CN110184235B - 一种adsc外泌体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ADSC外泌体及其制备方法与应用。采用来源于人体腹部的废弃脂肪组织分离培养的脂肪间充质干细胞，经过组织分离和原代细胞获得培养，脂肪间充质干细胞纯化和扩大培养，脂肪间充质干细胞库的建立，脂肪间充质干细胞外泌体的提取，得到生发液。采用ADSC外泌体制备成外涂抹液或注射液，治疗脱发患者，治疗方法温和，容易被患者接受，是一种治标又治本的治疗脱发的方法。

Description

一种ADSC外泌体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于人源外泌体制备技术领域，具体涉及一种ADSC外泌体及其制 备方法与应用。

背景技术

脱发是一种常见的且令人困扰的问题，它是由包括基因、激素、外伤和医 源性事件等一系列复杂的原因造成的。仅在中国就约有1.6亿人有脱发的烦恼， 目前针对脱发患者就有几种治疗选择，如使用口服或者外用药物，或者手术治 疗。然而，这些治疗方式具有局限性，药物治疗只能暂短的缓解症状，当病人 停止用药后头发又会开始脱落。比如口服非那雄胺有副作用并且会至畸，停止 用药后，头发会加速脱落。采用自体的单个毛囊和毛囊单位移植是一种可靠的 手术治疗方法，但是毛囊供体数量是有限的，并且毛囊移植存活率低而费用高， 并且给病人带来极大的痛苦。

头发的生长脱落究其本源与毛囊干细胞健康有着密不可分关系。毛囊干细 胞是毛囊内原始细胞，属于成体干细胞，但它却没有成体干细胞那么活跃，长 时间处于冬眠状态，直到接受外界的再生信号之后，才会恢复活力，古人有方， 涂抹生姜会生发，是因为姜辣油成分刺激了毛囊干细胞。在国际医学界，对脱 发的原因有多种的解释，包括西方医学以及中国的中医理论。不论何种病因， 其结果是一样的，那就是毛囊的萎缩与退化，萎缩退化的毛囊不参与机体循环， 无法吸收周围头皮养分，毛发自然不再生长。所以，让毛囊重新恢复机能是关 键。

刺激患者的身体(例如，通过给药、身体锻炼或者物理疗法等)以刺激存 在于该患者损伤器官或组织原位的干细胞，和/或患者的血液来源或者骨髓来源 干细胞，而不在体外培养诱导干细胞的增长或/和分化。将该方法定义为“原位 组织再生”。相对而言，利用“原位组织再生”的方法更为简单可靠，即刺激本 来存在于患者身体内部的干细胞(即，病变组织内部或附近原有的干细胞，或来 自患者自身血液来源或骨髓来源干细胞)分化，再生损伤器官和组织，从而可恢 复其功能。研究发现，脱发患者的脱发区域的毛囊干细胞数量上没有损失，只 是相比正常人来说，脱发区域的毛囊祖细胞数量表现的更为稀少。因此脱发的 原因也可以解释为身体因素导致毛囊干细胞想毛囊祖细胞分化过程出现障碍， 导致毛囊干细胞不能正常的分化为毛囊祖细胞，以至于毛囊重建受到抑制，从 而导致脱发。如果能够刺激毛囊干细胞进行分化，那么就可以在脱发区域生出 头发来。目前，尚没有有效的刺激毛囊干细胞进行分化的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种ADSC外泌体及其在制备治疗脱发的药物中的 应用。

