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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue Sulfotransferase. Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung eine Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase,
die selektiv eine Sulfatgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes überträgt, der
in Heparin und Heparansulfat enthalten ist.
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Hintergrund
der Erfindung
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Heparin
und Heparansulfat sind Polysaccharide, die zum Glycosaminoglycan
gehören.
Heparin und Heparansulfat haben eine ähnliche Zuckerketten-Grundstruktur
und werden beide durch Synthese einer Kette hergestellt, die aus
N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und Glucuronsäure (GlcA) besteht, die über eine
1 → 4-Bindung
verknüpft
sind, gefolgt von einer Weiterverknüpfung oder Weiterverarbeitung,
wobei jedoch der Grad der Weiterverknüpfung oder Weiterverarbeitung
unterschiedlich zwischen den beiden ist. Obwohl nämlich die
beiden stark negativ geladen sind, enthält Heparin größere Mengen
an N-sulfatiertem Glucosamin, 6-O-sulfatiertem Glucosamin und 2-O-sulfatierter Iduronsäure. Heparansulfat
und Heparin liegen in Geweben in einer Proteoglycan-Form vor, in
der die Zuckerkette in der gleichen Weise ebenso wie andere Glycosaminoglycane
kovalent an ein Kern-Protein bindet.
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Heparin-Proteoglycan
ist in sekretorischen Granula von Mastzellen und basophilen Zellen
gefunden worden, und es kommt in Betracht beim Verpacken von Histaminen
und basischer Protease beteiligt zu sein. Heparansulfat-Proteoglycan
ist weit verbreitet, z. B. über
extrazellulare Matrizen und Zelloberflächen, und es ist bekannt geworden,
dass es verschiedene Funktionen aufweist, wie z. B. solche, die
relevant für
eine Differenzierung, ein Wachstum und eine Bewegung von Zellen
und eine Antikoagulation sind.
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Nebenbei
bemerkt ist der basische Fibroblast-Wachstumsfaktor (bFGF) ein Protein,
das ein starkes Wachstum einer extrem breiten Auswahl von Zellen
erleichtert, wie z. B. jene eines vaskulären Systems, eines Bindegewebs-Systems,
eines Gehirnnervensystems und eines Immunsystems. Auf der anderen
Seite ist ein saurer Fibroblast-Wachstumsfaktor (aFGF) ein Protein,
das oft im Nervensystem, wie z. B. einem Gehirn und einer Retina,
gefunden wird. Da aFGF an einen mit bFGF gemeinsamen Zelloberflächenrezeptor
bindet, kommen die beiden in Betracht, dass sie einen im Wesentlichen
gleichen Wirkmechanismus aufweisen.
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Es
ist offenbart worden, dass aFGF und bFGF stark an einen Zuckerkettenrest
eines Heparansulfat-Proteoglycans binden, das in extrazelluläre Matrizen
oder Basalmembranen von Geweben eingebaut ist. Es ist vor kurzem
vorgeschlagen worden, dass ein Heparin oder eine Neparansulfat-Kette
für bFGF
notwendig ist, um an einen hoch affinen Rezeptor zu binden (Yayon,
A. et al., Cell, 64, 841–848
(1991); Rapraeger, A. C., Science, 252, 1705–1708 (1991)). Es ist des Weiteren
vorgeschlagen worden, dass die bFGF-Aktivität selbst auch eine Bindung
dieser Zuckerketten an den hoch affinen Rezeptor erfordert (Kan,
M. et al., Science 259, 1918–1921
(1993); Guimond, S. et al., J. Biol., Chem., 268, 23906–23914 (1993)).
Die vorliegenden Erfinder haben gezeigt, dass eine besondere Domainstruktur,
die eine Bindung an bFGF betrifft, in der Kette eines Heparansulfats
vorliegt, und dass sich die Bindung von bFGF an die Kette eines
Heparansulfats außerordentlich auf
den bFGF-Stoffwechsel auswirkt (Habuchi, H. et al. (1992) Biochem.
J., 285, 805–813).
Es ist bekannt, dass die Bindung von bFGF die Gegenwart einer 2-O-Sulfat-Gruppe
eines Iduronsäurerestes
und eines N-sulfatierten Glucosaminrests in der Heparansulfat-Kette
benötigt
(Habuchi, H. et al., Biochem. J., 285, 805–813 (1992); Turnbull, J. E.
et al., J. Biol. Chem., 267, 10337–10341 (1992)).
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Es
ist berichtet worden, dass Herapansulfat, das maßgeblich an der Entstehung
einer hoch organisierten Basalmembran beteiligt ist, einen hohen
Sulfatierungsgrad an der C-6-Position eines Glucosaminrests aufweist
(Nakanishi, H. et al., Biochem. J., 288, 215–224 (1992)). Es ist auch berichtet
worden, dass die Affinität eines
Heparins an Fibronectin in Proportion zu dem Molekulargewicht und
dem im Heparin enthaltenen Sulfat ansteigt (Ogamo, A. et al., Biochem.
Biophys. Acta, 841, 30–41
(1985)). Es ist auch bekannt, dass je höher die Metastase-Fähigkeit
eines Zelllinien- Klons
ist, der aus einem Lewis-Lungen-Karzinom stammt, um so größer ist
der Inhalt eines 6-O-Sulfats in einem synthetisierten Heparansulfat
(Nakanishi, H., Biochem. J., 288, 215–224 (1992)), und dass der
Grad der Sulfatierung eines Heparansulfats entsprechend mit einer
malignen Veränderung
abfällt.
Es kommt dementsprechend in Betracht, dass die Sulfatierung eine
wichtige Rolle in einer Expression von physiologischen Aktivitäten von
Heparin und Heparansulfat spielt.
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In
Anbetracht auf den Einfluss einer Sulfatierung in einer Expression
von physiologischen Aktivitäten von
Heparin und Heparansulfat, kann ein Verfahren zur Sulfatierung einer
spezifischen Stelle eines Heparins und eines Heparansulfats essentiell
für eine
Analyse von physiologischen Aktivitäten und einer Modifikation von
Funktionen eines Heparins und eines Heparansulfats sein. Von einem
Verfahren zum chemischen selektiven Einfügen von Sulfatgruppen im Hinblick
auf eine N- oder eine O-Sulfatierung ist schon berichtet worden („Shin-Seikagaku-Jikken-Koza
3, Toshitsu (Saccharides) II",
p324, publiziert von Tokyo-Kagaku-Dojin). Es bedarf jedoch komplizierte
Behandlungsvorgänge,
benötigt
viele Arten von Reagenzien und braucht eine lange Zeit. Deshalb
ist ein Verfahren zum enzymatischen Einführen einer Sulfatgruppe gefordert
worden. Eine Heparansulfat (GlcN)-2-N-Sulfotransferase ist isoliert worden
und als ein Enzym für
ein N-selektives Einführen einer
Sulfatgruppe in einen Glucosamin (GlcN)-Rest gereinigt worden („Shin-Seikagaku-Jikken-Koza
3, Toshitsu II",
p194, publiziert von Tokyo-Kagaku-Dojin). Es ist auch versucht worden,
ein Enzym zu isolieren und zu reinigen, das eine Sulfatgruppe selektiv
an die C-2-Position eines Iduronsäure (IdoA)-Rests eines Heparins und
eines Heparansulfats (Heparansulfat (IdoA)-2-O-Sulfotransferase) überträgt. Es wurde
jedoch berichtet, dass das Enzym selbst nach einer Reinigung bis
zu einem hohen Grad mit einer Heparansulfat (GlcN)-6-O-Sulfotransferase
(ein Enzym zur selektiven Übertragung
einer Sulfatgruppe an die C-6-Position eines Glucosaminrests eines
Heparins und eines Heparansulfats, wenn nötig im Folgenden einfach als „Heparansulfat-6-Sulfotransferase" bezeichnet) kontaminiert
war und die Trennung der beiden schwierig war (Wald, H. et al.,
Glycoconjugate J., 8, 200–201
(1991)). Vor kurzem sind die vorliegenden Erfinder in einer Isolierung und
einer Reinigung einer Heparansulfat-6-O-Sulfotransferase erfolgreich
geworden (J. Biol. Chem., 270, 4712–4719 (1995)). Eine Heparansulfat
(IdoA)-2-O-Sulfotransferase ist jedoch nicht isoliert und gereinigt
worden.
