CN113144283A

CN113144283A - 一种促进创伤愈合的TSCP-GelMA水凝胶及其制备和应用

Info

Publication number: CN113144283A
Application number: CN202110454585.4A
Authority: CN
Inventors: 黄娜; 张宏纯; 孔松芝; 胡章; 李程鹏; 廖铭能; 叶翠钰; 叶铭欣
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2021-04-26
Filing date: 2021-04-26
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-04-26
Also published as: CN113144283B

Abstract

本发明提供了一种促进创伤愈合的TSCP‑GelMA水凝胶及其制备和应用。本发明将罗非鱼多肽加入到GelMA溶液中，避光加入光引发剂，待光引发剂溶解后进行紫外光光照反应，得到所述TSCP‑GelMA水凝胶。本发明制得的TSCP‑GelMA水凝胶既提升了TSCP的促创伤愈合功效，也加快了GelMA在体内被分解吸收的速度，促进创伤胶原纤维增生，且能有效调控TGF‑β1的表达水平，甲基丙烯酰化明胶和罗非鱼多肽协同促进创伤愈合，为皮肤修复技术领域提供一种新型材料。

Description

一种促进创伤愈合的TSCP-GelMA水凝胶及其制备和应用

技术领域

本发明属于皮肤修复技术领域。更具体地，涉及一种促进创伤愈合的TSCP-GelMA水凝胶及其制备和应用。

背景技术

罗非鱼是我国主要养殖水产品，具有生成快、产量高、食性杂、疾病少、繁殖力强等特点。目前罗非鱼的养殖遍布120多个国家和地区，我国罗非鱼养殖总产量比值占世界总产量的32％，高达169.85万吨。其中，有超过10％的罗非鱼在简单加工成冻鱼片后，被出口至各国各地，而在加工的过程中常常产生大量鱼鳞、鱼皮等下脚料，除用于加工饲料外，没有得到更好的价值利用，造成较大的资源浪费。

罗非鱼多肽(TSCP)作为海洋胶原肽，具有易于吸收、分子量较低和亲水性较强等特点，且可降低炎性因子的生成，促进组织再生和上皮形成，因而TSCP促进创伤愈合的研究成为当前研究的热点，如李高荣等研究发现TSCP对皮肤的烫伤创面有较好的修复作用(李高荣，欧阳茜茜，杨萍，等.罗非鱼皮多肽的制备及其对烫伤修复的应用[J]广东农业科学，2017，44(10)：88-95.)，然而其促愈合效果有限。

因此，亟需寻找一种能够切实提高TSCP促创伤愈合功效的方法，对于皮肤修复技术领域具有相当的必要性。

发明内容

本发明针对现有促创伤愈合方法的缺陷和不足，提供一种促进创伤愈合的TSCP-GelMA水凝胶及其制备和应用。本发明制得的TSCP-GelMA水凝胶既提升了TSCP的促创伤愈合功效，也加快了GelMA在体内被分解吸收的速度，促进创伤胶原纤维增生，且能有效调控TGF-β1的表达水平，在愈合早期，上调TGF-β1表达水平以加速细胞生长分化和组织再生；在癜痕形成期，下调TGF-β1表达水平以抑制癜痕形成及皮肤纤维化，使伤口更加平整美观。甲基丙烯酰化明胶和罗非鱼多肽协同促进创伤愈合，为皮肤修复技术领域提供一种新型材料。

本发明的目的是提供一种TSCP-GelMA水凝胶的制备方法。

本发明的另一目的是提供由上述任一方法制备得到的TSCP-GelMA水凝胶。

本发明的又一目的是提供上述TSCP-GelMA水凝胶在制备促进创伤愈合产品方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种TSCP-GelMA水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

将罗非鱼多肽加入到GelMA溶液中得到TSCP-GelMA溶液，避光加入光引发剂，待光引发剂溶解后进行紫外光光照反应，得到所述TSCP-GelMA水凝胶。

本发明制得的TSCP-GelMA水凝胶属于光交联水凝胶，既提升了TSCP的促创伤愈合功效，也加快了GelMA在体内被分解吸收的速度，促进创伤胶原纤维增生，且能有效调控TGF-β1的表达水平，在愈合早期，上调TGF-β1表达水平以加速细胞生长分化和组织再生；在癜痕形成期，下调TGF-β1表达水平以抑制癜痕形成及皮肤纤维化，使伤口更加平整美观。甲基丙烯酰化明胶和罗非鱼多肽协同促进创伤愈合，为皮肤修复技术领域提供一种新型材料。

本发明制备得到的TSCP-GelMA水凝胶在使用时，可裁剪成任意形状使用，能够更好贴合皮肤多样的创伤，更大程度防止皮肤与外界环境接触，防止发生感染。

并且所述光照可在自然光下进行，即创伤患者可在紫外光光照之前将加入光引发剂的TSCP-GelMA溶液涂抹于伤口，暴露在自然光下，由自然光中的紫外光光照，使TSCP-GelMA溶液固化形成所述TSCP-GelMA水凝胶。

优选地，所述明胶为A型明胶或B型明胶。

优选地，所述TSCP-GelMA溶液中光引发剂的质量分数为0.01％～5％。

优选地，所述GelMA溶液中甲基丙烯酰化明胶的质量分数为5～20％。

优选地，所述TSCP-GelMA溶液中罗非鱼多肽的质量分数为2～13％。

优选地，所述紫外光光照时间为30～60s。

进一步优选地，所述紫外光光照时间为45～60s。

优选地，所述光引发剂为光引发剂Irgacure 2959。

优选地，所述紫外光的波长为100～400nm。

优选地，所述GelMA溶液的制备方法为：

将甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中，加热混匀，得到所述GelMA溶液。

优选地，所述加热为在40～80℃，水浴加热2～4h。

优选地，所述溶解后，还将加入光引发剂的TSCP-GelMA溶液倒入模具中进行倒模，再进行紫外光光照。

所述TSCP-GelMA水凝胶在紫外光光照之前，可以采用模具进行倒模，以制备成任意需要的形状，适用于多种场合多种不同形状的创伤修复。

此外，本发明还请求保护由上述方法制备得到的TSCP-GelMA水凝胶。

所述TSCP-GelMA水凝胶既提升了TSCP的促创伤愈合功效，也加快了GelMA在体内被分解吸收的速度，促进创伤胶原纤维增生，且能有效调控TGF-β1的表达水平，甲基丙烯酰化明胶和罗非鱼多肽协同促进创伤愈合，因此，上述TSCP-GelMA水凝胶在制备促进创伤愈合产品方面的应用也在本发明请求保护的范围内。

