TWI433694B - 使用彈力蛋白與膠原蛋白的交聯物及其用途 - Google Patents

使用彈力蛋白與膠原蛋白的交聯物及其用途 Download PDF

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Takatoshi Yotsuyanagi
Shinichi Suto
Yoshifumi Yamaya
Yosuke Hoshino
Kazunari Nishimura
Tomoko Koga
Hiroyuki Enari
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Maruha Nichiro Foods Inc
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Description

使用彈力蛋白與膠原蛋白之交聯物及其用途
本發明係關於使用來自魚類之彈力蛋白與來自魚類之膠原蛋白之交聯物及其用途。
使用膠原蛋白之創傷被覆材或人造真皮，揭示於日本專利第2997823號說明書、日本專利第3772232號說明書、日本專利第3105308號說明書等，且亦有實際市售品。但於此等所使用之膠原蛋白，其大部分採自牛、豬等家畜之組織，而近年BSE(Bovine Spongiform Encephalopathy、牛海綿狀腦病)之問題浮現，使用含有牛皮等來自哺乳動物原料之膠原蛋白製品，有病原感染人類危險性之顧慮。
在此種背景中，希望研發生物親和性高、細胞侵入性良好、不抑制創傷收縮、形成似真皮組織後快速表現生物分解性等特性之使用來自牛、豬等哺乳動物以外材料之人造真皮。有人揭示含有魚皮真皮膠原蛋白之發泡體片材及其用途(日本特開2005－95331號公報)。
膠原蛋白在水溶液或懸浮液中加熱時變性成為明膠。變性之明膠因易溶於水而強度弱，被生物體中之蛋白水解酶分解而容易被生物體吸收，故不適於作為要求在生物體中具有適當安定性之醫療用材料。再者，來自魚類之膠原蛋白與來自哺乳動物者比較時，有變性溫度低、凝膠強度弱之缺點。為防止變性而須要在變性溫度以下進行反應，但在低溫下有視交聯劑種類而不能進行反應之缺點。
另一方面，彈力蛋白為韌帶、皮膚等各種組織或器官之彈性纖維之主要蛋白質，現今有人正在探討彈力蛋白作為損傷組織或器官再生之醫療用材料的用途。
日本特公平6－30616號公報揭示將水溶性彈力蛋白與可溶性膠原蛋白在冷時混合而成之成型用組成物。又，國際公開第2002/96978號說明小冊(WO2002/96978號)揭示將彈力蛋白以交聯劑進行交聯時，使膠原蛋白等成分化學性鍵結而成之彈力蛋白交聯物，及其醫療用器具及再生組織。
[專利文獻1]日本專利第2997823號說明書
[專利文獻2]日本專利第3772232號說明書
[專利文獻3]日本專利第3105308號說明書
[專利文獻4]日本特開2005－95331號公報
[專利文獻5]日本特公平6－30616號公報
[專利文獻6]國際公開第2002/96978號說明小冊
膠原蛋白及彈力蛋白，作為人造真皮製造用材料及組織再生之醫療用材料等用途而備受注目，但以現狀而言，在原材料來源、製得製品之處理性及機械強度、對應使用目的之特性等各種必要條件上，尚無令人滿意者。
例如，目前在先前技術文獻中，尚未見揭示使用來自魚類之膠原蛋白與來自魚類之水溶性彈力蛋白當做牛、豬以外來源之創傷被覆材或人造真皮者。又，來自魚類之膠原蛋白與來自哺乳動物者比較時，有變性溫度低、凝膠強度弱之缺點。為防止變性而須要在變性溫度以下進行反應，但在低溫下有視交聯劑種類而不能進行反應之缺點。
日本特公平6－30616號公報記載將水溶性彈力蛋白與可溶性膠原蛋白在冷時混合而成之成型用組成物，及使用其而獲得之膜狀構造體。但由此成型用組成物製得之構造體因未實施交聯等不溶化處理，故有時無法在水中長時間保持形態。又，人造真皮為多孔體，但由該公報所記載之成型用組成物不易製得人造真皮用多孔體。
國際公開第2002/96978號說明小冊揭示將水溶性彈力蛋白以交聯劑進行交聯時化學性鍵結膠原蛋白而成之交聯物及其作為醫療用材料之用途。但，國際公開第2002/96978號說明小冊所記載之交聯方法，記載因交聯劑或交聯條件而流入模型困難、反應速度控制困難、不能製得目標形狀及性質之交聯體等。再者，即使依交聯方法製得交聯體，亦有時不能充分對應包括人造真皮之醫療用材料及細胞培養基礎材料等各種用途。
本發明之目的在於提供能夠充分對應包括人造真皮之醫療用材料及細胞培養基礎材料等各種用途之膠原蛋白/彈力蛋白交聯物。
本發明之交聯物，其特徵在於：係藉由將來自魚類之膠原蛋白及來自魚類之彈力蛋白交聯而獲得。
本發明之交聯物之製造方法，其特徵為具有以下步驟：在來自魚類之彈力蛋白不引起凝聚(Coacervation)之條件下，製備溶解來自魚類之膠原蛋白與來自魚類之彈力蛋白之溶液之步驟，及在來自魚類之彈力蛋白不引起凝聚之條件下，添加交聯劑於上述溶液，在冷凍乾燥中形成交聯製得交聯物之步驟，或在來自魚類之彈力蛋白不引起凝聚之條件下，將上述溶液進行乾燥，再將所得乾燥物進行交聯之步驟。
又，本發明之交聯物之製造方法，其特徵為：將上述未交聯乾燥物進行交聯之方法，以使用交聯劑之交聯、利用熱之交聯、利用照射紫外線或放射線之交聯、此等單獨或組合，製得不溶於水之交聯物。
本發明之醫療用材料，特徵在於：含有上述交聯物。又，本發明之細胞培養基礎材料，特徵在於：含有上述交聯物。又，本發明之化粧品基材，特徵在於：含有上述交聯物。
依據本發明，能夠提供充分對應包括人造真皮之醫療用材料及細胞培養基礎材料等各種用途之來自魚類原料之膠原蛋白/彈力蛋白交聯物及其製造方法，並提供利用該膠原蛋白/彈力蛋白交聯物製得之醫療用材料、細胞培養基礎材料、化粧品基材之用途。
在本發明，使用來自魚類之彈力蛋白。製備彈力蛋白用之魚類，如鮭魚、鱒魚等鮭形目(Salmoniformes )鮭科(Salmonidae )，鮪魚、鰹魚等鱸形目(Perciformes )鯖科(Scombridae )，五條鰤等鱸形目(Perciformes )鰺科(Carangidae )，長蛇齒單線魚(Lingcod、學名Ophiodon elongatus )等鮋亞目(Scorpaenoidei )六線魚科(Hexagrammidae )等。就彈力蛋白而言，為與膠原蛋白形成交聯物而獲得均勻之交聯物，以水溶性彈力蛋白較佳。水溶性彈力蛋白，有係彈力蛋白生合成先質之原彈力蛋白，彈力蛋白以酸及鹼處理所得之α-彈力蛋白、κ-彈力蛋白，及以酵素處理所得之彈力蛋白水解物等。本發明所使用之彈力蛋白以製備交聯物時容易獲得機械強度之分子量整齊一致之高分子α-彈力蛋白為宜。
又，本發明所使用彈力蛋白之分子量並無特別限定，其重量平均分子量以約1萬～10萬較佳。
