JP5060653B2 - エラスチン及びコラーゲンを用いた架橋物及びその用途 - Google Patents
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Description
・グリシン:35〜45%
・アラニン:10〜20%
・バリン:3〜8%
・イソデスモシン:0.1〜1.0%
・デスモシンが0.1〜1.0%
・非極性アミノ酸の合計が67〜77%
なお、上記のアミノ酸組成において分析対象のアミノ酸は、グリシン(Gly)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ileu)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、リシン(Lys)、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、ヒドロキシリジン(Hylys)、システイン(Cys)、メチオニン(Met)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)、プロリン(Pro)、ヒドロキシプロリン(Hypro)、イソデスモシン(Iso-Des)及びデスモシン(Des)である。上記のグリシン、アラニン、バリン、イソデスモシン、デスモシン以外のアミノ酸の含有率(mol%)の一例を以下にあげる。
・ロイシン:3.4〜4.5
・イソロイシン:0.9〜1.9
・セリン:3.1〜3.4
・トレオニン:3.1〜6.5
・アスパラギン酸:1.6〜2.9
・グルタミン酸:3.2〜4.3
・リシン:0.7〜1.5
・アルギニン:1.6〜2.6
・ヒスチジン:0.2〜0.8
・ヒドロキシリジン:0
・システイン:0〜0.2
・メチオニン:0.4〜0.7
・チロシン:3.4〜4.4
・フェニルアラニン:1.1〜3.1
・プロリン:8.6〜10.1
・ヒドロキシプロリン:0.5〜0.9
一方、コラーゲンとしても魚類由来のものを用いる。コラーゲン調製用の魚類として、サケ、マス等のサケ目サケ科、マグロ、カツオ等のスズキ目・サバ科、ブリ等のスズキ目・アジ科、マダラ、スケトウダラ等のタラ目タラ科などを挙げることができる。コラーゲンとしては、エラスチンとの架橋物の形成において、均質な架橋物を得る上では、可溶性(水溶性)コラーゲンが好ましい。魚類からのコラーゲンの調製は、常法により行うことができる。ところでコラーゲンの両端には、コラーゲンの主たる抗原部位であるテロペプチドが存在する。この部分を酵素処理で取り外すと、コラーゲンの抗原性が極端に低くなる。このようなコラーゲンをアテロコラーゲンと呼び、医療用のインプラント材料や組織工学用の足場材料に応用されている。本発明に用いる可溶性コラーゲンとしては、魚類由来のアテロコラーゲンがより好ましい。
・グリシン:34〜40%
・プロリン:5.0〜11.0%
・ヒドロキシプロリン:4.0〜8.0%
・ヒスチジン:0.8〜2.0%
なお、上記のアミノ酸組成において分析対象のアミノ酸は、グリシン(Gly)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ileu)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、アスパアラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、リシン(Lys)、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、ヒドロキシリジン(Hylys)、システイン(Cys)、メチオニン(Met)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)、プロリン(Pro)及びヒドロキシプロリン(Hypro)である。
・アラニン:10.5〜15.0
・バリン:1.1〜2.2
・ロイシン:1.5〜2.3
・イソロイシン:0.5〜1.1
・セリン:3.5〜6.3
・トレオニン:2.1〜3.6
・アスパアラギン酸:4.3〜5.3
・グルタミン酸:7.4〜9.5
・リシン:2.4〜2.9
・アルギニン:4.9〜5.5
・ヒドロキシリジン:0.5〜0.8
・システイン:0〜0.2
・メチオニン:0.3〜1.7
・トリプトファン:0
・チロシン:0.2〜0.3
・フェニルアラニン:1.1〜1.4
エラスチンとコラーゲンの架橋物の形成には、架橋剤を用いてもよい。特に、架橋物に強度安定性が求められる場合には、架橋剤を用いておくことが好ましい。架橋剤としては、これらを架橋できるものであればよい。例えば、カルボジイミド系、アジド系、フルオロホスフェート系、トリアジン系、エポキシ系の架橋剤(縮合剤)などを挙げることができる。また縮合助剤を用いてもよく、N-ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類、N-ヒドロキシトリアゾール類、トリアジン類、及び2−ヒドロキシイミノ−2−シアノ酢酸エチルエステル等が挙げられる。これらの縮合剤および縮合助剤としては、医療用材料として用いる場合は残留性や毒性が低いものを選択することが望ましい。
