CN111374934A - 脂质体包裹人干细胞因子的制备及皮肤损伤修复检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂质体包裹人干细胞因子的制备及皮肤损伤修复检测方法，其中，脂质体包裹人干细胞因子的制备方法包括：制备间充质干细胞培养上清液的步骤；制备空白脂质体悬液的步骤；在2‑8℃的无菌条件下于空白脂质体悬液加入质量比为10％的间充质干细胞培养液以制备得到含间充质脂质体干细胞的脂质体混悬液的步骤；以及，测定脂质体混悬液的性能的步骤。通过上述制备方法，提高了干细胞的稳定性，且便于保存运输，且可以更加方便地将间充质干细胞培养液应用到美容领域中。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种脂质体包裹人干细胞因子的制备及皮肤损伤修复检测方法。
背景技术
皮肤从外层起包含表皮、真皮、皮下组织，具有通过其屏障功能保护生物体不受外界刺激的影响，皮肤的表皮和真皮由表皮细胞、成纤维细胞、真皮细胞外基质等构成，其中成纤维细胞是皮肤真皮层中最重要的细胞，在皮肤生物学中起着重要作用，如伤口愈合、疤痕和防止光老化。通常情况下皮肤会由于干燥、紫外线等外因和年龄增加、压力等内因引起皮肤的粗糙、老化以及各种皮肤炎症，其中长期的紫外线照射是外界环境中引起皮肤衰老的最主要的外因，这种现象又称为皮肤光老化。
紫外线包括三个波段：长波紫外线(UVA，320-400nm)、中波紫外线(UVB，280-320nm)和短波紫外线(UVC，200-280nm)，UVA和UVB可以穿过大气层到达地面，因此对人体产生影响的主要是UVA和UVB。UVA能造成皮肤真皮层成纤维细胞合成胶原的功能下调，导致胶原分泌减少，同时UVA能够产生超氧阴离子、羟自由基等氧自由基，这些氧自由基能攻击处于液态的细胞，造成细胞严重损伤，加速皮肤光老化进程。
干细胞是这个世纪以来的研究热点，研究的领域在不断地拓宽和深入，间充质干细胞是一类具有自我复制、体外可大量扩增和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，其分泌的因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和肝细胞生长因子(HGF)等，这些细胞生长因子能控制和维持受伤组织细胞，引导其自身修复，同时有研究表明，间充质干细胞分泌的细胞因子对氧化损伤具有保护作用。
人间充质干细胞培养基上清，是人体间充质干细胞在增殖过程中，经过特殊培养后分泌出的多种生命活性物质，包括蛋白质、多肽、细胞生长因子等促进细胞生长、活化，再生等活性因子，经过特殊的分离提取工艺和加工手段，将其中的多种有效活性成分经过检验制备而成。单一的细胞因子很难发挥其最大的生物学效应，而是需要多种因子的相互协调作用，因此人间充质干细胞提取物比单一的细胞因子具有更好的增加皮肤弹性、抗衰老、活化机体功能的功效。长期使用人间充质干细胞提取物具有美容、抗衰老、活化机体机能、细胞新生、紫外损伤修复及提高肌肤免疫力等功效。
目前，将人间充质干细胞培养上清用到美容领域中，仍需要考虑解决细胞因子的稳定性、皮肤吸收性以及与其他活性物质的兼容性，存在较大的改进空间。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种脂质体包裹人干细胞因子的制备及皮肤损伤修复检测方法，具有可更加安全有效的将人间充质干细胞应用到美容领域中的优点。
为达到上述目的，第一方面，本发明提供一种脂质体包裹人干细胞因子的制备方法，包括：
制备间充质干细胞培养上清液的步骤；
制备空白脂质体悬液的步骤；
在2-8℃的无菌条件下于空白脂质体悬液加入质量比为10％的间充质干细胞培养液以制备得到含间充质脂质体干细胞的脂质体混悬液的步骤；以及，
测定脂质体混悬液的性能的步骤。
作为本发明的一种优选方案，所述制备间充质干细胞培养上清液的步骤具体包括：
取包含第三代至第二十代液氮冷冻保藏的人间充质干细胞；
将装有人间充质干细胞的冻存管置于37℃水浴中在1min内迅速解冻复苏后，置于生物安全柜内进行培养；
取复苏后的人间充质干细胞通过流式细胞仪鉴定细胞表面的抗原表达情况以对细胞种类进行判定；
将解冻的人间充质干细胞转移到装有预热完成的完全生长培养基的离心管内，以1000rpm的转速离心3-5min后，在无菌条件下弃去上清液并将细胞重新悬浮在完全生长培养基中于培养容器中进行培养；