一种ADSC外泌体，所述ADSC外泌体由人腹部脂肪组织提取的细胞经传 代培养，提取其分泌的外泌体得到。

一种ADSC外泌体的制备方法，按照如下步骤进行：

(1)原代细胞培养：人腹部脂肪组织提取，将原代细胞用无血清培养基对 细胞悬液进行培养扩增；

(2)原代细胞纯化及扩大培养：将扩增融合到80％-90％的源代脂肪间充 质干细胞进行消化、传代至3代，并鉴定细胞纯度为95％以上，作为种子细胞；

(3)脂肪间充质干细胞工作细胞库的建立：将步骤(2)中的种子细胞计 数并无血清培养基悬浮，待培养瓶中细胞融合到80％-90％，将细胞进行消化、 传代至3-6代；

(4)提取步骤(3)所获细胞的外泌体，加入生理盐水或者微载体定容， 制成ADSC外泌体制剂。

所述无血清培养基是由DMEM/F12、L-谷氨酰胺、细胞因子组成，无任何 动物源血清成分。

步骤(1)所述原代细胞的来源为人腹部脂肪组织，然后消化酶将组织消化 离心获得原代脂肪间充质干细胞悬液。

步骤(4)的ADSC外泌体制剂的提取方法包括以下步骤：

(a)将步骤(3)悬液超高速离心，转速20,000g，4℃，60min；

(b)将上清液过滤后转入另外6只PP管内，最后0.5mL弃去；

(c)重新配重，转速100,000g离心，4℃，70min；

(d)将无外泌体培养基收集作为阴性对照，各管最后余1mL，吹打重悬 后移入到PP管内，再用PBS洗涤各管两次，吹打重悬后转入PP管内；

(e)转速100,000g离心，4℃，70min；

(f)用注射器吸去上清，弃掉，底部可见白色环形片状物；

(g)重悬：PBS 100uL重悬沉淀，吹打混匀，再用20uL洗管底，制成。

步骤(4)中，所述微载体包括脂质体、微胶囊或微球载体。

上述ADSC外泌体在促进皮肤再生方面的应用。

上述ADSC外泌体在治疗脱发中的应用，所述ADSC外泌体作为外涂抹液， 涂抹脱发处。

上述ADSC外泌体在治疗脱发中的应用，述ADSC外泌体植入患者体内。

所述植入方法为定点注射。

本发明的有益效果：本发明通过实验证实人源充质干细胞外泌体能显著的 促进毛囊的生成，从而促进毛发的再生。采用ADSC外泌体制备成外涂抹液或 注射液，治疗脱发患者，治疗方法温和，容易被患者接受，是一种治标又治本 的治疗脱发的方法。

附图说明

图1-3为ADSC-EXO促进伤口愈合速率；

图1为生理盐水Control组、康复新液(KFXY)阳性组、ADSC-EXO处 理组分组以及各项实验的时间安排；图2为Control组、KFXY组、ADSC-EXO 组对皮肤伤口愈合的促进效果；图3为Control组、KFXY组、ADSC-EXO组 皮肤伤口愈合速率。

图4为伤口愈合的第14天PCNA的表达。

图5为皮下新生血管。

图6为伤口愈合的第14天Cav-1的表达。

图7-10为ADSC-EXO对毛发生长的影响；

图7为伤口部位0、3、7、14、21天毛发生长状态；图8为第14天伤口部 位的HE染色结果；图9为第21天伤口部位的HE染色结果；图10为第21天 毛囊数量的量化图。

图11为小鼠皮肤组织中β-catenin的表达。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技 术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调 整和改进，这些都属于本发明的保护范围。

实施例1脂肪间充质干细胞外泌体促进伤口愈合速率

1、实验分组

对照组：生理盐水；阳性组：创伤药(康复新液)；处理组：人脂肪间充质干 细胞外泌体。

组别	对照组	阳性组	处理组
				数量(只)	30	30	30

2、皮肤全层皮肤损伤模型的建立方法

(1)称重，腹腔注射水合氯醛350mg/kg，使小鼠麻醉；

(2)小鼠背部毛发用剪毛剪去掉，露出裸露皮肤；

(3)在背部剪一个直径为1cm的圆形缺口损伤至皮肤真皮部位；

(4)手术后的小鼠皮下注射0.5ml糖生理盐水补充能量；

(5)将术后的小鼠置于取暖灯下保温。

3、小鼠伤口愈合面积的测量

用塑料透明软膜轻贴于伤口处，用马克笔画出伤口部位，用1cm(100格) 计算当前的伤口面积。在0、3、7、14、21天拍照记录伤口愈合状态以及皮下 血管生成情况。

按照下列公示计算伤口愈合速率：

伤口愈合速率(％)＝(原伤口面积-现在伤口面积)/原伤口面积*100

结果如图1-3所示：ADSC-EXO组皮肤伤口愈合效果更佳，瘢痕组织较少，且愈 合速率较快。

实施例2小鼠损伤部位皮肤中PCNA的表达

1、小鼠损伤部位皮肤总蛋白的提取

分别提取在3、7、14、21天以断颈法将小鼠处死，常规无菌解剖，将皮 肤分离出来，并提取皮肤总蛋白。具体方法如下：

(1)准备工作：制冰(打开制冰机ON键)；清洗研钵和研杵并在烘箱中 烘干；准备1.5mL EP管；从-20℃取出RIPA、BSA5mg/mL和4×loading buffer， 并放入4℃中解冻；

