DE69731575T2

DE69731575T2 - Verfahren zur Herstellung von sulfatierten Lactosamin-Oligosacchariden

Info

Publication number: DE69731575T2
Application number: DE69731575T
Authority: DE
Inventors: Osami Nagoya-Shi Habuchi
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-04-01
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2017-04-02
Also published as: JPH09263595A; JP4023848B2; DE69731575D1; EP0798385A2; EP0798385B1; EP0798385A3; US5955325A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung eines sulfatierten Lactosamin-Oligosaccharids. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines sulfatierten nicht-fucosylierten Lactosamin-Oligosaccharids, welches auf der Verwendung einer Enzymreaktion basiert.
Die aus Lactosamin-Rückgraten bestehenden Zuckerketten bieten als den Ligand eine Zuckerkette, die die Fähigkeit aufweist, die zu der Selektin-Familie gehörenden Zelladhäsions-Moleküle zu binden, und sie exprimieren auf diese Weise wichtige physiologische Aktivitäten in vivo. Es ist aufgeklärt worden, dass eine Expression solcher Zuckerketten auf Zelloberflächen an der spezifischen Adhäsion zwischen verschiedenartigen Zellen beteiligt ist. Von funktional aktivierenden Wirkstoffen und supprimierenden Wirkstoffen, die auf der Verwendung dieser Zuckerketten basieren, wird erwartet, dass sie als Arzneimittel nützlich sind. Und zwar wird es angenommen, dass diese Zuckerketten als ihre Hauptzusammensetzung Sialyl Lewis^x (SLe^x) und seine Analogons enthalten, mit denen das Selektin-Molekül geblockt wird, um die Adhäsion zwischen einer Lymphozyte und einer Endothelzelle zu inhibieren, und sie sind daher nützlich, um verschiedene Erkrankungen zu mildern, die mit einer Entzündung assoziiert sind. Es wird zudem angenommen, dass diese Zuckerketten bei einer Adhäsion von Endothelzellen während einer hämatogenen Metastase von Tumorzellen beteiligt sind und sie bei einer Adhäsion von Zielzellen während einer Infektion mit einem Mikroorganismus beteiligt sind. Daher werden diese Zuckerketten als Materialien, um Pharmazeutika zur Prävention solcher Erkrankungen zu entwickeln, als wichtig angesehen.
Auf der anderen Seite wird einer dieser Liganden für L-Selektin (auf einer Lymphozyte exprimiert), der am Homing der Lymphozyte und am Rolling einer Leukozyte beteiligt ist, was in einer initialen Phase einer Entzündung verursacht wird, als „GlyCAM-1 (hochglycolysiertes Zell-Adhäsions-Molekül-1, Glycosylierungsabhängiges Zelladhäsions-Molekül-1, auf Blutgefäß-Endothel exprimiert)" betrachtet, und die Zuckerkette besetzt nicht weniger als 70% vom GlyCAM-1. Schließlich zieht GlyCAM-1 mit einem Grundrückgrat der Zuckerkette (NeuAc-Gal(6S)-(Fuc-)GlcNAc-R, wobei NeuAc einen N-Acetylneuraminsäurerest darstellt, Gal einen Galactoserest darstellt, (6S) angibt, dass die Hydroxylgruppe an einer C-6-Position sulfatiert ist, Fuc einen Fucoserest darstellt, GlcNAc einen N-Acetylglucosaminrest darstellt, – eine Glycosid-Verknüpfung darstellt und R ein Wasserstoffatom oder eine Zuckerkette darstellt: dieses Grundrückgrat ist im Nachfolgenden, wenn nötig, als „Grundrückgrat einer GlyCAM-1-Zuckerkette" bezeichnet) eine große Aufmerksamkeit auf sich.
Von GlyCAM-1 und dem Grundrückgrat seiner Zuckerkette wird erwartet, dass sie wichtige Rollen bei der Entwicklung von neuen Pharmazeutika und in Studien von physiologischen Aktivitäten in vivo spielen. Es wird erwünscht, diese Substanzen dauerhaft bereitzustellen. Zurzeit können sie jedoch nur von Tieren erhalten werden, die GlyCAM-1 exprimieren. Erhaltbare Mengen sind daher sehr gering. Es ist schwierig GlyCAM-1 und das Grundrückgrat seiner Zuckerkette mittels organischer Synthese herzustellen. Wie auch immer, bis jetzt ist kein Verfahren zur Herstellung eines sulfatierten Lactosamin-Oligosaccharids bekannt geworden, welches in das Grundrückgrat der GlyCAM-1-Zuckerkette umgewandelt werden kann.
Die vorliegende Erfindung ist in Anbetracht der vorhergenannten Gesichtspunkte gemacht worden, deren Ziel es ist, ein neues Verfahren zur Herstellung eines sulfatierten Lactosamin-Oligosaccharids bereitzustellen, um das Grundrückgrat der GlyCAM-1-Zuckerkette zu erhalten.
Zusammenfassung der Erfindung
Als ein Ergebnis von sorgfältigen Studien durch die vorliegenden Erfinder, um das oben beschriebene Ziel zu erreichen, ist es herausgefunden worden, dass ein sulfatiertes Lactosamin-Oligosaccharid erhalten werden kann, indem es einer Sulfotransferase ermöglicht wird, auf ein Lactosamin-Oligosaccharid zu wirken, wobei die Sulfotransferase eine Sulfatgruppe zu einer Hydroxylgruppe an der C-6-Position eines Galactoserests des Lactosamin-Oligosaccharids überträgt. Auf diese Weise ist die vorliegende Erfindung vollendet worden.
Die vorliegende Erfindung stellt nämlich ein Verfahren zur Herstellung eines sulfa tierten nicht-fucosylierten Lactosamin-Oligosaccharids bereit, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus:
sulfatierten Lactosamin-Oligosacchariden, die durch die folgenden Formeln dargestellt sind: Gal(6S)-GlcNAc(6S)-R SA-Gal(6S)-GlcNAc(6S)-R, und
aus einem Lactosamin-Oligosaccharid besteht, das nicht fucosyliert ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Oligosacchariden besteht, die die folgenden Formeln aufweisen: Gal-GlcNAc(6S)-R SA-Gal-GlcNAc(6S)-R, wobei Gal ein Galactoserest ist. GlcNAc ein N-Acetylglucosaminrest ist, SA ein Sialinsäurerest ist, (6S) angibt, dass die Hydroxylgruppe an der C-6-Position sulfatiert ist, – eine Glycosid-Verknüpfung darstellt und R ein Wasserstoffatom oder eine Zuckerkette ist, die 1 bis 17 Zucker enthält,
wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

i) Gemeinsames Einbringen einer Sulfotransferase, eines Sulfatgruppendonors und eines Lactosamin-Oligosaccharids, das nicht fucosyliert ist, in eine wässrige Lösung, wobei die Sulfotransferase geeignet ist, eine Sulfatgruppe zu einer Hydroxylgruppe an der C-6-Position eines Galactoserests des Lactosamin-Oligosaccharids zu übertragen, und im Wesentlichen kein Sulfat zu einem fucosylierten Lactosamin-Oligosaccharid überträgt, wonach die Sulfotransferase eine Sulfatgruppe von dem Sulfatgruppendonor zu der Hydroxylgruppe an der C-6-Position des Galactoserests überträgt, der in dem nicht-fucosylierten Lactosamin-Oligosaccharid vorhanden ist, um ein sulfatiertes nicht-fucosyliertes Lactosamin-Oligosaccharid herzustellen, und wobei die Sulfotransferase eine Sulfotransferase aus embryonalen Hühnerchondrocyten ist und die folgenden Eigenschaften aufweist:
a) Wirkung: Die Sulfotransferase überträgt eine Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu einer Hydroxylgruppe an einer C-6-Position eines N-Acetylgalactosaminrests oder eines Galactoserests eines Glycosaminoglycans,
b) Substratspezifität: Die Sulfotransferase überträgt die Sulfatgruppe zu Chondroitin, zu Chondroitin-Sulfat-A, zu Chondroitin-Sulfat-C und zu Keratansulfat, aber die Sulfatgruppe wird nicht wesentlich zu Chondroitin-Sulfat-E, zu Dermatansulfat und zu Herapansulfat übertragen,
c) pH-Reaktionsoptimum: Die Sulfotransferase hat ein pH-Reaktionsoptimum in der Nähe von 6,4,
d) Aktivierung: Die Aktivität der Sulfotransferase wird durch Protamin oder MnCl₂ gesteigert,
e) Molekulargewicht: Die Sulfotransferase weist ein durch eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter einer reduzierenden Bedingung geschätztes Molekulargewicht von etwa 75 Kilodalton auf,
f) Sulfat-Übertragungs-Aktivität Die Sulfotransferase hat eine Eigenschaft, dass eine Sulfat-Übertragungsaktivität zu einem Lactosamin-Oligosaccharid, bei dem ein N-Acetylglucosaminrest, der an das reduzierende Ende eines Galactoserests anschließt, an der C-6-Position nicht sulfatiert ist, geringer ist, als die zu einem Lactosamin-Oligosaccharid, bei dem der N-Acetylglucosaminrest, der an das reduzierende Ende eines Galactoserests anschließt, an der C-6-Position sulfatiert ist, und wobei das Lactosamin-Oligosaccharid, das nicht fucosyliert ist, an der C-6-Position eines N-Acetylglucosaminrests, der an das reduzierende Ende des Galactoserests anschließt, sulfatiert ist, und
ii) Gewinnen des sulfatierten nicht-fucosylierten Lactosamin-Oligosaccharids.

Der Begriff „Lactosamin" schließt hierin sowohl ein Lactosamin (eine Substanz, in der ein Galactoserest durch eine Glycosid-Verknüpfung an einen Glucosaminrest gebunden ist, dargestellt durch Gal-GlcN) als auch ein N-Acetyllactosamin ein (eine Substanz, in der ein Galactoserest durch eine Glycosid-Verknüpfung an einen N-Acetylglucosaminrest gebunden ist, dargestellt durch Gal-GlcNAc). In der hierin beschriebenen Formel stellt Gal einen Galactoserest dar, GlcNAc stellt einen N-Acetylglucosaminrest dar, GlcN stellt einen Glucosaminrest dar, SA stellt einen Sialinsäurerest dar, NeuAc stellt einen N-Acetylneuraminsäurerest dar, Fuc stellt einen Fucoserest dar, (6S) gibt an, dass die Hydroxylgruppe an der C-6-Position sulfatiert ist, und – stellt eine Glycosid-Verknüpfung dar.
