CN108373996A - 一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用，包括脂肪干细胞分离、外泌体提取和脂肪干细胞外泌体‑纳米胶原蛋白包被；通过脂肪干细胞外泌体‑纳米胶原蛋白进行面部皮肤微雕整容，观察其相比脂肪干细胞自体移植、外泌体注射、或单纯纳米胶原蛋白在皮肤再生性修复和微整容方面的优越性；具体为，本发明通过分离脂肪干细胞，提取其外泌体，然后将纳米胶原蛋白与分离的外泌体融合形成脂肪干细胞外泌体‑纳米胶原蛋白联合制剂，注入新西兰大白兔受损皮肤部位，观察和单纯脂肪干细胞移植组、外泌体组和单纯纳米胶原蛋白相比，脂肪干细胞外泌体‑纳米胶原蛋白对受损皮肤再生的促进效果，同时观察其对身体有无伤害。

Description

一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用
技术领域
本发明涉及美容整形领域，尤其涉及一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用。
背景技术
传统的自体脂肪填充只是将纯化的自体脂肪，注入面部所需部位。但脂肪存活率低，多次手术方见效果。脂肪容易坏死或空洞，导致面部看上去凹凸不平，且越来越多的研究发现真正起治疗效果的不是脂肪干细胞，而是其分泌的外泌体通过对局部组织微环境的调节实现的。“纳米驻颜”突破自体脂肪干细胞提纯技术，被提纯的高浓度自体脂肪干细胞具有高度的再生能力，运用于面部微雕领域。为面部结构不协调、面部凹陷或缺陷、皮肤松弛、皱纹细纹、干瘪消瘦等女性重获圆润饱满的面庞、恢复青春活力，从而真正达到驻颜，其中最为常见的是纳米胶原蛋白。在整形领域，发现纳米胶原蛋白可促进皮肤再生、容易被真皮吸收，进而达到面部微雕、整容的目的。
发明内容
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明提供了一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用，以脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白做为填充材料，用于面部微雕整容，可促进皮肤再生、容易被真皮吸收。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用，包括脂肪干细胞分离、外泌体提取和脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白包被；
所述脂肪干细胞分离包括以下步骤：
S1、取新西兰大白兔腹股沟处的脂肪组织，放入含有青链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液中洗净血污，转入一个新的培养皿中，充分剪碎，加入消化液，移液器充分打匀，直到组织能够通畅的出入吸嘴；
S2、将脂肪组织转入离心管中，37℃消化1h，定时摇晃，使组织和消化液充分混匀，消化完后，反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液，1200rpm离心5min，将上层的脂肪组织反复吹打最少1min，再次离心；弃掉上层成熟的脂肪组织和中层的消化液，再用基础培养基重悬底层的细胞；
S3、先将细胞悬液用250μM的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为80μM的尼龙过滤，除去大部分的成熟脂肪细胞，收集滤液，每次过滤后注意再用适量的基础培养基洗涤滤网，减少滤网上的细胞残留，将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍；
S4、细胞培养，最后一次用完全培养基重悬，接种，置于培养箱中常规培养，首次换液，弃去培养基，PBS反复洗涤5～6次，加入新鲜的完全培养基继续培养，重复3次换液直到细胞面基本干净。
进一步，所述外泌体提取包括以下步骤：
1)准备冰盒，离心管，超速离心管，tip；
2)将上清吸出至15ml试管；(谁的上清)
3)500g，5min离心；
4)将离心后上清移至新的试管内；
5)2000g，20min离心；
6)将离心后上清移至超速离心管，配平，<0.1g；
7)超速离心10000g，30min；
8)将离心后上清移至新的超速离心管(直接倒出)，配平；
9)超速离心100000g，70min；
10)弃净上清，只留ev沉淀(肉眼无法看出))；
11)冰filter PBS 60-80μl resuspend EV palet，使用tip来回转圈吹打60次，vortex后，并继续吹打10次后收样；
12)收样：RNA：10μl ev+300μl Trizol；蛋白：40μl ev+40μl lysate；Nanosight检测：10μl+990Filter PBS。
进一步，所述脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白包被包括以下步骤：利用CaCl2预处理外泌体，打开外泌体中的双层膜结构，将纳米胶原蛋白与外泌体混合电转构建脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白。
进一步，所述步骤S1中的消化液，以质量百分比计包括10％胎牛血清，0.09％胶原酶I，其余为DMEM/F12。