(2)将研钵和研杵放在冰盒中预冷，称量小鼠皮肤重量，放入预冷研钵中， 剪碎，加入RIPA1mL研磨碎，收集组织液至EP管中，并放在冰盒中预冷，防 止高温蛋白质降解；

(3)每隔20min漩涡震荡一次，共计2h，在此期间，提前30min预冷4℃ 离心机；

(4)4℃，10000g，离心10min；

(5)分别将每管上清液吸出移至3个上清管中；

(6)每管分别取1μL移至3个稀释管中，编号1、2、3，取各1mL上清 液；A，B，C三管分别加入49μL，99μL，199μLPBS,分别稀释成50，100， 200倍；

(7)将标准蛋白5mg/mL稀释成1mg/mL至BSA管中。取40μL5mg/mL BSA+160μL PBS，并混匀；

(8)将7个浓度梯度BSA，分别编号1-7，1-2号试管分别加入50μL 1mg/mL BSA,2-7号管分别加50μLPBS,2号管加入后，枪头吹打均匀，并吸取50μL混 合液加入到3号管，混匀；再吸取50μL混合液至4号管......直到加入6号管为 止；

(9)将BSA和待测蛋白加到96孔板中，如表2.1所示；

表2.1标准蛋白和待测蛋白样加入96孔板顺序

(10)各孔先加200μL考马斯亮蓝G-250，再将以上各溶液每孔加20μL； 酶标仪提前预热30min，96孔板，492nm处测定吸光值。

2、考马斯亮蓝法检测蛋白含量

(1)提取蛋白质

皮肤称重，然后用眼科剪剪成碎块，按3mL/g加入RIPA裂解液，在冰浴中 研磨，待成匀浆液后移入1.5mL离心管中，继续冰浴直至蛋白质充分裂解。大 约40分钟后，放入离心机，4℃，10000转/分钟，离心10分钟。选取上清液 移入1.5mL离心管中，-20℃备用。

(2)蛋白定量

Bradford法蛋白定量：考马斯亮蓝G-250于游离状态下呈现红色，最大吸 收波长为488nm；当其与蛋白质结合后即为青色，形成蛋白质-色素结合物，此 复合物最大吸收波长为595nm。因其吸光值与蛋白质含量成正比，故可用作蛋 白定量。

首先，以1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)制作标准曲线，见表2.2。

表2.2 BSA标准曲线

其次，将上述不同浓度的标准溶液按照40μL/孔依次加入96孔板中。随后， 将稀释好的样品(1：50)上清混匀，按照40μL/孔加入96孔板中，同样设置4个 平行孔。

根据BSA浓度不同，595nm波长处紫外吸光值不同。根据吸光值＝k×样品 浓度+b，求出样品浓度(μg/μL)。设定酶标仪参数(参照表2.3)。

表2.3酶标仪参数设定

按照蛋白质含量100μg/孔，根据蛋白质浓度，计算出容积。加入蛋白质溶 液后，在冰上敷浴，每支样品管中加入4×样品缓冲液、0.01M PBS缓冲液。溶 液充分混匀后在沸水中煮7分钟，而后在冰箱4℃保存待用。

3、蛋白免疫印迹

表2.4配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)溶液

(1)制样

根据不同浓度标准蛋白溶液在595nm波长处的吸光值不同，绘制标准曲 线，计算出待测蛋白浓度与每孔所加样品体积(每孔加入100μg蛋白质)，终 体积为20μL，每个样品管中加入5μL 4×loading buffer，不足部分用1×PBS 缓冲液补足。所有操作均在冰上进行。混匀后沸水浴7min，-20℃储存待用。

(2)制胶

先将胶板洗净，用胶板夹夹好。将蒸馏水加入胶板中，检验是否漏水。待 水不漏后将水倒掉并用滤纸擦净。将梳子插入胶板中，并在其下方1cm处画一 线(分离胶的位置)。配分离胶(配制成分见下表)，迅速混匀并倾斜注射至胶 板内。用少量无水乙醇加至分离胶上约1-2mm，清洗注射器，静止1h待分离 胶凝固。配置浓缩胶(配制成分见表2.5)，将浓缩胶加满并将梳子擦入，静止 1h待浓缩胶凝。

