JP3522775B2 - ヘパリン不飽和４糖およびその製造法 - Google Patents
ヘパリン不飽和４糖およびその製造法Info
- Publication number
- JP3522775B2 JP3522775B2 JP19900492A JP19900492A JP3522775B2 JP 3522775 B2 JP3522775 B2 JP 3522775B2 JP 19900492 A JP19900492 A JP 19900492A JP 19900492 A JP19900492 A JP 19900492A JP 3522775 B2 JP3522775 B2 JP 3522775B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- heparin
- unsaturated
- heparitinase
- tetrasaccharide
- heparinase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、グルコサミン−３−Ｏ
−硫酸を含む新規なヘパリン不飽和４糖に関する。該不
飽和４糖は、ヘパリンの抗凝血活性の中心となる機能領
域を構成する糖鎖である。また、本発明は、ヘパリンを
原料として酵素的方法によって該不飽和４糖を製造する
方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ヘパリンは抗凝血活性が強いため、医薬
品として広く用いられている。その活性は血液中に存在
するアンチトロンビンIII （ＡＴIII）とヘパリンが複
合体を形成し凝固因子の活性を抑制するためであること
が知られている。このＡＴIIIとヘパリンとが結合する
部分については詳しい研究がなされ、ヘパリンについて
は活性発現に必要な構造としてグルコサミンの３位の炭
素にＯ−硫酸エステルをもつ糖鎖を含む次の５糖（下記
（２））の構造が決定されている。 【０００３】 （式中、Ｒはアセチル基等のアシル基を示す。GlcAはグ
ルクロン酸を、GlcNはグルコサミンを、(3,6-di-SO3)は
３−Ｏ及び６−Ｏ−硫酸エステルを、IdoAはイズロン酸
をそれぞれ示す。） 本構造を特徴づける２糖（上記（３））、GlcA→GlcNSO
3(3,6-di-SO3) はヘパリン糖鎖の中では微量成分であ
る。この２糖（３）はＡＴIIIへの結合には不可欠な成
分であるため、抗凝固活性を保有するヘパリンの最も適
切なマ−カ−となっている。 【０００４】また、ヘパリンがＡＴIIIと結合すること
によって発現する凝固因子に対する抑制活性は、ＡＴII
I結合領域の分子量によって変化することがわかってお
り、このサイズを調節することによって血液凝固Ｘａ因
子（ファクタ−Ｘａ）とトロンビンの活性抑制の程度を
変化させることが可能である。すなわち、ヘパリンの分
子量を小さくするこにより、トロンビンへの阻害活性を
低減して出血作用を抑え、Ｘａ活性への阻害活性は温存
させて血栓形成を抑制するという考えがある。この考え
に基づいて、出血の副作用の少ない血栓予防薬、低分子
ヘパリンが発明されるに至っている。（例えば米国特許
第４，３０３，６５１号、米国特許第４，３９６，７６
２号）。 【０００５】従来、自然界から得られる糖鎖の中で２糖
（３）の構造を有する原料はヘパリン／ヘパラン硫酸の
他はあまり知られていない。しかしながら、ヘパリンか
ら２糖（３）を含むオリゴ糖を効率よく取り出す良い方
法はなく、また、化学合成によってこれを大量に得るこ
とは極めて困難であった。すなわち、これら低分子ヘパ
リンを、ヘパリンの限定的な化学処理によって製造する
場合、分子量が多分散でかつ多種構成糖からなる生産物
しか得られず、活性領域を含むオリゴ糖のみを調製する
ことは困難であった。 【０００６】比較的簡易な方法としては、フラボバクテ
リウム・ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）由来
のヘパリナ−ゼおよびヘパリチナーゼＩを含むヘパリン
分解酵素を用いてヘパリンを徹底分解した後、２糖から
８糖までのオリゴ糖異性体の混合物を高速液体クロマト
グラフィ−（ＨＰＬＣ）で分離して、２糖（３）を還元
端側に含む不飽和６糖を得る方法（K. G. Rice & R. J.
Linhardt, Carbohydr.Res. 190, 219-233, 1989）が知
られている。ここで得られる不飽和６糖は、その純度が
８０％程度とされている。しかしながら、この方法では
２糖（３）を含む不飽和４糖は生成していない。 【０００７】別の報告では同様の方法で２糖（３）が中
間に存在する不飽和６糖が得られ、これを亜硝酸分解す
ることにより還元端がアンヒドロマンノ−ス体に変化し
た不飽和４糖が得られるとの報告がある(J. Choay, J.
C. Lormeau, M. Petitou, P.Snay & J. Fareed, Annals
of the New York Academy of Sciences, 370, 644-64
9, 1981)。 【０００８】以上の通り、従来の報告ではヘパリンから
酵素を用いて２糖（３）を含む最小のオリゴ糖を得よう
としているが、これらの報告を含めて酵素分解法、化学
分解法、化学合成法のいずれによっても、現在までに上
記式（３）の２糖単位を含む不飽和４糖を調製した報告
はない。もし、このような４糖が得られれば、アンチト
ロンビンIII結合領域に関与する糖鎖の合成原料や新し
い血液凝固因子の阻害剤として活用することが期待でき
る。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】本発明の第１の目的
は、グルコサミン−３−Ｏ−硫酸を含む新規なヘパリン
４糖を提供することである。また、他の目的はこのよう
なヘパリン４糖を、ヘパリンを原料として酵素的手段を
用いて効率よく、簡便に得る手法を提供することであ
る。 【００１０】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヘパリン
由来の２糖（３）を含む不飽和４糖を得るべく、ヘパリ
ン／ヘパラン硫酸系の分解酵素の特異性を研究し、その
応用を試みた結果、新規なヘパリン不飽和４糖を効率よ
く、簡易に製造できることを見出し、本発明を完成する
に至った。 【００１１】すなわち本発明は、ヘパリンを、ヘパリチ
ナーゼＩと、ヘパリチナーゼＩＩと、ヘパリナーゼまた
はヘパリチナーゼＩＶとを用いて分解し、この分解生成
物から一般式（１）で表されるヘパリン不飽和４糖を分
取することを特徴とするヘパリン不飽和４糖およびその