当细胞融合度达到80％时，弃去培养基并用磷酸缓冲液进行洗涤，并加入无血清的人间充质干细胞培养基继续培养48-72h后，取无血清上清即得到间充质干细胞培养上清液。
作为本发明的一种优选方案，所述制备空白脂质体悬液的步骤具体包括：
按照4：0.5-1.5：1-2：0.5-2的质量比称取高纯蛋黄卵磷脂、胆固醇、培化磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰胆碱，共溶于2-6倍量的乙醚-氯仿溶剂，利用旋转蒸发器在35-45℃水浴中进行加热减压旋转干燥，去除有机溶剂成膜后，于室温下真空干燥12h，制成空白脂质体；
用含0.1％-2％生育酚乙酸酯和0.1％-0.6％辛酸/癸酸甘油三酯的磷酸盐缓冲液旋转洗膜，搅拌水化后在水浴中超声5min，再转移到超声波细胞粉碎机中进一步超声，制得含质量比为1％-20％的空白脂质体悬液。
作为本发明的一种优选方案，在超声波粉碎机中进行超声处理的条件为：按照工作10s、间歇30s的周期顺序运行10min，工作温度为35℃。
作为本发明的一种优选方案，所述测定脂质体混悬液的性能的步骤包括：利用贝克曼库尔特粒度分析仪检测脂质体粒径的步骤和采用离心超滤法进行脂质体包封率检测的步骤。
作为本发明的一种优选方案，进行脂质体粒径检测时，取1mL新制得的脂质体混悬液用磷酸缓冲液进行稀释。
作为本发明的一种优选方案，所述进行脂质体包封率检测的步骤具体包括：
取适量脂质体混悬液测定总蛋白浓度；
将脂质体混悬液置于超滤管中，在6000rpm的转速、温度为4℃的条件下离心30min进行过滤，收集离心底液获取游离的未包裹成分，并检测其蛋白浓度；
按照标准公式计算包封率，所述标准公式为包封率＝(W总-W未)/W总*100％，其中，W总、W未分别表示总蛋白浓度和游离未包裹成分的蛋白浓度。
第二方面，本发明还提供一种检测由上述制备方法制得的脂质体混悬液对人皮肤成纤维细胞增殖影响的方法，包括：
用含体积比10％FBS的DME/F12培养基配制细胞密度为5*103个/mL的HSF细胞悬液，分别注于2块96孔细胞培养板，每孔100μL，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内培养40h；
弃去原培养液，分别加入100μL含1％、2％、5％、10％脂质体混悬液的培养基，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内分别培养24h和48h；
培养结束时，每孔加入10μL的CCK-8试剂，于37℃的温度条件下孵育1.5h，在在酶标仪上测定其在450nm波长处的吸光度，进行结果比对。
第三方面，本发明还提供一种检测由上述制备方法制得的脂质体混悬液对经UVA照射后细胞的增殖活性影响的方法，包括：
用含体积比10％FBS的DME/F12培养基配制细胞密度为5*103个/mL的HSF细胞悬液，分别注于4块96孔细胞培养板，每孔100μL，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内培养40h；
待细胞出现汇合生长时，取其中两块细胞培养板作为试验组，取出在显微镜下对细胞形态拍照保存后，弃去培养基加入磷酸缓冲液润洗一次，后弃去磷酸缓冲液并补加40μL的DME/F12无血清培养基，置于生物安全柜中在UVA灯下照射4h，弃去无血清培养基后分别加入100μL含1％、2％、5％、10％脂质体混悬液的培养基，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内分别培养24h和48h；
培养结束时，每孔加入10μL的CCK-8试剂，于37℃的温度条件下孵育1.5h，在在酶标仪上测定其在450nm波长处的吸光度，进行结果比对。
第四方面，本发明还提供一种检测由上述制备方法制得的脂质体混悬液对受紫外照射后皮肤损伤修复作用的方法，包括：
分别在经UVA照射过的实验鼠皮肤上涂抹1％、2％、5％、10％的脂质体混悬液，持续照射14天后，对皮肤组织切片进行HE染色，测定羟脯氨酸含量。
综上所述，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、从脐带中分离间充质干细胞，收集含有干细胞因子的培养液，其中包含蛋白质、多肽、细胞生长因子和生物活性因子等多种成分，相较于单一的细胞因子具有更好的抗衰老、活化机体功能的功效；