本发明具有以下有益效果：

本发明制备得到的TSCP-GelMA水凝胶在使用时，可裁剪成任意形状使用，能够更好贴合皮肤多样的创伤，更大程度防止皮肤与外界环境接触，防止发生感染；且所述TSCP-GelMA水凝胶具有良好的生物相容性，对皮肤刺激性小。

附图说明

图1是A型明胶的红外光谱图。

图2是泡沫状GelMA的红外光谱图。

图3是L929的增殖曲线图。

图4是L929的相对增殖情况。

图5是泡沫状GelMA的照片。

图6是TSCP-GelMA水凝胶的照片。

图7是GelMA水凝胶的结构图。

图8是TSCP-GelMA水凝胶的结构图。

图9是GelMA水凝胶和TSCP-GelMA水凝胶的降解性能曲线图。

图10是光照时间为45s时TSCP-GelMA水凝胶溶胀性的三维响应面图。

图11是光照时间为45s时TSCP-GelMA水凝胶溶胀性的等高线图。

图12是光照时间为60s时TSCP-GelMA水凝胶溶胀性的三维响应面图。

图13是光照时间为60s时TSCP-GelMA水凝胶溶胀性的等高线图。

图14是光照时间为45s时TSCP-GelMA水凝胶吸水性的三维响应面图。

图15是光照时间为45s时TSCP-GelMA水凝胶吸水性的等高线图。

图16是光照时间为60s时TSCP-GelMA水凝胶吸水性的三维响应面图。

图17是光照时间为60s时TSCP-GelMA水凝胶吸水性的等高线图。

图18是光照时间为45s时TSCP-GelMA水凝胶降解性的三维响应面图。

图19是光照时间为45s时TSCP-GelMA水凝胶降解性的等高线图。

图20是光照时间为60s时TSCP-GelMA水凝胶降解性的三维响应面图。

图21是光照时间为60s时TSCP-GelMA水凝胶降解性的等高线图。

图22是小鼠背部的创面分布及给药情况。

图23是小鼠皮肤刺激现象的照片。

图24是小鼠不同时间创面愈合情况。

图25是Masson染色结果。

图26是大鼠背部的创面分布及给药情况。

图27是TGF-β1表达水平图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1泡沫状GelMA、GelMA水凝胶、TSCP-GelMA水凝胶的制备

(1)TSCP-GelMA水凝胶的制备：

S1.GelMA溶液的制备：称取10g的A型明胶置于烧杯中，加入100mL PBS缓冲溶液，60℃水浴下搅拌至完全溶解，配制成10％的明胶溶液，再以0.5mL/min的速度滴加8mL甲基丙烯酸酐(MA)，在60℃水浴下搅拌反应3h后，加入400mL PBS缓冲溶液混合均匀以终止反应；将混合后的溶液用透析袋(MW：12000-14000)分装，置于装有超纯水的大烧杯中，于45℃恒温水浴锅中透析一周，每隔4h换超纯水一次，以除去未反应的MA、小分子及盐类等；透析一周后，将溶液分装于离心管中，离心，将上清液分装于培养皿中，放置-20℃冷冻过夜，再置于冷冻干燥机中冷冻至完全干燥，制得泡沫状GelMA，用50℃超纯水进行溶解，制备得到的GelMA溶液中甲基丙烯酰化明胶的质量分数为10％。

S2.TSCP-GelMA水凝胶的制备：将1g罗非鱼多肽溶解于步骤S1得到的10gGelMA溶液，避光加入0.1g光引发剂Irgacure 2959，摇匀溶解，用移液枪吸取溶液至模具中进行倒模，在波长为365nm的紫外灯下光照60s进行固化，得到所述TSCP-GelMA水凝胶。

(2)泡沫状GelMA的制备：

如(1)中TSCP-GelMA水凝胶的制备方法中步骤S1所示。

(3)GelMA水凝胶的制备：

同TSCP-GelMA水凝胶的制备方法，区别在于，不加罗非鱼多肽。

实施例2泡沫状GelMA的红外分析

一、实验方法：

(1)将A型明胶进行红外检测。

(2)将实施例1制得的泡沫状GelMA研磨成粉末，加入KBr压片后进行红外检测。

二、实验结果：

(1)A型明胶的红外光谱图如图1所示，～3304cm^-1处为酰胺A带，～3078cm^-1处为酰胺B带，主要由N-H键伸缩振动产生的；～1635cm^-1处的酰胺Ι带主要是由C＝O键的伸缩振动产生的；～1539cm^-1处的酰胺Ⅱ带主要由N-H键的弯曲振动及C-N键的伸缩振动的耦合产生；～1241cm^-1处为酰胺Ⅲ带，其吸收峰源自骨架N-H的弯曲振动、酰胺键的C-N的伸缩振动及脯氨酸和肽链骨架上的CH₂振动。

(2)泡沫状GelMA的红外光谱图如图2所示，其峰型与A型明胶的红外光谱图十分相似，酰胺Ⅲ带都位于～1241cm^-1处，但泡沫状GelMA的酰胺Ι带位于～1639cm^-1处，酰胺Ⅱ带位于～1547cm^-1处，相比于A型明胶的酰胺Ι带及酰胺Ⅱ带的吸收峰位置，都略向高频处移动，这可能是由于甲基丙烯酸酐与明胶反应，在A型明胶分子上接枝了甲基丙烯酰胺键引起的。