(A)魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンをエラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程。
(B)工程(A)で得られた溶液からエラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で架橋物を得る工程。
(B−1)エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で、工程(A)で得られた溶液に架橋剤を加えて凍結乾燥中に架橋を形成させて架橋物を得る工程。
(B−2)工程(A)で得られた溶液をエラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で乾燥させて得た乾燥物を架橋させる工程。
(魚類由来のアテロコラーゲン及び水溶性エラスチンの細胞毒性試験)
試料としてサケ皮由来のアテロコラーゲン、サケ心臓由来の水溶性エラスチンを用いた。評価細胞は皮膚マトリックス内の主体をなすヒト皮膚正常線維芽細胞を用いた。細胞毒性試験は、WST-1アッセイにて実施した。WST-1アッセイは、細胞内のミトコンドリアの働きによりWST−1が分解されて生成するホルマザン(Formazan)を比色定量(測定波長450nm)し、その吸光度が生細胞数と相関することを利用して生細胞数を測定する当業者において周知の方法である。得られた結果を図1及び図2に示す。いずれのサンプルも0.1〜10μg/mLの濃度において細胞生存率が高く、細胞毒性を示さないことが確認された。
(架橋剤を用いた魚類由来コラーゲン/エラスチン多孔体の調製例)
実施例1で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわち鮭皮由来アテロコラーゲンと鮭心臓由来水溶性エラスチンの配合比(重量比)がコラーゲン/エラスチン=8:2となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン/エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下(3℃)攪拌して濃度5%のコラーゲン/エラスチン混合溶液を得た。調製したコラーゲン/エラスチン混合溶液に冷蔵下(3℃)でEDC(架橋剤:1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride、東京化成(株))水溶液を加えて混合した(コラーゲンとエラスチンの総重量に対してEDCが20%(w/w)となるように添加した)。EDCを添加したコラーゲン/エラスチン混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、コラーゲン/エラスチン多孔体を得た。得られたコラーゲン/エラスチン多孔体をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、含水状態のコラーゲン/エラスチン多孔体を凍結乾燥させ、コラーゲン/エラスチン多孔体を得た。
(熱架橋を用いた魚類由来コラーゲン/エラスチン多孔体の調製例)
実施例1で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわち鮭皮由来アテロコラーゲンと鮭心臓由来水溶性エラスチンの配合比(重量比)がコラーゲン/エラスチン=7:3となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン/エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下(3℃)攪拌して濃度10%のコラーゲン/エラスチン混合溶液を得た。該混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、凍結乾燥物を得た。該凍結乾燥物を減圧下で150度、24時間熱架橋を行い、コラーゲン/エラスチン多孔体を得た。得られた多孔体を水中に入れたところ1週間以上形状を保持していた。得られたコラーゲン/エラスチン多孔体の構造を走査型電子顕微鏡(JEOL製,JSM-6380LV,以下SEM)により観察した結果、孔の大きさは50〜100μmであり、孔径は揃っていた(図4参照)。
サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて、実施例2と同様の架橋方法で、コラーゲン100%の多孔体、コラーゲンに対し20%(w/w)のエラスチンを添加した多孔体、コラーゲンに対し40%(w/w)のエラスチンを添加した多孔体をそれぞれ同一の大きさ及び形状(直径12mm厚さ6mmの円柱状)となるように調製した(コラーゲンとエラスチンの合計濃度は5%とした)。これらの多孔体を水中に24時間放置して、膨潤状態のゲルとした。このゲルの機械的強度をREOMETER(製造販売:(株)サン科学)で測定した。その結果、エラスチンを添加することでコラーゲン単体(エラスチン含有率0%)の場合より、ゲルの破断強度、およびゲルの柔軟性を示す値である破断距離が長くなった(図5、図6参照)。また比較対照として哺乳動物由来のコラーゲンを使用した市販されている人工真皮を上記と同じ分析条件で測定したところ、強度が弱く破断距離は測定できなかった。
(魚類由来コラーゲン/エラスチン多孔体のスキャホールド(細胞培養足場材)としての評価)
実施例2と同じ方法で調製した魚類由来コラーゲン/エラスチン多孔体(径11mm×厚さ3mm)を用いた。評価用の細胞として、WFB(WKAラットの線維芽細胞不死化株)、ヒト皮膚正常線維芽細胞を用いた。コラーゲン/エラスチン多孔体をエチレンオキサイドガス滅菌し、脱気処置した多孔体を12穴培養プレートに置いた。次に細胞含培養液(細胞濃度5×105個/mL)を1mLずつ各スポンジに染み込ませたのち、1mLの培養液を注ぎ、これを3、4日ごとに培養液を交換して培養した。細胞の生存確認と組織学的評価を培養後14,28日目に実施した。細胞の生存確認はWST−1アッセイの変法を用いた。すなわち培養プレートに接着した細胞を除去し、多孔体に生着した細胞のみを測定するため、多孔体を新しい培養プレートに移した。2〜3mLのWST−1液−培養液(1:10)を新しい培養プレートに注ぎ、そのまま4時間反応させて、吸光度をプレートリーダーで測定した。組織学的評価はコラーゲン/エラスチン多孔体をホルマリン固定し、これをパラフィンブロックに包埋し、薄切後にヘマトキシリン−エオジン染色して実施した。
(魚類由来コラーゲン/エラスチン多孔体の生体内(ラット皮下)への埋め込み試験)
実施例2と同じ方法で調製した魚類由来コラーゲン/エラスチン多孔体(径11mm×厚さ5mm)を用いた。Wister系ラット(4週齢、200g前後、メス)にエーテルで麻酔をかけ、背部の毛をバリカンで剃り落とした。剪刀にて背部皮膚を約1cm切開し、皮下(肉様膜下)に直径約1cmのポケットを作成後、エチレンオキサイドガス滅菌した多孔体を埋入し、ナイロン糸で縫合閉創した。手術日より3、7、14、21、28、56日目にラットを計画屠殺し、多孔体を埋入した部分を生検した。組織をホルマリン固定した後、パラフィン標本とした。これをヘマトキシリン-エオジン染色して、生体適合性を評価した。
(ラット皮膚欠損創への魚類由来コラーゲン/エラスチン多孔体の移植試験)
実施例2と同じ方法で魚類由来コラーゲン/エラスチン多孔体(径20mm×厚さ5mm)を調製し、サンプル群はこれを移植材料とした。コントロール群には市販されているコラーゲン使用人工真皮であるテルダーミス(コラーゲン単層タイプ、テルモ製)を移植材料として用いた。Wister系ラットにエーテルで麻酔をかけ、背部に直径15mmほどの皮膚欠損創を作成し、欠損創に移植材料を置き、ドレッシング保護材で欠損創と移植材料を完全に覆い、ドレッシング保護材と皮膚断端をナイロン糸で縫合した。移植材料と下床を密着させるためガーゼで軽く圧迫し、さらに伸縮性バンドで圧迫固定した。移植材料なしのOPEN WOUND群、移植材料として魚類由来コラーゲン/エラスチン多孔体を用いたサンプル群、移植材料としてテルダーミスを用いたコントロール群の3群を作成し、同様の処置を各群5匹行った。
(架橋剤を用いたDNA添加コラーゲン/エラスチン多孔体の調製例)
実施例1で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわちサケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンの配合比(重量比)がコラーゲン/エラスチン=8:2となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン/エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下(3℃)攪拌して濃度5%のコラーゲン/エラスチン混合溶液を得た。サケ白子由来DNAに脱イオン水を加えて、冷蔵下(3℃)攪拌して濃度5%のDNA溶液を得た。
(架橋剤を用いたプロタミン添加コラーゲン/エラスチン多孔体の調製例)
