JPH0376576A - エンド型β‐Ｄ‐キシロシダーゼ及びその製造方法 - Google Patents
エンド型β‐Ｄ‐キシロシダーゼ及びその製造方法Info
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- JPH0376576A JPH0376576A JP21293989A JP21293989A JPH0376576A JP H0376576 A JPH0376576 A JP H0376576A JP 21293989 A JP21293989 A JP 21293989A JP 21293989 A JP21293989 A JP 21293989A JP H0376576 A JPH0376576 A JP H0376576A
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、糖鎖の構造解析に有用な純化されたエンド型
β−Ｄ−キシロシダーゼ及びその製造方法に関する。
β−Ｄ−キシロシダーゼ及びその製造方法に関する。
従来より、エンド型β−Ｄ−キシロシダーゼに関しては
、ウサギ肝臓にその存在が報告されている〔バイオキミ
カ・工・バイオフィジヵ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ）、′１ｐｊ９６６巻、第
９４頁（Ｉ９８８年）〕。
、ウサギ肝臓にその存在が報告されている〔バイオキミ
カ・工・バイオフィジヵ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ）、′１ｐｊ９６６巻、第
９４頁（Ｉ９８８年）〕。
しかしながら、ウサギ肝臓のエンド型β−Ｄキシロシダ
ーゼは、非常に精製が困難であり、いまだに他のグリコ
シダーゼと完全に分離精製された例はない。
ーゼは、非常に精製が困難であり、いまだに他のグリコ
シダーゼと完全に分離精製された例はない。
エンド型β−〇−キシロシダーゼは主に糖鎖の構造研究
に用いられるが、例えば、ペプチドグリカンの糖鎖部分
とアミノ酸部分のキシロシド結合を加水分解する時に他
のグリコシダーゼ、プロテアーゼ、スルファダーゼ及び
ホスファタ−ゼが混在すると、横進を調べたい糖鎖部分
やペプチド部分を分解することがある。
に用いられるが、例えば、ペプチドグリカンの糖鎖部分
とアミノ酸部分のキシロシド結合を加水分解する時に他
のグリコシダーゼ、プロテアーゼ、スルファダーゼ及び
ホスファタ−ゼが混在すると、横進を調べたい糖鎖部分
やペプチド部分を分解することがある。
上記の様に、エンド型β−Ｄ−キシロシダーゼに関して
は、容易に他のグリコシダーゼと分離精製できる酵素源
の検索が望まれていた。
は、容易に他のグリコシダーゼと分離精製できる酵素源
の検索が望まれていた。
本発明の金的は、純化されたエンド型β−Ｄ−キシロシ
ダーゼを工業的に安価に提供することにある。
ダーゼを工業的に安価に提供することにある。
本発明を概説ずれば、本発明の第１の発明は、下記の理
化学的性質を有していることを特徴とするエンド型β−
Ｄ−キシロシダーゼに関する。
化学的性質を有していることを特徴とするエンド型β−
Ｄ−キシロシダーゼに関する。
（Ｉ）作用：ペプチドグリカン分子内のセリンに結合し
ているＤ−キシロースのキシロシド結合を加水分解する （ＩＩ）基質特異性：ペプチドコンドロイチン硫酸、ペ
プチドデルマタン硫酸、ペプチドヘパラン硫酸に作用す
る （ＩＩＩ）至適ｐＨ： ｐＨ４，Ｏ付近（Ｉ’Ｖ）至適
温度：４０℃付近 （Ｖ）分子量：約７８０００ （セファクリルＳ−２０
０を用いたゲルろ過法による） また、本発明の第２の発明は、上記第１の発明のエンド
型β−Ｄ−キシロシダーゼの製造方法に関する発明であ
って、ホタテ貝属に属する貝類からエンド型β−Ｄ−キ
シロシダーゼを抽出することを特徴とする。
ているＤ−キシロースのキシロシド結合を加水分解する （ＩＩ）基質特異性：ペプチドコンドロイチン硫酸、ペ
プチドデルマタン硫酸、ペプチドヘパラン硫酸に作用す
る （ＩＩＩ）至適ｐＨ： ｐＨ４，Ｏ付近（Ｉ’Ｖ）至適
温度：４０℃付近 （Ｖ）分子量：約７８０００ （セファクリルＳ−２０
０を用いたゲルろ過法による） また、本発明の第２の発明は、上記第１の発明のエンド
型β−Ｄ−キシロシダーゼの製造方法に関する発明であ
って、ホタテ貝属に属する貝類からエンド型β−Ｄ−キ
シロシダーゼを抽出することを特徴とする。
本発明者らがエンド型β−Ｄ−キシロシダーゼをスクリ
ーニングした結果、ホタテ貝属に属する貝類中に著量の
エンド型β−Ｄ−キシロシダーゼが存在することを見出
した。
ーニングした結果、ホタテ貝属に属する貝類中に著量の
エンド型β−Ｄ−キシロシダーゼが存在することを見出
した。
また、本酵素は後述のごとく非常に精製が容易でかつ優
れた性質を有している。
れた性質を有している。
以下本発明について詳細に説明する。
まず、本発明に使用される貝類としては、ホタテ貝属に
馬する貝類ならばいかなる貝類でも良い。
馬する貝類ならばいかなる貝類でも良い。
エンド型β−Ｄ−キシロシダーゼは主に貝類の中腸腺に
存在するので、貝類の中腸腺を集め、通常用いられる細
