JP4505056B2 - 抗トロンビン活性物質 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
【０００２】
本発明は、抗トロンビン活性物質に関し、詳細には、血栓症等の阻害剤として有効な抗トロンビン活性物質に関する。
【０００３】
【従来の技術】
【０００４】
抗トロンビン活性物質としては、ヘパリンが最もよく知られている。
該ヘパリンは、哺乳類の組織、特に牛の肝、肺、豚や羊の腸粘膜から抽出し、分画法で精製することで製造されているが、製造工程において、不快な臭気が発生したり、残渣処理に手間がかかる等の問題を有していた。
そのため、製造上の問題がない抗トロンビン活性物質を見つけ出す多くの試みがなされている。
従来、製造上の問題がない抗トロンビン活性物質として、硫酸化多糖類が有効であることが知られており、例えば、褐藻類フコイダン由来の物質等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、製造上の問題がない抗トロンビン活性物質として、従来より知られている褐藻類フコイダン由来の物質等とは、全く別の新規な物質を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、日本国の万田発酵株式会社製の万田酵素（商品名）から精製した成分中の硫酸化ヘテロ多糖体が、抗トロンビン活性物質であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の課題を解決するための手段は、下記のとおりである。
【００１０】
第１に、硫酸基及びウロン酸残基を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコースと、フコース以外の中性糖の組成が、フコース：フコース以外の中性糖＝１．０：０．６〜１．４の比率である、抗トロンビン活性物質。
第２に、硫酸基及びウロン酸残基を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３０〜０．４０：０．２３〜０．３３：０．１７〜０．２７：０．１０〜０．１０の比率で含まれる、抗トロンビン活性物質。
第３に、硫酸基及びウロン酸残基を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３５：０．２８：０．２２：０．１５の比率で含まれる、抗トロンビン活性物質。
第４に、硫酸基（１８．０〜２３．０％）及びウロン酸残基（５．６〜８．６％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３３〜０．３７：０．２６〜０．３０：０．２０〜０．２４：０．１３〜０．１７の比率で含まれ、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定された平均分子量が１９０〜２５０ｋＤａである、抗トロンビン活性物質。
第５に、硫酸基（２０．５％）及びウロン酸残基（７．１％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３５：０．２８：０．２２：０．１５の比率で含まれ、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定された平均分子量が２２２ｋＤａである、抗トロンビン活性物質。
【００１１】
【実施例】
【００１２】
以下に、本発明の実施例及び試験例について説明する。
なお、実施例や試験例で用いたものは、以下のように入手した。
ブタ腸粘膜由来のヘパリン、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ（ヒバマタ目の褐藻類）由来のフコイダン、ヒトトロンビン、ウシフィブリノーゲンは、シグマケミカル社（セントルイス、ミズーリー州）より購入した。
クエン酸処理したヒト保存血漿、アクチン活性化セファロプラスチン試薬、トロンボプラスチンＣプラスは、デイドインターナショナル社（マイアミ、フロリダ州）から入手した。
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ及びセファロースＣＬ−６Ｂは、ファルマシアバイオテック社（ウップザラ、スウェーデン）から入手した。
クロモチームＴＨ（トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−パラニトロソアニリド）は、ベーリンガーマンハイム社（バスレ、スイス）から入手した。
セルロースアセテート膜は、ヘレナラボラトリーズ社（ビューモント、テキサス州）から入手した。
【００１３】
（ａ）工程［抽出及びエタノール分画工程］
【００１４】
日本国の万田発酵株式会社製の万田酵素（１５０ｇ湿重量）を、３００ｍｌの蒸留水中に懸濁し、室温で２時間撹拌した後、３層からなる布地で濾過した。
濾過後の溶液を１１０００Ｇで２０分間遠心した後に、上清に冷エタノールを加え、エタノール濃度が１０％になるように調整した。
調整後の溶液を、室温で２０分間撹拌した後に、１１０００Ｇで２０分間遠心し沈殿物を除いた後に、上清に冷エタノールを加え、エタノール濃度が５５％になるように調整した。
調整後の溶液を、更に、１１０００Ｇで２０分間遠心し、今度は沈殿物を採取した。
該沈殿物を窒素気流中で乾燥させ、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）４００ｍｌ中に溶解させた。
その溶液を、１１０００Ｇで２０分間遠心し、沈殿物を取り除き、窒素気流中で乾燥させ可溶性の多糖体を得た。
【００１５】
（ｂ）工程［ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィー］
【００１６】
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（６．７ｃｍ×２．５ｃｍ）に、可溶性の多糖体（１．５ｇ）を充填した。
充填後、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を４００ｍｌ流した。
ここで、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中の塩化ナトリウムの濃度（０．３Ｍ〜２．０Ｍ）を直線的に変化させ、６０ｍｌ／ｈの流速で溶出した。