彈力蛋白與膠原蛋白比較時，雖然在生物體中之分解較慢，但與膠原蛋白相同其生物體親和性高，故添加彈力蛋白可期待附加機械強度與柔軟性。又，α-彈力蛋白因具有巨噬細胞遷移性、細胞黏著、抑制血小板凝聚等生物學功能，故使用α-彈力蛋白為交聯物原料時，期待能夠附加此等生物學功能。
來自魚類之彈力蛋白之製備，可依常法進行。
來自魚類之彈力蛋白與來自牛、豬之彈力蛋白比較時，除與彈力蛋白分子中之交聯結構相關的一種胺基酸即鎖鍊素(desmosine)、異鎖鍊素含量較少外，尚具有其胺基酸組成與來自牛、豬等哺乳動物之彈力蛋白不同的特徵。
能夠在本發明利用之來自魚類之彈力蛋白，其組成胺基酸含量與來自動物之彈力蛋白不同之例可舉如下述組成(mol%)。
‧甘胺酸：35～45%
‧丙胺酸：10～20%
‧纈胺酸：3～8%
‧異鎖鍊素：0.1～1.0%
‧鎖鍊素：0.1～1.0%
‧非極性胺基酸合計為67～77%
又，於上述胺基酸組成，其分析對象胺基酸為：甘胺酸(Gly)、丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ileu)、絲胺酸(Ser)、酥胺酸(Thr)、天門冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、羥離胺酸(Hylys)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、酪胺酸(Tyr)、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸(Pro)、羥脯胺酸(Hypro)、異鎖鍊素(Iso-Des)及鎖鍊素(Des)。上述甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異鎖鍊素、鎖鍊素以外之胺基酸含量(mol%)例示如下。
‧白胺酸：3.4～4.5
‧異白胺酸：0.9～1.9
‧絲胺酸：3.1～3.4
‧酥胺酸：3.1～6.5
‧天門冬胺酸：1.6～2.9
‧麩胺酸：3.2～4.3
‧離胺酸：0.7～1.5
‧精胺酸：1.6～2.6
‧組胺酸：0.2～0.8
‧羥離胺酸：0
‧半胱胺酸：0～0.2
‧甲硫胺酸：0.4～0.7
‧酪胺酸：3.4～4.4
‧苯丙胺酸：1.1～3.1
‧脯胺酸：8.6～10.1
‧羥脯胺酸：0.5～0.9
另一方面，膠原蛋白亦使用來自魚類之膠原蛋白。膠原蛋白製備用魚類，如鮭魚、鳟魚等鮭形目(Salmoniformes )鮭科(Salmonidae )，鮪魚、鰹魚等鱸形目(Perciformes )鯖科(Scombridae )，五條鰤等鱸形目(Perciformes )鯵科(Carangidae )，太平洋鱈、狹鱈等鱈形目(Gadiformes )鱈科(Gadidae )等。至於膠原蛋白，由與彈力蛋白形成交聯物時獲得均勻交聯物之觀點，以可溶性(水溶性)膠原蛋白較佳。由魚類製備膠原蛋白，可依常法進行。在膠原蛋白兩端存在其主要抗原部位之末端胜肽(Telopeptide)。如以酵素處理取除此部位時，膠原蛋白之抗原性極端減低。此種膠原蛋白稱為去端肽膠原蛋白(atelocollagen)，應用於醫療用植入材料及組織工程用基礎材料。本發明所使用之可溶性膠原蛋白以來自魚類之去端肽膠原蛋白較佳。
又，本發明所使用膠原蛋白之分子量並無特別限定，其重量平均分子量以約1萬～30萬較佳。
來自魚類之膠原蛋白與來自牛、豬之膠原蛋白比較時，其胺基酸組成不同，如脯胺酸及羥脯胺酸含量低。又，膠原蛋白具有在某一溫度以上時變性而明膠化之性質，但來自魚類之膠原蛋白與來自牛、豬之膠原蛋白比較時，其變性溫度通常較低。
能夠在本發明利用之來自魚類之膠原蛋白，其組成胺基酸含量與來自動物之膠原蛋白不同之例可舉如下述組成(mol%)。
‧甘胺酸：34～40%
‧脯胺酸：5.0～11.0%
‧羥脯胺酸：4.0～8.0%
‧組胺酸：0.8～2.0%
又，於上述胺基酸組成，其分析對象胺基酸為：甘胺酸(Gly)、丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ileu)、絲胺酸(Ser)、酥胺酸(Thr)、天門冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、羥離胺酸(Hylys)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸(Pro)、及羥脯胺酸(Hypro)。
上述甘胺酸、脯胺酸、羥脯胺酸、組胺酸以外之胺基酸含量(mol%)例示如下。
‧丙胺酸：10.5～15.0
‧纈胺酸：1.1～2.2
‧白胺酸：1.5～2.3
‧異白胺酸：0.5～1.1
‧絲胺酸：3.5～6.3
‧酥胺酸：2.1～3.6
‧天門冬胺酸：4.3～5.3
‧麩胺酸：7.4～9.5
‧離胺酸：2.4～2.9
‧精胺酸：4.9～5.5
‧羥離胺酸：0.5～0.8
‧半胱胺酸：0～0.2
‧甲硫胺酸：0.3～1.7
‧色胺酸：0
‧酪胺酸：0.2～0.3
‧苯丙胺酸：1.1～1.4
形成彈力蛋白與膠原蛋白之交聯物時可使用交聯劑。尤其交聯物需求強度安定性時，使用交聯劑較好。至於交聯劑，只要能夠使其交聯即可。如碳二醯亞胺系、疊氮系、氟磷酸系、三系、環氧系等交聯劑(縮合劑)。又，亦可使用助縮合劑，如N-羥基多價羧酸醯亞胺類、N-羥基三唑類、三類、2-羥亞胺基-2-氰基醋酸乙酯(2-hydroxyimino-2-cyanoethylacetate)等。此等縮合劑或助縮合劑如當做醫療用材料使用時，以選擇低殘留性及低毒性者為宜。
本發明之交聯物，可將來自魚類之彈力蛋白與來自魚類之膠原蛋白，利用使用交聯劑之交聯法、利用熱之交聯法、利用紫外線或放射線之交聯法製造。為獲得當做人造真皮等醫療用材料、細胞培養基礎材料及化粧品基劑之特性，以具有下述步驟之製造方法製造交聯物較好。
(A)將來自魚類之膠原蛋白與來自魚類之彈力蛋白在彈力蛋白不發生凝聚(coacervation)之條件下進行溶解以製備溶液之步驟；
(B)在彈力蛋白不發生凝聚之條件下，由步驟(A)製得之溶液製造交聯物之步驟。
步驟(B)可使用下述步驟(B－1)或步驟(B－2)。
(B－1)在彈力蛋白不發生凝聚之條件下，添加交聯劑於步驟(A)製得之溶液後在冷凍乾燥中形成交聯，製得交聯物之步驟。
(B－2)在彈力蛋白不發生凝聚之條件下，將步驟(A)製得之溶液進行乾燥，再將所得乾燥物進行交聯之步驟。
步驟(B－2)之乾燥方法，可利用冷凍乾燥、真空乾燥、吹風乾燥、以脫水溶劑進行乾燥、自然乾燥等。又於步驟(B)之後，可再加使用交聯劑之交聯、利用熱之交聯、利用紫外線或放射線之交聯等單獨或此等之組合之交聯處理。