塩の製造法を提供するものである。 【００１２】 【化２】 【００１３】（式中、（Ｒ 1 、Ｒ 2 ）は、（ＣＯＣＨ 3 、
Ｈ）、（ＣＯＣＨ 3 、ＳＯ 3 - ）、又は（ＳＯ 3 - 、Ｓ
Ｏ 3 - ）を表す。尚、ＣＯＣＨ 3 （アセチル基；以下「Ａ
ｃ」と略す。））尚、一般式（１）の構造式において、
末端不飽和糖残基を４、以下他の糖残基を１〜３と番号
を当て、各糖残基の基本単位糖を示した。また、一般式
（１）の構造式では電離した状態のみを記載したが、本
発明は、これに限定されないことは明らかであり、これ
にプロトンが付加した構造のもの、あるいはアルカリ金
属（ナトリウム、カリウム、リチウム等）、アルカリ土
類金属（カルシウム、バリウム等）、あるいはアンモニ
ウムイオン等との塩を包含する。 【００１４】以下本発明を具体的に説明する。 【００１５】〔ヘパリン不飽和４糖〕本発明のヘパリン
不飽和４糖は、好ましくは、一般式（１）において下記
置換基を選択した化合物Ｉ〜III である。 化合物Ｉ ：ΔGlcA-GlcNAc(6S)-GlcA-GlcN(NS,3S) （R1はAc、R2はH の場合。) 化合物II ：ΔGlcA-GlcNAc(6S)-GlcA-GlcN(NS,3S,6
S) （R1はAc、R2はSO3 - の場合。) 化合物III ：ΔGlcA-GlcN(NS,6S)-GlcA-GlcN(NS,3S,6
S) （R1はSO3 - 、R2はSO3 - の場合。) （上記式においてΔは不飽和糖であることを、GlcAはグ
ルクロン酸を、GlcNはグルコサミンを、Acはアセチル基
を、NSはＮ−硫酸エステルを、3Sは３−Ｏ−硫酸エステ
ルを、6Sは６−Ｏ−硫酸エステルをそれぞれ示す。） これら本発明の不飽和４糖は還元端糖残基が３−Ｏ−硫
酸エステル化されたグルコサミンである共通構造を有し
ている。後述の実施例に示す通り、本発明の不飽和４糖
の、構造はプロトン核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭ
Ｒ）を測定することにより解析された。 【００１６】〔ヘパリン不飽和４糖の製造〕ヘパリンか
らヘパリン不飽和４糖を切り出すために、活性領域にお
ける２糖（３）周辺の糖鎖構造に作用する酵素を活用す
る手段を検討した。すなわち、このような用途に使用で
きる可能性のある酵素として、二種類のフラボバクテリ
ウム属微生物によって生産された基質特異性の異なる６
種類（ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼＩ、I0、II、IVお
よびＶ）のヘパリン分解酵素を選び、その種々の組合せ
について逐次または同時に用いてヘパリンを分解し、そ
の生成物の組成について調べた。具体的には、各酵素に
よるヘパリンの分解物について、生成オリゴ糖の分解パ
タ−ンをゲル濾過法で、その構成２糖組成の相違を陰イ
オン交換ＨＰＬＣで検討した。 【００１７】その結果、ヘパリンの主構造であるIdo(2S
O3)-GlcNSO3(6SO3)のクラスタ−部分については、ヘパ
リナ−ゼがより早く分解して不飽和の２糖〜８糖の種々
のオリゴ糖を生じやすく、このオリゴ糖に対してヘパリ
チナ−ゼＩおよびＩＩを同時に作用させると、本発明の
前記化合物Ｉ〜III の三種の不飽和４糖と一種の糖−蛋
白質結合部位の不飽和オリゴ糖（ΔGlcA-GlcNAc(6S)-Gl
cA-Gal-Gal-Xyl-Ser）の四種の不飽和オリゴ糖が残るの
みで、他のオリゴ糖は全て不飽和２糖となることが見出
された。このうち一種の不飽和オリゴ糖は、原料として
使用したヘパリンが還元端にペプチドが結合した構造で
ある場合のみ生じる。このオリゴ糖は、ヘパリチナーゼ
Ｖで２糖と４糖-Serに分解されたが、本発明の三種の不
飽和４糖は上記の６種のいずれのヘパリン分解酵素（エ
リミナーゼ）を作用させてもそれ以上は分解されず、不
飽和２糖を生じないことがわかった。なお、これらの６
種の酵素の性質、一般的な基質特異性等については「新
生化学実験講座３、糖質ＩＩ、プロテオグリカンとグリ
コサミノグリカン」、２４４〜２４９頁（１９９１年、
株式会社東京化学同人発行）に記載されているが、ＡＴ
IIIとの結合に関与する２糖単位（３）周辺の構造に対
してどのように作用するかは不明であった。 【００１８】以上の実験結果より、ヘパリンの主糖鎖
（タンパクへの橋渡し構造を除く）については、グルコ
サミン−３−Ｏ−硫酸を含む部分（前記（３）の２糖構
造を含む）のみが酵素分解によって不飽和４糖として残
されるため、本発明の不飽和４糖だけを容易に濃縮、回
収することが可能であることが判明した。以上は本発明
に至る基礎実験であり、本発明のヘパリン不飽和４糖の
製造法はこの結果を基に完成された。 【００１９】本発明の製造法はヘパリンにヘパリチナ−
ゼIIを作用させることを必須要件とする。本発明ではヘ
パリチナ−ゼIIと組み合わせて種々のヘパリン分解酵素
を使用することができる。すなわち、ヘパリチナ−ゼII
を効率よく経済的に作用させるために、ヘパリナ−ゼ、
ヘパリチナ−ゼＩ、I0、IV、ヘパリチナーゼＶ等公知の
ヘパリン分解酵素を併用することができる。本発明にお
いて使用するヘパリン分解酵素としては、フラボバクテ
リウム属微生物（例えば、フラボバクテリウム・ヘパリ
ナム（ＡＴＣＣ １３１２５；米国特願第１８０，７８
０号）、フラボバクテリウムｓｐ．Ｈｐ２０６（微工研
菌寄第１０２０７号；特開平２−５７１８３号）；Xth
International Symposium on Glycoconjugates(Proceed
ings),No228, p.330-331(1989)）由来の酵素が例示され
るが、本発明の目的に適合する限り、他の起源の酵素
（例えば、バチルス属微生物由来；特開平２−１４２４
７０、特願平３−６３７０７）であってもよい。 【００２０】種々のヘパリン分解酵素を併用する際に
は、これらの酵素を任意に組み合わせて混合し用いる
か、単独または二種以上を混合して任意の順序で別々に
作用させることができる。この場合、好ましくは、ヘパ
リチナーゼIIと（ａ：ヘパリナーゼ及びヘパリチナーゼ
IVからなる群）から選択される１種以上の酵素（ａ群酵
素）と（ｂ：ヘパリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼI0及び
ヘパリチナーゼＶからなる群）から選択される１種以上
の酵素（ｂ群酵素）とを併用することが挙げられる。な
お、ヘパリチナーゼIIとａ群酵素およびｂ群酵素の一方
を併用することも可能である。 【００２１】特に、好ましくは、ヘパリチナーゼIIと、
ヘパリチナーゼＩと、ヘパリナーゼまたはヘパリチナー
ゼIVとを併用することが挙げられる。併用の態様として