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In
Anbetracht auf den Einfluss einer Sulfatierung in einer Expression
von physiologischen Aktivitäten eines
Heparins und eines Heparansulfats, ist es sehr wichtig, ein Verfahren
für eine Übertragung
einer Sulfatgruppe zu einem Heparin und zu einem Heparansulfat,
nicht nur zum Studium der funktionalen Analysen eines Heparins und
eines Heparansulfats, sondern auch um ein Heparin und Heparansulfat
für den
Zweck einer Gestaltung von Pharmazeutika zu entwickeln, die physiologische
Aktivitäten
bevorzugt für
den Menschen aufweisen. Insbesondere sind nun eine Heparansulfat
(GlcN)-2-N-Sulfotransferase und eine Heparansulfat (GlcN)-6-O-Sulfotransferase
isoliert worden, und deshalb eine Isolierung und Reinigung einer
Heparansulfat (IdoA)-2-O-Sulfotransferase erwünscht worden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung ist unter Betrachtung der vorhergehenden Standpunkte
ausgeführt
worden, dessen Aufgabe es ist, eine Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase
bereitzustellen, die selektiv eine Sulfatgruppe in die Hydroxylgruppe
an der C-2-Position
eines Iduronsäurerestes
eines Heparins und eines Heparansulfats einfügt.
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Die
vorliegenden Erfinder haben unablässig nach einem Enzym gesucht,
welches selektiv eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an die
C-2-Position eines Iduronsäurerestes überträgt, der
in einem Heparin und einem Heparansulfat enthalten ist, d. h. eine
Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase (wenn nötig im Folgenden als „Heparansulfat-2-Sulfotransferase" oder „das Enzym
der vorliegenden Erfindung" bezeichnet),
und waren erfolgreich in einer Isolierung und Reinigung des Enzyms,
bestätigten,
dass das Enzym selektiv eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe
an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes eines Heparins und
eines Heparansulfats überträgt, und
vollendeten die vorliegende Erfindung.
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Und
zwar stellt die vorliegende Erfindung eine Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase
bereit, die die folgenden Eigenschaften aufweist.
- (i)
Wirkung: Eine Sulfatgruppe wird von einem Sulfatgruppendonor selektiv
zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes
eines Sulfatgruppenakzeptors übertragen,
- (ii) Substratspezifität:
Die Sulfatgruppe wird zu Heparansulfat, Heparin oder zu chemisch
modifiziertem Heparin übertragen,
das durch die komplette Desulfatierung der N,O-Sulfatgruppen des
Heparins, gefolgt von einer N-Resulfatierung, erhalten wird (vollständig desulfatiertes,
N-sulfatiertes Heparin, im folgenden als „CDSNS-Heparin" bezeichnet), aber die Sulfatgruppe
wird nicht zu Chondroitin, Chondrotinsulfat, Dermatansulfat und
Keratansulfat übertragen,
- (iii) pH-Reaktionsoptimum: etwa 5 bis 6,5,
- (iv) Ionenstärke-Optimum:
etwa 50 bis 200 mM bei Verwendung von Natriumchlorid,
- (v) Inhibition und Aktivierung: die Aktivität des Enzyms wird durch Protamin
erhöht;
die Aktivität
des Enzyms wird durch Adenosin-3',5'-diphosphat (3'-5'-ADP) inhibiert und
die Aktivität
des Enzyms wird durch Dithiothreitol (DTT) bei 10 mM oder weniger
beeinflusst; und welches ein durch die Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
bestimmtes Molekulargewicht von etwa 44 kDa oder etwa 47 kDa aufweist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung
der Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase bereit, welches die Schritte
einer Kultivierung von Kulturzellen, die aus dem Ovar von chinesischen Hamstern
stammen, und Isolierung der Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase aus
der Kultur umfasst.
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung wird in geeigneter Weise als „Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase" oder als „Heparansulfat-2-Sulfotransferase" bezeichnet. Es ist
jedoch nicht gemeint, dass das Substrat des Enzyms auf Heparansulfat
beschränkt
ist. Das Enzym der vorliegenden Erfindung überträgt zum Beispiel eine Sulfatgruppe
zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes
eines CDSNS-Heparins.
Unmodifiziertes Heparin weist eine Sulfatgruppe an der C-2-Position
von fast allen Iduronsäureresten
auf. Heparin, das eine Hydroxylgruppe an dieser Position aufweist,
ist jedoch ein wenig vorhanden. Das Enzym der vorliegenden Erfindung überträgt auch
eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines
Iduronsäurerestes
eines solchen Heparins. In dieser Beschreibung sind, wenn nötig, jene
als „Heparin" bezeichnet, die
ein modifiziertes Heparin, wie zum Beispiel CDSNS-Heparin, enthalten.
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Die
vorliegende Erfindung wird unten im Detail erklärt werden.
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<1> Heparansulfat-2-Sulfotransferase
der vorliegenden Erfindung
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung ist ein Enzym, welches gemäß der vorliegenden
Erfindung zum ersten Mal isoliert worden ist, und die folgenden
Eigenschaften aufweist.
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(i) Wirkung
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Eine
Sulfatgruppe wird von einem Sulfatgruppendonor selektiv zu der Hydroxylgruppe
an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes eines Sulfatgruppenakzeptors übertragen.
Der Sulfatgruppendonor wird vorzugsweise beispielhaft durch aktiviertes
Sulfat (3'-Phosphoadenosin
5'-Phosphosulfat,
wenn nötig
im Folgenden als „PAPS" bezeichnet) erläutert. Die
Sulfatgruppe wird kaum zu einem Glucosaminrest übertragen. Der Sulfatgruppenakzeptor
enthält
Heparin und Heparansulfat.
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(ii) Substratspezifität
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Die
Sulfatgruppe wird zu Heparansulfat, Heparin oder CDSNS-Heparin übertragen,
aber die Sulfatgruppe wird nicht zu Chondroitin, Chondroitinsulfat,
Dermatansulfat und Keratansulfat übertragen.
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(iii) pH-Reaktionsoptimum
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung weist eine hohe Aktivität, um eine
Sulfatgruppe zu übertragen, in
einem Bereich von pH 5 bis 6,5, vorzugsweise in dem Bereich von
pH 5,5 auf.
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(iv) Ionenstärke-Optimum
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Die
Aktivität
des Enzyms der vorliegenden Erfindung steigt mit dem Ansteigen der
Ionenstärke
an. In dem Fall, wenn NaCl verwendet wird, liegt die höchste Aktivität bei 50
bis 200 mM vor, vorzugsweise in der Umgebung von 100 mM. Die Aktivität nimmt
fortschreitend ab, wenn die Konzentration von NaCl übermäßig über den
voran genannten Bereich ansteigt. Die Aktivität wird bei 500 mM extrem gering.
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(v) Inhibition und Aktivierung
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Die
Aktivität
des Enzyms der vorliegenden Erfindung wird durch Protamin erhöht. Die
Aktivität
wird durch Protamin um etwa das dreifache auf etwa 0,013 mg/ml oder
mehr gesteigert, verglichen mit der bei der Abwesenheit von Protamin.
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Die
Aktivität
des Enzyms der vorliegenden Erfindung wird durch 3'-5'-ADP inhibiert.
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Die
Aktivität
des Enzyms der vorliegenden Erfindung wird kaum durch DTT bei 10
mM oder weniger beeinträchtigt.
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(vi) Michaelis-Konstante
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung weist vorzugsweise eine Michaelis-Konstante
(Km) von etwa 0,20 μM
für PAPS
auf, wenn CDSNS-Heparin als ein Sulfatgruppenakzeptor und PAPS als
ein Sulfatgruppendonor verwendet werden.
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(vii) Andere Eigenschaften
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Als
ein Analyseergebnis einer aktiven Fraktion des Enzyms der vorliegenden
Erfindung, die aus einer Kultur von Zellen erhalten wird, die aus
einem Ovar von chinesischen Hamstern stammen (d. h., CHO-Zellen), mittels
einer Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE), sind zwei nah beieinander liegende breite Banden in
der Umgebung von 44 kDa und 47 kDa gefunden worden. Es ist nicht
klar, ob eines oder keines dieser Proteine das Enzym der vorliegenden
Erfindung ist, oder ob diese beiden das Enzym der vorliegenden Erfindung
sind. Auf jeden Fall sind die oben beschriebenen physikalischen
und chemischen Eigenschaften des Enzyms der vorliegenden Erfindung
unter Verwendung der Enzymfraktion, die die Proteine enthält, die
die breiten Banden von 44 kDa und 47 kDa aufweisen, bestimmt worden.