因此，該製造方法具有以下特徵：在彈力蛋白不發生凝聚之條件下溶解彈力蛋白、並在此狀態下對於溶有彈力蛋白與膠原蛋白之溶液添加交聯劑，使在冷凍乾燥中形成交聯以製得交聯物之步驟；或將該溶液在彈力蛋白不發生凝聚之條件下進行乾燥、再將所得乾燥物進行交聯之步驟。水溶性彈力蛋白具有在水溶液中發生所謂凝聚(coacervation)現象之溫度或pH條件。若發生凝聚，溶液底部凝聚成水飴狀，不僅與其他混合物不均勻交聯，更視交聯劑種類或交聯條件，水溶性彈力蛋白完全不交聯，而與其他混合物分離。因此，在交聯用溶液中，應使彈力蛋白不發生凝聚為宜。在藉由彈力蛋白不發生凝聚之條件下使膠原蛋白與交聯劑進行反應，彈力蛋白、膠原蛋白及交聯劑進行均勻之反應，能夠製得均質之交聯物。而以多孔體形式製得交聯物時，亦能夠形成具有更均質之空孔分布之多孔體者。在彈力蛋白發生凝聚之狀態下進行交聯，交聯物中會產生彈力蛋白偏多之部分，再者有時發生在交聯物全體不能充分形成交聯結構的情形。
不發生凝聚之條件，可依所使用水溶性彈力蛋白種類而設定。通常採用由0～40℃溫度範圍及1～12pH範圍選擇之溫度及pH條件。
另一方面，膠原蛋白在某一溫度以上即變性成明膠。變性之膠原蛋白因易溶於水而強度弱，故易被生物體中之蛋白水解酶分解吸收，而不適於在生物體中要求適當安定性之醫療用材料。由上述理由，製備溶液及進行交聯必須在變性溫度以下實施。來自魚類之膠原蛋白變性溫度一般據說為20℃上下，故在較低於此溫度之溫度範圍進行製備溶液及交聯反應為宜。又，膠原蛋白具有在中性pH範圍較酸性pH範圍可溶化，但在鹼性則不溶化之性質。由上述種種，欲使含膠原蛋白之組成物在均一條件下進行交聯，則溶解膠原蛋白之溶液之pH以1～7較佳，3～6更佳。
因此，要獲得彈力蛋白與膠原蛋白之均質溶液，需為兩者均溶解之狀態。亦即，溫度為彈力蛋白不發生凝聚且膠原蛋白不變性之10℃以下，並以0～5℃更佳，而pH為彈力蛋白不發生凝聚且膠原蛋白溶解之pH3～6，並以所選擇之交聯劑容易反應之pH更佳。
溶解彈力蛋白與膠原蛋白時之溶劑，可使用水，或含酸、鹼、界面活性劑之水，含低濃度水溶性有機溶劑之水等。
彈力蛋白與膠原蛋白混合比例(重量%)，相對於交聯物重量以0.5%～99.5%範圍為佳。並以1～50%更佳，只要在此範圍即可製得良好多孔質之成型體，可製得當做包括人造真皮等醫療用器具、細胞培養基礎材料及化粧品基劑之良好成形物。
將含有彈力蛋白與膠原蛋白之乾燥物進行交聯時之交聯方法，可應用使用交聯劑之化學交聯、利用熱交聯、利用紫外線或放射線交聯等。亦即，含有彈力蛋白與膠原蛋白之乾燥物即使不添加交聯劑，亦可利用熱、紫外線及放射線之至少一種而使交聯。
又，乾燥物之交聯可視須要而在溶劑中進行。例如為使乾燥物不溶解於溶劑中，在高濃度鹽類水溶液中，或醇類、DMSO、DMF、二烷等有機溶劑中及此等之混合液中，並因應須要在交聯劑存在下進行交聯。
交聯劑之配合比例(重量%)並無特別限定，但相對於進行交聯之組成物重量以1～50%較佳。欲製得當做包含人造真皮等醫療用器具、細胞培養基礎材料及化粧品基劑之良好成形物則以1～30%之配合比例特佳。
在溶液中使彈力蛋白與膠原蛋白進行交聯時，其等之濃度(重量%)並無特別限定，但考慮膠原蛋白及彈力蛋白之溶解性及依據混合液黏性之成型性時，濃度以0.5～50%較佳。欲製得當做包含人造真皮等醫療用器具、細胞培養基礎材料及化粧品基劑之良好成形物則以1～10%之濃度範圍特佳。
本發明之膠原蛋白/彈力蛋白交聯體之成型方法並無特別限定，可使用一般合成樹脂成型所使用之成型用模型。例如將交聯劑加入含有彈力蛋白與膠原蛋白之溶液中後流入模型再將此冷凍乾燥進行交聯，或將含有彈力蛋白與膠原蛋白之溶液流入模型並乾燥得成型乾燥物，再將此乾燥物進行交聯得成型物。以此方法能夠使膠原蛋白/彈力蛋白交聯體成型為反映所使用模型之海綿狀、線狀、膜狀、棒狀、丸粒狀、管狀等。又，亦可以利用溶液澆鑄法使成型為膜狀。例如將交聯劑加入含有彈力蛋白與膠原蛋白之溶液後在樹脂或金屬基板上薄薄地展開，再將溶劑去除後乾燥，藉此得交聯體；或將含有彈力蛋白與膠原蛋白之溶液在樹脂等基板上薄薄地展開後，去除溶劑並乾燥所得物進行交聯即得膜狀膠原蛋白/彈力蛋白交聯體。
本發明之交聯物除彈力蛋白與膠原蛋白外，亦可添加來自魚類之DNA及魚精蛋白(protamine)。
DNA對人正常皮膚纖維芽細胞具有促進產生玻尿酸效果，且其分解物之去氧核糖核苷酸類具有人正常皮膚纖維芽細胞之生長活性及促進產生膠原蛋白之效果。來自魚類之DNA可使用來自鮭科之DNA等。又，本發明所使用DNA之分子量並無特別限定，以重量平均分子量約1萬～1000萬較佳。
魚精蛋白為特異性存在於脊椎動物精核之蛋白質，由於具有抗菌效果故期望對創傷有預防感染作用。魚精蛋白可使用來自鮭科之鮭精蛋白(salmine)、來自鯡科之鯡精蛋白(clupeine)等。
構成魚精蛋白之胺基酸以精胺酸含量較多，來自鮭科之魚精蛋白之鮭精蛋白約含70%精胺酸，如膠原蛋白/彈力蛋白多孔體含有魚精蛋白時，因其生物體中之分解過程而產生精胺酸。精胺酸能夠抑制伴隨組織發炎釋出之過多細胞激素(cytokine)(給予刺激之生理活性物質)之表現。又，精胺酸為產生NO(一氧化氮)之代表性成分，NO具有攻擊腫瘤細胞或受感染細胞之作用。再者，精胺酸對T淋巴球之成熟具有重要作用。如上所述，精胺酸具有活化免疫反應、促進細胞增殖效果，促進膠原蛋白生成效果等，亦為促進治療創傷或褥瘡之重要胺基酸。
因此，添加此等來自魚類之DNA或魚精蛋白於膠原蛋白/彈力蛋白交聯物時，可期待有如上述之效果。此等成分之配合量為使得能夠賦予交聯物目標物性、特性或功能性而配合。配合量並無特別限定，相對於膠原蛋白與彈力蛋白合計量，添加0.5%～50%之DNA及或魚精蛋白，並以1～20%較佳。
再者，本發明之交聯物除添加來自魚類之彈力蛋白與膠原蛋白外，亦可添加粉末狀或顆粒狀磷酸鈣。該交聯物能夠應用於作為骨再生誘導劑或促進骨再生劑、或在骨缺損部位以引導或促進骨形成為目的之骨填補材料，但其用途不限定於此等。
磷酸鈣配合量以能夠賦予交聯物目標物性、特性或功能性而配合。配合量並無特別限定，相對於膠原蛋白與彈力蛋白合計量，添加0.5%～50%之磷酸鈣，並以1～20%較佳。
磷酸鈣如氫氧磷灰石(HA)、磷酸三鈣(α－TCP、β－TCP)、磷酸氫鈣二水合物(DCPD)、磷酸八鈣(OCP)、磷酸四鈣(TeCP)、碳酸磷灰石(CAP)等，此等可使用至少1種。
依據本發明，能獲得由非水溶性且均質之複合物構成之交聯物，即使作成多孔體，交聯物亦能獲得適合當做人造真皮或細胞培養基礎材料之多孔質結構。再者，製造有關本發明之交聯物所使用彈力蛋白與膠原蛋白，非為有BSE(牛海綿狀腦病)等傳染病之疑慮之向來來自哺乳動物之原料，而為來自魚類之天然原料，故能夠提供更安全之交聯物。
有關本發明之交聯物，由於添加彈力蛋白，故較單獨之膠原蛋白提升生物體中之安定性與機械強度，同時具有生物體中之分解性，故具有適合醫療用材料之物性。