は、例えばヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼＩおよびIIを
混合してヘパリンに作用させる方法、ヘパリチナ−ゼ
Ｉ、IIおよびIVを混合してヘパリンに作用させる方法、
ヘパリンをヘパリナ−ゼまたはヘパリチナ−ゼIVで消化
した後、不飽和２糖を除去し、これにヘパリチナ−ゼＩ
およびＩＩを加えて再度徹底消化する方法などが例示さ
れる。しかし、いずれの場合においても、ヘパリチナ−
ゼＩＩの使用は必須である。 【００２２】原料として使用するヘパリンは、通常入手
できるヘパリンであればよく、特に限定されない。例え
ば、ブタ、ウシ、ヒツジ、クジラ等の哺乳動物の臓器
（例えば、小腸、肺）由来のヘパリンを使用することが
できる。通常、市販ヘパリンはアルカリ処理を施された
ものであるため、還元端のペプチドや橋渡し構造を失っ
ている場合が多く、本発明による酵素処理を行っても糖
と蛋白質の結合部位の不飽和糖を生じない場合が多い。 【００２３】上記の酵素反応を行う具体的方法、反応条
件は各ヘパリン分解酵素について採用されている通常の
方法および条件であればよく特に限定されない。すなわ
ち、ヘパリンを含有する水性溶液（水溶液、任意の緩衝
剤（例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤
など）を含む溶液）に各種ヘパリン分解酵素を全て混合
して添加し、インキュベートするか、単独または二種以
上混合したヘパリン分解酵素を任意の順序で順次添加し
てインキュベートすることができる。更に、単独または
二種以上の酵素を通常の方法（米国特願第１９６，７２
０号）で固定化た固定化酵素（例えば、セファロース
（ファルマシア・ファインケミカル社製）に固定化した
固定化酵素）を用いて反応させることもできる。 【００２４】反応条件は、二種以上の酵素を混合して用
いるときは各酵素のそれぞれが作用し得る条件を設定す
る必要があるが、二種以上の酵素を別々に作用させると
きは各酵素の最適の反応条件を選択して反応させること
ができる。反応時間は、本発明の不飽和４糖の生成をＨ
ＰＬＣ等のクロマトグラフィーで分析することによって
当業者であれば容易に決定することができる。各ヘパリ
ン分解酵素の最適の反応条件（ｐＨ、温度）は以下の通
りである。 【００２５】ヘパリチナーゼII：至適ｐＨ約７．５、至
適温度約４０℃ ヘパリナーゼ：至適ｐＨ約７．０、至適温度約３０℃ ヘパリチナーゼＩ：至適ｐＨ約６．５〜７．５、至適温
度約４５℃ ヘパリチナーゼI0：至適ｐＨ約７．５、至適温度約４５
℃ ヘパリチナーゼIV：至適ｐＨ約７．５、至適温度約４０
℃ ヘパリチナーゼＶ：至適ｐＨ約７．０、至適温度約４０
℃ 各酵素に共通する反応条件として、例えば、ヘパリン濃
度１．０〜１００ｇ／Ｌの基質溶液を用い、ｐＨ５〜
８、１０〜４０℃において０．１〜１００時間反応させ
る条件が例示される。 【００２６】また、使用する酵素の量は、併用する酵素
の種類によって種々選択され得る。例えば、酵素とし
て、ヘパリチナーゼII、ヘパリチナーゼＩ、及びヘパリ
ナーゼまたはヘパリチナーゼIVを併用する場合、各酵素
量は、ヘパリン１ｇに対しヘパリチナーゼIIが１０〜１
００ユニット、ヘパリチナーゼＩが５〜５０ユニット、
ヘパリナーゼまたはヘパリチナーゼIVが２０〜２００ユ
ニットが例示できる。ここで、ユニットとは、１分間に
１μモルの不飽和糖を生成せしめる力価を意味する。た
だし、力価測定にあたり、基質としては、ヘパリチナー
ゼＩ、I0、II、Ｖについては、ウシ腎臓由来のヘパラン
硫酸を用い、ヘパリナーゼおよびヘパリチナーゼIVにつ
いては、ブタ小腸由来のヘパリンを用いる。 【００２７】酵素によるヘパリンの分解反応終了後、分
解生成オリゴ糖は、通常の分離精製方法、例えば、各種
クロマトグラフィーによって精製され、目的のヘパリン
不飽和４糖を分離精製することができる。例えば、通
常、該分解生成物は、初めゲル濾過によりほぼ４糖近辺
のオリゴ糖を粗分画し、次いで、ＨＰＬＣ（例えば、ポ
リアミン結合シリカゲルカラムを使用するＨＰＬＣ）に
より化合物Ｉ〜III を分離、分画することが挙げられ
る。この場合、分取される分画は、本発明の一般式
（１）を満足する化合物から構成されるのであれば、必
ずしも単一な化合物のみである必要はなく、例えば、化
合物Ｉ〜III から選択される２種以上の混合物であって
もかまわない。また、化合物１〜III の各単品を精製す
る場合は、上記混合物等を再度精製すること等により行
ってもよい。 【００２８】ゲル濾過法としては、分画分子量範囲５０
０〜２０，０００のものが好ましい。また、ＨＰＬＣ
は、陰イオン交換クロマトグラフィーを採用することが
好ましい。 〔用途〕本発明の不飽和４糖は、化合物１〜III あるい
はその構成オリゴ糖、または単糖、特に残基１の３−Ｏ
−硫酸置換糖を貴重な各種試薬として提供できる。ま
た、ヘパリン不飽和４糖は、ＡＴIII結合領域に関与す
る糖鎖の合成原料（素材）や血液凝固因子の新しい阻害
剤としての用途が期待できる。また、該不飽和４糖の還
元端または非還元端を他の糖類、リガンド、医用材料、
その他合成ポリマーに結合させた修飾物は、ＡＴIII結
合性アフィニティー担体として各種クロマトグラフィー
や人工血管表面等の機能性素材として用いることが期待
できる。また、これらの修飾物は弱い抗凝固活性物質と
しての利用が可能である。 【００２９】 【実施例】以下、本発明の具体的実施例を説明するが、
本発明は、これに限定されるものではない。また、各ヘ
パリン分解酵素の呼称は前述の「新生化学実験講座３、
糖質II、プロテオグリカンとグリコサミノグリカン」の
記載にしたがっている。 実施例１：ブタ小腸由来のヘパリン５００ｍｇを２０ｍ
Ｌ（ミリリットル）の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ７．
０）（２ｍＭ酢酸カルシウム含有）に溶解した。この液
にフラボバクテリウム・ヘパリナム由来のヘパリナーゼ
３０ユニット、ヘパリナーゼII １２ユニットおよび
ヘパリチナーゼＩ ６ユニットを加えて３７℃で５時間
消化した。反応終了後、沸騰浴中にて３分間加熱して酵
素を変性させ、生じた不溶物を３０００ｒｐｍ、１０分
遠心分離して除去した。 【００３０】この上清液に食塩を添加して０．２モル濃
度とし、セルロファインＧＣＬ−９０ｍ（生化学工業株
式会社）カラム（４．５×１０５ｃｍ）に負荷して、
０．２Ｍ食塩溶液にてゲル濾過を行った。４糖相当画分
を分取して濃縮した後で２ｍＬの蒸留水に溶解、セルロ
ファインＧＣＬ−２５（生化学工業株式会社）カラム