2、由于干细胞因子的保存活性很短，大大的限制了其效果和应用，采用脂质体包裹技术，将干细胞因子成分包封于脂质体中，可以将活性物质从中释放出来，从而可以极大程度提高这些活性物质的稳定性，同时其有效成分慢慢渗透出来，长时间发挥作用，起到了缓释和控释的作用；
3、脂质体膜成分与人体细胞生物膜成分极其接近，因此脂质体的生物相容性好，易于透过细胞，使得某些难透过的物质在脂质体化后能够进入细胞内发挥作用；
4、通过包封和缓释，降低了内容物的免疫原性和刺激性，从而更好地促进细胞新生、紫外损伤修复、延缓衰老，能够使皮肤更富有弹性；
5、将干细胞培养液与脂质体结合形成脂质体混悬液，提高了干细胞的稳定性，且便于保存运输，且可以更加方便地将间充质干细胞培养液应用到美容领域中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例一中人脐带间充质干细胞表面抗原CD44、CD73、CD90、CD105流式鉴定图。
图2为本发明实施例二中脂质体混悬液对人皮肤成纤维细胞增殖活性影响的结果图。
图3为本发明实施例三中脂质体混悬液对经UVA照射后细胞的增殖活性影响的结果图。
图4为本发明实施例四中皮肤组织中羟脯氨酸含量的测定结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种脂质体包裹人干细胞因子的制备方法，如图1所示，包括：
S100、制备间充质干细胞培养上清液，具体包括：
S101、取包含第三代至第二十代液氮冷冻保藏的人间充质干细胞，人间充质干细胞从新鲜脐带中提取，获得离体的人新鲜脐带，去除残留血液、表皮和动静脉，将组织将脐带剪碎至适当大小，消化后通过筛网过滤收集细胞，并对收集的细胞进行洗涤离心，随后将细胞按照适当的密度接种，并放入CO2培养箱中激进行培养；
S102、将装有人间充质干细胞的冻存管从液氮容器中取出后立即置于37℃水浴中，轻轻转动冻存管，直至冻存管内仅剩余一小块冰芯，使细胞在1min内迅速解冻复苏，随后转移到生物安全柜内进行培养，在打开冻存管盖子前用75％的乙醇擦拭冻存管外部；
S103、取复苏后的人间充质干细胞通过流式细胞仪鉴定细胞表面CD44、CD90、CD105、CD73等抗原的表达情况以对细胞种类进行判定，具体为判定前期分离冻存的细胞是否为人脐带间充质干细胞，若未表达CD44等细胞表面抗原，则与人脐带间充质干细胞的特征一致，即说明该前期分离冻存的细胞为人脐带间充质干细胞，检测结果如图1所示；
S104、将解冻的人间充质干细胞转移到装有预热完成的完全生长培养基的离心管内，以1000rpm的转速离心3-5min后，在无菌条件下弃去上清液并将细胞重新悬浮在完全生长培养基中，然后转移到培养容器中进行培养，完全生长培养基的含有10％FBS(FetalBovine Serum，胎牛血清)；
S105、当细胞融合度达到80％时，弃去培养基并用磷酸缓冲液进行洗涤，并加入无血清的人间充质干细胞培养基继续培养48-72h后，取无血清上清即得到间充质干细胞培养上清液。
S200、制备空白脂质体悬液，具体包括：
S201、按照4：0.5-1.5：1-2：0.5-2的质量比称取高纯蛋黄卵磷脂、胆固醇、培化磷脂酰乙醇胺(DSPE-MPEG2000)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，共溶于2-6倍量的乙醚-氯仿溶剂，利用旋转蒸发器在35-45℃水浴中进行加热减压旋转干燥，去除有机溶剂成膜后，于室温下真空干燥12h，制成空白脂质体，本实施例中高纯蛋黄卵磷脂、胆固醇、培化磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰胆碱的质量比选用4：1：1.5：1.5，乙醚-氯仿溶剂选用5倍量的，旋转蒸发器的水浴温度选用37℃；
S202、用含0.1％-2％生育酚乙酸酯和0.1％-0.6％辛酸/癸酸甘油三酯的磷酸盐缓冲液旋转洗膜，本实施例中生育酚乙酸酯中含量选用1％、辛酸/癸酸甘油三酯的含量选用0.6％，搅拌水化后在水浴中超声5min，再转移到超声波细胞粉碎机中进一步超声，制得含质量比为1％-20％的空白脂质体悬液，本实施例中超神波细胞粉碎机进行超声处理的条件为：按照工作10s、间歇30s的周期顺序运行10min，工作温度为35℃，最终制得5％的空白脂质体悬液。