溶出した画分について、フィブリン凝集時間の延長によって、抗トロンビン活性を評価し、図１に示した。
図１によると、抗トロンビン活性物質は二つの画分に分かれ、少ない方の画分は活性も非常に弱かったので、抗トロンビン活性が多い画分（フラクション番号４０〜７０）を集めて部分精製し、水で透析した後、凍結乾燥により、多糖体標品を得た。
【００１７】
（ｃ）工程［セファロースＣＬ−６Ｂゲル濾過クロマトグラフィー］
【００１８】
部分精製した多糖体標品（６１ｍｇ）を、セファロースＣＬ−６Ｂカラム（１１５ｃｍ×１．２８ｃｍ）に重層した。
重層後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）により、３０ｍｌ／ｈの流速で溶出した。
溶出した画分について、フィブリン凝集時間の延長によって、抗トロンビン活性を評価し、図２に示した。ここで、糖含量はフェノール硫酸法によって測定した。
なお、図２で「○−○」は抗トロンビン活性を示し、「●−●」は糖含量を示す。
図２に示す、抗トロンビン活性が多い画分（０．３９〜０．６２）を集めて、水で透析した後、凍結乾燥し、本発明に係る抗トロンビン活性物質（２４ｍｇ）を得た。
図２のグラフを考察すると、本発明に係る抗トロンビン活性物質は、クロマトグラム上で実質的に単一で対照的なピークを与える抗トロンビン活性を持つ多糖体であることが確認できる。
【００１９】
【試験例１】
［電気泳動］
【００２０】
上記実施例で得た抗トロンビン活性物質について、精製純度を確認するために、電気泳動を行った。
電気泳動は、Ｎａｒｄｅｌｌａらの方法［Ｎａｒｄｅｌｌａ，Ａ．，Ｃｈａｕｂｅｔ，Ｆ．，Ｂｏｉｓｓｏｎ−Ｖｉｄａｌ，Ｃ．，Ｂｌｏｎｄｉｎ，Ｃ．，Ｄｕｒａｎｄ，Ｐ．，ａｎｄ Ｊｏｚｅｆｏｎｖｉｃｚ，Ｊ．，Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆｕｃａｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒａｄｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆｕｃａｎｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｒｏｗｎ ｓｅａｗｅｅｄ Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２８９，２０１−２０８（１９９６）］と同様の方法によりセルロースアセテート膜上で行った。
すなわち、０．３Ｍの酢酸カルシウム（ｐＨ７．５）中で、１．５時間、１．５ｍＡ／ｃｍの条件で電気泳動を行った後、膜を０．１％トルイジンブルーを含む３％酢酸で染色し、３％酢酸で脱染色し、図３中にレーン２として示した。
ここで、市販のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ（ヒバマタ目の褐藻類）由来のフコイダンを標準物質として用い、図３中にレーン１として示した。
図３の結果を考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質は、セルロースアセテート膜電気泳動で単一のバンドを示すことが確認できた。
【００２１】
【試験例２】
［サイズ排除ＨＰＬＣ］
【００２２】
上記実施例で得た抗トロンビン活性物質について、精製純度を確認するために、電気泳動に加え、サイズ排除ＨＰＬＣを行った。
サイズ排除ＨＰＬＣは、約１０から２０００ｋＤａの分子量のデキストランを分離するＳｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｃｋ ＫＢ−８０５（昭和電工製）を用い、０．２Ｍ塩化ナトリウムにより１．０ｍｌの流速で行ない、示差屈折計により検出した。その結果を図４に示した。
図４の結果を考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質は、鋭く対称なピークを示し、図３の結果と併せて考慮すると、単一に近い状態で精製されたことが確認できた。
【００２３】
【試験例３】
［分子量の決定］
【００２４】
平均分子量は、Ｚｈｕａｎｇらの方法［Ｚｈａｕｎｇ，Ｃ．，Ｉｔｏｈ，Ｈ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｈ．，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｉｔｖｅ ｆｕｃｏｉｄａｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｒｏｗｎ ｓｅａｗｅｅｄ，Ｕｍｉｔｏｒａｎｏｏ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｔｈｎｂｅｒｇｉｉ）．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，５６３−５６７（１９９５）］により、０．３Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したセファロースＣＬ−６Ｂゲル濾過カラムにより測定した。
ここで、較正曲線は分子量マーカーとしてデキストラン（分子量６７，１４８，２８２，４６４）を用いて作成した。
その結果に加え、後の試験例で測定した硫酸含量、中性糖の組成、活性の結果と共に、表１に示す。なお、表１では、他の起源の硫酸化多糖体についての測定結果も示した。
【００２５】
【表１】
【００２６】
表１に示すように、本発明の抗トロンビン活性物質は、平均分子量が２２２ｋＤａと推定され、褐藻類及びきのこの一種であるカワラタケからの活性な硫酸化多糖体のものとは異なることが確認された。
【００２７】
【試験例４】
［化学分析］
【００２８】
糖分の総量は、Ｄｕｂｉｏｓらの方法［Ｄｕｂｉｏｓ，Ｍ．Ｋ．Ａ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｔ．Ｋ．，Ｒｅｂｅｒｓ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｏｎｉｓｔｈ，Ｆ．，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２８，３５０−３５８（１９５６）］により、フコースを標準としてフェノール−硫酸法で測定した。
