DE69722901T2

DE69722901T2 - Keratansulfat 6-Sulfotransferase und dafür kodierende DNS

Info

Publication number: DE69722901T2
Application number: DE69722901T
Authority: DE
Inventors: Masakazu Fukuta; Osami Habuchi
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1997-11-27
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2017-11-28
Also published as: JP3766487B2; EP0845533A2; JPH10155488A; EP0845533B1; US6051406A; EP0845533A3; DE69722901D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid der Glykosaminoglykan-Sulfotransferase (Glykosaminoglykan-Sulfatgruppen-Transferase) und eine dafür kodierende DNS. Noch spezieller betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid der vom Menschen stammenden 6-Sulfotransferase, welche Keratansulfat sulfoniert, aber im Wesentlichen kein Chondroitin, Chondroitin-Sulfat A, Chondroitin-Sulfat C, Dermatansulfat und CDSNS-Heparin sulfatiert, und eine dafür kodierenden DNS. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids und ein Verfahren zur Verwendung des Polypeptids der 6-Sulfotransferase.
Keratansulfat ist eine Art des Glykosaminoglykans, welches durch Galaktosereste (GAL) und N-Acetylglukosaminreste (GlcNAc) aufgebaut ist, einem Teil, welcher Substituenten der Sulfatgruppen an der C-6-Position aufweist, und seine Wiederholungsstruktur durch 3GALβ1 → 4GLcNAcβ1 → dargestellt ist.
Es wird erwartet, dass falls ein Gen für die Sulfotransferase für das Glykosaminoglykan geklont werden könnte, es eine Information über die Substratspezifität für seinen Rezeptor und nützliche Lösungswege für die strukturelle und funktionelle Untersuchung des Glykosaminoglykans bereitstellen würde. Verschiedene Glykosaminoglykan-Sulfotransferasen scheinen an der Synthese des Glykosaminoglykans involviert zu sein. Jedoch ist es schwierig, eine cDNS der Sulfotransferase zu klonieren.
Die vorliegenden Erfinder haben offensichtlich schon eine homogene Chondroitin-6-Sulfotransferase (sie kann im Weiteren als „C6ST" bezeichnet werden) aus einem serumfreien Hühner Chondrozytenkulturüberstand (Habuchi, O., Matsui, Y., Kotoya, Y., Aoyama, Y., Asuda, Y., und Noda, M. (1993) J. Biol. Chem. 268, 21968–21974) gereinigt, welche eine Sulfatgruppe vom 3'-Phosphoadenosin 5'-Phosphosulfat zu der Hydroxylgruppe an die C-6-Position des N-Acetylgalactosaminrestes des Glykosaminoglykans wie z. B. Chondroitin überträgt. Darüber hinaus haben sie einen Oli gonukleotid-„Primer" von deren unvollständigen Aminosäuresequenz präpariert, eine Hühner-cDNS kloniert und demonstriert, dass die von der DNS resultierenden Polypeptide die C6St-Aktivität zeigten. Des Weiteren fanden sie, dass das Enzym eine Aktivität für die Übertragung der Sulfatgruppen zu der Hydroxylgruppe an C-6-Positionen von Galaktosereste des Keratinsulfats (Fukuta, M., Uchimura., K., Nakashima, K., Kato, M., Kimata, K., Shinomura, T., und Habuchi, O. (1995) J. Biol. Chem. 270, 18575–18580) zeigen konnte.
Die EP 0 745 668 beschreibt wie Chondroitin-6-Sulfotransferase (C6ST) zur Übertragung einer geeigneten Gruppe zu der Hydroxylgruppe an die C-6-Position des N-Acetylgalactosaminrestes oder Galaktoserestes des Glykosaminoglykans aus einer Kulturlösung von Hühnerembryochondrozyten gereinigt wurde, um teilweise deren Aminosäuresequenzen zu bestimmen. Die unvollständige cDNS der C6ST wurde von der Poly(A)⁺ RNS, die von den Chondrozyten präpariert wurde, mittels PCR unter Verwendung der auf der Basis der bestimmten Sequenzen präparierten Oligonukleotid-Primer amplifiziert. Die gesamte Länge der cDNS der C6ST wurde aus einer cDNS-Bibliothek mittels Hybridisierung unter Verwendung eines erhaltenen cDNS Fragments als eine Probe erhalten.
Jedoch wurde über keine DNS berichtet, welche für ein Polypeptid der Sulfotransferase kodiert, welche nur Keratansulfat unter den Chondroitinen und Keratansulfat, d. h. sulfotransferasespezifisch für Keratansulfat, sulfatiert. Im Besonderen wurde über solch eine vom Menschen stammende und infolgedessen erwartungsgemäß für Pharmazeutika nützliche Sulfotransferase niemals berichtet.
Ein Enzym, welches spezifisch eine Sulfatgruppe zum Keratansulfat überträgt, ist wichtig für funktionelle Studien des Keratansulfats. Im Besonderen ist ein solches vom Menschen stammendes Enzym sehr wichtig für die Bereitstellung von Keratansulfaten, um Pharmazeutika zu entwerfen, welche eine physiologische Aktivität bevorzugt für Menschen zeigen. Wenn des Weiteren eine DNS, die für ein Polypeptid der vom Menschen stammenden Keratansulfat-6-Sulfotransferase kodiert, erhaltbar ist, kann erwartet werden, es für therapeutische Arzneimittel zu verwenden, beinhaltend solche für die Gentherapie oder diagnostische Arzneimittel für menschliche Erkrankungen, die zum Beispiel durch niedrige Sulfation der Galaktosereste des Kera tansulfats an ihren C-6-Positionen („niedrige Sulfation" bedeutet hierbei, dass die Sulfationsrate niedrig ist) verursacht sind.
Von dem Enzym, welches spezifisch eine Sulfatgruppe zum Keratansulfat überträgt, wird erwartet für die Synthese von GlyCAM-1 (hoch glykosiliertes Zelladhäsionsmolekül-1, Glykosilierungs abhängiges Zelladhäsionsmolekül-1, erwartungsmäßig als ein antiinflammatorisches Agens verwendbar) verwendbar zu sein, welches als einer der Liganden für L-Selektin, welches im „homing" der Lymphozyten und dem Rollen der Leukozyten involviert ist, welches während einer frühen Phase der Inflammation stattfindet, und als sulfatiertes Lactosamin-Oligosaccharide betrachtet werden kann. Es wird auch erwartet, dass die für dieses Enzym kodierende DNS für die Herstellung des Enzyms in einem großen Maßstab und in vivo-Synthesen des GlyCAM-1 durch den Gentransfer verwendbar ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid und ein unvollständiges Polypeptid der Glykosaminoglykan-Sulfotransferase, welche spezifisch für das Keratansulfat ist, und eine DNS, die für die Polypeptide kodiert, bereitzustellen. Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren für die Herstellung der Polypeptide und ein Verfahren für die Verwendung der Glykosaminoglykan-Sulfotransferase bereitzustellen.
Die vorliegenden Erfinder haben eine cDNS kloniert, welche für die Hühner-Chondroitin-6-Sulfotransferase kodiert, und unter Verwendung eines von der Hühner-cDNS- herleitbaren Fragments wurde erfolgreich eine Glykosaminoglykan-6-Sulfotransferase kodierende cDNS kloniert, welche Galaktosereste des Keratansulfats sulfatiert, aber im Wesentlichen keine Chondroitine (im Weiteren als „KSGal6ST" bezeichnet) aus der menschlichen cDNS-Bibliothek sulfatiert. Daher stellt die vorliegenden Erfindung ein Polypeptid der KSGal6ST oder einen Teil davon (im Weiteren allgemein als „Polypeptid der vorliegenden Erfindung" bezeichnet) und eine für mindestens einen Teil der menschlichen KSGal6ST kodierende DNS (im Weiteren als „DNS der vorliegenden Erfindung" bezeichnet) bereit.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein Polypeptid der Keratansulfat-6-Sulfotransferase sein, welches die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften zeigt:

➀ Wirkung: Eine Sulfatgruppe wird von einem Sulfatgruppendonor zu der Hydroxylgruppe an die C-6-Position des Galaktoserestes des Keratansulfats übertragen;
– es Substratspezifität: Eine Sulfatgruppe wird im Wesentlichen nicht zu Chondroitin, Chondroitin-Sulfat A, Chondroitin-Sulfat C, Dermatansulfat und CDSNS-Heparin übertragen;
– pH-Optimum: 6,2 bis 6,5
– Aktivierung: Eine Aktivität ist durch Mn²⁺ oder Ca²⁺ erhöht;
– Km-Wert für 3'-Phosphoadenosin 5'-Phosphosulfat: etwa 2 × 10^–7 M.

Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein Polypeptid der 6-Sulfotransferase sein, welches selektiv C-6-Positionen von Galaktosereste des Keratansulfats sulfatiert und mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz umfasst, welche in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, welche eine Deletion, eine Substitution oder eine Addition von einer oder mehreren Aminosäuren beinhalten kann, welche im Wesentlichen die 6-Sulfotransferase-Aktivität zur Sulfatierung des Keratansulfats nicht beeinflusst. Das Polypeptid ist bevorzugt ein Polypeptid der 6-Sulfotransferase, welche selektiv C-6-Positionen von Galaktosereste des Keratansulfats sulfatiert und mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz umfasst, welche in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist. Noch bevorzugter ist es ein Polypeptid, das mindestens einen Teil einer Aminosäure-sequenz umfasst, welche durch die Aminosäuren 1-411 der SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch ein Polypeptid sein, welches einen Teil der oben genannten Polypeptide enthält.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch ein Polypeptid sein, welches mit einem anderen Polypeptid gebunden ist.
Die DNS der vorliegenden Erfindung ist eine DNS, die mindestens für einen Teil der obigen Polypeptide kodiert. Vorzugsweise weist sie eine Nukleotidsequenz auf, welche für die Aminosäuresequenz, welche durch die Aminosäuren 1 bis 411 der SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, kodiert, und noch bevorzugter umfasst sie einen Teil oder eine gesamte Nukleotidsequenz, die durch die Nukleotide 1 bis 1233 der SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung bereit, welches die Kultivierung von Zellen in einem geeigneten Kulturmedium umfasst, welche die DNS der vorliegenden Erfindung beherbergen, so dass ein durch die DNS kodiertes Polypeptid in der Kultur hergestellt. und akkumuliert wird, und das Sammeln des Polypeptids aus der Kultur, und ein Verfahren zur Herstellung eines sulfatierten Polysaccharids, welches das Aussetzen des Keratansulfats mit dem obigen Polypeptid der 6-Sulotransferase umfasst.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind dort eine DNS, die für die menschliche Keratansulfat-6-Sulfotransferase (KSGal6ST) kodiert, welche eine Sulfatgruppe zu der Hydroxylgruppe an die C-6-Position des Galaktoserestes des Keratansulfats überträgt, und ein durch ein DNS-Fragment exprimiertes Polypeptid, welches von der DNS ableitbar ist, bereitgestellt.
Da durch die vorliegenden Erfindung eine für die menschliche KSGal6ST kodierende DNS bereitgestellt ist, wird es erwartet, dass die menschliche KSGal6ST in einem solch großen Maßstab hergestellt werden könnte, dass die industrielle Verwendung der menschlichen KSGal6ST realisiert werden könnte. Auch die Verwendungen der DNS der menschlichen KSGal6ST und des KSGal6ST-Enzymproteins für Pharmazeutika werden erwartet.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Ergebnisse der DEAE-Sephacel-Säulen-Chromatographie. A und C stellen die Elutionsprofile der Extrakte der mit dem pCXNKSST eingeführten COS-7-Zellen, und B und D die für die Extrakte der Kontroll-COS-7-Zellen dar. A und B stellen die KSST-Aktivität dar und C und D stellen die CST-Aktivität dar.
2 zeigt das Ergebnis der HPLC (Partisil 10-SAX) Säulen-Chromatographie der Produkte, die durch den Abbau mit der Keratanase II erhalten wird. A stellt das Elutionsprofil der Abbauprodukte des Keratansulfats dar, und B stellt die Abbauprodukte des unvollständig desulfatierten Keratansulfats dar.
3 zeigt das Ergebnis der HPLC-Säulen-Chromatogrphie der Hydrolysate, die mit Keratanase II erhalten werden. A ist das Elutionsprofil des ³H-makierten GAL (6SO₄) β1-4GLcNAc_R (Peak 1), des GALβ1-4GLcNAc_R(6SO₄) (Peak 2), des GLcNAc_R (6SO₄) (Peak 3) und des Gal_R(6SO₄) (Peak 4). B stellt das Elutionsprofil des Peaks 1 der 2A dar, C stellt den Peak 2 der 2B dar und D stellt entsprechend den Peak 4 der 2B dar: ∘ stellt die ³H-Radioaktivität dar, und • stellt die ³⁵S-Radioaktivität dar.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird im Weiteren im Einzelnen bezüglich des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, des Verfahrens zur Herstellung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, der DNS der vorliegenden Erfindung und des Verfahrens zur Herstellung des sulfatierten Polysaccharids in dieser Reihenfolge beschrieben werden.
<1> Polypeptid der vorliegenden Erfindung
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein Polypeptid der Keratansulfat-6-Sulfotransferase sein, welches die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:

➀ Wirkung: Eine Sulfatgruppe wird von einem Sulfatgruppendonor zu der Hydroxylgruppe an die C-6-Position des Galaktoserestes des Keratansulfats übertragen;
– Substratspezifität: Eine Sulfatgruppe wird im Wesentlichen nicht zu Chondroitin, Chondroitin-Sulfat A, Chondroitin-Sulfat C, Dermatansulfat und CDSNS-Heparin übertragen;
– pH-Optimum: 6,2 bis 6,5
– Aktivierung: Eine Aktivität ist durch Mn²⁺ oder Ca²⁺ erhöht;
– Km-Wert für den Sulfatgruppendonor (3'-Phosphoradenosin 5'-Phosphorsulfat): etwa 2 × 10^–7 M.

Für den oben genannten Substratgruppen-Donor ist 3'-Phosphoradenosin 5'-Phosphorsulfat bevorzugt.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch ein Polypeptid der 6-Sulfotransferase sein, welches selektiv die C-6-Position der Galaktosereste des Keratansulfats sulfatiert und mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz umfasst, welche in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, welche eine Deletion, eine Substitution oder eine Addition von einer oder mehreren Aminosäuren enthalten kann, welche im Wesentlichen die 6-Sulfotransferase-Aktivität zur Sulfatierung des Keratansulfats nicht beeinflussen.
Das heißt, es kann ein Polypeptid der 6-Sulfotransferase sein, welches selektiv die C-6-Position der Galaktosereste des Keratansulfats sulfatiert und mindestens einen Teil der folgenden Aminosäuresequenz (a) oder (b) umfasst:

(a) Die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist,
(b) eine Aminosäuresequenz von (a) die eine Deletion, eine Substitution oder eine Addition von einer oder mehreren Aminosäuren aufweist, welche im Wesentlichen die 6-Sulfotransferase-Aktivität zur Sulfatierung des Keratansulfats nicht beeinflussen.

