JPH1169983A - ヘパラン硫酸６−ｏ硫酸基転移酵素のポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヘパラン硫酸６−Ｏ硫酸基転移酵素（ＨＳ６
Ｔ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。 【解決手段】 チャイニーズハムスターの卵巣細胞から
ＨＳ６ＳＴを部分精製してその部分的アミノ酸配列を決
定し、その配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチド
プライマーを用いたＰＣＲにより上記細胞から調製した
ポリ(A)⁺RNAからＨＳ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡを増幅し、
得られたｃＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼ
ーションによりｃＤＮＡライブラリーからＨＳ６Ｔ部分
長ｃＤＮＡを得、次いでこれをプローブとするハイブリ
ダイゼーションによりｃＤＮＡライブラリーからＨＳ６
ＳＴ完全長ｃＤＮＡを得た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グリコサミノグリ
カン硫酸基転移酵素（グリコサミノグリカンスルホトラ
ンスフェラーゼ）及びそれをコードする塩基配列を有す
るＤＮＡに関するものである。より詳しくはヘパラン硫
酸又はＣＤＳＮＳ−ヘパリン等の硫酸基受容体であるグ
リコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミン
残基の６位水酸基を選択的に硫酸化するヘパラン硫酸６
−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドをコードする塩基
配列を有するＤＮＡ及びそのＤＮＡによってコードされ
るポリペプチドに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヘパラン硫酸は、ヘキスロン酸（Ｈｅｘ
Ａ）残基（Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基又はＬ−
イズロン酸（ＩｄｏＡ）残基）とＮ−アセチルグルコサ
ミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の二糖の繰り返し構造（４Ｇ
ｌｃＡβ１／ＩｄｏＡα１→４ＧｌｃＮＡｃα１）を基
本骨格とし、そのヘキスロン酸残基の２位の一部及びＮ
−アセチルグルコサミン残基の２位と６位の一部のそれ
ぞれに硫酸基を有するグリコサミノグリカンの一種であ
る。

【０００３】グリコサミノグリカン硫酸基転移酵素の遺
伝子がクローニングされることにより、硫酸基受容体と
なるグリコサミノグリカンに対する該酵素の基質特異性
についての情報を得ることが可能となり、グリコサミノ
グリカンの構造と機能の関係を研究する上で有用なアプ
ローチが提供されると考えられる。グリコサミノグリカ
ンの生合成、その中でもヘパリン／ヘパラン硫酸の生合
成には多くの硫酸化のプロセスがあることが知られてお
り（木幡陽、箱守仙一郎、永井克孝編、グリコテクノロ
ジー、57(1994)、講談社サイエンティフィク発行）、
この硫酸化には様々なグリコサミノグリカン硫酸基転移
酵素が関与しているものと考えられる。ヘパリン／ヘパ
ラン硫酸に硫酸基を転移するグリコサミノグリカン硫酸
基転移酵素としては、ヘパラン硫酸Ｎ−硫酸基転移酵素
（以下「ＨＳＮＳＴ」と略記することもある）、ヘパラ
ン硫酸２−Ｏ−硫酸基転移酵素（以下「ＨＳ２ＳＴ」と
略記することもある）及びヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基
転移酵素（以下「ＨＳ６ＳＴ」と略記することもある）
が単離されており、上記硫酸基転移酵素のうちのＨＳＮ
ＳＴ及びＨＳ２ＳＴのｃＤＮＡのクローニングがされて
いる。

【０００４】本発明者らは既に硫酸基供与体である3'-
ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸から、硫酸基受容体で
あるヘパラン硫酸に含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残
基の６位水酸基に硫酸基を選択的に転移するヘパラン硫
酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素をチャイニーズハムスター、
マウス及びヒト由来の培養細胞から精製した（J. Biol.
Chem.,270,4172-4179(1995)）。しかしながら、該酵素
のｃＤＮＡのクローニングはまだなされていなかった。
また、マウス及びニワトリ由来の該酵素はこれまでに得
られていなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ヘパラン硫酸に含まれ
るＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位の水酸基に選択的
に硫酸基を転移する酵素を大量に得ることはヘパラン硫
酸の構造解析研究において重要な手段を提供することに
なるので、当該酵素のｃＤＮＡのクローニングは非常に
重要である。すなわち、本発明は当該酵素のポリペプチ
ドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをクローニング
することにより、当該酵素を簡便な方法により大量に入
手する手段を提供し、それにより硫酸化多糖の構造−機
能の関係の解明に寄与することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヘパラン
硫酸又はＣＤＳＮＳ−ヘパリンのＮ−硫酸化グルコサミ
ン残基の６位の水酸基を選択的に硫酸化するグリコサミ
ノグリカン硫酸基転移酵素、すなわちＨＳ６ＳＴのポリ
ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを鋭意検
索し、該酵素のポリペプチドをコードする塩基配列を有
するＤＮＡのクローニングに成功し、該ＤＮＡによりＨ
Ｓ６ＳＴが発現することを確認して本発明を完成させ
た。

【０００７】すなわち本発明は、以下の性質を有する硫
酸基転移酵素のポリペプチド及びそれをコードする塩基
配列を有するＤＮＡを提供する。 作用：硫酸基供与体から、硫酸基受容体であるグリコ
サミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基
の６位水酸基へ硫酸基を選択的に転移する。硫酸基供与
体は好ましくは3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸であ
る。 基質特異性：ヘパラン硫酸又はＣＤＳＮＳ−ヘパリン
のＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基には硫酸基
を転移するが、コンドロイチン及びコンドロイチン−４
−硫酸の上記水酸基には硫酸基を転移しない。 至適反応ｐＨ：ｐＨ６〜７ 至適イオン強度：塩化ナトリウムを用いた場合、０．
１〜０．３Ｍ。 阻害及び活性化：ジチオスレイトール、アデノシン-
3',5'-ジリン酸で酵素活性が阻害され、プロタミンによ
り酵素活性が上がる。

【０００８】上記ＤＮＡは好ましくは、チャイニーズハ
ムスター、マウス、ニワトリ又はヒト由来である。ま
た、本発明は以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを
コードするＤＮＡを提供する。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転移したアミノ酸配
列からなり、かつ硫酸基供与体から硫酸基受容体である
グリコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミ
ン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有す
るポリペプチド。

【０００９】本発明のＤＮＡとして具体的には、配列番
号２のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列もしく
はその部分配列、配列番号４のアミノ酸配列の全てをコ
ードする塩基配列もしくはその部分配列、配列番号５の
アミノ酸配列の全てをコードする塩基配列もしくはその
部分配列、配列番号７のアミノ酸配列の全てをコードす
る塩基配列もしくはその部分配列又は配列番号９アミノ
酸配列の全てをコードする塩基配列もしくはその部分配
列を有するＤＮＡが挙げられる。

【００１０】さらに、本発明は、上記ＤＮＡの塩基配列
によってコードされるグリコサミノグリカン硫酸基転移
酵素のポリペプチドの全部又は部分からなるポリペプチ
ドを提供する。

【００１１】なお、本発明ＤＮＡが有する塩基配列がコ
ードするポリペプチドを含むグリコサミノグリカン硫酸
基転移酵素を便宜的にヘパラン硫酸６−Ｏ硫酸基転移酵
素又はヘパラン硫酸６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ
と称することもあるが、これは該酵素の基質がヘパラン
硫酸に限られることを意味するものではない。例えば本
酵素は、ＣＤＳＮＳ−ヘパリン中のＮ−硫酸化グルコサ
ミン残基の６位の水酸基にも選択的に硫酸基を転移す
る。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を説
明する。 ＜１＞本発明のグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素の
ポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（本
発明ＤＮＡ） 本発明ＤＮＡが有する塩基配列によってコードされるポ
リペプチドを含むグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素
は、例えば、本発明者らによってチャイニーズハムスタ
ーの卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞：ATCC CCL61等）、マウ
ス乳癌由来細胞（ＦＭ３Ａ細胞：国立衛生試験所ＪＣＲ
Ｂ細胞バンク JCRB0701等）及びヒト骨肉腫由来細胞
（ＭＧ６３：ATCC CRL1427等）等の培養細胞から精製さ
れたヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素（特開平８−
３３４８３号公報）であり、下記のような理化学的性質
を有する。 作用：硫酸基供与体から、硫酸基受容体であるグリコ
サミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基
の６位水酸基へ硫酸基を選択的に転移する。すなわち、
上記硫酸基受容体のＮ−硫酸化グルコサミンの６位の水
酸基以外には実質的に硫酸基を転移しない。硫酸基供与
体としては活性硫酸（３’ホスホアデノシン５’−ホス
ホ硫酸；以下「ＰＡＰＳ」とも記載する）が好適には挙
げられる。ヘキスロン酸残基には実質的に硫酸基を転移
しない。 基質特異性：ヘパラン硫酸又はＣＤＳＮＳ−ヘパリン
（Completely Desulfated, N-Sulfated Heparin：完全
脱硫酸化後、グルコサミン残基をＮ−硫酸化したヘパリ
ン）のＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基には硫
酸基を転移するが、コンドロイチン及びコンドロイチン
−４−硫酸の上記水酸基には硫酸基を転移しない。ま
た、一般にＮＤＳ−ヘパリン（N-Desulfated Heparin：
Ｎ−脱硫酸化したヘパリン）のように、グルコサミンの
２位に硫酸基を有しないヘパリン又はヘパラン硫酸には
硫酸基をほとんど転移しない。したがって、本発明酵素
の硫酸基受容体としては、グリコサミノグリカンのグル
コサミン残基の２位が硫酸化されたＮ−硫酸化グルコサ
ミン（元々、Ｎ−硫酸基を有するヘパラン硫酸に含まれ
るものを含む）が必要であると考えられる。 至適反応ｐＨ：本酵素はｐＨ６．０〜７．０の範囲、
特にｐＨ６．３付近で高い硫酸基転移活性を有する。ｐ
Ｈ４．７以下ではほとんど活性を有しない。 至適イオン強度：本酵素の活性は、反応環境下のイオ
ン強度の変化に伴って変化し、ＮａＣｌの場合、０．１
〜０．３Ｍ、特に０．１５Ｍ付近で最も高い活性を示
す。この範囲を超えてＮａＣｌ濃度が増加すると活性は
徐々に低下し、０．５Ｍでは活性は極めて低くなる。 阻害及び活性化：本酵素の活性は、ジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）、アデノシン−３’，５’−ジリン酸
（３’，５’−ＡＤＰ）で阻害され、プロタミンにより
上がる。一般に、ＤＴＴ１ｍＭ存在下で活性は半減し、
約０．０２５ｍｇ／ｍｌ以上のプロタミンにより、プロ
タミン非存在下と比して１０倍程度活性が上がる。

【００１３】また、本酵素は一般に下記の理化学的性質
も有する。 ミカエリス定数：ＣＨＯ細胞由来の本酵素は、本酵素
に対して、硫酸基の受容体としてヘパラン硫酸を、供与
体としてＰＡＰＳを用いたときのＰＡＰＳに対するミカ
エリス定数（Ｋｍ）は、約４．４×１０^-7Ｍである。 その他：ＣＨＯ細胞の培養液から得られる本酵素の活
性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分析すると、４５ｋＤａ及び５２ｋＤａの分子量のバ
ンドが認められる。また、本酵素をＮ−グリカナーゼ処
理したものをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析した結果、３８ｋＤａ及び４３ｋＤａの分子
量のバンドが認められる。

【００１４】上記の理化学的性質は、J. Biol. Chem. 2
70, 4172-4179(1995)に記載の方法に従って測定するこ
とができる。本発明ＤＮＡは、本発明により初めて単離
されたＤＮＡであり、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペ
プチドをコードしているのであればその塩基配列は特に
限定はされない。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてに１もしくは数個の
アミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転移したアミノ酸
配列からなり、かつ硫酸基供与体から硫酸基を硫酸基受
容体であるグリコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化
グルコサミン残基の６位の水酸基に転移する酵素活性を
有するポリペプチド。

【００１５】すなわち、配列番号２のアミノ酸配列は、
硫酸基供与体から、硫酸基受容体であるグリコサミノグ
リカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水
酸基に硫酸基を選択的に転移する活性を実質的に害さな
い１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又
は転位を有していてもよく、そのようなアミノ酸配列の
置換、欠失、挿入又は転位を有するポリペプチドをコー
ドする、塩基配列の置換、欠失、挿入及び転位を有する
ＤＮＡのいずれもが本発明ＤＮＡに包含される。本明細
書における「アミノ酸の数個」とは該酵素の活性が失わ
れない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示
し、例えば４００アミノ酸残基からなるポリペプチドの
場合、２０程度以下の数を示す。また、好ましくは、相
同性が８５％以上、さらに好ましくは９０％以上となる
程度の数を示す。該酵素の活性の測定方法は公知であり
（例えば、J. Biol. Chem. 270, 4172-4179(1995)）、
当業者であれば、目的とする酵素活性の有無を指標とし
て、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基
の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することがで
きる。ＤＮＡの塩基配列の置換、欠失、挿入又は転位
は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を
含む配列を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩基配列の相
当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡに導入する
ことができる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. an
d Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987);
Kunkel,T.A. et al., Meth. in Enzymol.,154,367(198
7)）などの方法によっても、ＤＮＡに置換、欠失、挿入
又は転位を導入することができる。

【００１６】本発明ＤＮＡとして具体的には配列番号２
のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部
分配列、配列番号４のアミノ酸配列の全てをコードする
塩基配列又はその部分配列、配列番号５のアミノ酸配列
の全てをコードする塩基配列又はその部分配列、配列番
号７のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はそ
の部分配列、又は配列番号９のアミノ酸配列の全てをコ
ードする塩基配列又はその部分配列をコードするＤＮＡ
が挙げられ、かつ好ましいがこれに限定はされない。上
記の「部分配列を有するＤＮＡ」とは、例えばＨＳ６Ｓ
ＴのポリペプチドをコードするＤＮＡとハイブリダイズ
しＨＳ６ＳＴのＤＮＡを検出するためのプローブとして
使用することができる又はそれによってコードされるポ
リペプチドがＨＳ６ＳＴ活性を有するあるいはＨＳ６Ｓ
Ｔと同様の抗原性を有するＤＮＡを示す。上記ハイブリ
ダイズの条件は、後記実施例記載の１次スクリーニング
又は２次スクリーニングと実質的に同一の条件である。
なお、配列番号５のアミノ酸配列においては、それぞ
れ、アミノ酸番号１８のアミノ酸はチロシン又はアスパ
ラギン、アミノ酸番号１３２のアミノ酸はセリン又はプ
ロリン、アミノ酸番号１３４のアミノ酸はアラニン又は
グリシン、アミノ酸番号１３７のアミノ酸はスレオニン
又はセリン、アミノ酸番号１４５のアミノ酸はスレオニ
ン又はイソロイシン、アミノ酸番号１４７のアミノ酸は
ロイシン又はバリンであることが好ましい。

【００１７】本発明ＤＮＡが有する塩基配列としてより
具体的には、配列番号１又は配列番号３に示す全塩基配
列又はその部分配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好
ましい。このようなＤＮＡとして具体的には、配列番号
１における塩基番号１１２〜１３４１及び配列番号３に
おける塩基番号２〜７０９の塩基配列からなるＤＮＡが
挙げられる。

【００１８】配列番号１に示す塩基配列においては、Ｈ
Ｓ６ＳＴｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの
５’末端部には３つのイン・フレームのＡＴＧコドンが
含まれている。第１番目のＡＴＧコドンの周囲の塩基配
列は、Ｋｏｚａｋの知見（Kozak, M. (1986)Cell, 44,2
83-292）による真核細胞の翻訳開始部位の共通配列（Ｔ
ＣＣ（Ａ又はＧ）ＣＣＡＴＧＧ）と比較すると、４個の
塩基が保存されている。第２番目のＡＴＧコドンの周囲
の塩基配列は、上記配列の塩基が７個、第３番目のＡＴ
Ｇコドンの周囲の塩基配列は６個保存されている。