ウロン酸含量は、ＢｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚとＡｓｂｏｅ−Ｈａｎｓｅｎ［Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ，Ｎ．ａｎｄ Ａｓｂｏｅ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｇ．，Ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４（２），４８４−４８９（１９７３）］のメタヒドロキシジフェニル硫酸法変法によりＤ−グルクロン酸を標準として用いて測定した。
硫酸含量は、ＤｏｇｓｏｎとＰｒｉｃｅの比濁法［Ｄｏｇｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．ａｎｄ Ｐｒｉｃｅ，Ｒ．Ｇ．，Ａ ｎｏｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｔｅｒ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｕｌｐｈａｔｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，８４，１０６−１１０（１９６２）］により、硫酸カリウムを標準として定量した。
赤外線スペクトルは、バイオラッドＦＴＳ−６０スペクトロメーター（ヘラクレス、カリフォルニア州）により測定した。
中性糖は、以下に記述するＪｏｎｅｓとＡｌｂｅｒｓｈｅｉｍの方法［Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄ Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ，Ｐ．，Ａ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｄｏｓｅ ａｎｄ ｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４９，９２６−９３６（１９７２）］により分析した。
その結果を、上記の表１に示す。
表１に示すように、本発明の抗トロンビン活性物質の中性糖は、フコース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコースから構成されており、中でもフコースが最も多量に含まれ、全中性糖の中の５０％を占めることが確認できた。
また、抗凝固及び抗トロンビン活性を持つフコース含有多糖体が種々の起源、特に褐藻類から単離されているが、本発明の抗トロンビン活性物質の硫酸含量と糖組成は、他のフコイダン硫酸と明らかに異なっていることが確認できた。
そして、本発明の抗トロンビン活性物質は、相当量の硫酸基（２０．５％）を含む硫酸化ヘテロ多糖体であり、その他にウロン酸（７．１％）も含んでいた。
【００２９】
上記実施例で得た抗トロンビン活性物質（２ｍｇ）を、２．０Ｍトリフルオロ酢酸により１２１℃で６時間加水分解し、ミオイノシトールを内部標準として生成した糖のアルジトールアセテート誘導体をスペルコＳＰ−２３８０カラム（スペルコ社、ベルフォンテ、ペンシルベニア州）を備えたＹｏｕｎｇ Ｌｉｎ Ｍ６００Ｄ型ガスクロマトグラフにて測定し、図５のＢに赤外線スペクトルを示した。
なお、図５のＡは、市販のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来のフコイダンの測定結果を示す。
図５の結果を考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質の赤外線スペクトルの吸収特性は、糖に結合した硫酸基に由来する少なくとも二つの吸収バンドを示している。
そして、図５に見られるようにＳ＝Ｏ伸縮振動に基ずく１２５７ｃｍ−１の強い吸収に加え、８４７ｃｍ−１付近に現れるＣ−Ｏ−Ｓに基ずく吸収ピークは、Ｃ１配座のフコピラノースのアキシアルＣ−４位に結合する硫酸基の指標であることが知られている。
すなわち、本発明の抗トロンビン活性物質の赤外線スペクトルは、Ｆｕｃｕｓｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ（ヒバマタ目の褐藻類）由来の抗凝固フコイダン硫酸のものと各ピークの位置や全体的な形状が酷似していることが確認できた。
【００３０】
【試験例５】
［抗凝固活性の測定］
【００３１】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、トロンビン時間（ＴＴ）は、血液凝固測定装置（型式：Ｃｏａｇ−Ｓｔａｔ、（株）京都第一科学製）を用いてＦｏｘらの方法［Ｆｏｘ，Ｉ．，Ｄａｗｓｏｎ Ａ．，Ｌｏｎｄｓ，Ｐ．，Ｅｉｓｎｅｒ，Ｊ．，．Ｆｉｎｄｌｅｎ，Ｋ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｅ．，Ｈａｎｓｏｎ，Ｄ．，Ｍａｎｔ，Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ，Ｊ．，Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＨｉｒｕｌｏｇＴＭ，ａ ｄｉｒｅｃｔ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｃｍｏｓｔ．，６９（２），１５７−１６３（１９９３）．］に準じ、測定した。
すなわち、実施例で得た抗トロンビン活性物質を溶かした溶液（１５μｌ）、クエン酸処理したヒト保存血漿（１００μｌ）を３７℃で３分間培養した。
培養後、それぞれ２００μｌのトロンボプラスチンＣ試薬を添加した後にＰＴ及びＴＴを測定した。
また、培養後、それぞれ１００μｌのトロンビン溶液（５Ｕ／ｍｌ）添加した後にも、ＰＴ及びＴＴを測定した。
さらに、培養後、それぞれ２０ｍＭ塩化カルシウムを１００μｌ添加し、ａＰＴＴを測定した。
【００３２】
【試験例６】
［抗トロンビン活性の検定］
【００３３】
Ｃａｐｐｉｅｌｌｏらの方法［Ｃａｐｐｉｅｌｌｏ，Ｍ．，Ｖｉｌａｒｄｏ，Ｐ．Ｇ．，Ｌｉｐｐｉ，Ａ．，Ｃｒｉｓｃｕｏｌｉ，Ｍ．，Ｃｏｒｓｏ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ Ｍｕｒａ，Ｕ．，Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｈｉｒｎｏｒｍ ＩＶ ａｎｄ Ｈｉｒｕｎｏｒｍ Ｖ）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５２，１１４１−１１４６（１９９６）］により、フィブリノーゲン凝集活性及びアミド分解活性を測定した。