有關本發明之交聯物所構成之多孔體為均質，且具有適合當做人造真皮或細胞培養基礎材料之多孔質結構。因此當做人造真皮使用時，其皮膚纖維芽細胞之侵入性優異，肉芽形成良好而能抑制創傷收縮，且創傷治癒後快速被生物體吸收，故皮膚因創傷、熱傷、褥瘡等而受損傷時，適合應用於損傷面，能夠使用於真皮成分欠缺部位。因此依據本發明，能夠提供有效促進創傷治癒之人造真皮。
再者，有關本發明之交聯物所構成之多孔體，內部存在均一之細孔，具有生物體適合性及在生物體中緩緩分解之特性，故能夠應用於傳達系統(DDS)用材料，以保持生長因子(b－FGF、BMP等)或抗生素等藥物，送達並供給患部等須要部位。又，不僅人造真皮，亦能夠多方面應用於再生醫療用基礎材料(scaffold)(細胞生長支架材料)、移植材料等醫療用材料。
有關本發明之交聯物，能夠應用於骨再生基材，但亦可使其含有骨形成因子及生長因子。骨形成因子如骨形成蛋白質(BMP)、基因重組人骨形成蛋白質(rhBMP)，生長因子如纖維芽細胞生長因子(FGF)、β轉形作用生長因子(TGF－β)、上皮生長因子(EGF)、類胰島素生長因子(IGF)、血小板由來生長因子(PDGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、神經營養因子(NGF)等，此等至少可使用1種。
有關本發明之交聯物，能夠應用於醫療用及細胞培養基礎材料用之軟骨再生基材。例如，膠原蛋白/彈力蛋白多孔體為均質，且具有優異侵入性的理想多孔質結構，因此能夠維持軟骨樣組織。由於軟骨再生後快速被生物體吸收，故適合應用於損傷面，能有效再生軟骨狀組織。因此依據本發明，能夠提供有效促進軟骨再生之軟骨再生基材。
有關本發明之交聯物，能夠含有應用於醫療用及細胞培養基礎材料用之軟骨再生基材之軟骨分化引導因子及生長因子。軟骨分化引導因子如β轉形作用生長因子(TGF－β)、骨形成蛋白質(BMP)、基因重組人骨形成蛋白質(rhBMP)，Sox基因組(Sox9、Sox5或Sox6)等，此等至少可使用1種。
本發明之膠原蛋白/彈力蛋白交聯物，能夠作為於化粧品基材。化粧品基材可使用於化粧用面膜及濕片材等。尤其以多孔體狀態能夠含浸多量化粧水或美容液，故能夠期待膠原蛋白、彈力蛋白之功能。當做化粧用面膜使用時，可利用厚度約1～5mm之片狀多孔體，且符合顏面形狀或覆蓋部分顏面形狀者。
「實施例」
其次以實施例詳細記載實施本發明之最佳形態，但本發明不受下述實施例之限定。又於下述實施例，若非另有特別規定，「%」為重量基準。
[實施例1]
(來自魚類之去端肽膠原蛋白及來自魚類之水溶性彈力蛋白之細胞毒性試驗)
供試材料使用來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白及來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白。評價細胞使用形成皮膚基質中主體之人正常皮膚纖維芽細胞。細胞毒性試驗以WST－1檢測法實施。WST－1檢測法為本業界周知之方法，乃以比色定量(測定波長450nm)WST－1被細胞中粒線體之作用而分解產生之甲(Formazan)，利用其吸光度與活細胞數相關而測定活細胞數。所得結果示如圖1及圖2。所有試樣在0.1～10μg/mL濃度之細胞存活率高，確認無細胞毒性。
[實施例2]
(使用交聯劑製備來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體)
使用與實施例1相同之來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白及來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白製備多孔體。亦即，在試管中量取來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白，使配合比(重量比)為膠原蛋白/彈力蛋白=8：2。加去離子水於此膠原蛋白/彈力蛋白混合粉末，在冷藏(3℃)下攪拌得濃度5%之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液。對於製備之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液，於冷藏下(3℃)加入EDC(交聯劑：1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-羰二醯亞胺氯化氫(1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride、東京化成(股))水溶液並混合(EDC添加量為使相對於膠原蛋白之彈力蛋白之總重量，EDC為20%(w/w))。將添加有EDC之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液流入目的形狀之模型，冷凍乾燥得到膠原蛋白/彈力蛋白多孔體。將得到的膠原蛋白/彈力蛋白多孔體以離子交換水清洗。清洗後，使含水狀態之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體冷凍乾燥，得到膠原蛋白/彈力蛋白多孔體。
以掃描式電子顯微鏡(JEOL製，JSM－6380LV，以下稱為SEM)觀察得到之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之構造，結果孔之大小為50～100μm，孔徑一致(參照圖3)。
[實施例3]
(使用熱交聯製備來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之製備例)
與實施例1使用者同樣，使用來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白製備多孔體。亦即，在試管中量取來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白及來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白，使配合比(重量比)為膠原蛋白/彈力蛋白=7：3。於此混合膠原蛋白/彈力蛋白粉末中加入去離子水，並於冷藏下(3℃)攪拌，得到濃度10%之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液。將該混合溶液流入目的形狀之模型，冷凍乾燥得到冷凍乾燥物。將該冷凍乾燥物於減壓下進行150度、24小時熱交聯，得到膠原蛋白/彈力蛋白多孔體。將得到的多孔體放入水中，結果保持著形狀1週以上。以掃描式電子顯微鏡(JEOL製，JSM-6380LV，以下稱SEM)觀察得到的膠原蛋白/彈力蛋白多孔體的構造，結果孔大小為50～100μm，孔徑一致(參照圖4)。