本发明的有益效果为：本发明通过脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白进行面部皮肤微雕整容，观察其相比脂肪干细胞自体移植、外泌体注射、或单纯纳米胶原蛋白在皮肤再生性修复和微整容方面的优越性。具体为，本发明通过分离脂肪干细胞，提取其外泌体，然后将纳米胶原蛋白与分离的外泌体融合形成脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白联合制剂，注入新西兰大白兔受损皮肤部位，观察和单纯脂肪干细胞移植组、外泌体组和单纯纳米胶原蛋白相比，脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白对受损皮肤再生的促进效果，同时观察其对身体有无伤害。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：包括脂肪干细胞分离、外泌体提取和脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白包被；
所述脂肪干细胞分离包括以下步骤：
S1、取新西兰大白兔腹股沟处的脂肪组织，放入含有青链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液中洗净血污，转入一个新的培养皿中，充分剪碎，加入消化液，移液器充分打匀，直到组织能够通畅的出入吸嘴；
其中，消化液以质量百分比计包括10％胎牛血清，0.09％胶原酶I，其余为DMEM/F12。
S2、将脂肪组织转入离心管中，37℃消化1h，定时摇晃，使组织和消化液充分混匀，消化完后，反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液，1200rpm离心5min，将上层的脂肪组织反复吹打最少1min，再次离心；弃掉上层成熟的脂肪组织和中层的消化液，再用基础培养基重悬底层的细胞；
S3、先将细胞悬液用250μM的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为80μM的尼龙过滤，除去大部分的成熟脂肪细胞，收集滤液，每次过滤后注意再用适量的基础培养基洗涤滤网，减少滤网上的细胞残留，将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍；
S4、细胞培养，最后一次用完全培养基重悬，接种，置于培养箱中常规培养，首次换液，弃去培养基，PBS反复洗涤5～6次，加入新鲜的完全培养基继续培养，重复3次换液直到细胞面基本干净。
所述外泌体提取包括以下步骤：
1)准备冰盒，离心管，超速离心管，tip；
2)将上清吸出至15ml试管；
3)500g，5min离心；
4)将离心后上清移至新的试管内(直接倒出)；
5)2000g，20min离心；
6)将离心后上清移至超速离心管(直接倒出)，配平，<0.1g；
7)超速离心10000g，30min；
8)将离心后上清移至新的超速离心管(直接倒出)，配平；
9)超速离心100000g，70min；
10)弃净上清，只留ev沉淀(肉眼无法看出))；
11)冰filter PBS 60-80μl resuspend EV palet，使用tip来回转圈吹打60次(外泌体很难溶解)，vortex后，并继续吹打10次后收样(收样管需要提前以filter PBS清洗，干燥)；
12)收样：RNA：10μl ev+300μl Trizol；蛋白：40μl ev+40μl lysate(蛋白裂解液)；Nanosight检测：10μl+990Filter PBS(tube需要提前用filter PBS清洗)
脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白包被：利用CaCl2预处理外泌体，打开外泌体中的双层膜结构，将纳米胶原蛋白与外泌体混合电转构建脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白。
移植治疗：构建新西兰大白兔皮肤损伤模型，利用锉刀挫伤兔子背部皮肤，脂肪干细胞、外泌体、纳米胶原蛋白、外泌体-纳米胶原蛋白分别进行局部注射，分3天、7天、2周、1月、2月分别观察皮肤伤口愈合情况。
请给出3天、7天、2周、1月、2月皮肤伤口愈合数据。
实施例一
一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：包括脂肪干细胞分离、外泌体提取和脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白包被；
所述脂肪干细胞分离包括以下步骤：
S1、取新西兰大白兔腹股沟处的脂肪组织，放入含有青链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液中洗净血污，转入一个新的培养皿中，充分剪碎，加入消化液，移液器充分打匀，直到组织能够通畅的出入吸嘴；
其中，消化液以质量百分比计包括10％胎牛血清，0.09％胶原酶I，其余为DMEM/F12。
S2、将脂肪组织转入离心管中，37℃消化1h，定时摇晃，使组织和消化液充分混匀，消化完后，反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液，1200rpm离心5min，将上层的脂肪组织反复吹打最少1min，再次离心；弃掉上层成熟的脂肪组织和中层的消化液，再用基础培养基重悬底层的细胞；
S3、先将细胞悬液用250μM的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为80μM的尼龙过滤，除去大部分的成熟脂肪细胞，收集滤液，每次过滤后注意再用适量的基础培养基洗涤滤网，减少滤网上的细胞残留，将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍；
S4、细胞培养，最后一次用完全培养基重悬，接种，置于培养箱中常规培养，首次换液，弃去培养基，PBS反复洗涤5～6次，加入新鲜的完全培养基继续培养，重复3次换液直到细胞面基本干净。
所述外泌体提取包括以下步骤：
1)准备冰盒，离心管，超速离心管，tip；
2)将上清吸出至15ml试管；
3)500g，5min离心；
4)将离心后上清移至新的试管内(直接倒出)；