【００３４】
（ａ）フィブリノーゲン凝集活性
【００３５】
ヒト血漿トロンビン及びウシ血漿フィブリノーゲンは、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、０．１％ＰＥＧ６０００を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ７．４）に溶解した。
実施例で得た抗トロンビン活性物質を、蒸留水に溶解して種々の濃度に調整し、各濃度の多糖体標品（１０μｌ）と０．１２５％のフィブリノーゲン溶液（２００μｌ）を混合し、３７℃で３分間前培養した。
培養後の混合液に、トロンビン溶液（５Ｕ／ｍｌ，１００μｌ）を加え、凝集塊の形成される時間を血液凝固測定装置（型式：Ｃｏａｇ−Ｓｔａｔ、（株）京都第一科学製）を用いて測定し、凝集時間の延長により抗凝固作用を調べた。
その結果を図６に示した。
なお、図６において、相対的抗凝固活性とは、対照の凝集時間に対する活性の％を示したもので、データーは平均値±標準偏差により表示し、「○−○」は活性化部分トロンボプラスチン時間を示し、「●−●」はプロトロンビン時間を示し、「□−□」はトロンビン時間を示す。
図６の結果を考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質は、活性化部分トロンボプラスチン時間及びトロンビン時間において濃度依存的な抗凝固作用が認められたが、プロトロンビン時間においては認められなかった。
したがって、本発明の抗トロンビン活性物質の活性は、内因性の凝固作用及び血漿の凝固の第三相に関与していると考えられる。
ここで、トロンビン時間の著しい上昇は、トロンビンによるフィブリンの形成が関わる凝固の第三相が強力に阻害されているということを示している。
また、活性化部分トロンボプラスチン時間及びトロンビン時間における凝集時間を２倍に延長するのに要する本発明の抗トロンビン活性物質の濃度は、それぞれ１４．３及び２．４μｇ／ｍｌであったが、その濃度は生体内での作用に匹敵するものである。
【００３６】
（ｂ）アミド分解活性
【００３７】
上述のフィブリノーゲン凝集活性の測定の場合と同様に、緩衝液に溶解したヒト血漿トロンビンと種々の濃度の多糖体標品とを混合し、２５℃で３分間前培養した。
培養後の混合液に、クロモチームＴＨ（１．９ｍＭ）を添加し、アミド分解反応を開始し、４０５ｎｍの吸光度の分光光学的測光によりパラニトロアニリンの遊離を測り、トロンビンによるクロモチームＴＨの加水分解を測定した。
その結果を図７に示した。
なお、図７は、各濃度の抗トロンビン活性物質について、「○−○」は抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の延長を示し、「●−●」はパラニトロソアニリンの遊離を示す。
本発明の抗トロンビン活性物質は、ヘパリンコファクターＩＩ及び抗トロンビンＩＩＩのようなプロテアーゼ阻害剤の非存在下にトロンビンによるフィブリノーゲンの分解を有意に阻害するものである。
凝集を５０％阻害する本発明の抗トロンビン活性物質の濃度は、０．２９μｇ／ｍｌであった。
しかしながら、本発明の抗トロンビン活性物質は、５μｇ／ｍｌの濃度までトロンビンのアミド分解活性を阻害しなかった。
より高濃度（５０μｇ／ｍｌ）でさえ、本発明の抗トロンビン活性物質によるアミド分解活性はほんのわずかで７％までであった。
同様の効果がヒルジン様合成ペプチドでも報告されており、トロビンのフィブリノーゲン凝集活性は阻害するが、クロモチームＴＨのアミド分解活性には何ら影響しない。抗トロンビンのフィブリノーゲン−トロンビン相互作用に対して二つの有力な説明がなされている。
即ち、抗トロンビン物質がトロンビンの触媒部位の近傍に結合し、フィブリノーゲンのトロンビンへの接触を阻害するという説と、もう一つは、抗トロンビン物質がフィブリノーゲン側のトロンビン結合部位の近傍に結合し、トロンビンのフィブリノーゲンへの接触を阻害するという説である。
フコイダンのフィブリノーゲン−トロンビン相互作用に対する阻害活性は、後者の説によりこの多糖体がフィブリノーゲンへ結合することによって生じる立体障害によるものとされ、本発明の抗トロンビン活性物質も抗トロンビン物質がフィブリノーゲン側のトロンビン結合部位の近傍に結合し、トロンビンのフィブリノーゲンへの接触を阻害するものであることが確認できた。
結論として、本発明の抗トロンビン活性物質は、これまで報告されているその他の活性なフコイダン硫酸と分子量及び糖組成の点で、はっきりとは異なる抗凝固及び抗トロンビン活性をもつ新規多糖体であることが確認できた。
【００３８】
【発明の効果】
【００３９】
本発明の抗トロンビン活性物質は、製造上の問題がない抗トロンビン活性物質として従来より知られている褐藻類フコイダン由来の物質等とは、全く別の新規な物質であり、優れた抗トロンビン活性を有している。
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ｂ）工程のクロマトグラフィーにおける各画分の抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の延長によって評価したグラフ
【図２】（ｃ）工程のゲル濾過クロマトグラフィーにおける各画分の抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の延長によって評価したグラフ
【図３】電気泳動の結果を示す写真
【図４】サイズ排除ＨＰＬＣの結果を示すグラフ
【図５】本発明の抗トロンビン活性物質及び市販のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来のフコイダンの赤外線スペクトルを示すグラフ
【図６】各濃度の抗トロンビン活性物質について、凝集時間の延長により抗凝固作用を示すグラフ
【図７】各濃度の抗トロンビン活性物質について、凝集時間の延長により抗トロンビン活性を示すグラフ
【発明が属する技術分野】
【０００２】
本発明は、抗トロンビン活性物質に関し、詳細には、血栓症等の阻害剤として有効な抗トロンビン活性物質に関する。
【０００３】
【従来の技術】