（２×４５ｃｍ）を用いて脱塩し、凍結乾燥した。 凍
結乾燥物を１ｍＬの２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）
（２ｍＭ酢酸カルシウム含有）に溶解し、ヘパリチナー
ゼII ２ユニットを加えて３７℃で３時間消化した。以
後、前記と同様に酵素を変性させ、生じた不溶物を３０
００ｒｐｍ、１０分遠心分離して除去し、セルロファイ
ンＧＣＬ−９０ｍカラム（３×１００ｃｍ）で４糖を回
収し、セルロファインＧＣＬ−２５カラム（２×４５ｃ
ｍ）を用いて脱塩、凍結乾燥して化合物Ｉ、II、III を
含むヘパリン不飽和４糖の混合物を得た。 【００３１】この混合物を０．５ｍＬの１６ｍＭリン酸
２水素ナトリウム溶液に溶解し、ＨＰＬＣカラム（アミ
ノシリカゲルカラム、ＰＡ０３ ４．６×２５０ｍｍ、
ＹＭＣ社製）に負荷して、ＨＰＬＣでリン酸２水素ナト
リウム濃度を２００ｍＭから８００ｍＭまで直線的に上
昇せしめて溶出させ、紫外部吸収２３２ｎｍで追跡して
３成分Ｉ、II、III を分取した（図１参照）。 【００３２】いずれの成分も濃縮乾固した後、少量の蒸
留水に溶解、セルリファインＧＣＬ−２５カラムで脱
塩、凍結乾燥してヘパリン不飽和４糖Ｉ、II、III を得
た。それぞれの乾燥物を蒸留水に溶解し、その１部を
０．０１規定の塩酸溶液で希釈して、２３２ｎｍにおけ
る紫外部吸収を求めた。この値を不飽和２糖のモル分子
吸光係数で除してモル濃度を概算した結果、ヘパリン５
００ｍｇからの収量は、Ｉは、３．８ｍｇ、IIは、１
６．８ｍｇ、III は、２．８ｍｇであった。得られたヘ
パリン不飽和４糖の500MHz 1H-NMR スペクトルとプロト
ンの帰属から構造が確認された。 【００３３】各構造の1H-NMRスペクトルのδ値を表１に
まとめて示す。尚、各シグナルの帰属は、二次元ＨＯＨ
ＡＨＡ（Homonuclear Hartmann-Hahn Spectroscopy) 、
ＣＯＳＹ(Corelation Spectroscopy; 同種核シフト相関
２次元ＮＭＲ）で行った。 【００３４】 【表１】 【００３５】実施例２：ブタ小腸由来のヘパリン５００
ｍｇを２０ｍＬ（ミリリットル）の２０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ７．０）（２ｍＭ酢酸カルシウム含有）に溶解し
た。この液にフラボバクテリウム ｓｐ． Ｈｐ２０６
由来のヘパリチナーゼIV ２５ユニット、フラボバクテ
リウム・ヘパリナム由来のヘパリチナーゼII １５ユニ
ットおよびヘパリチナーゼＩ ５ユニットを加えて３７
℃で５時間消化した。後は、実施例１と同様に処理し
た。ヘパリン５００ｍｇからの収量は、Ｉは、４．２ｍ
ｇ、IIは、１７．５ｍｇ、III は、３．１ｍｇであっ
た。 【００３６】 【発明の効果】本発明は、一般式（１）で表されるヘパ
リン不飽和４糖を提供するものであり、これは還元末端
がグルコサミン−３−Ｏ−硫酸で非還元末端が不飽和グ
ルクロン酸を含む新規な構造であって、ヘパリンの抗凝
固活性の制御に係わる部位を含む非常に有用な構造を提
供する。このヘパリン不飽和４糖は、ヘパリンを本発明
による選択した酵素により分解し、生成した混合物を分
画することにより非常に容易に構造が単一な化合物とし
て大量に製造することができる。従って、本発明は、こ
の分野においては非常に高価な試薬の低コスト化が可能
であると共に本発明の化合物を基本とした各種医用材料
あるいは医薬の有用な原料を安価に提供できる。
−硫酸を含む新規なヘパリン不飽和４糖に関する。該不
飽和４糖は、ヘパリンの抗凝血活性の中心となる機能領
域を構成する糖鎖である。また、本発明は、ヘパリンを
原料として酵素的方法によって該不飽和４糖を製造する
方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ヘパリンは抗凝血活性が強いため、医薬
品として広く用いられている。その活性は血液中に存在
するアンチトロンビンIII （ＡＴIII）とヘパリンが複
合体を形成し凝固因子の活性を抑制するためであること
が知られている。このＡＴIIIとヘパリンとが結合する
部分については詳しい研究がなされ、ヘパリンについて
は活性発現に必要な構造としてグルコサミンの３位の炭
素にＯ−硫酸エステルをもつ糖鎖を含む次の５糖（下記
（２））の構造が決定されている。 【０００３】 （式中、Ｒはアセチル基等のアシル基を示す。GlcAはグ
ルクロン酸を、GlcNはグルコサミンを、(3,6-di-SO3)は
３−Ｏ及び６−Ｏ−硫酸エステルを、IdoAはイズロン酸
をそれぞれ示す。） 本構造を特徴づける２糖（上記（３））、GlcA→GlcNSO
3(3,6-di-SO3) はヘパリン糖鎖の中では微量成分であ
る。この２糖（３）はＡＴIIIへの結合には不可欠な成
分であるため、抗凝固活性を保有するヘパリンの最も適
切なマ−カ−となっている。 【０００４】また、ヘパリンがＡＴIIIと結合すること
によって発現する凝固因子に対する抑制活性は、ＡＴII
I結合領域の分子量によって変化することがわかってお
り、このサイズを調節することによって血液凝固Ｘａ因
子（ファクタ−Ｘａ）とトロンビンの活性抑制の程度を
変化させることが可能である。すなわち、ヘパリンの分
子量を小さくするこにより、トロンビンへの阻害活性を
低減して出血作用を抑え、Ｘａ活性への阻害活性は温存
させて血栓形成を抑制するという考えがある。この考え
に基づいて、出血の副作用の少ない血栓予防薬、低分子
ヘパリンが発明されるに至っている。（例えば米国特許
第４，３０３，６５１号、米国特許第４，３９６，７６
２号）。 【０００５】従来、自然界から得られる糖鎖の中で２糖
（３）の構造を有する原料はヘパリン／ヘパラン硫酸の
他はあまり知られていない。しかしながら、ヘパリンか
ら２糖（３）を含むオリゴ糖を効率よく取り出す良い方
法はなく、また、化学合成によってこれを大量に得るこ
とは極めて困難であった。すなわち、これら低分子ヘパ
リンを、ヘパリンの限定的な化学処理によって製造する
場合、分子量が多分散でかつ多種構成糖からなる生産物
しか得られず、活性領域を含むオリゴ糖のみを調製する
ことは困難であった。 【０００６】比較的簡易な方法としては、フラボバクテ
リウム・ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）由来
のヘパリナ−ゼおよびヘパリチナーゼＩを含むヘパリン
分解酵素を用いてヘパリンを徹底分解した後、２糖から
８糖までのオリゴ糖異性体の混合物を高速液体クロマト
グラフィ−（ＨＰＬＣ）で分離して、２糖（３）を還元
端側に含む不飽和６糖を得る方法（K. G. Rice & R. J.