Die Mobilität
der beiden Proteine in einer Elektrophorese wurde nicht durch die
Gegenwart von Mercaptoethanol beeinträchtigt.
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Als
ein Ergebnis einer Analyse des Enzyms der vorliegenden Erfindung
nach einer N-Glycanase (hergestellt von Genzyme)-Behandlung mittels
einer SDS-PAGE sind die voran genannten breiten Banden von 44 kDa
und 47 kDa verloren gegangen, während
Banden von 34 kDa und 38 kDa neu erschienen sind. Es ist entsprechend
vorgeschlagen worden, dass diese Proteine Glycoproteine sind, die
nicht weniger als 19 Gewichtsprozent Zucker enthalten.
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung wurde in der Umgebung eines Molekulargewichts
von etwa 130.000 bei einer Superose-12 (hergestellt von Pharmacia-LKB)-Gel-Chromatographie
eluiert.
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Die
Aktivität,
um eine Sulfatgruppe des Enzyms der vorliegenden Erfindung zu übertragen,
kann unter Verwendung von [35S]-PAPS als
ein Sulfatgruppendonor und Heparin oder Heparansulfat als ein Sulfatgruppenakzeptor,
durch Ermöglichen
des Enzyms der vorliegenden Erfindung auf diese zu wirken und durch
Messung der Radioaktivität
von [35S], das in Heparin oder Heparansulfat
eingefügt
ist, gemessen werden. Die Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität kann unter
Verwendung von CDSNS-Heparin als ein Sulfatgruppenakzeptor gemessen
werden. Die Heparansul fat-2-Sulfotransferase, die das Enzym der
vorliegenden Erfindung ist, wird nicht durch 10 mM DTT inhibiert,
während
die Heparansulfat-6-Sulfotransferase, die ein bekanntes Enzym ist,
durch 10 mM DTT inhibiert wird. Dementsprechend kann nur die Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität durch
Zugabe von 10 mM DTT zu einer Enzym-Reaktionslösung gemessen werden, die [35S]-PAPS, CDSNS-Heparin und eine Sulfotransferase
enthält,
indem die Heparansulfat-6-Sulfotransferase-Aktivität inhibiert wird. Wenn die
Reaktion des Enzyms der vorliegenden Erfindung ausgeführt wird,
ist es wünschenswert, dass
ein pH einer Enzym-Reaktionslösung
5 bis 6,5 ist, die Ionenstärke
etwa 50 bis 200 mM (NaCl) ist, und Protamin in einer Menge von nicht
weniger als 0,025 mg/ml hinzugegeben wird. Zum Beispiel insbesondere eine
Enzym-Reaktionslösung
(50 μl),
die 2,5 μmol
Imidazol-Hydrochlorid
(pH 6,8), 3,75 μg
Protamin-Hydrochlorid, 25 nmol CDSNS-Heparin und 50 pmol [35S]-PAPS (etwa 5 × 105 cpm)
enthält,
und das Enzym bei einer Temperatur von 37°C gehalten wird, gefolgt von
einem Erhitzen bei 100°C
für eine
Minute, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend wird 0,1 μmol Chondroitin-Sulfat-A
als ein Träger
hinzugegeben und dann wird ein 35S-markiertes
Glycosaminoglycan durch Zugabe von kaltem Ethanol in einer dreifachen
Menge der Reaktionslösung
präzipitiert,
welches 1,3% Kaliumacetat enthält.
Des Weiteren werden [35S]-PAPS und dessen
abgebauten Produkte durch Aussalzen entfernt, ein Flüssigkeits-Szintillator
wird hinzugegeben und eine [35S]-Radioaktivität wird unter
Verwendung eines Flüssigszintillationszählers gemessen.
Bei der vorliegenden Erfindung wird eine Aktivität, um 1 pmol einer Sulfatgruppe
pro Minute unter der voran genannten Bedingung zu übertragen,
als eine Enzymmenge von 1 Unit (U) definiert.
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<2> Verfahren
zur Herstellung des Enzyms der vorliegenden Erfindung
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung, das die oben beschriebenen Eigenschaften
aufweist, kann durch Kultivierung von Zellen, die von Tieren stammen,
z. B. von Zellen, die aus einem Ovar chinesischer Hamster stammen,
im Speziellen von CHO-Zellen
(zum Beispiel ATCC CCL61 und dergleichen) in einem Kulturmedium
und durch Isolierung der Heparansulfat-2-O-Sulfotransferase aus
der Kultur erhalten werden. CHO-Zellen sind als die für die Kultivierung
verwendeten Kulturzellen bevorzugt. Das Enzym der vorliegenden Erfindung
kann aus anderen als den oben beschriebenen Kulturzellen erhalten
werden, jedoch sind die oben beschriebenen Kulturzellen aufgrund
ihrer guten Wachstumseigenschaften und einer Möglichkeit einer Kultivierung
in einer großen
Menge unter Verwendung von Zellen in Suspension bevorzugt. Das Enzym
der vorliegenden Erfindung kann auch nach einer Kultivierung aus
dem Medium extrahiert werden. Das Enzym der vorliegenden Erfindung
kann als ein Roh-Enzym verwendet werden, wenn es keine andere Sulfotransferase-Aktivität enthält, oder
wenn andere kontaminierende Sulfotransferase-Aktivitäten wirksam
unterdrückt
werden können.
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Das
Medium, das wie oben beschrieben für die Kultivierung der Kulturzellen
verwendet wird, ist nicht besonders eingeschränkt, es ist jedoch bevorzugt
ein solches zu verwenden, das für
schwimmende Zellen, die z. B. in einer „Spinner-Flask" enthalten sind,
zu verwenden, um effizient eine große Zellmenge zu erhalten. Speziell
kann ein kommerziell erhältliches
Medium verwendet werden, wie z. B. ein CHO-S-SFMII-Medium (hergestellt
von Gibco), das für
eine Suspensionskultur für
CHO-Zellen entwickelt ist.
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Um
ein Wachstum von Mikroorganismen zu vermeiden, ist es bevorzugt
ein Antibiotikum, wie z. B. Penicillin und Streptomycin, zu dem
Medium zu geben. Wenn das wie oben beschriebene Medium verwendet wird,
um eine Kultivierung in der gleichen Weise wie bei gewöhnlichen
Kulturzellen unter Verwendung von Roller-Flaschen, Schalen oder
dergleichen durchzuführen,
wird das Enzym der vorliegenden Erfindung in der Kultur, insbesondere
in Kulturzellen akkumuliert.
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung eines Ausgangsmaterials,
wie z. B. einem Überstand
nach einer Zentrifugation, welcher durch Sammeln von Zellen aus
einer Kultur nach einer Kultivierung zum Beispiel mittels Zentrifugation
erhalten wird, und Aufschluss von Zellen zum Beispiel mittels Homogenisierung,
Ultraschallbehandlung oder osmotischen Druck-Schock, und einem Zentrifugieren
einer Zell-Aufschluss-Lösung,
die durch den vorangehenden Schritt erhalten wird, gereinigt werden.
Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann mittels einer Affinitäts-Chromatographie
unter Verwendung einer Heparin-Sepharose-CL-6B
(hergestellt von Pharmacia)-Säule,
einer 3'-5'-ADP-Agarose-Säule und
dergleichen oder einer Gel-Filtrations-Chromatographie unter Verwendung
einer Superose-12 (hergestellt von Pharmacia)-Säule gereinigt werden. Wenn
nötig,
kann das Enzym zusätzlich
unter Verwendung bekannter Enzym-Reinigungs-Verfahren, z. B. einer
Ionen-Austauscher-Chromatographie, einer Gel-Filtration, einer Elektrophorese,
einer hydrophobischen Chromatographie und einem Aussalzen gereinigt
werden.
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung kann auch unter Verwendung transformierter
Zellen, die durch Isolierung eines Gens aus den oben beschriebenen
Kulturzellen, welches für
das Enzym der vorliegenden Erfindung codiert, und durch Einfügen dieses
in andere Kulturzellen oder mikrobielle Zellen, erhalten werden.
