CN108969466A - 一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜及其制备方法，其制备步骤包括，1)选取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4℃环境下36小时内冷藏后提取脐带组织间充质干细胞进行培养；2)选取截留量为3500D的透析袋在透析袋置内对培养的脐带间充质干细胞进行透析处理，后利用透析脱水剂进行脱水处理；3)经过透析处理的脐带间充质干细胞预冻后通过冻干机制备成冻干粉；4)用适量的透明质酸和面膜液溶解冻干粉形成驻颜面膜，其利用新生胎儿脐带组织进行干细胞培养，提取高能度复合细胞生长因子，采用先进的冷冻干燥技术制备成冻干粉，结合保湿锁水的透明质酸和甘油作用于皮肤，优化肌肤质量，抵抗肌肤衰老，达到美容养颜的作用。

Description

一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜及其制 备方法

技术领域

本发明涉及一种面膜领域，具体为一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜及其制备方法。

背景技术

在人体内，干细胞是一类保持未分化状态、具有高度自我更新和多项分化潜能的细胞，是机体所有功能细胞的祖宗细胞，在人体的发育及发育成熟后组织器官的维护中起重要作用。干细胞除了能分化为组织细胞修复组织损伤外，还有一个更重要的再生医学功能就是旁分泌细胞因子进行组织修复，如分泌神经细胞营养因子、促血管新生因子、造血支持因子、免疫调节因子、抗凋亡因子和趋化因子等。在干细胞传代过程中分泌的面部修复促进细胞再生的鲜活因子主要为BFGF碱性成纤维细胞生长因子、EGF表皮细胞生长因子和AFGF酸性成纤维细胞生长因子。

BFGF碱性成纤维细胞生长因子可改善细胞生长的微环境；1.可促进弹性纤维和胶原蛋白的合成；2.能够促进成纤维细胞的生长发育，以新的细胞取代老化细胞；3.更新衰老细胞；4.能迅速修复受损细胞；5.刺激皮肤肉芽组织的形成和促进肉芽组织的上皮化，还可调节胶原降解及更新。

EGF表皮细胞生长因子能促进表皮细胞组织内多种细胞的生长分裂，使表皮细胞变得饱满，还可促使胶原蛋白生长能力，修复老化断裂的胶原弹性纤维，年龄越小，肌肤中EGF含量越高，肌肤更新速度就越快，这样肌肤就娇嫩，随着年龄的增大，肌肤中EGF的含量逐步下降，这样肌肤就老化、粗糙、沉淀色斑，因此EGF的含量决定了皮肤是否娇嫩。

AFGF酸性成纤维细胞生长因子是一种多功能强力细胞因子，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥着重要功能，可增进细胞分裂与繁殖，快速高效地修复创伤，通过皮肤更新，促进表皮弹性，补充皮肤营养三个途径起到防止和祛除皱的效果，并通过促进新细胞的生成来替代原来细胞，以降低皮肤中黑色素和有色细胞含量等。

干细胞根据所处的发育阶段不同，干细胞可以分为胚胎干细胞，胎体干细胞、围产期干细胞以及成体干细胞，早期未分化的胚胎细胞为胚胎干细胞，胎儿组织中的干细胞为胎体干细胞，胎儿发育伴随的胎盘脐带组织中的干细胞为围产期干细胞。围产期组织被认为是干细胞的天然宝库，所含的干细胞种类较多，脐带间充质干细胞是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞，因此采用脐带组织干细胞为实验材料，提取脐带组织中的间充质干细胞进行培养，再采用德国先进的冷冻干燥技术将其制备成冻干粉，结合保湿锁水的透明质酸和甘油直接作用于皮肤激活细胞功能，以便于解决人们的肌肤问题。

发明内容

本发明的目的在于提供基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜制备和使用方法，通过以新生胎儿剥离的脐带组织作为干细胞培养源，进行脐带间充质干细胞培养，并采用先进的冷冻干燥技术将其冷却成冻干粉，并伴随保湿锁水的透明质酸和甘油直接作用于皮肤激活细胞功能，以帮助人们优化肌肤质量，修复皮肤屏障、祛斑、淡化痘印和晒后修复，以抵抗肌肤衰老，其还可应用在医学领域，以便于创面修复和皱纹修复等，帮助人们修复肌肤屏障。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜制备和使用方法，其制备步骤包括，

