale à 30 U/mg vis-à-vis dudit secord substrat de référence (RPb), et
(c) supérieure ou égale à 100 U/mg vis-à-vis dudit troisième substrat de référence (RPc).
12. Composition phytosanitaire, caractérisée en ce qu'elle contient, en association avec un excipient physiologiquement acceptable, une dose phytosanitairement efficace d'au moins une substance enzymatique selon l'une quelconque des revendications 5 à 7.
13. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la production à l'échelle industrielle d' oligoglucuronanes de degré de polymérisation inférieur ou égal à 15, et mieux d'oligoglucuronanes de degré de polymérisation inférieur ou égal à 8, pour l'usage desdits oligoglucuronanes notamment en agriculture en tant qu'agents phytosanitaires et/ou fertilisants.
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| DELATTRE C ET AL: "Purification and characterization of a novel glucuronan lyase from Trichoderma sp. GL2", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 265, 16 July 2005 (2005-07-16), pages 437 - 443, XP002375138 * |
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