Linhardt, Carbohydr.Res. 190, 219-233, 1989）が知
られている。ここで得られる不飽和６糖は、その純度が
８０％程度とされている。しかしながら、この方法では
２糖（３）を含む不飽和４糖は生成していない。 【０００７】別の報告では同様の方法で２糖（３）が中
間に存在する不飽和６糖が得られ、これを亜硝酸分解す
ることにより還元端がアンヒドロマンノ−ス体に変化し
た不飽和４糖が得られるとの報告がある(J. Choay, J.
C. Lormeau, M. Petitou, P.Snay & J. Fareed, Annals
of the New York Academy of Sciences, 370, 644-64
9, 1981)。 【０００８】以上の通り、従来の報告ではヘパリンから
酵素を用いて２糖（３）を含む最小のオリゴ糖を得よう
としているが、これらの報告を含めて酵素分解法、化学
分解法、化学合成法のいずれによっても、現在までに上
記式（３）の２糖単位を含む不飽和４糖を調製した報告
はない。もし、このような４糖が得られれば、アンチト
ロンビンIII結合領域に関与する糖鎖の合成原料や新し
い血液凝固因子の阻害剤として活用することが期待でき
る。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】本発明の第１の目的
は、グルコサミン−３−Ｏ−硫酸を含む新規なヘパリン
４糖を提供することである。また、他の目的はこのよう
なヘパリン４糖を、ヘパリンを原料として酵素的手段を
用いて効率よく、簡便に得る手法を提供することであ
る。 【００１０】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヘパリン
由来の２糖（３）を含む不飽和４糖を得るべく、ヘパリ
ン／ヘパラン硫酸系の分解酵素の特異性を研究し、その
応用を試みた結果、新規なヘパリン不飽和４糖を効率よ
く、簡易に製造できることを見出し、本発明を完成する
に至った。 【００１１】すなわち本発明は、ヘパリンを、ヘパリチ
ナーゼＩと、ヘパリチナーゼＩＩと、ヘパリナーゼまた
はヘパリチナーゼＩＶとを用いて分解し、この分解生成
物から一般式（１）で表されるヘパリン不飽和４糖を分
取することを特徴とするヘパリン不飽和４糖およびその
塩の製造法を提供するものである。 【００１２】 【化２】 【００１３】（式中、（Ｒ 1 、Ｒ 2 ）は、（ＣＯＣＨ 3 、
Ｈ）、（ＣＯＣＨ 3 、ＳＯ 3 - ）、又は（ＳＯ 3 - 、Ｓ
Ｏ 3 - ）を表す。尚、ＣＯＣＨ 3 （アセチル基；以下「Ａ
ｃ」と略す。））尚、一般式（１）の構造式において、
末端不飽和糖残基を４、以下他の糖残基を１〜３と番号
を当て、各糖残基の基本単位糖を示した。また、一般式
（１）の構造式では電離した状態のみを記載したが、本
発明は、これに限定されないことは明らかであり、これ
にプロトンが付加した構造のもの、あるいはアルカリ金
属（ナトリウム、カリウム、リチウム等）、アルカリ土
類金属（カルシウム、バリウム等）、あるいはアンモニ
ウムイオン等との塩を包含する。 【００１４】以下本発明を具体的に説明する。 【００１５】〔ヘパリン不飽和４糖〕本発明のヘパリン
不飽和４糖は、好ましくは、一般式（１）において下記
置換基を選択した化合物Ｉ〜III である。 化合物Ｉ ：ΔGlcA-GlcNAc(6S)-GlcA-GlcN(NS,3S) （R1はAc、R2はH の場合。) 化合物II ：ΔGlcA-GlcNAc(6S)-GlcA-GlcN(NS,3S,6
S) （R1はAc、R2はSO3 - の場合。) 化合物III ：ΔGlcA-GlcN(NS,6S)-GlcA-GlcN(NS,3S,6
S) （R1はSO3 - 、R2はSO3 - の場合。) （上記式においてΔは不飽和糖であることを、GlcAはグ
ルクロン酸を、GlcNはグルコサミンを、Acはアセチル基
を、NSはＮ−硫酸エステルを、3Sは３−Ｏ−硫酸エステ
ルを、6Sは６−Ｏ−硫酸エステルをそれぞれ示す。） これら本発明の不飽和４糖は還元端糖残基が３−Ｏ−硫
酸エステル化されたグルコサミンである共通構造を有し
ている。後述の実施例に示す通り、本発明の不飽和４糖
の、構造はプロトン核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭ
Ｒ）を測定することにより解析された。 【００１６】〔ヘパリン不飽和４糖の製造〕ヘパリンか
らヘパリン不飽和４糖を切り出すために、活性領域にお
ける２糖（３）周辺の糖鎖構造に作用する酵素を活用す
る手段を検討した。すなわち、このような用途に使用で
きる可能性のある酵素として、二種類のフラボバクテリ
ウム属微生物によって生産された基質特異性の異なる６
種類（ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼＩ、I0、II、IVお
よびＶ）のヘパリン分解酵素を選び、その種々の組合せ
について逐次または同時に用いてヘパリンを分解し、そ
の生成物の組成について調べた。具体的には、各酵素に
よるヘパリンの分解物について、生成オリゴ糖の分解パ
タ−ンをゲル濾過法で、その構成２糖組成の相違を陰イ
オン交換ＨＰＬＣで検討した。 【００１７】その結果、ヘパリンの主構造であるIdo(2S
O3)-GlcNSO3(6SO3)のクラスタ−部分については、ヘパ
リナ−ゼがより早く分解して不飽和の２糖〜８糖の種々
のオリゴ糖を生じやすく、このオリゴ糖に対してヘパリ
チナ−ゼＩおよびＩＩを同時に作用させると、本発明の
前記化合物Ｉ〜III の三種の不飽和４糖と一種の糖−蛋
白質結合部位の不飽和オリゴ糖（ΔGlcA-GlcNAc(6S)-Gl
cA-Gal-Gal-Xyl-Ser）の四種の不飽和オリゴ糖が残るの
みで、他のオリゴ糖は全て不飽和２糖となることが見出
された。このうち一種の不飽和オリゴ糖は、原料として
使用したヘパリンが還元端にペプチドが結合した構造で
ある場合のみ生じる。このオリゴ糖は、ヘパリチナーゼ
Ｖで２糖と４糖-Serに分解されたが、本発明の三種の不
飽和４糖は上記の６種のいずれのヘパリン分解酵素（エ
リミナーゼ）を作用させてもそれ以上は分解されず、不
飽和２糖を生じないことがわかった。なお、これらの６
種の酵素の性質、一般的な基質特異性等については「新
生化学実験講座３、糖質ＩＩ、プロテオグリカンとグリ
コサミノグリカン」、２４４〜２４９頁（１９９１年、
株式会社東京化学同人発行）に記載されているが、ＡＴ
IIIとの結合に関与する２糖単位（３）周辺の構造に対