【０００４】
抗トロンビン活性物質としては、ヘパリンが最もよく知られている。
該ヘパリンは、哺乳類の組織、特に牛の肝、肺、豚や羊の腸粘膜から抽出し、分画法で精製することで製造されているが、製造工程において、不快な臭気が発生したり、残渣処理に手間がかかる等の問題を有していた。
そのため、製造上の問題がない抗トロンビン活性物質を見つけ出す多くの試みがなされている。
従来、製造上の問題がない抗トロンビン活性物質として、硫酸化多糖類が有効であることが知られており、例えば、褐藻類フコイダン由来の物質等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、製造上の問題がない抗トロンビン活性物質として、従来より知られている褐藻類フコイダン由来の物質等とは、全く別の新規な物質を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、日本国の万田発酵株式会社製の万田酵素（商品名）から精製した成分中の硫酸化ヘテロ多糖体が、抗トロンビン活性物質であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の課題を解決するための手段は、下記のとおりである。
【００１０】
第１に、硫酸基及びウロン酸残基を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコースと、フコース以外の中性糖の組成が、フコース：フコース以外の中性糖＝１．０：０．６〜１．４の比率である、抗トロンビン活性物質。
第２に、硫酸基及びウロン酸残基を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３０〜０．４０：０．２３〜０．３３：０．１７〜０．２７：０．１０〜０．１０の比率で含まれる、抗トロンビン活性物質。
第３に、硫酸基及びウロン酸残基を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３５：０．２８：０．２２：０．１５の比率で含まれる、抗トロンビン活性物質。
第４に、硫酸基（１８．０〜２３．０％）及びウロン酸残基（５．６〜８．６％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３３〜０．３７：０．２６〜０．３０：０．２０〜０．２４：０．１３〜０．１７の比率で含まれ、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定された平均分子量が１９０〜２５０ｋＤａである、抗トロンビン活性物質。
第５に、硫酸基（２０．５％）及びウロン酸残基（７．１％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３５：０．２８：０．２２：０．１５の比率で含まれ、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定された平均分子量が２２２ｋＤａである、抗トロンビン活性物質。
【００１１】
【実施例】
【００１２】
以下に、本発明の実施例及び試験例について説明する。
なお、実施例や試験例で用いたものは、以下のように入手した。
ブタ腸粘膜由来のヘパリン、Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ（ヒバマタ目の褐藻類）由来のフコイダン、ヒトトロンビン、ウシフィブリノーゲンは、シグマケミカル社（セントルイス、ミズーリー州）より購入した。
クエン酸処理したヒト保存血漿、アクチン活性化セファロプラスチン試薬、トロンボプラスチンＣプラスは、デイドインターナショナル社（マイアミ、フロリダ州）から入手した。
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ及びセファロースＣＬ−６Ｂは、ファルマシアバイオテック社（ウップザラ、スウェーデン）から入手した。
クロモチームＴＨ（トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−パラニトロソアニリド）は、ベーリンガーマンハイム社（バスレ、スイス）から入手した。
セルロースアセテート膜は、ヘレナラボラトリーズ社（ビューモント、テキサス州）から入手した。
【００１３】
（ａ）工程［抽出及びエタノール分画工程］
【００１４】
日本国の万田発酵株式会社製の万田酵素（１５０ｇ湿重量）を、３００ｍｌの蒸留水中に懸濁し、室温で２時間撹拌した後、３層からなる布地で濾過した。
濾過後の溶液を１１０００Ｇで２０分間遠心した後に、上清に冷エタノールを加え、エタノール濃度が１０％になるように調整した。
調整後の溶液を、室温で２０分間撹拌した後に、１１０００Ｇで２０分間遠心し沈殿物を除いた後に、上清に冷エタノールを加え、エタノール濃度が５５％になるように調整した。
調整後の溶液を、更に、１１０００Ｇで２０分間遠心し、今度は沈殿物を採取した。
該沈殿物を窒素気流中で乾燥させ、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）４００ｍｌ中に溶解させた。
その溶液を、１１０００Ｇで２０分間遠心し、沈殿物を取り除き、窒素気流中で乾燥させ可溶性の多糖体を得た。
【００１５】
（ｂ）工程［ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィー］
【００１６】
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（６．７ｃｍ×２．５ｃｍ）に、可溶性の多糖体（１．５ｇ）を充填した。
充填後、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を４００ｍｌ流した。
ここで、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中の塩化ナトリウムの濃度（０．３Ｍ〜２．０Ｍ）を直線的に変化させ、６０ｍｌ／ｈの流速で溶出した。
溶出した画分について、フィブリン凝集時間の延長によって、抗トロンビン活性を評価し、図１に示した。
図１によると、抗トロンビン活性物質は二つの画分に分かれ、少ない方の画分は活性も非常に弱かったので、抗トロンビン活性が多い画分（フラクション番号４０〜７０）を集めて部分精製し、水で透析した後、凍結乾燥により、多糖体標品を得た。
【００１７】