実施例1で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわちサケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンの配合比(重量比)がコラーゲン/エラスチン=8:2となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン/エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下(3℃)攪拌して濃度5%のコラーゲン/エラスチン混合溶液を得た。サケ白子由来プロタミンに脱イオン水を加えて、冷蔵下(3℃)攪拌して濃度5%のプロタミン溶液を得た。先に調製した濃度5%のコラーゲン/エラスチン混合溶液に対し、濃度5%のプロタミン溶液を重量比が8:2となるように添加し、冷蔵下(3℃)攪拌してプロタミン添加コラーゲン/エラスチン混合液を得た。このプロタミン添加コラーゲン/エラスチン混合液に対し、EDC(架橋剤:1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride、東京化成(株))水溶液を加えて混合した(コラーゲン、エラスチンおよびプロタミンの総重量に対してEDCが20%(w/w)となるように添加した)。EDCを添加したプロタミン添加コラーゲン/エラスチン混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、プロタミン添加コラーゲン/エラスチン多孔体を得た。得られたプロタミン添加コラーゲン/エラスチン多孔体をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、含水状態のプロタミン添加コラーゲン/エラスチン多孔体を凍結乾燥させ、プロタミン添加コラーゲン/エラスチン多孔体を得た。
(架橋剤を用いたヒドロキシアパタイト添加コラーゲン/エラスチン多孔体の調製例)
実施例1で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわちサケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンの配合比(重量比)がコラーゲン/エラスチン=8:2となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン/エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下(3℃)攪拌して濃度5%のコラーゲン/エラスチン混合溶液を得た。調製したコラーゲン/エラスチン混合溶液に対し、コラーゲンとエラスチンの合計重量とヒドロキシアパタイト(以下、HA)の重量比が8:2となるようにHAを加え、冷蔵下(3℃)で錬和した。このHA添加コラーゲン/エラスチン混合液に対し、EDC(架橋剤:1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride、東京化成(株))水溶液を加えて混合した(コラーゲンとエラスチンの総重量に対してEDCが20%(w/w)となるように添加した)。EDCを添加したHA添加コラーゲン/エラスチン混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、HA添加コラーゲン/エラスチン多孔体を得た。得られたHA添加コラーゲン/エラスチン多孔体をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、含水状態のHA添加コラーゲン/エラスチン多孔体を凍結乾燥させ、HA添加コラーゲン/エラスチン多孔体を得た。
(コラーゲン/エラスチン多孔体の軟骨再生分野での利用)
実施例2と同じ方法で調製した魚類由来コラーゲン/エラスチン多孔体(直径11mm×厚さ5mm)を用いた。培養液中で脱気処置したコラーゲン/エラスチン多孔体を10cm培養皿に設置した。次に培養した軟骨細胞を培養フラスコから回収して細胞数を数え、5×106個を500μLの培養液中に再懸濁し、細胞培養液とした。この細胞培養液をコラーゲン/エラスチン多孔体に染み込ませ、インキュベーター内で培養を開始した。さらに12時間後に培養液10mLを培養皿に注いだ。3日または4日に一度培養液を交換した。培養後18日目に組織を回収し、これをホルマリン固定した後、パラフィンブロックに包埋・薄切し、組織切片を作成した。組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色、アルシアンブルー染色、トルイジンブルー染色、II型コラーゲン抗体による免疫染色を行った。
(フィルム状の魚類由来コラーゲン/エラスチン複合体の調製)