Solch eine Deletion, eine Substitution oder eine Addition von einer oder mehreren Aminosäuren kann durch Einführen einer Deletion, einer Substitution oder einer Addition von Nukleotiden, welche eine Deletion, eine Substitution oder eine Addition von einer oder mehreren Aminosäuren in einer DNS verursachen können, welche für mindestens einen Teil der Sequenz von SEQ ID NO: 2 kodiert, und der Expression der resultierenden DNS, erhalten werden. Solch ein Einführen einer Deletion, einer Substitution oder einer Addition von Nukleotiden in eine DNS-Sequenz kann durch Synthetisierung einer Sequenz durchführbar sein, welche eine mutierte Sequenz und Restriktionsschnittstellen an den beiden Enden enthält, und durch Ersetzen eines entsprechenden Teils einer nicht mutierten Sequenz mit der synthetisierten Sequenz. Die Deletion, die Substitution oder die Addition können auch durch gezielt eingeführte Mutationen (site-directed mutagenesis) (Kramer, W. und Frits, N. J., Meth, in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154 367 (1987) in eine DNS-Sequenz eingeführt werden. Die Aktivität für die selektive Sulfatierung des Keratansulfats, d. h., die Übertragung einer Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor an die C-6-Position des Galaktoserestes des Keratansulfats kann z. B. mit einem Enzym-Aktivitätsassay-Verfahren, wie im Weiteren beschrieben, gemessen werden, und Fachleute werden leicht eine solche Deletion, Substitution oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren, welche im Wesentlichen die Aktivität nicht beeinflussen, erkennen.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Polypeptid der KSGal6ST, die mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz enthält, welche in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und keine Substitution, Deletion oder Addition der Aminosäuren enthält. Noch bevorzugter ist es ein Polypeptid, das mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz enthält; welche durch die Aminosäuren 1 bis 411 der SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
Es ist vorhersagbar, dass die Aminosäuresequenz zwischen Individuen unterschiedlich sein kann. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung beinhaltet homologe Varianten, die Unterschiede aufweisen.
Der Ausdruck „mindestens einen Teil einer Aminosäuresequenz umfasst" bedeutet ein Minimum einer Aminosäuresequenz enthaltend, welche ausreicht, die Sulfotransferase-Aktivität für die selektive Sulfatierung des Keratansulfats zu zeigen.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch ein Polypeptid sein, welches einen Teil des oben genannten Polypeptids umfasst. Die hierbei verwendete Bezeichnung „Teil" bedeutet einen Teil, der einige Aktivität zeigt oder einige Funktionen aufweist, wie z. B. eine Sulfotransferase-Aktivität und Antigenität. Ein solcher Teil kann leicht durch Fachleute erkannt werden.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung sollte nicht unbedingt nur durch das Polypeptid an sich aufgebaut sein und kann, wenn nötig, in der Form eines gebundenen Polypeptids sein. Zum Beispiel kann ein gebundendes Polypeptid, welches das Peptid der vorliegenden Erfindung und ein anderes für die Expression benötigtes Polypeptid enthält, ein gebundenes Polypeptid, welches das Peptid der vorliegenden Erfindung und eine Gluthation-S-Transferase enthält, ein gebundenes Polypeptid, welches das Peptid der vorliegenden Erfindung und ein biotinyliertes Peptid enthält, und dergleichen beispielhaft erläutert werden, aber es ist nicht auf diese eingeschränkt.
<2> Verfahren zur Herstellung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung
Das oben genannte Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung der DNS der vorliegenden Erfindung, wie im Weiteren beschrieben, erhalten werden. Und zwar kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung durch die Kultivierung von Zellen in einem geeigneten Kulturmedium hergestellt werden, welche die DNS der vorliegenden Erfindung beherbergen, so dass ein durch die DNS kodiertes Polypeptid in der Kultur hergestellt und akkumuliert wird, und das Sammeln des Polypeptids aus der Kultur.
Die eine DNS der vorliegenden Erfindung beherbergenden Zellen können durch Insertion eines Fragments der DNS der vorliegenden Erfindung in einen bekannten Expressionsvektor, um ein rekombinantes Plasmide zu konstruieren, und durch die Transformierung der Zellen mit dem rekombinanten Plasmid erhalten werden. Die Zellen können prokariotische Zellen, wie z. B. E. coli, oder eukaryotische Zellen, wie z. B. Tierzellen, sein.
In diesem Herstellungsverfahren können beliebige konventionell verwendete Wirt-Vektor-Systeme für die Herstellung des Proteins verwendet werden, zum Beispiel eine Kombination aus Säugetierzellen, wie z. B. COS-7 Zellen und einem Vektor für die Säugetierzellexpression, wie z. B. pCXN2 (Niwa, N., Yamamura, K. und Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193–200) oder dergleichen, können bevorzugt angwandt werden. Das Kulturmedium und die Kulturbedingung können angemessen in Abhängigkeit an die verwendeten Wirtszellen ausgewählt werden.
Die DNS der vorliegenden Erfindung kann direkt exprimiert sein oder kann als ein gebundendes Polypeptid mit einem anderen Polypeptid exprimiert sein. Die DNS der vorliegenden Erfindung kann in ihrer gesamten Länge exprimiert sein, oder ihr Teil kann als ein unvollständiges Peptid exprimiert sein.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann durch ein bekanntes Verfahren zur Reinigung von Polypeptiden aus der Kultur gesammelt werden. Die Kultur beinhaltet das Kulturmedium und die Zellen, die in dem Medium enthalten sind.
Eine Antikörperbindung zur KSGal6ST kann unter Verwendung eines Polypeptids der KSGal6ST, eines unvollständigen Polypeptids davon oder einem gebundenen Polypeptid davon mit einem anderen Polypeptid, wie oben hergestellt, hergestellt werden. Die Herstellung von solchen Antikörpern kann auf eine solche Weise ähnlich zu der der konventionellen Herstellung von Antikörpern ausgeführt werden. Monoklonale Antikörper, die an die KSGal6ST binden, können auch auf konventionelle Weise hergestellt werden.
<3> DNS der vorliegenden Erfindung
Die DNS der vorliegenden Erfindung ist eine DNS, die für mindestens einen Teil des obigen Polypeptids der Keratansulfat-6-Sulfotransferase (KSGal6ST) kodiert, und sie ist zum ersten Mal gemäß der vorliegenden Erfindung aus dem Menschen isoliert.
Die Nukleotidsequenz der DNS der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders eingeschränkt, so lange sie für mindestens einen Teil des Polypeptids der KSGal6ST kodiert.
Das Polypeptid der durch die DNS der vorliegenden Erfindung kodierenden menschlichen KSGal6ST kann eine Deletion, eine Substitution oder eine Addition von einer oder mehreren Aminosäuren enthalten, welche im Wesentlichen die Aktivität für die selektive Sulfatierung des Keratansulfats nicht beeinflussen.
Als ein Beispiel für die DNS der vorliegenden Erfindung kann eine die Nukleotidsequenz aufweisende DNS, die für die Aminosäuresequenz kodiert, welche durch die Aminosäuren 1 bis 411 der SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, genannt werden, und eine solche DNS ist bevorzugt. Speziell kann als ein Beispiel für die DNS der vorliegenden Erfindung eine DNS genannt werden, die mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz enthält, die als SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, und solch eine DNS ist besonders bevorzugt. Spezielle Beispiele einer solchen DNS beinhalten eine Nukleotidsequenz aufweisende DNS, welche durch die Nukleotide 1 bis 1233 der SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Es wird von Fachleuten leicht verstanden werden, dass verschiedenartige DNS's Nukleotidsequenzen aufweisen, die abweichend von den oben beispielhaft erläuterten aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, auch die DNS der vorliegenden Erfindung sein können. Jede solcher DNS's fallen in den Bereich der vorliegenden Erfindung.
Während es des Weiteren erwartet ist, dass das chromosomale KSGal6ST-Gen Introns in der kodierenden Region enthält, kann ein solches DNS-Fragment, das durch Introns unterbrochen ist, ein DNS-Fragment der vorliegenden Erfindung sein, solange es für mindestens einen Teil des Polypeptids der KSGal6ST kodiert. Das heißt, dass der hierbei verwendete Ausdruck für „kodiert für" auch bedeuten kann, eine Nukleotidsequenz zu haben, welche einen Prozess während der Transkription durchmachen kann und letztendlich ein gewünschtes Polypeptid bietet.
Der hierbei verwendete Ausdruck für eine „Sequenz, die für mindestens einen Teil des Polypeptids kodiert" bedeutet bevorzugt eine Sequenz, die für eine Sequenz kodiert, welche eine bestimmte Aktivität oder Funktion zeigt, wie z. B. die KSGal6ST-Aktivität und Antigenität, oder eine Sequenz, die eine Nukleotidsequenz enthält, die spezifisch zu der KSGal6ST ist und folglich als Primer oder Probe verwendbar ist.
Jede DNS oder RNS die komplementär zu der DNS der vorliegenden Erfindung ist, fällt auch in den Bereich der vorliegenden Erfindung. Des Weiteren kann die DNS der vorliegenden Erfindung durch einen Einfachstrang aufgebaut sein, der für die KSGal6ST kodiert, oder es kann eine Doppelstrangnukleotidsequenz sein, die aus dem für die KSGal6ST kodierenden DNS-Strang und einem anderen DNS- oder RNS-Strang besteht, der komplementär zu dem DNS-Strang ist.
Die DNS der vorliegenden Erfindung kann die kodierende Region für die KSGal6ST in ihrer gesamten Länge enthalten, oder kann eine Sequenz enthalten, die für einen Teil für das KSGal6ST-Peptid kodiert.
Da die Nukleotidsequenz für die DNS der vorliegenden Erfindung durch die vorliegende Erfindung aufgeklärt worden ist, kann sie durch Synthese basierend auf der aufgeklärten Sequenz erhalten werden, oder sie kann durch Amplifizierung von der menschlichen Chromosomen-DNS oder -mRNS durch die PCR (Polymerase Chain Reaction)-Technik unter Verwendung eines auf der aufgeklärten Sequenz basierenden Oligonukleotid-Primers erhalten werden. Die DNS der vorliegenden Erfindung wurde ursprünglich durch einen cDNS-Klonierungsprozess erhalten, welcher die Schritte in den nachfolgend erklärten Beispielen umfasst.
(1) Klonierung der cDNS, die für ein Polypeptid der Hühner-Chondroitin-6-Sulfotransferase (C6ST) kodiert.

➀ Sequenzierung eines Teils der aus den Hühnerembryochondrozyten gereinigten Aminosäuresequenz der C6ST.
– Herstellung des auf der Aminosäuresequenz basierenden Oligonukleotid-Primer's für die PCR.
– Amplifikation der teilweisen cDNS durch die PCR aus der aus den Hühnerembryochondrozyten stammenden Poly(A)⁺-RNS der C6ST.
– Selektion der gesamten Länge der C6ST-cDNS aus einer cDNS-Bibliothek, die von Hühnerembryochondrozyten stammt.

(2) Klonierung der für ein Polypeptid der menschlichen KSGal6ST kodierenden cDNS.

➀ Herstellung einer Probe zum „Screenen" einer cDNS-Bibliothek, basierend auf der Sequenzierung der cDNS, die in der obigen (1) 4 isoliert ist.
– Screenen eines cDNS-Klons unter Verwendung der Probe, welcher für die menschliche KSGal6ST kodiert.
– Nukleotidsequenz der gescreenten cDNS.