（ｃ）工程［セファロースＣＬ−６Ｂゲル濾過クロマトグラフィー］
【００１８】
部分精製した多糖体標品（６１ｍｇ）を、セファロースＣＬ−６Ｂカラム（１１５ｃｍ×１．２８ｃｍ）に重層した。
重層後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）により、３０ｍｌ／ｈの流速で溶出した。
溶出した画分について、フィブリン凝集時間の延長によって、抗トロンビン活性を評価し、図２に示した。ここで、糖含量はフェノール硫酸法によって測定した。
なお、図２で「○−○」は抗トロンビン活性を示し、「●−●」は糖含量を示す。
図２に示す、抗トロンビン活性が多い画分（０．３９〜０．６２）を集めて、水で透析した後、凍結乾燥し、本発明に係る抗トロンビン活性物質（２４ｍｇ）を得た。
図２のグラフを考察すると、本発明に係る抗トロンビン活性物質は、クロマトグラム上で実質的に単一で対照的なピークを与える抗トロンビン活性を持つ多糖体であることが確認できる。
【００１９】
【試験例１】
［電気泳動］
【００２０】
上記実施例で得た抗トロンビン活性物質について、精製純度を確認するために、電気泳動を行った。
電気泳動は、Ｎａｒｄｅｌｌａらの方法［Ｎａｒｄｅｌｌａ，Ａ．，Ｃｈａｕｂｅｔ，Ｆ．，Ｂｏｉｓｓｏｎ−Ｖｉｄａｌ，Ｃ．，Ｂｌｏｎｄｉｎ，Ｃ．，Ｄｕｒａｎｄ，Ｐ．，ａｎｄ Ｊｏｚｅｆｏｎｖｉｃｚ，Ｊ．，Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆｕｃａｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒａｄｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆｕｃａｎｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｒｏｗｎ ｓｅａｗｅｅｄ Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２８９，２０１−２０８（１９９６）］と同様の方法によりセルロースアセテート膜上で行った。
すなわち、０．３Ｍの酢酸カルシウム（ｐＨ７．５）中で、１．５時間、１．５ｍＡ／ｃｍの条件で電気泳動を行った後、膜を０．１％トルイジンブルーを含む３％酢酸で染色し、３％酢酸で脱染色し、図３中にレーン２として示した。
ここで、市販のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ（ヒバマタ目の褐藻類）由来のフコイダンを標準物質として用い、図３中にレーン１として示した。
図３の結果を考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質は、セルロースアセテート膜電気泳動で単一のバンドを示すことが確認できた。
【００２１】
【試験例２】
［サイズ排除ＨＰＬＣ］
【００２２】
上記実施例で得た抗トロンビン活性物質について、精製純度を確認するために、電気泳動に加え、サイズ排除ＨＰＬＣを行った。
サイズ排除ＨＰＬＣは、約１０から２０００ｋＤａの分子量のデキストランを分離するＳｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｃｋ ＫＢ−８０５（昭和電工製）を用い、０．２Ｍ塩化ナトリウムにより１．０ｍｌの流速で行ない、示差屈折計により検出した。その結果を図４に示した。
図４の結果を考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質は、鋭く対称なピークを示し、図３の結果と併せて考慮すると、単一に近い状態で精製されたことが確認できた。
【００２３】
【試験例３】
［分子量の決定］
【００２４】
平均分子量は、Ｚｈｕａｎｇらの方法［Ｚｈａｕｎｇ，Ｃ．，Ｉｔｏｈ，Ｈ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｈ．，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｉｔｖｅ ｆｕｃｏｉｄａｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｒｏｗｎ ｓｅａｗｅｅｄ，Ｕｍｉｔｏｒａｎｏｏ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｔｈｎｂｅｒｇｉｉ）．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，５６３−５６７（１９９５）］により、０．３Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したセファロースＣＬ−６Ｂゲル濾過カラムにより測定した。
ここで、較正曲線は分子量マーカーとしてデキストラン（分子量６７，１４８，２８２，４６４）を用いて作成した。
その結果に加え、後の試験例で測定した硫酸含量、中性糖の組成、活性の結果と共に、表１に示す。なお、表１では、他の起源の硫酸化多糖体についての測定結果も示した。
【００２５】
【表１】
表１に示すように、本発明の抗トロンビン活性物質は、平均分子量が２２２ｋＤａと推定され、褐藻類及びきのこの一種であるカワラタケからの活性な硫酸化多糖体のものとは異なることが確認された。
【００２７】
【試験例４】
［化学分析］
【００２８】
糖分の総量は、Ｄｕｂｉｏｓらの方法［Ｄｕｂｉｏｓ，Ｍ．Ｋ．Ａ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｔ．Ｋ．，Ｒｅｂｅｒｓ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｏｎｉｓｔｈ，Ｆ．，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２８，３５０−３５８（１９５６）］により、フコースを標準としてフェノール−硫酸法で測定した。
ウロン酸含量は、ＢｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚとＡｓｂｏｅ−Ｈａｎｓｅｎ［Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ，Ｎ．ａｎｄ Ａｓｂｏｅ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｇ．，Ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４（２），４８４−４８９（１９７３）］のメタヒドロキシジフェニル硫酸法変法によりＤ−グルクロン酸を標準として用いて測定した。
