CN102210855A - 一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的抗紫外辐射损伤复配物，所述复配物是由具有抗氧化活性的海洋特征寡糖以及分子量为2800-3000Da的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽配伍而成；化学及药理实验表明，与配伍的单一组分相比，本发明能够更显著的抑制紫外辐射所引起的氧自由基生成，并能更大程度地靶向进入皮肤细胞线粒体，抑制光老化，对紫外辐射所造成的皮肤损伤具有显著的保护作用。本发明将会为天然寡糖-肽类复配物抗紫外剂及线粒体靶向药物的研制、开发以及海水养殖产业的高值化利用提供理论支持。

Description

一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物及其制备方法和应用。

背景技术

近年，随着臭氧空洞的出现，紫外辐射所引起的过量氧自由基已严重危害到人类的健康与环境。皮肤是接受紫外辐照最直接且面积最大的人体器官，作为机体的第一道天然保护屏障，紫外辐射所产生过量的氧自由基对其所造成的损伤最为明显。研究表明，发生于光损伤初始过程中的光老化及细胞的凋亡坏死，对皮肤肿瘤的形成具有极强的促进作用。因此，由紫外线诱发的皮肤疾病，已引起人们的高度重视。

为了减缓由紫外辐照所导致的光损伤，天然抗氧化剂的研制与开发已受到广泛关注。其中，来源丰富，安全低毒，并具有显著抗氧化活性的海洋特征糖类及罗非鱼鱼皮胶原蛋白倍受青睐。近年，随着研究的深入，人们除将目光聚焦于海洋糖类及蛋白外，两者间复配所形成的改性产物也引起了人们的广泛关注，其已能够代替单一的蛋白或糖类生物材料，成功地应用于组织工程学领域。但目前，低分子量甘露糖醛酸与胶原蛋白肽间的复配及其对抗氧化活性的影响却鲜有报道。

发明内容

本发明提供了一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物及其制备方法和应用，本发明所述的海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物具有较强的抗氧化、抗紫外活性，所述复配物可用于抗衰老口服药物及日光照射的化妆品或皮肤用组合物中，并可用于寡糖-肽类复配物线粒体的靶向药物。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物，其特征在于所述复配物由具有抗氧化活性、分子量为2800-3000Da、重量百分比为1-4的胶原蛋白肽溶液与重量百分比为1-10的海洋特征寡糖溶液按1∶(1-10)复配而成。

对技术方案的进一步改进：所述海洋特征寡糖溶液为聚合度为2-8且重量百分比为1-10的甘露糖醛酸溶液、聚合度为2-8且重量百分比为1-5的壳寡糖溶液或聚合度为9-13且重量百分比为1-10的κ-卡拉胶寡糖溶液。

对技术方案的进一步改进：所述胶原蛋白肽为鱼皮胶原蛋白肽。

本发明还提供了一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)海洋特征寡糖的制备

甘露糖醛酸的制备：用浓度为0.1-0.3M的HCL溶液，将β-D-(1，4)-连接的聚甘露糖醛酸原料配成重量百分比浓度为1-10％的悬浊液，高压反应釜中120℃水解1h，冷却后用0.1M氢氧化钠调节至pH7，经0.45μm膜过滤固形物后，旋转蒸发浓缩，分离，用0.1M碳酸氢铵缓冲液进行洗脱，得到聚合度为2-8的寡糖，经Sephadex G10脱盐后，冷冻干燥得褐色粉末即制得甘露糖醛酸；

或壳寡糖的制备：将壳聚糖原料用乙酸溶解为壳聚糖乙酸溶液(0.01-0.05g/mL)，加入4-6μ/g壳聚糖酶于50℃水解15-20min，调节至pH5.8，继续水解80-100mi n后，100℃灭酶15min，离心，取上清，冷冻干燥得褐色粉末即制得聚合度为2-8的壳寡糖；

或κ-卡拉胶寡糖的制备：用浓度为0.1-0.3M的H₂SO₄溶液，将κ-卡拉胶原料配成重量百分比浓度为1-10％的悬浊液，60℃水解1h，冷却后用BaSO₄调节至pH7，离心，取上清，经0.45μm膜过滤固形物后，旋转蒸发浓缩，分离，用0.1M碳酸氢铵缓冲液进行洗脱，得到聚合度为9-13的寡糖，冷冻干燥得黄色粉末即制得κ-卡拉胶寡糖；