してどのように作用するかは不明であった。 【００１８】以上の実験結果より、ヘパリンの主糖鎖
（タンパクへの橋渡し構造を除く）については、グルコ
サミン−３−Ｏ−硫酸を含む部分（前記（３）の２糖構
造を含む）のみが酵素分解によって不飽和４糖として残
されるため、本発明の不飽和４糖だけを容易に濃縮、回
収することが可能であることが判明した。以上は本発明
に至る基礎実験であり、本発明のヘパリン不飽和４糖の
製造法はこの結果を基に完成された。 【００１９】本発明の製造法はヘパリンにヘパリチナ−
ゼIIを作用させることを必須要件とする。本発明ではヘ
パリチナ−ゼIIと組み合わせて種々のヘパリン分解酵素
を使用することができる。すなわち、ヘパリチナ−ゼII
を効率よく経済的に作用させるために、ヘパリナ−ゼ、
ヘパリチナ−ゼＩ、I0、IV、ヘパリチナーゼＶ等公知の
ヘパリン分解酵素を併用することができる。本発明にお
いて使用するヘパリン分解酵素としては、フラボバクテ
リウム属微生物（例えば、フラボバクテリウム・ヘパリ
ナム（ＡＴＣＣ １３１２５；米国特願第１８０，７８
０号）、フラボバクテリウムｓｐ．Ｈｐ２０６（微工研
菌寄第１０２０７号；特開平２−５７１８３号）；Xth
International Symposium on Glycoconjugates(Proceed
ings),No228, p.330-331(1989)）由来の酵素が例示され
るが、本発明の目的に適合する限り、他の起源の酵素
（例えば、バチルス属微生物由来；特開平２−１４２４
７０、特願平３−６３７０７）であってもよい。 【００２０】種々のヘパリン分解酵素を併用する際に
は、これらの酵素を任意に組み合わせて混合し用いる
か、単独または二種以上を混合して任意の順序で別々に
作用させることができる。この場合、好ましくは、ヘパ
リチナーゼIIと（ａ：ヘパリナーゼ及びヘパリチナーゼ
IVからなる群）から選択される１種以上の酵素（ａ群酵
素）と（ｂ：ヘパリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼI0及び
ヘパリチナーゼＶからなる群）から選択される１種以上
の酵素（ｂ群酵素）とを併用することが挙げられる。な
お、ヘパリチナーゼIIとａ群酵素およびｂ群酵素の一方
を併用することも可能である。 【００２１】特に、好ましくは、ヘパリチナーゼIIと、
ヘパリチナーゼＩと、ヘパリナーゼまたはヘパリチナー
ゼIVとを併用することが挙げられる。併用の態様として
は、例えばヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼＩおよびIIを
混合してヘパリンに作用させる方法、ヘパリチナ−ゼ
Ｉ、IIおよびIVを混合してヘパリンに作用させる方法、
ヘパリンをヘパリナ−ゼまたはヘパリチナ−ゼIVで消化
した後、不飽和２糖を除去し、これにヘパリチナ−ゼＩ
およびＩＩを加えて再度徹底消化する方法などが例示さ
れる。しかし、いずれの場合においても、ヘパリチナ−
ゼＩＩの使用は必須である。 【００２２】原料として使用するヘパリンは、通常入手
できるヘパリンであればよく、特に限定されない。例え
ば、ブタ、ウシ、ヒツジ、クジラ等の哺乳動物の臓器
（例えば、小腸、肺）由来のヘパリンを使用することが
できる。通常、市販ヘパリンはアルカリ処理を施された
ものであるため、還元端のペプチドや橋渡し構造を失っ
ている場合が多く、本発明による酵素処理を行っても糖
と蛋白質の結合部位の不飽和糖を生じない場合が多い。 【００２３】上記の酵素反応を行う具体的方法、反応条
件は各ヘパリン分解酵素について採用されている通常の
方法および条件であればよく特に限定されない。すなわ
ち、ヘパリンを含有する水性溶液（水溶液、任意の緩衝
剤（例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤
など）を含む溶液）に各種ヘパリン分解酵素を全て混合
して添加し、インキュベートするか、単独または二種以
上混合したヘパリン分解酵素を任意の順序で順次添加し
てインキュベートすることができる。更に、単独または
二種以上の酵素を通常の方法（米国特願第１９６，７２
０号）で固定化た固定化酵素（例えば、セファロース
（ファルマシア・ファインケミカル社製）に固定化した
固定化酵素）を用いて反応させることもできる。 【００２４】反応条件は、二種以上の酵素を混合して用
いるときは各酵素のそれぞれが作用し得る条件を設定す
る必要があるが、二種以上の酵素を別々に作用させると
きは各酵素の最適の反応条件を選択して反応させること
ができる。反応時間は、本発明の不飽和４糖の生成をＨ
ＰＬＣ等のクロマトグラフィーで分析することによって
当業者であれば容易に決定することができる。各ヘパリ
ン分解酵素の最適の反応条件（ｐＨ、温度）は以下の通
りである。 【００２５】ヘパリチナーゼII：至適ｐＨ約７．５、至
適温度約４０℃ ヘパリナーゼ：至適ｐＨ約７．０、至適温度約３０℃ ヘパリチナーゼＩ：至適ｐＨ約６．５〜７．５、至適温
度約４５℃ ヘパリチナーゼI0：至適ｐＨ約７．５、至適温度約４５
℃ ヘパリチナーゼIV：至適ｐＨ約７．５、至適温度約４０
℃ ヘパリチナーゼＶ：至適ｐＨ約７．０、至適温度約４０
℃ 各酵素に共通する反応条件として、例えば、ヘパリン濃
度１．０〜１００ｇ／Ｌの基質溶液を用い、ｐＨ５〜
８、１０〜４０℃において０．１〜１００時間反応させ
る条件が例示される。 【００２６】また、使用する酵素の量は、併用する酵素
の種類によって種々選択され得る。例えば、酵素とし
て、ヘパリチナーゼII、ヘパリチナーゼＩ、及びヘパリ
ナーゼまたはヘパリチナーゼIVを併用する場合、各酵素
量は、ヘパリン１ｇに対しヘパリチナーゼIIが１０〜１
００ユニット、ヘパリチナーゼＩが５〜５０ユニット、
ヘパリナーゼまたはヘパリチナーゼIVが２０〜２００ユ
ニットが例示できる。ここで、ユニットとは、１分間に
１μモルの不飽和糖を生成せしめる力価を意味する。た
だし、力価測定にあたり、基質としては、ヘパリチナー
ゼＩ、I0、II、Ｖについては、ウシ腎臓由来のヘパラン
硫酸を用い、ヘパリナーゼおよびヘパリチナーゼIVにつ
いては、ブタ小腸由来のヘパリンを用いる。 【００２７】酵素によるヘパリンの分解反応終了後、分
解生成オリゴ糖は、通常の分離精製方法、例えば、各種
クロマトグラフィーによって精製され、目的のヘパリン
不飽和４糖を分離精製することができる。例えば、通
常、該分解生成物は、初めゲル濾過によりほぼ４糖近辺
のオリゴ糖を粗分画し、次いで、ＨＰＬＣ（例えば、ポ
リアミン結合シリカゲルカラムを使用するＨＰＬＣ）に