实施例3 MTT法测定泡沫状GelMA对成纤维细胞的影响

一、实验方法：

(1)收集对数期的L929细胞，调整细胞悬液浓度为10⁴个细胞/ml，接种到96孔板，每孔接种细胞悬液100μL，边缘孔用无菌PBS填充，常规培养。另取培养基放置于37℃的水浴锅进行加热备用，将泡沫状GelMA溶解于培养基中，配成20mL浓度为5％的GelMA溶液，用0.22μm孔径微孔滤膜过滤，待用。

(2)实验分为两组：实验组(在96孔板上加入100μL含GelMA溶液的DMEM培养基)、对照组(在96孔板上加入等体积的DMEM培养基)。对照组与实验组分别做三个平行样。

(3)在24h、48h、72h点定时取一块细胞板样进行MTT试验，具体步骤如下：每孔中加入20μL浓度为5mg/mL的MTT试剂，将96孔板重新置于培养箱中常规培养4h，4h后小心弃去孔内的混合液后，每孔加入100μl DMSO于摇床震荡，至结晶充分溶解，用微孔板分光光度仪于490nm测OD值。

(4)用MTT法测定GelMA对L929增殖情况的影响，该方法的原理是活细胞中线粒体的琥珀酸脱氢酶将MTT试剂还原成紫色甲瓒，而死细胞无此功能，通过测定OD值可以间接反映活细胞的数量。

因此，本发明通过对比对照组和实验组在24h、48h、72h时的OD值变化情况及L929的相对增值率，参照ISO 10993细胞毒性反应等级评定标准(表1)来评价GelMA对成纤维细胞的影响。其中，等级为0或1，则评定为及格，对细胞无毒性；等级为2，则结合细胞的生长形态进行综合评定；等级为3、4或5，则评定为不及格，具有细胞毒性。

表1 ISO 10993细胞毒性反应等级评定标准

细胞的相对增殖度	反应级数
		≥100	0
99-75	1
		74-50	2
49-25	3
		24-1	4
0	5

二、实验结果：

L929的增殖曲线如图3所示，L929的相对增殖情况如图4所示。

由图3可知，在24h、48h、72h后，OD值的增加反映了L929活细胞数量的增加，虽然GelMA组的细胞增殖速度略低于空白组的细胞增殖速度，但是基本持逐渐递增的趋势。通过图4的计算结果得L929细胞在24h、48h、72h后的相对增值率值均在94％以上。根据ISO10993细胞毒性反应等级，评级为1级，即及格、对细胞无毒性，因此，GelMA材料对成纤维细胞是无细胞毒性的。

分析成纤维细胞的增殖曲线图及相对增值率可知，GelMA材料具有良好的生物相容性，可成为潜在的应用于皮肤工程的材料。

实施例4 TSCP-GelMA水凝胶的物理性质

(1)观察泡沫状GelMA(图5)和TSCP-GelMA水凝胶的外观(图6)发现，泡沫状GelMA呈疏松多孔的结构，且易溶水中；TSCP-GelMA水凝胶呈半透明的固体状，质地似果冻，不易溶于水，对皮肤有较佳的粘性，不易脱落，可成为皮肤敷料的理想材料。

(2)SEM分析：将GelMA水凝胶和TSCP-GelMA水凝胶分别放进冰箱-20℃冷冻过夜后，放置于冷冻干燥机至完全干燥。剪下一小段导电胶，将其粘贴于载物台上，用锋利的小刀分别切割下一小块已干燥完全的水凝胶，将其分别固定在导电胶上，需观察的面朝上放置，且水凝胶大小不得超过导电胶的大小。将已固定好的水凝胶分别进行喷金处理后，放置在扫描电镜仪器中的试样室后抽真空，调整试样的距离，分别观察水凝胶的结构，并分别对水凝胶的结构进行拍照。

GelMA水凝胶的结构如图7所示，TSCP-GelMA水凝胶的结构如图8所示。由SEM图可得，GelMA水凝胶和TSCP-GelMA水凝胶的内部结均为构致密多孔，呈蜂窝状结构；GelMA水凝胶的内部孔径为8μm—12μm，TSCP-GelMA水凝胶的内部孔径约为19μm—22μm，相比于GelMA水凝胶的孔径大小，TSCP-GelMA水凝胶的孔径较大，且内部结构更为规整。说明负载TSCP有利于形成孔径稍大的3d多孔结构，有利于细胞的粘附，并可保留较多的水分以支持细胞的生长代谢。

(3)降解性：分别称取GelMA水凝胶和TSCP-GelMA水凝胶的质量W_i，再分别将其浸泡于含1mL 0.02U/ml胶原酶的蒸馏水中，每隔24h换一次酶解液，当浸泡时间为2h、4h、8h、16h、24h、42h、50h时取出样品，用蒸馏水洗涤两遍后，称取水凝胶的质量Wr。

根据该公式分别计算GelMA水凝胶和TSCP-GelMA水凝胶的降解性：

并根据计算得到的数据，绘制降解性能曲线(图9)，可知TSCP-GelMA水凝胶经过8h的酶解就已降解完全，而与此同时，GelMA水凝胶质量损失仅为25.52％，一直到酶解50h后GelMA水凝胶才降解完全。说明负载TSCP对水凝胶的降解性影响较大，降解速率明显增大，即本发明制备得到的TSCP-GelMA水凝胶中TSCP与GelMa发挥协同作用，促使GelMa在体内被快速吸收。

实施例5探究三因素对TSCP-GelMA水凝胶性能的影响

使用实验设计软件Design Expert，设计实验方案。该方案以星点设计法，又名中心组合设计(CCD)法，将考察TSCP-GelMA水凝胶制备过程中三个因素的不同组合状况，测量各组实验数据；再采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优因素组合。

此设计实验方案的三个因素是GelMA质量分数、TSCP质量分数和紫外光照时间；所探究的因变量是TSCP-GelMA水凝胶的溶胀性、吸水性和降解性。

(1)按照实施例1的制备方法，分别制备如表2所示组合状况的TSCP-GelMA水凝胶。

表2

制备过程中发现，紫外光照时间不小于30s的TSCP-GelMA水凝胶能形成轮廓完整的形状，而第7组(紫外光照时间19.77s)则不能形成轮廓完整的形状，未能形成水凝胶。