(2)胶原蛋白肽的制备：

将罗非鱼皮作为提取原料，用水将鱼皮洗净，放入0.5-1‰的氢氧化钠中浸泡，去除杂蛋白，再以0.5-1‰醋酸水溶液40-50℃下溶胶，于反应釜中加压灭菌后，将中性食品酶与鱼皮按1∶50于pH 7.5水解1-1.5小时，加热灭菌后，将风味酶与鱼皮按1∶50于pH7.5水解1-1.5小时，使胶原蛋白变成小分子肽，最后经活性炭过滤脱色、浓缩、干燥，即制成分子量为2800-3000Da的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽；

(3)海洋特征寡糖和胶原蛋白肽复配物的制备：

将聚合度为2-8的甘露糖醛酸、聚合度为2-8的壳寡糖或聚合度为9-13的κ-卡拉胶寡糖中的一种或几种的组合物与步骤(2)制得的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽分别溶于50℃双蒸水中，各配制成重量百分比浓度为1-4的水溶液，所述罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽的分子量为2800-3000Da，将胶原蛋白肽溶液与上述制备的海洋特征寡糖溶液按1∶(1-10)于50℃热水浴中充分搅拌混合，浓缩，冷冻，干燥成粉备用。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(1)中采用Bio-Gel-P6柱进行分离。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(2)中性食品酶和风味酶复合水解制成平均分子量为2800-3000Da。

本发明还提供了一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物在抗氧化和抗紫外中的应用。

对技术方案的进一步改进：它在制备用于治疗抗衰老口服药物中的应用。

对技术方案的进一步改进：它在制备防日光照射的化妆品或皮肤用组合物中的应用。

对技术方案的进一步改进：它在制备线粒体靶向药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：本发明利用甘露糖醛酸和胶原蛋白活性肽均具有较强的抗氧化、抗紫外活性的特点，将甘露糖醛酸和低分子量鱼皮胶原蛋白肽复配，获得了良好的改性产物，并运用化学、生物学方法阐明了其抗紫外作用及保护机制。本发明中所述甘露糖醛酸和低分子量鱼皮胶原蛋白肽的复配物可用于抗衰老口服药物及日光照射的化妆品或皮肤用组合物中，并可用于寡糖-肽类复配物线粒体的靶向药物。

因此，无论从经济角度还是人类健康角度出发，本发明对甘露糖醛酸与蛋白活性肽的复配及其改性复配物在抗紫外损伤方面的研究，均具有重要的经济效益和社会效益。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1表明本发明中甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物对DPPH·、O₂ ^-·、OH·的清除作用的结果。

图2表明本发明中甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物对紫外辐照后HaCaT(A)及MEF(B)细胞增殖力的影响。

图3表明本发明中甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物对紫外辐照导致的HaCaT细胞内活性氧的影响。

图4表明本发明中甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物对紫外辐照后MEF细胞中MMP-1含量的影响。

图5表明本发明中甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物对紫外辐照后MEF细胞中I型胶原蛋白含量的影响。

图6是应用流式细胞仪分析甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物对紫外所引起HaCaT细胞调亡的影响，PI荧光染色正常对照组(A)，模型组(B)，复配物预处理组(C)以及DNA直方图(D)。

图7是本发明中TUNEL检测甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物对紫外辐照后HaCaT细胞凋亡的影响，正常对照组(A)，模型组(B)，复配物处理组(C)。

图8表明甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物对辐照后PARP蛋白裂解的影响。

图9表明本发明中甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物对紫外辐照后MAPK信号转导途径的影响。

图10是FITC标记罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽(a)和FITC标记复配物(b)与线粒体的共定位。

图11是本发明中甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物对紫外辐照后caspase-3，8，9蛋白裂解的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

本发明首先制备甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物，并对其进行了化学及皮肤细胞药理实验。

实施例1、制备方法

1、具有抗氧化活性、聚合度为2-8左右的甘露糖醛酸的制备

用浓度为0.1-0.3M的HCL溶液将β-D-(1，4)-连接的聚甘露糖醛酸(平均分子量7000Da)配成重量百分比浓度为1-10％的悬浊液，然后，在高压反应釜中120℃水解1h，冷却后用0.1％氢氧化钠调节至pH 7，经0.45μm膜过滤后，旋转蒸发浓缩，采用Bio-Gel-P6柱进行分离，用0.1M碳酸氢铵缓冲液进行洗脱，得到聚合度为2-8的寡糖，经Sephadex G10脱盐后，冷冻干燥得褐色粉末即制得本发明所需的甘露糖醛酸产品。