硫酸含量は、ＤｏｇｓｏｎとＰｒｉｃｅの比濁法［Ｄｏｇｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．ａｎｄ Ｐｒｉｃｅ，Ｒ．Ｇ．，Ａ ｎｏｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｔｅｒ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｕｌｐｈａｔｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，８４，１０６−１１０（１９６２）］により、硫酸カリウムを標準として定量した。
赤外線スペクトルは、バイオラッドＦＴＳ−６０スペクトロメーター（ヘラクレス、カリフォルニア州）により測定した。
中性糖は、以下に記述するＪｏｎｅｓとＡｌｂｅｒｓｈｅｉｍの方法［Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄ Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ，Ｐ．，Ａ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｄｏｓｅ ａｎｄ ｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４９，９２６−９３６（１９７２）］により分析した。
その結果を、上記の表１に示す。
表１に示すように、本発明の抗トロンビン活性物質の中性糖は、フコース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコースから構成されており、中でもフコースが最も多量に含まれ、全中性糖の中の５０％を占めることが確認できた。
また、抗凝固及び抗トロンビン活性を持つフコース含有多糖体が種々の起源、特に褐藻類から単離されているが、本発明の抗トロンビン活性物質の硫酸含量と糖組成は、他のフコイダン硫酸と明らかに異なっていることが確認できた。
そして、本発明の抗トロンビン活性物質は、相当量の硫酸基（２０．５％）を含む硫酸化ヘテロ多糖体であり、その他にウロン酸（７．１％）も含んでいた。
【００２９】
上記実施例で得た抗トロンビン活性物質（２ｍｇ）を、２．０Ｍトリフルオロ酢酸により１２１℃で６時間加水分解し、ミオイノシトールを内部標準として生成した糖のアルジトールアセテート誘導体をスペルコＳＰ−２３８０カラム（スペルコ社、ベルフォンテ、ペンシルベニア州）を備えたＹｏｕｎｇ Ｌｉｎ Ｍ６００Ｄ型ガスクロマトグラフにて測定し、図５のＢに赤外線スペクトルを示した。
なお、図５のＡは、市販のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来のフコイダンの測定結果を示す。
図５の結果を考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質の赤外線スペクトルの吸収特性は、糖に結合した硫酸基に由来する少なくとも二つの吸収バンドを示している。
そして、図５に見られるようにＳ＝Ｏ伸縮振動に基ずく１２５７ｃｍ−１の強い吸収に加え、８４７ｃｍ−１付近に現れるＣ−Ｏ−Ｓに基ずく吸収ピークは、Ｃ１配座のフコピラノースのアキシアルＣ−４位に結合する硫酸基の指標であることが知られている。
すなわち、本発明の抗トロンビン活性物質の赤外線スペクトルは、Ｆｕｃｕｓｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ（ヒバマタ目の褐藻類）由来の抗凝固フコイダン硫酸のものと各ピークの位置や全体的な形状が酷似していることが確認できた。
【００３０】
【試験例５】
［抗凝固活性の測定］
【００３１】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、トロンビン時間（ＴＴ）は、血液凝固測定装置（型式：Ｃｏａｇ−Ｓｔａｔ、（株）京都第一科学製）を用いてＦｏｘらの方法［Ｆｏｘ，Ｉ．，Ｄａｗｓｏｎ Ａ．，Ｌｏｎｄｓ，Ｐ．，Ｅｉｓｎｅｒ，Ｊ．，．Ｆｉｎｄｌｅｎ，Ｋ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｅ．，Ｈａｎｓｏｎ，Ｄ．，Ｍａｎｔ，Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ，Ｊ．，Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＨｉｒｕｌｏｇＴＭ，ａ ｄｉｒｅｃｔ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｃｍｏｓｔ．，６９（２），１５７−１６３（１９９３）．］に準じ、測定した。
すなわち、実施例で得た抗トロンビン活性物質を溶かした溶液（１５μｌ）、クエン酸処理したヒト保存血漿（１００μｌ）を３７℃で３分間培養した。
培養後、それぞれ２００μｌのトロンボプラスチンＣ試薬を添加した後にＰＴ及びＴＴを測定した。
また、培養後、それぞれ１００μｌのトロンビン溶液（５Ｕ／ｍｌ）添加した後にも、ＰＴ及びＴＴを測定した。
さらに、培養後、それぞれ２０ｍＭ塩化カルシウムを１００μｌ添加し、ａＰＴＴを測定した。
【００３２】
【試験例６】
［抗トロンビン活性の検定］
【００３３】
Ｃａｐｐｉｅｌｌｏらの方法［Ｃａｐｐｉｅｌｌｏ，Ｍ．，Ｖｉｌａｒｄｏ，Ｐ．Ｇ．，Ｌｉｐｐｉ，Ａ．，Ｃｒｉｓｃｕｏｌｉ，Ｍ．，Ｃｏｒｓｏ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ Ｍｕｒａ，Ｕ．，Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｈｉｒｎｏｒｍ ＩＶ ａｎｄ Ｈｉｒｕｎｏｒｍ Ｖ）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５２，１１４１−１１４６（１９９６）］により、フィブリノーゲン凝集活性及びアミド分解活性を測定した。
【００３４】
（ａ）フィブリノーゲン凝集活性
【００３５】