胞破壊手段、例えば、ホモジナイザー等で細胞を破砕す
ると無細胞抽出液が得られる。次いで、この抽出液から
通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ること
ができる。例えば、塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カ
ラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過、凍
結乾燥などにより精製を行い、他のグリコシダーゼを含
まない純化されたエンド型β−Ｄ−キシロシダーゼを得
ることができる。
存在するので、貝類の中腸腺を集め、通常用いられる細
胞破壊手段、例えば、ホモジナイザー等で細胞を破砕す
ると無細胞抽出液が得られる。次いで、この抽出液から
通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ること
ができる。例えば、塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カ
ラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過、凍
結乾燥などにより精製を行い、他のグリコシダーゼを含
まない純化されたエンド型β−Ｄ−キシロシダーゼを得
ることができる。
本発明のエンド型β−Ｄ−キシロシダーゼの酵素化学的
及び理化学的性質は次のとおりである。
及び理化学的性質は次のとおりである。
（Ｉ） 作用：ペプチドグリカン分子内のセリンに結
合しているＤ−キシロースのキシロシド結合を加水分解
する。
合しているＤ−キシロースのキシロシド結合を加水分解
する。
（２）基質特異性：ペプチドコンドロイチン硫酸、ペプ
チドデルマタン硫酸、ペプチドヘパラン硫酸に作用する
。
チドデルマタン硫酸、ペプチドヘパラン硫酸に作用する
。
（３）至適ｐＨ：至適ＰＨはｐＨ４，０付近である（第
１図）。
１図）。
すなわち第１図は、本酵素のＰＨと相対活性の関係を表
すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを
示す。なお、実線は０．１Ｍ酢酸緩衝液中、点線は０．
Ｉ Ｍグリシン−塩酸緩衝液中の各測定結果を示す曲
線である。
すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを
示す。なお、実線は０．１Ｍ酢酸緩衝液中、点線は０．
Ｉ Ｍグリシン−塩酸緩衝液中の各測定結果を示す曲
線である。
（４）至適温度；至適温度は４０℃付近である（第２図
）。
）。
すなわち第２図は、本酵素の温度と相対活性の関係を表
すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（
Ｉ＞を示す。
すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（
Ｉ＞を示す。
（５）分子量二分子量は約７８０００である（セファク
リルＳ−２００を用いたゲルろ過法による）、。
リルＳ−２００を用いたゲルろ過法による）、。
（６）金属イオンの影響：本酵素は第１表に示すように
、ｐ ｅ ＋ ＋、Ｈｇ＋＋、 Ｃｕ４４、＾１等によ
り強力に阻害された。
、ｐ ｅ ＋ ＋、Ｈｇ＋＋、 Ｃｕ４４、＾１等によ
り強力に阻害された。
第
１
表
無添加
Ｆｅ＋＋
Ｈｇ＋＋
Ａ ｇ ＋ ４
Ｃｕ＋“
Ｚｎ＋“
Ｃｄ＋１
Ｍｇ＋＋
（７）酵素活性測定法：
エンド型β−Ｄ−キシロシダーゼ活性の測定は次の様に
して行った。すなわち、１．２５μＭの４−メチルウン
ベリフェリルグリコサミノグリカン、０．１２５Ｍの酢
酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０） 、３１ ｍ
Ｍのグルコノδ−ラクトンを含む溶液１６０μｌに、適
当に希釈した酵素液を４０μｌ加え、３７℃で２時間反
応させた後、０．２Ｍのグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ１０，４） ３．０ ｍｌを加えて反応を
停止させ、励起波長３５０ ｎｍ。
して行った。すなわち、１．２５μＭの４−メチルウン
ベリフェリルグリコサミノグリカン、０．１２５Ｍの酢
酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０） 、３１ ｍ
Ｍのグルコノδ−ラクトンを含む溶液１６０μｌに、適
当に希釈した酵素液を４０μｌ加え、３７℃で２時間反
応させた後、０．２Ｍのグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ１０，４） ３．０ ｍｌを加えて反応を
停止させ、励起波長３５０ ｎｍ。
測定波長４５０ｎｍで蛍光強度を測定する（Ｌサンプル
）。別に対照として酵素溶液の代りに蒸留水４０μｌを
加え、同様の操作によって蛍光強度を測定しくＬブラン
ク）、ΔＬ（Ｌサンプル−Ｌブランク）を求める。
）。別に対照として酵素溶液の代りに蒸留水４０μｌを
加え、同様の操作によって蛍光強度を測定しくＬブラン
ク）、ΔＬ（Ｌサンプル−Ｌブランク）を求める。