将制备得到的其它14组TSCP-GelMA水凝胶按以下方式量化其溶胀性、吸水性和降解性。

I.溶胀性

分别用干净的滤纸吸收TSCP-GelMA水凝胶表面的水分，用电子天平称量其质量，记为m₀；将其浸没在蒸馏水中令其充分吸收水分，在室温下放置3h后取出，再次用干净的滤纸吸收其表面的水分，用电子天平称量其质量，记为m₁。

根据以下公式计算TSCP-GelMA水凝胶的质量差异，量化其溶胀性。

II.吸水性

分别将TSCP-GelMA水凝胶放入干净的容器中，于-20℃冷冻过夜。将冻结的TSCP-GelMA水凝胶置于冷冻干燥机中至完全干燥，用电子天平称量其质量，记为w₁；将干燥的TSCP-GelMA水凝胶浸没在蒸馏水中令其充分吸收水分，在室温下放置12h后取出，再次用干净的滤纸吸收其表面的水分，用电子天平称量其质量，记为w₂。根据以下公式计算TSCP-GelMA水凝胶的质量差异，量化其吸水性。

III.降解性

用电子天平准确称量0.1600g胶原酶，溶于蒸馏水，并用蒸馏水定容至1000mL，配制为0.02U/mL的胶原酶溶液；另用干净的滤纸吸收TSCP-GelMA水凝胶表面的水分，用电子天平称量其质量，记为d₁；再放入24孔细胞培养孔板中，每孔TSCP-GelMA水凝胶滴加1mL胶原酶溶液，置于37℃恒温水浴，每隔12h更换一次酶解液，经酶解48h后，再次用干净的滤纸吸收其表面的水分，用电子天平称量其质量，记为d₂。根据以下公式计算TSCP-GelMA水凝胶的质量差异，量化其降解性。

(2)将上述得到的14组TSCP-GelMA水凝胶的溶胀性、吸水性和降解性数据录入实验设计软件Design Expert，软件通过全面运算各种组合，生成三维响应面图像和等高线图，并且可得出一个最优化的因素组合。

I.三因素的不同水平对TSCP-GelMA水凝胶溶胀性的影响

在生成的三维响应面图像中设置紫外光照时间为45s(图10)，X₁轴为多肽质量分数，X₂轴为GelMA质量分数，Y₁轴为TSCP-GelMA水凝胶充分吸收水分之后，相对于其吸收水分之前质量增加的百分比；通过图像能够直观看出，对TSCP-GelMA水凝胶溶胀性影响能力更大的单因素是多肽质量分数(以下用A表示多肽质量分数)，大于GelMA质量分数对TSCP-GelMA水凝胶溶胀性的影响(以下用B表示GelMA质量分数)；在等高线图(图11)中可知Y₁等高线的最小水平在A(7.57,10.14)、B(11.43,15.18)，Y₁等高线对应为20.00％。溶胀性能反映TSCP-GelMA水凝胶新制备后，在湿重状态时对水分的吸附能力，结果表明本发明的制备方法提高了TSCP-GelMA水凝胶的溶胀性。

另调整紫外光照时间为60s，得到三维响应面图像(图12)和等高线图(图13)，比较紫外光照时间45s与60s对应的等高线图像，Y₁的等高线投影的(X₁,X₂)的面积有小量增加；经计算得知，Y₁的30.00％等高线投影面积增加7.06％；40.00％等高线投影面积增加2.08％，可见，增加紫外光照时间至60s能小幅提高TSCP-GelMA水凝胶的溶胀性，同时为了使水凝胶溶液经光照固化，GelMA的质量分数建议不低于CCD实验方案中的最小值6.59％。

II.三因素的不同水平对TSCP-GelMA水凝胶吸水性的影响

在生成的三维响应面图像中设置紫外光照时间为45s(图14)，X₃轴为多肽质量分数(以下用A表示)，X₄轴为GelMA质量分数(以下用B表示)，Y₂轴为经冷冻干燥后的TSCP-GelMA水凝胶充分吸收水分后，相对其干重增加的质量的百分比；通过图像能够直观看出，与对TSCP-GelMA水凝胶溶胀性的影响程度相似，A的单因素对TSCP-GelMA水凝胶吸水性的影响更大，并且随着A、B两个因素的取值增加，Y₂的取值随之增加；在等高线图(图15)中可知Y₂等高线的最小水平在A(0.00,7.59)、B(8.97,20.00)，其极小值为583.33％，Y₂取值在580％～870％的范围内。吸水性能反映TSCP-GelMA水凝胶在干燥状态下吸收水分子的能力，能吸收不小于自身质量6倍的高分子材料可视为高吸水性的高分子材料，可见本发明制备得到的TSCP-GelMA水凝胶具备高吸水性。

另调整紫外光照时间为60s，得到三维响应面图像(图16)和等高线图(图17)。从等高线图可知，Y2的取值在480％～650％的范围内；对比紫外光照时间45s与60s的三维响应面图像和等高线图，反映出了增加光照时间令TSCP-GelMA水凝胶干重状态的吸水性总体下降，且光照时间的增加会导致GelMA质量分数与多肽质量分数的共同作用对Y₂取值的影响程度减弱，故增加紫外光照时间至60s会减小TSCP-GelMA水凝胶的吸水性。

III.三因素的不同水平对TSCP-GelMA水凝胶降解性的影响

在生成的三维响应面图像中设置紫外光照时间为45s(图18)，X₅轴为多肽质量分数(以下用A表示)，X₆轴为GelMA质量分数(以下用B表示)，Y₃轴为TSCP-GelMA水凝胶经过48h酶解后其质量减少的百分比。从等高线图(图19)中可知，A、B对TSCP-GelMA水凝胶降解性的影响较小，Y₃的较高水平不小于50.0％，可见，本发明的制备方法提高了TSCP-GelMA水凝胶的降解性