Jedoch ist die Herstellung der DNS der vorliegenden Erfindung nicht auf die oben genannten Verfahren eingeschränkt, und die DNS der vorliegenden Erfindung kann durch die PCR oder alle anderen bekannten Verfahren zur Klonierung von cDNS hergestellt sein.
Das Verfahren zur Gewinnung der DNS der vorliegenden Erfindung wird im Weiteren speziell erklärt werden.
(1) Klonierung der für ein Polypeptid der Hühner-C6ST kodierenden cDNS.
Das Klonieren der für ein Polypeptid der Hühner-C6ST kodierenden cDNS kann nach den bekannten Verfahren ausgeführt werden. (Fukuta, M., Uchimura. K., Nakashima, K., Kato, M., Kimata, K., Shinomura, T., und Habuchi, O. (1995) J. Biol, Chem. 270, 18575–18580).
(2) Klonierung der für ein Polypeptid der menschlichen KSGal6ST kodierenden cDNS.
➀ Herstellung der Hybridisierungsprobe
Eine radioaktive [³²P] dCTP markierte Probe für das Screenen einer cDNS-Bibliothek kann durch das „Random-Primer-Markierungsverfahren" unter Verwendung der wie oben erhaltenen cDNS der Hühner-C6ST erhalten werden. Das heißt, dass eine solche radioaktiv markierte DNS-Probe durch das „Random-Oligonukleotid-Primed-Markierungsverfahren" (Feinberg, A. P., und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6–13) für die obige Hühner-cDNS unter Verwendung des [α-³²P] dCTP (Amersham) und dem DNS-Random-Labeling-Kit (Takara Shuzo) erhalten werden kann.
– Herstellung der menschlichen cDNS-Bibliothek
Eine menschliche cDNS-Bibliothek kann durch die Herstellung von Gesamt-RNS's aus menschlichen Geweben oder Zellen, der Herstellung von Poly(A)⁺ RNS's aus den Gesamt-RNS's und der reversen Transkription unter Verwendung der Poly(A)⁺ RNS's als Templates aufgebaut werden. All diese Prozesse können mit konventionellen auf dem Gebiet der genetischen Technologie verwendeten Verfahren durchgeführt werden.
Jede cDNS wird in einen Klonierungsvektor ligiert. Jedoch ist der Klonierungsvektor nicht besonders eingeschränkt, zum Beispiel wird der λgt11 mit EcoRI verdaut bevorzugt verwendet. Auch kommerziell erhältliche in einen Klonierungsvektor ligierte menschliche cDNS kann verwendet werden. Speziell ist eine aus dem menschlichen fetalen Gehirn von Clontech erhältliche cDNS-Bibliothek unter Verwendung eines Lambda Vektors λgt11 bevorzugt.
– Screenen des für die menschliche KSGal6ST kodierenden cDNS-Klons.
Phagenklone, die eine gesamte Länge der KSGal6ST-cDNS enthalten, können aus der wie oben beschrieben erhaltenen cDNS-Bibliothek durch Hybridisierung unter Verwendung der radioaktiven mit [³²P] dCTP markierten Probe, die wie in dem obigen ➀ hergestellt ist, selektiert werden. Die Hybridisierung kann durch ein konventionelles auf dem Gebiet der Gentechnologie verwendeten Verfahren, wie z. B. die Plaquehybridisierung, durchgeführt werden. Positive Klone können als die Plaques, die mit der Probe hybridisieren, durch Detektion des markierten an der Probe gebundenen Agents selektiert werden.
Die Phagen-DNS wird von den selektierten positiven Klonen hergestellt und mit einem angemessenen Restriktionsenzym verdaut, um ein cDNS-Fragment für die Insertion zu bieten. Dieses Fragment wird in einen geeigneten Expressionvektor eingefügt, um eine rekombinantes Plasmid zu konstruieren. Für den Expressionsvektor geeignete Wirtszellen werden mit dem rekombinanten Plasmid transfiziert, und die cDNS wird in den Wirtszellen exprimiert. Die Chondroitin-6-Sulfotransferase-Aktivität, die Chondroitin-4-Sulfotransferase-Aktivität und die Keratansulfotransferase-Aktivität in den Zellen werden gemessen, und die Zellen, die nur die Keratansulfotransferase (KSST) -Aktivität zeigen, werden ausgewählt.
– Nukleotidsequenz der cDNS
Unter den ausgewählten positiven Klonen werden die in die Zellen eingebrachten Klone verwendet, welche nur die KSST-Aktivität stark anzeigen, um die Phagen-DNS herzustellen, und die KSGal6ST-cDNS kann durch Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms aus der Phagen-DNS ausgeschnitten werden. Die resultierende cDNS kann, wie sie ist, oder nach dem Subklonieren in einem geeigneten Plasmid sequenziert werden.
Eine Nukleotidsequenz des offenen Leserasterrahmens der cDNS, die für die wie oben beschrieben bestimmte menschliche KSGal6ST kodiert, ist als SEQ ID NO: 1 mit der dazugehörigen Aminosäuresequenz als SEQ ID NO: 2 gezeigt. Ein Polypeptid bestehend aus 411 Aminosäureresten mit einem Molekulargewicht von etwa 46.700 ist für einen einfachen offenen Leserahmen vorausberechnet.
Die wie oben beschrieben erhaltene DNS kann eine Substitution, eine Deletion oder eine Addition eines Nukleotids aufweisen, welches eine Substitution, eine Deletion oder eine Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste verursacht, so lange die Aktivität für die Sulfatierung des Keratansulfats der KSGal6ST, die durch diese DNS kodiert ist, im Wesentlichen nicht beeinträchtigt ist. Eine solche Substitution, Deletion oder Addition eines Nukleotids kann durch Synthetisierung einer Sequenz, die Restriktionsschnittstellen an ihren beiden Enden und eine mutierte Sequenz enthält, in die DNS-Sequenz eingeführt werden, und durch Ersetzen einer entsprechenden Sequenz der nicht mutierten DNS-Sequenz mit der synthetisierten Sequenz. Des Weiteren kann eine solche Substitution, Deletion oder Addition durch die gezielt eingeführte Mutation (site-directed mutagenesis) (Kramer, W. und Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)) in eine DNS Sequenz eingeführt sein. Die Aktivität des ausgewählten sulfatierten Keratansulfats, d. h., die Aktivität für die selektive Übertragung einer Sulfatgruppe von einem Sulfatgruppendonor zu der Hydroxylgruppe an die C-6-Position des Galaktoserestes des Keratansulfats kann z. B. durch das hiernach beschriebene Enzym-Aktivitätsassay-Verfahren gemessen werden, und Fachleute werden leicht die Substitution, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste identifizieren können, welche im Wesentlichen die Aktivität nicht beeinflussen.
<4> Verfahren zur Herstellung eines sulfatierten Polysaccharids
Das Verfahren zur Herstellung eines sulfatierten Polysaccharids der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es das Aussetzen des Keratansulfats mit der KSGal6ST umfasst, welches selektiv Keratansulfat sulfatiert.
Wenn das Keratansulfat unter die Aktivität der KSGal6ST in der Gegenwart eines Sulfatgruppendonors gestellt ist, werden Sulfatgruppen zu den Hydroxylgruppen an C-6-Positionen von Galaktoseresten des Keratansulfats übertragen, und auf diese Weise werden sulfatierte Polysaccharide gebildet. Während der pH-Wert für diese Reaktion nicht besonders eingeschränkt ist, so lange die Aktivität für die KSGal6ST erhalten bleibt, ist es bevorzugt, dass die Reaktion unter einer pH-Bedingung um das pH-Optimum der KSGal6ST herum durchgeführt wird. Die Reaktionstemperatur für die Reaktion unter Anwendung der KSGal6ST ist ebenso nicht besonders einge schränkt, so lange die Reaktion der KSGal6ST erhalten bleibt, aber es ist bevorzugt, dass die Reaktion bei einer Temperatur um das Temperaturoptimum der KSGal6ST herum durchgeführt werden sollte. Wenn ein Agens, welches fähig ist die Aktivität der KSGal6ST zu erhöhen, erhältlich ist, kann ein solches Agens zu dem Reaktionssystem hinzugefügt werden. Die Reaktionszeit kann von Fachleuten angemessen in Abhängigkeit von den Mengen des Keratansulfats, des Sulfatgruppendonors und der KSGal6ST und anderen Reaktionsbedingungen ausgewählt werden. Im Allgemeinen wird die Reaktion bevorzugt bei einer Temperatur um 37°C herum und einem pH-Wert von etwa 6 bis 7 durchgeführt. Die Ca²⁺- oder Mn²⁺-Ionen können während der Reaktion koexistent sein.
Als der Sulfatgruppendonor für die Reaktion unter Anwendung der KSGal6ST ist ein aktives Sulfat (3'-Phosphoadenosind 5'-Phosphosulfat, im Weiteren als „PAPS" bezeichnet) bevorzugt.
Wenn die Reaktion in einem kleinen Maßstab durchgeführt wird, kann die KSGal6ST, welche selbst selektiv Keratansulfat sulfatiert, mit Keratansulfat und dem Sulfatgruppendonor verwendet werden. Wenn die Reaktion in einem großen Maßstab durchgeführt wird, kann die Immobilisierung der KSGal6ST an eine angemessene feste Phase (z. B. Kügelchen) verwendet werden, oder das Reaktionssystem kann unter die kontinuierliche Wirkung des Enzyms unter Verwendung eines Reaktors einer Membranart, der mit einer Ultrafiltationsmembran, einer Dialysemembran oder dergleichen bereitgestellt ist, ausgesetzt werden. Ein Bioreaktor, der den Sulfatgruppendonor recycled (synthetisiert) kann gemeinsam verwendet werden.
Um das sulfatierte Polysaccharid aus der Reaktionsmischung zu sammeln, können konventionelle Verfahren für die Trennung und Reinigung von Polysacchariden verwendet werden. Zum Beispiel kann es durch Adsorptionschromatographie, Anionen-Austauscherchromatographie, hydrophobischer Chromatographie, Gelfiltration, Gelpermeationschromatographie, Papierelektrophorese, Papierchromatographie, Fraktionierung mit einem organischen Lösungsmitteln (z. B. Alkohole, Aceton und dergleichen sind bevorzugt) oder einer Kombination davon, durchgeführt werden. Jedoch sind die Trennungs- und Reinigungsverfahren nicht auf diese eingeschränkt.
Das Substrat Keratansulfat ist auch nicht besonders eingeschränkt und jene von unterschiedlichen Ursprüngen mit unterschiedlichen Sulfatierungsgraden und Molekulargewichten können verwendet werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird mit Hinweis auf die folgenden Beispiele spezieller erklärt werden. Jedoch sind diese Beispiele nur einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und deshalb ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele eingeschränkt. Allgemeine in den Beispielen verwendete Techniken werden als erstes beschrieben werden. „%" bedeutet „Gewichtsprozent", sofern nichts anderes angegeben ist.