[實施例4]由於在膠原蛋白添加彈力蛋白所造成之多孔體之物性變化
使用來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白及來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白，以與實施例2同樣交聯方法，分別製備膠原蛋白100%之多孔體、對於膠原蛋白添加20%(w/w)之彈力蛋白的多孔體、對於膠原蛋白添加40%(w/w)之彈力蛋白的多孔體為同樣大小及形狀(直徑12mm厚度6mm之圓柱狀)(膠原蛋白與彈力蛋白合計濃度定為5%)。將此等多孔體於水中放置24小時，成為膨潤狀態之凝膠。以流變計(製造販售：sun-kagaku(股))測定其凝膠之機械強度。其結果，藉由添加彈力蛋白，比起膠原蛋白單體(彈力蛋白含有率0%)之情形，凝膠之斷裂強度、及代表凝膠柔軟性之值的斷裂距離增長(參照圖5、圖6)。又，就比較對照而言，將使用來自哺乳動物之膠原蛋白的市售人造真皮與上述以同樣分析條件測定，結果強度弱，無法測定斷裂距離。
[實施例5]
(來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體作為支架(細胞培養基礎材料)之評價)
使用與實施例2以同樣方法製備之來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體(徑11mm×厚度3mm)。作為評價用細胞，使用WFB(WKA大鼠之纖維芽細胞不死化株)、人類皮膚正常纖維芽細胞。將膠原蛋白/彈力蛋白多孔體以環氧乙烷氣體滅菌，將經脱氣處置之多孔體置於12孔培養平盤。其次，各將含細胞之培養液(細胞濃度5×105 個/mL)1mL滲入各海綿後，注入1mL培養液，將其隔3、4日更換培養液並進行培養。細胞之存活確認與組織學評價，於培養後第14、28日實施。細胞之存活確認，使用WST－1檢測法之變法。亦即，為了除去黏著在培養平盤的細胞，僅測定生著在多孔體之細胞，將多孔體移到新的培養平盤。將2～3mL的WST－1液－培養液(1：10)注入新的培養平盤，以此狀態使反應4小時，以平盤讀取儀測定吸光度。組織學評價，係將膠原蛋白/彈力蛋白多孔體以福馬林固定，並將其以石蠟塊包埋，薄切後進行蘇木素-伊紅染色而實施。
以WST－1檢測法變法所得結果如表1。
如表1所示，兩細胞與空白組(無細胞)比較時，均明顯存在吸光度，又，相較於第14日，第28日的吸光度增大，因此，暗示於多孔體內存活且增殖中。將培養組織染色並於顯微鏡下觀察，結果，人類皮膚正常纖維芽細胞，WFB的細胞均為細胞彼此黏着，認為附著在多孔體。由此可知：來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體可作為細胞培養基礎材料使用。
[實施例6]
(來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體對於生物體內(大鼠皮下)之埋入試驗)
使用以與實施例2同樣方法製備之來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體(直徑11mm×厚度5mm)。對於Wister系大鼠(4週齡、約200g、雌)施以乙醚麻醉，將背部的毛以電動剃刀剃掉。以剪刀切開背部皮膚約1cm，於皮下(肉狀膜下)製作直徑約1cm之囊後，埋入經環氧乙烷氣體滅菌之多孔體，以尼龍線縫合使創口閉合。手術日起算第3、7、14、21、28、56日，將大鼠計畫性地屠殺，對於埋乳多孔體之部分進行生物檢驗。將組織以福馬林固定後，製作成石蠟標本。將其進行蘇木素-伊紅染色，評價生物體適合性。
觀察多孔體埋入後之組織，結果於移植初期，於多孔體周圍可散見發炎細胞浸潤、毛細血管、纖維芽細胞‧內皮細胞的所謂肉芽組織，之後逐漸肉芽組織增生，產生新的膠原纖維(膠原蛋白等)，於第56日大致完全結疤。另一方面，多孔體從周圍被破壞、吸收，於第56日完全被吸收(參照圖7)。此結果與以前報告之使用膠原蛋白之人造真皮的Pernac(販售商；Johnson＆ Johnson，製造商；Gunze)之動物實驗的結果大致同等。
[實施例7]
(來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體移植到大鼠皮膚缺損創傷的試驗)
以與實施例2同樣方法製備來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體(直徑20mm×厚度5mm)，樣品組以其作為移植材料。對照組以市售之使用膠原蛋白之人造真皮的TERUDERMIS(膠原蛋白單層型、Terumo製)作為移植材料。對於Wister系大鼠施以乙醚麻醉，在背部製作直徑約15mm的皮膚缺損創傷，於缺損創傷放置移植材料，以敷藥保護材將缺損創傷及移植材料完全覆蓋，將敷藥保護材及皮膚斷端以尼龍線縫合。為了使移植材料與其下部密合，以紗布輕輕地壓迫，再以伸縮性繃帶壓迫固定。製作無移植材料之開放創傷組、使用來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體作為移植材料之樣品組、使用TERUDERMIS作為移植材料之對照組共3組，且同樣的處置對於各組進行5隻。
各組均未確認到伴隨試驗結果之試樣埋入的死亡及感染等。創面以肉眼觀察，樣品組於受術後，創面未急速收縮，於第7日，大部分為肉芽化。開放創傷組之創面於手術後開始急速收縮，於第14日大致治癒。經時比較探討創面大小的結果，開放創傷組之創面於手術後初期起急速開始收縮，相對於此，樣品組及對照組，認為創傷收縮比較徐緩發生(參照圖8、9)。進行創面(治癒面)之組織學探討之結果，於術後第7日之樣品組，由周圍組織觀察到發炎細胞浸潤、纖維芽細胞及血管內皮細胞等。於術後第14日，下部組織為肉芽‧結疤組織，從其上部之皮膚斷端，有再生上皮伸展。潰瘍底部富含細胞成分、毛細血管，深層部位的細胞成分減少且結疤持續成熟。本結果與市售人造真皮TERUDERMIS的結果相同。
[實施例8]
(使用交聯劑製備添加DNA之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之製備例)
與實施例1使用者同樣，使用來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白製備多孔體。亦即，於試管量取來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白，使配合比(重量比)為膠原蛋白/彈力蛋白=8：2。於此混合膠原蛋白/彈力蛋白粉末加入去離子水，於冷藏下(3℃)攪拌，得到濃度5%之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液。於來自鮭魚雄魚生殖腺之DNA加入去離子水，於冷藏下(3℃)攪拌，得到濃度5%之DNA溶液。