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Das
Enzym der vorliegenden Erfindung hat eine enzymatische selektive
Einfügung
einer Sulfatgruppe in die Hydroxylgruppe an der C-2-Position eines
Iduronsäurerestes
ermöglicht,
der in Heparin und Heparansulfat enthalten ist. Die Heparansulfat-2-Sulfotransferase
fügt äußerst genau
eine Sulfatgruppe selektiv in die C-2-Position eines Iduronsäurerestes
eines Heparins und eines Heparansulfats ein. Es wird entsprechend
erwartet, dass das Enzym für
Reagenzien zu verwerten ist, die nützlich für Studien, wie z. B. funktionellen
Analysen von Heparin und Heparansulfat, sind.
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In
Anbetracht einer Gestaltung eines Heparins und eines Heparansulfats,
die zurzeit unbekannte neue physiologische Aktivitäten aufweisen,
und eine Applikation als Pharmazeutika unter Verwendung des Enzyms der
vorliegenden Erfindung, um selektiv eine Sulfatgruppe in die C-2-Position
eines Iduronsäurerestes
eines Heparansulfats einzufügen,
kann es erwartet werden, ein Heparin oder ein Heparansulfat zu gestalten,
das physiologische Aktivitäten
vorzugsweise für
den Menschen aufweist. Da es bekannt ist, dass der Sulfatierungsgrad
eines Heparansulfats in Übereinstimmung
mit einer malignen Veränderung
abfällt,
wird es auch erwartet, dass die Menge des Enzyms mit der malignen
Veränderung
von Zellen in Verbindung gebracht werden kann, indem ein Antikörper gegen
das Enzym der vorliegenden Erfindung hergestellt und das Enzyms
der vorliegenden Erfindung in Geweben nachgewiesen wird.
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Kurze Erläuterung
der Zeichnungen
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1 zeigt
ein Ergebnis einer ersten Heparin-Sepharose-CL-6B-Chromatographie
für das
Enzym der vorliegenden Erfindung. Geschlossene Kreise zeigen eine
Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität an (die Aktivität wurde
in der Abwesenheit von DTT gemessen), offene Kreise zeigen eine
Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität an (die Aktivität wurde
in der Gegenwart von 10 mM DTT gemessen), geschlossene Quadrate zeigen
eine Proteinkonzentration an und eine unterbrochene Linie zeigt
eine NaCl-Konzentration an.
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2 zeigt
ein Ergebnis einer zweiten Heparin-Sepharose-CL-6B-Chromatographie
für das
Enzym der vorliegenden Erfindung. Geschlossene Kreise, offene Kreise,
geschlossene Quadrate bzw. eine unterbrochene Linie in 2 zeigen
das gleiche wie jene in 1 an.
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3 zeigt
ein Ergebnis einer Superose-12-Gel-Chromatographie. Geschlossene
Kreise bzw. offene Kreise in 3 zeigen
das gleiche wie jene in 1 an. Bezifferte Pfeile 1, 2
bzw. 3 in 3 zeigen Positionen einer Elution
eines Standard-Proteins an. 1: Rinderserum-Albumin (BSA, 67 kDa),
2: Ovalbumin (43 kDa) und 3: Chymotrypsinogen (25 kDa).
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4 ist
eine elektrophoretische Aufnahme, die ein Ergebnis einer SDS-PAGE
von Fraktionen zeigt, die durch die Superose-12-Gel-Chromatographie
fraktioniert sind. Die Zahlen in den oberen Bereichen in 4 zeigen
Fraktionsnummern an. M zeigt eine Molekulargewichtsmarke an.
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5 ist
eine elektrophoretische Aufnahme, die ein Ergebnis einer SDS-PAGE
von Enzymfraktionen der vorliegenden Erfindung von jedem der Reinigungsschritte
zeigt. M: Molekulargewichtsmarker, Bahn 1: Rohextrakt, Bahn 2: eine
Fraktion, die mit einem Abschnitt übereinstimmt, der durch eine
horizontale Linie (dicke Linie) in 1 bei der
ersten Heparin-Sepharose-CL-6B angezeigt wird, Bahn 3: eine adsorbierte
Fraktion in der ersten 3'-5'-ADP-Agarose, Bahn
4: eine Fraktion, die einem Abschnitt entspricht, der durch eine
horizontale Linie (dicke Linie) in 2 bei der
zweiten Heparin-Sepharose-CL-6B-Chromatographie angezeigt wird, und
Bahn 5: eine adsorbierte Fraktion bei der zweiten 3'-5'-ADP-Agarose.
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6 ist
eine elektrophoretische Aufnahme, die ein Ergebnis einer SDS-PAGE
des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt, das einer oder keiner
N-Glycanase-Behandlung unterzogen ist. Bahn 1: das Enzym der vorliegenden
Erfindung, welches keiner Behandlung unterzogen ist, Bahn 2: das
Enzym der vorliegenden Erfindung, das mit N-Glycanase behandelt
ist, und Bahn 3: N-Glycanase.
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7 zeigt
HPLC-Chromatogramme von Heparitinase-verdauten Reaktionsprodukten,
die durch eine Sulfatgruppen-Übertragung
unter Verwendung des Enzyms der vorliegenden Erfindung zu (A) CDSNS-Heparin
und (B) Heparansulfat erhalten werden, die aus einem EHS-Tumor stammen.
Geschlossene Kreise und eine unterbrochene Linie zeigen eine Radioaktivität bzw. eine
KH2PO4-Konzentration
an.
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8 zeigt
HPLC-Chromatogramme von Disacchariden, die unter Verwendung einer
Partisil-10-SAX-Säule
eluiert sind, wobei die Disaccharide durch Abbau mit Nitrit bei
pH 1,5 hergestellt werden und Reaktionsprodukte durch einen Sulfatgruppentransfer
unter Verwendung des Enzyms der vorliegenden Erfindung zu (A) CDSNS-Heparin
und (B) Heparansulfat, die aus einem EHS-Tumor stammen, und einer
Reduzierung mit NaBH4 erhalten werden. Geschlossene
Kreise und eine unterbrochene Linie zeigen das gleiche wie jene
in 7 an.
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9 zeigt
pH-Enzym-Aktivitäts-Kurven,
die ein pH-Optimum des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigen.
Offene Kreise zeigen einen Tris-HCl-Puffer an, geschlossene Kreise
zeigen einen Imidazol-HCl-Puffer an, offene Quadrate zeigen einen
2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure
(MES)-Puffer an und geschlossene Quadrate zeigen einen Kalium-Acetat-Puffer
an.
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10 zeigt
eine NaCl-Konzentrations-Enzym-Aktivitäts-Kurve, die ein NaCl-Konzentrations-Optimum
des Enzyms der vorliegenden Erfindung zeigt.
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11 zeigt
eine DTT-Konzentrations-Enzym-Aktivitäts-Kurve, die den Einfluss
von DTT auf das Enzym der vorliegenden Erfindung zeigt.
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12 zeigt
eine Protamin-Konzentrations-Enzym-Aktivitäts-Kurve, die den Einfluss
von Protamin auf das Enzym der vorliegenden Erfindung zeigt.
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Beschreibung
einer bevorzugten Ausführungform
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Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden unten beschrieben werden. Verfügbare Quellen
und Verfahren, um die Reagenzien und Proben zu erhalten, die in
den Ausführungsformen
verwendet werden, sind unten beschrieben.
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[35S]-H2SO4 wurde von der Japan Isotope Association
bezogen. Ein CHO-S-SFMII-Medium
wurde von Gibco bezogen. PAPS, 3'-5'-ADP-Agarose und
Heparin wurden von Sigma bezogen. Cosmedium-001-Medium wurde von
Cosmo Bio bezogen. Polyethylenglycol #20000 wurde von Nacalai Tesque
bezogen. Eine schnelle Entsalzungs-Säule, eine Heparin-Sepharose-CL-6B,
eine Superose-12-Säule
und eine Superdex-30pg-Säule wurden
von Pharmacia-LKB bezogen. Eine PAMN-Säule (Siliziumsäule mit
gebundenem Polyamin) wurde von YMC bezogen. Eine Partisil-10-SAX-Säule wurde von Whatman bezogen.