S300、在2-8℃的无菌条件下于空白脂质体悬液加入质量比为10％的间充质干细胞培养液以制备得到含间充质脂质体干细胞的脂质体混悬液。
S400、测定脂质体混悬液的性能，具体包括：利用贝克曼库尔特粒度分析仪检测脂质体粒径的步骤和采用离心超滤法进行脂质体包封率检测的步骤。
本发明实施例中间充质干细胞的粒径选取10nm-5μm，优选粒径为50nm-1μm，更优选粒径为50nm-500nm；进行脂质体粒径检测时，取1mL新制得的脂质体混悬液用磷酸缓冲液进行稀释，利用贝克曼库尔特粒度分析仪检测结果粒径分布为50nm-500nm，平均粒径为200nm-250nm。
进行脂质体包封率检测的步骤具体包括：
S401、取适量脂质体混悬液测定总蛋白浓度；
S402、将脂质体混悬液置于超滤管中，超滤管中的滤膜优选孔径为100kDa，在6000rpm的转速、温度为4℃的条件下离心30min进行过滤，将脂质体被截留在滤膜上，收集离心底液获取游离的未包裹成分，并检测其蛋白浓度；
S403、按照标准公式计算包封率，标准公式为包封率＝(W总-W未)/W总*100％，其中，W总、W未分别表示总蛋白浓度和游离未包裹成分的蛋白浓度。
由于脂质体可以将细胞因子等活性物质包裹到其中，而且还可以将活性物质从中释放出来，从而可以极大程度提高这些活性物质的稳定性，而且起到了缓释和控释的作用；同时，由于脂质体膜成分与人体细胞生物膜成分极其接近，因此脂质体的生物相容性好，安全性高，所以将干细胞培养液与脂质体结合形成脂质体混悬液能够更好的应用于美容行业。
综上所述，本发明具有如下有益效果：
1、从脐带中分离间充质干细胞，收集含有干细胞因子的培养液，其中包含蛋白质、多肽、细胞生长因子和生物活性因子等多种成分，相较于单一的细胞因子具有更好的抗衰老、活化机体功能的功效；
2、由于干细胞因子的保存活性很短，大大的限制了其效果和应用，采用脂质体包裹技术，将干细胞因子成分包封于脂质体中，可以将活性物质从中释放出来，从而可以极大程度提高这些活性物质的稳定性，同时其有效成分慢慢渗透出来，长时间发挥作用，起到了缓释和控释的作用；
3、脂质体膜成分与人体细胞生物膜成分极其接近，因此脂质体的生物相容性好，易于透过细胞，使得某些难透过的物质在脂质体化后能够进入细胞内发挥作用；
4、通过包封和缓释，降低了内容物的免疫原性和刺激性，从而更好地促进细胞新生、紫外损伤修复、延缓衰老，能够使皮肤更富有弹性；
5、将干细胞培养液与脂质体结合形成脂质体混悬液，提高了干细胞的稳定性，且便于保存运输，且可以更加方便地将间充质干细胞培养液应用到美容领域中。
实施例二：
一种检测由实施例一中制备方法制得的脂质体混悬液对人皮肤成纤维细胞增殖影响的方法，包括：
S501、用含体积比10％FBS的DME/F12培养基配制细胞密度为5*103个/mL的人皮肤成纤维细胞(HSF)细胞悬液，分别注于2块96孔细胞培养板，每孔100μL，空白孔不加入细胞，每个处理组设置复孔5个，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内培养40h；
S502、弃去原培养液，分别加入100μL含1％、2％、5％、10％脂质体混悬液的培养基，对照组加入100μL培养基，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内分别培养24h和48h；
S503、培养结束时，每孔加入10μL的CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂，于37℃的温度条件下孵育1.5h，在在酶标仪上测定其在450nm波长处的吸光度，进行结果比对，检测结果如下表和图2所示。
实施例三：
一种检测由实施例一中制备方法制得的脂质体混悬液对经UVA照射后细胞的增殖活性影响的方法，包括：
S601、用含体积比10％FBS的DME/F12培养基配制细胞密度为5*103个/mL的HSF细胞悬液，分别注于4块96孔细胞培养板，每孔100μL，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内培养40h；