SDS-PAGE配制：

表2.5分离胶和浓缩胶的配制

(3)上样、电泳

将制好的胶放在电泳槽中，夹好夹子，加满running buffer溶液，竖直轻轻 拔掉梳子，用微量加样器加入处理好的蛋白质样液，左侧第一个孔道为Marker 蛋白，依次在各个孔道中加入样品，并做好顺序记录。在电泳槽两侧敷上冰袋 以防止高温降解蛋白活质性。安装电泳槽后，在4℃、220V电压下跑电泳，首 先蛋白质样品在浓缩胶中压缩成一条细带，继续电泳后，直至样品指示剂溴酚 蓝到达玻璃板的下边缘，关毕电源，取下制胶板，用刀片和镊子将两块玻璃板 轻轻撬开，用单面刀片将浓缩胶切断，在分离胶左上方切掉一个斜角用以标记 样品方向。

(4)转膜

首先将PVDF膜放在甲醇中，在4℃的条件下浸泡3min目的是增大膜的通 透性。再将PVDF膜和滤纸一同放入1×transfer buffer中20min，条件同样为 4℃。在半干式转膜仪的石墨板上依次放置4层滤纸、PVDF膜、电泳凝胶、4 层滤纸，在此过程中可适量滴加几滴1×transfer buffer。盖上盖子后接通电源， 在室温条件下冰敷，220V电压下转膜大约50min。转膜结束后，将胶放在考 马斯亮蓝R-250中进行染色，并对PVDF膜进行封闭处理。

(5)封闭

在室温25℃条件下，将PVDF膜放入封闭液blocking buffer中封闭非特异性 结合位点。置于恒温摇床上，50r/min，振荡40min。

(6)结合一抗

根据抗体说明书的有效浓度，用PBST混匀配制一抗，然后将经过封闭处理 的PVDF膜放入一抗自封袋中，4℃过夜孵育。用镊子小心将PVDF膜从自封袋 中取出，放在平底皿中，清洗一抗：25℃条件下，用PBST缓冲液洗去PVDF膜 上未结合的一抗，置于恒温摇床上，75r/min，每次10min，共3次。

(7)结合二抗

根据抗体说明书的有效浓度，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠或抗兔 IgG，37℃条件下置于恒温摇床上，60r/min，结合1h。清洗二抗：室温条件下， 用PBST缓冲液洗去PVDF膜上未结合的二抗，置于恒温摇床上，75rpm，每次 10min，共3次。再用PBS清洗1次，75r/min，洗膜10min。

(8)ECL显色

避光条件下，在平皿中加入ECL试剂盒中等量的A液和B液，混匀。使PVDF 膜上抗体与ECL充分结合。2min后取出PVDF膜，用滤纸吸干，之后将PVDF 膜正面朝上用保鲜膜包上，挤出气泡后粘贴在暗盒左上角。在暗室中用X医学 胶片进行曝光操作，室温下在显影液中浸泡3min，在定影液中浸泡1min。取 出后用自来水冲洗胶片、晾干并观察记录，采用计算机扫描定量仪分析，记录 相应条带的透射光积分光密度(IOD)数值。

结果如图4所示：ADSC-EXO组PCNA的表达明显高于其他组，并具有显著 性差异。说明ADSC-EXO组新生细胞数量多，增殖效果较好。

实施例3小鼠皮肤组织中Caveolin-1的表达

1.免疫印迹方法如实施例2

2、免疫组织化学

①脱蜡、复水，流程如下：二甲苯Ⅰ10min；二甲苯Ⅱ10min；二甲苯+乙 醇10min；无水乙醇5min；无水乙醇5min；95％乙醇5min；95％乙醇5min； 75乙醇5min；50％乙醇5min；PBS洗3次，每次5min；