【００１９】ところで、β−１，４−ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼは、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを
含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988)
J.Biochem, 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988)
J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaper
らは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ
は、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いもの
との両方の形態が合成されることを示している。さら
に、Lopezらは、長い形態のものは原形質膜を優先的に
標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在
することを示唆する証拠を示している（Lopez, L. et a
l. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15591）。同様
に、ＨＳ６ＳＴについても、複数のＡＴＧコドンが開始
コドンとして機能する可能性はあるが、定かではない。
しかし、いずれのＡＴＧコドンが開始コドンであって
も、上記の硫酸基転移酵素のポリペプチドをコードする
点では同じであり、第２番目、第３番目のＡＴＧコドン
から始まる塩基配列を有するＤＮＡも本発明に包含され
るものである。

【００２０】配列番号１の最初のＡＴＧコドンで始まる
単一のオープンリーディングフレームからは、４１０ア
ミノ酸残基からなり、分子量４８，２４３Ｄａ、Ｎ−結
合グリコシレーション部位である可能性がある２カ所の
部位を有するタンパク質が予測される。このアミノ酸配
列から作成したハイドロパシープロット（図２）から、
Ｎ末端から１７〜３１番目のアミノ酸残基に渡る長さ１
５残基の１つの顕著な疎水性部分が認められ、トランス
メンブレン（膜貫通）ドメインを有することが予想され
る。

【００２１】尚、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配
列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されることは、
当業者であれば容易に理解されるところである。また、
本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又は
ＲＮＡも包含される。さらに本発明ＤＮＡは、ＨＳ６Ｓ
Ｔをコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、
この一本鎖およびこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖
又はＲＮＡ鎖からなる二本鎖であってもよい。

【００２２】また、本発明ＤＮＡは、ＨＳ６ＳＴのポリ
ペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配列を
有していてもよく、またＨＳ６ＳＴのポリペプチドの一
部分をコードする塩基配列を有するものであってもよ
い。

【００２３】ところで、一般にグリコサミノグリカン硫
酸基転移酵素では、チャイニーズハムスターとヒトとの
間でアミノ酸配列に高い相同性を有することが知られて
おり、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドも、種間
におけるアミノ酸配列の相同性は約７０％以上と想定さ
れる。従って、本発明で具体的に開示しているＤＮＡが
コードするポリペプチドと高い相同性を有するポリペプ
チド及びそれをコードするＤＮＡも本発明に包含され
る。上述のようにＨＳ６ＳＴのポリペプチドは膜貫通領
域を有するが、膜内の末端にあたるＮ末端部から当該膜
貫通領域を含む領域を欠失したＨＳ６ＳＴのポリペプチ
ドの部分もまた本発明に包含される。このようなポリペ
プチドを具体的に例示すると、例えば配列番号２に示す
アミノ酸配列におけるアミノ酸番号３４〜４１０などが
挙げられる。

【００２４】＜２＞本発明ＤＮＡの製造方法 以下、本発明ＤＮＡを得る方法について説明する。本発
明によりＨＳ６ＳＴのポリペプチドの一部のアミノ酸配
列が明らかにされたので、その配列に基づいて作成した
オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリ
メラーゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体
ＤＮＡあるいはｍＲＮＡから本発明のＤＮＡを増幅する
ことによって取得することも可能であり、また、特に、
以下の各工程からなるｃＤＮＡクローニングにより製造
することも可能である。 (1)精製したヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポ
リペプチドの一部のアミノ酸配列を決定する。 (2)上記アミノ酸配列に基づいて対応する塩基配列のオ
リゴヌクレオチドプライマーを作製する。 (3)培養細胞より抽出したＲＮＡから上記プライマーを
用いてＰＣＲ法によりｃＤＮＡを増幅することによって
前記硫酸基転移酵素の１次プローブを製造する。 (4)上記１次プローブによって培養細胞又は生体組織由
来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてｃＤＮ
Ａ断片を得る。 (5)上記ｃＤＮＡ断片を２次プローブとして培養細胞又
は生体組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グする。

【００２５】スクリーニングによって、通常には、上記
硫酸基転移酵素の完全長ｃＤＮＡを選択する。しかし、
本発明のＤＮＡの製造方法はこれに限定されるものでは
なく、上記ＰＣＲ法や、他の公知のｃＤＮＡクローニン
グの手法によっても本発明ＤＮＡを製造することができ
る。

【００２６】以下に、本発明のＤＮＡを製造する方法の
一例を具体的に説明する。 （１）ヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素（ＨＳ６Ｓ
Ｔ）のアミノ酸配列の決定 (i)ヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素の精製 ＨＳ６ＳＴは、例えばチャイニーズハムスター、マウス
又はヒト由来の培養細胞、ヒト脳組織等ＨＳ６ＳＴを発
現する細胞又は組織から、通常のタンパク質の精製方
法、および本酵素の基質又は阻害剤を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーを組み合わせることによって精
製することが可能である。具体的には、J.Biol. Chem.
270,(8),4172-4179,(1995)に記載された方法に従って行
うことができる。

【００２７】(ii)ヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素
の部分アミノ酸配列の決定 精製したＨＳ６ＳＴには糖鎖が結合していることが知ら
れているので、この糖鎖を除去するために精製ＨＳ６Ｓ
ＴをＮ−グリカナーゼなどの糖鎖分解酵素で消化し、脱
グリコシル化されたＨＳ６ＳＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）等で分離し、
ポリビニリデンフルオリド(polyvinylidene fluoride;
ＰＶＤＦ)膜やニトロセルロース膜などに転写する。こ
の膜をクマシー・ブリリアント・ブルー(ＣＢＢ)やアミ
ドブラックなどのタンパク質を染色する色素で染色し、
Ｎ−グリカナーゼ消化後に形成したタンパク質バンドを
切り出して断片化に用いる。

【００２８】断片化の方法は特に限定はされないが、上
記タンパク質バンドにタンパク質分解酵素を接触させる
など、公知の方法でタンパク質を断片化することができ
る。具体的なタンパク質分解酵素の例としてはエンドプ
ロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ
−Ｎなどが挙げられる。ゲルからバンドを切り出し、タ
ンパク質分解酵素に接触させ、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
などで分離してもよい。簡便な操作としては、Clevel a
nd, D. W., Fischer, S. G., Kirshner, M. W., and La
emmli, U. K.(1977) J. Biol. Chem. 252, 1102-1106
の方法がある。すなわち、タンパク質バンドを切り出し
て別のゲルのウェルに挿入し、タンパク質分解酵素を含
む緩衝液を、挿入したゲルに乗せてＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行い、色素マーカーの先端が分離ゲルにはいる直前に電
源を切ることによって泳動を一時中断し、約３０分間酵
素消化を行い、その後電気泳動を再開するという方法で
ある。この方法によれば酵素消化と消化後のペプチド断
片の分離が単一工程でできるため好ましい。断片化によ
って生じたペプチドをＰＶＤＦ膜やニトロセルロース膜
などに転写した後、ＣＢＢ又はアミドブラックなどを用
いてペプチドを染色し、ペプチドのバンドを切り出す。
タンパク質分解酵素消化後に生じたペプチドを含むＰＶ
ＤＦ膜やニトロセルロース膜などは、公知の方法でペプ
チドのアミノ末端配列決定を行うことが可能である。具
体的にはモデル４７６Ａプロテインシークエンサー（ア
プライド バイオシステムス(Applied Biosystems)社
製）などを用いてアミノ酸の配列を分析することが好ま
しいがこれに限定はされない。なお、業者に依頼してア
ミノ酸配列を決定してもらうことも可能である。

【００２９】(iii)オリゴヌクレオチドプライマーの合
成 ＨＳ６ＳＴの部分的アミノ酸配列に基づき、ＰＣＲ用オ
リゴヌクレオチドプライマーを作成する。アミノ酸配列
のうち、なるべくコドンの縮重が少ない部位を用いるこ
とが好ましい。このようなプライマーの例を、図１に示
す（センスプライマー：配列番号１５、１７；アンチセ
ンスプライマー：配列番号１６、１８）。

【００３０】（２）ＨＳ６ＳＴｃＤＮＡの調製とプロー
ブの作成 全ＲＮＡは、公知の方法（Kingston, R. S., (1991)
in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl.
14, Unit 4.2, Greene Publishing Associates and Wil
ey Interscience, New Yorkなど）で得ることができ
る。材料は、ＨＳ６ＳＴのｍＲＮＡを発現している材料
であれば限定はされないが、取り扱いの容易さ、および
増殖可能な点で例えばチャイニーズハムスター由来のＣ
ＨＯ細胞（例えばATCC CCL61等）、マウス由来のＦＭ３
Ａ細胞（例えば国立衛生試験所ＪＣＲＢ細胞バンク JC
RB0701等）、ヒト由来のＭＧ６３細胞（例えばATCC CCL
1427等）等の培養細胞が好ましい。培養細胞の中でも特
にＣＨＯ細胞が本酵素が強く発現し、酵素活性も比較的
高いため好ましい。上記培養細胞の培養に用いる培地は
特に制限されないが、大量の細胞を効率よく得るには、
スピナーフラスコなどによる浮遊細胞の培養に適した培
地が好ましい。具体的にはＣＨＯ細胞を使用する場合に
は浮遊培養用のＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ギブコ
製）などの市販の培地を用いてもよい。上記のような培
地を用いてスピナーフラスコを使用して通常の培養細胞
と同様にして培養すればよい。培養は、炭酸ガスインキ
ュベーター中で行うことが好ましく、インキュベーター
中の炭酸ガス濃度が５〜７％、空気が９５〜９３％とな
るように調整することが好ましい。また、温度は３７〜
３８℃程度に調整することが好ましい。

【００３１】全ＲＮＡは、前述のように培養した培養細
胞から通常用いられる全ＲＮＡの調製方法により得るこ
とができるが、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法
(Kingston, R. E., (1991) in Current Protocols in M
olecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Greene Publ
ishing Associates and Wiley Interscience, New Yor
k)で調製することが好ましい。

【００３２】ポリ(A)⁺ＲＮＡの調製 ポリ(A)⁺ＲＮＡは、上記のようにして得られた全ＲＮＡ
から、オリゴｄＴ(oligo-(dT))セルロースカラムクロマ
トグラフィーなどによって精製することができる。

【００３３】ＰＣＲ法によるＨＳ６ＳＴ部分的ｃＤＮ
Ａの増幅 上記ポリ(A)⁺ＲＮＡを鋳型とし、オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いた逆転写ＰＣＲにより、ＨＳ６ＳＴ部分
的ｃＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは、通常の
方法と同様にして行えばよいが、具体的方法を示すなら
ば以下の通りである。１μｌのポリ(A)⁺ＲＮＡ、それぞ
れ１００ｐｍｏｌのオリゴｄＴとランダムオリゴヌクレ
オチドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオ
キシヌクレオシド三リン酸、２００単位のＭ−ＭＬＶ逆
転写酵素（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）、１ｍＭジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）、１２０単位のＲＮａｓｅ（リ
ボヌクレアーゼ）インヒビター（宝酒造（株）製）を含
む緩衝液（終体積２０μｌ）を５０℃で６０分間インキ
ュベートし、ｃＤＮＡ一次鎖を合成する。次に、上記の
逆転写反応混合液５μｌ、各１００ｐｍｏｌの前述のオ
リゴヌクレオチドプライマー、それぞれ２５０μＭの４
種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単位の
Ｔａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積５０μｌ）に
対し、９５℃１分、４６〜６２℃１分、７２℃２分を３
５サイクル繰り返して行う。

【００３４】このようにして得られた部分的ｃＤＮＡ
は、ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡ（コード領域全
長を含むｃＤＮＡ）断片をスクリーニングするためのハ
イブリダイゼーションプローブ（１次プローブ）として
用いられる。また、このＰＣＲ産物は通常の方法により
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIベクター（ストラタジーン
製）へサブクローニングして塩基配列の決定を行うこと
が好ましい。

【００３５】（３）ｃＤＮＡライブラリーの作成 (i)ｃＤＮＡの合成と組換えＤＮＡの作成 ｃＤＮＡは、ポリ(A)⁺ＲＮＡを鋳型とした逆転写酵素反
応により通常の方法を用いて合成することができる。合
成する際は市販のｃＤＮＡ合成用キットを用いるのが便
利である。例えばＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノ
ロジー）を用いると、ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡを
クローニングベクターに連結することもできる。また、
市販のｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、より
簡便にｃＤＮＡを得ることも可能である。本発明実施例
においてもＣＨＯ細胞及びヒト胎児脳由来のλｇｔ１１
ライブラリーを用いている。クローニングベクターに結
合した状態のこれらの組換えＤＮＡを宿主細菌細胞中に
導入（トランスフェクション）する。用いる宿主細菌細
胞は、用いるクローニングベクターにより選択する必要
があるが、通常は大腸菌（エシェリキア・コリ：Escher
ichia coli(E. coli)）を宿主とするクローニングベク
ターと大腸菌との組み合わせが頻用されているがこれに
限定はされない。トランスフェクションは通常、組換え
ＤＮＡと３０ｍＭ塩化カルシウムの存在下で細胞膜の透
過性を変化させた大腸菌とを混合することにより行われ
る。λｇｔ１１のようなλファージベクターの場合、組
換えＤＮＡを直接塩化カルシウム処理した大腸菌に導入
もできるが、予め試験管中でファージ外殻に入れて（in
vitroパッケージングという）、大腸菌に効率よく感染
させる方法が一般に使用されており、市販されているパ
ッケージング用のキット（Gigapack II packaging extr
act、ストラタジーン(Stratagene)製等）を用いてパッ
ケージングを行うことも可能である。パッケージングし
た組換えＤＮＡは、大腸菌にトランスフェクションする
が、用いるクローニングベクターによって用いる大腸菌
株を選択する必要がある。すなわち、抗生物質耐性遺伝
子を含むクローニングベクターを用いる場合は、大腸菌
に抗生物質に対する耐性の性質があってはならず、ま
た、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）等の遺伝
子を含むクローニングベクターを用いる場合は、β−ガ
ラクトシダーゼ活性を発現しない大腸菌を選択する必要
がある。このことは、組換えＤＮＡがトランスフェクシ
ョンされた大腸菌をスクリーニングするために必要なこ
とである。例えば、λｇｔ１１クローニングベクターを
用いる場合、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０８８等の大腸菌株を
選択すればよい。組換えＤＮＡや組換えプラスミドが導
入された大腸菌は抗生物質に対する耐性の獲得や、β−
ガラクトシダーゼ活性の獲得等によりスクリーニングす
ることが可能である。具体的には、大腸菌を寒天培地に
まき、生育したコロニーを選択すればよい。生育した大
腸菌（組換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸
菌）は、ｃＤＮＡライブラリーを構成する。プラスミド
にブルースクリプトを用いた場合は、指示菌とともに軟
寒天培地に懸濁し、寒天培地上に重層してプラークを形
成させればよい。ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを
保持するファージプラークはβ−ガラクトシダーゼ活性
を発現しないので、容易に選択することができる。

【００３６】(ii)ＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片クローニング 次に上記のようにして得られたｃＤＮＡライブラリー
を、上記１次プローブを用いてハイブリダイゼーション
により選択することができる。ハイブリダイゼーション
は、通常の方法に従って行えばよい（１次スクリーニン
グ）。選択された陽性クローンからファージＤＮＡを調
製し、適当な制限酵素で切断することによりＨＳ６ＳＴ
ｃＤＮＡ断片を切り出すことができる。当該ｃＤＮＡ断
片は、そのまま、あるいは適当なプラスミドにサブクロ
ーニングして、塩基配列を決定することができるが、Ｈ
Ｓ６ＳＴの場合、後記実施例に示すように、オープンリ
ーディングフレームの全領域をコードするものを得るこ
とが極めて難しいことが判明している。しかしながら、
当該ｃＤＮＡ断片を上記１次プローブの作成と同様な手
法を用いて例えば放射線又は蛍光標識し、再度、２次プ
ローブとして以下の２次スクリーニングにより完全長ｃ
ＤＮＡを得ることが可能である。このようなｃＤＮＡ断
片の例として、ＣＨＯ細胞のｃＤＮＡライブラリーから
得られるＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片の塩基配列及びこの塩
基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号３に、ア
ミノ酸配列のみを配列番号４に示す。本明細書中におけ
る部分的ｃＤＮＡとは、上記ｃＤＮＡ断片のように、プ
ローブを用いてスクリーニングを行って得られたＤＮＡ
のうち、塩基配列を決定するとオープンリーディングフ
レームの全領域をコードしておらず、更に当該ＤＮＡを
プローブとして他のＤＮＡを得るためにプローブとして
使用することができるＤＮＡを指称する。