S602、待细胞出现汇合生长时，取其中两块细胞培养板作为试验组，取出在显微镜下对细胞形态拍照保存后，弃去培养基加入磷酸缓冲液润洗一次，后弃去磷酸缓冲液并补加40μL的DME/F12无血清培养基，使其充分覆盖住细胞，然后在无菌环境下置于生物安全柜中在UVA灯下照射4h，照射后弃去无血清培养基后分别加入100μL含1％、2％、5％、10％脂质体混悬液的培养基，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内分别培养24h和48h；
另外两块细胞培养板选5个孔为阴性对照组，阴性对照组进行UVA灯照射，且不加的培养基不含脂质体混悬液，最后同样置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内分别培养24h和48h；
S603、培养结束时，每孔加入10μL的CCK-8试剂，于37℃的温度条件下孵育1.5h，在在酶标仪上测定其在450nm波长处的吸光度，进行结果比对，检测结果如下表和图3所示。
实施例四：
一种检测由实施例一中制备方法制得的脂质体混悬液对受紫外照射后皮肤损伤修复作用的方法，包括：分别在经UVA照射过的实验鼠皮肤上涂抹1％、2％、5％、10％的脂质体混悬液，持续照射14天后，对皮肤组织切片进行HE染色，测定羟脯氨酸含量。
具体操作方式如下：
1、选用1％、2％、5％、10％脂质体混悬液的检测样品和6周龄KM小鼠作为受试生物体；
2、试验目的：前期体外实验的结果表明1％、2％、5％、10％脂质体混悬液对紫外照射造成的细胞损伤具有显著的修复作用，该试验是为了验证不同浓度的脂质体混悬液对经UVA照射损伤后的小鼠皮肤的修复作用，从而为实际应用提供实验依据。
3、试验过程
1)动物饲养及备皮处理：选取6周龄SPF级雌雄各半KM小鼠，体重25±2g，适应性饲养一周后将所有试验小鼠相同背部位置毛发剃掉约2cm2，试验过程中正常喂食水和饲料。
2)分组及药物处理：备皮后小鼠随机分为6组，每组选用雌雄各两只，分别进行如下试验操作：
A.阴性对照：不照紫外，不涂脂质体混悬液；
B.模型组：照紫外，不涂脂质体混悬液；
C.照紫外，涂1％脂质体混悬液；
D.照紫外，涂2％脂质体混悬液；
E.照紫外，涂5％脂质体混悬液；
F.照紫外，涂10％脂质体混悬液。
处理过程为先将小鼠背部暴露在UVA下照射3h，照射后涂脂质体混悬液，持续照射14天，其中UVA强度为0.25mJ/cm2·s，照射总剂量为50.4J，持续照射14天后处死小鼠，并做相关试验指标的检测。
4、检测过程
1)取试验组小鼠剃毛取皮肤，用10％甲醛溶液固定，进行常规石蜡切片后进行HE染色(hematoxylin-eosin staining，苏木精-伊红法)，观察皮肤结构的变化。
2)对试验组小鼠剃毛区的皮肤组织用羟脯氨酸检测试剂盒(Sigma-AldrichHydroxyproline Assay Kit)进行羟脯氨酸含量的测定。
5、检测结果
1)皮肤组织切片HE染色结果：
A组：表皮正常，真皮内胶原纤维以不同方向呈现束状排列，胶原纤维的粗细、分布比较均匀，排列整齐，无明显裂痕；
B组：皮肤附件明显增生，真皮内胶原纤维开始增粗，排列紊乱，出现裂痕；
C组：皮肤附件有少许增生，真皮内的胶原纤维排列较为整齐，没有明显的断裂；
D组：皮肤附件有轻微增生，真皮内的胶原纤维排列较为整齐，没有明显的断裂；
E组：表皮厚度正常，和正常皮肤组织相比没有明显的差异，胶原纤维排列比较整齐；
F组：表皮有一定的增生现象，皮肤深层胶原纤维排列出现松散现象。
结果表明：不同浓度的脂质体混悬液对经紫外照射后的小鼠皮肤的修复作用有一定的差异，浓度为5％时修复作用最强，2％和1％相对次之，10％时最较弱，原因可能在于浓度太高对细胞的增殖有一定的抑制作用，浓度太低活性成分减少，修复作用不佳。
2)皮肤组织中羟脯氨酸含量测定结果：
羟脯氨酸是胶原组织的主要成分之一，且为胶原中特有的氨基酸，约占胶原氨基酸总量的13％，利用羟脯氨酸在胶原蛋白中含量最高这一特点，通过测定羟脯氨酸的含量，可了解胶原蛋白的代谢情况，如皮肤老化后，胶原蛋白的合成量就会降低。如图4所示，A组羟脯氨酸的含量最高，B组含量最低且仅为A组的35％左右，C组D组和E组依次升高，F组介于B组和C组之间。羟脯氨酸的含量测定结果与皮肤组织切片HE染色结果及体外UVA照射后细胞的增殖活性实验结果基本一致。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种脂质体包裹人干细胞因子的制备方法，其特征在于，包括：