②滴加3％H₂O₂现用现配，37℃水浴孵育30min，清除内源性过氧化物酶， 若不清除，会使抗原以外的背景染色；PBS洗3次，每次5min；

③柠檬酸缓冲液微波大火加热至沸水，微波小火抗原修复10min，放凉至 室温；PBS洗3次，每次5min；

④滴加0.1％TritonX-100，37℃水浴孵育10min；用PBS洗3次，每次3min；

⑤滴加A液(封闭用正常山羊血清工作液)封闭非特异性结合位点,37℃ 水浴孵育30min，擦干，勿洗；

⑥滴加一抗(PBS稀释)50μL，4℃过夜；

⑦室温条件下复温30min；用PBS清洗3次，每次5min；

⑧滴加B液(生物素标记山羊抗兔/大鼠/小鼠/豚鼠IgG)，37℃水浴孵育 20～30min；PBS洗3次，每次5min；

⑨滴加C液(辣根酶标记链霉卵白素工作液)，37℃水浴孵育10min；PBS 洗3次，每次5min；

⑩DAB室温显色5～20min(因不同材料时间不同)，注意避光并在显微镜 下实时观察以掌握染色程度；纯水洗涤；

苏木精染色15～20min；自来水冲洗，洗去浮色；

1％盐酸酒精分色5～10s；氨水返蓝5～10s；蒸馏水5min；

50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇Ⅰ、95％乙醇、无水乙醇Ⅰ及无水乙醇Ⅱ 梯度脱水；

二甲苯：乙醇(1:1)、二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ透明；

中性树胶封片，显微镜下镜检；

结果如图5-6所示：结果发现，处理组的小鼠皮肤的caveolin-1的表达为 强阳性，相比对照组来说，处理组的新生细胞数量更加多，结果表明ADSC-EXO 促进小鼠皮肤损伤修复与窖蛋白-1介导的增殖信号通路有关。从caveolin-1的 负调控作用来看，caveolin-1在瘢痕皮肤组织中低表达。本实验的结果是 ADSC-EXO组的caveolin-1的表达高于对照组，可以说明处理组的皮肤组织状 态更加接近于正常皮肤而对照组的皮肤组织状态趋近于瘢痕皮肤。

实施例4脂肪间充质干细胞外泌体促进毛囊再生

1.表观观察

2.组织学HE染色

(1)4％多聚甲醛溶液的配制

4g多聚甲醛(EM级)溶于100mLPBS，加入数滴氢氧化钠，水浴锅60℃ 加热(打开瓶盖)使之溶解，冷却至室温，调整PH为7.4。

(2)固定液的配置如表4.1：

表4.1固定液的配置

(3)石蜡切片技术

①取材：

第12天先取6只小广口瓶分别标号1空白组、2阳性对照组①、3阳性对照②、 4处理组①、5处理组②、6处理组③，加入适量的固定液。将3组小鼠分别取一 只脱颈处死，用剪毛剪子剪去多余的毛，手术剪取损伤部位的皮肤，大约取面 积为1平方厘米大小的皮肤组织，细致小心的处理多余的毛发。

②固定：

用大头针将皮肤固定在橡皮胶塞上，防止皮肤打卷。将处理之后的胶塞放 入已经标号的对应的广口瓶中，进行固定，约24h，尽可能保持原有形态。

③冲洗：

洗去渗入组织内部的固定液，以防对以后染色造成干扰。冲洗液为70％的 乙醇，直到组织去掉发黄为止(约1天半)。

④脱水

完全除去组织块的水分，适当的增强组织块的硬度。其步骤如下：70％乙 醇、80％乙醇(35min)、95％乙醇Ⅰ(20min)、95％乙醇Ⅱ(20min)、无水乙醇 (10min)、无水乙醇Ⅱ(10min)

⑤透明

乙醇和石蜡不能混合，需要经透明剂处理。过程如下：1:1无水乙醇与二 甲苯(30min)、二甲苯Ⅰ(30min)、二甲苯Ⅱ(30min)

⑥浸蜡

去除组织中的透明剂，以便石蜡浸入整个组织。浸蜡依次为蜡杯Ⅰ、蜡杯 Ⅱ、蜡杯Ⅲ，时间一般为2-4h。

⑦包埋

把上一步的材料包埋到石蜡中，待石蜡的温度与皮肤温度差不多时即可以 拿出蜡块。

⑧切片

将蜡块经过仔细修理后在切片机上，冠状切片，将其切成4μm的薄片，然 后用毛笔尖轻轻托取蜡带，放在纸上备用。

⑨贴片和烤片

取一滴蛋白甘油滴在干净的载玻片上，用手指肚均匀用力涂抹，再滴几滴 蒸馏水，然后把蜡带放在水上展开，此过程在展片台上进行，温度50℃。待完 全展开后放入恒温箱烘干。