【００３７】(iii)ＨＳ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡクローニ
ング 前述のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーから、
ＨＳ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを有するファージクローン
を、２次プローブを用いてハイブリダイゼーションによ
り選択することができる（２次スクリーニング）。ハイ
ブリダイゼーションは、通常の方法に従って行えばよい
が、使用するｃＤＮＡライブラリーは１次スクリーニン
グで使用したものと同じである必要はない。選択された
陽性クローンから、ファージＤＮＡを調製し、適当な制
限酵素で切断することによりＨＳ６ＳＴｃＤＮＡを切り
出すことができる。得られたｃＤＮＡは、そのまま、あ
るいは適当なプラスミドにサブクローニングして、塩基
配列を決定する。

【００３８】例えば、上述の１次スクリーニングにより
得られたＣＨＯのＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片を２次プロー
ブとして用いて、ヒト胎児脳のｃＤＮＡを保持するλｇ
ｔ１１ライブラリーをスクリーニングすることにより得
られ、決定されたヒト由来のＨＳ６ＳＴｃＤＮＡの塩基
配列及びこの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配
列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。上
記の様にある生物種のＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片を２次プ
ローブとして使用し、別の生物種のｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングすることによって別の生物種のＨＳ
６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを得ることが可能である。また、
同種の生物種のｃＤＮＡライブラリーを用いることによ
りその生物のＨＳ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡを得ることも当
然可能である。

【００３９】＜３＞本発明ＤＮＡの塩基配列によってコ
ードされるグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素のポリ
ペプチドの全部又は部分からなるポリペプチド 本発明は、上記の本発明ＤＮＡによってコードされるグ
リコサミノグリカン硫酸基転移酵素のポリペプチドの全
部又は部分からなるポリペプチドも提供する。本明細書
において、上記のポリペプチドの「部分」とは、ＨＳ６
ＳＴ活性を有する、抗原性を有するなどの何らかの活性
ないし機能を有する部分を意味する。本ポリペプチドは
単独であってもよいし、他のポリペプチドと融合してい
てもよい。

【００４０】ところで、哺乳類の生体内で発現している
ＨＳ６ＳＴはその構造中に糖鎖を有するため、ＨＳ６Ｓ
ＴのポリペプチドとＨＳ６ＳＴは明確に区別される。こ
のようなポリペプチドは、例えば、後記のポリペプチド
の製造方法によって得ることができ、また、上記の活性
ないし機能の有無を判定することは当業者に公知の方法
（例えばJ. Biol. Chem., 270(8),4172-4179(1995)）に
よって行うことができる。

【００４１】＜４＞本発明ＤＮＡを利用したＨＳ６ＳＴ
のポリペプチド又はＨＳ６ＳＴの製造方法 上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地
で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培
養物中に生成蓄積させ、その培養物から本発明ポリペプ
チドを採取することによって、ＨＳ６ＳＴのポリペプチ
ド又はＨＳ６ＳＴを製造することができる。

【００４２】本発明ＤＮＡで形質転換された細胞は、公
知の発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換
えプラスミドを構築し、この組換えプラスミドを用いて
形質転換を行うことによって得ることができる。細胞と
しては大腸菌等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞
が例示される。大腸菌などの原核細胞を用いた際は、本
発明ＤＮＡの発現によって生じるＨＳ６ＳＴのポリペプ
チドに糖鎖の付加が起こらないため、純粋にＨＳ６ＳＴ
のポリペプチドのみを得ることが可能であり、また、哺
乳類細胞等の真核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発
現によって生じるＨＳ６ＳＴのポリペプチドに糖鎖の付
加がなされる。そのため、糖鎖も含むＨＳ６ＳＴの形態
で得ることが可能である。

【００４３】本製造方法においては、タンパク質の製造
に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することがで
き、例えば、ＣＯＳ−７細胞等の哺乳類由来の培養細胞
とｐＣＸＮ２(Niwa, H., Yamanura, K. and Miyazaki,
J. (1991) Gene 108, 193-200)又はｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ
−２（イーストマン コダック(Eastman Kodak)製）等
の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせを採用する
ことが好ましい。培地や培養条件は、用いる宿主すなわ
ち細胞に合わせて適宜選択される。

【００４４】本発明ＤＮＡは直接発現させてもよいし、
他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させ
てもよい。また、本発明ＤＮＡは全長を発現させてもよ
いし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。

【００４５】培養物からの本発明ポリペプチドの採取
は、公知のポリペプチドの精製方法によって行うことが
できる。なお培養物には、培地および当該培地中の細胞
が包含される。

【００４６】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。 ＜１＞チャイニーズハムスターのヘパラン硫酸６−Ｏ−
硫酸基転移酵素の調製およびアミノ酸配列の分析 J. Biol. Chem.,270,4172-4179(1995)に記載の方法によ
り精製したＨＳ６ＳＴを得た。ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行うために、２８μｇ
のＨＳ６ＳＴを１０％トリクロロ酢酸により沈殿させ、
アセトンで２回洗浄した。この沈殿は、５％（Ｖ／Ｖ）
の２−メルカプトエタノールを含むローディングバッフ
ァーで１００℃、３分間還元およびＳＤＳ化した後、La
emmli（Laemmli, U. K.(1970) Nature 227, 680-685）
の方法に従って１０％のポリアクリルアミドゲルを用い
てＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離
されたタンパク質を、１０％メタノールを含有するｐＨ
１１の１０ｍＭ ３−シクロヘキシルアミノ−１−プロ
パンスルフォン酸（ＣＡＰＳ）溶液中、２００ｍＡで２
時間３０分、ＰｒｏＢｌｏｔｔのＰＶＤＦ膜（アプライ
ド バイオシステム製）に転写した。転写したタンパク
質をAebersoldらの方法（Aebersold, R.H.,Leavitt,
J., Saavedra, R.A., Hood, L.E., and Kent, S.B.H.(1
987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,6970-6974）に従
ってPonceau Sで染色した。４５ｋＤａの領域のバンド
を切り出し、Iwamatsuの方法（Iwamatsu, A.(1992) Ele
ctrophoresis 13, 142-147）を改変した方法によってＰ
ＶＤＦ膜上で変性させＳ−カルボキシメチル化した。膜
に転写されたタンパク質は、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．８、５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル、１ｍ
ｇ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む８Ｍ グアニ
ジン塩酸塩溶液３００μｌ中で室温で１時間還元した。
そこに３ｍｇのヨード酢酸を含む１Ｎ ＮａＯＨ溶液１
２μｌを加え、暗所に１５分間置いた。この膜を蒸留水
で洗浄し、その後０．１％ ＳＤＳを含有する２％アセ
トニトリルで洗浄した。膜上のＳ−カルボキシメチル化
したタンパク質は、１ｍｇのメチオニンを含む１００ｍ
Ｍの酢酸に溶解した０．５％ ポリビニルピロリジン
（ＰＶＰ−４０） ３００μｌ中で室温で３０分間イン
キュベートし、１０％（Ｖ／Ｖ） アセトニトリルで洗
浄した。膜を細かく切断し、５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）に溶解した０．３ＵのＮ−グリカナー
ゼで３７℃１５時間処理した。その後、ｉｎ ｓｉｔｕ
逐次的消化を、１０％（Ｖ／Ｖ） アセトニトリルを含
むｐＨ９．０の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に酵素：
基質（ｍｏｌ：ｍｏｌ）が１：５０となるように溶解し
たエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃにより３７℃で１５
時間行い、続いて１０％（Ｖ／Ｖ） アセトニトリルを
含むｐＨ７．５の２０ｍＭ 炭酸水素アンモニウムと２
５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含むｐＨ７．８の反応液中に酵
素：基質（ｍｏｌ：ｍｏｌ）が１：５０となるように溶
解したエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎにより４０℃で
２４時間行うことにより行った。この消化産物を回収し
てフィルターにかけ、凍結乾燥した。１％（Ｖ／Ｖ）
アセトニトリルを含む移動相Ａ（０．０６％（Ｖ／Ｖ）
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））１８μｌにこの凍結乾燥
物を溶解し、逆相カラム（０．３×１５０ｍｍ）でキャ
ピラリーＨＰＬＣを行った。ペプチドの溶出は流速３．
３μｌ／ｍｉｎ、１００分間で２％〜１００％までの移
動相Ｂ（０．０５２％ ＴＦＡを含む８０％ アセトニ
トリル）の濃度勾配により行った。ペプチドの画分は２
１４ｎｍの吸光度をモニターしながら手作業で回収し、
ＰＶＤＦ膜の小片にブロットした。アミノ酸配列決定は
モデル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライド
バイオシステムス(Applied Biosystems)）で行った。
表１に結果を示す。

【００４７】

【表１】 ──────────────────────────────────── ペプチド番号 アミノ酸配列 配列番号 ──────────────────────────────────── １ YXFPVREL １０ ２ ETWLF １１ ３ HLVQN １２ ４ DPAGLR １３ ５ DCPYNLA １４ ────────────────────────────────────

【００４８】＜２＞ＨＳ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡのＰＣＲ
による増幅 （１）ＰＣＲ用プライマーの作成 上記ペプチドの１と２に基づいて、末端および内部のプ
ライマーのデオキシイノシン置換を有する縮重オリゴヌ
クレオチド（図１）を作成した（鋳型ＤＮＡ配列を持つ
プライマー２ｓ（配列番号１５）、５ｓ（配列番号１
７）、鋳型の相補的配列を持つプライマー２ａ（配列番
号１６）、５ａ（配列番号１８））。

【００４９】（２）ＰＣＲ反応 ＣＨＯ細胞からオリゴｄＴ（oligo-(dT)）セルロースク
ロマトグラフィーを使用する常法により採取したポリ
(A)⁺ＲＮＡを逆転写反応の鋳型として、オリゴｄＴ及び
ランダムヌクレオチドプライマーを用いてｃＤＮＡの一
本鎖を合成し、これをＰＣＲの鋳型として使用した。Ｐ
ＣＲは、各１００ｐｍｏｌのプライマー２ｓと５ａの混
合物（又は２ａと５ｓ）、５μｌの逆転写反応液、それ
ぞれ０．２５ｍＭの４種類のデオキシヌクレオチド三リ
ン酸、および１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラー
ゼ（パーキン−エルマー(Perkin-Elmer）製）を含む混
合液５０μｌで行った。増幅は以下のように行った。解
離反応は９５℃で１分、アニーリングは４６〜６２℃で
１分、伸長反応は７２℃で２分とし、３サイクルごとに
４８℃までアニーリングの温度のみを２℃ずつ低くし、
最終的にはアニーリングの温度が４６℃の条件で１１サ
イクル行った。その後、さらに１５分間伸長反応を行っ
た。この操作によって生じた増幅物質をアガロースゲル
電気泳動により解析すると、増幅された約３３０ｂｐの
ＤＮＡのバンドが検出された。３３０ｂｐのＰＣＲ産物
を常法によりアガロースゲル電気泳動し、ＨＳ６ＳＴ部
分的ｃＤＮＡとしてＤＮＡ断片を回収した。

【００５０】＜３＞チャイニーズハムスターのＨＳ６Ｓ
ＴｃＤＮＡ断片の取得 （１）ハイブリダイゼーション用プローブの作成 ２ｓと５ａをプライマーとしてＰＣＲを行って得られ
た、１次プローブとするＤＮＡ断片はＪｅｔｓｏｒｂ
（ゲノメッド(Genomed)製）を使って回収した。Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼを使い平滑化し、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼによりリン酸化したこのＤＮＡを、アルカ
リホスファターゼ処理をしたブルースクリプト(Bluescr
ipt)プラスミド（ストラタジーン(Strategene)製）ＤＮ
ＡのＥｃｏＲＶ消化断片と結合し、ＪＭ１０９を用い
て、青と白の色による選択によりサブクローン化した。
サブクローンは配列決定により確認した。その結果、こ
のＰＣＲ産物にはペプチド２及び５の他にペプチド４が
コードされることが明らかとなった。

【００５１】ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに
使用した放射線ラベルした一次プローブは、プライマー
２ｓおよび５ａ、鋳型としてサブクローン化された約３
３０ｂｐのＤＮＡ、ならびに[α-³²P]ｄＣＴＰ（アマシ
ャム(Amersham)製）を含む最終量２５μｌの溶液で増幅
したＰＣＲ産物から調製した。ＰＣＲは、９５℃で１
分、５０℃で１分、７２℃で１分のサイクルを３０回繰
り返し、最終のサイクルではさらに７２℃での伸長時間
を１５分延長することにより行った。

【００５２】（２）ＨＳ６ＳＴｃＤＮＡクローンの１次
スクリーニング ＣＨＯ細胞のｃＤＮＡライブラリーであるλｇｔ１１
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。具体的には、ＲＮＡ
抽出キット（ファルマシア製）を使用し、培養したＣＨ
Ｏ細胞から全ＲＮＡを調製し、オリゴｄＴ−ラテックス
（Oligotex dT30、ロシュ製）を使用してポリＡ−ＲＮ
Ａを調製した。ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ
消化したλｇｔ１１（ファルマシア製）への結合はＴｉ
ｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア
製）で行った。逆転写反応はランダムオリゴヌクレオチ
ドプライマー及びｏｌｉｇｏｄＴを使用して行った。結
合したＤＮＡはStratagene Gigapack II（ストラタジー
ン製）を用いてファージにパッケージングした。宿主の
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０８８細胞に上記で調製したｃＤＮ
Ａを保持するファージを感染させた。プレート１枚当た
り２〜４×１０⁴個のプラークが形成されるようにま
き、約８×１０⁵個のプラークをスクリーニングした。
λｇｔ１１ライブラリーから生じたプラークを転写した
Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋ナイロン膜をアルカリ固定法により
固定し、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナト
リウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ緩衝液）、５×デ
ンハルト溶液(Denhardt's solution)、０．５％ ＳＤ
Ｓと５０μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む
溶液中、４２℃で３時間プレハイブリダイズした。³²Ｐ
ラベルした１次プローブを上記バッファー中に加え、５
０℃で１６時間ハイブリダイズした。フィルターを、５
５℃で１×ＳＳＰＥ、１％ ＳＤＳ、さらに０．１×Ｓ
ＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳにより洗浄し、オートラジオ
グラフィーにより１個の陽性クローンを検出した（１次
スクリーニング）。

【００５３】（３）チャイニーズハムスター由来のＨＳ
６ＳＴｃＤＮＡ断片の塩基配列 １個の陽性クローンからのブルースクリプト プラスミ
ドを、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージとＥ．ｃｏｌ
ｉ ＳＯＬＲを使用するストラタジーンのｉｎｖｉｖｏ
ＤＮＡ切り出し法(Stratagene in vivo excision proto
col)により切り出した。ＳＯＬＲに導入されたブルース
クリプトプラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮプラスミドキ
ットを用いて精製した。導入されたｃＤＮＡのうち、
０．７ｋｂｐのクローンの塩基配列が決定された（Ｅｃ
ｏＲＩで処理して得られる断片の塩基配列を配列番号３
に示す）。塩基配列はSequenaseバージョン２．０を含
むｄＧＴＰ／ｄｅａｚａＧＴＰキット（U.S.バイオケミ
カル(Biochemical)製）を使用して確かめた。塩基配列
はコンピュータソフトウェアのジェネティックス-マッ
ク(GENETYX-MAC:ソフトウェアデベロプメント社製)によ
り編集、解析した。このクローンはオープンリーディン
グフレームの一部を有していることが明らかとなった。

【００５４】＜４＞ヒトＨＳ６ＳＴｃＤＮＡクローニン
グと塩基配列の決定 上記ＣＨＯ細胞から得られたＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片を
ＥｃｏＲＩで処理して得られた断片を２次プローブとし
て上記と同様の手法を用いてヒト胎児脳のλｇｔ１１ｃ
ＤＮＡライブラリーを導入したＥ．ｃｏｌｉ Ｙ１０８
８をスクリーニングした。その結果、１７個の陽性クロ
ーンが検出された（２次スクリーニング）。