制备间充质干细胞培养上清液的步骤；
制备空白脂质体悬液的步骤；
在2-8℃的无菌条件下于空白脂质体悬液加入质量比为10％的间充质干细胞培养液以制备得到含间充质脂质体干细胞的脂质体混悬液的步骤；以及，
测定脂质体混悬液的性能的步骤。
2.根据权利要求1所述的脂质体包裹人干细胞因子的制备方法，其特征在于，所述制备间充质干细胞培养上清液的步骤具体包括：
取包含第三代至第二十代液氮冷冻保藏的人间充质干细胞；
将装有人间充质干细胞的冻存管置于37℃水浴中在1min内迅速解冻复苏后，置于生物安全柜内进行培养；
取复苏后的人间充质干细胞通过流式细胞仪鉴定细胞表面的抗原表达情况以对细胞种类进行判定；
将解冻的人间充质干细胞转移到装有预热完成的完全生长培养基的离心管内，以1000rpm的转速离心3-5min后，在无菌条件下弃去上清液并将细胞重新悬浮在完全生长培养基中于培养容器中进行培养；
当细胞融合度达到80％时，弃去培养基并用磷酸缓冲液进行洗涤，并加入无血清的人间充质干细胞培养基继续培养48-72h后，取无血清上清即得到间充质干细胞培养上清液。
3.根据权利要求2所述的脂质体包裹人干细胞因子的制备方法，其特征在于，所述制备空白脂质体悬液的步骤具体包括：
按照4：0.5-1.5：1-2：0.5-2的质量比称取高纯蛋黄卵磷脂、胆固醇、培化磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰胆碱，共溶于2-6倍量的乙醚-氯仿溶剂，利用旋转蒸发器在35-45℃水浴中进行加热减压旋转干燥，去除有机溶剂成膜后，于室温下真空干燥12h，制成空白脂质体；
用含0.1％-2％生育酚乙酸酯和0.1％-0.6％辛酸/癸酸甘油三酯的磷酸盐缓冲液旋转洗膜，搅拌水化后在水浴中超声5min，再转移到超声波细胞粉碎机中进一步超声，制得含质量比为1％-20％的空白脂质体悬液。
4.根据权利要求3所述的脂质体包裹人干细胞因子的制备方法，其特征在于，在超声波粉碎机中进行超声处理的条件为：按照工作10s、间歇30s的周期顺序运行10min，工作温度为35℃。
5.根据权利要求1所述的脂质体包裹人干细胞因子的制备方法，其特征在于，所述测定脂质体混悬液的性能的步骤包括：利用贝克曼库尔特粒度分析仪检测脂质体粒径的步骤和采用离心超滤法进行脂质体包封率检测的步骤。
6.根据权利要求5所述的脂质体包裹人干细胞因子的制备方法，其特征在于，进行脂质体粒径检测时，取1mL新制得的脂质体混悬液用磷酸缓冲液进行稀释。
7.根据权利要求5所述的脂质体包裹人干细胞因子的制备方法，其特征在于，所述进行脂质体包封率检测的步骤具体包括：
取适量脂质体混悬液测定总蛋白浓度；
将脂质体混悬液置于超滤管中，在6000rpm的转速、温度为4℃的条件下离心30min进行过滤，收集离心底液获取游离的未包裹成分，并检测其蛋白浓度；
按照标准公式计算包封率，所述标准公式为包封率＝(W总-W未)/W总*100％，其中，W总、W未分别表示总蛋白浓度和游离未包裹成分的蛋白浓度。
8.一种检测由权利要求1-7中任一项所述制备方法制得的脂质体混悬液对人皮肤成纤维细胞增殖影响的方法，其特征在于，包括：
用含体积比10％FBS的DME/F12培养基配制细胞密度为5*103个/mL的HSF细胞悬液，分别注于2块96孔细胞培养板，每孔100μL，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内培养40h；
弃去原培养液，分别加入100μL含1％、2％、5％、10％脂质体混悬液的培养基，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内分别培养24h和48h；
培养结束时，每孔加入10μL的CCK-8试剂，于37℃的温度条件下孵育1.5h，在在酶标仪上测定其在450nm波长处的吸光度，进行结果比对。
9.一种检测由权利要求1-7中任一项所述制备方法制得的脂质体混悬液对经UVA照射后细胞的增殖活性影响的方法，其特征在于，包括：
用含体积比10％FBS的DME/F12培养基配制细胞密度为5*103个/mL的HSF细胞悬液，分别注于4块96孔细胞培养板，每孔100μL，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内培养40h；