より化合物Ｉ〜III を分離、分画することが挙げられ
る。この場合、分取される分画は、本発明の一般式
（１）を満足する化合物から構成されるのであれば、必
ずしも単一な化合物のみである必要はなく、例えば、化
合物Ｉ〜III から選択される２種以上の混合物であって
もかまわない。また、化合物１〜III の各単品を精製す
る場合は、上記混合物等を再度精製すること等により行
ってもよい。 【００２８】ゲル濾過法としては、分画分子量範囲５０
０〜２０，０００のものが好ましい。また、ＨＰＬＣ
は、陰イオン交換クロマトグラフィーを採用することが
好ましい。 〔用途〕本発明の不飽和４糖は、化合物１〜III あるい
はその構成オリゴ糖、または単糖、特に残基１の３−Ｏ
−硫酸置換糖を貴重な各種試薬として提供できる。ま
た、ヘパリン不飽和４糖は、ＡＴIII結合領域に関与す
る糖鎖の合成原料（素材）や血液凝固因子の新しい阻害
剤としての用途が期待できる。また、該不飽和４糖の還
元端または非還元端を他の糖類、リガンド、医用材料、
その他合成ポリマーに結合させた修飾物は、ＡＴIII結
合性アフィニティー担体として各種クロマトグラフィー
や人工血管表面等の機能性素材として用いることが期待
できる。また、これらの修飾物は弱い抗凝固活性物質と
しての利用が可能である。 【００２９】 【実施例】以下、本発明の具体的実施例を説明するが、
本発明は、これに限定されるものではない。また、各ヘ
パリン分解酵素の呼称は前述の「新生化学実験講座３、
糖質II、プロテオグリカンとグリコサミノグリカン」の
記載にしたがっている。 実施例１：ブタ小腸由来のヘパリン５００ｍｇを２０ｍ
Ｌ（ミリリットル）の２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ７．
０）（２ｍＭ酢酸カルシウム含有）に溶解した。この液
にフラボバクテリウム・ヘパリナム由来のヘパリナーゼ
３０ユニット、ヘパリナーゼII １２ユニットおよび
ヘパリチナーゼＩ ６ユニットを加えて３７℃で５時間
消化した。反応終了後、沸騰浴中にて３分間加熱して酵
素を変性させ、生じた不溶物を３０００ｒｐｍ、１０分
遠心分離して除去した。 【００３０】この上清液に食塩を添加して０．２モル濃
度とし、セルロファインＧＣＬ−９０ｍ（生化学工業株
式会社）カラム（４．５×１０５ｃｍ）に負荷して、
０．２Ｍ食塩溶液にてゲル濾過を行った。４糖相当画分
を分取して濃縮した後で２ｍＬの蒸留水に溶解、セルロ
ファインＧＣＬ−２５（生化学工業株式会社）カラム
（２×４５ｃｍ）を用いて脱塩し、凍結乾燥した。 凍
結乾燥物を１ｍＬの２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）
（２ｍＭ酢酸カルシウム含有）に溶解し、ヘパリチナー
ゼII ２ユニットを加えて３７℃で３時間消化した。以
後、前記と同様に酵素を変性させ、生じた不溶物を３０
００ｒｐｍ、１０分遠心分離して除去し、セルロファイ
ンＧＣＬ−９０ｍカラム（３×１００ｃｍ）で４糖を回
収し、セルロファインＧＣＬ−２５カラム（２×４５ｃ
ｍ）を用いて脱塩、凍結乾燥して化合物Ｉ、II、III を
含むヘパリン不飽和４糖の混合物を得た。 【００３１】この混合物を０．５ｍＬの１６ｍＭリン酸
２水素ナトリウム溶液に溶解し、ＨＰＬＣカラム（アミ
ノシリカゲルカラム、ＰＡ０３ ４．６×２５０ｍｍ、
ＹＭＣ社製）に負荷して、ＨＰＬＣでリン酸２水素ナト
リウム濃度を２００ｍＭから８００ｍＭまで直線的に上
昇せしめて溶出させ、紫外部吸収２３２ｎｍで追跡して
３成分Ｉ、II、III を分取した（図１参照）。 【００３２】いずれの成分も濃縮乾固した後、少量の蒸
留水に溶解、セルリファインＧＣＬ−２５カラムで脱
塩、凍結乾燥してヘパリン不飽和４糖Ｉ、II、III を得
た。それぞれの乾燥物を蒸留水に溶解し、その１部を
０．０１規定の塩酸溶液で希釈して、２３２ｎｍにおけ
る紫外部吸収を求めた。この値を不飽和２糖のモル分子
吸光係数で除してモル濃度を概算した結果、ヘパリン５
００ｍｇからの収量は、Ｉは、３．８ｍｇ、IIは、１
６．８ｍｇ、III は、２．８ｍｇであった。得られたヘ
パリン不飽和４糖の500MHz 1H-NMR スペクトルとプロト
ンの帰属から構造が確認された。 【００３３】各構造の1H-NMRスペクトルのδ値を表１に
まとめて示す。尚、各シグナルの帰属は、二次元ＨＯＨ
ＡＨＡ（Homonuclear Hartmann-Hahn Spectroscopy) 、
ＣＯＳＹ(Corelation Spectroscopy; 同種核シフト相関
２次元ＮＭＲ）で行った。 【００３４】 【表１】 【００３５】実施例２：ブタ小腸由来のヘパリン５００
ｍｇを２０ｍＬ（ミリリットル）の２０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ７．０）（２ｍＭ酢酸カルシウム含有）に溶解し
た。この液にフラボバクテリウム ｓｐ． Ｈｐ２０６
由来のヘパリチナーゼIV ２５ユニット、フラボバクテ
リウム・ヘパリナム由来のヘパリチナーゼII １５ユニ
ットおよびヘパリチナーゼＩ ５ユニットを加えて３７
℃で５時間消化した。後は、実施例１と同様に処理し
た。ヘパリン５００ｍｇからの収量は、Ｉは、４．２ｍ
ｇ、IIは、１７．５ｍｇ、III は、３．１ｍｇであっ
た。 【００３６】 【発明の効果】本発明は、一般式（１）で表されるヘパ
リン不飽和４糖を提供するものであり、これは還元末端
がグルコサミン−３−Ｏ−硫酸で非還元末端が不飽和グ
ルクロン酸を含む新規な構造であって、ヘパリンの抗凝
固活性の制御に係わる部位を含む非常に有用な構造を提
供する。このヘパリン不飽和４糖は、ヘパリンを本発明
による選択した酵素により分解し、生成した混合物を分
画することにより非常に容易に構造が単一な化合物とし
て大量に製造することができる。従って、本発明は、こ
の分野においては非常に高価な試薬の低コスト化が可能
であると共に本発明の化合物を基本とした各種医用材料
あるいは医薬の有用な原料を安価に提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるＨＰＬＣの結果を示すクロマ
トグラムである。
トグラムである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，1990,
29，ｐ．4362−4368
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，1981，90，ｐ.