【００５５】１．７ｋｂｐと２．０ｋｂｐの２つのクロ
ーンの塩基配列を決定し（配列番号１）、さらにこの配
列からコードされたアミノ酸配列を予測した（配列番号
２）。アミノ末端の配列に４つのイン・フレームのＡＴ
Ｇコドンが含まれた。最初のＡＴＧコドンの上流域−６
の場所に終止コドンのＴＧＡ配列が存在した。最初のＡ
ＴＧコドンから開始するオープンリーディングフレーム
からは４１０アミノ酸残基の４８，２４３Ｄａで２カ所
の糖結合可能域を持つタンパク質が予想された。このア
ミノ酸配列のハイドロパシープロットにより、ＨＳ６Ｓ
Ｔアミノ末端領域の１７番目から３１番目までの１５ア
ミノ酸残基が明確な疎水領域であるタイプIIの膜タンパ
ク質であることが判明した（図２）。このアミノ酸配列
を上記チャイニーズハムスター由来のＨＳ６ＳＴの部分
アミノ酸配列とその相当する部分で比較すると、その相
同性は、９７．４％であった（図３）。チャイニーズハ
ムスター由来のＨＳ６ＳＴ断片との相同性のある部分は
ヒトのＨＳ６ＳＴの膜貫通領域よりも細胞外寄りに位置
し、この位置（アミノ酸番号３４）から塩基配列で終止
コドンまでの領域の分子量を算出すると、４４，３８９
Ｄａとなった。この数値は、チャイニーズハムスター由
来のＨＳ６ＳＴをＮ−グリカナーゼ処理した際の分子量
とほぼ一致する。

【００５６】＜５＞マウスＨＳ６ＳＴｃＤＮＡクローニ
ングと塩基配列の決定 上記ＣＨＯのｃＤＮＡライブラリーから得られた２．０
ｋｂｐのＨＳ６ＳＴｃＤＮＡを２次プローブとして上記
と同様の手法を用いてマウス脳のλｇｔ１１ｃＤＮＡラ
イブラリーを導入したＥ．ｃｏｌｉ Ｙ１０８８をスク
リーニングした。その結果、２個の陽性クローンが検出
された（２次スクリーニング）。

【００５７】１．７ｋｂｐと２．１ｋｂｐの２つのクロ
ーンの塩基配列から、マウスＨＳ６ＳＴの全塩基配列を
決定し（配列番号６）、さらにこの配列からコードされ
たアミノ酸配列を予測した（配列番号７）。このアミノ
酸配列を上記ヒト由来のＨＳ６ＳＴの部分アミノ酸配列
とその相当する部分で比較すると、その相同性は、９０
％以上であった。

【００５８】＜６＞ニワトリＨＳ６ＳＴｃＤＮＡクロー
ニングと塩基配列の決定 上記ヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリーから得られた
２．０ｋｂｐのＨＳ６ＳＴｃＤＮＡを２次プローブとし
て上記と同様の手法を用いてニワトリ胚肢芽のλｇｔ１
１ｃＤＮＡライブラリーを導入したＥ．ｃｏｌｉ Ｙ１
０８８をスクリーニングした。その結果、１１個の陽性
クローンが検出された（２次スクリーニング）。

【００５９】陽性クローンのうち、１．６ｋｂｐと１．
７ｋｂｐの２つのクローンの塩基配列から、ニワトリＨ
Ｓ６ＳＴの全塩基配列を決定し（配列番号８）、さらに
この配列からコードされたアミノ酸配列を予測した（配
列番号９）。このアミノ酸配列を上記チャイニーズハム
スター由来のＨＳ６ＳＴの部分アミノ酸配列とその相当
する部分で比較すると、その相同性は、９０％以上であ
った。

【００６０】また、既に知られているＣＨＯ由来のＨＳ
２ＳＴのｃＤＮＡ（J. Biol. Chem.,272,21, 13980-139
85(1997)）をプローブとして使用し、上記手法と同様に
マウス脳のｃＤＮＡライブラリーから、ＨＳ２ＳＴのｃ
ＤＮＡの取得を試みた。マウス脳のλｇｔ１１ｃＤＮＡ
ライブラリーを導入したＥ．ｃｏｌｉ Ｙ１０８８をス
クリーニングした結果、４個の陽性クローンが検出され
（２次スクリーニング）、１．９ｋｂｐ、１．２ｋｂ
ｐ、１．３ｋｂｐ及び１．４ｋｂｐのそれぞれのクロー
ンの塩基配列からマウスのＨＳ２ＳＴの全塩基配列を決
定した（配列番号１９）。

【００６１】またさらに、ヒト由来のＨＳ２ＳＴのｃＤ
ＮＡ（日本結合組織学会 1997年6月5,6日）をプローブ
として使用し、上記手法と同様にニワトリ胚肢芽のｃＤ
ＮＡライブラリーからＨＳ２ＳＴのｃＤＮＡの取得を試
みた。ニワトリ胚肢芽のλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリ
ーを導入したＥ．ｃｏｌｉ Ｙ１０８８をスクリーニン
グした結果、８個の陽性クローンが検出され（２次スク
リーニング）、陽性クローンのうち、１．８ｋｂｐと
２．３ｋｂｐの２つのクローンの塩基配列からニワトリ
のＨＳ２ＳＴの全塩基配列を決定した（配列番号２
０）。マウス及びニワトリのＨＳ２ＳＴは、ＣＨＯ及び
ヒト由来のＨＳ２ＳＴと塩基配列で８０％以上、アミノ
酸配列で９０％以上の高い相同性を示した。

【００６２】＜７＞ヒト由来のＨＳ６ＳＴｃＤＮＡの発
現 （１）ＨＳ６ＳＴ発現プラスミドの構築 ＨＳ６ＳＴｃＤＮＡを発現させるために、発現ベクター
にｃＤＮＡ断片を挿入し、組換えプラスミドを構築し
た。単離したヒト由来のオープンリーディングフレーム
を含むｃＤＮＡを哺乳動物の発現ベクターｐＦＬＡＧ−
ＣＭＶ−２（イーストマン コダック製）のHindIII/Ec
oRI部位に導入した組換えプラスミドであるｐＦＬＡＧ
−ＣＭＶ−２ｈＨＳ６ＳＴを構築した。このプラスミド
は酵素などの活性を有さないタグとしての配列であるＦ
ＬＡＧとＨＳ６ＳＴの融合タンパク質を発現するように
構築されている。

【００６３】（２）ＣＯＳ−７細胞中でのＨＳ６ＳＴｃ
ＤＮＡのトランジェント（一過性）な発現 ＨＳ６ＳＴｃＤＮＡの発現の宿主にはＣＯＳ−７細胞を
用いた。

【００６４】ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ｈＨＳ６ＳＴをト
ランスフェクトした細胞を６７時間培養し、この細胞か
らHabuchi, H., Habuchi, O., and Kimata, K. (1995)
J. Biol. Chem. 270, 4172-4179に記載の方法に従って
細胞抽出液を調製した。この細胞抽出液を３０分間４
℃、１０，０００×ｇで遠心処理した後、上清画分のＨ
Ｓ６ＳＴ及びＨＳ２ＳＴ活性を調べた。対照としてｃＤ
ＮＡを含まないｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２をトランスフェ
クトしたＣＯＳ−７細胞と何もトランスフェクトしない
ＣＯＳ−７細胞を用いた。単離したヒト由来のｃＤＮＡ
を含むベクターをトランスフェクトすると、ＨＳ６ＳＴ
活性は何もトランスフェクトしない対照の約７倍に上が
っていた（表２）。なお、これらの活性の測定はHabuch
i, H., Habuchi, O., and Kimata, K. (1995) J. Biol.
Chem. 270, 4172-4179及びKobayashi, M., Habuchi,
H., Habuchi, O., Saito, M., and Kimata, K. (1996)
J. Biol. Chem. 271, 7645-7653に記載の方法に従って
行った。

【００６５】

【表２】 ──────────────────────────────────── 硫酸基転移酵素活性 ──────────────────── プラスミド HS6ST HS2ST ──────────────────────────────────── 細胞抽出液 pmol/min/mgタンパク質 pFLAG-CMV-2 2.4±0.2 4.8±0.2 pFLAG-CMV-2hHS6ST 17.9±0.5 3.9±0.2 細胞抽出液のFLAG アフィニティカラム吸着画分 pFLAG-CMV-2 ＜0.1 ＜0.1 pFLAG-CMV-2hHS6ST 3.9±0.2 ＜0.1 培養後の培地 pFLAG-CMV-2 16.7±0.4 2.1±0.2 pFLAG-CMV-2hHS6ST 62.4±0.1 3.8±0.6 培養後の培地のFLAG アフィニティカラム吸着画分 pFLAG-CMV-2 ND ND pFLAG-CMV-2hHS6ST ＜0.1 ＜0.1 ────────────────────────────────────

【００６６】表で示したように、上記で単離されたｃＤ
ＮＡを発現させるベクターを保持する細胞のＨＳ６ＳＴ
活性は対照のｃＤＮＡを保持しないプラスミドを導入し
た細胞の約７．５倍であった。これに対してＨＳ２ＳＴ
活性の増加は起こらなかった。これらの結果から、単離
されたｃＤＮＡがＨＳ６ＳＴ活性を持つタンパク質をコ
ードしていることが証明された。また、ＨＳ６ＳＴを導
入した細胞を培養した後の培地中のＨＳ６ＳＴ活性は、
対照と比較して約３．７倍に増加していた。しかし、こ
の培地のＦＬＡＧに対するアフィニティカラムへの吸着
画分にはＨＳ６ＳＴ活性が見られなかった。従って、上
記培地中にはＦＬＡＧとの融合タンパク質の形態ではな
く、細胞膜貫通領域で切断され、ＦＬＡＧを結合してい
ないＨＳ６ＳＴの細胞外領域のみが、ＨＳ６ＳＴ活性を
有する遊離体として可溶化された形態となっていること
が示唆された。

【００６７】＜８＞チャイニーズハムスター卵巣細胞ポ
リ(A)⁺ＲＮＡのノザンブロットによるＨＳ６ＳＴ発現の
解析 チャイニーズハムスター卵巣由来培養細胞株ＣＨＯから
抽出したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡをｐＨ７．０の５０％ ホ
ルムアミド（Ｖ／Ｖ）、６％ ホルムアルデヒド（Ｖ／
Ｖ）、２０ｍＭ ＭＯＰＳバッファーで６５℃、１０分
間変性し、６％ホルムアルデヒド（Ｖ／Ｖ）を含む１．
２％アガロースゲルで電気泳動を行った。５０ｍＭのＮ
ａＯＨで２０分間処理した後、２０×ＳＳＣ（酢酸ナト
リウム／塩化ナトリウム緩衝液）で４５分間中和し、ゲ
ル中のＲＮＡをHybond N⁺ナイロン膜に一晩転写し、５
０ｍＭのＮａＯＨで５分間固定した。膜上に固定された
ＲＮＡを４２℃で３時間、５０％ ホルムアルデヒド、
５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液(Denhardt's soluti
on)、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性させ
たサケ精子ＤＮＡを含む溶液中でプレハイブリダイズし
た。ハイブリダイズは³²Ｐラベルしたプローブ(1×10⁶c
pm/ml（上記＜３＞で得られたチャイニーズハムスター
由来のＨＳ６ＳＴ部分的ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理して
得られた断片）)を含む上記緩衝液で行った。この膜は
５０℃で１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳにより洗浄した
後、同温度で０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳによ
り洗浄した。この膜を−８０℃で１４時間、増感膜を用
いてＸ線フィルムに感光させた。その結果、４．０ｋｂ
のバンドが得られた。

【００６８】＜９＞インシチュハイブリダイゼーション
によるニワトリ胚におけるＨＳ６ＳＴ発現の確認 孵卵２〜５日のニワトリ胚を４％のパラホルムアルデヒ
ドを含むリン酸緩衝生理食塩水で常法に従って固定し
た。配列番号６記載の塩基配列のうち、PstI-EcoRI断片
（塩基番号945〜塩基番号1679からなる断片）を鋳型と
してＲＮＡポリメラーゼを用いて転写を行い、デゴキシ
ジェニンで標識したＲＮＡを合成してプローブとした。
このプローブを発生段階の異なるニワトリ胚にハイブリ
ダイズさせた後、アルカリホスファターゼを付加した抗
ディオキシジェニン抗体を反応させ、更にアルカリホス
ファターゼの基質を添加して発色させることによりｍＲ
ＮＡの発現部位を観察した。

【００６９】その結果、ＨＳ６ＳＴ遺伝子は脳の神経上
皮、頭部の神経冠細胞、肢芽、尾芽などで強く発現して
いることが判明した。

【００７０】

【発明の効果】本発明により、ヘパラン硫酸及びヘパリ
ンに含まれる６位が硫酸化されていないＮ−硫酸化グル
コサミン残基の６位の水酸基に硫酸基を選択的に転移す
るヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素（ＨＳ６ＳＴ）
のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡが
得られる。また更に該ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片から発現
されるポリペプチドが得られる。

【００７１】本発明により、ＨＳ６ＳＴのポリペプチド
をコードする塩基配列を有するＤＮＡが得られたので、
ＨＳ６ＳＴを工業的に使用可能な程度まで大量生産でき
ることが期待される。