待细胞出现汇合生长时，取其中两块细胞培养板作为试验组，取出在显微镜下对细胞形态拍照保存后，弃去培养基加入磷酸缓冲液润洗一次，后弃去磷酸缓冲液并补加40μL的DME/F12无血清培养基，置于生物安全柜中在UVA灯下照射4h，弃去无血清培养基后分别加入100μL含1％、2％、5％、10％脂质体混悬液的培养基，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内分别培养24h和48h；
培养结束时，每孔加入10μL的CCK-8试剂，于37℃的温度条件下孵育1.5h，在在酶标仪上测定其在450nm波长处的吸光度，进行结果比对。
10.一种检测由权利要求1-7中任一项所述制备方法制得的脂质体混悬液对受紫外照射后皮肤损伤修复作用的方法，其特征在于，包括：
分别在经UVA照射过的实验鼠皮肤上涂抹1％、2％、5％、10％的脂质体混悬液，持续照射14天后，对皮肤组织切片进行HE染色，测定羟脯氨酸含量。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112546072A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-03-26 | 苏州倍乐勇生物科技有限公司 | 一种脂质体包裹人干细胞混悬液的制备方法 |
| WO2023012722A1 (en) * | 2021-08-06 | 2023-02-09 | Leadermed Champion Limited | miRNA-BASED COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF |
| CN113813289B (zh) * | 2021-09-07 | 2023-10-27 | 深圳市莱利赛生物科技有限公司 | 基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106176563A (zh) * | 2016-07-26 | 2016-12-07 | 西安艾尔菲生物科技有限公司 | 人脐带msc无血清培养液脂质体冻干粉及其制备和应用 |
| CN108904534A (zh) * | 2018-08-02 | 2018-11-30 | 傅松涛 | 一种干细胞分泌因子柔性脂质体的制备方法 |
-
2020
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106176563A (zh) * | 2016-07-26 | 2016-12-07 | 西安艾尔菲生物科技有限公司 | 人脐带msc无血清培养液脂质体冻干粉及其制备和应用 |
| CN108904534A (zh) * | 2018-08-02 | 2018-11-30 | 傅松涛 | 一种干细胞分泌因子柔性脂质体的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘美林等: "人脐带间充质干细胞条件培养基脂质体修复大鼠皮肤创面损伤", 《中国组织工程研究》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112546072A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-03-26 | 苏州倍乐勇生物科技有限公司 | 一种脂质体包裹人干细胞混悬液的制备方法 |
| WO2023012722A1 (en) * | 2021-08-06 | 2023-02-09 | Leadermed Champion Limited | miRNA-BASED COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF |
| CN113813289B (zh) * | 2021-09-07 | 2023-10-27 | 深圳市莱利赛生物科技有限公司 | 基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法 |
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