Der Begriff „Lactosamin" schließt hierin ein Lactosamin ein, das einen Sialinsäurerest und/oder einen Fucoserest enthält. Der Begriff „Lactosamin-Oligosaccharid" bezeichnet hierin ein Oligosaccharid, das mindestens ein Lactosamin enthält, das zum Beispiel selbst ein Lactosamin, Oligosaccharide, die mindestens ein Lactosamin enthalten, und Oligosaccharide, die ein Grundrückgrat einer wiederholenden Struktur umfassen, die aus Lactosaminen besteht, einschließt. Der Begriff „Lactosamin-Oligosaccharid" schließt jene ein, die einen sulfatierten Glucosaminrest (oder einen sulfatierten N-Acetylglucosaminrest) und/oder einen sulfatierten Galactoserest enthalten, vorausgesetzt, dass sie Lactosamin-Oligosaccharide sind, die mindestens ein Lactosamin enthalten, das einen Galactoserest aufweist, der nicht an seiner Hydroxylgruppe an der C-6-Position sulfatiert ist. Der Begriff „sulfatiertes Lactosamin-Oligosaccharid" bedeutet hierin eine Substanz, bei der eine Sulfatgruppe zu einem Teil oder zu allen Hydroxylgruppen an den C-6-Positionen der nicht-sulfatierten Galactosereste in dem Lactosamin-Oligosaccharid hinzugefügt ist. Die Beschreibung von nur „Lactosamin" bedeutet hierin Lactosamin selbst, wie auch eine Lactosamin-Struktur (Rückgrat) in dem Lactosamin-Oligosaccharid.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein sulfatiertes Lactosamin-Oligosaccharid wie oben definiert. Es wird von dem sulfatierten Lactosamin-Oligosaccharid, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, erwartet, dass es als ein Zwischenprodukt benutzt werden kann, um das Grundrückgrat einer GlyCAM-1-Zuckerkette zu erhalten. GlyCAM-1 und das Grundrückgrat einer GlyCAM-1-Zuckerkette können als antiinflammatorische Wirkstoffe verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Ergebnis einer Superdex-30-Chromatographie für ³⁵S-markierte Oligosaccharide, die aus verschiedenen Lactosamin-Oligosacchariden hergestellt sind.
2 zeigt Ergebnisse einer Papier-Elektrophorese für Reaktionsprodukte, die nach einem Verdau mit einer Neuraminidase aus NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc (SLN), einer N-Deacetylierung, einer Deaminierung und einer Reduktion mit NaBH₄ erhalten werden.
3 zeigt eine Trennung durch eine HPLC für Substanzen, die aus SLN nach einer Deaminierung und einer Reduktion mit NaBH₄ erhalten werden.
4 zeigt Ergebnisse einer Gel-Filtrations-Chromatographie für desialylierte Produkte, die aus sulfatiertem NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc (SL1L1) vor und nach einem Verdau mit β-Galactosidase erhalten werden.
5 zeigt Ergebnisse einer Gel-Filtrations-Chromatographie für desialylierte Produkte, die aus sulfatiertem NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (SL2L4) vor und nach einem Verdau mit β-Galactosidase erhalten werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Sulfotransferase mit den oben beschriebenen Eigenschaften, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird aus Hühnerchondrocyten erhalten.
Es ist besonders vorteilhaft, eine durch die vorliegenden Erfinder aus einem Kulturüberstand aus in einem serumfreien Medium kultivierten Hühnerchondrocyten gereinigte Sulfotransferase zu verwenden (Habuchi, O., Matsui, Y., Kotoya, Y., Aoyama, Y., Yasuda, Y. und Noda, M. (1993), J. Biol. Chem., 268, 21968–21974). Die Sulfotransferase (wenn nötig im Folgenden als „Chondroitin-6-Sulfotransferase" oder „C6ST" bezeichnet) weist die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften auf:
(1) Wirkung
Die Sulfotransferase überträgt eine Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu einer Hydroxylgruppe an einer C-6-Position eines N-Acetylgalactosaminrests oder eines Galactoserests eines Glycosaminoglycans.
(2) Substratspezifität
Die Sulfotransferase überträgt eine Sulfatgruppe zu Chondroitin, zu Chondroitin-Sulfat-A, zu Chondroitin-Sulfat-C und zu Keratansulfat, aber die Sulfatgruppe wird nicht wesentlich zu Chondroitin-Sulfat-E, zu Dermatansulfat und zu Heparansulfat übertragen. Vorzugsweise stammt das Chondroitin aus einer Tintenfischhaut, das Chondroitin-Sulfat-A stammt vorzugsweise aus Walknorpel, das Chondroitin-Sulfat-C stammt vorzugsweise aus Haiknorpel und das Keratansulfat stammt vorzugsweise aus Rinderhornhaut. Das Chondroitin-Sulfat-E stammt vorzugsweise aus Tintenfischknorpel, das Dermatansulfat stammt vorzugsweise aus Schweinehaut und das Heparansulfat stammt vorzugsweise aus Rinderniere. Die C6ST überträgt auch eine Sulfatgruppe zu Chondroitin-Sulfat, das aus dem Knorpel eines Hühnerembryos stammt.
(3) pH-Reaktionsoptimum
Die Sulfotransferase hat ein pH-Reaktionsoptimum in der Nähe von 6,4.
(4) Aktivierung
Die Aktivität der Sulfotransferase wird durch Protamin oder MnCl₂ gesteigert.
(5) Molekulargewicht
Die Sulfotransferase weist ein durch eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und einer reduzierenden Bedingung geschätztes Molekulargewicht von etwa 75 Kilodalton auf.
Die oben beschriebene C6ST kann durch das Kombinieren von Verfahren zum gewöhnlichen Reinigen von Proteinen und Verfahren zum gewöhnlichen Reinigen von Sulfotransferasen aus Kulturzellen gereinigt werden, die C6ST exprimieren, wie z. B. aus Chondrocyten. Besonders bevorzugt wird eine Reinigung gemäß einem in J. Biol. Chem., 268, (29), 21968–21967 (1993) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Eine im Wesentlichen homogene C6ST kann nämlich mittels einer Affinitäts-Chromatographie, die auf der Verwendung einer Heparin-Sepharose-CL-6B (kommerziell erhältlich von Pharmacia LK Biotechnology), einer Weizenkeim-Agglutinin-Agarose (kommerziell erhältlich von der Seikagaku Corporation) und einer 3',5'-ADP-Agarose (kommerziell erhältlich von Sigma) aus einem Kulturüberstand von in einem serumfreien Medium kultivierten Hühnerchondrocyten erhalten werden.
Die Sulfotransferase kann auch durch Klonieren eines Gens für die in der vorliegenden Erfindung verwendbare Sulfotransferase, durch Einfügen des klonierten Gens in einen passenden Wirt und durch exprimieren des Gens gemäß einem bekannten Verfahren erhalten werden. Eine die für die Sulfotransferase kodierende DNS wird zum Beispiel unter Verwendung eines Index der Sulfatgruppen-Übertragungs-Aktivität, die spezifisch zu der Hydroxylgruppe an einer C-6-Position eines Galactoserests in dem Lactosamin-Oligosaccharid oder dem Glycosaminoglycan ist, aus einer DNS-Bibliothek eines Organismus isoliert, der die Sulfotransferase aufweist, die für die vorliegende Erfindung verwendbar ist (vorzugsweise Keratansulfat). Die isolierte DNS wird in einen Vektor mittels Gen-Rekombination inseriert und der Vektor wird dann in eine Wirtszelle eingefügt, um darin die Expression durchzuführen. Auf diese Weise kann die Sulfotransferase erhalten werden. Alternativ kann das Klonieren unter Herstellung und Verwendung eines Antikörpers durchgeführt werden, der spezifisch zu der Sulfotransferase ist. Alternativ kann eine N-Terminale-Aminosäure-Sequenz der Sulfotransferase bestimmt werden, um das Klonieren unter Verwendung einer DNS-Sonde durchzuführen, die eine von der bestimmten Aminosäure-Sequenz abgeleitete Nukleotid-Sequenz aufweist. Das exprimierte Enzym kann entsprechend mit gewöhnlichen Verfahren für eine Enzymextraktion und -reinigung erhalten werden. Im Speziellen enthält das Extraktionsverfahren zum Beispiel eine auf der Verwendung eines Zellaufschlusses basierende Extraktion, wie z. B. eine Homogenisierung, eine Ultraschallbehandlung, einen osmotischen Schock und ein Frieren und Auftauen, eine auf der Verwendung einer oberflächenaktiven Substanz basierende Extraktion und Behandlungsverfahren, die auf der Verwendung einer Kombination der vorangehenden Verfahren basieren. Im Speziellen enthält das Reinigungsverfahren zum Beispiel ein auf der Verwendung von Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat basierendes Aussalzen, eine Zentrifugation, eine Dialyse, eine Ultrafiltration, eine Adsorptions-Chromatographie, eine Ionenaustauscher-Chromatographie, eine hydrophobische Chromatographie, eine Reverse-Phase-Chromatographie, eine Gel-Filtration, eine Gel-Permeations-Chromatographie, eine Affinitäts-Chromatographie, eine Elektrophorese und Behandlungsverfahren, die auf der Verwendung einer Kombination der vorangehenden Verfahren basieren.
Ein Verfahren zur Messung der Sulfotransferase-Aktivität und ein Verfahren zur genauen Untersuchung der Position eines Sulfatgruppen-Transfers wird im Detail in den Beispielen erklärt werden.