Enzym-Aktivitätsassay-Verfahren
Die Sulfotransferase-Aktivität wurde wie folgt untersucht.
Die Reaktionsmischungen für die Untersuchung der Chondroitinsulfotransferaseaktivität und der KeratanSulfotransferase-Aktivität hatten die folgende Zusammensetzung: 2.5 μmol Imidazol-Chlorwasserstoffsäure (pH 6.8), 1,25 μg (für das Chondroitinsulfotransferase-Aktivitätsassay) oder 3,75 μg (für das Keratansulfatsulfotransferase-Aktivitätsassay) Protamin-Hydrochlorid, 0,1 μmol Dithiothreitol, 25 nmol (als Glukoronsäure) Chondroitin (für das Chondroitinsulfotransferase-Aktivitätsassay) oder 25 nmol (als Glukosamin) Keratansulfat (für das Keratansulfatsulfotransferase-Aktivitätsassay), 25 pmol [³⁵S] PAPS (3'-Phosphoadenosin 5'-Phosphosulfat, etwa 2,5 × 10⁵ cpm) und ein Enzym in einem Gesamtvolumen von 50 μl (Reaktionsmischung I).
Eine andere Reaktionsmischung für die Untersuchung der Aktivität von unterschiedlichen Arten des Glykosaminoglykans hatte die folgende Zusammensetzung: 2,5 μmol Imidazol-Chlorwasserstoffsäure (pH 6,8), 0,5 μg CaCl₂, 0,1 μmol Dithiothreitol, 25 nmol (als Glukosamin) Keratansulfat, 25 pmol [³⁵S] PAPS und einem Enzym in einem Gesamtvolumen von 50 μl (Reaktionsmischung II).
Die Aktivitäten für unterschiedliche Arten von Glykosaminglykanen als das Substrat wurden unter Verwendung von 25 nmol (als Galaktosamin für Chondroitinsulfat (A und C) und Dermatansulfat, und als Glukosamin für Keratansulfat und CDSNS-Heparin (komplett desulfatiert, N-sulfatiertes Heparin, erhältlich von Seikagaku Corp.)) Glykosaminoglykan anstelle des Keratansulfats untersucht.
In den obigen beiden Fällen wurden die Reaktionsmischungen bei 37°C für 20 Minuten inkubiert, und die Reaktion wurde durch Eintauchen der Reaktionsgefäße für eine Minute in kochendes Wasser gestoppt.
Nach dem Stoppen der Reaktion wurde 0,1 μmol (als Glukoronsäure) Chondroitinsulfat A als ein Träger hinzugegeben und 3 Volumen Ethanol, welches 1,3% Natriumacetat enthält, wurde zu der Reaktionsmischung hinzugegeben, um das ³⁵S-markiertes Polysaccharid zu präzipitieren. Die Reaktionsmischung wurde bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert und die resultierenden Präzipitate wurden in 70 μl Wasser gelöst. Die resultierende Lösung (50 μl) wurde auf eine mit 0,1 NH₄HCO₃ equilibrierte Entsalzungssäule geladen und die eluierten Fraktionen, die das ³⁵S-markierte Polysaccharid enthalten, wurden gesammelt. Ein Scintillationscocktail (1 ml, Clearsol, Nakari Tesque) wurde zu 200 μl zu jeder der erhaltenen Fraktionen hinzugegeben und die Aufnahme des ³⁵S in das Polysaccharid wurde durch Untersuchung der ³⁵S-Radioaktivität bestimmt. Die Aktivität, die die Übertragung von 1 pmol Sulfatgruppe/Minute katalysiert, wurde als 1 Einheit (unit) bestimmt.
Wenn die Chondroitin-6-Sulfotransferase (C6ST) -Aktivität und die Chondroitin 4-Sulfotransferase (C4ST) -Aktivität unverwechselbar untersucht wurden, wurden 400 μl der verbliebenen Lösung mit 800 μl Methanol, welches 1,3% Natriumacetat enthält, gemischt. Die Mischung wurde für 30 Minuten Eis gestellt und dann bei 10.000 × g für zehn Minuten zentrifugiert, um das ³⁵S-Polysaccharid zu präzipitieren. Die Präzipitate wurden in einem Puffer (25 μl) aufgelöst, welcher 0,1 mg/ml BSA, 0,05 M Tris-Essigsäure, pH 7,5 und 10 Milliunits der Chondroitinase ACII (stammend von Arthrobacter aurescens, Seikagaku Corp.) enthält, und durften bei 37°C für zwei Stunden reagieren. Die Reaktionsmischung wurde auf ein Whatman No. 1 Filterpapier zusammen mit jeweils 0,1 μmol 2-Acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluko-4-enopyranosyluronsäure)-6-O-sulfo-D-galaktose (ΔDi-6S) und 2-Acetamido-2-deoxy- 3-O-(β-D-gluko-4-enopyranosyluronsäure)-4-O-sulfo-D-galaktose (ΔDi-4S) (beide von Seikagaku Corp.) „gespottet" und mit 1-Butanol/Essigsäure/1 M Amoniumhydroxyd (2 : 3 : 1 (V/V/V) für 20 Stunden entwickelt.
Positionen der ΔDi-6S und der ΔDi-4S wurden mittels einer ultravioletten Lampe bestimmt, und jede Lage wurde aus dem Filterpapier geschnitten und in einen durch Auflösen von 5 g Diphenyloxasol und 0,25 g Dimethyl-1,4-bis (2-(5-phenyloxasol))-benzen in 1 L Toluene hergestellten Scintillators gegeben, und die Radioaktivität wurde gemessen. Für die Probe, die mit der Chondroitinase ACII abgebaut wurde, war die verbliebene Radioaktivität am Ausgangspunkt des Filterpapiers 1% oder weniger der gespotteten Radioaktivität. Basierend auf die Einführung des ³⁵S in die ΔDi-6S und die ΔDi-4S wurde die Chondroitin-6-Sulfotransferase-Aktivität und die Chondroitin 4-Transferase-Aktivität berechnet.
Ein Herstellungsbeispiel einer DNS der vorliegenden Erfindung wird im Weiteren beschrieben werden.
<1> Klonierung der Keratansulfat-6-Sulfotransferase-cDNS
Eine radioaktive Probe für das cDNS-Bibliothek-Screenen, welche mit [³²P] dCTP markiert wurde, wurde durch das Random-Primer-Markierungsverfahren unter Verwendung der cDNS der von Hühnerchondrozyten stammenden Hühner-C6ST, und durch ein bekanntes Verfahren (J. Biol. Chem. 270 (31), 18575–18580, 1995) erhalten. Das heißt, dass eine Probe durch die Radiomarkierung der obigen Hühner-cDNS in Übereinstimmung mit den Random-Oligonukleotid-Primed-Markierungsverfahren (Feinberg, A. P., und Vorgelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6–13) unter Verwendung von [α-³²P] dCTP (Amersham) und dem „DNS-Random-Labeling-Kit" (Takara Shuzo) erhalten wurde.
(2) Menschliche cDNS-Bibliothek
Um eine cDNS zu erhalten, die eine gesamte Länge der kodierenden Region der menschlichen KSST enthält, wurde eine menschliche aus dem fetalen Gehirn stam mende cDNS-Bibliothek (Clontech), die auf einem Lambda Vektor, λgt11, basiert, verwendet.
Die cDNS's dieser aus dem menschlichen fetalen Gehirn stammenden cDNS-Bibliothek wurden in Phagenpartikeln unter Verwendung eines in vitro Verpackungs-Kit (Gigapack II Verpackungsextrakt, Stratagene) verpackt. Escherichia Coli Y1088 wurde mit den resultierenden Phagenpartikeln infiziert und auf eine Platte geschichtet, so dass die Plaques gebildet wurden. Die resultierende Phagenbibliothek, die wie oben beschrieben erhalten wurde, wurde für das cDNS-Screenen ohne weitere Amplifikation verwendet.
(3) Screenen der KSST-cDNS-Klone
Das Screenen wurde für die Plaques der λgt11 cDNS-Bibliothek, die wie oben beschrieben erhalten wurde, durchgeführt. Die Plaques wurden auf eine kommerziell erhältliche Nylonmembran (Hybond-N⁺-Nylonmembran, Amersham) transferiert und die Phagen-DNS's wurden durch das alkalische Fixierungsverfahren auf der Nylonmembran fixiert. Die fixierten Phagen-DNS's auf der Membran wurden in einer Lösung bei 42°C für 3,5 Stunden prähybridisiert, welche 50% Formamide, 5 × SSPA (Zusammensetzung 1 × SSPE: 10 mM NaH₂PO₄ (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA), 5 × Denhardt's Lösung (Zusammensetzung 1 × Denhardt's Lösung; 0,02% Ficol 400, 0,02% Polyvinylpyrolidon, 0,02% BSA), 0,5% SDS, 0,04 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNS und 0,004 mg/ml einer E. coli DNS enthält. Die Hybridisierung wurde in der gleichen wie der obigen Lösung bei 42°C für 16 Stunden durchgeführt, außer dass sie die ³²P markierte Probe (präpariert in der obigen <1> (1)) enthält. Danach wurde die Membran mit 1 × SSPE, 0,1% SDS und dann mit 0,1 × SSPE, 01,% SDS bei 55°C gewaschen und die Hybridisierung der positiven Klone wurde durch Autoradiografien detektiert. Über 90 positive Klone wurden von 5 × 10⁵ Plaques erhalten.
(4) Herstellung des Expressionsplasmids
Positive λgt11 Klone wurden in der obigen Hybridisierung selektiert und die Phagen-DNS wurde für jeden Klon präpariert und mit EcoRI geschnitten, welches ein cDNS- Insert aus der Vektor-DNS als ein Einfachfragment ausschneiden kann. Dieses cDNS-Fragement wurde in einen Expressionsvektor eingefügt, um ein rekombinantes Plasmid zu konstruieren. Als der Expressionsvektor wurde der Expressionsvektor pCXN2 für Säugetierzellen verwendet (er wurde von Dr. Jun'ichi Miyazaki von der Universität von Tokio konstruiert (Niwa, H., Yamamura, K., und Miyasaki, J. (1991) Gene 108, 193–200) als ein Geschenk erhalten von Dr. Yasuhiro Hashimoto des Tokio Metropolitan Instituts of Medical Science). Der pCXN2 ist ein Vektor, welcher ein Streptomycin resistentes Gen und ein Penicillin resistentes Gen enthält, und ein DNS Framgment exprimieren kann, welches in eine Eco-RI-„site" unter der Kontrolle eines β-Actin-Gen-Promotors eingefügt ist. Jedes cDNS-Fragment, welches von den obigen positiven Klonen erhalten wird, wurde in die Eco-RI-site des pCXN2 ligiert.
E. coli JM109 wurde unter Verwendung dieser Ligationslösung transformiert und auf eine Ampicillin enthaltende LB-Platte plattiert. Das rekombinante Plasmid wurde von den Transformanten gesammelt und durch dreimalige CsCI/Ethidium-Bromid-Dichte Gradienten-Zentrifugation gereinigt.
(5) Transiente Expression der cDNS in COS-7 Zellen und Auswählen der cDNS, die die Sulfotransferasekativität spezifisch für das Keratansulfat exprimiert.
COS-7 Zellen wurden als Wirt für die Expression der cDNS verwendet. Die COS-7 Zellen (von der RIKEN GENE BANK, Tsukuba, Japan; erhalten) wurden in Kulturschalen inokuliert, welche einen Durchmesser von 100 mm bei einer Dichte von 8 × 10⁵ Zellen/Schale aufweisen. Zehn Milliliter eines „Dulbecco's Modified Eagle medium" (DMEM), welches Penicillin (100 units/ml), Streptomycin (50 μg/ml) und 10% fetales Rinderserum (Gibco BRL) enthält, wurde als Kulturmedium pro Kulturschale verwendet, und die Kultivierung wurde bei 37°C in 5 Vol% CO₂ und 95 Vol% Luft durchgeführt.