2、具有抗氧化活性、分子量为2800Da左右的罗非鱼胶原蛋白肽的制备

将罗非鱼皮作为提取原料，将鱼皮用水洗净，放入1‰的氢氧化钠中浸泡，去除杂蛋白，再以1‰醋酸水溶液40℃-50℃下溶胶，于反应釜中加压灭菌后，将中性食品酶与鱼皮按1∶50于pH 7.5水解1-1.5小时，加热灭菌后，将风味酶与鱼皮按1∶50于pH7.5水解1-1.5小时，使胶原蛋白变成小分子肽，最后经活性炭过滤脱色、浓缩、干燥，即制成分子量为2800-3000Da的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽。

3、甘露糖醛酸和罗非鱼胶原蛋白肽复配物的制备

将上述制得的分子量为2800-3000Da的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽及聚合度2-8的甘露糖醛酸于分别溶于50℃双蒸水中，各配制成重量百分比浓度为1-4的水溶液，将分子量为2800-3000Da的胶原蛋白肽溶液与聚合度为2-8的甘露糖醛酸溶液按1∶(1-10)于50℃热水浴中充分搅拌混合，浓缩，冷冻，干燥成粉贮存备用。

所述聚合度为2-8且重量百分比为1-10的甘露糖醛酸溶液、聚合度为2-8且重量百分比为1-5的壳寡糖溶液或聚合度为9-13且重量百分比为1-10的κ-卡拉胶寡糖溶液中一种或几种的组合与罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽的复配物制备方法同上。

实施例2、氧自由基清除实验

实验目的：在分子水平测定甘露糖醛酸与胶原蛋白肤的复配物对氧自由基DPPH·、O₂ ^-·以及OH.的清除能力，并将复配物与其单一组分的抗氧化作用相比较，以期确定复配对其单一组分抗氧化活性的提高作用。

实验方法：各称取20mg复配物、分子量为2800-3000Da的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽以及聚合度为2-8的甘露糖醛酸，配制成0.25-20mg/ml的样品溶液，于震荡器充分震荡，待测。分别采用DPPH法、AP-TEMED分光光度法以及邻二氮菲-Fe²⁺氧化法检测了复配物与其单一组分的抗氧化活性。

实验结果：如附图1所示，复配物对三种自由基DPPH·、O₂ ^-·以及OH·的清除率均呈剂量依赖关系，且均高于其单独组成。其清除率按下列顺序排列：MA1000+CP＞MA1000＞CP。

实验提示：罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽与聚合度为2-8的甘露糖醛酸通过复配，能够提高各自对氧自由基的清除能力，并获得抗氧化性能良好的改性复配物。

实施例3、MTT细胞活力实验

实验目的：在细胞水平采用MTT法检测了甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物对紫外损伤皮肤细胞的保护作用，并将复配物与其单一组分的抗氧化作用相比较，以期确定复配对其单一组分抗紫外活性的提高作用。

实验方法：胎鼠成纤维细胞(MEF)以及人永生化角质形成细胞(HaCaT)被随机分为对照组(正常培养细胞)，模型组(紫外照射组)以及加药组(不同样品处理+紫外照射)。当细胞生长接近80％融合时，于无菌条件下，将终浓度为10，20，50，100，200，500和1000μg/ml的复配物，罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽以聚合度为2-8的甘露糖醛酸以10μl/孔加入培养板内，对HaCaT和MEF细胞株，每个浓度均为八个复孔。其中，对照组和模型组中仅加入细胞专用培养基，使各孔终体积相等。细胞放入37℃，5％CO₂培养箱中孵育1h，吸出培养液，PBS洗三次，每孔加入50μl PBS，暴露于UVA灯管(320-400nm)和UVB灯管(290-320nm)下(UVA和UVB照射强度分别为5J/cm²和15mJ/cm²)。紫外照射后，将原先吸掉的培养基重新加入各孔，并于37℃，5％CO₂培养箱中孵育18h，加MTT液20μl/孔；继续培养4h，加三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01M HCl)50μl/孔，于CO₂培养箱中过夜。酶标仪570nm处测OD₅₇₀值。

实验结果：如附图2所示，无论对HaCaT还是MEF细胞，紫外辐照后，经20μg/ml(经MTT法筛选所得其最大有效浓度)复配物预处理的细胞活力最强，其HaCaT和MEF的细胞增殖率分别为92.8％和90.1％；其次，是聚合度为2-8的甘露糖醛酸，其HaCaT和MEF的细胞增殖率分别为53.8％和54.3％；经罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽预处理的细胞活力最低，在其最大有效浓度100μg/ml时，HaCaT和MEF的细胞增殖率仅为35.4％和34.7％。