Das in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbare nicht-fucosylierte Lactosamin-Oligosaccharid ist ein Oligosaccharid, das mindestens ein Lactosamin enthält, wie z. B. ein Lactosamin, ein Oligosaccharid, das mindestens ein Lactosamin enthält, und ein Oligosaccharid, das ein Grundrückgrat enthält, das aus einer wiederholenden Struktur von Lactosaminen besteht. Unter diesen wird ein Lacto samin selbst oder das Oligosaccharid bevorzugt, das das Grundrückgrat enthält, das aus der wiederholenden Struktur von Lactosaminen besteht. Das Oligosaccharid, das das Grundrückgrat enthält, das aus der wiederholenden Struktur von Lactosaminen besteht, enthält vorzugsweise 2 bis 10 Einheiten, noch vorzugsweiser 2 bis 7 Einheiten und besonders bevorzugt 2 Einheiten der Lactosamin-Strukturen.
In dem Fall des Oligosaccharids, das mindestens ein Lactosamin enthält, werden jene bevorzugt, in denen ein Lactosamin an dem nicht-reduzierenden Ende des Oligosaccharids vorliegt.
Bei dem Oligosaccharid, das mindestens ein Lactosamin enthält, besteht keine besondere Begrenzung was die Bindungsart zwischen den Zuckerresten betrifft, die kein Lactosamin sind.
Der Aminozuckerrest im Lactosamin und in dem Lactosamin-Oligosaccharid ist ein Glucosaminrest oder ein N-Acetylglucosaminrest. Ein N-Acetylglucosaminrest wird bevorzugt.
Was die Anzahl der Zuckerreste betrifft, weist das Lactosamin-Oligosaccharid bevorzugt 2 bis 20 Zuckerreste auf, noch bevorzugter weist es 2 bis 15 Zuckerreste auf und besonderes bevorzugt weist es 2 bis 5 Zuckerreste auf.
Wenn der Aminozuckerrest im Lactosamin ein N-Acetylglucosaminrest ist, ist die Glycosid-Verknüpfung von dem Galactoserest zu dem N-Acetylglucosaminrest im Lactosamin bevorzugt eine β-Glycosid-Verknüpfung, noch bevorzugter eine β1 → 4-Glycosid-Verknüpfung, d. h., Galβ1-4GlcNAc. Wenn das Grundrückgrat die wiederholende Lactosamin-Struktur ist, ist die Glycosid-Verknüpfung von dem N-Acetylglucosaminrest zu dem Galactoserest (d. h., die Glycosid-Verknüpfung vom Lactosamin, das sich an dem nicht-reduzierenden Ende befindet, zu einem Lactosamin, das sich an dem reduzierenden Ende in den zwei angrenzenden Lactosaminen befindet) bevorzugt eine β-Glycosid-Verknüpfung, noch bevorzugter eine β1 → 3-Glycosid-Verknüpfung, d. h., GlcNAcβ1-3Gal.
Ein Lactosamin kann einen Sialinsäurerest aufweisen. Ein Lactosamin kann nämlich sialyliert sein. In dem Fall eines sialylierten Lactosamins ist der Sialinsäurerest bevorzugt durch eine α-Glycosid-Verknüpfung an den Galactoserest gebunden und noch bevorzugter ist der Sialinsäurerest durch eine α2 → 3-Glycosid-Verknüpfung an den Galactoserest gebunden, d. h., SAα2-3Gal. Die Sialinsäure enthält z. B. N-Acetylneuraminsäure und N-Glycolylneuraminsäure. N-Acetylneuraminsäure wird bevorzugt.
Der N-Acetylglucosaminrest im Lactosamin ist sulfatiert. Oligosaccharide, die ein Lactosamin mit einem sulfatierten Galactoserest enthalten, können für die vorliegende Erfindung unter der Voraussetzung verwendet werden, dass sie mindestens ein Lactosamin enthalten, das einen Galactoserest aufweist, der nicht an der Hydroxylgruppe an der C-6-Position sulfatiert ist.
Von den Lactosamin-Oligosacchariden ist das Lactosamin-Oligosaccharid, das einen Sialinsäurerest an seinem nicht-reduzierenden Ende aufweist, im Vergleich zu dem Lactosamin-Oligosaccharid, das keinen Sialinsäurerest enthält, gewissermaßen geneigt, teilweise sulfatiert zu werden. Des Weiteren ist das Lactosamin-Oligosaccharid, das einen sulfatierten N-Acetylglucosaminrest aufweist, der an das nicht-reduzierende Ende eines Galactoserests angrenzt, der nicht an der Hydroxylgruppe an der C-6-Position sulfatiert ist, im Vergleich mit dem Lactosamin-Oligosaccharid, das einen nicht-sulfatierten N-Acetylglucosaminrest aufweist, der an das nicht-reduzierende Ende des Galactoserests angrenzt, der nicht an der Hydroxylgruppe an der C-6-Position sulfatiert ist, geneigt, sulfatiert zu werden. Daher ist es bevorzugt jene zu verwenden, die einen sulfatierten N-Acetylglucosaminrest (vorzugsweise an der Hydroxylgruppe an der C-6-Position sulfatiert)aufweisen, der an das reduzierende Ende des Galactoserests angrenzt, der nicht an der Hydroxylgruppe an der C-6-Position in dem Lactosamin-Oligosaccharid sulfatiert ist, an die eine Sulfatgruppe zu übertragen beabsichtigt wird (eingeführt).
Des Weiteren ist das nicht fucosylierte Lactosamin-Oligosaccharid im Vergleich mit einem Lactosamin-Oligosaccharid, das einen fucosylierten N-Acetylglucosaminrest aufweist, geneigt, sulfatiert zu werden. Besonders wenn das Lactosamin-Oligosaccharid einen fucosylierten N-Acetylglucosaminrest aufweist, der an das reduzierende Ende eines Galactoserests angrenzt, der nicht an der Hydroxylgruppe an der C-6-Position sulfatiert ist (d. h. z. B., Gal-(Fuc-)GalNAc), ist der Galactoserest schwer zu sulfatieren. Wenn es daher beabsichtigt wird, ein fucosyliertes sulfatiertes Lactosamin-Oligosaccharid zu erhalten, ist es bevorzugt, dass ein nicht-fucosyliertes Lactosamin-Oligosaccharid verwendet wird, um ein sulfatiertes Lactosamin-Oligosaccharid zu erhalten, das dann unter Verwendung einer Fucosyltransferase fucosyliert wird.
Es ist bekannt, dass das in der vorliegenden Erfindung verwendete Lactosamin-Oligosaccharid von Fachleuten in angemessener Weise in Abhängigkeit auf ein erzieltes sulfatiertes Lactosamin-Oligosaccharid ausgewählt werden kann.
Im Speziellen wird es bevorzugt, als das in der vorliegenden Erfindung verwendete Lactosamin-Oligosaccharid zum Beispiel ein Oligosaccharid zu verwenden, das durch die folgenden Formeln dargestellt ist: Gal-GlcNAc-R* (1) Gal-GlcNAc(6S)-R (2) SA-Gal-GlcNAc-R* (3) SA-Gal-GlcNAc(6S)-R (4)
Jedoch liegen die mit einem Sternchen (*) markierten Formeln außerhalb der Ansprüche der vorliegenden Erfindung und sind nur als Beispiel eingefügt.
In jeder der vorangegangenen Formeln stellt R ein Wasserstoffatom oder eine Zuckerkette dar, die 1 bis 17 Zucker enthält, bevorzugt stellt R ein Wasserstoffatom oder eine Zuckerkette dar, die 1 bis 12 Zucker enthält, und besonders bevorzugt stellt R ein Wasserstoffatom oder eine Zuckerkette dar, die 1 bis 2 Zucker enthält.
Wenn R eine Zuckerkette darstellt, enthält R vorzugsweise ein Grundrückgrat, das aus einer wiederholenden Gal-GlcNAc-Struktur besteht. In diesem Fall können zu dem Grundrückgrat zum Beispiel irgendein Sialinsäurerest und eine Sulfatgruppe hinzugefügt sein. Außerdem kann, wenngleich außerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung, ein Fucoserest zu dem Grundrückgrat hinzugefügt sein.
Noch bevorzugter ist es, als das in der vorliegenden Erfindung verwendete Lactosamin-Oligosaccharid Oligosaccharide zu verwenden, die durch die folgenden Formeln dargestellt sind: Gal-GlcNAc* (5) Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc* (6) Gal-GlcNAc(6S)-Gal(6S)-GlcNAc(6S) (7) SA-Gal-GlcNAc* (8) SA-Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc* (9) SA-Gal-GlcNAc(6S)-Gal(6S)-GlcNAc(6S) (10)
Jedoch liegen die mit einem Sternchen (*) markierten Formeln außerhalb der Ansprüche der vorliegenden Erfindung und sind nur als Beispiel eingefügt.
In jeder der vorangegangenen Formeln (1) bis (10) kann die Sialinsäure zum Beispiel N-Acetylneuraminsäure und N-Glycolylneuraminsäure sein. N-Acetylneuraminsäure wird bevorzugt.
Die Herkunft für die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Lactosamin-Oligosaccharide ist nicht besonders eingeschränkt. Jedes durch irgendein Verfahren erhaltenes Lactosamin-Oligosaccharid kann verwendet werden, inbegriffen z. B. jene, die aus Naturprodukten extrahiert und gereinigt sind, jene, die durch eine chemische Synthese hergestellt sind, jene, die durch einen chemischen Abbau hergestellt sind, jene, die unter Verwendung eines Zucker abbauenden Enzyms hergestellt sind, und jene, die unter Verwendung einer Zucker-Transferase hergestellt sind. Jene, die kommerziell erhältlich sind, können verwendet werden.
Besonders in dem Fall der Herstellung unter Verwendung des Zucker abbauenden Enzyms kann z. B. das für die vorliegende Erfindung verwendbare Lactosamin-Oligosaccharid durch Abbau von Keratansulfat, vorzugsweise von Keratansulfat, das aus Knorpel, aus Knochen, aus Hornhaut oder dergleichen aus Knorpelfischen, wie z. B. einem Hai, oder aus einem Säugetier erhältlich ist, wie z. B. einem Wal und einem Rind, mit z. B. einem Endo-β-Galactosidase-Typ-Enyzm (z. B. einer Endo-β-Galactosidase und einer Keratanase, beide sind kommerziell von Seikagaku Corporation erhältlich) oder einem Endo-β-Glucosaminidase-Typ-Enzyms (z. B. Keratanase II, kommerziell erhältlich von der Seikagaku Corporation) hergestellt werden.