對於先前製備之濃度5%之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液，添加濃度5%之DNA溶液，使重量比為8：2，於冷藏下(3℃)攪拌，得到添加DNA之膠原蛋白/彈力蛋白混合液。對於此添加DNA之膠原蛋白/彈力蛋白混合液，加入EDC(交聯劑：1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride、東京化成(股))水溶液並混合(對於膠原蛋白、彈力蛋白及DNA之總重量，添加EDC使為20%(w/w))。將添加有EDC之添加DNA之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液流入目的形狀之模型，冷凍乾燥得到添加DNA之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體。將得到的添加DNA之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體以離子交換水清洗。清洗後，使含水狀態之添加DNA之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體冷凍乾燥，得到添加DNA之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體。
以掃描式電子顯微鏡(JEOL製，JSM－6380LV，以下稱為SEM)觀察得到的添加DNA之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之構造，結果孔大小為約100μm，孔徑為一致(參照圖10)。
[實施例9]
(使用交聯劑製備添加魚精蛋白之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之製備例)
與實施例1使用者同樣，使用來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白製備多孔體。亦即，於試管量取來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白，使配合比(重量比)為膠原蛋白/彈力蛋白=8：2。於此混合膠原蛋白/彈力蛋白粉末加入去離子水，於冷藏下(3℃)攪拌，得到濃度5%之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液。於鮭魚雄魚生殖腺來源的魚精蛋白加入去離子水，於冷藏下(3℃)攪拌，得到濃度5%之魚精蛋白溶液。對於先前製備之濃度5%之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液，添加濃度5%之魚精蛋白溶液，使重量比為8：2，於冷藏下(3℃)攪拌，得到添加魚精蛋白之膠原蛋白/彈力蛋白混合液。對於此添加魚精蛋白之膠原蛋白/彈力蛋白混合液，添加EDC(交聯劑：1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride、東京化成(股))水溶液並混合(對於膠原蛋白、彈力蛋白及魚精蛋白之總重量，添加EDC使為20%(w/w))。將添加有EDC之添加魚精蛋白之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液流入目的形狀之模型，冷凍乾燥得到添加魚精蛋白之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體。將得到的添加魚精蛋白之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體以離子交換水清洗。清洗後，使含水狀態之添加魚精蛋白之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體冷凍乾燥，得到添加魚精蛋白之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體。
以掃描式電子顯微鏡(JEOL製，JSM－6380LV，以下稱為SEM)觀察得到的添加魚精蛋白之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之構造，結果孔的大小為約100μm，孔徑為一致(參照圖11)。
[實施例10]
(使用交聯劑製備添加羥基磷灰石之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之製備例)
與實施例1使用者同樣，使用來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白製備多孔體。亦即，於試管量取來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白，使配合比(重量比)為膠原蛋白/彈力蛋白=8：2。於此混合膠原蛋白/彈力蛋白粉末加入去離子水，於冷藏下(3℃)攪拌，得到濃度5%之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液。對於製備之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液，加入羥基磷灰石(以下，稱為HA)，使膠原蛋白與彈力蛋白之合計重量與HA之重量比為8：2，於冷藏下(3℃)混合。對此添加HA之膠原蛋白/彈力蛋白混合液，加入EDC(交聯劑：1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride、東京化成(股))水溶液並混合(對於膠原蛋白與彈力蛋白之總重量，添加EDC使為20%(w/w))。將添加有EDC之添加HA之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液流入目的形狀之模型，冷凍乾燥得到添加HA之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體。將得到的添加HA之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體以離子交換水清洗。清洗後，使含水狀態之添加HA之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體冷凍乾燥，得到添加HA之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體。