5)2000g，20min离心；
6)将离心后上清移至超速离心管(直接倒出)，配平，<0.1g；
7)超速离心10000g，30min；
8)将离心后上清移至新的超速离心管(直接倒出)，配平；
9)超速离心100000g，70min；
10)弃净上清，只留ev沉淀(肉眼无法看出))；
11)冰filter PBS 60-80μl resuspend EV palet，使用tip来回转圈吹打60次(外泌体很难溶解)，vortex后，并继续吹打10次后收样(收样管需要提前以filter PBS清洗，干燥)；
12)收样：RNA：10μl ev+300μl Trizol；蛋白：40μl ev+40μl lysate(蛋白裂解液)；Nanosight检测：10μl+990Filter PBS(tube需要提前用filter PBS清洗)
脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白包被：利用CaCl2预处理外泌体，打开外泌体中的双层膜结构，将纳米胶原蛋白与外泌体混合电转构建脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白。
移植治疗：构建新西兰大白兔皮肤损伤模型，利用锉刀挫伤兔子背部皮肤，脂肪干细胞、外泌体、纳米胶原蛋白、外泌体-纳米胶原蛋白分别进行局部注射，观察1周皮肤伤口愈合的情况。
实验结果：
植入1周后，脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白移植治疗组受损皮肤恢复良好，2周后皮肤处无可见疤痕，皮肤周围未发现有红肿及渗出等炎症反应。组化检测发现移植部位血管新生明显，且有胶原蛋白沉积，皮肤光滑而有弹性。
对照实验：
构建新西兰大白兔皮肤损伤模型，利用锉刀挫伤兔子背部皮肤，利用生理盐水进行局部注射，观察1周皮肤伤口愈合的情况。
对照实验结果：
脂肪干细胞和外泌体移植治疗组移植3周后伤口才完全愈合，而纳米胶原蛋白移植组对伤口愈合促进作用不明显。免疫组化检测发现，脂肪干细胞和外泌体移植部位血管新生明显，但胶原沉积不足，皮肤弹性欠佳；纳米胶原蛋白移植组血管新生没有前面几组好，虽然有胶原沉积。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：包括脂肪干细胞分离、外泌体提取和脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白包被；
所述脂肪干细胞分离包括以下步骤：
S1、取新西兰大白兔腹股沟处的脂肪组织，放入含有青链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液中洗净血污，转入一个新的培养皿中，充分剪碎，加入消化液，移液器充分打匀，直到组织能够通畅的出入吸嘴；
S2、将脂肪组织转入离心管中，37℃消化1h，定时摇晃，使组织和消化液充分混匀，消化完后，反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液，1200rpm离心5min，将上层的脂肪组织反复吹打最少1min，再次离心；弃掉上层成熟的脂肪组织和中层的消化液，再用基础培养基重悬底层的细胞；
S3、先将细胞悬液用250μM的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为80μM的尼龙过滤，除去大部分的成熟脂肪细胞，收集滤液，每次过滤后注意再用适量的基础培养基洗涤滤网，减少滤网上的细胞残留，将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍；
S4、细胞培养，最后一次用完全培养基重悬，接种，置于培养箱中常规培养，首次换液，弃去培养基，PBS反复洗涤5～6次，加入新鲜的完全培养基继续培养，重复3次换液直到细胞面基本干净。
2.根据权利要求1所述的一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用，其特征在于，所述外泌体提取包括以下步骤：
1)准备冰盒，离心管，超速离心管，tip；
2)将离心得到的上清吸出至15ml试管；
3)500g，5min离心；
4)将离心后上清移至新的试管内；
5)2000g，20min离心；
6)将离心后上清移至超速离心管，配平，<0.1g；
7)超速离心10000g，30min；
8)将离心后上清移至新的超速离心管(直接倒出)，配平；
9)超速离心100000g，70min；
10)弃净上清，只留ev沉淀(肉眼无法看出))；
11)冰filter PBS 60-80μl resuspend EV palet，使用tip来回转圈吹打60次，vortex后，并继续吹打10次后收样；
12)收样：RNA：10μl ev+300μl Trizol；蛋白：40μl ev+40μl lysate；Nanosight检测：10μl+990 Filter PBS。
3.根据权利要求1所述的一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用，其特征在于，所述脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白包被包括以下步骤：利用CaCl2预处理外泌体，打开外泌体中的双层膜结构，将纳米胶原蛋白与外泌体混合电转构建脂肪干细胞外泌体-纳米胶原蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种在面部年轻化中脂肪干细胞外泌体的制备和应用，其特征在于：所述步骤S1中的消化液，以体积比计包括10％胎牛血清，0.09％胶原酶I，其余为DMEM/F12。
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