Der Sulfotransferase, die eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an der C-6-Position des Galactoserests im Lactosamin in dem Lactosamin-Oligosaccharid überträgt, wird es ermöglicht, auf das Lactosamin-Oligosaccharid unter der Mitanwesenheit eines Sulfatgruppendonors zu wirken. Auf diese Weise wird die Sulfatgruppe von dem Sulfatgruppendonor zu der Hydroxylgruppe an der C-6-Position des Galactoserests im Lactosamin in dem Lactosamin-Oligosaccharid übertragen und das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid hergestellt. Bevorzugt enthalten die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlichen sulfatierten Lactosamin-Oligosaccharide zum Beispiel sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharide, die durch die folgenden Formeln dargestellt sind: Gal(6S)-GlcNAc-R* (11) Gal(6S)-GlcNAc(6S)-R (12) SA-Gal(6S)-GlcNAc-R* (13) SA-Gal(6S)-GlcNAc(6S)-R (14)
Jedoch liegen die mit einem Sternchen (*) markierten Formeln außerhalb der Ansprüche der vorliegenden Erfindung und sind nur als Beispiel eingefügt.
In jeder der vorangegangenen Formeln stellt R ein Wasserstoffatom oder eine Zuckerkette dar, die 1 bis 17 Zucker enthält. Bevorzugt stellt R ein Wasserstoffatom oder eine Zuckerkette dar, die 1 bis 12 Zucker enthält, und besonders bevorzugt stellt R ein Wasserstoffatom oder eine Zuckerkette dar, die 1 bis 2 Zucker enthält.
Wenn R eine Zuckerkette darstellt, weist R bevorzugt ein Grundrückgrat auf, das aus einer wiederholenden Gal-GlcNAc-Struktur besteht. In diesem Fall können zu dem Grundrückgrat zum Beispiel eine Sialinsäure und/oder eine Sulfatgruppe hinzugefügt sein. Obgleich außerhalb der Ansprüche der vorliegenden Erfindung, kann das Grundrückgrat auch einen hinzugefügten Fucoserest aufweisen.
In Bezug auf das Vorangehende wird es bevorzugt, sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharide zu verwenden, die durch die folgenden Formeln dargestellt sind: Gal(6S)-GlcNAc* (15) Gal(6S)-GlcNAc-Gal-GlcNAc* (16) Gal-GlcNAc-Gal(6S)-GlcNAc* (17) Gal(6S)-GlcNAc-Gal(6S)-GlcNAc* (18) Gal(6S)-GlcNAc(6S)-Gal(6S)-GlcNAc(6S) (19) SA-Gal(6S)-GlcNAc* (20) SA-Gal(6S)-GlcNAc-Gal-GlcNAc* (21) SA-Gal-GlcNAc-Gal(6S)-GlcNAc*(22) SA-Gal(6S)-GlcNAc-Gal(6S)-GlcNAc* (23) SA-Gal(6S)-GlcNAc(6S)-Gal(6S)-GlcNAc(6S) (24)
Jedoch liegen die mit einem Sternchen (*) markierten Formeln außerhalb der Ansprüche der vorliegenden Erfindung und sind nur als Beispiel eingefügt.
In jeder der vorangegangenen Formeln (11) bis (24) kann die Sialinsäure zum Beispiel N-Acetylneuraminsäure und N-Glycolylneuraminsäure sein. N-Acetylneuraminsäure wird bevorzugt.
Das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid (11) wird aus dem Lactosamin-Oligosaccharid (1) erhalten. Das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid (12) wird aus dem Lactosamin-Oligosaccharid (2) erhalten. Das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid (13) wird aus dem Lactosamin-Oligosaccharid (3) erhalten. Das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid (14) wird aus dem Lactosamin-Oligosaccharid (4) erhalten. Das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid (15) wird aus dem Lactosamin-Oligosaccharid (5) erhalten. Die sulfatierten Lactosamin-Oligosaccharide (16), (17) und (18) werden aus dem Lactosamin-Oligosaccharid (6) erhalten. Das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid (19) wird aus dem Lactosamin-Oligosaccharid (7) erhalten. Das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid (20) wird aus dem Lactosamin-Oligosaccharid (8) erhalten. Die sulfatierten Lactosamin-Oligosaccharide (21), (22) und (23) werden aus dem Lactosamin-Oligosaccharid (9) erhalten. Das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid (24) wird aus dem Lactosamin-Oligosaccharid (10) erhalten.
Die Reaktion, in der es der Sulfotransferase, die eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an der C-6-Position des Galactoserests in dem Lactosamin-Oligosaccharid überträgt, ermöglicht wird auf das Lactosamin-Oligosaccharid einzuwirken, kann durchgeführt werden, indem es der Sulfotransferase, einem Sulfatgruppendonor und dem Lactosamin-Oligosaccharid ermöglicht werden, zu koexistieren. Bei dieser Reaktion ist der pH nicht besonders eingeschränkt, vorausgesetzt, dass die Aktivität der Sulfotransferase erhalten bleibt. Jedoch wird es bevorzugt, die Reaktion unter einer pH-Bedingung in der Nähe eines pH-Reaktionsoptimums der Sulfotransferase durchzuführen. Noch bevorzugter wird die Reaktion in einem Puffer durchgeführt, der eine puffernde Wirkung auf den vorangehenden pH aufweist. Auch unter der Voraussetzung, dass die Aktivität der Sulfotransferase erhalten bleibt, ist die Temperatur nicht besonders eingeschränkt. Es wird jedoch bevorzugt, die Reaktion in der Nähe eines Temperaturoptimums für die Sulfotransferase durchzuführen. Wenn eine Substanz erhältlich ist, die zu einer Steigerung der Aktivität der Sulfotransferase beiträgt, kann die Substanz hinzugefügt werden. Die Reaktionszeit kann von Fachleuten in Abhängigkeit von den Mengen des Lactosamin-Oligosaccharids, des Sulfatgruppendonors und der verwendeten Sulfotransferase und anderen Reaktionsbedingungen angemessen bestimmt werden. Wenn C6ST als die Sulfotransferase verwendet wird, wird die Reaktion zum Beispiel bevorzugt in der Nähe von pH 6,4 bei einer Temperatur in der Nähe von 30 bis 40°C, vornehmlich in der Nähe von 37°C durchgeführt. Des Weiteren kann es Protamin oder MnCl₂ ermöglicht werden, während der Reaktion zu koexistieren.
Der Sulfatgruppendonor, der für die Reaktion verwendet wird, um es der Sulfotransferase zu ermöglichen zu wirken, enthält bevorzugt ein aktiviertes Sulfat (3'-Phosphoadenosin 5'-Phosphosulfat, im Folgenden als „PAPS" bezeichnet).
Für den Fall der Herstellung in einer kleinen Menge ist es ausreichend, dass es der Sulfotransferase, die die Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an der C-6-Position des Galactoserests in dem Lactosamin-Oligosaccharid überträgt, ermöglicht wird, zu existieren und die Enzym-Wirkung unter der Mitanwesenheit des Lactosamin-Oligosaccharids und des Sulfatgruppendonors auszuführen. Für den Fall der Herstellung in einer großen Menge ist es jedoch möglich, es dem Enzym zu ermöglichen, beispielsweise unter Verwendung eines immobilisierenden Enzyms, dass durch Bindung der Sulfotransferase an eine angemessene Festphase (Kügelchen oder dergleichen) erhalten wird, oder durch Verwendung eines Membran-Typ-Reaktors, der auf der Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran, einer Dialyse-Membran oder dergleichen basiert, kontinuierlich zu wirken. Alternativ kann ein Bioreaktor kombiniert werden und für ein Reproduzieren (Synthetisieren) des Sulfatgruppendonors verwendet werden.
Um das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid aus der Reaktionslösung zu gewinnen, ist es möglich, gewöhnliche Verfahren zur Trennung und zur Reinigung von Zuckerketten zu verwenden. Das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid kann z. B. mittels eines Verfahrens gewonnen werden, das z. B. eine Adsorptions-Chromatographie, eine Anionen-Austauscher-Chromatographie, eine Gel-Filtration, eine Gel-Permeations-Chromatographie, eine Papier-Elektrophorese, eine Papier-Chromatographie, eine Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln (bevorzugt z. B. Alkohol und Aceton) und eine Kombination der vorangehenden Verfahren enthält. Es ist jedoch keine Begrenzung darauf. Das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid kann z. B. durch Zugabe von NaCl zu einer Reaktionslösung, die das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid enthält, das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt ist, so dass die Konzentration von NaCl z. B. etwa 0,2 M ist, durch Auftragen einer erhaltenen Lösung auf eine Anionen-Austauscher-Säule, um die nicht adsorbierten Fraktionen zu entfernen, und durch Eluieren einer adsorbierten Fraktion mit z. B. NaCl bei etwa 2,5 M gewonnen werden. Bei diesem Prozess kann die adsorbierte Fraktion (sulfatiertes Lactosamin-Oligosaccharid) mit einem Konzentrationsgradienten von NaCl eluiert werden. Die Bedingung für die Elution und andere Parameter können von Fachleuten angemessen bestimmt werden.
Das erhaltene sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid kann als ein Zwischenprodukt zur Herstellung des Grundrückgrats der Zuckerkette des GlyCAM-1's verwendet werden. Wenn für diesen Zweck das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid verwendet wird, das einen nicht-sialylierten Galactoserest aufweist (z. B. jene, die durch die vorangehenden Formeln (11), (12), (15) dargestellt sind), kann Sialinsäure zu dem Galactoserest unter Verwendung einer Sialyltransferase hinzugefügt werden. Wenn auf der anderen Seite das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid verwendet wird, das einen nicht-fucosylierten N-Acetylglucosaminrest aufweist, kann Fucose unter Verwendung einer Fucosyltransferase dazu hinzugefügt werden.