以掃描式電子顯微鏡(JEOL製，JSM－6380LV，以下稱SEM)觀察得到的添加HA之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之構造，結果孔大小為約100μm(參照圖12)。
[實施例11]
(膠原蛋白/彈力蛋白多孔體於軟骨再生領域之利用)
使用與實施例2以同樣方法製備之來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體(直徑11mm×厚度5mm)。將在培養液中經脱氣處置之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體設置於10cm培養皿。其次，將培養的軟骨細胞從培養瓶回收並計數細胞數，將5×106 個再懸浮於500μL之培養液中，作為細胞培養液。使此細胞培養液滲入膠原蛋白/彈力蛋白多孔體，於培養箱內開始培養。又，於12小時後將培養液10mL注入培養皿。3日或4日更換培養液一次。培養後第18日回收組織，將其以福馬林固定後，包埋在石蠟塊並薄切，作成組織切片。將組織切片進行蘇木素-伊紅染色、亞爾襄藍染色、甲苯胺藍染色、利用II型膠原蛋白抗體之免疫染色。
由亞爾襄藍染色(圖13)及甲苯胺藍染色(圖14)，細胞周圍的基質被濃染，故認為係含多量軟骨素硫酸或玻尿酸等酸性黏多糖類之軟骨基質。又，甲苯胺藍染色觀察到軟骨細胞特徵的染色變化性(metachromasy)。又，利用將軟骨基質特徵含有之II型膠原蛋白染色以II型膠原蛋白抗體所為之免疫染色也係濃染，確認細胞周邊產生軟骨基質(圖15)。由以上結果，暗示膠原蛋白/彈力蛋白多孔體成為軟骨細胞培養基材(Scaffold)或軟骨再生基材。
[實施例12]
(膜狀之來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白複合體之製備)
與實施例1使用者同樣，使用來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白製備膜。亦即，於試管量取去端肽膠原蛋白與水溶性彈力蛋白，使配合比(重量比)為膠原蛋白/彈力蛋白=8：2。於此混合膠原蛋白/彈力蛋白粉末加入去離子水，得到濃度20%之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液。於製備的膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液加入EDC(交聯劑：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride、東京化成(股))水溶液並混合(相對於膠原蛋白與彈力蛋白之總重量添加EDC使為0.5%(w/w))。將添加有EDC之此混合溶液塗佈在聚丙烯製片材上，將其在放有乾燥劑之乾燥器內靜置，使乾燥固化(以上操作於5℃以下進行)。乾燥固化後，將膜狀膠原蛋白/彈力蛋白複合體於減壓下，於180℃進行1小時間加熱處理。
將得到的膜狀膠原蛋白/彈力蛋白複合體浸泡於水，結果保持著形狀於一週以上(圖16)。
[實施例13]
(利用膠原蛋白/彈力蛋白複合體作為化粧品基材)
將受試者(20幾歲～30幾歲的男性4名)的左前腕以肥皂充分清洗，水洗後將手擦乾。清洗30分鐘後，於左前腕內側3處測定器探針觸及的地方做記號。做記號的部位的黏彈性，以皮膚黏彈性測定裝置Cutometer MPA 580(Courage+Khazaka社、測定模式1)測定(塗佈前：0時)。0時測定後，於各受試者的3處的記號當中，1處貼附充份滲入市售化粧水的片狀膠原蛋白/彈力蛋白多孔體，並放置15分鐘。又，片狀膠原蛋白/彈力蛋白多孔體係與實施例2以同樣方式製備。15分鐘後，剝開含化粧水的膠原蛋白/彈力蛋白多孔體(簡稱CES+化粧水塗佈)，同時於做記號的另一處，塗佈化粧水。同樣對於全部4名的受試者，作成無塗佈部、化粧水塗佈部、CES+化粧水塗佈部。塗佈2小時後，與上述以同樣方式測定做記號的部位的皮膚黏彈性。
比較各部的塗佈前後的皮膚黏彈性值(R7值)的差異，CES+化粧水塗佈部比起無塗佈部，皮膚黏彈性顯著上升(圖17)。又，CES+化粧水塗佈部肉眼觀察未認為有異常。如以上，膠原蛋白/彈力蛋白多孔體提高化粧品之效果，故可作為化粧品基材使用。
[實施例14]
(膜狀之來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白複合體之製備(2))
與實施例1使用者同樣，使用來自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白製備膜。亦即，於試管中量取去端肽膠原蛋白與水溶性彈力蛋白，使配合比(重量比)為膠原蛋白/彈力蛋白=8：2。於此混合膠原蛋白/彈力蛋白粉末加入去離子水，製得濃度20%之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶液。將此混合溶液塗佈在聚丙烯製片材上，將其靜置在放有乾燥劑的乾燥箱內，使乾燥(以上操作於5℃以下進行)。乾燥固化後，將膜狀膠原蛋白/彈力蛋白複合體於減壓下於180℃進行1小時加熱處理，製備膜狀之膠原蛋白/彈力蛋白之交聯物。
將得到的膜狀膠原蛋白/彈力蛋白複合體浸泡於水，結果於水中保持形狀1週以上(圖18)。
圖1顯示實施例1之來自魚類去端肽膠原蛋白細胞毒性試驗結果之圖(絲裂黴素C(細胞毒性物質；協和醱酵KIRIN有限公司販售)。
圖2表示實施例1之來自魚類水溶性彈力蛋白細胞毒性試驗結果之圖(絲裂黴素C(細胞毒性物質；協和醱酵KIRIN有限公司販售)。
圖3顯示實施例2之使用交聯劑之來自魚類膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之掃瞄式電子顯微鏡圖像(SEM圖像：200倍)。
圖4顯示實施例3之使用熱交聯之來自魚類膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之掃瞄式電子顯微鏡圖像(SEM圖像：200倍)。
圖5顯示實施例4之添加彈力蛋白於膠原蛋白所製成多孔體之斷裂強度之圖。
圖6顯示實施例4之添加彈力蛋白於膠原蛋白所製成多孔體之斷裂距離之圖。
圖7顯示實施例6之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體埋入大鼠皮下第56日之組織圖像(巨觀圖像)。
圖8顯示實施例7之創傷面積變化之圖(剛手術後之創傷面積定為100%)。
圖9顯示實施例7之樣品組之創傷狀態圖(手術後第14日)。