Wenn die Zelldichte 3 × 10⁶ Zellen/Schale (nach 48 Stunden Kultivierung) erreichte, wurden die COS-7 Zellen transfiziert. Die Transfektion wurde durch das DEAE-Dextran-Verfahren (Aruffo, A. (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 16.13, Greene Publishing Associates und Wiley Interscience, New York) durchgeführt. Fünf Milliliter des vorher erhitzten DMEM's, welches Nu Serum enthält (Ersatzserum mit einer geringen Proteinkonzentration, Collaborative Biomedial Products) wurde mit 0,2 ml PBS (Phosphat gepuffertes Salz), welches 10 mg/ml DEAE-Dextran und 2,5 mM Chloroquine-Lösung enthält, gemischt. Diese Lösung wurde mit 15 μg des rekombinanten Plasmids gemischt, und die Mischung wurde zur der Zellsuspensiion hinzugefügt. Nach der Inkubation der Zellen in einem CO₂-Inkubator für vier Stunden wurde das Kulturmedium mit 5 ml einer PBS-Lösung ersetzt, welche 10% Dimethyl-Sulfoxid (DMSO) enthält. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur für zwei Minuten stehen gelassen, die Dimethyl-Sulfoxid-Lösung wurde durch Ansaugen entfernt und 25 ml DMEM, welches Penicillin (100 units/ml), Streptomycin (50 μg/ml) und 10% fetales Rinderserum enthält, wurde dazugegeben. Die Zellen wurden für 67 Stunden inkubiert und dann nur mit DMEM gewaschen. Die Zellen wurden gesammelt und in 1,5 ml von 0,25 M Sacharose, 10 mM Tris-Hcl (pH 7,2) und 0,5% Triton X-100 Lösung pro Zellen von einer Schale mit einem Dounce Homogenisierungerät homogenisiert. Die resultierenden Homogenate wurden bei 10.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert und die Chondroitin-6-Sulfotransferase (C6ST) -Aktivität, die Chondroitin 4-Sulfotransferase (C4ST) -Aktivität und die Keratan-Sulfotransferase (KSST) -Aktivität in dem Überstand der Fraktion mit dem Aktivitäts-Assay-Verfahren unter Verwendung der Reaktionsmischung I geprüft. Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C für 20 Minuten inkubiert und dann wurde die Reaktion durch Erhitzen des Reaktionsgefäßes bei 100°C für eine Minute gestoppt. Danach wurde das hergestellte ³⁵S-markierte Glykosaminoglykan durch Ethanol-Präzipitation gesammelt, durch die Gelchromatographie unter Verwendung einer schnell entsalzenden Säule (Habuchi et al., J. Biol. Chem., 268(29) 21968–21974, 1993) separiert und dessen Radioaktivität wurde gemessen. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass während die C6ST- und die C4ST-Aktivitäter nicht in den transfizierten Zellen beobachtet wurden, einige von diesen eine starke KSST-Aktivität zeigten.
(6) Nukleotidsequenz der cDNS und des abgeleiteten Polypeptids
Die λgt11 Klone, welche positiv in der Hybrisierung waren und eingebracht in den Zellen nur stark die KSST-Aktivität zeigen, wurden ausgewählt, jede Phagen-DNS wurde davon präpariert und mit EcoRI verdaut, um das cDNS-Insertionsfragment als ein Einfachfragment auszuschneiden. Die resultierenden cDNS-Fragmente wurden in einem „Bluescript-Plasmid" (Stratagene) subkloniert. Die Deletionsklone wurden durch das bekannte Verfahren (Henikoff, S. (1984) Gene 28, 351–359, Yanisch-Perron, C., Viera, J., und Messing, J. (1985) Gene 33, 103–109) unter Verwendung eines DNS-Deletions-Kits (Takara Shuzo) hergestellt. Beide Stränge der resultierenden Deletionsklone wurden unabhängig voneinander durch das Dideoxy-Kettenterminationsverfahren (Sanger, F., Nicklens, S., und Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 74, 5463–5467) unter Verwendung des [α³²P] dCTP's und einer Sequenase (U.S. Biochemical) sequenziert. Die bestimmten DNS-Sequenzen wurden durch ein Gene-Works-Computerprogramm (IntelliGenetics) analysiert. Die aufgeklärte cDNS-Sequenz der KSST und der Polypeptid Sequenz, die von dieser Sequenz abgeleitet ist, sind in SEQ ID NO: 1 gezeigt. Ein einfacher offener Leserahmen deutet ein Polypeptid mit 411 Aminosäureresten, welche durch die cDNS kodiert sind, mit einem Molekurgewicht von etwa 46.700 und einem iso-elektrischen Punkt von etwa 9,5 an, welches von der Aminosäuresequenz abgeleitet ist. Dieses Polypeptid enthält auch 5 Positionen die für die N-verknüpfte Glykosilierung empfänglich sind. Zur Bestimmung, ob dieses Polypeptid eine transmembrane Domäne besitzt, und wenn es eine besaß, wurde zur Lokalisierung der Domäne ein Wasserplot von der abgeleiteten Aminosäuresequenz präpariert. Der Wasserplot wurde mit einem Fenster von 11 Aminosäuren gemäß dem Verfahren nach Kyte (Kyte, J. und Doolittle, R. F., (1982) J. Mol. Biol. 157, 105–132) berechnet. Analysen dieses Plots enthüllen eine ausgeprägte hydrophobische Domäne von 12 Aminosäureresten an dem aminoterminalen Ende, welche als eine transmembrane Domäne betrachtet wurde.
Diese cDNS wurde in ein Plasmid (pCXN2) (ein rekombinantes Plasmid, wobei die Richtung des Promotors mit der der cDNS übereinstimmt wurde als pCXNKSST bezeichnet, und ein rekombinantes Plasmid, wobei die cDNS in einer entgegengesetzten- Richtung eingefügt wurde, wurde als pCXNKSST2 bezeichnet) eingefügt, und COS-7-Zellen wurden mit den erhaltenen Plasmiden durch das oben beschriebene Verfahren transfiziert. Sechsundsiebzig Stunden nach der Transfektion wurden die COS-7-Zellen homogenisiert und zentrifugiert und die Aktivitäten der C6ST, der C4ST und der KSST in dem resultierenden Überstand gemäß dem Aktivitäts-Assay-Verfahren unter Verwendung der Reaktionsmischung I untersucht. Als ein in Tabelle 1 gezeigtes Ergebnis zeigen die den Vektor aufgenommen Zellen, welcher die cDNS der KSST in der richtigen Richtung eingefügt hatte, eine 6 bis 10fach höhere KSST- Aktivität im Vergleich zu der Kontrolle, wobei sie keinen Anstieg der C6ST- und C4ST-Aktivitäten zeigten. Wenn Dermatansulfat, Heparansulfat, oder komplett desulfiertes N-Sulfatiertes Heparin (CDSNS-Heparin) als der Sulfatgruppen Rezeptor verwendet wurde, wurde kein Anstieg der Sulfotransferase-Aktivität beobachtet.
Tabelle 1
Die Werte in Tabelle 1 sind ein Durchschnitt von drei Bestimmungen ± S.A.
<2> Herstellung der Keratansulfat-6-Sulfotransferase
(1) Isolierung der Keratansulfat-6-Sulfotransferase
Ein Rohextrakt der COS-7-Zellen mit eingefügtem pCXNKSST, oder COS-7 Zellen ohne eingefügtem pCXNKSST (Kontrolle) (4,8 mg als Protein) wurde auf eine mit 10 mM Tris-HCl Puffer, pH 7,2, welcher 20% Glycerol, 20 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂ und 10 mM 2-Mercaptoethanol (Puffer A) enthält, equilibrierte DEAE-Sephacel-Säule (Pharmacia, Auftragungsvolumen; 1 ml) aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer A, welcher 0,05 M NaCl enthält, gewaschen und die absorbierte Fraktion mit Puffer A, der 0,05 M NaCl enthält, eluiert, um 1-ml-Fraktionen zu sammeln. Die KSST-Aktivität und die Chondroitinsulfotransferase (CST) -Aktivität aus den eluierten Fraktionen der Extrakte der COS-7-Zellen mit eingeführtem pCXNKSST und der Kontroll-COS-7 Zellen wurden durch das Aktivitäts-Assay-Verfahren unter Verwendung der Reaktionsmischung 1 untersucht. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
In der 1 sind A und C die Elutionsprofile des Extrakts der COS-7-Zellen mit eingeführtem pCXNKSST, und B und D sind diejenigen des Extrakts der Kontroll-COS-7- Zellen. A und B stellen die KSST-Aktivität dar, und C und D stellen die CST-Aktivität dar. Die Pfeile in 1 stellen den Ausgangspunkt der Elution mit dem Puffer A dar, welcher 0,5 M NaCl enthält.
Wenn der Extrakt der COS-7-Zellen mit eingeführtem pCXNKSST verwendet wurde, wurde etwa 20% der KSST-Aktivität in der nicht an der Säule absorbierten Fraktion gefunden, und etwa 80% der KSST-Aktivität wurde in der adsorbierten Fraktion (Fraktion eluiert mit Puffer A, der 0,5 M NaCl enthält) (1, A) gefunden. Die CST-Aktivität wurde nur in der adsorbierten Fraktion (1, C) gefunden. Wenn der Extrakt der COS-7-Zellen ohne das eingefügte pCXNKSST-Plasmid auf die gleiche Säule aufgetragen wurde, wurde keine KSST-Aktivität in der nicht adsorbierten Fraktion (1, B) gefunden.
Um die Fraktion von dem Extrakt der COS-7-Zellen mit eingeführten pCXNKSST, welche die KSST-Aktivität aufweist aber keine CST-Aktivität aufweist, zu erhalten, wurde KSST, welches keine CST-Aktivität aufweist, von der nicht adsorbierten Fraktion wie folgt isoliert.
Das Homogenat der COS-7-Zellen mit dem eingeführten pCXNKSST von 80 Schalen (224 mg als Protein) wurde auf eine DEAE-Sephadex A-50 Säule (Pharmacia, 2,2 × 13 cm), welche mit Puffer A equilibriert ist, aufgetragen. Die Säule wurde mit 500 ml Puffer A gewaschen und die adsorbierte Fraktion mit Puffer A, welcher 0,5 M NaCl enthält, eluiert. Etwa 1/3 der Keratansulfatsulfotransferase-Aktivität wurde in der nicht adsorbierten Fraktion beobachtet, wohingegen etwa 2/3 der KSST-Aktivität und der gesamten CST-Aktivität in der adsorbierten Fraktion (die Fraktion, die mit Puffer A eluiert ist, der 0,5 M NaCl enthält) gefunden wurden.
Die nicht adsorbierte Fraktion wurde vereinigt und auf eine Heparin-Sepharose CL-6B-Säule (Pharmacia, 1,2 × 8,0 cm) aufgetragen, welche mit Puffer A, welcher 0,15 M NaCl enthält, equilibriert ist. Die adsorbierte Fraktion wurde mit Puffer A, der 0,5 M NaCl enthält, eluiert, und das Eluat wurde gegen den Puffer A, der 50 mM NaCl enthält, dialysiert. Das Dialysat wurde als KSST, welches kein CST enthält, verwendet. Die KSST-Aktivität wurde 15 x nach der Heparin-Sepharose CL-6B Säulenreinigung gereinigt. Die Tabelle 2 stellt die Daten der KSST-Enzym-Aktivität des Rohextrakts und des teilweise gereinigten Produkts im Hinblick auf verschiedene Arten von Rezeptoren dar, welche mit dem Aktiväts-Assay-Verfahren unter Verwendung der Reaktionsmischung 2 untersucht wurden. Für die Aktivitätsprüfung wurden 25 nmol (als Galaktosamin für Chrondroitin, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat C und Dermatansulfat und als Glukosamin für Keratansulfat und CDSNS-Heparin) des Glykosaminoglykans anstatt des Keratansulfats, welches in der Standardreaktionsmischung enthalten ist, verwendet.