Für GlyCAM-1 und das Grundrückgrat seiner Zuckerketten wird erwartet, dass sie als antiinflammatorische Wirkstoffe verwendbar sind.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird im Weiteren noch genauer mit Bezug auf die Beispiele erklärt werden. Die Beispiele dienen jedoch nur zur Darstellung der vorliegenden Erfindung, auf welche die vorliegende Erfindung nicht eingeschränkt ist.
Als erstes werden unten verfügbare Quellen von in den Beispielen verwendeten Reagenzien, eine beispielhafte Herstellung einer Chondroitin-Sulfotransferase (C6ST) und in den Beispielen verwendete Arbeitsabläufe beschrieben werden.
(1) Verfügbare Reagenzien-Quellen

H₂ ³⁵SO₄ (du Pont/NEN),
[³H]NaBH₄ (16,3 GBq/mmol) (Amersham),
PAPS (Sigma),
Schnell-Entsalzer-Säule HR 10/10 (Pharmacia),
Hiload Superdex 30 16/60 (Pharmacia),
Chondroitinase ACII (Seikagaku Corporation),
aus Streptococcus stammende Neuraminidase (Seikagaku Corporation),
aus Streptococcus stammende β-Galactosidase (Seikagaku Corporation),
Partisil 10-SAX-Säule (Whatman),
NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc(Sle^x) (Funakoshi),
NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc (SLN) (Funakoshi),
Galβ1-4GlcNAc (LN) (Funakoshi),
aus Rinderhornhaut stammendes Keratansulfat (Seikagaku Corporation),
NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (SL2L4) (Seikagaku Corporation),
NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc (SL1L1) (Seikagaku Corporation),
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc (L1L1) (Seikagaku Corporation),
[³⁵S]PAPS (gemäß Delfert, D. M. und Conrad, H. E. (1985), Anal. Biochem., 148, 303–310 erhalten),
[³H]Gal(6S)β1-4AManR und [³H]Galβ1-4AManR(6S) (hierin auch als „standardsulfatierte Disaccharide" bezeichnet, wobei AManR ein Alditol einer 2,5-Anhydro-D-mannose bedeutet), welche als Standardsubstanzen für eine hoch-auflösende-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) verwendet werden, die auf der Verwendung einer Partisil-SAX-Säule basiert, wurden erhalten, indem es einem Keratansulfat ermöglicht wurde, eine N-Deacetylierung, eine deaminative Spaltung und eine Reduktion mit NaB³H₄ zu durchlaufen, um [³H]Gal(6S)β1-4AManR(6) herzustellen, das dann einer partiellen Säurehydrolyse (0,1 M HCl, 100°C, 40 Minuten) unterzogen wurde (s. Shaklee, P. N. und Conrad, H. E. (1986), Biochem. J., 235, 225–236). [³H]Gal(6S)β1-4AManR und [³H]Galβ1-4AManR(6S) wurden aus den durch die oben beschriebene Hydrolyse erhaltenen Produkten mittels einer Papier-Chromatographie (Entwicklungs-Lösungsmittel: 1-Butanol/Essigsäure/1 M NH₃ = 3 : 2 : 1 (v/v/v)) und einer Papier-Elektrophorese gereinigt.

Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (L2L4) wurde durch Verdau mit einer Neuraminidase aus SL2L4 hergestellt. Die durch den Neuraminidase-Verdau erhaltenen Produkte wurden auf eine Partisil 10-SAX-Säule aufgetragen, gefolgt von einer Elution mit einem KH₂PO₄-Konzentrationsgradienten in einem Bereich von 25 mM bis 500 mM. Eine von der Säule eluierte „Peak"-Fraktion wurde des Weiteren unter Verwendung einer Gel-Filtrations-Chromatographie (Superdex 30-Chromatographie) gereinigt und daraufhin lyophilisiert.
(2) Herstellung einer Chondroitin-6-Sulfotransferase (C6ST)
Eine Chondroitin-6-Sulfotransferase wurde aus einem serumfreien Medium nach einer Kultivierung von Hühnerchondrocyten darin gemäß einem bekannten Verfahren gereinigt (Habuchi, O., Matsui, Y., Kotoya, Y., Aoyama, Y., Yasuda, Y. und Noda, M. (1993), J. Biol. Chem., 268, 21968–21974).
Chondrocyten eines Hühnerembryos wurden in eine Kulturschale inokuliert, um eine Konzentration von 5,6 × 10⁴/Schale zu ermöglichen, und wurden dann für 11 Tage unter einer Bedingung von 7% CO₂ und 93% Luft bei 38°C in auf pH 7,0 eingestellten Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) kultiviert, das 2 g/L D-Glucose, 100 Units/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin und 10% fetales Rinderserum (FBS) enthält. Das Medium wurde durch ein frisches Medium bei pH 7,4 am 2., 4., 7., 9. und 10. Tag nach dem Beginn der Kultivierung ersetzt.
Ein Medium, das 10% Hitze inaktiviertes Serum enthält, das durch Erhitzen von FBS bei 60°C für 60 Minuten hergestellt wird, wurde am 10. Tag verwendet. Die Zellen wuchsen am 11. Tag bis zu einer Konzentration von 5,0 × 10⁶ Zellen/Schale. Danach wurde ein mit 50 μg/ml Natriumascorbat ergänztes Cosmedium-001 (geliefert von CosmoBio) verwendet, um die Kultivierung für 10 Tage unter täglichem Wechsel des Mediums fortzusetzen.
Das verwendete Cosmedium-001-Medium wurde gesammelt und das gesammelte Medium wurde bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Ein erhaltener Überstand wurde angepasst, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 20 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 20% Glycerol aufweist.
Der Kulturüberstand wurde auf eine mit Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 20 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 20% Glycerol), der 0,15 M NaCl enthält, equilibrierte Heparin-Sepharose-CL-6B (hergestellt von Pharmacia LKB Biotechnology, 2,2 × 28 cm) aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen, der 0,15 M NaCl enthält, gefolgt von einer Elution mit Puffer A, der 0,45 M NaCl enthält, um eine Fraktionierung durchzuführen.
Die Fraktionen, die die Sulfotransferase-Aktivität aufweisen, wurden gesammelt, und eine erhaltene gesammelte Fraktion wurde auf eine mit Puffer A, der 0,15 M NaCl enthält, equilibrierte Weizenkeim-Agglutinin-Agarose-Säule (hergestellt von Seikagaku Corporation, 1,2 × 15 cm) aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer A (200 ml) gewaschen, der 0,15 M NaCl enthält, gefolgt von einer Elution mit Puffer A (200 ml), der 0,15 M NaCl und 0,3 M N-Acetylglucosamin enthält. Eluierte Fraktionen wurden gesammelt, und eine erhaltene gesammelte Fraktion wurde gegen Puffer A dialysiert, der 0,05 M NaCl enthält.
Die erhaltene Fraktion wurde auf eine mit Puffer A, der 0,05 M NaCl enthält, equilibrierte 3',5'-ADP-Agarose-Säule (hergestellt von Sigma, 1,2 × 11,8 cm, 1,9 μmol 3', 5'-ADP-/ml Gel) aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer A (150 ml) gewaschen, der 0,05 M NaCl enthält, gefolgt von einer Elution mit einem linearen Gradienten, der auf Puffer A (300 ml) basiert, der 0,05 NaCl enthält und des Weiteren 0,02 mM 3',5'-ADP enthält. Fraktionen, die die Sulfotransferase-Aktivität aufweisen, wurden gesammelt, und eine erhaltene gesammelte Fraktion wurde gegen Puffer A dialysiert, der 1 M NaCl enthält, und dann gegen Puffer A dialysiert, der 0,05 M NaCl enthält.
In den Reinigungsschritten wurde die Sulfotransferase-Aktivität wie folgt gemessen. Die Reaktionslösung hatte die folgende Zusammensetzung. Die Reaktionslösung (50 μl) enthielt nämlich 2,5 μmol Imidazol-HCl, pH 6,8, 1,25 μg Protamin- Hydrochlorid, 0,1 μmol Dithiothreitol, 25 nmol (als eine Menge einer glucoronischen Säure) Chondroitin (hergestellt von Seikagaku Corporation), 50 pmol [³⁵S]PAPS (Adenosin 3'-Phosphat,5'-Phosphosulfat) und das Enzym.
Die Aktivität wurde für verschiedene Glycosaminoglycane als das Substrat unter Verwendung von 25 nmol Glycosaminoglycanen (als eine Menge von Galactosamin für ein Chondroitin-Sulfat und ein Dermatansulfat, oder als eine Menge eines Glucosamins für ein Heparansulfat und ein Keratansulfat) anstelle von Chondroitin gemessen.
Die Reaktionslösung wurde in einem Reaktionsgefäß bei 37°C für 20 Minuten inkubiert und dann wurde die Reaktion durch Eintauchen des Reaktionsgefäßes in kochendes Wasser für eine Minute beendet. Nach der Beendigung der Reaktion wurden 0,1 μmol Chondroitin-Sulfat-A (als eine Menge einer glucoronischen Säure) als ein Träger hinzugegeben, und drei Volumen 1,3% Kaliumacetat enthaltenes Ethanol wurden dazugegeben, um ein ³⁵S-markiertes Polysaccharid zu präzipitieren. Die Mischung wurde bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um ein Präzipitat zu erhalten, das dann in 70 μl Wasser gelöst wurde. Ein Aliquot (50 μl) der erhaltenen Lösung wurde in eine mit 0,1 M NH₄HCO₃ equilibrierte Entsalzer-Säule injiziert, und eluierte Fraktionen, die das ³⁵S-markierte Polysaccharid enthalten, wurden gesammelt. Zu einem Aliquot (200 μl) einer erhaltenen gesammelten Fraktion wurde 1 ml eines Scintillations-Cocktails (Clearsol, hergestellt durch nacalai tesque) hinzugegeben, um die ³⁵S-Radioaktivität zu messen. Auf diese Weise wurde die Aufnahme von ³⁵S in das Polysaccharid gemessen.