圖10顯示實施例8之使用交聯劑之DNA添加膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之掃瞄式電子顯微鏡圖像(SEM圖像：100倍)。
圖11顯示實施例9之使用交聯劑之添加魚精蛋白之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之掃瞄式電子顯微鏡圖像(SEM圖像：100倍)。
圖12顯示實施例10之使用交聯劑之添加羥基磷灰石之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之掃瞄式電子顯微鏡圖像(SEM圖像：100倍)。
圖13顯示實施例11之使用膠原蛋白/彈力蛋白多孔體當做細胞培養基礎材料所培養組織之亞爾襄藍(Alcian blue)染色結果圖。
圖14顯示實施例11之使用膠原蛋白/彈力蛋白多孔體當做細胞培養基礎材料所培養組織之甲苯胺藍(Toluidine blue)染色結果圖。
圖15顯示實施例11之使用膠原蛋白/彈力蛋白多孔體當做細胞培養基礎材料所培養組織之以II型膠原蛋白抗體進行免疫染色之結果圖。
圖16顯示實施例12之膜狀膠原蛋白/彈力蛋白複合物(含水狀態)之照相圖像。
圖17顯示實施例13之皮膚黏彈性測定結果之圖(n=4、與CES+化粧水塗佈組之比較；t檢定：＊＊p<0.01、＊p<0.05)。
圖18顯示實施例14之膜狀膠原蛋白/彈力蛋白複合物(含水狀態)之照相圖像。

Claims (41)

  1. 一種多孔體交聯物，其特徵在於：藉由具有以下步驟的製造方法獲得：製備將來自魚類之膠原蛋白與重量平均分子量為1萬~10萬之來自魚類之彈力蛋白於0~10℃溶解而得之溶液；於5℃以下的溫度從該溶液獲得乾燥物；將該乾燥物進行交聯並形成交聯物；且該來自魚類之膠原蛋白與來自魚類的彈力蛋白的混合比例為8：2~5：5。
  2. 如申請專利範圍第1項之多孔體交聯物，其中，該魚類為屬於鮭科(Salmonidae)、鯖科(Scombridae)、鰺科(Carangidae)、鱈科(Gadidae)或六線魚科(Hexagrammidae)之魚類。
  3. 如申請專利範圍第2項之多孔體交聯物，其中，該交聯物之機械強度較膠原蛋白單體之交聯物提升。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之多孔體交聯物，其中，該交聯物係以孔徑50~100μm的多孔體的狀態獲得。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之多孔體交聯物，其中，該溶液含有交聯劑。
  6. 如申請專利範圍第5項之多孔體交聯物，其中，該交聯物之交聯形成及乾燥之步驟以冷凍乾燥進行。
  7. 如申請專利範圍第5項之多孔體交聯物，更包含DNA及魚精蛋白至少其中之一。
  8. 如申請專利範圍第6項之多孔體交聯物，更包含DNA及魚精蛋白至少其中之一。
  9. 如申請專利範圍第5項之多孔體交聯物，更包含磷酸鈣。
  10. 如申請專利範圍第6項之多孔體交聯物，更包含磷酸鈣。
  11. 如申請專利範圍第7項之多孔體交聯物，更包含磷酸鈣。
  12. 如申請專利範圍第5項之多孔體交聯物，其係以薄膜(膜)狀態製得。
  13. 如申請專利範圍第6項之多孔體交聯物，其係以薄膜(膜)狀態 製得。
  14. 如申請專利範圍第7項之多孔體交聯物，其係以薄膜(膜)狀態製得。
  15. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之多孔體交聯物，其中，該乾燥係利用冷凍乾燥獲得。
  16. 如申請專利範圍第1項之多孔體交聯物，更包含DNA及魚精蛋白至少其中之一。
  17. 如申請專利範圍第15項之多孔體交聯物，更包含DNA及魚精蛋白至少其中之一。
  18. 如申請專利範圍第1項之多孔體交聯物，更包含磷酸鈣。
  19. 如申請專利範圍第16項之多孔體交聯物，更包含磷酸鈣。
  20. 如申請專利範圍第17項之多孔體交聯物，更包含磷酸鈣。
  21. 如申請專利範圍第1項之多孔體交聯物，其係以薄膜(膜)狀態製得。
  22. 如申請專利範圍第16項之多孔體交聯物，其係以薄膜(膜)狀態製得。
  23. 如申請專利範圍第17項之多孔體交聯物，其係以薄膜(膜)狀態製得。
  24. 一種多孔體交聯物之製造方法，其特徵在於：具有以下步驟：製備將來自魚類之膠原蛋白與重量平均分子量為1萬~10萬之來自魚類之彈力蛋白於0~10℃溶解而得之溶液；於5℃以下的溫度從該溶液獲得乾燥物；將該乾燥物進行交聯並形成多孔體交聯物；且該來自魚類之膠原蛋白與來自魚類的彈力蛋白的混合比例為8：2~5：5。
  25. 如申請專利範圍第24項之多孔體交聯物之製造方法，其中，該乾燥係利用冷凍乾燥獲得。
  26. 如申請專利範圍第24項之多孔體交聯物之製造方法，其中，該交聯物係以孔徑50~100μm的多孔體的狀態獲得。
  27. 如申請專利範圍第24至26項中任一項之多孔體交聯物之製造方法，其中，該溶液含有交聯劑。
  28. 如申請專利範圍第24至26項中任一項之多孔體交聯物之製造方法，其中，該交聯物之交聯形成及乾燥步驟係利用冷凍乾燥進行。
  29. 如申請專利範圍第24至26項中任一項之多孔體交聯物之製造方法，其中，該交聯物係以薄膜或膜狀態製得。
  30. 如申請專利範圍第24至26項中任一項之多孔體交聯物之製造方法，其中，該交聯物之機械強度能夠較膠原蛋白單體之交聯物提升。
  31. 如申請專利範圍第24至26項中任一項之多孔體交聯物之製造方法，該溶液更包含DNA及魚精蛋白至少其中之一。
  32. 如申請專利範圍第24至26項中任一項之多孔體交聯物之製造方法，更包含磷酸鈣。
  33. 一種醫療用材料，其特徵在於：包含如申請專利範圍第1至23項中任一項之多孔體交聯物。
  34. 如申請專利範圍第33項之醫療用材料，其係人造真皮。
  35. 如申請專利範圍第33項之醫療用材料，其係軟骨再生基材。
  36. 如申請專利範圍第33項之醫療用材料，其係骨再生基材。
  37. 如申請專利範圍第36項之醫療用材料，其係載持骨形成因子或骨成長因子。
  38. 一種細胞培養基礎材料，其係包含如申請專利範圍第1至23項中任一項之多孔體交聯物。
  39. 如申請專利範圍第38項之細胞培養基礎材料，其係適合培養軟骨細胞。
  40. 如申請專利範圍第38項之細胞培養基礎材料，其係適合培養骨細胞。
  41. 一種化粧品基材，其特徵在於：包含如申請專利範圍第1至23項中任一項之多孔體交聯物。
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