【００７２】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：2051 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ヒト 組織の種類：胎児脳 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：112..1341 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：transmembrane domain 存在位置：159..204 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：898..906 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：1063..1071 特徴を決定した方法：S 配列 CGGCGCCGAG TAGCCGGGCC GGGCCGGAGC GCGGGCGCGG CGGAGGCAGC TGCGCCCGGC 60 TCCTCCCCTC CCAGGCCCCG CCCCCCGCCC GGGCCCCGGC GATGGTGACA C ATG CGG 117 Met Arg 1 CGG CGG CCG CGC GGC AGG ACC ATG GTT GAG CGC GCC AGC AAG TTC GTG 165 Arg Arg Pro Arg Gly Arg Thr Met Val Glu Arg Ala Ser Lys Phe Val 5 10 15 CTG GTG GTG GCG GGC TCG GTG TGC TTC ATG CTC ATC TTG TAC CAG TAC 213 Leu Val Val Ala Gly Ser Val Cys Phe Met Leu Ile Leu Tyr Gln Tyr 20 25 30 GCG GGC CCA GGA CTG AGC CTG GGC GCG CCC GGC GGC CGC GCG CCG CCC 261 Ala Gly Pro Gly Leu Ser Leu Gly Ala Pro Gly Gly Arg Ala Pro Pro 35 40 45 50 GAC GAC CTG TAC CTG TTC CCC ACG CCC GAC CCC CAC TAC GAG AAG AAG 309 Asp Asp Leu Tyr Leu Phe Pro Thr Pro Asp Pro His Tyr Glu Lys Lys 55 60 65 TAC TAC TTC CCG GTC CGC GAG CTG GAG CGC TCG CTG CGC TTC GAC ATG 357 Tyr Tyr Phe Pro Val Arg Glu Leu Glu Arg Ser Leu Arg Phe Asp Met 70 75 80 AAG GGC GAC GAC GTG ATC GTC TTC CTG CAC ATC CAG AAG ACG GGC GGC 405 Lys Gly Asp Asp Val Ile Val Phe Leu His Ile Gln Lys Thr Gly Gly 85 90 95 ACC ACC TTC GGC CGC CAC CTC GTG CAG AAC GTA CGC CTC GAG GTG CCG 453 Thr Thr Phe Gly Arg His Leu Val Gln Asn Val Arg Leu Glu Val Pro 100 105 110 TGC GAC TGC CGG CCC GGC CAG AAG AAG TGC ACC TGC TAC CGG CCC AAC 501 Cys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Lys Lys Cys Thr Cys Tyr Arg Pro Asn 115 120 125 130 CGC CGC GAG ACT TGG CTC TTC TCC CGC TTC TCC ACC GGC TGG AGC TGC 549 Arg Arg Glu Thr Trp Leu Phe Ser Arg Phe Ser Thr Gly Trp Ser Cys 135 140 145 GGG CTG CAC GCC GAC TGG ACC GAG CTC ACC AAC TGC GTG CCC GGC GTG 597 Gly Leu His Ala Asp Trp Thr Glu Leu Thr Asn Cys Val Pro Gly Val 150 155 160 CTG GAC CGC CGC GAC TCC GCC GCG CTG CGC ACG CCC AGG AAG TTC TAC 645 Leu Asp Arg Arg Asp Ser Ala Ala Leu Arg Thr Pro Arg Lys Phe Tyr 165 170 175 TAC ATC ACC CTG CTA CGA GAC CCC GTG TCC CGC TAC CTG AGC GAG TGG 693 Tyr Ile Thr Leu Leu Arg Asp Pro Val Ser Arg Tyr Leu Ser Glu Trp 180 185 190 CGG CAT GTG CAG AGG GGT GCC ACG TGG AAG ACG TCT TTG CAT ATG TGT 741 Arg His Val Gln Arg Gly Ala Thr Trp Lys Thr Ser Leu His Met Cys 195 200 205 210 GAT GGG CGC ACG CCC ACG CCT GAG GAG CTG CCG CCC TGC TAC GAG GGC 789 Asp Gly Arg Thr Pro Thr Pro Glu Glu Leu Pro Pro Cys Tyr Glu Gly 215 220 225 ACG GAC TGG TCG GGC TGC ACG CTA CAG GAG TTC ATG GAC TGC CCG TAC 837 Thr Asp Trp Ser Gly Cys Thr Leu Gln Glu Phe Met Asp Cys Pro Tyr 230 235 240 AAC CTG GCC AAC AAC CGC CAG GTG CGC ATG CTG GCC GAC CTG AGC CTG 885 Asn Leu Ala Asn Asn Arg Gln Val Arg Met Leu Ala Asp Leu Ser Leu 245 250 255 GTG GGC TGC TAC AAC CTG TCC TTC ATC CCC GAG GGC AAG CGG GCC CAG 933 Val Gly Cys Tyr Asn Leu Ser Phe Ile Pro Glu Gly Lys Arg Ala Gln 260 265 270 CTG CTG CTC GAG AGC GCC AAG AAG AAC CTG CGG GGC ATG GCC TTC TTC 981 Leu Leu Leu Glu Ser Ala Lys Lys Asn Leu Arg Gly Met Ala Phe Phe 275 280 285 290 GGC CTG ACC GAG TTC CAG CGC AAG ACG CAG TAC CTG TTC GAG CGG ACG 1029 Gly Leu Thr Glu Phe Gln Arg Lys Thr Gln Tyr Leu Phe Glu Arg Thr 295 300 305 TTC AAC CTC AAG TTC ATC CGG CCC TTC ATG CAG TAC AAT AGC ACG CGG 1077 Phe Asn Leu Lys Phe Ile Arg Pro Phe Met Gln Tyr Asn Ser Thr Arg 310 315 320 GCG GGC GGC GTG GAG GTG GAT GAA GAC ACC ATC CGG CGC ATC GAG GAG 1125 Ala Gly Gly Val Glu Val Asp Glu Asp Thr Ile Arg Arg Ile Glu Glu 325 330 335 CTC AAC GAC CTG GAC ATG CAG CTG TAC GAC TAC GCC AAG GAC CTC TTC 1173 Leu Asn Asp Leu Asp Met Gln Leu Tyr Asp Tyr Ala Lys Asp Leu Phe 340 345 350 CAG CAG CGC TAC CAG TAC AAG CGG CAG CTG GAG CGC AGG GAG CAG CGC 1221 Gln Gln Arg Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Leu Glu Arg Arg Glu Gln Arg 355 360 365 370 CTG AGG AGC CGC GAG GAG CGT CTG CTG CAC CGG GCC AAG GAG GCA CTG 1269 Leu Arg Ser Arg Glu Glu Arg Leu Leu His Arg Ala Lys Glu Ala Leu 375 380 385 CCG CGG GAG GAT GCC GAC GAG CCG GGC CGC GTG CCC ACC GAG GAC TAC 1317 Pro Arg Glu Asp Ala Asp Glu Pro Gly Arg Val Pro Thr Glu Asp Tyr 390 395 400 ATG AGC CAC ATC ATT GAG AAG TGG TAGTGGCGGT GGTGGCCACG GGGAGGCCTC 1371 Met Ser His Ile Ile Glu Lys Trp 405 410 TTGGGGGGTG TGGGGGATAA AACAGGACAG ACGACAGGTC CACCCAAGAC TGTCAAGGGA 1431 TGAGCATCCC AAACCTGCTC CACAGAGGTA GCTGCGTCCT GAAAAAAAAC AGAGCAGGGA 1491 TGTAGTGGGG CTGGGCAGGG ATGGGGGCTT GAGAAATCAA CAGGTGCAGC CCAGTGGGTC 1551 AGAGGAAAGC GTGCTCGAAG GATGCCATGG TCAGGGCAGG GCCTCCAGAG CAGGTGTTGT 1611 GCCTGGAGCT GCTCTCCTGG CCTCCTTGGA TTTATCGCAA AAACTGAAGG TTTGCGCAAG 1671 AGACGAGGAC AGCGGAAAGT GGACCTGCCA GGCCGGGAGT GTGTCCCTCA CCAACTATGC 1731 ACACAGCACT CGCTCTTAAC TCCTCTGTCC GGGCTACTAG GAGTGAGACC AGCTTCTGGC 1791 AACTGCCCCA GCTCCAGGCC ATCCCATAGC CCCTCCTCTT CTGGCTGCCC CCAATGCCCC 1851 GAGGCCTGGG GAGCCCCCAG CTCACCCATC TGTAGCTCCC TCAAAGTCAG GGCCCACCCC 1911 ATCTGAGGCA GAGAAGACTC GAGTCCAGCC CCCAGGAAGC CTGCTCCCCT CTCTGGCCCA 1971 TGGTCCTGCT TCATGCTTTG GGTCAGGAGG CCAAAGCTGA TGTTCAGGCC CCACCCACTC 2031 CCTACAGTCC TCAGACCCCG 2051

【００７３】配列番号：2 配列の長さ：410 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Arg Arg Arg Pro Arg Gly Arg Thr Met Val Glu Arg Ala Ser Lys 1 5 10 15 Phe Val Leu Val Val Ala Gly Ser Val Cys Phe Met Leu Ile Leu Tyr 20 25 30 Gln Tyr Ala Gly Pro Gly Leu Ser Leu Gly Ala Pro Gly Gly Arg Ala 35 40 45 Pro Pro Asp Asp Leu Tyr Leu Phe Pro Thr Pro Asp Pro His Tyr Glu 50 55 60 Lys Lys Tyr Tyr Phe Pro Val Arg Glu Leu Glu Arg Ser Leu Arg Phe 65 70 75 80 Asp Met Lys Gly Asp Asp Val Ile Val Phe Leu His Ile Gln Lys Thr 85 90 95 Gly Gly Thr Thr Phe Gly Arg His Leu Val Gln Asn Val Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Cys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Lys Lys Cys Thr Cys Tyr Arg 115 120 125 Pro Asn Arg Arg Glu Thr Trp Leu Phe Ser Arg Phe Ser Thr Gly Trp 130 135 140 Ser Cys Gly Leu His Ala Asp Trp Thr Glu Leu Thr Asn Cys Val Pro 145 150 155 160 Gly Val Leu Asp Arg Arg Asp Ser Ala Ala Leu Arg Thr Pro Arg Lys 165 170 175 Phe Tyr Tyr Ile Thr Leu Leu Arg Asp Pro Val Ser Arg Tyr Leu Ser 180 185 190 Glu Trp Arg His Val Gln Arg Gly Ala Thr Trp Lys Thr Ser Leu His 195 200 205 Met Cys Asp Gly Arg Thr Pro Thr Pro Glu Glu Leu Pro Pro Cys Tyr 210 215 220 Glu Gly Thr Asp Trp Ser Gly Cys Thr Leu Gln Glu Phe Met Asp Cys 225 230 235 240 Pro Tyr Asn Leu Ala Asn Asn Arg Gln Val Arg Met Leu Ala Asp Leu 245 250 255 Ser Leu Val Gly Cys Tyr Asn Leu Ser Phe Ile Pro Glu Gly Lys Arg 260 265 270 Ala Gln Leu Leu Leu Glu Ser Ala Lys Lys Asn Leu Arg Gly Met Ala 275 280 285 Phe Phe Gly Leu Thr Glu Phe Gln Arg Lys Thr Gln Tyr Leu Phe Glu 290 295 300 Arg Thr Phe Asn Leu Lys Phe Ile Arg Pro Phe Met Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Arg Ala Gly Gly Val Glu Val Asp Glu Asp Thr Ile Arg Arg Ile 325 330 335 Glu Glu Leu Asn Asp Leu Asp Met Gln Leu Tyr Asp Tyr Ala Lys Asp 340 345 350 Leu Phe Gln Gln Arg Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Leu Glu Arg Arg Glu 355 360 365 Gln Arg Leu Arg Ser Arg Glu Glu Arg Leu Leu His Arg Ala Lys Glu 370 375 380 Ala Leu Pro Arg Glu Asp Ala Asp Glu Pro Gly Arg Val Pro Thr Glu 385 390 395 400 Asp Tyr Met Ser His Ile Ile Glu Lys Trp 405 410

【００７４】配列番号：3 配列の長さ：710 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：チャイニーズハムスター 組織の種類：卵巣 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：680..688 特徴を決定した方法：S 配列 T CCG GGG CTG AGC CTG GGC GCG CCC GGT GGC CGT GCG CCA CCC GAC 46 Pro Gly Leu Ser Leu Gly Ala Pro Gly Gly Arg Ala Pro Pro Asp 1 5 10 15 GAC CTG GAT CTC TTC CCC ACG CCG GAC CCA CAT TAC GAG AAA AAG TAC 94 Asp Leu Asp Leu Phe Pro Thr Pro Asp Pro His Tyr Glu Lys Lys Tyr 20 25 30 TAC TTC CCG GTG CGC GAG CTG GAG CGC TCG CTG CGC TTC GAC ATG AAG 142 Tyr Phe Pro Val Arg Glu Leu Glu Arg Ser Leu Arg Phe Asp Met Lys 35 40 45 GGC GAC GAT GTG ATC GTC TTC CTG CAC ATC CAG AAG ACC GGC GGC ACC 190 Gly Asp Asp Val Ile Val Phe Leu His Ile Gln Lys Thr Gly Gly Thr 50 55 60 ACC TTC GGT CGC CAC CTT GTG CAG AAC GTG CGC CTC GAG GTG CCC TGC 238 Thr Phe Gly Arg His Leu Val Gln Asn Val Arg Leu Glu Val Pro Cys 65 70 75 GAC TGT CGG CCC GGC CAG AAG AAG TGC ACC TGC TAT CGG CCC AAC CGC 286 Asp Cys Arg Pro Gly Gln Lys Lys Cys Thr Cys Tyr Arg Pro Asn Arg 80 85 90 95 CGC GAG ACG TGG CTC TTT TCT CGC TTC TCC ACC GGC TGG AGC TGC GGA 334 Arg Glu Thr Trp Leu Phe Ser Arg Phe Ser Thr Gly Trp Ser Cys Gly 100 105 110 CTG CAT GCT GAC TGG ACC GAA CTC ACC AAC TGT GTG CCC GGT GTG CTA 382 Leu His Ala Asp Trp Thr Glu Leu Thr Asn Cys Val Pro Gly Val Leu 115 120 125 GAC CGC CGC GAC CCA GCA GGT TTG CGT TCG CCC AGG AAA TTT TAC TAC 430 Asp Arg Arg Asp Pro Ala Gly Leu Arg Ser Pro Arg Lys Phe Tyr Tyr 130 135 140 ATC ATT TTA GTG CGA GAC CCA GTA TCC CGC TAC CTG AGT GAG TGG CGA 478 Ile Ile Leu Val Arg Asp Pro Val Ser Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Arg 145 150 155 CAT GTA CAG CGT GGA GCC ACG TGG AAG ACC TCA CTG CAC ATG TGT GAT 526 His Val Gln Arg Gly Ala Thr Trp Lys Thr Ser Leu His Met Cys Asp 160 165 170 175 GGG CGC ACA CCA ACT CCA GAG GAG CTG CCG CCC TGC TAC GAG GGC ACA 574 Gly Arg Thr Pro Thr Pro Glu Glu Leu Pro Pro Cys Tyr Glu Gly Thr 180 185 190 GAC TGG TCA GGC TGC ACG CTG CAG GAG TTC ATG GAT TGC CCT TAC AAC 622 Asp Trp Ser Gly Cys Thr Leu Gln Glu Phe Met Asp Cys Pro Tyr Asn 195 200 205 CTG GCC AAC AAC CGG CAG GTG CGC ATG CTG GCT GAC CTC AGC CTG GTG 670 Leu Ala Asn Asn Arg Gln Val Arg Met Leu Ala Asp Leu Ser Leu Val 210 215 220 GGC TGC TAC AAC CTG TCC TTC ATC CCC GAG AGA GCG GCC G 710 Gly Cys Tyr Asn Leu Ser Phe Ile Pro Glu Arg Ala Ala 225 230 235

【００７５】配列番号：4 配列の長さ：236 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Pro Gly Leu Ser Leu Gly Ala Pro Gly Gly Arg Ala Pro Pro Asp Asp 1 5 10 15 Leu Asp Leu Phe Pro Thr Pro Asp Pro His Tyr Glu Lys Lys Tyr Tyr 20 25 30 Phe Pro Val Arg Glu Leu Glu Arg Ser Leu Arg Phe Asp Met Lys Gly 35 40 45 Asp Asp Val Ile Val Phe Leu His Ile Gln Lys Thr Gly Gly Thr Thr 50 55 60 Phe Gly Arg His Leu Val Gln Asn Val Arg Leu Glu Val Pro Cys Asp 65 70 75 80 Cys Arg Pro Gly Gln Lys Lys Cys Thr Cys Tyr Arg Pro Asn Arg Arg 85 90 95 Glu Thr Trp Leu Phe Ser Arg Phe Ser Thr Gly Trp Ser Cys Gly Leu 100 105 110 His Ala Asp Trp Thr Glu Leu Thr Asn Cys Val Pro Gly Val Leu Asp 115 120 125 Arg Arg Asp Pro Ala Gly Leu Arg Ser Pro Arg Lys Phe Tyr Tyr Ile 130 135 140 Ile Leu Val Arg Asp Pro Val Ser Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Arg His 145 150 155 160 Val Gln Arg Gly Ala Thr Trp Lys Thr Ser Leu His Met Cys Asp Gly 165 170 175 Arg Thr Pro Thr Pro Glu Glu Leu Pro Pro Cys Tyr Glu Gly Thr Asp 180 185 190 Trp Ser Gly Cys Thr Leu Gln Glu Phe Met Asp Cys Pro Tyr Asn Leu 195 200 205 Ala Asn Asn Arg Gln Val Arg Met Leu Ala Asp Leu Ser Leu Val Gly 210 215 220 Cys Tyr Asn Leu Ser Phe Ile Pro Glu Arg Ala Ala 225 230 235