另调整紫外光照时间为60s，得到三维响应面图像(图20)和等高线图(图21)。对比紫外光照时间45s与60s的三维响应面图像和等高线图可知，紫外光照射时间的增加会导致Y3的等高线投影的(X5,X6)的面积减小。经计算，Y3的60.00％等高线投影面积变化为-9.58％，50.00％等高线投影面积变化为-3.38％，40.00％等高线投影面积变化为-3.44％，可知增加紫外光照时间至60s制得的TSCP-GelMA水凝胶，由于光照时间增加，降解性有小幅下降。可见，多肽质量分数和GelMA质量分数两因素水平分别在2～13％和5～20％的范围内时都表现出经过48h的降解，TSCP-GelMA水凝胶质量减少不小于50％的性能，属于理想的降解性；而紫外光照时间的因素对降解性的影响是，紫外光照时间增加令TSCP-GelMA水凝胶降解性整体有一定下降，这一影响与紫外光照时间增加会提高水凝胶交联程度的情况基本一致。

实施例6 TSCP-GelMA水凝胶对创伤愈合的影响

一、仪器与材料

(1)主要实验试剂

罗非鱼胶原蛋白：购买于河南悦欣生物科技有限公司；

重组人表皮生长因子凝胶：购买于桂林华诺威基因药业有限公司。

(2)实验动物及饲养条件

实验动物：昆明小鼠80只，雄性，普通级，体质量18-25g，购于广东省医学动物中心。

饲养条件：无毒塑料鼠盒，不锈钢丝笼盖饲养，5只/笼；温度：18-25℃；湿度：50％-60％；饲料每日9:00添加，每日一餐，一餐给予100g饲料；每日9:00换小鼠饮用水，一次100ml，垫料每2天更换；作息时间：21:00-次日9:00。

(3)昆明小鼠创伤模型的制备

随机取70只检疫合格的昆明小鼠于创模前一天在其背部用小鼠剃毛器脱毛，面积为全背部，背部脱毛用生理盐水清洗干净，归笼饲养，使用10％水合氯醛对小鼠腹腔注射麻醉(0.1mL/20g)。小鼠背部脱毛区皮肤以75％乙醇消毒后，使用蘸取了苦味酸的特质打孔器在小鼠背脊两侧垂直于皮肤各压出四个圆形痕迹，在四个创面中线上端压出第五个圆形痕迹。利用眼科镊子挑起小鼠背部皮肤，弯头手术剪延压痕剪去全层皮肤直达筋膜，用医用棉球止血，生理盐水擦拭伤口，共制备五个创面，创面面积为0.5024cm2。造模后的小鼠分笼饲养，自由进食、饮水。

(4)实验分组和给药

采用自身对照法，小鼠背部5个创面给予不同给药处理(图22)，每日定时给药，一天给药两次，使用医用棉花及医用绷带使药物在小鼠创面保留至少一小时。A组：TSCP-GelMA水凝胶(实施例1)；B组：GelMA水凝胶(实施例1)；C组：空白对照(BC组，不给药)；D组：罗非鱼多肽(TSCP组)；E组：重组人表皮生长因子凝胶(rhEGF组)。

二、实验方法和结果

(1)小鼠皮肤刺激实验

随机选取6只未建立创伤模型的昆明小鼠脱毛并分成3组，2只/组，分别在小鼠去毛区敷上TSCP-GelMA水凝胶、75％乙醇、浓度为0.1％的2，4-二硝基氯苯，以保鲜薄膜包敷，无刺激性胶布固定，持续6h后温水洗去各组药物。即刻观察并拍照皮肤过敏反应情况以及小鼠物有无哮喘、站立不稳等全身性过敏反应；于24h、48h、72h再观察并拍照(图23)，用箭头表示红斑水肿处。

I.平均反应均值：根据皮肤反应程度评分标准(表3)对三组小鼠进行评分，并按以下公式计算平均反应分均值：平均反应均值＝所有动物的总积分/动物总数。

表3皮肤反应程度评分标准

II.致敏率：根据致敏评价标准(表4)对药物进行评价，并根据以下公司计算致敏反应发生率：致敏反应发生率(％)＝有过敏反应动物数/动物总数×100％

表4致敏评价标准

III.实验结果

皮肤刺激反应积分表如表5所示，且观察得知75％乙醇组和TSCP-GelMA水凝胶组的小鼠一般情况良好，未出现哮喘、站立不稳等全身性过敏反应,两组小鼠的脱毛区在激发6h后均无红斑和水肿形成；且在24h、48h、72h观察，小鼠均无异样，也未见过敏现象，致敏率为0％；而2,4-二硝基氯苯组在激发6h后，在小鼠脱毛区可见轻度至中度的红斑及水肿出现，其致敏率为100％，且24h小鼠的脱毛区可见轻度的红斑，48h红斑逐渐消退，72h小鼠脱毛区的红斑基本消去。

表5皮肤刺激反应积分表

(2)TSCP-GelMA水凝胶对创面组织愈合率的影响

I.实验方法

在按照图22方式处理的小鼠中，于给药后第1、3、7、14和21天分别随机取2只，对创面进行拍照，放置15cm直尺作为比例尺校准对照。伤口面积的减小是伤口愈合最直观的表现，分别于给药后1、3、7、14和21天通过伤口面积的减小情况计算其愈合率。在创伤后用半透明硫酸纸覆盖于创口表面，沿创口边缘画线，用网格正交坐标纸测量创口面积，按以下公式计算其愈合率，从而评价损伤创面愈合率：创面愈合率(％)＝(创面给药前面积-创面给药后面积)/创面给药前面积×100％。

II.实验结果

①昆明小鼠在建模后，昆明小鼠日常活动，日常饮食作息以及精神状态良好。小鼠创面建模结束后可见筋膜，少有出血的情况。建模第1天后，各组创面均有水肿现象，肉芽组织红润，柔软；建模第3天，TSCP-GelMA水凝胶组与rhEGF组创面水肿开始消退，湿润的创面逐渐变干燥，稍有皱缩，GelMA水凝胶组、TSPC组与BC组创面较为湿润，可见轻度水肿；建模第7天，各组创面结痂，外周痂皮开始脱落，创面缩小，TSCP-GelMA水凝胶组的创面面积为原始面积的66.28％，rhEGF组的则为65.79％，这两组的创面愈合情况均优于BC组以及对照组；建模第14天，各组的痂皮均完全脱落，创面区域无毛发生长，TSCP-GelMA水凝胶组和rhEGF组的创面愈合情况均优于BC组。建模第21天，各组的创面基本愈合，各创面相对于第14天有毛发生长，各组愈合情况均优于BC组。