Chondroitinase-ABC, Heparitinase I, II, III, Chondroitin-Sulfat-A
(aus Walknorpel, 4S/6S:80/20), CDSNS-Heparin, Chondroitinsulfat-C
(aus Haiknorpel, 4S/6S:10/90), Dermatansulfat, Keratansulfat und
ein Kit von ungesättigten
Disacchariden vom Glycosaminoglycan wurden von der Seikagaku Corporation
bezogen. [35S]-PAPS wurde gemäß einem
von Delfert, D. M. und Conrad, E. H. (1985) in Anal. Biochem. 148,
303–310
beschriebenen Verfahren hergestellt. Chondroitin (aus der Tintenfisch-Haut)
wurde gemäß einem
von Habuchi, O. und Miyata, K. (1980) in Biochem. Biophys. Acta,
616, 208–217
beschriebenen Verfahren hergestellt. p-Tosyl-L-Lysin-Chloromethyl-Keton
wurde von Aldrich bezogen. Phenylmethylsulfonylfluorid und N-Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethyl-Keton wurden von
Sigma bezogen. Pepstatin wurde von Wako Pure Chemical Industries
bezogen. Heparansulfat aus einem Maus-EHS (Engelbreht-Holm-Swarm)-Tumor, Heparansulfat
aus einer Schweine-Aorta und Heparansulfat aus einer Rinder-Leber
wurden von der Seikagaku Corporation erhalten.
-
<1> Verfahren
zur Messung einer Sulfotransferase-Enzym-Aktivität
-
(1) Messung einer Sulfotransferase-Aktivität
-
Die
Enzymaktivität
wurde gemäß einem
in den Reinigungsschritten der Heparansulfat-2-Sulfotransferase,
in der Analyse der Eigenschaften des Enzyms usw. unten beschriebenen
Verfahren gemessen.
-
Eine
Enzym-Reaktionslösung
war eine Mischung (50 μl),
die 2,5 μmol
Imidazol-Hydrochlorid (pH 6,8), 3,75 μg Protamin-Hydrochlorid, CDSNS-Heparin
(25 nmol, wie es in einer Hexosamin-Menge umgesetzt ist), 50 pmol
[35S]-PAPS (etwa 5 × 105 cpm)
und das Enzym enthält.
Diese Reaktionslösung
wurde bei einer Temperatur von 37°C
für 20
Minuten gehalten, gefolgt von einem Erhitzen bei 100°C für eine Minute,
um die Reaktion zu stoppen. Anschließend wurde Chondroitinsulfat
A (0,1 μmol,
wie es in einer Glucoronsäure-Menge umgesetzt
ist) als ein Träger
hinzugegeben, und dann wurde 35S-Glycosaminoglycan
durch Zugabe kalten Ethanols in einer dreifachen Menge der Reaktionslösung präzipitiert,
welches 1,3% Kaliumacetat enthält.
Des Weiteren wurden [35S]-PAPS und seine
Abbauprodukte unter Verwendung einer schnellen Entsalzungssäule, wie
in Habuchi, O. et al., (1993) J. Biol. Chem., 258, 21968–21974 beschrieben,
komplett getrennt. Ein Flüssigkeits-Szintillator (Ready
Safe Scintillator, hergestellt von Beckman) wurde damit gemischt
und eine Radioaktivität
wurde unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers gemessen,
um die Menge einer übertragenen
Sulfatgruppe zu berechnen. Eine Aktivität, um 1 pmol einer Sulfatgruppe
pro Minute unter der voran genannten Bedingung zu übertragen,
wurde als eine Enzymmenge von 1 Unit (U) definiert.
-
Die
Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität wurde wie oben beschrieben
unter Verwendung von CDSNS-Heparin als ein Sulfatgruppenakzeptor
gemessen. Wenn nötig,
wurde wie oben beschrieben die Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität durch
Inhibierung der Heparansulfat-6-Sulfotransferase-Aktivität durch
Zugabe von 10 mM DTT zu der Enzym-Reaktionslösung gemessen.
-
(2) Messung des Galactosamin-
und Glucosamin-Gehalts im Glycosaminoglycan
-
Ein
Galactosamin- und Glucosamin-Gehalt im Glycosaminoglycan wurde durch
ein Elson-Morgan-Verfahren nach einer Hydrolysierung des Glycosaminoglycans
in 6 M HCl bei 100°C
für vier
Stunden gemessen.
-
<2> Heparansulfat-6-Sulfotransferase-
und Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Verteilung in CHO-Kulturzellen
-
Um
die Heparansulfat-6-Sulfotransferase- und Heparansulfat (HexA)-2-Sulfotransferase-Verteilung (eine
Sulfatgruppe ist zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Hexuronsäure (HexA)-Rests übertragen)
in CHO-Kulturzellen zu untersuchen, wurde das folgende Experiment
durchgeführt.
-
CHO-Zellen
(ATCC CCL61) wurden für
48 Stunden in Cosmedium-001-Medium kultiviert. Danach wurde die
Sulfotransferase-Aktivität
für das
Medium und für
eine Extraktlösung
aus Zellen (Überstand,
der durch Homogenisierung von Zellen mit Puffer A (10 mM Tris-HCl,
pH 7,2, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2,
20% Glycerol und 0,1% Triton X-100), der 0,15 M NaCl enthält, durch
Steigerung der Konzentration von Triton X-100 bis 0,5% und der Durchführung einer
Extraktion für
eine Stunde unter Agitation, gefolgt von einer Zentrifugation bei
10.000 × g
für 30
Minuten erhalten wird) unter Verwendung von CDSNS-Heparin als ein
Substrat und [35S]-PAPS als ein Sulfatgruppendonor
gemessen. Als ein Ergebnis, wie in Tabelle 1 gezeigt, waren nicht weniger
als 95% der Heparansulfat-(HexA)-2-Sulfotransferase in den Zellen
vorhanden, und nicht mehr als 5% davon waren in dem Medium vorhanden.
In Tabelle 1 ist die Heparansulfat-(HexA)-2-Sulfotransferase einfach als „2-Sulfotransferase" ausgedrückt.
-
-
Auf
der anderen Seite ist es schon von den vorliegenden Erfindern berichtet
worden, dass nicht weniger als 90% einer Heparansulfat-6-Sulfotransferase
in dem Medium vorlagen. Gemäß diesen
Beobachtungen ist es gezeigt worden, dass eine Reinigung der Heparansulfat-2-Sulfotransferase
als das Enzym der vorliegenden Erfindung bevorzugt von einer Extraktlösung ausgeht,
die aus CHO-Zellen erhalten wird.
-
<3> Reinigung
einer von CHO-Zellen produzierten Heparansulfat-2-Sulfotransferase
-
(1) Kultivierung von CHO-Zellen
und Herstellung eines Rohextrakts
-
CHO-Zellen
(ATCC CCL61) wurden in CHO-S-SFMII-Medium (10 ml), das 50 μg/ml Streptomycin
und 50 Units Penicillin (1 ml) enthält, in einer Zelldichte von
2 × 106 Zellen/100 mm pro Schale inokuliert, und
für vier
Tage kultiviert. Danach wurden die Kulturzellen in ein CHOS-SFMII-Medium
(500 ml) in einer Zelldichte von 3,0 × 105 Zellen/ml
inokuliert und in einem Schwebestadium in einer Spinner-Flasche
(hergestellt von Techne) für
vier Tage unter Agitation bei 90 rpm kultiviert. Eine erhaltene
Flüssigkultur
wurde, um Zellen zu sammeln, bei 1.000 × g für fünf Minuten zentrifugiert, und
die Zellen wurden dann mit kaltem Phosphatpuffer (PBS (–)) gewaschen.
Um eine Sulfotransferase aus den Zellen zu extrahieren, wurde ein
Extraktionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,5% w/v Triton X-100,
10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2,
0,15 M NaCl, 20% v/v Glycerol, vier Protease-Inhibitor-Arten (5 μM p-tosyl-L-lysin-chloromethyl-Keton,
3 μM N-tosyl-L-phenylalanin-chloromethyl-Keton,
30 μM Phenylmethylsulfonylfluorid
und 3 μM
Pepstatin) in einer Menge von 55 ml zu 1 × 109 Zellen hinzugegeben.