1553−1556
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，1982，205，ｐ.
23−30
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12P 19/00 - 19/64
C07H 11/00
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 ヘパリンを、ヘパリチナーゼＩと、ヘパ
リチナーゼＩＩと、ヘパリナーゼまたはヘパリチナーゼ
ＩＶとを用いて分解し、この分解生成物から一般式
（１）で表されるヘパリン不飽和４糖を分取することを
特徴とするヘパリン不飽和４糖およびその塩の製造法。 【化１】（式中、（Ｒ 1 、Ｒ 2 ）は、（ＣＯＣＨ 3 、Ｈ）、（ＣＯ
ＣＨ 3 、ＳＯ 3 - ）、又は（ＳＯ 3 - 、ＳＯ 3 - ）を表す。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19900492A JP3522775B2 (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | ヘパリン不飽和４糖およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19900492A JP3522775B2 (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | ヘパリン不飽和４糖およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0616687A JPH0616687A (ja) | 1994-01-25 |
| JP3522775B2 true JP3522775B2 (ja) | 2004-04-26 |
Family
ID=16400508
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19900492A Expired - Lifetime JP3522775B2 (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | ヘパリン不飽和４糖およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3522775B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2161615B1 (es) * | 1999-07-23 | 2003-03-16 | Rovi Lab Farmaceut Sa | Composiciones de heparinas de muy bajo peso molecular. |
| JP4897991B2 (ja) * | 1999-07-23 | 2012-03-14 | ラボラトリオス ファルマセウティコス ロビ ソシエダッド アノニマ | 超低分子量ヘパリン組成物 |
| JP4768936B2 (ja) * | 2000-08-07 | 2011-09-07 | 生化学工業株式会社 | 硫酸基を有するオリゴ糖 |
| WO2008068854A1 (ja) | 2006-12-05 | 2008-06-12 | Glycoscience Laboratories, Inc. | 変形性関節症の治療剤 |
-
1992
- 1992-07-03 JP JP19900492A patent/JP3522775B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，１９８２，２０５，ｐ．２３−３０ |
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０，２９，ｐ．４３６２−４３６８ |
| Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８１，９０，ｐ．１５５３−１５５６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0616687A (ja) | 1994-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4916219A (en) | Oligosaccharide heparin fragments as inhibitors of complement cascade | |
| EP0014184B2 (en) | Heparin fragments having a selective anticoagulation activity and process for their preparation | |
| Loganathan et al. | Structural variation in the antithrombin III binding site region and its occurrence in heparin from different sources | |
| US4401758A (en) | Process for making oligosaccharides having anti-Xa activity and the resulting oligosaccharides | |
| CA1171375A (en) | Oligosaccharides having selective anticoagulation activity | |
| Mascellani et al. | Structure and contribution to the heparin cofactor II-mediated inhibition of thrombin of naturally oversulphated sequences of dermatan sulphate | |
| Linhardt et al. | Search for the heparin antithrombin III-binding site precursor. | |
| Li et al. | Low-molecular-weight fucosylated glycosaminoglycan and its oligosaccharides from sea cucumber as novel anticoagulants: A review | |
| JPH07501684A (ja) | 抗凝固剤およびその調製方法 | |
| Petitou et al. | Is there a unique sequence in heparin for interaction with heparin cofactor II? Structural and biological studies of heparin-derived oligosaccharides. | |
| Chi et al. | Mass spectrometry for the analysis of highly charged sulfated carbohydrates | |
| Linhardt et al. | Low molecular weight dermatan sulfate as an antithrombotic agent structure-activity relationship studies | |
| JP2007501305A (ja) | 血漿中で高度の抗血栓活性を有する多糖類誘導体 | |
| Yamada et al. | Structural studies on the tri-and tetrasaccharides isolated from porcine intestinal heparin and characterization of heparinase/heparitinases using them as substrates | |
| US20080207895A1 (en) | Methods for synthesizing polysaccharides | |
| JP3522775B2 (ja) | ヘパリン不飽和４糖およびその製造法 | |
| AU6287594A (en) | Heparan sulphate oligosaccharides having hepatocyte growth factor binding affinity | |
| Linhardt et al. | New methodologies in heparin structure analysis and the generation of LMW heparins | |
| Chavante et al. | A novel heparan sulphate with high degree of N-sulphation and high heparin cofactor-II activity from the brine shrimp Artemia franciscana | |
| Van Boeckel et al. | Synthesis and conformational analysis of an analogue of the antithrombin‐binding region of heparin: The role of the carboxylate function of α‐L‐idopyranuronate | |
| Larnkjaer et al. | Isolation and charaterization of hexasaccharides derived from heparin. Analysis by HPLC and elucidation of structure by 1H NMR | |
| Hoffman et al. | Studies on the blood-anticoagulant activity of sulphated polysaccharides with different uronic acid content | |
| Danishefsky | Synthesis and properties of heparin derivatives | |
| MOFFAT et al. | Heparinase II from Flavobacterium heparinum: HPLC analysis of the saccharides generated from chemically modified heparins | |
| US4539398A (en) | Affinity fractionation of heparin on immobilized Concanavalin A |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040128 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040205 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080220 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090220 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090220 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100220 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110220 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130220 Year of fee payment: 9 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130220 Year of fee payment: 9 |