得られた蛍光強度を既知濃度の４−メチルウンベリフェ
ロンの蛍光強度と比較計算することにより反応液中に生
成された４−メチルウンベリフェロンの濃度を求める。
ロンの蛍光強度と比較計算することにより反応液中に生
成された４−メチルウンベリフェロンの濃度を求める。
１単位の酵素は、本反応系において１分間にｌ ｎ ｍ
ａｔの４−メチルウンベリフェロンを遊離させる酵素量
とした。
ａｔの４−メチルウンベリフェロンを遊離させる酵素量
とした。
なお、４−メチルウンベリフェリルグリコサミノグリカ
ンの調製は、下記の方法で行った。
ンの調製は、下記の方法で行った。
人皮膚繊維芽細胞を、４−メチルウンベリフェリル−β
−Ｄ−キシロシド（４ＭＵＸ）を含むイーグル（Ｅａｇ
ｌｅ）の最少必須培地で培養し、培養液をゲルろ過、プ
ロナーゼ消化し、Ｎａ［：Ｉ飽和のエタノール溶液で沈
殿させ、乾燥後、更にセチル ピリジニウム クロリド
法で沈殿させた両分を、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来のヒアルｏニダーゼ（ｈｙａｌ
ｕｒｏｎｉｄａｓｅ）とへパリチナーゼ（ｈｅｐａｌｉ
−ｔｉｎａｓｅ）で消化した後、セファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ） Ｇ −２５（ファルマシア社製）でゲ
ルろ過した高分子画分より、還元末端側に４ＭＵＸを有
するグリコサミノグリカンを得た。
−Ｄ−キシロシド（４ＭＵＸ）を含むイーグル（Ｅａｇ
ｌｅ）の最少必須培地で培養し、培養液をゲルろ過、プ
ロナーゼ消化し、Ｎａ［：Ｉ飽和のエタノール溶液で沈
殿させ、乾燥後、更にセチル ピリジニウム クロリド
法で沈殿させた両分を、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来のヒアルｏニダーゼ（ｈｙａｌ
ｕｒｏｎｉｄａｓｅ）とへパリチナーゼ（ｈｅｐａｌｉ
−ｔｉｎａｓｅ）で消化した後、セファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ） Ｇ −２５（ファルマシア社製）でゲ
ルろ過した高分子画分より、還元末端側に４ＭＵＸを有
するグリコサミノグリカンを得た。
以下に本発明によるエンド型β−Ｄ−キシロシダーゼの
製造方法を実施例をもって示すが、本発明が以下の実施
例の範囲のみに限定されるものではない。
製造方法を実施例をもって示すが、本発明が以下の実施
例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例１
以下の操作は４℃で行い、遠心分離は１２０００Ｘｇ、
３０分の条件で行った。
３０分の条件で行った。
生きているホタテ貝の中腸腺１２０ｇを、常法によりア
セトンパラ６ｆ−，（２５ｇ） （！：Ｌ、１０ｍＭＥ
ＤＴＡ、１００ｍＭｇ−アミノ−ｎ−カプロン酸、５ｍ
Ｍベンズアミジン塩酸塩、５ｍＭＰＭＳＦ（フェニル
メチル スルホニル フルオリド）、０．３６ｍＭペプ
スタチンを含むｌｏｍＭＦリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，０
中で４時間穏やかにかくはん後遠心分離し、その上清を
集めた。この上清に０．２％になる様にプロタミン硫酸
溶液（ｐＨ７，０）を加え、１５分放置後遠心分離を行
った。その上清に５０％飽和となる様に硫安を加え、１
５分間静置し、遠心分離後、上清に７０％飽和になる様
に硫安を追加し、１時間放置した。遠心分離によりその
沈殿画分を回収し、この沈殿を５１ｎ１の１０ｍＭ）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解した。
セトンパラ６ｆ−，（２５ｇ） （！：Ｌ、１０ｍＭＥ
ＤＴＡ、１００ｍＭｇ−アミノ−ｎ−カプロン酸、５ｍ
Ｍベンズアミジン塩酸塩、５ｍＭＰＭＳＦ（フェニル
メチル スルホニル フルオリド）、０．３６ｍＭペプ
スタチンを含むｌｏｍＭＦリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，０
中で４時間穏やかにかくはん後遠心分離し、その上清を
集めた。この上清に０．２％になる様にプロタミン硫酸
溶液（ｐＨ７，０）を加え、１５分放置後遠心分離を行
った。その上清に５０％飽和となる様に硫安を加え、１
５分間静置し、遠心分離後、上清に７０％飽和になる様
に硫安を追加し、１時間放置した。遠心分離によりその
沈殿画分を回収し、この沈殿を５１ｎ１の１０ｍＭ）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解した。
酵素溶液をセファクリルＳ−２００（２，２ｘ１００ｃ
ｍ＞（７アル７シア社製）のカラムに添加し、上記緩衝
液で溶出した。溶出した活性画分を、１０ｍＭ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）に透析後、同緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥ−セファセル（２，２Ｘ ２１ｃｍ）
（ファルマシア社製）のカラムに添加し、同緩衝液で洗