Die Sulfotransferase-Aktivität zur Übertragung einer Sulfatgruppe zu Chondroitin, CDSNS-Heparin oder dergleichen wurde in dem Rohextrakt gefunden, aber sie war um 2% oder weniger zu der Keratansulfatsulfotransferase-Aktivität nach der Reinigung reduziert.
Tabelle 2
(2) Merkmale der KSST
Die Charakterisierung der KSST, die wie oben beschrieben teilweise gereinigt ist, wurde durchgeführt. Das pH-Optimum dieser KSST war 6,2 bis 6,5. Wenn die KSST-Aktivität unter sich änderndem CaCl₂ gemessen wurde, welches in dem Aktivitäts-Assay-Verfahren unter Verwendung der Reaktionsmischung II für verschiedene Arten von Salzen bis zu einer Endkonzentration von 5 mM verwendet wird, erhöhen Mn²⁺ und Ca²⁺ am stärksten die in der Tabelle 3 gezeigte KSST-Aktivität. Das Konzentrationsoptimum von Ca²⁺ war etwa 10 mM. Das Dithiotreitol bei einer Konzentration bis zu 10 mM beeinflusste die KSST-Aktivität nicht. Der Km-Wert für PAPS war 2 × 10^–7 M.
Tabelle 3
(3) Identifizierung der Position der durch die KSST übertragenen Sulfatgruppe
Die Strukturanalyse des vom Keratansulfat durch das teilweise gereinigte KSST synthetisierte Glykosaminoglykan wurde durchgeführt. Das ³⁵S-markierte Glykosaminoglykan wurde durch Inkubierung des Keratansulfats, des [³⁵S] PAPS und des teil weise gereinigten KSST's (2 μg des Proteins) in der Reaktionsmischung II hergestellt. Das ³⁵S-markierte Glykosaminoglykan, das aus vier Reaktionsröhrchen erhalten wird, wurde vereinigt. Dieses Glykosaminoglykan wurde vom ³⁵SO₄ und vom [³⁵S] PAPS unter Verwendung einer schnell entsalzenden Säule getrennt und lyophilisiert. Die resultierende Probe wurde mit Keratanase II (Seikagaku Corp.) wie folgt abgebaut. Speziell wurde die Probe in 50 μl des 2,5 μmol-Essigsäurepuffers (pH 6,5), der 0,005 unit der Keratanase II enthält, abgebaut, und die Reaktionsmischung wurde bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Die Keratanase II, die das Produkt abbaut wurde durch HPLC unter Verwendung der Whatman Partisil RTM 10-SAX-Säule (Whatmann, 4,5 × 20 cm), die mit 5 mM KHP₂O₄ equilibriert ist, analysiert. Die Säule wurde mit 5 mM KHP₂O₄ für fünf Minuten entwickelt und mit einem Gradienten von 5 mM bis 250 mM KHP₂O₄ über 20 Minuten bei einer Flussrate von 1 ml/min eluiert, um 0,5-ml-Fraktionen zu sammeln, und dann wurde die ³⁵S-Radioaktivität gemessen (2, A). Ein einfacher Peak, der der Gal(6SO₄)β1-4GlcNAc(6SO₄) entspricht, der die ³⁵S-Radioaktivität aufweist, wurde erhalten (2, Peak 1). Der radioaktive Peak wurde gesammelt und in einem Vakuumzentrifugal-Evaporator getrocknet, in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und in eine Hiload Superdex RTM 30 16/60 Säule (Pharmacia), die mit 0,2 M NH₄HCO₃ equlibriert ist, injiziert. Die Fraktionierung wurde bei einer Flussrate von 1 ml/min durchgeführt, um 1-ml-Fraktionen zu sammeln, von der jede mit 4 ml des Clearsol RTM (Nakarai Tesque) gemischt wurde und die ³⁵S-Radioaktivität wurde gemessen. Das Disaccharid wurde bei einer Absorption von 210 nm überwacht. Das resultierende Eluat wurde lyophilisiert.
Die ³⁵S-Radioaktivsubstanz, die in Peak 1 in 2 enthalten ist, wurde mit NaBH₄ reduziert und mit 50 μl des 0,1 M HCl bei 100°C für 40 Minuten hydrolisiert. Das Hydrolisat wurde mit der Papierchromatographie und Papierelektrophorese gereinigt. Speziell- wurde die Papierchromatographie unter Verwendung des Whatman RTM No. 3 Filterpapier (2,5 cm × 57 cm) durchgeführt und mit 1-Buthanol/Essigsäure/1 M NH₃ (3 : 2 : 1 (V/V/V)) entwickelt. Die Papierelektrophorese wurde bei 30 V/cm für 40 Minuten unter Verwendung des Whatman RTM No. 3 Filterpapiers (2,5 cm × 57 cm) durchgeführt, welches in einer Mischung aus Pyridin/Essigsäure/Wasser (1 : 10 : 400 (V/V/V), pH 4) eingetaucht wurde, durchgeführt. Nach der Papierelektrophorese und der Papierchromatographie wurde das Filterpapier getrocknet und in 1,25 cm Stücke für jede Bande geschnitten und die Radioaktivität in einer Scintillationslösung ge messen, die 5 g Diphenyloxasol und 0,25 g Dimethyl 1,4-bis (2-(5-phenyloxasol)) benzen in 1 L Toluen enthält. Die Peaks mit geringer Wanderung wurden gesammelt und eluiert, um eine Mischung aus Galβ1-4GlncNAc_R(6SO₄), Gal(6SO₄)β1-4GlcNAc_R und Gal(6SO₄) zu sammeln. Diese wurde mit Na₂CO₃ gemischt, welches 0,5 m NaBH₄ (pH 10,2, 10 μl) enthält, und auf Eis für zwei Stunden eingeengt. Das Na₂CO₃, das 0,5 M NaBH₄ (pH 10,2, 10 μl) enthält, wurde wieder dazugegeben und für zusätzliche zwei Stunden auf Eis inkubiert. Überschüssiges NaBH₄ wurde durch die Zugabe von 3 M Essigsäure (10 μl) abgebaut und der Rest wurde unter Stickstofffluss getrocknet. Das reduzierte Produkte wurde in Wasser gelöst und auf eine Dowex RTM 50 H⁺ Säule (Daw Chemical) auftragen.
Das Eluat wurde getrocknet, mit Methanol gemischt und das Methanol wurde evaporiert. Das Mischen und das Trocknen des Methanols wurde dreimal wiederholt.
Die ³⁵S-markierte Substanz, die während der obigen Einwirkung zu einer Position, die zu Gal β1-4GlcNAc_R(6SO₄) korrespondiert, wandert, wobei R Aldithol bedeutet, welches durch die Reduktion mit NaBH₄ gebildet ist, wurde der HPLC unterzogen, um in die Gal(6SO₄)β1-4GlcNAc_R und die Galβ1-4GlcNAc_R(6SO₄) (3, B) zu trennen. Im Speziellen wurde eine Probe auf eine Whatman Partisil RTM 10-SAX Säule (4,5 × 25 cm) die mit 5 mM KHP₂O₄ equlibriert ist, aufgetragen, und mit 5 mM KHP₂O₄ bei einer Flussrate von 1 ml/min und einer Säulentemperatur von 40°C entwickelt. 0,5-ml Fraktionen wurden gesammelt, jede mit 4 ml Clearsol RTM gemischt und die Radioaktivität wurde gemessen. Als ein Ergebnis wurde starke ³⁵S-Radioaktivität an einer Position detektiert, die zu der Gal(6SO₄)β1-4GlnNAc_R korrespondiert, und schwache Radioaktivität wurde an einer Position der Gal_R(6SO₄) detektiert. Andere Radioaktivität an einer zu der Galβ1-4GlcNAc(6SO₄) korrespondierenden Position wurde nicht gemessen. Dies deutet darauf hin, dass die KSST Sulfatgruppen zu monosulfatierten Wiederholeinheiten des Keratansulfats übertragen, d. h., an die C-6-Position der Galaktosereste, die in einer Struktur enthalten sind, welche aus den Wiederholeinheiten der Galβ1-4GlcNAc(6SO₄) zusammengesetzt ist. Um zu bestimmen, ob das Enzym Gruppen zu den Galaktoseresten der Wiederholungseinheit, die keine Sulfatgruppen des Keratansulfats aufweist, überträgt, wurde das Aktivitäts-Assay-Verfahren unter Verwendung der Reaktionsmischung II unter Verwendung des teilweise desulfatierten Keratansulfats als Rezeptor für die Sulfat gruppen mit einer Inkubation von 18 Stunden durchgeführt. Das ³⁵S-markierte Glykosaminoglykan, das durch das desulfatierte Keratansulfat hergestellt ist, wurde mit 0,005 unit der Keratanase II abgebaut, und das Abbauprodukt wurde der HPLC unter Verwendung der mit 5 mM KHP₂O₄ equilibrierten Whatman Partisil RTM 10-SAX Säule (4,5 × 25 cm) unterzogen, welche bei einer Flussrate von 1 ml/min für fünf Minuten entwickelt wurde und wie oben beschrieben mit einem Gradienten von 5 mM bis 250 mM KHP₂O₄ über 20 Minuten bei einer Flussrate von 1 ml/min eluiert. 0,5-ml Fraktionen wurden gesammelt, um drei radioaktive Peaks (2, B) zu erhalten. Peak 2 in 2, B wurde etwas früher als die Galβ1-4GlnNAc(6SO₄) eluiert, und Peak 4 wurde am Ort der Gal(6SO₄)β1-4GlcNAc(6SO₄) eluiert. Peak 3 wurde zwischen Peak 2 und Peak 4 eluiert.
Peak 2 und Peak 4 der 2, B wurden ähnlich wie der obige Peak 1 der 2 analysiert, und als ein Ergebnis wurde eine einfacher Peak an der Position des Gal(6 SO₄)β1-4GlcNAc_R beobachtet (die Resultate der Analysen des Peaks 2 in 2 sind in 3, C gezeigt und diejenigen für Peak 4 in 2 sind in 3, D gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass das Enzym Sulfatgruppen an C-6-Positionen von Galaktosereste, die an GlcNAc(6SO₄) oder GlcNAc gebunden sind, überträgt. Basierend auf dieser Tatsache wurde das Enzym der vorliegenden Erfindung Keratansulfat-Galaktose 6-Sulfotransferase (KSGal6ST) genannt.
<3> Northern-Hybridisierung der PolyA⁺ RNS
Die Poly(A)⁺ RNS die von verschiedenen menschlichen Geweben extrahiert ist, wurde mit 20 mM 50% Formamide (V/V) und 5% Formaldehyd (V/V) enthaltenden MOPS-Puffer, pH 7,0, denaturiert, und der Elektrophorese in einem 1,2% Agarosegel; welches 5% Formaldehyd enthält; unterzogen. Über Nacht wurd sie auf eine RTM N⁺ Nylonmembran transferiert. Die RNS wurde durch Erhitzen bei 80°C für zwei Stunden fixiert und in einer Lösung, die 50% Formamide, 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 0,1 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNS enthält, bei 42°C Celsius für drei Stunden prähybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 42°C für 14 Stunden unter Verwendung des obigen Puffers durchgeführt, welcher eine Probe enthält, die unter Verwendung der ³²P-markierten KSGal6ST-cDNS, die durch das Random-Oligonukleotid-Primed-Markierungsverfahrens präpariert ist. Nach der Hy bridisierung wurde die Membran mit 2 × SSPE und 0,1% SDS bei 65°C und dann mit 1 × SSPE und 0,1% SDS gewaschen. Ein Röntgenfilm wurde auf der Membran unter Verwendung eines Intensivierungscreens bei –80°C für 26 Stunden belichtet. Als ein Ergebnis wurde, wenn Poly(A)⁺ RNS des Gehirns verwendet wurde, eine Hybridisierungsbande um 2,8 kb beobachtet.
Die Expression der KSGal6ST in der Cornea wurde auch durch Crosshybridisierung untersucht. Speziell wurde Poly(A)⁺ RNS aus der Hühnerembryo-Cornea anstelle der obigen aus den menschlichen Geweben extrahierten Poly(A)⁺ RNS hergestellt, und die Crosshybridisierung wurde unter Verwendung einer aus der menschlichen KSGal6ST-cDNS gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten Probe durchgeführt. Die Poly(A)⁺ RNS's die vom Herzen und vom Gehirn der Hühnerembyos extrahiert sind, wurden als Kontrolle verwendet. Die Poly(A)⁺ RNS, die aus der Cornea der Hühnerembryos präpariert ist, ist in einer Crosshybridisierungsbande gezeigt.
Sequenzauflistung