实验提示：高剂量紫外辐照能够显著抑制细胞的增殖率，并直接导致皮肤细胞的凋亡和坏死。MTT法检测表明经复配物及其两种单一组成预处理后，两种紫外损伤细胞的增值率较模型组均得到提高，其中复配物处理组最为显著，分别提高了62.7％和60％，其次是聚合度2-8的甘露糖醛酸处理组，分别提高了23.7％和24.2％。最后是罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽处理组。结果表明，罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽与聚合度2-8的甘露糖醛酸通过复配，能提高各自对紫外损伤细胞的保护能力，并得到抗紫外性能良好的改性复配物。

实施例4、胞内抗氧化酶SOD，GSH-Px活力以及MDA含量实验

实验目的：在细胞水平测定了甘露糖醛酸与胶原蛋白肽的复配物在其最大有效浓度时，对紫外损伤皮肤细胞内抗氧化酶活力(SOD，GSH-Px)及MDA含量的影响，并将其与单一组分相比较，确定复配对其单一组分胞内抗氧化酶活性的提高作用。

实验方法：按细胞生长速率，将5×10⁴个/ml处于对数生长期的HaCaT和MEF细胞900μl/孔接种于6孔培养板内，培养24h后，复配物(20μg/ml)、聚合度2-8的甘露糖醛酸(20μg/ml)、罗非鱼鱼皮胶原蛋白活性肽(100μg/ml)以100μl/孔加入培养板。对HaCaT和MEF两个细胞株，每个浓度均为3个复孔。细胞经照射(UVA和UVB照射强度分别为5J/cm²和15mJ/cm²)，37℃，5％CO₂条件下孵育18h，胰酶消化，1000rpm离心5min收集细胞沉淀(细胞密度为1×10⁶个/ml)。PBS洗一次，同样条件下离心收集细胞沉淀，于其中加入300μl冷生理盐水，在冰水混合物中手动匀浆3min，取裂解的细胞悬浮液分别按照南京建成公司SOD、GSH-Px及MDA试剂盒进行SOD、GSH-Px活力以及MDA含量测定。

实验结果如下：

P＜0.05；^**，P＜0.01^**加药组对于模型组。

由此可见，辐照后HaCaT和MEF细胞的SOD，GSH-Px活力较正常组显著下降，而MDA含量却显著升高。而经复配物预处理后，紫外辐照HaCaT和MEF细胞中的SOD，GSH-Px活力显著升高，MDA含量显著下降，各项指标均仅次于正常对照组；其次是聚合度2-8的甘露糖醛酸处理组；而罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽处理组的抗氧化酶活力最低，MDA含量最高，接近紫外辐照组。

实验提示：生物膜是活性氧攻击的主要目标，其主要攻击生物膜磷脂的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化链式反应。MDA是脂质过氧化的最终产物之一，其含量的升高常被认为是氧化损伤的重要标志。此外，由紫外线诱导的过量氧自由基能够显著降低正常细胞的抗氧化酶活力(如SOD，GSH-Px)，并抑制其对氧自由基的天然保护作用。因此，MDA含量及SOD，GSH-Px酶活的检测对于进一步评价细胞氧化损伤程度具有重要意义。结果表明，罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽与聚合度2-8的甘露糖醛酸通过复配，能够得到抗紫外性能显著提高的改性复配物，进一步提高细胞抗氧化酶活力的同时，还能显著降低细胞的脂质过氧化程度，减轻过量氧自由基所引起的氧化损伤。

实施例5、胞内活性氧实验

实验目的：检测复配物对紫外辐照所引起的胞内氧自由基的清除作用。

实验方法：按细胞生长速率，将处于对数生长期的HaCaT细胞900μl/孔接种于6孔培养板内，培养24h后，将复配物(20μg/ml)100μl/孔加入培养板。于37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育1h，吸出培养液，PBS洗三次，每孔加入500μl PBS，采取高剂量UVA 5J/cm²和UVB 15mJ/cm²进行联合辐照。紫外辐照后，将原来吸掉的培养基重新加入各孔，于37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育2h后取出，按照上海碧云天生物技术有限公司活性氧检测试剂盒，装载DCFH-DA探针，经流式细胞仪于525nm处进行检测。

实验结果：如附图3所示，紫外辐照组胞内活性氧的平均荧光强度是正常对照组的1.3-1.5倍。而经复配物预处理后，胞内活性氧的平均荧光强度显著降低，且仅次于正常对照组。

实验提示：亲脂性的DCFH-DA易于通过细胞膜在胞内经脂酶分解，去酰基形成不产生荧光的极性DCFH。活性氧能够进一步将DCFH氧化为具绿色荧光的DCF，因此DCF的荧光强度反映了细胞内活性氧产生的总体状况。结果表明，复配物能够显著降低紫外辐照后胞内DCF的平均荧光强度，清除或抑制紫外辐照所引起的胞内活性氧。