浄した。
ｍ＞（７アル７シア社製）のカラムに添加し、上記緩衝
液で溶出した。溶出した活性画分を、１０ｍＭ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）に透析後、同緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥ−セファセル（２，２Ｘ ２１ｃｍ）
（ファルマシア社製）のカラムに添加し、同緩衝液で洗
浄した。
次に、０〜０．６Ｍ食塩でグラジェント溶出した後、１
００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ４，０＞で溶出し
、精製酵素０．５４単位を得た。本酵素標品の比活性は
、１．３５単位／ｍｇであった。この酵素標品は、他の
グリコシダーゼを含まなかった。
００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ４，０＞で溶出し
、精製酵素０．５４単位を得た。本酵素標品の比活性は
、１．３５単位／ｍｇであった。この酵素標品は、他の
グリコシダーゼを含まなかった。
以上の精製工程の各結果を第２表に示す。
本発明により、複合糖質糖鎖の構造の解明に有用な純化
されたエンド型β−Ｄ−キシロシダーゼ及びその製造方
法が提供された。
されたエンド型β−Ｄ−キシロシダーゼ及びその製造方
法が提供された。
第１図は本発明の酵素エンド型β−Ｄ−キシロシダーゼ
のｐｌ＋と相対活性の関係を表すグラフ、第２図は本発
明の酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフである。 特許山願人 賓酒造株式会社 代 理 人 中 本 宏量
井 上 昭 同 吉 嶺 桂十０．７Ｍ酢酸
紋イむ液
のｐｌ＋と相対活性の関係を表すグラフ、第２図は本発
明の酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフである。 特許山願人 賓酒造株式会社 代 理 人 中 本 宏量
井 上 昭 同 吉 嶺 桂十０．７Ｍ酢酸
紋イむ液
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を有していることを特徴とする
エンド型β−Ｄ−キシロシダーゼ。 （ I ）作用：ペプチドグリカン分子内のセリンに結合
しているＤ−キシロースのキシロシド結合を加水分解す
る （II）基質特異性：ペプチドコンドロイチン硫酸、ペプ
チドデルマタン硫酸、ペプチドヘパラン硫酸に作用する （III）至適ｐＨ：ｐＨ４．０付近 （IV）至適温度：４０℃付近 （Ｖ）分子量：約７８０００（セファクリルＳ−２００
を用いたゲルろ過法による） ２、ホタテ貝属に属する貝類から抽出することを特徴と
する請求項１記載のエンド型β−Ｄ−キシロシダーゼの
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21293989A JPH0376576A (ja) | 1989-08-21 | 1989-08-21 | エンド型β‐Ｄ‐キシロシダーゼ及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21293989A JPH0376576A (ja) | 1989-08-21 | 1989-08-21 | エンド型β‐Ｄ‐キシロシダーゼ及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0376576A true JPH0376576A (ja) | 1991-04-02 |
Family
ID=16630800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21293989A Pending JPH0376576A (ja) | 1989-08-21 | 1989-08-21 | エンド型β‐Ｄ‐キシロシダーゼ及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0376576A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05147133A (ja) * | 1991-11-26 | 1993-06-15 | Showa Aircraft Ind Co Ltd | 防火ハニカムコアの製造方法 |
-
1989
- 1989-08-21 JP JP21293989A patent/JPH0376576A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05147133A (ja) * | 1991-11-26 | 1993-06-15 | Showa Aircraft Ind Co Ltd | 防火ハニカムコアの製造方法 |
| JPH0661881B2 (ja) * | 1991-11-26 | 1994-08-17 | 昭和飛行機工業株式会社 | 防火ハニカムコアの製造方法 |
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