【００７６】配列番号：5 配列の長さ：236 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Pro Gly Leu Ser Leu Gly Ala Pro Gly Gly Arg Ala Pro Pro Asp Asp 1 5 10 15 Leu Xaa Leu Phe Pro Thr Pro Asp Pro His Tyr Glu Lys Lys Tyr Tyr 20 25 30 Phe Pro Val Arg Glu Leu Glu Arg Ser Leu Arg Phe Asp Met Lys Gly 35 40 45 Asp Asp Val Ile Val Phe Leu His Ile Gln Lys Thr Gly Gly Thr Thr 50 55 60 Phe Gly Arg His Leu Val Gln Asn Val Arg Leu Glu Val Pro Cys Asp 65 70 75 80 Cys Arg Pro Gly Gln Lys Lys Cys Thr Cys Tyr Arg Pro Asn Arg Arg 85 90 95 Glu Thr Trp Leu Phe Ser Arg Phe Ser Thr Gly Trp Ser Cys Gly Leu 100 105 110 His Ala Asp Trp Thr Glu Leu Thr Asn Cys Val Pro Gly Val Leu Asp 115 120 125 Arg Arg Asp Xaa Ala Xaa Leu Arg Xaa Pro Arg Lys Phe Tyr Tyr Ile 130 135 140 Xaa Leu Xaa Arg Asp Pro Val Ser Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Arg His 145 150 155 160 Val Gln Arg Gly Ala Thr Trp Lys Thr Ser Leu His Met Cys Asp Gly 165 170 175 Arg Thr Pro Thr Pro Glu Glu Leu Pro Pro Cys Tyr Glu Gly Thr Asp 180 185 190 Trp Ser Gly Cys Thr Leu Gln Glu Phe Met Asp Cys Pro Tyr Asn Leu 195 200 205 Ala Asn Asn Arg Gln Val Arg Met Leu Ala Asp Leu Ser Leu Val Gly 210 215 220 Cys Tyr Asn Leu Ser Phe Ile Pro Glu Xaa Xaa Xaa 225 230 235

【００７７】配列番号：6 配列の長さ：1959 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 組織の種類：脳 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：279..1482 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：transmembrane domain 存在位置：301..345 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：1039..1047 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：1204..1212 特徴を決定した方法：S 配列 GCGGGTGCGG GCGCGCGCGG CTGCGGGGCG CTGTGGCGGG GGCCGGGCTG TACGCTAGCC 60 GAGCCGGGAT CGGGGCGGGG AGCAGCCACG GCGCCGCCGA GGCCCGGGGC CCGCGACGCT 120 GCGCACAGCC TGGGCGCCGA GTAGCCGGGC CGGGCCGGAC GCGGGCGGCG GTGGCGGCGG 180 CGGTGGCGGA GCAGCTGCGC CCCCCGCCCT CCCAAGGCCC GGCGCCCGGG CCGCTGGCGA 240 TGGTGACACA TGCGGCGGCG GCGCGCCGGC GGCAGGACC ATG GTT GAG CGC GCC 294 Met Val Glu Arg Ala 1 5 AGC AAG TTC GTG CTG GTG GTG GCG GGC TCG GCG TGC TTC ATG CTC ATC 342 Ser Lys Phe Val Leu Val Val Ala Gly Ser Ala Cys Phe Met Leu Ile 10 15 20 CTT TAC CAG TAC GCG GGC CCG GGG CTG AGT CTG GGC GCG CCC GGT GGC 390 Leu Tyr Gln Tyr Ala Gly Pro Gly Leu Ser Leu Gly Ala Pro Gly Gly 25 30 35 CGC GTG CCC CCC GAC GAC CTG GAT CTC TTC CCC ACG CCG GAC CCA CAT 438 Arg Val Pro Pro Asp Asp Leu Asp Leu Phe Pro Thr Pro Asp Pro His 40 45 50 TAC GAG AAA AAG TAC TAC TTC CCG GTG CGC GAG CTG GAG CGC TCG CTG 486 Tyr Glu Lys Lys Tyr Tyr Phe Pro Val Arg Glu Leu Glu Arg Ser Leu 55 60 65 CGC TTC GAC ATG AAG GGC GAC GAC GTG ATC GTC TTC CTG CAC ATC CAG 534 Arg Phe Asp Met Lys Gly Asp Asp Val Ile Val Phe Leu His Ile Gln 70 75 80 85 AAG ACC GGC GGC ACC ACC TTC GGC CGC CAC CTA GTG CAG AAC GTG CGC 582 Lys Thr Gly Gly Thr Thr Phe Gly Arg His Leu Val Gln Asn Val Arg 90 95 100 CTC GAG GTG CCC TGC GAC TGT CGC CCG GGC CAG AAG AAG TGC ACC TGC 630 Leu Glu Val Pro Cys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Lys Lys Cys Thr Cys 105 110 115 TAT CGG CCC AAT CGC CGC GAG ACC TGG CTC TTC TCT CGC TTC TCC ACG 678 Tyr Arg Pro Asn Arg Arg Glu Thr Trp Leu Phe Ser Arg Phe Ser Thr 120 125 130 GGC TGG AGC TGC GGG CTG CAC GCT GAC TGG ACC GAA CTC ACC AAC TGT 726 Gly Trp Ser Cys Gly Leu His Ala Asp Trp Thr Glu Leu Thr Asn Cys 135 140 145 GTG CCC GGT GTG CTA GAC CGC CGC GAC CCA GCA GGT CTG CGT TCG CCC 774 Val Pro Gly Val Leu Asp Arg Arg Asp Pro Ala Gly Leu Arg Ser Pro 150 155 160 165 AGA AAG TTC TAC TAC ATC ACC CTG CTG CGA GAC CCC GTA TCC CGC TAC 822 Arg Lys Phe Tyr Tyr Ile Thr Leu Leu Arg Asp Pro Val Ser Arg Tyr 170 175 180 CTG AGT GAA TGG CGA CAT GTA CAG CGT GGG GCC ACG TGG AAG ACC TCC 870 Leu Ser Glu Trp Arg His Val Gln Arg Gly Ala Thr Trp Lys Thr Ser 185 190 195 TTG CAC ATG TGT GAC GGG CGC ACA CCG ACC CCA GAG GAG CTG CCG CCC 918 Leu His Met Cys Asp Gly Arg Thr Pro Thr Pro Glu Glu Leu Pro Pro 200 205 210 TGC TAC GAG GGC ACA GAC TGG TCG GGC TGC ACG TTG CAG GAG TTC ATG 966 Cys Tyr Glu Gly Thr Asp Trp Ser Gly Cys Thr Leu Gln Glu Phe Met 215 220 225 GAT TGC CCC TAT AAC CTG GCT AAC AAC CGG CAG GTG CGC ATG CTG GCC 1014 Asp Cys Pro Tyr Asn Leu Ala Asn Asn Arg Gln Val Arg Met Leu Ala 230 235 240 245 GAC CTC AGC CTG GTG GGC TGC TAC CAC CTA TCT TTC ATC CCC GAG AGC 1062 Asp Leu Ser Leu Val Gly Cys Tyr His Leu Ser Phe Ile Pro Glu Ser 250 255 260 AAG CGG GCC CAG TTG CTG CTG GAG AGC GCC AAG AAG AAC CTG CGA GGC 1110 Lys Arg Ala Gln Leu Leu Leu Glu Ser Ala Lys Lys Asn Leu Arg Gly 265 270 275 ATG GCC TTC TTC GGC CTC ACT GAG TCC CAG CGC AAG ACG CAG CAC CTA 1158 Met Ala Phe Phe Gly Leu Thr Glu Ser Gln Arg Lys Thr Gln His Leu 280 285 290 TTT GAG CGG ACG TTC AAC CTC AAG TTC ATC CGG CCA TTC ATG CAA TAC 1206 Phe Glu Arg Thr Phe Asn Leu Lys Phe Ile Arg Pro Phe Met Gln Tyr 295 300 305 ATC AGC ACG CGG GCG GGC GGT GTG GAG GTG GAT GAG GAC ACT ATC CGC 1254 Ile Ser Thr Arg Ala Gly Gly Val Glu Val Asp Glu Asp Thr Ile Arg 310 315 320 325 CAC ATC GAG GAG CTC AAC GAC CTG GAC ATG CAG CTG TAT GAC TAT GCC 1302 His Ile Glu Glu Leu Asn Asp Leu Asp Met Gln Leu Tyr Asp Tyr Ala 330 335 340 AAG GAC CTC TTT CAG CAG CGT TAC CAG TAC AAG AGA CAG CTG GAG CGC 1350 Lys Asp Leu Phe Gln Gln Arg Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Leu Glu Arg 345 350 355 AGG GAA CAG CGC CTG CGC AAT CGC GAA GAG CGC CTC CTG CAC CGC TCC 1398 Arg Glu Gln Arg Leu Arg Asn Arg Glu Glu Arg Leu Leu His Arg Ser 360 365 370 AAG GAA GCG CTG CCA CGG GAG GAC CCA GAA GAG CCG GGC CGT GTG CCC 1446 Lys Glu Ala Leu Pro Arg Glu Asp Pro Glu Glu Pro Gly Arg Val Pro 375 380 385 ACC GAG GAC TAC ATG AGC CAT ATC ATT GAG AAG TGG TAGTAG TGTCAGGGGC 1498 Thr Glu Asp Tyr Met Ser His Ile Ile Glu Lys Trp 390 395 400 AGAGAGTGAT GGGCACGATT TAACAGGGAA AGAAATGGGG CCAACAGTTC TTCCTGTTCG 1558 GTGCAGCGGG TGCTAGTAGG ATGCCCTAGT CCTTGATGGG GCAGGGTAGG ACCTCTGGGG 1618 CAGATGGCCT CCCTGCTCTT CTGGCCCCCA TGTCATAGTT AAAACTGACA AGGGATTTGA 1678 AAAAGACTGG CGAGGGAACG TGTCTGCTTA GCCGAGACTC CCATACCTAC TATGCACGCA 1738 CTGGCCCCCA ACGACCAGCC CCCTAGGAAC GTGTTACTAG CTCCTAATAG CTTGGTTGAA 1798 GCTCCTTGGC CTCTGAGGAC CCCTAATAAC CCAGAATGCT TGGGGAGCCC TTTCCTTTGA 1858 GAATACAAGC ATGTCTCTGA GGCATCCTCA GACCTGGAGT GCTCCCCAAC CCCCACCTAT 1918 CAAAGCTGCT TTCAAGGTCA GGGTCAGCCC CAGCTGTGGC A 1959

【００７８】配列番号：7 配列の長さ：401 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Val Glu Arg Ala Ser Lys Phe Val Leu Val Val Ala Gly Ser Ala 1 5 10 15 Cys Phe Met Leu Ile Leu Tyr Gln Tyr Ala Gly Pro Gly Leu Ser Leu 20 25 30 Gly Ala Pro Gly Gly Arg Val Pro Pro Asp Asp Leu Asp Leu Phe Pro 35 40 45 Thr Pro Asp Pro His Tyr Glu Lys Lys Tyr Tyr Phe Pro Val Arg Glu 50 55 60 Leu Glu Arg Ser Leu Arg Phe Asp Met Lys Gly Asp Asp Val Ile Val 65 70 75 80 Phe Leu His Ile Gln Lys Thr Gly Gly Thr Thr Phe Gly Arg His Leu 85 90 95 Val Gln Asn Val Arg Leu Glu Val Pro Cys Asp Cys Arg Pro Gly Gln 100 105 110 Lys Lys Cys Thr Cys Tyr Arg Pro Asn Arg Arg Glu Thr Trp Leu Phe 115 120 125 Ser Arg Phe Ser Thr Gly Trp Ser Cys Gly Leu His Ala Asp Trp Thr 130 135 140 Glu Leu Thr Asn Cys Val Pro Gly Val Leu Asp Arg Arg Asp Pro Ala 145 150 155 160 Gly Leu Arg Ser Pro Arg Lys Phe Tyr Tyr Ile Thr Leu Leu Arg Asp 165 170 175 Pro Val Ser Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Arg His Val Gln Arg Gly Ala 180 185 190 Thr Trp Lys Thr Ser Leu His Met Cys Asp Gly Arg Thr Pro Thr Pro 195 200 205 Glu Glu Leu Pro Pro Cys Tyr Glu Gly Thr Asp Trp Ser Gly Cys Thr 210 215 220 Leu Gln Glu Phe Met Asp Cys Pro Tyr Asn Leu Ala Asn Asn Arg Gln 225 230 235 240 Val Arg Met Leu Ala Asp Leu Ser Leu Val Gly Cys Tyr His Leu Ser 245 250 255 Phe Ile Pro Glu Ser Lys Arg Ala Gln Leu Leu Leu Glu Ser Ala Lys 260 265 270 Lys Asn Leu Arg Gly Met Ala Phe Phe Gly Leu Thr Glu Ser Gln Arg 275 280 285 Lys Thr Gln His Leu Phe Glu Arg Thr Phe Asn Leu Lys Phe Ile Arg 290 295 300 Pro Phe Met Gln Tyr Ile Ser Thr Arg Ala Gly Gly Val Glu Val Asp 305 310 315 320 Glu Asp Thr Ile Arg His Ile Glu Glu Leu Asn Asp Leu Asp Met Gln 325 330 335 Leu Tyr Asp Tyr Ala Lys Asp Leu Phe Gln Gln Arg Tyr Gln Tyr Lys 340 345 350 Arg Gln Leu Glu Arg Arg Glu Gln Arg Leu Arg Asn Arg Glu Glu Arg 355 360 365 Leu Leu His Arg Ser Lys Glu Ala Leu Pro Arg Glu Asp Pro Glu Glu 370 375 380 Pro Gly Arg Val Pro Thr Glu Asp Tyr Met Ser His Ile Ile Glu Lys 385 390 395 400 Trp