Ein Aliquot (400 μl) wurde von der restlichen Lösung dispensiert, zu den 800 μl 1,3% Kaliumacetat enthaltenen Ethanol hinzugegeben und daraufhin gemischt. Die Mischung wurde für 30 Minuten auf Eis gestellt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Minuten, um das ³⁵S-markierte Polysaccharid zu präzipitieren. Das Präzipitat wurde in 25 μl eines Puffers gelöst, der 0,1 mg/ml BSA, 0,05 M Tris-Acetat, pH 7,5 und 10 Milliunits einer Chondroitinase ACII (die aus Arthrobacter aurescens stammt, hergestellt von Seikagaku Corporation) enthält, um eine Reaktion bei 37°C für zwei Stunden durchzuführen. Nach der Reaktion wurde die Lösung auf ein Whatman Nr. 1 Filterpapier zusammen mit 2-Acetamido-2-Deoxy-3-O-(β-D-Gluco-4- Enopyranosyluronsäure)-6-O-Sulfo-D-Galactose (ΔDi-6S) und 2-Acetamido-2-Deoxy-3-O-(β-D-Gluco-4-Enopyranosyluronsäure)-4-O-Sulfo-D-Galactose (ΔDi-4S) (jedes 0,1 μl, jedes hergestellt von Seikagaku Corporation) gespottet, gefolgt von einer Entwicklung für 20 Stunden mit 1-Butanol/Essigsäure/1 M Ammoniumhydroxid (2 : 3 : 1 (V/V/V)).
Positionen von ΔDi-6S beziehungsweise von ΔDi-4S wurden unter Verwendung einer UV-Lampe überprüft. Abschnitte, die diesen entsprachen, wurden entsprechend aus dem Filterpapier geschnitten und wurden dann, um die Radioaktivität zu messen, in einem Scintillator untergebracht, der durch Auflösen von 5 g Diphenyloxazol und 0,25 g Dimethyl-1,4-bis(2-(5-Phenyloxazol))-Benzen in 1 L Toluen hergestellt ist. In Bezug auf eine Probe, die durch den Verdau mit der Chondroitinase ACII erhalten wurde, war die zurückgebliebene Radioaktivität an dem Ausgangspunkt auf dem Filterpapier nicht mehr als 1% der gespotteten Radioaktivität. Entsprechend zur ³⁵S-Aufnahme in ΔDi-6S und ΔDi-4S wurden Chondroitin-6-Sulfotransferase-Aktivitäten bzw. Chondroitin-4-Sulfotransferase-Aktivitäten berechnet. Die Aktivität, um die Übertragung von 1 pmol Sulfat-Gruppe/Minute zu katalysieren, wurde als 1 Unit definiert. Als ein Ergebnis war die spezifische Chondroitin-6-Sulfotransferase-Aktivität 4,3 × 10⁵ Units/mg und das Verhältnis von Chondroitin-4-Sulfotransferase-Aktivitäten/Chondroitin-6-Sulfotransferase-Aktivitäten war 0,02.
Die wie oben beschrieben gereinigte C6ST bildete eine Einfachbande bei der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) unter einer reduzierenden Bedingung und ihr Molekulargewicht wurde mit etwa 75.000 bestimmt. Als ein Ergebnis einer Messung unter Verwendung einer Superose 12 HR 10/30 Gel-Filtrations-Chromatographie (Elutionsmittel: 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 2 M NaCl, 20 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 0,1% Triton X-100 und 20% Glycerol) war das Molekulargewicht etwa 160.000. Es wurde daher vorgeschlagen, dass C6ST ein Dimer in der Gegenwart von 2 M NaCl bildete.
Die Sulfotransferase-Aktivität wurde für eine Auswahl von Substraten gemessen. Es ist als ein Ergebnis gezeigt worden, dass die wie oben beschrieben erhaltene C6ST die Sulfatgruppe zu aus Tintenfischhaut stammenden Chondroitin, zu aus Hühner embryoknorpel stammenden Chondroitin-Sulfat, zu aus Walknorpel stammenden Chondroitin-Sulfat-A, zu aus Haiknorpel stammenden Chondroitin-Sulfat-C und zu aus Rinderhornhaut stammenden Keratansulfat überträgt, aber die Sulfatgruppe kaum zu aus Tintenfischknorpel stammenden Chondroitin-Sulfat-E, zu aus Schweinehaut stammenden Dermatansulfat und aus Rinderniere stammenden Heparansulfat überträgt. Es ist durch die vorliegenden Erfinder bestätigt worden, dass C6ST die Sulfatgruppe zur Hydroxylgruppe an der C-6-Position eines Galactoserests im Falle eines Keratansulfats überträgt.
Die C6ST-Aktivität der vorliegenden Erfindung wurde durch Protamin bzw. MnCl₂ erhöht.
C6ST hatte ein pH-Reaktionsoptimum bei etwa 6,4 in dem oben beschriebenen Messsystem.
(3) In Beispielen verwendete Verfahren
(3-1) Abbau mit Neuraminidase und β-Galactosidase
Ein Verdau mit Neuraminidase wurde unter Verwendung einer Reaktionsmischung (25 μl) durchgeführt, die ein Oligosaccharid, zu dem ³⁵SO₄ übertragen wurde, 2,5 μmol Kaliumacetatpuffer (pH 6,5), 0,25 μmol CaCl₂ und 10 mU einer Neuraminidase enthält (s. Kiyohara, T. et al. (1974), Arch. Biochem. Biophys., 164, 575–582). Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C für 60 Minuten inkubiert.
Ein Verdau mit β-Galactosidase wurde unter Verwendung einer Reaktionsmischung (50 μl) durchgeführt, die ein Oligosaccharid, von dem eine Sialinsäure entfernt worden ist und zu dem ³⁵SO₄ übertragen worden ist, 50 nmol L1L1 oder L2L4, 2,5 μmol Natriumacetatpuffer (pH 5,5) und 10 mU β-Galactosidase enthält (s. Kiyohara, T. et al. (1976), J. Biochem., 80, 9–17). Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C für 60 Minuten inkubiert.
(3-2) Gel-Filtrations-Chromatogranhie und Papier-Elektrophorese
Eine Gel-Filtrations-Chromatographie wurde unter Verwendung einer Hiload Superdex 30 16/60-Säule durchgeführt. Die Säule wurde mit 0,2 M NH₄HCO₃ equilibriert und die Flussrate betrug 1 ml/Minute. Fraktionen von 1 ml oder 0,5 ml wurden gesammelt, die dann mit 4 ml Clearsol (hergestellt von nacalai tesque) gemischt wurden, um die Radioaktivität zu messen. Die Oligosaccharide wurden auf der Basis eines Absorptionsvermögens bei 210 nm überwacht.
Eine Papier-Elektrophorese wurde bei 30 V/cm für 40 Minuten oder 80 Minuten unter Verwendung eines Whatman Nr. 3 Filter-Papiers (2,5 cm × 57 cm) in Pyridin/Essigsäure/Wasser (1 : 10 : 400 (v/v/v), pH 4) durchgeführt. Nach der Papier-Elektrophorese wurde das Filterpapier getrocknet und in kleine Stücke von 1,25 cm geschnitten und die Radioaktivität wurde mittels eines Flüssigkeits-Scintillations-Zählgeräts unter Verwendung einer Scintillations-Lösung analysiert, die 5 g Diphenyloxazol und 0,25 g Dimethyl-1,4-bis-(2-(5-Phenyloxazol))-Benzen in 1 L Toluen enthält.
(3-3) Quantitative Bestimmung für Glucosamin und Sialinsäure
Der Glucosamingehalt im Oligosaccharid wurde nach einer Hydrolyse eines Glycosaminoglycans in 6 M HCl bei 100°C für 4 Stunden quantitativ gemäß einem teilweise modifizierten Elson-Morgan-Verfahren bestimmt, das durch Strominger et al. beschrieben ist (Strominger, J. L. et al. (1959), J. Biol. Chem., 234, 3263–3268).
Eine Sialinsäure wurde nach Durchführung einer Hydrolyse in 0,1 M H₂SO₄ bei 80°C für 60 Minuten gemäß dem Thiobarbiturinsäureverfahren (Aminoff, D. (1961), Biochem. J., 81, 384–392) bestimmt.
Beispiel 1: Übertragungsreaktion einer Sulfatgruppe zu verschiedenen Lactosamin-Oligosacchariden unter Verwendung einer Sulfotransferase
Die hierin verwendeten Strukturen und Abkürzungen von Lactosamin-Oligosacchariden sind in Tabelle 1 gezeigt.
Im Speziellen wurde die Übertragungsreaktion einer Sulfatgruppe (³⁵SO₄ wurde als eine Sulfatgruppe verwendet, um die Sulfatierung zu bestätigen) zu verschiedenen Lactosamin-Oligosacchariden unter Verwendung einer Sulfotransferase gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt. Eine Standard-Reaktionsmischung war eine Lösung, die 2,5 μmol Imidazol-HCl (pH 6,8), 0,25 μmol CaCl₂, 0,1 μmol Dithiothreitol, 0,025 μmol verschiedene Lactosamin-Oligosaccharide, 25 pmol [³⁵S]PAPS (etwa 2,5 × 10⁵ cpm) und 0,09 μg gereinigte Chondroitin-6-Sulfotransferase in einem Endvolumen von 50 μl enthält. Die Reaktionsmischung wurde in einem Reaktionsgefäß der Reaktion bei 37°C für 60 Minuten unterzogen. Die Reaktion wurde durch Eintauchen des Reaktionsgefäßes in kochendes Wasser für 1 Minute beendet. Nach der Beendigung der Reaktion wurde Lactosamin-Oligosaccharid (sulfatiertes Lactosamin-Oligosaccharid), zu dem ³⁵SO₄ übertragen worden ist, von freiem ³⁵SO₄ und [³⁵S]PAPS mittels einer Gel-Filtrations-Chromatographie getrennt. Eine Fraktion (1 ml) wurde gesammelt, um die Radioaktivität zu messen.
Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Ein unter Verwendung von LN als das Lactosamin-Oligosaccharid erhaltenes Ergebnis ist in A gezeigt, ein unter Verwendung von SLN erhaltenes Ergebnis ist in B gezeigt, ein unter Verwendung von SLe^x erhaltenes Ergebnis ist in C gezeigt, ein unter Verwendung von L1L1 erhaltenes Ergebnis ist in D gezeigt, ein unter Verwendung von SL1L1 erhaltenes Ergebnis ist in E gezeigt, ein unter Verwendung von L2L4 erhaltenes Ergebnis ist in F gezeigt und ein unter Verwendung von SL2L4 erhaltenes Ergebnis ist in G gezeigt. In A bis C zeigen die nicht ausgefüllten Kreise die unter Verwendung einer gereinigten Chondroitin-6-Sulfotransferase, die mittels einer Behandlung bei 100°C für zwei Minuten hitzeinaktiviert worden ist (Kontrolle), erhaltenen Ergebnisse, und die ausgefüllten Kreise zeigen die unter Verwendung einer intakten gereinigten Chondroitin-6-Sulfotransferase erhaltenen Ergebnisse. In D bis G zeigen die nicht ausgefüllten Kreise Werte an, die durch Subtraktion von Werten, die unter Verwendung einer gereinigten Chondroitin-6-Sulfotransferase erhalten werden, die durch eine Behandlung bei 100°C für zwei Minuten hitzeinaktiviert worden ist (Kontrolle), von den unter Verwendung einer intakten gereinigten Chondroitin-6-Sulfotransferase erhaltenen Werten erhalten werden.
Die Retentionszeit des sulfatierten Lactosamin-Oligosaccharids war 2 bis 3 Minuten schneller als die Retentionszeit (durch die in 1 gezeigten Pfeile angegeben) des verwendeten Lactosamin-Oligosaccharids (Lactosamin-Oligosaccharid vor der Sulfatierung (Akzeptor)). Wenn Sle^x als der Akzeptor verwendet wurde, konnte es vorhergesagt wurde, dass das sulfatierte Sle^x eine Retentionszeit von 83 bis 84 Minuten hatte. Es wurde jedoch keine Radioaktivität in der Nähe der vorhergesagten Retentionszeit detektiert. Die Aufnahme einer Sulfatgruppe in die Lactosamin-Oligosaccharide ist in Tabelle 1 gezeigt. Ein Peak eines sulfatiertes LN's überlappt teilweise mit jenen eines freien ³⁵SO₄ und eines [³⁵S]PAPS. Ein radioaktiver Peak (durch einen horizontalen Strich in 1A gezeigt) eines aus einem LN hergestellten Produkts wurde einer Papier-Elektrophorese unterzogen. Als ein Ergebnis wurde das sulfatierte LN vom ³⁵SO₄ und vom [³⁵S]PAPS getrennt. Daher wurde die Aufnahme einer Sulfatgruppe (³⁵SO₄) in das LN nach der Papier-Elektrophorese berechnet.
Tabelle 1
Gemäß Tabelle 1 wurde keine Übertragung (Aufnahme) einer Sulfatgruppe für Sle^x detektiert, während eine Aufnahme einer Sulfatgruppe für LN, SLN, L1L1, SL1L1, L2L4 und SL2L4 beobachtet wurde. Die Aufnahmemengen in Oligosaccharide, die eine Sialinsäure an ihren nicht-reduzierenden Enden aufweisen, waren etwas größer als die Aufnahmemengen in Oligosaccharide, die keine Sialinsäure aufweisen. Unter diesen Oligosacchariden wurde die maximale Sulfatgruppen-Aufnahme in SL2L4 beobachtet. Gemäß dieser Tatsache wird es vorgeschlagen, dass die Sulfatgruppe (6S) des GlcNAc(6S)-Rests, der an das reduzierende Ende des Gal-Rests angrenzt, die Aufnahme einer Sulfatgruppe in den Gal-Rest steigert. Es wurde keine Aufnahme einer Sulfatgruppe bei Sle^x beobachtet. Es ist entsprechend vorgeschlagen worden, dass der Fuc-Rest, der mit dem nicht-reduzierenden Ende des Gal-Rests verknüpft ist, der an das reduzierende Ende des GlcNAc-Rests angrenzt, die Übertragungsreaktion einer Sulfatgruppe zu dem Gal-Rest mit Hilfe einer Chondroitin-6-Sulfotransferase unterdrückt.
Beispiel 2: Untersuchung eine Position einer Sulfatierung im Lactosamin-Oligosaccharid
Um die Position einer Übertragung einer Sulfatgruppe in das sulfatierte Lactosamin-Oligosaccharid zu bestimmen, wurde sulfatiertes SLN Reaktionen in der Reihenfolge eines Verdaus mit Neuraminidase, einer N-Deacetylierung, einer Deaminierung und einer Reaktion mit NaBH₄ unterzogen. Ein erhaltenes abgebautes Produkt wurde mit den standard-sulfatierten Disacchariden verglichen. Der Ablauf war im Speziellen wie folgt:
Ein eine übertragene Sulfatgruppe (³⁵SO₄) enthaltenes SLN (sulfatiertes SLN) wurde in der gleichen Weise wie bei der in Beispiel 1 beschriebenen Übertragungsreaktion präpariert, außer dass die Konzentration von [³⁵S]PAPS in der Reaktionsmischung vierfach gesteigert war und die Inkubation für 16 Stunden durchgeführt wurde. SLN, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, wurde auf eine Gel-Filtrations-Säule (Superdex 30-Säule) aufgetragen. Das von der Säule eluierte sulfatierte SLN wurde lyophilisiert, mittels Papier-Elektrophorese gereinigt und mit Neuraminidase in der gleichen Weise wie oben beschrieben verdaut.
Die nach dem Neuraminidase-Verdau erhaltene Probe wurde einer Trennung mittels Papier-Elektrophorese unterzogen, gefolgt von einer Hydrazinolyse. Die Hydrazinolyse wurde gemäß einem von Guo, Y. und Conrad, H. E. (1989), Anal. Biochem., 176, 96–104 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die desialylierte Probe wurde in ein Glasfläschchen mit einem Volumen von 100 μl (Reacti-Vial, hergestellt von Pierce) gegeben, in einem N₂-Strom getrocknet und schließlich in 100 μl 70%igem Hydrazin gelöst, das 0,2 mg Hydrazin-Sulfat enthält. Die Probe wurde mit einer Kappe verschlossen, worauf sie für 6 Stunden in einem Sandbad bei 95°C stehengelassen wurde. Die Probe wurde gekühlt, in einem N₂-Strom getrocknet, in einer kleinen Menge Wasser gelöst und lyophilisiert, um nahezu das gesamte Hydrazin zu entfernen.
Ein auf diese Weise erhaltenes deacetyliertes Material wurde mittels einer Gel-Filtrations-Chromatographie und einer Papier-Elektrophorese gereinigt, gefolgt von einer Deaminierung mit salpetriger Säure. Im Speziellen wurde die Deaminierung wie folgt gemäß einem von Shaklee, P. N. und Conrad, H. E. (1986), Biochem. J., 235, 225–236 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Und zwar wurde das deacetylierte Material in 20 μl einer HNO₂-Lösung (pH 4) (hergestellt durch Mischen von 250 μl 5,5 M NaNO₂ und 100 μl 1 M H₂SO₄) gelöst. Die Probe wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehengelassen und dann in Eis gekühlt. Der pH wurde mit 7 μl 1 M Na₂CO₃ auf 8,5 eingestellt. Die Probe wurde mit 10 μl 0,5 M NaBH₄ gemischt und in 0,2 M Na₂CO₃ (pH 10,2) (reduziert mit NaBH₄) gelöst. Überschüssiges NaBH₄ wurde durch Zugabe von 3 M Essigsäure abgebaut. Die Probe wurde im N₂-Strom getrocknet, wieder in Wasser gelöst und wieder getrocknet. Schließlich wurde die Probe in 60 μl Wasser gelöst und mittels einer Gel-Filtrations-Chromatographie und einer Papier-Elektrophorese gereinigt.
Die in den vorangehenden jeweiligen Schritten erhaltenen Reaktionsprodukte wurden einer Papier-Elektrophorese unterzogen, um eine Radioaktivität zu messen. Ergebnisse sind in 2 gezeigt. In 2 zeigt A ein Ergebnis für SLN, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, B zeigt ein Ergebnis für ein Reaktionsprodukt, das durch Verdau einer in A gezeigten Peak-Fraktion mit Neuraminidase erhalten wird, C zeigt ein Ergebnis für ein Reaktionsprodukt, das durch eine Hydrazinolyse (N-Deacetylierung) einer in B gezeigten Peak-Fraktion erhalten wird, und D zeigt ein Ergebnis für ein Reaktionsprodukt, das durch eine Deaminierung einer Fraktion gefolgt von einer Reduktion mit NaBH₄ erhalten wird, welche einem in C gezeigten sich langsam bewegenden Peak (durch einen horizontalen Strich in 2C angegeben) entspricht. Die Ergebnisse wurden unter Durchführung einer Elektrophorese für 40 Minuten (A und B) oder für 80 Minuten (C und D) erhalten.
Es wird vermutet, dass ein sich schnell bewegender Peak in 2C (ein Peak, der nicht durch einen horizontalen Strich in 2C angegeben ist), einer nicht-reagierten Substanz entspricht, was durch eine unvollständige Deacetylierung zustande kommt.
Ein Peak einer nach der Deaminierung und der Reduktion mit NaBH₄ erhaltenen Substanz (durch einen in 2D gezeigten horizontalen Strich angegeben) wurde mit den standard-sulfatierten Disacchariden gemischt, um unter Verwendung einer mit 5 mM KH₂PO₄ equilibrierten Whatman Partisil 10-SAX-Säule (4,5 × 25 cm) eine hoch-auflösende-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) durchzuführen. Die Säule wurde mit 5 mM KH₂PO₄ entwickelt. Die Flussrate betrug 1 ml/Minute und die Temperatur der Säule betrug 40°C. Eine Fraktionierung wurde für jede Fraktion mit einem Volumen von 0,5 ml durchgeführt. Erhaltene Fraktionen wurden entsprechend mit 4 ml Clearsol gemischt, um die Radioaktivität quantitativ zu messen. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. In 3 zeigen nicht ausgefüllte Kreise die ³H-Radioaktivität an und ausgefüllte Kreise zeigen die ³⁵S-Radioaktivität an. Peak 1 und Peak 2 sind [³H]Gal(6S)β1-4AManR bzw. [³H]Galβ1-4AManR(6S) (standardsulfatierte Disaccharide) (Shaklee, P. N. und Conrad, N. E. (1986), Biochem. J., 235, 225–236).