(4)HE染色

脱蜡：①二甲苯Ⅰ脱蜡10min；②二甲苯Ⅱ脱蜡10min；③无水乙醇Ⅰ 洗去二甲苯5min；④无水乙醇Ⅱ洗去二甲苯5min；⑤95％酒精5min；⑥85％ 酒精5min；⑦自来水洗片刻。

染色：①苏木素染色20min左右；②自来水洗片刻；③.1％盐酸水分化3～ 5s；④氨水蓝化片刻；⑤伊红酒精染液浸染20min。

脱水、透明、封固：①85％的酒精脱水5min；②95％的酒精5min；③ 无水乙醇Ⅰ染5min；④无水乙醇Ⅱ染色5min；⑤二甲苯Ⅰ浸10min；⑥二甲 苯Ⅱ浸10min；⑦中性树胶封片

结果如图7-10所示：图7为伤口愈合及毛发生成的表观图，可以观察到 ADSC-EXO组毛发生长数量多密度大。图8，图9为HE染色结果，可以观察 到用ADSC-EXO组伤口愈合的效果更好，表现为新生表皮较厚，细胞层数多 且分明，有上皮角质层的生成，细胞排列紧凑，新生细胞状态较好，更为显著 的是毛囊数较多并且整齐排列相对紧凑。图10图为毛囊数量的量化图，说明 ADC-EXO组毛囊数量多。

实施例5小鼠皮肤组织中β-catenin的表达

免疫印迹方法如实施例2。结果如图11所示：β-catenin信号通路为毛发 生成的经典信号通路，结果表明，ADSC-EXO组β-catenin表达较高，且具有 显著性差异。

综上可见：脂肪间充质干细胞外泌体可以促进创面愈合，并可参与β -catenin信号通路，介导毛发的生成。

Claims (3)

1.ADSC外泌体在制备治疗脱发药物中的应用，其特征在于，所述ADSC外泌体作为外涂抹液，涂抹脱发处；

所述ADSC外泌体的制备方法，按照如下步骤进行：

（1）原代细胞培养：人腹部脂肪组织提取，将原代细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增；

（2）原代细胞纯化及扩大培养：将扩增融合到80%-90%的原代脂肪间充质干细胞进行消化、传代至3代，并鉴定细胞纯度为95%以上，作为种子细胞；

（3）脂肪间充质干细胞工作细胞库的建立：将步骤（2）中的种子细胞计数并无血清培养基悬浮，待培养瓶中细胞融合到80%-90%，将细胞进行消化、传代至3-6代；

（4）提取步骤（3）所获细胞的外泌体，加入生理盐水或者微载体定容，制成ADSC外泌体制剂；

所述无血清培养基是由DMEM/F12、L-谷氨酰胺、细胞因子组成，无任何动物源血清成分；

所述步骤（4）的ADSC外泌体制剂的提取方法包括以下步骤：

（a）将步骤（3）悬液超高速离心，转速20,000g，4℃，60min；

（b）将上清液过滤后转入另外6只PP管内，最后0.5mL弃去；

（c）重新配重，转速100,000g离心，4℃，70min；

（d）将无外泌体培养基收集作为阴性对照，各管最后余1mL，吹打重悬后移入到PP管内，再用PBS洗涤各管两次，吹打重悬后转入PP管内；

（e） 转速100,000g离心，4℃，70min；

（f）用注射器吸去上清，弃掉，底部可见白色环形片状物；

（g）重悬： PBS 100uL重悬沉淀，吹打混匀，再用20uL洗管底，制成。

2.根据权利要求1所述ADSC外泌体在制备治疗脱发药物中的应用，其特征在于，步骤（1）所述原代细胞的来源为人腹部脂肪组织，然后消化酶将组织消化离心获得原代脂肪间充质干细胞悬液。

3.根据权利要求1所述ADSC外泌体在制备治疗脱发药物中的应用，其特征在于，步骤（4）中，所述微载体包括脂质体、微胶囊或微球载体。

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