【００７９】配列番号：8 配列の長さ：1664 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ニワトリ胚 組織の種類：肢芽 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：258..1470 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：transmembrane domain 存在位置：289..333 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：1027..1035 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：1192..1200 特徴を決定した方法：S 配列 CGCGGCCTGC GCAGCGGCTG GCTGCCGGCT GTCCTGCCCG GCCCGGCCCG GCCCGGTGCC 60 CGCGGCGCGG TGCTGCGGGG CGGGCGGCGC GCGGAGCGAG GCGGGGAGCA GCGGCCCCGC 120 AGCGGCGGGG GGAGGCGGCT GGCAGCGGGC GGGCGGGCAG GCAGGCAGGC AGCGTTGCCC 180 GGCTCCGCCG CCCGCCCCCG GCCCCGCCGC CCGCCCAGCG CCGGCGGCCC CGGGAGATGG 240 TGACACATGA AGCGCGCGGG GAGGACC ATG GTT GAG AGG ACC AGC AAG TTC CTG 294 Met Val Glu Arg Thr Ser Lys Phe Leu 1 5 CTG ATC GTG GCC GCG TCC GTG TGC TTC ATG CTC ATC CTG TAC CAG TAC 342 Leu Ile Val Ala Ala Ser Val Cys Phe Met Leu Ile Leu Tyr Gln Tyr 10 15 20 25 GTG GGG CCG GGG CTG AGC CTG GGC GCG CCC AGC GGC CGC CCC TAC GCC 390 Val Gly Pro Gly Leu Ser Leu Gly Ala Pro Ser Gly Arg Pro Tyr Ala 30 35 40 GAG GAG CCG GAC CTG TTC CCC ACG CCG GAC CCG CAC TAC GTG AAG AAG 438 Glu Glu Pro Asp Leu Phe Pro Thr Pro Asp Pro His Tyr Val Lys Lys 45 50 55 TAC TAC TTC CCG GTG CGC GAG CTG GAG CGG GAG CTC GCC TTC GAC ATG 486 Tyr Tyr Phe Pro Val Arg Glu Leu Glu Arg Glu Leu Ala Phe Asp Met 60 65 70 AAG GGC GAG GAC GTG ATC GTG TTC CTG CAC ATC CAG AAG ACG GGC GGC 534 Lys Gly Glu Asp Val Ile Val Phe Leu His Ile Gln Lys Thr Gly Gly 75 80 85 ACC ACC TTC GGC CGC CAC CTG GTG CAG AAC GTG CGC CTG GAG GTG CCC 582 Thr Thr Phe Gly Arg His Leu Val Gln Asn Val Arg Leu Glu Val Pro 90 95 100 105 TGC GAC TGC CGG CCC GGC CAG AAG AAG TGC ACC TGC TAC CGC CCC AAC 630 Cys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Lys Lys Cys Thr Cys Tyr Arg Pro Asn 110 115 120 CGC CGC GAG ACC TGG CTC TTC TCC CGC TTC TCC ACC GGC TGG AGC TGC 678 Arg Arg Glu Thr Trp Leu Phe Ser Arg Phe Ser Thr Gly Trp Ser Cys 125 130 135 GGG CTG CAC GCC GAC TGG ACC GAG CTC ACC AAC TGC GTG CCC GGC GTG 726 Gly Leu His Ala Asp Trp Thr Glu Leu Thr Asn Cys Val Pro Gly Val 140 145 150 CTG GGC CGC CGC GAG AGC GCG CCC AAC CGG ACG CCC AGA AAA TTT TAC 774 Leu Gly Arg Arg Glu Ser Ala Pro Asn Arg Thr Pro Arg Lys Phe Tyr 155 160 165 TAC ATC ACA CTG CTG AGA GAC CCC GTA TCT CGT TAC CTC AGC GAA TGG 822 Tyr Ile Thr Leu Leu Arg Asp Pro Val Ser Arg Tyr Leu Ser Glu Trp 170 175 180 185 CGG CAC GTC CAG CGA GGA GCC ACC TGG AAG ACC TCC TTG CAC ATG TGT 870 Arg His Val Gln Arg Gly Ala Thr Trp Lys Thr Ser Leu His Met Cys 190 195 200 GAT GGC AGG ACG CCG ACT CCC GAA GAG CTG CCA TCG TGC TAT GAG GGC 918 Asp Gly Arg Thr Pro Thr Pro Glu Glu Leu Pro Ser Cys Tyr Glu Gly 205 210 215 ACG GAC TGG TCA GGC TGC ACG CTG CAG GAG TTC ATG GAT TGC CCC TAT 966 Thr Asp Trp Ser Gly Cys Thr Leu Gln Glu Phe Met Asp Cys Pro Tyr 220 225 230 AAC TTG GCC AAT AAC CGC CAG GTG AGG ATG TTG GCC GAC TTG AGC CTG 1014 Asn Leu Ala Asn Asn Arg Gln Val Arg Met Leu Ala Asp Leu Ser Leu 235 240 245 GTG GGC TGC TAC AAC ATG TCT TTC ATC CCA GAG AAC AAG CGA GCA CAG 1062 Val Gly Cys Tyr Asn Met Ser Phe Ile Pro Glu Asn Lys Arg Ala Gln 250 255 260 265 ATC CTG CTG GAG AGC GCA AAA AAG AAC CTC AAA GAC ATG GCC TTC TTC 1110 Ile Leu Leu Glu Ser Ala Lys Lys Asn Leu Lys Asp Met Ala Phe Phe 270 275 280 GGC CTG ACA GAG TTC CAG AGA AAG ACT CAG TAC CTG TTT GAG AGA ACT 1158 Gly Leu Thr Glu Phe Gln Arg Lys Thr Gln Tyr Leu Phe Glu Arg Thr 285 290 295 TTT AAC CTG AAA TTC ATC CGG CCC TTC ATG CAG TAC AAC AGC ACC AGG 1206 Phe Asn Leu Lys Phe Ile Arg Pro Phe Met Gln Tyr Asn Ser Thr Arg 300 305 310 GCA GGA GGG GTG GAG GTG GAC AAT GAC ACC ATC CGC AGG ATC GAG GAG 1254 Ala Gly Gly Val Glu Val Asp Asn Asp Thr Ile Arg Arg Ile Glu Glu 315 320 325 CTC AAT GAC CTG GAC ATG CAG CTC TAC GAC TAT GCA AAG GAC CTC TTC 1302 Leu Asn Asp Leu Asp Met Gln Leu Tyr Asp Tyr Ala Lys Asp Leu Phe 330 335 340 345 CAG CAG CGC TAT CAG TAC AAA CGG CAG CTA GAG AGG ATG GAG CAG AGG 1350 Gln Gln Arg Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Leu Glu Arg Met Glu Gln Arg 350 355 360 ATA AAG AAT CGG GAA GAG AGG CTT CTT CAC CGG TCC AAT GAA GCG CTT 1398 Ile Lys Asn Arg Glu Glu Arg Leu Leu His Arg Ser Asn Glu Ala Leu 365 370 375 CCC AAG GAA GAG ACC GAA GAG CAA GGA CGC TTG CCC ACT GAG GAC TAC 1446 Pro Lys Glu Glu Thr Glu Glu Gln Gly Arg Leu Pro Thr Glu Asp Tyr 380 385 390 ATG AGC CAT ATT ATA GAG AAG TGG TAGCCTAGGC AGACTTTTAT ATGAACGAAT 1500 Met Ser His Ile Ile Glu Lys Trp 395 400 GATACTGTAG GGTTTCCATT TCAAAGATCG TGGAAGTAAA ATCACAAAAG CAGCAGAAAA 1560 GTATTTTATT TAAAAGCAAG TCTGTAAAAC AGAAGGTAGA TTGCTTCCTT AAGCATAGGG 1620 TCTTTTTACT GTTTCTTACA AGACCGATGA GATTCTTAAA AAAA 1664

【００８０】配列番号：9 配列の長さ：401 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Val Glu Arg Thr Ser Lys Phe Leu Leu Ile Val Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 Cys Phe Met Leu Ile Leu Tyr Gln Tyr Val Gly Pro Gly Leu Ser Leu 20 25 30 Gly Ala Pro Ser Gly Arg Pro Tyr Ala Glu Glu Pro Asp Leu Phe Pro 35 40 45 Thr Pro Asp Pro His Tyr Val Lys Lys Tyr Tyr Phe Pro Val Arg Glu 50 55 60 Leu Glu Arg Glu Leu Ala Phe Asp Met Lys Gly Glu Asp Val Ile Val 65 70 75 80 Phe Leu His Ile Gln Lys Thr Gly Gly Thr Thr Phe Gly Arg His Leu 85 90 95 Val Gln Asn Val Arg Leu Glu Val Pro Cys Asp Cys Arg Pro Gly Gln 100 105 110 Lys Lys Cys Thr Cys Tyr Arg Pro Asn Arg Arg Glu Thr Trp Leu Phe 115 120 125 Ser Arg Phe Ser Thr Gly Trp Ser Cys Gly Leu His Ala Asp Trp Thr 130 135 140 Glu Leu Thr Asn Cys Val Pro Gly Val Leu Gly Arg Arg Glu Ser Ala 145 150 155 160 Pro Asn Arg Thr Pro Arg Lys Phe Tyr Tyr Ile Thr Leu Leu Arg Asp 165 170 175 Pro Val Ser Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Arg His Val Gln Arg Gly Ala 180 185 190 Thr Trp Lys Thr Ser Leu His Met Cys Asp Gly Arg Thr Pro Thr Pro 195 200 205 Glu Glu Leu Pro Ser Cys Tyr Glu Gly Thr Asp Trp Ser Gly Cys Thr 210 215 220 Leu Gln Glu Phe Met Asp Cys Pro Tyr Asn Leu Ala Asn Asn Arg Gln 225 230 235 240 Val Arg Met Leu Ala Asp Leu Ser Leu Val Gly Cys Tyr Asn Met Ser 245 250 255 Phe Ile Pro Glu Asn Lys Arg Ala Gln Ile Leu Leu Glu Ser Ala Lys 260 265 270 Lys Asn Leu Lys Asp Met Ala Phe Phe Gly Leu Thr Glu Phe Gln Arg 275 280 285 Lys Thr Gln Tyr Leu Phe Glu Arg Thr Phe Asn Leu Lys Phe Ile Arg 290 295 300 Pro Phe Met Gln Tyr Asn Ser Thr Arg Ala Gly Gly Val Glu Val Asp 305 310 315 320 Asn Asp Thr Ile Arg Arg Ile Glu Glu Leu Asn Asp Leu Asp Met Gln 325 330 335 Leu Tyr Asp Tyr Ala Lys Asp Leu Phe Gln Gln Arg Tyr Gln Tyr Lys 340 345 350 Arg Gln Leu Glu Arg Met Glu Gln Arg Ile Lys Asn Arg Glu Glu Arg 355 360 365 Leu Leu His Arg Ser Asn Glu Ala Leu Pro Lys Glu Glu Thr Glu Glu 370 375 380 Gln Gly Arg Leu Pro Thr Glu Asp Tyr Met Ser His Ile Ile Glu Lys 385 390 395 400 Trp

【００８１】配列番号：10 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Tyr Xaa Phe Pro Val Arg Glu Leu 1 5

【００８２】配列番号：11 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Thr Trp Leu Phe 1 5

【００８３】配列番号：12 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 His Leu Val Gln Asn 1 5

【００８４】配列番号：13 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Pro Ala Gly Leu Arg 1 5

【００８５】配列番号：14 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Cys Pro Tyr Asn Leu Ala 1 5

【００８６】配列番号：15 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：6 他の情報：N=i 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：12 他の情報：N=A、C、G又はT 配列 GARACNTGGY TNTT 14

【００８７】配列番号：16 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：3 他の情報：N=i 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：9 他の情報：N=A、C、G又はT 配列 AANARCCANG TYTC 14

【００８８】配列番号：17 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：3,6,9 他の情報：N=i 配列 GANTGNCCNT AYAAYYT 17

【００８９】配列番号：18 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：2,3,6,9 他の情報：N=i 配列 ANNTTNTANG GRCARTC 17

【００９０】配列番号：19 配列の長さ：3399 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 組織の種類：脳 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：877..1944 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：transmembrane domain 存在位置：916..957 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：1148..1156 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：1255..1263 特徴を決定した方法：S 配列 ACTATGTAGG CCAAGCTGGC CTCAACTCAG AGAAAACCAT CTGCGACTGC ATACACAATT 60 CTGAAATTGA GACTGTGGTC ATTTTGCCCT GTTTGTTTAC GATTTATTTT TTTCTCTTTA 120 TTGTTATGTC TGTGTCTGTG TGTAGGTAGG TGTGTACACA CAAGTACTGT GTGTACTGAA 180 GCCAGGCACT GTGTCCTCTA GAGTTATAGA TTTAGGCTGT TATAAGTCAC CCTGATATGG 240 ATGCTGGGAA CTGAACTTGA TTCCTTTGCA AGAGCAAACT ATTCCACTTA ATATAATGTG 300 TTGATGTAGA GAAATATCTA GAAGACTATT TTTACTGTTT TGAAGACATT AAGTTTTATT 360 GTCAAAGGAT AATAGATAAA GAGAAATTAA GTAAATTTTG AGCACTTAAA GAAAAGTTGT 420 GCCGGGCGTG GTGGCTCACA CCTTTAATCC CAGCACTCGG GAGGCAGAGG CAGGTGTATT 480 TCCGAGTTCG AGGCCATCTA CAAAGTGAGT TCCAGGGCAG CCAGGGCTAC AGAGAGAAAC 540 CCTGTCTCGA AAAACCAAAA CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AGAAGCGAGG 600 GAAGAGGGCG TGCGGCCGTG GGGTCCCGAA GCCAGGGGGC AGCGGCAGCG GCAGCGGCAG 660 GAGGGCGCCA GGGCCGTCGA GTGGGCCGGG GAGAAGCGTG CACCAGGCGG CCGGCGCTGG 720 CTCCCGCGGG CGGGAGACCG GAGAGGAGGA GGGGGTCGCT GCGGCGCGGC AGTCCGCGCA 780 GCTCCCGGGT CGGGGTCTCC TCCCGGCGCT TCGGTCGCCC TCGGGGCCCC GCTCCCCGCC 840 CCCCGCGGTA TGTCTTGATC GCGAGCGGCG GGTTTC ATG GGG CTC CTC AGG ATT 894 Met Gly Leu Leu Arg Ile 1 5 ATG ATG CCG CCC AAG TTG CAG CTG CTG GCG GTG GTG GCC TTC GCG GTG 942 Met Met Pro Pro Lys Leu Gln Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Ala Val 10 15 20 GCG ATG CTC TTC TTG GAG AAC CAG ATC CAG AAG CTG GAG GAG TCC CGG 990 Ala Met Leu Phe Leu Glu Asn Gln Ile Gln Lys Leu Glu Glu Ser Arg 25 30 35 GCG AAG CTA GAA AGG GCA ATT GCA AGG CAC GAA GTC CGA GAA ATT GAA 1038 Ala Lys Leu Glu Arg Ala Ile Ala Arg His Glu Val Arg Glu Ile Glu 40 45 50 CAG CGC CAT ACA ATG GAT GGC CCT CGG CAG GAT GCA ACT CTG GAT GAA 1086 Gln Arg His Thr Met Asp Gly Pro Arg Gln Asp Ala Thr Leu Asp Glu 55 60 65 70 GAA GAA GAC ATA ATC ATC ATT TAT AAC AGA GTG CCC AAA ACT GCA AGC 1134 Glu Glu Asp Ile Ile Ile Ile Tyr Asn Arg Val Pro Lys Thr Ala Ser 75 80 85 ACC TCG TTC ACC AAT ATA GCC TAC GAC CTG TGT GCA AAG AAT AGA TAC 1182 Thr Ser Phe Thr Asn Ile Ala Tyr Asp Leu Cys Ala Lys Asn Arg Tyr 90 95 100 CAT GTT CTT CAC ATC AAC ACT ACC AAA AAT AAC CCA GTA ATG TCA TTG 1230 His Val Leu His Ile Asn Thr Thr Lys Asn Asn Pro Val Met Ser Leu 105 110 115 CAA GAT CAG GTG CGC TTT GTG AAG AAC ATA ACC ACC TGG AAC GAG ATG 1278 Gln Asp Gln Val Arg Phe Val Lys Asn Ile Thr Thr Trp Asn Glu Met 120 125 130 AAG CCA GGC TTC TAT CAC GGA CAC ATC TCT TAC TTG GAT TTT GCA AAA 1326 Lys Pro Gly Phe Tyr His Gly His Ile Ser Tyr Leu Asp Phe Ala Lys 135 140 145 150 TTC GGT GTG AAG AAG AAA CCA ATT TAT ATC AAT GTC ATC AGG GAC CCT 1374 Phe Gly Val Lys Lys Lys Pro Ile Tyr Ile Asn Val Ile Arg Asp Pro 155 160 165 ATT GAG AGG CTA GTT TCC TAC TAT TAC TTC CTG AGG TTT GGA GAT GAT 1422 Ile Glu Arg Leu Val Ser Tyr Tyr Tyr Phe Leu Arg Phe Gly Asp Asp 170 175 180 TAC AGA CCA GGA TTA AGG AGA CGG AAA CAA GGA GAC AAA AAG ACC TTC 1470 Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Arg Arg Lys Gln Gly Asp Lys Lys Thr Phe 185 190 195 GAT GAA TGT GTG GCT GAG GGC GGC TCC GAC TGT GCT CCA GAG AAG CTC 1518 Asp Glu Cys Val Ala Glu Gly Gly Ser Asp Cys Ala Pro Glu Lys Leu 200 205 210 TGG CTT CAG ATC CCG TTC TTC TGT GGC CAC AGC TCA GAA TGC TGG AAT 1566 Trp Leu Gln Ile Pro Phe Phe Cys Gly His Ser Ser Glu Cys Trp Asn 215 220 225 230 GTA GGG AGC AGA TGG GCC ATG GAC CAG GCT AAG TCT AAC CTC ATT AAT 1614 Val Gly Ser Arg Trp Ala Met Asp Gln Ala Lys Ser Asn Leu Ile Asn 235 240 245 GAG TAC TTC CTG GTG GGA GTC ACC GAG GAG CTC GAG GAC TTC ATC ATG 1662 Glu Tyr Phe Leu Val Gly Val Thr Glu Glu Leu Glu Asp Phe Ile Met 250 255 260 CTG CTC GAG GCA GCT TTG CCC CGA TTC TTC CGG GGC GCT ACC GAC CTC 1710 Leu Leu Glu Ala Ala Leu Pro Arg Phe Phe Arg Gly Ala Thr Asp Leu 265 270 275 TAC CGT ACA GGA AAG AAA TCT CAC CTT AGG AAA ACC ACA GAG AAG AAG 1758 Tyr Arg Thr Gly Lys Lys Ser His Leu Arg Lys Thr Thr Glu Lys Lys 280 285 290 CTG CCC ACC AAG CAG ACT ATC GCG AAG CTG CAG CAG TCT GAC ATT TGG 1806 Leu Pro Thr Lys Gln Thr Ile Ala Lys Leu Gln Gln Ser Asp Ile Trp 295 300 305 310 AAG ATG GAG AAT GAG TTC TAT GAG TTT GCT CTG GAG CAG TTC CAG TTC 1854 Lys Met Glu Asn Glu Phe Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Gln Phe Gln Phe 315 320 325 ATC CGA GCT CAC GCT GTC CGC GAG AAA GAC GGA GAC CTC TAC ATC CTG 1902 Ile Arg Ala His Ala Val Arg Glu Lys Asp Gly Asp Leu Tyr Ile Leu 330 335 340 GCC CAG AAC TTT TTC TAC GAA AAG ATT TAC CCT AAG TCG AAC 1944 Ala Gln Asn Phe Phe Tyr Glu Lys Ile Tyr Pro Lys Ser Asn 345 350 355 TGAGCGCAGG TGTGGCCAGA GCACTCCTGC CCCGGAACTT GACTGTGTCA CCACCCTTCT 2004 CAGCCCCCTG CTGATGCGTG TGCGAGCTGT GAGCCACGCT GAGCTGGGGA CAGACATGAA 2064 TGTCAAGGAG TGAGATGCTG GCGGGCTGGC GGAGTCCTGT GGAGTTTTTA ACTTTCTGGC 2104 ATTTTTACTT TTTTGTTGTT TTATTTTCGT TTTCATGATA GTTATAATCT TCTCCTGGTG 2164 CAGGGACATG GGGACTTACA TTGCCTAAAA TACACACATG GACGTTTAGT CAGATGGCTG 2224 AATACCATTT CAGAAGAGGT TTGCATAAGC ATTTCTTTGC CTCTCCTTGA ATGAAGAGGA 2284 GTCTGTTTGC CACTTACCCT TCTGGAGTTT GTGCCGCCAC CTCTGCTGGA TAGTGCTAAA 2344 ATATGTTTGG CAGTATCTGA TTTATTTGTA TGAATCATGT CTCACAAAGT TTATTAGAAT 2404 GTTTGATCGT GTTTTCCCAG AACATTTCTG CTACAGTTGG GTTTGCCCAT ATTTATGTAG 2464 GCTTTATTTT ATTTTATTTG ATGATCATTA GTGTTAAAGA AATCAACTTA AACCATGAAT 2524 AATACTGTAA GAAGGTAAAA AGTTAAAGCA GTATTCCTGA CTCCTGTCAC CCCAGTATCC 2584 AATATTGGAA TGATATTTCT AAGAATGTGG ACATTATCTG AGGCTTTCTT AAGGATTTCC 2644 ACATATCAAT ATCAAAAAAT TGAGTTTAAT ACTTGTTCCT TCATGGCGTA TCTGTACCCC 2704 TGAACACTGG CATATTGGTG ACCGCACATG GCGACTCCAT CAGTGAGCTG TGATGTGGGT 2764 AGGATTTGCC TACTCTGTAC TTTTACCTGT AAACTATTTT TACTACGGTG CTTTATAATG 2824 TGTTTTAAAG CATTGCATTT ACAAAAGGAA AGTGCTGTAA ATATTGCATA TTTTATGTAT 2884 TTGGACCAAA AAGTTACAAG TAAGTAGACA ACAGTGGTGT TGCACCCGTT TTATTATGTC 2944 GAGTAAAGTC GTCAGACCTC CTATCCTATT CTGGTATTTC TCGTTTAAAC GTTACTGTTA 3004 GGATGTCACT AAAATGAGCT AACGTAGCCT TTCAAGTTTG ATAGAGAACA GTGCTCACCC 3064 CTGAGGCAGT AGTGGTCATA GAAAAGGTCG TAGAGTCTGA GGGTTCCATC TCTGGTTCCA 3124 GCTCTGCTGT CACCTTCCTG CTGTGTGACG TTAGGAAGTC ACCTGACCTC CCTGCCTCAG 3184 CTTCCTCATC TTGATATCAG GACACTAAGA CCCTTCTCCC CCTGCCTCAC AGGGATGTTG 3244 TGAGGACTAA GGAAGATGGC ATGGCGAAGA GCACTTTAAA ACTGTGGCGT GGTGTTCAAA 3304 TGTGAGGTGT TGTCACAGAA GTATCTTCTA GCTGATAGTT TCATAGTCTC TATTTTAGCA 3364 ACAAAAAGGG AAAATCCACT TTTAAGCTTT ATGAG 3399