实施例6、对光老化细胞的改善实验

1、细胞MMP-1含量实验

实验目的：通过ELISA法检测复配物对辐照后MEF细胞中MMP-1含量的影响。

实验方法：按细胞生长速率，将处于对数生长期的MEF细胞900μl/孔接种于6孔培养板内，培养24h后，将复配物(20μg/ml)100μl/孔分别加入培养板。于37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育1h，吸出培养液，PBS洗三次，每孔加入500μl PBS，采取低剂量UVA 5J/cm²和UVB 15mJ/cm²进行联合辐照。紫外线照射后，将原来吸掉的培养基重新加入各孔，于37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育18h，吸取细胞培养液，按照美国R&D公司小鼠基质金属蛋白酶(MMP-1)ELISA试剂盒进行测定。

实验结果：如附图4所示，紫外辐照组MEF细胞内MMP-1含量较正常组显著升高；而经复配物预处理后，MEF细胞MMP-1含量较紫外辐照组显著下降，且仅次于正常对照组。

实验提示：紫外辐照会导致真皮成纤维细胞胶原酶MMP-1上调，降解胶原，引起结缔组织损伤，从而造成光老化损伤，产生皱纹。MMP-1的高表达被视为光老化评价的常用指标。结果表明，复配物能够显著降低紫外辐照所引起的MMP-1表达，抑制紫外辐照引起的胶原蛋白降解。

2、细胞Collagen I含量实验

实验目的：通过ELISA法检测复配物对辐照后MEF细胞中I型胶原蛋白含量的影响。

实验方法：细胞处理方法同细胞MMP-1含量实验，按照美国R&D公司小鼠I型胶原蛋白(Collagen I)ELISA试剂盒进行测定。

实验结果：如附图5所示，紫外辐照组MEF细胞内collagen-1含量较正常组显著降低；而经复配物预处理后，MEF细胞collagen-1含量较紫外辐照组则显著升高，且仅次于正常对照组。

实验提示：I型胶原蛋白是维持皮肤弹性的主要成分，其生物合成的减少，规则网状结构的破坏是光老化发生的显著特征。复配物能够显著抑制紫外辐照所引起的I型胶原蛋白降解，减缓紫外辐照引起的光老化。

实施例7、细胞调亡实验

1、流式细胞术检测细胞调亡实验

实验目的：通过流式细胞仪检测复配物对细胞周期的影响。

实验方法：细胞处理方法同细胞MMP-1含量实验，细胞经37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育18h后，加入0.25％胰酶-0.02％EDTA消化细胞，培养液终止消化，分别收集细胞悬液，1000r/min离心5min，弃去培养液，PBS洗两次，每次1000r/min离心5min，弃去PBS，加入200μl碘化丙啶(PI)染液，4℃避光反应30min，上机分析。PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长为630nm，产生红色荧光。凋亡细胞处于G1峰前期的亚G1期峰，CellQuest软件计算凋亡细胞百分数。

实验结果：如附图6所示，模型组孵育18h后，可明显观察到处于G1前期的亚G1期峰，其调亡率高达56.4％；而经复配物(20μg/ml)预处理的HaCaT细胞亚G1期峰值显著降低，凋亡率仅为16.8％。

实验提示：紫外辐照引起的细胞凋亡与细胞所处周期相关，凋亡细胞百分数可通过G1峰前期的亚G1期峰峰面积来进行计算。结果表明，紫外辐照组中细胞亚G1期峰值显著高于正常组，而经复配物预处理后，细胞亚G1期峰值较紫外辐照组显著降低。因此，复配物能够显著抑制辐照所引起的HaCaT细胞凋亡。

2、TUNEL检测细胞调亡实验

实验目的：通过激光共聚焦显微镜观察复配物对辐照后HaCaT细胞DNA断裂的影响。

实验方法：取对数生长期的HaCaT细胞，调整细胞浓度5×10⁴个/ml接种至内铺盖玻片的24孔培养板，37℃，5％CO₂培养箱内孵育24h，将复配物(20μg/ml)100μl/孔加入培养板。于37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育1h，吸出培养液，PBS洗三次，每孔加入500μl PBS，采取高剂量UVA 5J/cm²和UVB 15mJ/cm²进行联合辐照。紫外辐照后，将原先吸掉的培养基重新加入各孔，于37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育2h，室温下PBS洗两次，每次浸泡5min，按美国Promega公司DeadEndTM Fluorometric TUNEL System试剂盒进行检测，PI标记定位细胞核。