Claims

Polypeptid mit spezifischer 6-Sulfotransferaseaktivität, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Schwefelgruppe an die Hydroxylgruppe an C-6-Positionen von Galaktoseresten des Keratansulftats aber nicht an Chondroitin überträgt, und weiterhin dahingehend gekennzeichnet ist, dass es mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 umfasst, der ausreicht, die 6-Sulfotransferaseaktivität zu zeigen, oder eine Mutante des genannten Polypeptids, welche Deletion, Substitution oder Addition von einer oder mehrerer Aminosäuren beinhaltet, aber die genannte spezifische 6-Sulfotransferaseaktivität beibehält.
Polypeptid nach Anspruch 1, welches mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz, die von SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, umfasst, welcher ausreicht, die genannte spezifische 6-Sulfotransferaseaktivität zu zeigen.
Polypeptid nach Anspruch 2, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die Aminosäuren 1 bis 411 von SEQ ID NO: 2 dargestellt wird.
Verbundenes Polypeptid, welches ein nach den Ansprüchen 1 bis 3 definiertes Polypeptid und ein weiteres Polypeptid umfasst.
DNS kodierend für mindestens einen Teil des nach den Ansprüchen 1 bis 4 definierten Polypeptids, wobei der genannte Teil einen Abschnitt umfasst, der ausreicht, die genannte spezifische Sulfotransferaseaktivität zu zeigen.
DNS nach Anspruch 5, welche eine Nukleotidsequenz umfasst, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die durch die Aminosäuren 1 bis 411 von SEQ ID NO: 2 dargestellt wird.
DNS nach Anspruch 6, welche einen Teil oder die gesamte Nukleotidsequenz umfasst, die durch die Nukleotide 1 bis 1233 von SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, wobei der genannte Teil einen Abschnitt umfasst, der ausreicht die genannte spezifische Sulfotransferaseaktivität zu zeigen, oder die genannte DNS eine Nukleotidsequenz umfasst, die als Primer oder Sonde spezifisch für eine Nukleotidsequenz verwendbar ist, welche das nach Anspruch 2 definierte Polypeptid kodiert.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids umfassend die Kultivierung von Zellen in einem geeigneten Kulturmedium, welche die nach einem der Ansprüche 5 bis 7 definierte DNS beherbergen, so dass ein durch die DNS kodiertes Polypeptid in der Kultur hergestellt und akkumuliert wird, und Gewinnung des Polypeptids aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung eines sulfatierten Polysaccharids umfassend das Aussetzen des Keratansulfats dem nach einem der Ansprüche 1 bis 4 definierten Polypeptid.