②愈合率计算结果如表6所示，TSCP-GelMA水凝胶组、rhEGF组和对照组(GelMA水凝胶组、TSCP组)的创面愈合率均高于BC组。给药后第3天，TSCP-GelMA水凝胶组、rhEGF组与对照组比较有显著差异(p<0.05)；给药后第7天，对照组与BC组比较有显著差异(p<0.05)；给药后第3、7、14、21天，TSCP-GelMA水凝胶组、rhEGF组与BC组比较，有显著差异(p<0.05)。TSCP-GelMA水凝胶组与rhEGF组愈合效果相当，未见明显差异。

可见，本发明制得的TSCP-GelMA水凝胶能提升TSCP的促创伤愈合功效，尤其在创面愈合的初期，如第1天和第3天，TSCP-GelMA水凝胶组的创面愈合率优于GelMA水凝胶组与TSPC组的愈合率之和，即甲基丙烯酰化明胶和罗非鱼多肽在愈合初期，发挥了协同增效的促创伤愈合效用。

表6不同时间创面愈合率比较(％，n＝4，

)

注：“^*”：与BC组比较；“^#”：与对照组比较

(3)TSCP-GelMA水凝胶对创面组织中胶原纤维增生的影响

人体最大的的器官是皮肤，覆盖全身，而皮肤分为两层：表皮层和真皮层，其中真皮层具有的结缔组织和弹性纤维是使皮肤维持紧致柔软的重要部分，胶原纤维广泛分布于真皮层中。在小鼠创伤模型中，小鼠背部皮肤被全层切除，大量胶原纤维流失，实验以不同周期小鼠创面胶原纤维的表达量为指标，能直观有效反映TSCP-GelMA水凝胶对创面组织中胶原纤维增生的影响。

胶原染色又称Masson染色，是指两种或三种阴离子染料混合后使胶原纤维呈蓝色、肌纤维呈红色的一种染色方法，能定性、定量地分析胶原纤维，Masson染色后各成分染色颜色对比明显，常用于炎症疾病的研究中。本实验采用ImageJ图像分析软件，分别测量染色后的创面组织面积及创面胶原纤维面积，按以下公式计算出胶原容积分数，胶原容积分数越大即代表胶原纤维的表达量越多，愈合效果越好。

I.创面病理组织学观察

在按照图22方式处理的小鼠中，于给药后第1、3、7、14和21天分别随机取5只，吸入乙醚过量处死，用手术剪以及一次性刀片切取创面外缘皮肤，置于50mL离心管中并在离心管外按照周期组别做好标记后，倒入适量固定液，经Bouin’s固定液(配方：苦味酸饱和液(1.22％)75ml、福尔马林25ml、冰醋酸5ml，苦味酸饱和液配方：将1.5g苦味酸固体溶解在100ml蒸馏水中)固定后，石蜡包埋，用于胶原染色。将创面组织按以下石蜡包埋切片和Masson染色的方式处理后，于显微镜下观察皮肤创面胶原纤维生长情况并进行比对。

①石蜡包埋切片过程：将组织块置于Bouin’s固定液固定24小时，固定后水洗10-20min，再用80％乙醇浸过夜，依次用90％乙醇、95％乙醇、100％乙醇分别浸1h以脱去多余水分，经无水乙醇和二甲苯各半的混合液浸1小时，再用纯二甲苯浸渍直至组织块透明，在50℃水浴锅中熔化石腊块后，将经过透化的组织块放入熔化的石蜡内浸渍1h，包埋好的蜡块用刀片修成方形，在切片机上切成一片接一片的4～7μm的蜡带，用毛笔轻托放纸上。用眼科镊子镢起蜡带轻轻平铺在42℃的水面上，待切片在水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中1/3和下1/3的中间，倾去载玻片上的余水，在60℃的温控仪内烤片30min，切片前还要用二甲苯脱蜡，经梯度酒精脱苯直至蒸馏水复水。

②Masson染色过程：取出切片，把切片周围蜡擦拭干净，依次用二甲苯Ⅰ浸泡10min、用二甲苯Ⅱ浸泡10min以使组织上的石蜡被融去；再用无水乙醇浸泡5min、95％乙醇浸泡5min、85％乙醇浸泡5min、75％乙醇浸泡5min以清洗组织上的残留石蜡；用1％高锰酸钾氧化切片5min，水洗，草酸漂白1min，水洗，蒸馏水洗，天青石蓝染5min，水洗，甩去余液不用水洗，滴染Mayer氏苏木素3-5min，流水冲洗5-10min，丽春红苦味酸饱和液染5min，1％醋酸水溶液洗，1％磷钼酸分化切片5min，蒸馏水洗，1％淡绿滴染30s，1％醋酸水溶液洗切片，95％酒精分化，无水酒精脱水，二甲苯浸渍至透明，中性树胶封固。

II.数据处理

采用ImageJ图像分析软件及SPSS19.0软件，对组织切片的染色结果(图25)进行分析，对比各组创面的胶原容积分数。

III.实验结果

①Masson染色切片观察

由图25可知，小鼠创伤第1天皮肤表皮层被破坏，缺损严重，可见少量胶原纤维呈波浪状，胶原纤维分布稀疏；BC组、GelMA水凝胶组、TSCP组、TSCP-GelMA水凝胶组、rhEGF组的创面胶原容积分数分别为12.58％、12.11％、14.81％、16.04％、16.77％，(p>0.05)，差异不明显。