Die Zellen in dem Extraktionspuffer wurden zehnmal unter Verwendung
eines Glas-Homogenisiergeräts
homogenisiert, gefolgt von einer Agitation bei 4°C für eine Stunde. Eine extrahierte
Lösung
wurde bei 10.000 × g
für 30
Minuten zentrifugiert, um einen Überstand
zu erhalten. Der Überstand
wurde als ein Rohextrakt verwendet und vereinigt (1,8 L), und der
Rohextrakt wurde bei –20°C bis zum
Beginn der Reinigung gelagert.
-
(2) Reinigung einer Heparansulfat-2-Sulfotransferase
-
Die
gesamten folgenden Arbeitsgänge
wurden bei 4°C
durchgeführt.
-
(i) Erster Schritt Erste
Heparin-Sepharose-CL-6B-Chromatographie
-
Ein
Drittel des, wie oben beschrieben, hergestellten Rohextrakts (600
ml) wurde auf eine Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule (30 × 70 mm, 50 ml) aufgetragen,
die mit Puffer A equilibriert ist, der vier Protease-Inhibitor-Arten
(p-tosyl-L-lysin-chloromythyl-Keton
(5 μM),
N-tosyl-L-phenylalanin-chloromethyl-Keton (3 μM), Phenylmethylsulfonylfluorid
(30 μM)
und Pepstatin (3 μM))
und 0,15 M NaCl enthält.
Die Flussrate betrug 76 ml/Stunde. Die Säule wurde mit Puffer A, der
vier Protease-Inhibitor-Arten und 0,15 NaCl enthält, zehnmal in einer Menge
des Säulenvolumens
gewaschen, um eine Fraktion zu entfernen, die nicht an der Säule adsorbiert ist,
und dann wurde eine adsorbierte Fraktion mit einem linearen Konzentrationsgradienten
(Gesamtvolumen 1.000 ml) eluiert, indem die NaCl-Konzentration von
0,15 M bis 1,2 M im Puffer A erhöht
wurde, der vier Protease-Inhibitor-Arten und NaCl enthält. Auf
diese Weise wurden Fraktionen (13 ml jede) gesammelt. Jede der eluierten
Fraktionen wurde für
die Proteinkonzentration, die Sulfotransferase-Aktivität in der
Gegenwart von 10 mM DTT (Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität) und die
Sulfotransferase-Aktivität
in der Abwesenheit von DTT (Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität) gemessen
(1). Fraktionen, die die Sulfotransferase-Aktivität enthalten
(übereinstimmend
mit einem Teil, der durch eine dicke Linie in 1 angezeigt
ist) wurden vereinigt, und die vereinigten Fraktionen wurden in
ein Dialyse-Gefäß eingefüllt. Polyethylen-Glycol-Pulver #20000
wurde darauf gesprenkelt, um eine Konzentrierung bis auf etwa 100
ml durchzuführen.
Für den
nächsten
Reinigungsschritt wurde die Konzentration von Triton X-100 auf 1%
eingestellt, gefolgt von einer Dialyse gegen Puffer A, der 0,05
M NaCl enthält.
-
Infolge
des oben beschriebenen Arbeitsvorgangs stieg die Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität um etwa
das 1,9-fache an. Dies kann durch die Eliminierung der abbauenden
Enzyme für
PAPS und den Substanzen, die eine Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität inhibieren,
durch die Säulenchromatographie
verursacht sein.
-
(ii) Zweiter Schritt 3'-5'-ADP-Agarose-Chromatographie
-
Die
dialysierte Lösung,
die in dem oben beschriebenen ersten Schritt erhalten wird, wurde
durch eine 3'-5'-ADP-Agarose-Säule (14 × 90 mm,
15 ml) gegeben, die mit Puffer A equilibriert ist, der 0,05 M NaCl
enthält.
Die Flussrate betrug 13 ml/Stunde. Die Säule wurde achtmal in einer
Menge des Säulenvolumens
mit Puffer A gewaschen, der 0,05 M NaCl enthält, um eine Fraktion zu entfernen,
die nicht an die Säule
adsorbiert ist, und dann wurde eine adsorbierte Fraktion fünfmal in
einer Menge des Säulenvolumens
mit Puffer A eluiert, der 0,05 M NaCl und 0,2 mM 3'-5'-ADP enthält. Zu der
Fraktion wurde Puffer A hinzugegeben, der 1 M NaCl enthält, so dass
die Endkonzentration von NaCl 0,15 M wurde.
-
Eine
Kombination aus dem ersten und dem zweiten Schritt wurde dreimal
wiederholt. Aktive Fraktionen, die durch die dreimaligen Arbeitsvorgänge erhalten
wurden, wurden vereinigt. Ein Aliquot der vereinigten Fraktion wurde
auf eine kleine Heparin-Sepharose-Säule (Bed-Volumen:
0,6 ml) aufgetragen und die Säule wurde
mit Puffer A gewaschen, der 0,15 M NaCl enthält, gefolgt von einer Elution
mit Puffer A, der 1,0 M NaCl enthält. Eine erhaltene Fraktion
wurde auf ihre Aktivität
gemessen, um eine Gesamtaktivität
des gereinigten Enzyms in dieser Phase zu bestimmen.
-
Infolge
des oben beschriebenen Arbeitsvorgangs wurde die spezifische Aktivität der Heparansulfat-2-Sulfotransferase
in einem Schritt 44-fach, wobei offenbart wurde, dass der Arbeitsvorgang
ein äußerst effektives
Verfahren zur Reinigung dieses Enzyms war.
-
(iii) Dritter Schritt
Zweite Heparin-Sepharose-CL-6B-Chromatographie
-
Die
aktive Fraktion der in dem zweiten Schritt erhaltenen Heparansulfat-2-Sulfotransferase
wurde auf eine Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule (16 × 50 mm, 10 ml) aufgetragen,
die mit Puffer A equilibriert ist, der 0,15 M NaCl enthält. Die
Säule wurde
fünfmal
in einer Menge des Säulenvolumens
mit Puffer A gewaschen, der 0,15 M NaCl enthält, und dann wurde eine adsorbierte
Fraktion mit einem linearen Konzentrationsgradienten (Gesamtvolumen:
300 ml) eluiert, indem die NaCl-Konzentration
von 0,15 M bis 1,0 M in dem Puffer gesteigert wurde. Die Proteinkonzentration,
die Sulfotransferase-Aktivität
in der Gegenwart von 10 mM DTT (Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität) und die
Sulfotransferase-Aktivität
in der Abwesenheit von DTT (Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität) wurden
für jede
der eluierten Fraktionen gemessen. Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
-
Unter
den, wie oben beschrieben, erhaltenen Fraktionen, die die Herapransulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität enthalten,
wurden Fraktionen gesammelt, die durch eine dicke Linie in 2 gezeigt
sind. Die Konzentration von Triton X-100 wurde auf 1% erhöht, gefolgt
von einer Dialyse gegen Puffer A, der 1 M NaCl enthält, und
gefolgt von einer Dialyse gegen Puffer A, der 0,05 M NaCl enthält.
-
(iv) Vierter Schritt Zweite
3'-5'-ADP-Agarose-Chromatographie
-
Die
in dem dritten Schritt erhaltene Fraktion wurde auf eine 3'-5'-ADP-Agarose-Säule in der
gleichen Weise, wie es bei der ersten Chromatographie gemacht wurde,
aufgetragen, um eine Chromatographie durchzuführen. Als ein Ergebnis der
Chromatographie stieg der Reinigungsgrad 11-fach an und die spezifische
Aktivität
war in dieser Phase 26.700-fach. Die NaCl-Konzentration einer mit
Puffer A eluierten Fraktion, der 0,2 mM 3'-5'-ADP
und 0,05 M NaCl enthält,
wurde auf 0,15 M eingestellt, und dann wurde die Fraktion auf 8
ml unter Verwendung von Polyethylen-Glycol, in der gleichen Weise wie oben
beschrieben, konzentriert. Das Konzentrat wurde gegen Puffer A dialysiert,
der 0,1 M NaCl enthält,
und wurde danach auf eine kleine Heparin-Sepharose-Säule (Bed-Volumen:
0,6 ml) aufgetragen. Die Säule
wurde mit Puffer B gewaschen (identisch mit Puffer A, außer dass
nur die Konzentration von Triton X-100 auf 0,02% verändert wurde),
der 0,1 M NaCl enthält, gefolgt
von einer Elution mit Puffer B, der 1 M NaCl (2,5 ml) enthält. Diese
eluierte Lösung
wurde auf 0,5 ml konzentriert und das Konzentrat wurde für den nächsten Reinigungsschritt
verwendet.