1)选取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4℃环境下36小时内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养；

2)选取截留量为3500D的透析袋在透析袋置内对培养的脐带间充质干细胞进行透析处理，后利用透析脱水剂进行脱水处理；

3)经过透析处理的脐带间充质干细胞预冻后通过冻干机制备成冻干粉；

4)用适量的透明质酸和面膜液溶解冻干粉形成驻颜面膜。

进一步而言，所述步骤1)中的干细胞培养步骤为：

(1)实验操作人员取出脐带组织放入预冷的组织清洗液中清洗两次，并取少许运输液做无菌检测；

(2)清洗后的脐带组织剪成4-5cm的小段，清洗一次；在清洗液中剥离脐带组织中的血管和表皮；华通氏胶撕成小块，清洗后于50ml离心管中剪碎；

(3)组织碎块转移至125ml储液瓶中，加入1-2倍体积的组织消化液，于37℃振荡培养箱中消化1.5-2小时，直至无成形组织块；

(4)消化结束后加入20-30ml 0.05％的胰酶继续消化10分钟，即完成组织消化；消化后细胞悬液中加入50-60mlDMEM培养基，混匀后静置2分钟以便于未消化的组织块沉降；

(5)细胞悬液过100um筛网去除未消化的组织块；细胞悬液离心(2000r*10min)后去除上清液；加入30mlDMEM培养基清洗一次，离心(2000r*5min)后去上清；

(6)沉淀可以直接接种或冻存，接种密度由组织量决定，约10ml组织接种一个15cmBD培养皿，约5-6ml组织接种一个T75培养瓶；

(7)接种的细胞放入培养箱中静置培养三天，三天后全量换液去除杂物，之后每3天半量或全量换液，细胞长至80％-90％时传代；

(8)按照1:4传代，细胞生长三天长到90％左右，传第二代，以此类推，传到第三代，收集培养基上清备用。

进一步而言，所述步骤2)中的透析袋长度为10-20cm，新透析袋用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用，使用后的透析袋洗净后需存于4℃蒸馏水中，若长时间不用则需加入少量NaN2，洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，不漏时方可重复使用。

进一步而言，所述步骤2)中的透析袋置在1mmol/LEDTA(PH＝8)中煮沸10min，且透析脱水剂选用PEG6000。

进一步而言，所述干细胞培养的清洗液选用0.9％的生理盐水，所述培养基含有酚红。

进一步而言，所述步骤3)中的面膜液主要成分是甘油和无菌水，按照1:9比例混合，总体积10ml，且所用的透明质酸每瓶2ml。

本发明又提出一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜制备方法制备的驻颜面膜。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：该发明通过提取新生胎儿的脐带组织的脐带间充质干细胞进行培养，提取干细胞分泌的高能度复合细胞生长因子，并采用德国先进的冷冻干燥技术制备成冻干粉，并结合保湿锁水的透明质酸和甘油使得冻干粉溶解，直接作用于皮肤，已达到激活细胞功能，方便对肌肤进行修复，其修复效果好，使用方便，可快速对受损肌肤进行修复，达到抵抗肌肤衰老，修复肌肤屏障的目的，达到美容养颜，逆转时光，挽留青春的作用，

1.该驻颜面膜结合保湿锁水的透明质酸和甘油，直接作用于皮肤，可帮助已经受损的肌肤细胞被激活，快速修复受损肌肤，使得受损肌肤细胞更新速度加快，促进弹性纤维和胶原蛋白的合成，使得肌肤富有弹性，更加娇嫩；

2.该驻颜面膜的制备过程和制备环境安全无菌，且在制备过程中无其他添加剂成分，可保证面膜成分安全可靠，可用于肌肤敏感和受损肌肤的人群；

3.采用德国先进的的冷冻干燥技术制备成冻干粉，可有效保证干细胞分泌的高能度复合细胞生长因子的活性，冻干粉使用方便，且可有效保证皮肤修复的功效；

4.PEG6000作为吸水剂在水中溶解性很大，而透析袋的最大截留量为3500D，是半透膜，而PEG6000无法透过半透膜，只有水分子和盐无机小分子等能透过半透膜，可有效减少样品的水分和无机小分子，提高样品纯度；