实验结果：如附图7所示，经复配物(20μg/ml)预处理后，荧光素-12-dUTP所标记的断裂DNA荧光强度仅次于正常对照组，且显著低于模型组。

实验提示：DNA断裂是紫外辐照引起细胞凋亡的显著特征。TUNEL系统检测断裂DNA时，可在末端脱氧核苷转移酶(TdT)作用下，依靠催化荧光素-12-dUTP掺入DNA的3′-OH末端检测细胞凋亡。因此通过观察荧光素-12-dUTP的绿色荧光强度可评价细胞DNA断裂的程度。结果表明，复配物能够显著降低荧光素-12-dUTP所标记的断裂DNA荧光强度，抑制辐照所引起的HaCaT细胞凋亡。

3、Western blot检测PARP表达实验

实验目的：用蛋白印迹法(western blotting)检测复配物(20μg/ml)对116kD完整PARP蛋白及紫外辐照所引起的PARP 89kD裂解片断的影响。

实验方法：将HaCaT细胞900μl/孔接种于种在六孔板中，培养24h后，将复配物(20μg/ml)100μl/孔加入培养板。于37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育1h。吸出培养液，PBS洗三次，每孔加入500μl PBS，采取UVA 5J/cm²和UVB15mJ/cm²进行联合辐照。照射后，将原先吸掉的培养基重新加入各孔，于37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育12h。细胞用冷PBS洗两次，每孔加入80μl裂解液，冰上裂解30min。用细胞刮刮下液体，收集于1.5ml EP管，12800rpm，4℃离心25min，取上清置于1.5ml EP管中，-20℃保存待测。采用Western Blot法以β-actin蛋白作为内参，检测磷酸化PARP表达。样品在10％SDS-PAGE胶中电泳，同时使用预染蛋白marker对比分子量。电泳结束后，用半干电转移系统将蛋白转移至硝酸纤维素膜。丽春红染色，可见红色蛋白质条带，TBST洗去丽春红，加5％脱脂奶粉(TBST溶解)封闭2h。TBST洗膜三次，每次5min。一抗封闭，4℃过夜。回收一抗，TBST洗膜3次，每次10min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液，室温反应2h。回收二抗，TBST洗膜3次，每次10min，用发光试剂发光，压片，显影。

实验结果：经密度扫描正常对照组，模型组，复配物预处理组的PARP和β-actin蛋白含量，凋亡程度经PARP(116KD)/β-actin直方图进行定量分析。如附图8所示，模型组89kD PARP蛋白含量最高，复配物(20μg/ml)能够显著降低辐照后89kD PARP裂解片段的蛋白表达。

实验提示：多聚ADP核糖聚合酶(PARP)具有保持染色体结构完整、参与DNA复制和转录的功能，其在维持基因组稳定以及细胞死亡过程中发挥了重要作用。其蛋白从116kD酶解为89kD半胱氨酸蛋白酶激活的分子事件，是细胞程序死亡的一个早期分子标志。结果表明，复配物能够显著降低紫外辐照引起的89kD PARP裂解片段的蛋白表达，从而抑制辐照所引起的HaCaT细胞凋亡。

实施例8、Western blot检测MAPK信号转导途径

实验目的：western blot法检测复配物(20μg/ml)对紫外辐照HaCaT细胞中磷酸化JNK，p38，ERK蛋白含量的影响。

实验方法：细胞处理及实验方法同Western blot检测PARP表达实验。

实验结果：经密度扫描正常对照组，模型组，复配物预处理组的p-JNK，p-p38，p-ERK和t-JNK，t-p38，t-ERK蛋白含量，复配物对HaCaT细胞中p-JNK，p-p38，p-ERK蛋白含量的影响分别经p-JNK/t-JNK，p-p38/t-p38，p-ERK/t-ERK，直方图进行定量分析。如附图9所示，HaCaT细胞经紫外辐照、孵育2h后，复配物(20μg/ml)处理组能够显著抑制紫外辐照后磷酸化JNK，p38蛋白含量的升高以及磷酸化ERK蛋白含量的下降，干预紫外辐照后MAPK信号转导途径的激活。

实验提示：MAPK家族中的三大重要成员ERK，JNK，p38参与了细胞生长、发育、分化和凋亡等一系列生理病理过程。ERK的表达涉及到调节细胞生长发育及分裂的信号网络核心，与细胞的增殖、分化和存活呈正相关。JNK，p38的磷酸化可以激活c-jun和c-fos，诱导内源性通路激活，参与促凋亡分子释放，引起DNA断裂。同时，JNK能够进一步介导胶原蛋白重要调节器AP-1的激活，导致下游基质金属蛋白酶MMPs基因表达，特异性降解细胞外基质，加剧光老化引起的损伤。结果表明，复配物能够通过抑制紫外辐照所诱导的磷酸化JNK、p38上调和磷酸化ERK下调，抑制氧自由基对MAPK信号通路的激活，并进一步抑制其对胶原蛋白降解及细胞凋亡的促进作用，保护皮肤细胞免受紫外损伤。