ヒト血漿トロンビン及びウシ血漿フィブリノーゲンは、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、０．１％ＰＥＧ６０００を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ７．４）に溶解した。
実施例で得た抗トロンビン活性物質を、蒸留水に溶解して種々の濃度に調整し、各濃度の多糖体標品（１０μｌ）と０．１２５％のフィブリノーゲン溶液（２００μｌ）を混合し、３７℃で３分間前培養した。
培養後の混合液に、トロンビン溶液（５Ｕ／ｍｌ，１００μｌ）を加え、凝集塊の形成される時間を血液凝固測定装置（型式：Ｃｏａｇ−Ｓｔａｔ、（株）京都第一科学製）を用いて測定し、凝集時間の延長により抗凝固作用を調べた。
その結果を図６に示した。
なお、図６において、相対的抗凝固活性とは、対照の凝集時間に対する活性の％を示したもので、データーは平均値±標準偏差により表示し、「○−○」は活性化部分トロンボプラスチン時間を示し、「●−●」はプロトロンビン時間を示し、「□−□」はトロンビン時間を示す。
図６の結果を考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質は、活性化部分トロンボプラスチン時間及びトロンビン時間において濃度依存的な抗凝固作用が認められたが、プロトロンビン時間においては認められなかった。
したがって、本発明の抗トロンビン活性物質の活性は、内因性の凝固作用及び血漿の凝固の第三相に関与していると考えられる。
ここで、トロンビン時間の著しい上昇は、トロンビンによるフィブリンの形成が関わる凝固の第三相が強力に阻害されているということを示している。
また、活性化部分トロンボプラスチン時間及びトロンビン時間における凝集時間を２倍に延長するのに要する本発明の抗トロンビン活性物質の濃度は、それぞれ１４．３及び２．４μｇ／ｍｌであったが、その濃度は生体内での作用に匹敵するものである。
【００３６】
（ｂ）アミド分解活性
【００３７】
上述のフィブリノーゲン凝集活性の測定の場合と同様に、緩衝液に溶解したヒト血漿トロンビンと種々の濃度の多糖体標品とを混合し、２５℃で３分間前培養した。
培養後の混合液に、クロモチームＴＨ（１．９ｍＭ）を添加し、アミド分解反応を開始し、４０５ｎｍの吸光度の分光光学的測光によりパラニトロアニリンの遊離を測り、トロンビンによるクロモチームＴＨの加水分解を測定した。
その結果を図７に示した。
なお、図７は、各濃度の抗トロンビン活性物質について、「○−○」は抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の延長を示し、「●−●」はパラニトロソアニリンの遊離を示す。
本発明の抗トロンビン活性物質は、ヘパリンコファクターＩＩ及び抗トロンビンＩＩＩのようなプロテアーゼ阻害剤の非存在下にトロンビンによるフィブリノーゲンの分解を有意に阻害するものである。
凝集を５０％阻害する本発明の抗トロンビン活性物質の濃度は、０．２９μｇ／ｍｌであった。
しかしながら、本発明の抗トロンビン活性物質は、５μｇ／ｍｌの濃度までトロンビンのアミド分解活性を阻害しなかった。
より高濃度（５０μｇ／ｍｌ）でさえ、本発明の抗トロンビン活性物質によるアミド分解活性はほんのわずかで７％までであった。
同様の効果がヒルジン様合成ペプチドでも報告されており、トロビンのフィブリノーゲン凝集活性は阻害するが、クロモチームＴＨのアミド分解活性には何ら影響しない。抗トロンビンのフィブリノーゲン−トロンビン相互作用に対して二つの有力な説明がなされている。
即ち、抗トロンビン物質がトロンビンの触媒部位の近傍に結合し、フィブリノーゲンのトロンビンへの接触を阻害するという説と、もう一つは、抗トロンビン物質がフィブリノーゲン側のトロンビン結合部位の近傍に結合し、トロンビンのフィブリノーゲンへの接触を阻害するという説である。
フコイダンのフィブリノーゲン−トロンビン相互作用に対する阻害活性は、後者の説によりこの多糖体がフィブリノーゲンへ結合することによって生じる立体障害によるものとされ、本発明の抗トロンビン活性物質も抗トロンビン物質がフィブリノーゲン側のトロンビン結合部位の近傍に結合し、トロンビンのフィブリノーゲンへの接触を阻害するものであることが確認できた。
結論として、本発明の抗トロンビン活性物質は、これまで報告されているその他の活性なフコイダン硫酸と分子量及び糖組成の点で、はっきりとは異なる抗凝固及び抗トロンビン活性をもつ新規多糖体であることが確認できた。
【００３８】
【発明の効果】
【００３９】
本発明の抗トロンビン活性物質は、製造上の問題がない抗トロンビン活性物質として従来より知られている褐藻類フコイダン由来の物質等とは、全く別の新規な物質であり、優れた抗トロンビン活性を有している。
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ｂ）工程のクロマトグラフィーにおける各画分の抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の延長によって評価したグラフ
【図２】（ｃ）工程のゲル濾過クロマトグラフィーにおける各画分の抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の延長によって評価したグラフ
【図３】電気泳動の結果を示す写真
【図４】サイズ排除ＨＰＬＣの結果を示すグラフ
【図５】本発明の抗トロンビン活性物質及び市販のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来のフコイダンの赤外線スペクトルを示すグラフ
【図６】各濃度の抗トロンビン活性物質について、凝集時間の延長により抗凝固作用を示すグラフ
【図７】各濃度の抗トロンビン活性物質について、凝集時間の延長により抗トロンビン活性を示すグラフ
Claims (1)
- 硫酸基（２０．５％）及びウロン酸残基（７．１％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３５：０．２８：０．２２：０．１５の比率で含まれ、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定された平均分子量が２２２ｋＤａである、抗トロンビン活性物質。
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