5.培养基中含有酚红，酚红可作为透析平衡的指示剂，随着培养基上清中颜色的变化，可便于透析情况观测，有效控制样品的纯度；

6.干细胞培养的清洗液选用0.9％的生理盐水，由于生理盐水的渗透压和PH值跟细胞培养基上清几乎相同，而且0.9％的生理盐水与人的渗透压相同，且只有Na离子和Cl离子对身体无任何危害，提高该面膜的安全性。

附图说明

图1为本发明第三代细胞结构示意图。

图2为本发明清洗液清洗示意图。

图3为本发明透析脱水剂使用示意图。

图4为本发明驻颜面膜组合示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的描述。

实施例

如图1-4所示，基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜制备和使用方法，其制备步骤包括，选取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4℃环境下36小时内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养；选取截留量为3500D的透析袋在透析袋置内对培养的脐带间充质干细胞进行透析处理，后利用透析脱水剂进行脱水处理；经过透析处理的脐带间充质干细胞预冻后通过冻干机制备成冻干粉；用适量的透明质酸和面膜液溶解冻干粉形成驻颜面膜。

该发明所述的干细胞培养步骤为：首先实验操作人员取出脐带组织放入预冷的组织清洗液中清洗两次，并取少许运输液做无菌检测；清洗后的脐带组织剪成4-5cm的小段，清洗一次；在清洗液中剥离脐带组织中的血管和表皮；华通氏胶撕成小块，清洗后于50ml离心管中剪碎；将组织碎块转移至125ml储液瓶中，加入1-2倍体积的组织消化液，于37℃振荡培养箱中消化1.5-2小时，直至无成形组织块；在消化结束后加入20-30ml 0.05％的胰酶继续消化10分钟，即完成组织消化；消化后细胞悬液中加入50-60mlDMEM培养基，混匀后静置2分钟以便于未消化的组织块沉降；细胞悬液过100um筛网去除未消化的组织块；细胞悬液离心(2000r*10min)后去除上清液；加入30mlDMEM培养基清洗一次，离心(2000r*5min)后去上清；沉淀可以直接接种或冻存，接种密度由组织量决定，约10ml组织接种一个15cmBD培养皿，约5-6ml组织接种一个T75培养瓶；接种的细胞放入培养箱中静置培养三天，三天后全量换液去除杂物，之后每3天半量或全量换液，细胞长至80％-90％时传代；按照1:4传代，细胞生长三天长到90％左右，传第二代，以此类推，传到第三代，收集培养基上清备用；

所述透析袋长度为10-20cm，新透析袋用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用，使用后的透析袋洗净后需存于4℃蒸馏水中，若长时间不使用透析袋则需在其中加入少量NaN2，洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，不漏时方可重复使用，可保证该驻颜面膜的制备过程和制备环境安全无菌，且在制备过程中无其他添加剂成分，可保证面膜成分安全可靠，可用于肌肤敏感和受损肌肤的人群；

所述透析袋置在1mmol/LEDTA(PH＝8)中煮沸10min，且透析脱水剂选用PEG6000，PEG6000作为吸水剂在水中溶解性很大，而透析袋的最大截留量为3500D，是半透膜，而PEG6000无法透过半透膜，只有水分子和盐无机小分子等能透过半透膜，可有效减少样品的水分和无机小分子，从而提高样品纯度；

所述干细胞培养的清洗液选用0.9％的生理盐水，所述培养基含有酚红，由于生理盐水的渗透压和PH值跟细胞培养基上清几乎相同，而且0.9％的生理盐水与人的渗透压相同，且只有Na离子和cl离子对身体无任何危害，提高该面膜的安全性，酚红可以作为透析平衡的指示剂，随着培养基上清中颜色的变化，可以说明盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质的变化情况，可便于透析情况观测，有效控制样品的纯度。

所述面膜液主要成分是甘油和无菌水，按照1:9比例混合，总体积10ml，且所用的透明质酸每瓶2ml，透明质酸和甘油具有保湿锁水的功效，直接用于皮肤上，保证皮肤高度补水，提高肌肤水分，帮助冻干粉快速溶解且激活受损肌肤细胞；