-
(v) Fünfter Schritt Superose-12-Gel-Chromatographie
-
Die
in dem vierten Schritt erhaltene Fraktion wurde auf eine Superose-12-Säule aufgetragen,
die mit Puffer A equilibriert ist, der 2 M NaCl enthält. Eine
Chromatographie wurde bei einer Flussrate von 0,25 ml/Minute durchgeführt, um
in jede Fraktion von 0,25 ml zu fraktionieren. Jede der eluierten
Fraktionen wurde auf die Sulfotransferase-Aktivität in der
Gegenwart von 10 mM DTT (Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Aktivität) und die
Sulfotransferase-Aktivität
in der Abwesenheit von DTT (Heparansulfat-O-Sulfotransferase-Aktivität) gemessen.
Eine Hauptaktivität
der Sulfotransferase wurde in der Umgebung von einem Molekulargewicht
von 130.000 eluiert (Peak auf einer Seite eines hohen Molekulargewichts
in 3 (Peak I)). Auf der anderen Seite wurde eine
Nebenaktivität,
die durch DTT inhibiert wurde, in der Umgebung eines Molekulargewichts
von 42.000 (Peak auf einer Seite eines niedrigen Molekulargewichts
(Peak II)) eluiert. Eine Heparansulfat-2-Sulfotransferase wird nicht
durch DTT inhibiert, aber eine Heparansulfat-6-Sulfotransferase
wird durch DTT inhibiert. Entsprechend scheint der Peak in der Umgebung
des Molekulargewichts von 42.000 eine Heparansulfat-6-Sulfotransferase
zu sein. Zusätzlich
ist dieses Molekulargewicht gut übereinstimmend
mit einem Molekulargewicht einer Heparansulfat-6-Sulfotransferase,
die in einem vorher berichteten Dokument durch die vorliegenden
Erfinder beschrieben ist. Des Weiteren enthielt ein Heparitinase-Verdau
eines 35S-markierten CDSNS-Heparins unter
Verwendung der Fraktion von Peak II ΔDi-(N, 6) diS als eine Hauptkomponente.
Fraktionen, die eine Sulfotransferase-Aktivität enthalten, die nicht durch
DTT inhibiert wird (übereinstimmend
zu dem Abschnitt, der als eine dicke Linie in 3 dargestellt
ist), wurden vereinigt, gegen Puffer A dialysiert, der 0,15 M NaCl
enthält,
und bei –20°C gelagert.
-
Wie
oben beschrieben, wurde die Heparansulfat-2-Sulfotransferase gegenüber dem
Rohextrakt um etwa 51.700-fach durch den Reinigungsprozess von fünf Schritten
gereinigt, und es gab, wie unten beschrieben (4),
zwei annähernd
homogene Banden in einer SDS-PAGE. Der Reinigungsgrad in jedem der
Schritte ist in Tabelle 2 gezeigt.
-
-
(3) Analyse eines gereinigten
Enzyms durch eine SDS-PAGE
-
Das
gereinigte Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Enzym und Proben aus
jedem der Reinigungsschritte, welche, wie oben beschrieben, erhalten
werden, wurden einer SDS-PAGE unter Verwendung eines 10%-igen Gels
gemäß einem
Verfahren von Laemmli (Laemmli, U. K. (1970) Nature, 227, 680–685) unterzogen.
Proteinbanden wurden durch eine Silberfärbung detektiert. Ein Ergebnis
einer SDS-PAGE des gereinigten Enzyms ist in 4 gezeigt.
Ein Ergebnis einer SDS-PAGE der Proben aus jedem der Reinigungsschritt ist
in 5 gezeigt. Nah beieinander liegende breite Banden
von etwa 44 kDa und etwa 47 kDa wurden vornehmlich in der Fraktion
gefunden, die durch eine Superose-12-Gel-Chromatographie erhalten
wird (4). Beurteilend aus dem Elutionsmuster der Enzymaktivität, scheinen
die zwei äußerst nah
beieinander liegenden Banden, die die Molekulargewichte von etwa
44 kDa und etwa 47 kDa aufweisen, mit der Heparansulfat-2-Sulfotransferase übereinzustimmen.
-
Als
nächstes
wurde es untersucht, ob eine oder keine Zuckerkette in dem Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Protein
vorhanden war. Das Enzymprotein wurde durch Zugabe von TCA (Trichloressigsäure) zu
einer Heparansulfat-2-Sulfotransferase-Lösung präzipitiert, die 0,15 μg des Proteins
enthält,
so dass die Endkonzentration 10% wurde. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation
gewonnen. Das Präzipitat
wurde mit Aceton gewaschen und getrocknet und dann bei einer Temperatur
von 37°C
für 16
Stunden in einer unten beschriebenen Reaktionslösung belassen.
-
Die
Reaktionslösung
enthielt 0,05 M Tris-HCl, pH 7,8, das 0,5% Sodium-Dodecyl-Sulfat (SDS) (10 μl) enthält, 7,5%
(w/v) Nonidet P-40 (5 μl),
0,25 M EDTA (1,2 μl),
Phenylmethylsulfonylfluorid (0,3 μl)
und 0,5 Unit einer N-Glycanase (rekombinante N-Glycanase: hergestellt von Genzyme).
-
Als
ein Analyseergebnis der oben beschriebenen Reaktionslösung mittels
SDS-PAGE verschwanden die
nah beieinander liegenden Proteinbanden von 44 kDa und 47 kDa, und
Proteinbanden von 34 kDa und 38 kDa erschienen (6).
Gemäß diesem
Ergebnis wird es vorgeschlagen, dass die Proteine beider Banden Glycoproteine
sind, die nicht weniger als 19 Gewichtsprozent Zucker enthalten.
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(4) Substratspezifität und Wirkung
einer Heparansulfat-2-Sulfotransferase
-
Um
die Substratspezifität
der Heparansulfat-2-Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung
zu untersuchen, wurde die Aktivität, um eine 35S-Sulfatgruppe
von [35S]-PAPS zu übertragen, unter Verwendung
des gereinigten Enzyms und unter Verwendung verschiedener Substrate
(25 nmol) als Akzeptoren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle
3 gezeigt. Umklammerte Zahlen in der Tabelle zeigen die Aktivität an, um
eine Sulfatgruppe in Bezug auf jeden Akzeptor zu übertragen,
wenn die Aktivität,
um eine Sulfatgruppe unter Verwendung von CDSNS-Heparin als der
Akzeptor zu übertragen,
als 100 betrachtet wird.
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Die
Heparansulfat-2-Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung übertrug
eine Sulfatgruppe zu CDSNS-Heparin und Heparansulfat, welche von
einem EHS-Turmor stammen, und übertrug
eher schwach eine Sulfatgruppe zu Heparansulfat, das aus einer Schweine-Aorta
und einer Rinder-Leber stammt. Jedoch wurde im Hinblick auf Chondroitin,
Chondroitinsulfat A und C, Dermatansulfat und Keratansulfat keine Übertragung
beobachtet.
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Um
die Position einer Sulfatgruppe zu untersuchen, die durch die Heparansulfat-2-Sulfotransferase der
vorliegenden Erfindung unter Verwendung von CDSNS-Heparin und Heparansulfat
aus einem EHS-Tumor als Akzeptoren und unter Verwendung von [35S]-PAPS als ein Sulfatgruppendonor übertragen
wurde, wurden die Transfer-Reaktions-Produkte
bei 37°C
für zwei
Stunden mit 50 μl
einer gemischten Lösung
verdaut, die etwa 25 nmol eines Reaktionsprodukts, 50 mM Tris-HCl
(pH 7,2), 1 mM CaCl2, 2 μg Rinderserum-Albumin (BSA),
10 mU Heparitinase I, 1 mU Heparitinase II und 10 mU Heparitinase
III enthält.