实施例9、复配物与线粒体共定位实验

实验目的：通过FITC、JC-1标记，追踪复配物于细胞内的定位。

实验方法：将待交联的复配物及罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液5mg/ml装入透析袋，置于碳酸盐缓冲液，4℃透析24h。用上述碳酸盐缓冲液配制0.1mg/mlFITC，所需量为待交联液体积的10倍，盛于烧杯内，4℃避光搅拌透析，平行结合18-24h后，取出移至0.01M pH 7.4PBS中透析，至清亮。葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱分离游离荧光素，收集标记的荧光标记物，待测。取对数生长期的HaCaT细胞，调整细胞浓度5×10⁴个/ml接种至内铺盖玻片的24孔培养板，37℃，5％CO₂孵育箱内培养24h后，按终浓度20μg/ml FITC-复配物和1000μg/ml FITC-罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽分别加入细胞板。于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中孵育1h，吸出培养液，PBS洗三次。按上海碧云天生物技术有限公司线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)，标记线粒体，激光共聚焦显微镜于520±20nm观察FITC-复配物/罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽的绿色荧光。633±20nm处检测JC-1聚合物标记的线粒体红色荧光。

实验结果：如附图10所示，FITC-复配物和FITC-罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽均定位于线粒体。但在两种标记物的最大有效浓度下，复配物靶向线粒体的绿色荧光强度强于单独的鱼皮胶原蛋白肽。

实验提示：线粒体是产生氧自由基的主要场所，同时也是受氧自由基损伤最主要的细胞器。大量的SOD，GSH-Px等抗氧化酶分布其上，保持细胞内氧自由基的动态平衡，对紫外辐照损伤及抑制具有重要意义。结果表明，甘露糖醛酸聚合度2-8甘露糖醛酸的引入有可能将更多的胶原蛋白肽带入线粒体，为寡糖-肽类复配物靶向线粒体药物的研制与开发提供理论依据。

实施例10、Western blot检测Caspase-3，8，9表达实验

实验目的：western blot法检测复配物对线粒体途径(caspase-9途径)以及非线粒体途径(caspase-8途径)凋亡激活的影响，进一步验证线粒体是复配物靶向作用的细胞器。

实验方法：细胞处理及实验方法同Western blot检测PARP表达实验。

实验结果：如附图11所示，经密度扫描正常对照组，复配物预处理组以及模型组中caspase-3，8，9和β-actin的蛋白含量，复配物对HaCaT细胞中caspase-3，8，9蛋白含量的影响分别经caspase-3(17kD)/β-actin，caspase-8(45kD)/β-actin，caspase-9(47kD)/β-actin直方图进行定量分析。HaCaT细胞经紫外辐照、孵育6h后，复配物(20μg/ml)处理组能够显著降低紫外辐照后caspase-3，9于17kD和35kD处的蛋白含量，却对紫外辐照后caspase-845kD处断裂片段的产生无明显抑制作用(详见附图说明11)。

实验提示：caspase蛋白酶家族是细胞凋亡的主要执行者，直接参与凋亡启动、信号传递及凋亡效应。哺乳动物caspase的活化主要有胞外(caspase-8途径/非线粒体途径)及胞内(caspase-9途径/线粒体途径)两条途径。其区别在于caspase-8可直接活化凋亡执行因子caspase-3，使细胞凋亡；caspase-9能在多种内、外源性刺激因子(如ROS)作用下，通过线粒体通路激活其下游caspase-3，从而诱导细胞凋亡。复配物对caspase-3/9的特异性抑制表明，其能够定位于线粒体，发挥氧自由基清除活性，提高抗氧化酶活力以及调节MAPK信号转导途径，抑制胶原蛋白降解，并通过抑制线粒体依赖途径的凋亡信号表达，抵御紫外辐照所导致的光损伤。