所述该面膜的使用方法为将面膜液与透明质酸混合后加入细胞因子中，使冻干粉溶解，并使液体充分混匀后加入面膜盒中，将压缩面膜粒放入面膜盒中将液体充分吸收，展开面膜纸贴在面部15-20分钟，且需坚持每周使用2-3贴，通过规范的使用周期和使用量，可帮助受损肌肤快速修复，加快细胞的更新和再生，使得受损肌肤在使用后有显著的变化。

本实施例还做过以下对比实验：

本实施例提供的面膜为实验例，以市场上的一叶子补水修复面膜为参照，随机选取100位群众(年龄段为25～45岁)，随机将这100位群众分成两组，让这50位群众使用本实施例提供的驻颜面膜，另外50位使用一叶子补水修复面膜，每周二、周五晚上9:00使用，保持正常作息，持续四周，实验结果如表1：

表1：

本实施例对比试验的部分使用对比情况进行观察，可明显观测到使用本实施例提供的驻颜面膜四周后，皮肤嫩白饱满且光滑，眼下的皱纹、法令纹以及痘印较之使用前明显变淡，肌肤富有弹性，更加娇嫩。

该驻颜面膜的成分来源安全可靠，且经过冷冻干燥的冻干粉活性极高，该面膜具有的细胞生长因子可快速有效的帮助肌肤细胞生长，提高肌肤新陈代谢速度，可快速恢复肌肤弹性和娇嫩，制备过程安全无菌，成分温和，无其他添加成分，使得面膜成分安全可靠，适用于敏感肌肤或具有其他受损肌肤问题的人群。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜制备方法，其特征在于：其制备步骤包括，

1)选取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4℃环境下36小时内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养；

2)选取截留量为3500D的透析袋在透析袋置内对培养的脐带间充质干细胞进行透析处理，后利用透析脱水剂进行脱水处理；

3)经过透析处理的脐带间充质干细胞预冻后通过冻干机制备成冻干粉；

4)用透明质酸和面膜液溶解冻干粉形成驻颜面膜。

2.根据权利要求1所述的一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的干细胞培养步骤为：

(1)实验操作人员取出脐带组织放入预冷的组织清洗液中清洗两次，并取少许运输液做无菌检测；

(2)清洗后的脐带组织剪成4-5cm的小段，清洗一次；在清洗液中剥离脐带组织中的血管和表皮；华通氏胶撕成小块，清洗后于50ml离心管中剪碎；

(3)组织碎块转移至125ml储液瓶中，加入1-2倍体积的组织消化液，于37℃振荡培养箱中消化1.5-2小时，直至无成形组织块；

(4)消化结束后加入20-30ml 0.05％的胰酶继续消化10分钟，即完成组织消化；消化后细胞悬液中加入50-60mlDMEM培养基，混匀后静置2分钟以便于未消化的组织块沉降；

(5)细胞悬液过100um筛网去除未消化的组织块；细胞悬液离心(2000r*10min)后去除上清液；加入30mlDMEM培养基清洗一次，离心(2000r*5min)后去上清；

(6)沉淀可以直接接种或冻存，接种密度由组织量决定，约10ml组织接种一个15cmBD培养皿，约5-6ml组织接种一个T75培养瓶；

(7)接种的细胞放入培养箱中静置培养三天，三天后全量换液去除杂物，之后每3天半量或全量换液，细胞长至80％-90％时传代；

(8)按照1:4传代，细胞生长三天长到90％左右，传第二代，以此类推，传到第三代，收集培养基上清备用。

3.根据权利要求1所述的一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的透析袋长度为10-20cm，新透析袋用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用，使用后的透析袋洗净后需存于4℃蒸馏水中，若长时间不用则需加入少量NaN2，洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，不漏时方可重复使用。

4.根据权利要求1所述的一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的透析袋置在1mmol/LEDTA(PH＝8)中煮沸10min，且透析脱水剂选用PEG6000。

5.根据权利要求1和2所述的一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜制备方法，其特征在于：所述干细胞培养的清洗液选用0.9％的生理盐水，所述培养基含有酚红。

6.根据权利要求1所述的一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜制备方法，其特征在于：所述步骤3)中的面膜液主要成分是甘油和无菌水，按照1:9比例混合，总体积10ml，且所用的透明质酸每瓶2ml。

7.如权利要求1至所述的一种基于脐带间充质干细胞分泌活性因子的驻颜面膜制备方法制备的驻颜面膜。