小鼠创伤第3天，与第1天相比，可见少量胶原纤维，皮肤创面发生炎症反应，表皮层未修复；BC组、GelMA水凝胶组、TSCP组、TSCP-GelMA水凝胶组、rhEGF组的创面胶原容积分数分别为13.17％、17.42％、24.69％、30.18％、30.04％；其中，BC组和GelMA水凝胶组的胶原纤维表达量较TSCP组少，TSCP组的胶原纤维表达量较TSCP-GelMA水凝胶组及rhEGF组少，TSCP-GelMA水凝胶组及rhEGF组的胶原容积分数相差0.87％(p>0.05)。除BC组、GelMA水凝胶组的胶原容积分数分别比第一天增加0.59％(p<0.05)、5.31％(p<0.05)，其余三组的胶原纤维均比第1天的表达量有较大幅度增加，TSCP-GelMA水凝胶组、TSCP水凝胶组、rhEGF组分别增加了9.88％、14.14％、13.27％，整体而言，无明显增生现象。

小鼠创伤第7天，皮肤表皮开始修复，细胞开始增殖分化，胶原纤维较第1天、第3天多，显色明显，由创缘往创面中心增殖，分布开始密集起来，纤维带增多增厚，可见部分胶原纤维成束；BC组、GelMA水凝胶组、TSCP组、TSCP-GelMA水凝胶组、rhEGF组的创面胶原容积分数分别为20.96％、24.06％、35.74％、62.70％、56.68％；其中，TSCP-GelMA水凝胶组和rhEGF组对胶原纤维增生的效果最为明显，与BC组相比较，TSCP-GelMA水凝胶组和rhEGF组的胶原容积分数分别增长了41.74％(p<0.05)、35.72％(p<0.05)；与GelMA水凝胶组比较，TSCP-GelMA水凝胶组和rhEGF组的胶原容积分数分别增长了38.64％(p<0.05)、32.62％(p<0.05)；与TSCP组比较，TSCP-GelMA水凝胶组和rhEGF组的胶原容积分数分别增长了26.96％(p<0.05)、20.94％(p<0.05)，增生能力活跃于其他三组。

小鼠创伤第14天，表皮层修复后期，表皮层有结痂现象，可见大量胶原纤维表达，胶原纤维在创面组织中明显增粗增厚，填补大部分缺损创面，大部分胶原纤维成束，整齐排列，分布密集伴随大量肌纤维表达，成纤维细胞生成；BC组、GelMA水凝胶组、TSCP组、TSCP-GelMA水凝胶组、rhEGF组的创面胶原容积分数分别为38.11％、40.15％、58.53％、70.95％、79.92％。

小鼠创伤第21天，皮肤组织重建，BC组的胶原纤维表达量较少，其余四组可见大量胶原纤维成束，分布密集，且有大量肌纤维，皮肤表皮基本修复；BC组、GelMA水凝胶组、TSCP组、TSCP-GelMA水凝胶组、rhEGF组的创面胶原容积分数分别为56.37％、67.79％、79.38％、88.89％、89.15％；其中，TSCP-GelMA水凝胶组和rhEGF组与第1天相比，增长了72.85％(p<0.05)、72.38％(p<0.05)；BC组、GelMA水凝胶组和TSCP组与第1天相比，分别增长了43.79％(p<0.05)、55.68％(p<0.05)、64.57％(p<0.05)，相比之下，TSCP-GelMA水凝胶组和rhEGF组恢复效果明显快于BC组、GelMA水凝胶组和TSCP组。

综上可知，TSCP-GelMA水凝胶组和rhEGF组在第1、3、7、14、21天的创面胶原容积分数相差无几，p>0.05，无统计学意义，故认为本发明制备得到的TSCP-GelMA水凝胶能达到现有常用药物rhEGF的药效，能提高GelMA被胶原酶分解吸收的效率，促进创面组织中胶原纤维增生。

实施例7 TSCP-GelMA水凝胶对创面组织中TGF-β1表达水平的影响

TGF-β家族包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，在伤口愈合过程的所有阶段中都发挥着重要的作用，而借助下游分子Smad介导的TGF-β1信号通路被认为是一条与创伤修复相关的经典通路，TGF-β1作为细胞生长的多功能调节因子，在伤口愈合过程中不同时期发挥的作用各不相同。

在伤口愈合早期，创面部位高浓度的TGF-β1具有加速细胞生长分化、提高上皮细胞与结缔组织的再生速度以及促进血管生成，达到促愈合功效；且TGF-β1还可通过加快胶原增生速度，改变各型胶原比例的同时减缓胶原分解速度，导致癜痕形成。因此在创面愈合后期的癜痕形成阶段，可借助下调TGF-β1表达水平的方式来抑制TGF-β1/Smads信号通路的表达，以达到在创面愈合的前提下抑制癜痕的形成。

I.实验准备

①实验动物

从广东省医学实验动物中心购买普通级雄性SD大鼠40只。大鼠在正式开展实验前统一饲养5天，饲养环境温度控制在24-28℃，统一每日喂食一次，垫料每两日更换一次，昼夜节律为13/11h(13小时光照，11小时黑暗)。实验动物平均分为5组，每组8只。

②构建全层皮肤创伤的动物模型

皮肤创伤前处理：麻醉前，对大鼠进行安抚。对大鼠采用腹腔注射10％的水合氯醛(300mg/kg)的方式进行麻醉，注射后静待片刻，使其处于完全麻醉的状态，用电动推子铲除其背部由颈至尾的毛发，并用6％硫化钠涂抹其背部至毛发脱去，再用生理盐水清洗干净。

皮肤创伤：将大鼠俯卧绑于解剖台上，用签字笔在大鼠背部脊椎两侧垂直于皮肤画下四个1.0cm×1.0cm的正方形(图26)，然后用手术剪沿痕迹剪下一块正方形的全层皮肤，其余三个伤口也做相同的处理，建立大鼠背部皮肤创伤模型。

皮肤创伤后处理：用洁净棉球擦去血后，采用自身对照法，分别在每只大鼠背部的4个创伤部位以1次/天的频率按顺序给药：A组：TSCP-GelMA水凝胶(实施例1)；B组：GelMA水凝胶(实施例1)；C组：空白对照(BC组，不给药)；D组：重组人表皮生长因子凝胶(rhEGF组)。