本发明中聚合度为2-8的壳寡糖以及聚合度为9-13的κ-卡拉胶寡糖同聚合度为2-8的甘露糖醛酸同属于海洋特征寡糖，具有海洋特征寡糖的相似性质，所以聚合度为2-8的壳寡糖以及聚合度为9-13的κ-卡拉胶寡糖分别与分子量为2800-3000Da的鱼皮胶原蛋白肽配伍所制得的复配物，均具有与聚合度为2-8的甘露糖醛酸-鱼皮胶原蛋白肽复配物相似的抗紫外活性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物，其特征在于所述复配物由具有抗氧化活性、分子量为2800-3000Da、重量百分比为1-4的胶原蛋白肽溶液与重量百分比为1-10的海洋特征寡糖溶液按1∶(1-10)复配而成。

2.根据权利要求1所述一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物，其特征在于所述海洋特征寡糖溶液为聚合度为2-8且重量百分比为1-10的甘露糖醛酸溶液、聚合度为2-8且重量百分比为1-5的壳寡糖溶液或聚合度为9-13且重量百分比为1-10的κ-卡拉胶寡糖溶液。

3.根据权利要求1所述一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物，其特征在于所述胶原蛋白肽为鱼皮胶原蛋白肽。

4.一种根据权利要求1或2所述的海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)海洋特征寡糖的制备

甘露糖醛酸的制备：用浓度为0.1-0.3M的HCL溶液，将β-D-(1，4)-连接的聚甘露糖醛酸原料配成重量百分比浓度为1-10％的悬浊液，高压反应釜中120℃水解1h，冷却后用0.1M氢氧化钠调节至pH 7，经0.45μm膜过滤固形物后，旋转蒸发浓缩，分离，用0.1M碳酸氢铵缓冲液进行洗脱，得到聚合度为2-8的寡糖，经Sephadex G10脱盐后，冷冻干燥得褐色粉末即制得甘露糖醛酸；

或壳寡糖的制备：将壳聚糖原料用乙酸溶解为壳聚糖乙酸溶液(0.01-0.05g/mL)，加入4-6μ/g壳聚糖酶于50℃水解15-20min，调节至pH5.8，继续水解80-100min后，100℃灭酶15min，离心，取上清，冷冻干燥得褐色粉末即制得聚合度为2-8的壳寡糖；

或κ-卡拉胶寡糖的制备：用浓度为0.1-0.3M的H₂SO₄溶液，将κ-卡拉胶原料配成重量百分比浓度为1-10％的悬浊液，60℃水解1h，冷却后用BaSO₄调节至pH 7，离心，取上清，经0.45μm膜过滤固形物后，旋转蒸发浓缩，分离，用0.1M碳酸氢铵缓冲液进行洗脱，得到聚合度为9-13的寡糖，冷冻干燥得黄色粉末即制得κ-卡拉胶寡糖；

(2)胶原蛋白肽的制备：

将罗非鱼皮作为提取原料，用水将鱼皮洗净，放入0.5-1‰的氢氧化钠中浸泡，去除杂蛋白，再以0.5-1‰醋酸水溶液40-50℃下溶胶，于反应釜中加压灭菌后，将中性食品酶与鱼皮按1∶50于pH 7.5水解1-1.5小时，加热灭菌后，将风味酶与鱼皮按1∶50于pH 7.5水解1-1.5小时，使胶原蛋白变成小分子肽，最后经活性炭过滤脱色、浓缩、干燥，即制成分子量为2800-3000Da的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽；

(3)海洋特征寡糖和胶原蛋白肽复配物的制备：

将聚合度为2-8的甘露糖醛酸、聚合度为2-8的壳寡糖或聚合度为9-13的κ-卡拉胶寡糖中的一种或几种的组合物与步骤(2)制得的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽分别溶于50℃双蒸水中，各配制成重量百分比浓度为1-4的水溶液，所述罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽的分子量为2800-3000Da，将胶原蛋白肽溶液与上述制备的海洋特征寡糖溶液按1∶(1-10)于50℃热水浴中充分搅拌混合，浓缩，冷冻，干燥成粉备用。

5.根据权利要求4所述的一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中采用Bio-Gel-P6柱进行分离。

6.根据权利要求4所述的一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中性食品酶和风味酶将鱼皮复合水解制成平均分子量为2800-3000Da的小分子肽。

7.根据权利要求1所述的一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物在抗氧化和抗紫外中的应用。

8.根据权利要求7所述的一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物在抗氧化和抗紫外中的应用，其特征在于它在制备用于治疗抗衰老口服药物中的应用。

9.根据权利要求7所述的一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物在抗氧化和抗紫外中的应用，其特征在于它在制备防日光照射的化妆品或皮肤用组合物中的应用。

10.根据权利要求7所述的一种海洋特征寡糖与胶原蛋白肽的复配物在抗氧化和抗紫外中的应用，其特征在于它在制备线粒体靶向药物中的应用。

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