Gemäß 3 wurde es gezeigt, dass die Haupt-³⁵S-Radioaktivität zusammen mit [³H]Gal(6S)β1-4AManR eluiert wurde, jedoch kein ³⁵S-Radiosaktivitäts-Peak an der Position von [³H]Galβ1-4AManR(6S) detektiert wurde. Es ist daher gezeigt worden, dass die Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an der C-6-Position des Gal-Rests durch eine Chondroitin-6-Sulfotransferase übertragen wird, jedoch die Sulfatgruppe nicht zu der Hydroxylgruppe an der C-6-Position des GlcNAc-Rests übertragen wird.
Beispiel 3: Sensitivität von SL1L1, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, und SL2L4, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, auf den Verdau mit β-Galactosidase
Um eine Information der Position von der an SL1L1 und SL2L4 übertragenen Sulfatgruppe zu erhalten, wurde die Sensitivität des Verdaus mit β-Galactosidase für SL1L1, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, und für SL2L4, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, untersucht.
SL1L1, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, oder SL2L4, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, wurde mit Neuraminidase verdaut, um eine endständige Sialinsäure zu entfernen. Desialylierte Substanzen wurden mittels einer Papier-Elektrophorese getrennt. Nach der Elektrophorese wurden die desialylierten Produkte, die vom SL1L1, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, und vom SL2L4, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, stammen, von dem Filterpapier eluiert, lyophilisiert und mit nicht-radioaktivem L1L1 bzw. mit nicht-radioaktivem L2L4 gemischt und mit β-Galactosidase verdaut.
Die Mischung des desialylierten Produkts, welches übertragenes ³⁵SO₄ und das nicht-radioaktive Oligosaccharid enthält, wurde vor oder nach dem Verdau mit β-Galactosidase einer Gel-Filtrations-Chromatographie unterzogen. Von der Gel-Filtrations-Säule eluierte Fraktionen wurden auf der Basis des Absorptionsvermögens bei 210 nm und der ³⁵S-Radioaktivität überwacht. 4 zeigt Ergebnisse für die Mischung des desialylierten SL1L1-Produkts, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, und dem nicht-radioaktiven L1L1. 5 zeigt Ergebnisse für die Mischung des desialylierten SL2L4-Produkts, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, und dem nicht-radioaktiven L2L4. In den 4 und 5 zeigen A und C die vor dem Verdau mit β-Galactosidase erhaltenen Ergebnisse und B und D zeigen die nach dem Verdau mit β-Galactosidase erhaltenen Ergebnisse. In den 4 und 5 zeigen C und D das Absorptionsvermögen bei 210 nm und A und B zeigen die Radioaktivität von 0,5 ml Fraktionen.
Mit Bezug auf die vor dem Verdau mit β-Galactosidase erhaltenen Ergebnisse, wurden die von SL1L1, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, und SL2L4 stammenden desialylierten Produkte an Positionen von sulfatiertem L1L2 (4A) bzw. sulfatier tem L2L4 eluiert (5A). Diese Tatsache zeigt, dass die Desialylierung komplett durchgeführt wurde.
Nach dem Verdau der Mischung mit β-Galactosidase des desialylierten SL1L1-Produkts, das übertragenes ³⁵SO₄ und das nicht-radioaktiven L1L1 enthält, ist das vom nicht-radioaktiven L1L1 stammende Absorptionsvermögen bei 210 nm komplett zu einer langsameren Elutionsposition übergegangen (4D). Auf der anderen Seite wurde noch ein Drittel der ³⁵S-Radioaktivität an der Position des sulfatierten L1L1 eluiert (4B). Diese Ergebnisse deuten an, dass etwa ein Drittel des an SL1L1 übertragenen ³⁵SO₄ an den Galactoserest positioniert wurde, der sich an dem nicht-reduzierenden Ende befindet.
L1L1, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, wurde präpariert und mit β-Galactosidase verdaut. Als ein Ergebnis trat keine signifikante Änderung in dem Verhältnis der Substanzen auf, die übertragenes ³⁵SO₄ enthalten, welche gegenüber einer β-Galactosidase beständig sind (Daten sind hierin nicht gezeigt). Diese Ergebnisse deuten an, dass die sich an dem nicht-reduzierenden Ende befindliche Sialinsäure nicht die Verteilung der übertragenen Sulfatgruppe beeinflusst. Dagegen war das vom SL2L4, das übertragenes ³⁵SO₄ enthält, stammende desialylierte Produkt im Allgemeinen unempfindlich gegenüber einer β-Galactosidase (5B), während nicht-radioaktives L2L4 komplett abgebaut wurde (5D). Entsprechend diesen Ergebnissen wurde es gezeigt, dass sich die gesamten zu SL2L4 übertragenen Sulfatgruppen an dem Galactoserest befinden, der sich am nicht-reduzierenden Ende befindet.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines sulfatierten nicht-fucosylierten Lactosamin-Oligosaccharids, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus: sulfatierten Lactosamin-Oligosacchariden, die durch die folgenden Formeln dargestellt sind: Gal(6S)-GlcNAc(6S)-R SA-Gal(6S)-GlcNAc(6S)-R, und aus einem Lactosamin-Oligosaccharid besteht, das nicht fucosyliert und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Oligosacchariden besteht, die die folgenden Formeln aufweisen: Gal-GlcNAc(6S)-R SA-Gal-GlcNAc(6S)-R, wobei Gal ein Galactoserest ist, GlcNAc ein N-Acetylglucosaminrest ist, SA ein Sialinsäurerest ist, (6S) angibt, dass die Hydroxylgruppe an der C-6-Position sulfatiert ist, – eine Glucosid-Verknüpfung darstellt und R ein Wasserstoffatom oder eine Zuckerkette ist, die ein bis 17 Zucker enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: i) Gemeinsames Einbringen einer Sulfotransferase, eines Sulfatgruppendonors und eines Lactosamin-Oligosaccharids, das nicht fucosyliert ist, in eine wässrige Lösung, wobei die Sulfotransferase geeignet ist, eine Sulfatgruppe zu einer Hydroxylgruppe an der C-6-Position eines Galactoserests des Lactosamin-Oligosaccharids zu übertragen, und im Wesentlichen kein Sulfat zu einem fucosylierten Lactosamin- Oligosaccharids überträgt, wonach die Sulfotransferase eine Sulfatgruppe von dem Sulfatgruppendonor zu der Hydroxylgruppe an der C-6-Position des Galactoserests überträgt, der in dem nicht-fucosylierten Lactosamin-Oligosaccharid vorhanden ist, um ein sulfatiertes nicht-fucosyliertes Lactosamin-Oligosaccharid herzustellen, und wobei die Sulfotransferase aus embryonalen Hühnerchondrocyten ist und die folgenden Eigenschaften aufweist: a) Wirkung: Die Sulfotransferase überträgt eine Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu einer Hydroxylgruppe an einer C-6-Position eines N-Acetylgalactosaminrests oder eines Galactoserests eines Glycosaminoglycans, b) Substratspezifität: Die Sulfotransferase überträgt die Sulfatgruppe zu Chondroitin, zu Chondroitin-Sulfat-A, zu Chondroitin-Sulfat-C und zu Keratansulfat, aber die Sulfatgruppe wird nicht wesentlich zu Chondroitin-Sulfat-E, zu Dermatansulfat und zu Heparansulfat übertragen, c) pH-Reaktionsoptimum: Die Sulfotransferase hat ein pH-Reaktionsoptimum in der Nähe von 6,4, d) Aktivierung: Die Aktivität der Sulfotransferase wird durch Protamin oder MnCl₂ gesteigert, e) Molekulargewicht: Die Sulfotransferase weist ein durch eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter einer reduzierenden Bedingung geschätztes Molekulargewicht von etwa 75 Kilodalton auf, f) Sulfat-Übertragungs-Aktivität Die Sulfotransferase hat eine Eigenschaft, dass eine Sulfat-Übertragungsaktivität zu einem Lactosamin-Oligosaccharid, bei dem ein N-Acetylglucosaminorest, der an das reduzierende Ende eines Galactoserests anschließt, an der C-6-Position nicht sulfatiert ist, geringer ist, als die zu einem Lactosamin-Oligosaccharid, bei dem der N-Acetylglucosaminrest, der an das reduzierende Ende eines Galactoserests anschließt, an der C-6-Position sulfatiert ist, und wobei das Lactosamin-Oligosaccharid, das nicht fucosyliert ist, an der C-6-Position eines N-Acetylglucosaminrests, der an das reduzierende Ende des Galactoserests anschließt, sulfatiert ist, und ii) Gewinnen des sulfatierten nicht-fucosylierten Lactosamin-Oligosaccharids.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das sulfatierte nicht-fucosylierte Lactosamin-Oligosaccharid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus: Oligosacchariden, die durch die folgenden Formeln dargestellt sind: Gal(6S)-GlcNAc(6S)-Gal(6S)-GlcNAc(6S) SA-Gal(6S)-GlcNAc(6S)-Gal(6S)-GlcNAc(6S), und dem Lactosamin-Oligosaccharid besteht, das nicht fucosyliert ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Oligosacchariden besteht, die die folgenden Formeln aufweisen: Gal-GlcNAc(6S)-Gal(6S)-GlcNAc(6S) SA-Gal-GlcNAc(6S)-Gal(6S)-GlcNAc(6S), wobei Gal ein Galactoserest ist, GlcNAc ein N-Acetylglucosaminrest ist, SA ein Sialinsäurerest ist, (6S) angibt, dass die Hydroxylgruppe an der C-6-Position sulfatiert ist und – eine Glycosid-Verknüpfung darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Sialinsäure eine N-Acetylneuraminsäure ist.