II.实验方法

①样本的制备和组织蛋白的提取：分别于给药后第1、3、5、7和14天随机取5只，处死后用手术剪和一次性刀片切取创面外缘皮肤30mg，分别放入标记好的1.5mL EP管中，向装有创面组织的EP管中加入预冷的1X的PBS溶液，剪碎并短暂离心，弃上清；在研钵中加入40μL组织裂解液(RIPA)和4μL PMSF,用干净黄枪头将创面组织转移到研钵中，冰上研磨创面组织至匀浆状态；将匀浆转移到1.5mL EP管中，冰上孵育20分钟；再在4℃下以12000rpm的转速离心20分钟，离心完毕后吸取中间层，分装并保存于-40℃冰箱中。

②蛋白样本的制备：用BCA蛋白测试盒测定蛋白样本蛋的蛋白含量，加入上样缓冲液将所有蛋白调至等浓度，制备蛋白样本。

③SDS-PAGE胶的制备：用自来水冲洗电泳槽、玻璃板及梳子等实验用品，再用超纯水二次冲洗，置于通风处晾干，将大小玻璃板整齐叠放形成制胶板，固定于制胶架上；用12％SDS-PAGE凝胶超快速配制试剂盒制胶，再用少量异丙醇压胶；用滤纸吸干异丙醇后插入梳子，避免气泡生成，静置10min。

④上样与电泳：将制胶板插入电泳槽中，再放入电泳盒中，向盒中倒入SDS-PAGE电泳液，拔出梳子并加入10μL蛋白样本及5μL预染蛋白Marker；打开电源，电压调至80V，等待30分钟后，可见样本跑成一条直线，同时Marker条带跑分开；再将电压调至120V，1小时后关闭电源结束电泳。

⑤转膜(湿转法)：将海绵和滤纸浸泡于转膜液中10分钟，同时剪下一段NC膜，于甲醇中活化2分钟，再转入转膜液中浸泡；把夹子放在装有转膜液的托盘中，负极朝下，依次放入海绵、4层滤纸、SDS-PAGE胶、NC膜、4层滤纸和海绵，放入转膜槽，倒入转膜液，接通电源，电压调至100V，1小时后结束转移。

⑥封闭：转膜完毕后，将NC膜放入5％的脱脂牛奶中，26℃震摇封闭1小时。

⑦一抗孵育：提前按照1：5000的比例稀释一抗，把封闭好的膜放入PBS溶液漂洗三次，每次5分钟，再放入抗体稀释液中，4℃下静置过夜。

⑧二抗孵育：将膜从一抗稀释液中取出，在适量TBST中缓慢摇动漂洗4分钟，共5次；提前按照1：5000的比例稀释二抗，待清洗完成后，将膜放入适量二抗稀释液中，37℃孵育1小时；孵育结束后将膜取出，放入装有适量TBST的托盘中，漂洗5次，每次5分钟。

⑨显色：从4℃的冰箱中取出显影液和暗盒，将显影液倒入暗盒中，吹打均匀。将膜从PBST中取出沥干，转移入暗盒中与显影液充分接触，使用相机进行拍摄(图27)

III.实验结果与分析

用SPSS 20.0、Image J、Origin 9.1和Q550图像分析软件统计分析数据、处理图片及作数据图，结果表示为平均值±标准差

通过单因素方差来对各组间愈合率进行差异比较，若p<0.05认为差异具有统计学意义。(*代表p<0.05，#代表p<0.01。)

TGF-β1表达水平计算结果如表7所示，观察可得：给药后第1天，TSCP-GelMA水凝胶组、rhEGF组和GelMA水凝胶组的TGF-β1表达水平与BC组相比皆无显著差异(p>0.05)；给药后第3天，TSCP-GelMA水凝胶组(p<0.05)的TGF-β1表达水平与BC组相比有显著差异；给药后第5天，TSCP-GelMA水凝胶组(p<0.01)、rhEGF组(p<0.01)和GelMA水凝胶组(p<0.01)的TGF-β1表达水平与BC组相比具有显著差异，且TSCP-GelMA水凝胶组和rhEGF组的TGF-β1表达水平要高于GelMA水凝胶组和BC组，出现一个表达高峰后，TSCP-GelMA水凝胶组和rhEGF组的TGF-β1表达水平迅速下降；给药后第7天，TSCP-GelMA水凝胶组(p<0.05)、rhEGF组(p<0.05)和GelMA水凝胶组(p<0.01)的TGF-β1表达水平与BC组相比具有显著差异，且GelMA水凝胶组和BC组的TGF-β1表达水平在第7天出现表达高峰，GelMA水凝胶组的TGF-β1表达水平高于BC组；给药后第14天，TSCP-GelMA水凝胶组、rhEGF组和GelMA水凝胶组的TGF-β1表达水平与BC组相比皆无显著差异(p>0.05)。

表7 TGF-β1表达水平比较(％，n＝4，

)

注：“*”：p<0.05；“**”：p<0.01；“***”p<0.001。

综上可知，在创面愈合早期，TSCP-GelMA水凝胶组相比于GelMA水凝胶组可显著上调TGF-β1表达水平，加速细胞生长分化和组织再生，促进创面愈合；同时，在癜痕形成期可下调TGF-β1表达水平，以抑制癜痕形成及皮肤纤维化，使伤口更加平整美观。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种TSCP-GelMA水凝胶的制备方法，其特征在于，通过如下方法制备得到：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述GelMA溶液中甲基丙烯酰化明胶的质量分数为5～20％。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述TSCP-GelMA溶液中罗非鱼多肽的质量分数为2～13％。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述紫外光光照时间为30～60s。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述光引发剂为光引发剂Irgacure2959。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述紫外光的波长为100～400nm。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述GelMA溶液的制备方法为：

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述加热为在40～80℃，水浴加热2～4h。

9.权利要求1～8任一所述方法制备得到的TSCP-GelMA水凝胶。

10.权利要求9所述TSCP-GelMA水凝胶在制备促进创伤愈合产品方面的应用。