【００９１】配列番号：20 配列の長さ：2308 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ニワトリ 組織の種類：肢芽 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：161..1228 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：transmembrane domain 存在位置：200..241 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：431..439 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を示す記号：potential N-glycosylation site 存在位置：539..547 特徴を決定した方法：S 配列 CCGCGCGGCG CTCGGGGCCG GGCCGGGGCG ATGTGAGCGG GCCCTGCGCG CGCCTCCCCT 60 CGCTCGCGCC GTCGGAGCGG CGGCTGCCGC GGCTCCCGCC TGCCCGCCCG GCCGGGCCCC 120 GCGTTATGTC GTGATCCCGG GCGGGCGGCG CCGCCGGGGC TGCCG ATG GGG CTG CTC 172 Met Gly Leu Leu 1 AGG ATC ATG CTG CCG CCC AAG TTG CAG CTG CTG GCC GTG CTG GTG TTC 220 Arg Ile Met Leu Pro Pro Lys Leu Gln Leu Leu Ala Val Leu Val Phe 5 10 15 20 GGC GTG GCG GTG CTA TTC CTG GAG AAC CAG ATC CAG AAG CTG GAG GAG 268 Gly Val Ala Val Leu Phe Leu Glu Asn Gln Ile Gln Lys Leu Glu Glu 25 30 35 TCC CGC GGC AAG CTG GAA AGG GCT ATT GCA AGA CAT GAA GTC AGA GAG 316 Ser Arg Gly Lys Leu Glu Arg Ala Ile Ala Arg His Glu Val Arg Glu 40 45 50 ATA GAA CAA CGT CAT ACA GCA GAT GGC CCC CGA CAA GAA GTG GCA CTG 364 Ile Glu Gln Arg His Thr Ala Asp Gly Pro Arg Gln Glu Val Ala Leu 55 60 65 GAT GAA GAA GAT GAT GTG GTG ATT ATT TAC AAT AGA GTA CCT AAG ACT 412 Asp Glu Glu Asp Asp Val Val Ile Ile Tyr Asn Arg Val Pro Lys Thr 70 75 80 GCC AGC ACA TCC TTC ACG AAT ATT GCC TAT GAT CTT TGT GCA AAG AAC 460 Ala Ser Thr Ser Phe Thr Asn Ile Ala Tyr Asp Leu Cys Ala Lys Asn 85 90 95 100 AGA TAC CAT GTT CTA CAT ATC AAT ACA ACC AAA AAT AAT CCT GTG ATG 508 Arg Tyr His Val Leu His Ile Asn Thr Thr Lys Asn Asn Pro Val Met 105 110 115 TCT CTG CAA GAT CAG GTT CGG TTT GTG AAG AAC GTG ACT TCC TGG AAG 556 Ser Leu Gln Asp Gln Val Arg Phe Val Lys Asn Val Thr Ser Trp Lys 120 125 130 GAA ATG AAA CCA GGA TTT TAC CAC GGA CAC GTA TCG TAT TTG GAC TTT 604 Glu Met Lys Pro Gly Phe Tyr His Gly His Val Ser Tyr Leu Asp Phe 135 140 145 GCG AAA TTT GGT GTT AAA AAG AAA CCC ATT TAC ATA AAC GTC ATA AGA 652 Ala Lys Phe Gly Val Lys Lys Lys Pro Ile Tyr Ile Asn Val Ile Arg 150 155 160 GAT CCC ATA GAA CGG CTA GTT TCT TAT TAT TAC TTT CTG CGC TTT GGA 700 Asp Pro Ile Glu Arg Leu Val Ser Tyr Tyr Tyr Phe Leu Arg Phe Gly 165 170 175 180 GAC GAT TAC AGA CCA GGG CTA CGA AGG AGA AAA CAG GGG GAT AAG AAG 748 Asp Asp Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Arg Arg Lys Gln Gly Asp Lys Lys 185 190 195 ACC TTT GAT GAA TGT GTG GCA GCT GGA GGG TCA GAC TGT GCT CCA GAG 796 Thr Phe Asp Glu Cys Val Ala Ala Gly Gly Ser Asp Cys Ala Pro Glu 200 205 210 AAA CTT TGG CTT CAA ATT CCA TTC TTC TGT GGC CAC AGC TCC GAG TGC 844 Lys Leu Trp Leu Gln Ile Pro Phe Phe Cys Gly His Ser Ser Glu Cys 215 220 225 TGG AAT GTG GGA AGC AGA TGG GCT TTG GAA CAA GCC AAG TAC AAC CTG 892 Trp Asn Val Gly Ser Arg Trp Ala Leu Glu Gln Ala Lys Tyr Asn Leu 230 235 240 ATT AAT GAA TAC TTC CTC GTG GGA GTT ACT GAA GAG CTT GAA GAT TTC 940 Ile Asn Glu Tyr Phe Leu Val Gly Val Thr Glu Glu Leu Glu Asp Phe 245 250 255 260 ATC ATG TTA TTG GAG GCA GCT TTG CCC CGG TTC TTC AGG GGT GCC ACA 988 Ile Met Leu Leu Glu Ala Ala Leu Pro Arg Phe Phe Arg Gly Ala Thr 265 270 275 GAA CTG TAC CGG ACA GGA AAG AAG TCT CAT CTT AGG AAA ACA ACT GAG 1036 Glu Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Lys Ser His Leu Arg Lys Thr Thr Glu 280 285 290 AAA AAA CTT CCC ACA AAA GAA ACT ATT GCC AAG CTG CAA CAG TCT GAA 1084 Lys Lys Leu Pro Thr Lys Glu Thr Ile Ala Lys Leu Gln Gln Ser Glu 295 300 305 ATC TGG AAA ATG GAG AAT GAG TTC TAT GAA TTT GCA CTG GAG CAA TTT 1132 Ile Trp Lys Met Glu Asn Glu Phe Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Gln Phe 310 315 320 CAG TTT GTC AGA GCA CAC GCA GTC CGG GAA AAA GAT GGA GAA TTG TAT 1180 Gln Phe Val Arg Ala His Ala Val Arg Glu Lys Asp Gly Glu Leu Tyr 325 330 335 340 ATC CTG GCT CAA AAC TTT TTC TAT GAA AAG ATT TAC CCC AAA TCA AAC 1228 Ile Leu Ala Gln Asn Phe Phe Tyr Glu Lys Ile Tyr Pro Lys Ser Asn 345 350 355 TAAGAACATA ATACTTTCAG ATTTACGGAC CGAAATCTTT GGTCACATCA TCATCTTAGT 1288 CCTCAGCCAT GGAAACTAGA TTGCTTGTTA GACCTCCAAG ATGTTTCTCT ATAGGTCCGA 1348 GAAAAGTGGG CTGTGGATCA CCTCCAGGGC GTTGGATACT GACTAACTGT GTTGGTAATC 1408 CAGAAGCAAA AGCTTCATGT CTTTTATCTA ACTAATACTT TCAGTGGGAG TTAATACCCT 1468 TTACCTGAGG AAATCTTCAC TTTAATTTGG AGCAATTAAC ACACAGCAGT TCTAGTTGAA 1528 AATATAAAGA AAAAAAAATG CTTCTGTTAA TGCTCTTTTT TAATTTTCAG AGCAATTTAT 1588 TTTCATTTAT ACTTCTGTGA AGAGGAAGTC ATTTTTTCCC AGCTTTCAAC ATGGAAATCT 1648 TGGTTGTATA CTATATGAGC AGTGTTAATA ACTGGTTGAC ATCTGTGCTT TGTTTTTGTG 1708 AATCGTGTCA CACGATGCTG ATTGGGATAG TTAATCATGT TCTGCCGAGA AATGCTGCTG 1768 CCGCTGGAAT TGCCCACATT TATATTTGTG GTTTTATTAA AAAGAAATTA TGACTAATCG 1828 TTAGCGTTAA AACATCATTT CCACATGAAG ATTGTAAGAA GTTAAAGAAT CAGAGCAGTG 1888 GGATTTTTTT GTTGTTGTGT TTTATGCCCA CCACCACTTG ACTGAGGTTG GGAAAACTGC 1948 AAGGAAAGTT GGTTTTGTCT GCAGTTATAG TCGGCACTTA CACAGTGGTA CAAAAATAGC 2008 AAAATCAGTA TGAAGTTCCT CCATGGATTC TTTGTAATTA TTGTAAGCTG AGGTATTGGT 2068 GAATCCATAT TATGACTCCA CTAGTGAGCT GTGGTATGGT TAGGGTTTTC CTACTACTTC 2128 AATACTTTTA CCTGTAGAAT ATTTTTACTA AGGTGCTTTA TAATGTGTTT TAAAGCATTG 2188 CATTTACAAA AGGAGTAAAA TGCTGTAAAT ACTGCTTATT TTATGTATTT GGACCAAAAG 2248 GTTTAAAGTA ACTTGTTTGA AGTGGGTTTT TTTGCACCGG TTCTGTTACG TGTAAAGCAA 2308

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＨＳ６ＳＴを酵素処理して得られたペプチド
断片とそれを基に合成されたオリゴヌクレオチドプライ
マー。

【図２】 ヒト由来のＨＳ６ＳＴのアミノ酸配列から作
成したハイドロパシープロット。

【図３】 １次スクリーニングで得られたチャイニーズ
ハムスター由来のＨＳ６ＳＴｃＤＮＡ断片とヒト由来の
ＨＳ６ＳＴ完全長ｃＤＮＡの相当部分との比較。両配列
間の記号の「＊」及び「．」はそれぞれ一致及び相違す
ることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 鈴木 宏昌 愛知県愛知郡長久手町五合池116 クロン ド藤ヶ丘２−Ｆ (72)発明者 田中 雅之 愛知県愛知郡長久手町砂子1505 シンメイ ＩＩ203

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するグリコサミ
   ノグリカン硫酸基転移酵素のポリペプチドをコードする
   塩基配列を有するＤＮＡ。 作用：硫酸基供与体から、硫酸基受容体であるグリコ
   サミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基
   の６位水酸基へ硫酸基を選択的に転移する。 基質特異性：ヘパラン硫酸又はＣＤＳＮＳ−ヘパリン
   のＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基には硫酸基
   を転移するが、コンドロイチン及びコンドロイチン−４
   −硫酸の上記水酸基には硫酸基を転移しない。 至適反応ｐＨ：ｐＨ６〜７。 至適イオン強度：塩化ナトリウムを用いた場合、０．
   １〜０．３Ｍ。 阻害及び活性化：ジチオスレイトール、アデノシン-
   3',5'-ジリン酸で酵素活性が阻害され、プロタミンによ
   り酵素活性が上がる。
2. 【請求項２】 硫酸基供与体が、3'-ホスホアデノシン
   5'-ホスホ硫酸である請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 チャイニーズハムスター、マウス、ニワ
   トリ又はヒト由来である請求項１又は２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド
   をコードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
   ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
   ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転移したアミノ酸配
   列からなり、かつ硫酸基供与体から硫酸基受容体である
   グリコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミ
   ン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有す
   るポリペプチド。
5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸配列の全てをコー
   ドする塩基配列またはその部分配列を有するＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列番号４のアミノ酸配列の全てをコー
   ドする塩基配列またはその部分配列を有するＤＮＡ。
7. 【請求項７】 配列番号５のアミノ酸配列からなるポリ
   ペプチドの全部又は部分をコードするＤＮＡ。
8. 【請求項８】 配列番号７のアミノ酸配列からなるポリ
   ペプチドの全部又は部分をコードするＤＮＡ。
9. 【請求項９】 配列番号９のアミノ酸配列からなるポリ
   ペプチドの全部又は部分をコードするＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチ
    ド。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
    ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
    ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転移したアミノ酸配
    列からなり、かつ硫酸基供与体から硫酸基受容体である
    グリコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミ
    ン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有す
    るポリペプチド。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載のポリペプチドのＮ末
    端部から細胞膜貫通領域を含む領域を欠失していること
    を特徴とし、かつ硫酸基供与体から硫酸基受容体である
    グリコサミノグリカンに含まれるＮ−硫酸化グルコサミ
    ン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有す
    るポリペプチド。