-
Der
Verdau wurde zusammen mit ungesättigten
Standarddisacchariden gemäß einem
bekannten Verfahren (Habuchi, H. et al., (1992) Biochem. J., 285,
805–813)
unter Verwendung einer HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie,
Säule:
Siliziumsäule
mit gebundenem Polyamin (PAMN-Säule))
getrennt, in Aliquots von jeweils 0,6 ml fraktioniert und mit 3
ml eines Flüssigkeits-Szintillators
(Ready Safe Scintillator, hergestellt von Beckman) gemischt, um
eine Radioaktivität
unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers zu
messen. Eine Heparitinase ist ein Enzym, das eine α-N-Acetyl/-Sulfo-D-Glucosaminyl
(1 → 4)-Uronsäure-Binding
eines Heparansulfats in der Art und Weise einer Eliminations-Reaktion
schneidet, um Oligosaccharide herzustellen, die eine Δ4-Hexuronsäure an deren
nicht reduzierendem Ende aufweisen.
-
Die
Ergebnisse sind in 7 gezeigt (A: CDSNS-Heparin
als ein Substrat, B: Heparansulfat aus einem EHS-Tumor als ein Substrat).
In 7 zeigen die bezifferten Pfeile 1 bis 5 Positionen
einer Elution von unten gezeigten ungesättigten Disacchariden an (siehe
Formel 1 und Tabelle 4). „ΔDiHS" zeigt ungesättigte Disaccharide
an, die durch einen Verdau von Heparin und Heparansulfat durch eine
Heparitinase hergestellt sind. „6, N" zeigt eine Position einer Sulfatierung
eines Glucosamins an. „U" zeigt an, dass die
C-2-Position einer Uronsäure
sulfatiert ist.
- 1: ΔDiHS-6S
- 2: ΔDiHS-NS
- 3: ΔDiHS-di
(6, N)S
- 4: ΔDiHS-di
(U, N)S
- 5: ΔDiHS-tri
(U, 6, N)S
-
-
-
Als
ein Ergebnis fiel fast die gesamte Radioaktivität mit der Elutionsposition
eines Standard-ΔDiHS-di (U,
N)S zusammen, wenn CDSNS-Heparin als ein Akzeptor verwendet wurde
(7A). Wenn auf der anderen Seite Heparansulfat
von einem EHS-Tumor als ein Akzeptor verwendet wurde, fiel fast
die gesamte Radioaktivität
in ähnlicher
Weise mit der Elutionsposition eines Standard-ΔDiHS-di (U, N)S zusammen (7B).
-
Des
Weiteren wurden das CDSNS-Heparin und das Heparansulfat von einem
EHS-Tumor, welche
wie oben beschrieben 35S-markiert waren,
mit Nitrit bei pH 1,5 abgebaut und dann mit NaBH4 reduziert,
um Disaccharid-Fraktionen zu erhalten, und die Fraktionen wurden
entsprechend durch eine HPLC unter Verwendung einer Partisil-10-SAX-Säule analysiert.
Ein Analyseergebnis der Disaccharid-Fraktion, die vom CDSNS-Heparin
stammt, ist in 8A gezeigt. Ein Analyseergebnis
der Disaccharid-Fraktion,
die aus einem Heparansulfat aus einem EHS-Tumor stammt, ist in 8B gezeigt. Wie unten beschrieben, zeigen
in 8A und 8B bezifferte
Pfeile 1 bis 5 Elutionspositionen von Disacchariden an. „AMan" zeigt eine 2,5-Anhydro-D-Mannose
an und „R" zeigt ein durch
eine Reduzierung mit NaBH4 erhaltenes Alditol
an. „(2SO4)" zeigt
an, dass eine C-2-Position sulfatiert ist. „(6SO4)" zeigt an, dass eine
C-6-Position sulfatiert
ist.
- 1: HexA-AManR
- 2: GlcA (2SO4)-AManR
- 3: GlcA-AManR (6SO4)
- 4: IdoA-AManR (6SO4)
- 5: IdoA (2SO4)-AManR
-
Als
ein Ergebnis fiel fast die gesamte Radioaktivität mit der Elutionsposition
von IdoA (2SO4),-AManR zusammen,
unabhängig
davon, welcher Akzeptor verwendet wird.
-
Entsprechend
den oben beschriebenen Ergebnissen ist es gezeigt worden, dass die
Heparansulfat-2-Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung eine
Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an die C-2-Position eines Iduronsäurerestes überträgt, der
an einen N-Sulfoglucosaminrest anschließt. Eine Sulfatierung eines Glucosaminrests
durch das Enzym der vorliegenden Erfindung wurde nicht beobachtet.
-
(5) Andere enzymatische
Eigenschaften einer Heparansulfat-2-Sulfotransferase
-
(i) pH-Optimum
-
Ein
pH-Optimum des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde gemessen.
Als Puffer wurden 50 mM Tris-HCl, 50 mM Imidazol-HCl, 50 mM MES-Puffer
(hergestellt von Nacalai Tesque) und 50 mM Kaliumacetat-Puffer verwendet,
um die Enzymaktivität
bei verschiedenen pH's
zu messen. Relative Aktivitäten
mit Bezug auf eine Enzymaktivität
im Imidazol-HCl-Puffer (pH 6,8) sind jeweils in 9 gezeigt.
Als ein Ergebnis zeigte das Enzym der vorliegenden Erfindung hohe
Enzymaktivitäten
bei etwa pH 5 bis 6,5. Eine Spitzenaktivität wurde bei etwa pH 5,5 erhalten.
-
(ii) Ionenstärke-Optipmum
-
Um
den Einfluss der Ionenstärke
auf die Aktivität
des Enzyms der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, wurde NaCl
zu der Enzym-Reaktionslösung
in verschiedenen Konzentrationen hinzugegeben, um die Enzymaktivität zu untersuchen.
Ein Ergebnis ist in 10 gezeigt. Entsprechend dem
Ergebnis zeigt das Enzym der vorliegenden Erfindung hohe Enzymaktivitäten in der
Umgebung von 50 bis 200 mM NaCl. Eine Spitzenaktivität wurde
bei etwa 100 mM NaCl beobachtet. Diese Eigenschaft ist unterschiedlich
zu der der N-Sulfotransferase, dessen Aktivität in einer NaCl-konzentrationsabhängigen Weise
inhibiert wird.
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(iii) Inhibierung und
Aktivierung des Enzyms der vorliegenden Erfindung
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Um
den Einfluss von DTT auf die Aktivität des Enzyms der vorliegenden
Erfindung zu untersuchen, wurde DTT in verschiedenen Konzentrationen
zu einer Reaktionslösung
hinzugegeben, um die Enzymaktivität zu messen (11).
DTT inhibierte die Aktivität
bis zu 10 mM kaum. Diese Eigenschaft unterscheidet sich extrem von
der einer Heparansulfat-6-Sulfotransferase.
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Der
Einfluss von Protamin auf die Enzymaktivität des Enzyms der vorliegenden
Erfindung wurde untersucht. Ein Ergebnis ist in 12 gezeigt.
Die Aktivität
der Heparansulfat-2-Sulfotransferase stieg durch Protamin in der
gleichen Weise wie die der Chondroitin-4-Sulfotransferase, der Chondroitin-6-Sulfotransferase und
der Heparansulfat-6-Sulfotransferase bemerkenswert an.
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Als
ein Untersuchungsergebnis über
den Einfluss von 3'-5'-ADP auf die Enzymaktivität des Enzyms der
vorliegenden Erfindung wurde eine starke inhibitorische Wirkung
in der gleichen Weise wie bei anderen Sulfotransferasen gefunden.
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(iv) Messung einer Michaelis-Konstante
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Die
Michaelis-Konstante (Km) wurde für
das Enzym der vorliegenden Erfindung bestimmt, wenn ein CDSNS-Heparin
als ein Sulfatgruppenakzeptor und PAPS als ein Donor verwendet wurde.
PAPS (0,125 bis 5 μm)
wurde zu 50 μl
einer Reaktionslösung
hinzugegeben, die 0,19 Unit des Enzyms der vorliegenden Erfindung
und 25 nmol CDSNS-Heparin enthält,
wie es in einer Hexosamin-Menge umgesetzt ist, und bei 37°C für 20 Minuten
reagiert, um die Initialgeschwindigkeiten der Reaktion zu messen.
Ein Lineweaver-Burk-Plot wurde hergestellt und die Michaelis-Konstante
wurde berechnet. Als ein Ergebnis war Km für das Enzym der vorliegenden
Erfindung für
PAPS 2,0 × 10–7 M.