実施例1で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて膜を調製した。すなわちアテロコラーゲンと水溶性エラスチンの配合比(重量比)がコラーゲン/エラスチン=8:2となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン/エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、濃度20%のコラーゲン/エラスチン混合溶液を得た。調製したコラーゲン/エラスチン混合溶液にEDC(架橋剤:1‐Ethyl‐3‐(3-dimethylaminopropyl)‐carbodiimide hydrochloride、東京化成(株))水溶液を加えて混合した(コラーゲンとエラスチンの総重量に対してEDCが0.5%(w/w)となるように添加した)。EDCを添加したこの混合溶液をポリプロピレン製のシート上に塗布し、これを乾燥剤入りのデシケータ内に静置し、乾燥・固化させた(以上の操作を5℃以下で行った)。乾燥・固化後、フィルム状のコラーゲン/エラスチン複合体を減圧下で、180℃で1時間加熱処理を行った。
(コラーゲン/エラスチン複合体の化粧品基材として利用)
被験者(20代〜30代の男性4名)の左前腕を石鹸でよく洗浄し、水洗したのち手を拭き乾かした。洗浄30分後、左前腕内側3箇所に測定器のプローブを当てる場所に印をつけた。印をつけた部位の粘弾性を皮膚粘弾性測定装置 キュートメーター MPA580(Courage+Khazaka社、測定モード1)で測定した(塗布前:0時)。0時測定後、各被験者の3箇所の印のうち、1箇所に市販化粧水を十分に染み込ませたシート状のコラーゲン/エラスチン多孔体を貼り付け、15分間放置した。なおシート状のコラーゲン/エラスチン多孔体は実施例2と同様に調製した。15分後、化粧水を含ませたコラーゲン/エラスチン多孔体(CES+化粧水塗布と略)を剥がすと同時に、印をつけた別の1箇所に化粧水を塗布した。同様にして全4名の被験者に対し、塗布なし部、化粧水塗布部、CES+化粧水塗布部を作成した。塗布2時間後、印をつけた部位の皮膚粘弾性を上述と同様に測定した。
(フィルム状の魚類由来コラーゲン/エラスチン複合体の調製(2))
実施例1で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて膜を調製した。すなわちアテロコラーゲンと水溶性エラスチンの配合比(重量比)がコラーゲン/エラスチン=8:2となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン/エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、濃度20%のコラーゲン/エラスチン混合溶液とした。この混合溶液をポリプロピレン製のシート上に塗布し、これを乾燥剤入りのデシケータ内に静置し、乾燥させた(以上の操作を5℃以下で行った)。乾燥・固化後、フィルム状のコラーゲン/エラスチン複合体を減圧下で、180℃で1時間、加熱処理を行い、フィルム状のコラーゲン/エラスチンの架橋物を調製した。
Claims (23)
- 魚類由来のコラーゲンと重量平均分子量が1万〜10万である魚類由来のエラスチンを0〜10℃で溶解させた溶液を調製する工程と、
5℃以下の温度において該溶液から乾燥物を得る工程と、
該乾燥物を架橋して架橋物を形成する工程と、
を有する製造方法により得られ、
かつ、魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンとの混合割合が、8:2〜5:5である
ことを特徴とする多孔体架橋物。 - 前記乾燥物が、凍結乾燥によって得られる請求項1に記載の多孔体架橋物。
- 前記架橋物が、コラーゲン単体の架橋物より機械的強度を高めた請求項1または2に記載の多孔体架橋物。
- 前記溶液が、DNA及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項1乃至3のいずれか1項に記載の多孔体架橋物。
- リン酸カルシウムを更に含む請求項1乃至4のいずれか1項に記載の多孔体架橋物。
- 前記架橋物が、孔径が50〜100μmの多孔体として得られる請求項1乃至5のいずれか1項に記載の多孔体架橋物。
- 前記架橋物がフィルムまたは膜として得られる請求項1乃至5のいずれか1項に記載の多孔体架橋物。
- 魚類由来のコラーゲンと重量平均分子量が1万〜10万である魚類由来のエラスチンを0〜10℃で溶解させた溶液を調製する工程と、
5℃以下の温度において該溶液から乾燥物を得る工程と、
該乾燥物を架橋して多孔体架橋物を形成する工程と、
を有し、
魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンとの混合割合が、8:2〜5:5である
ことを特徴とする多孔体架橋物の製造方法。 - 前記乾燥物が凍結乾燥によって得られる請求項8に記載の多孔体架橋物の製造方法。
- 前記架橋物が、孔径が50〜100μmの多孔体として得られる請求項8または9に記載の多孔体架橋物の製造方法。
- 前記架橋物がフィルムまたは膜として得られる請求項8または9に記載の多孔体架橋物の製造方法。
- 前記架橋物が、コラーゲン単体より機械的強度を高めることが可能な請求項8乃至11のいずれか1項に記載の多孔体架橋物の製造方法。
- 前記溶液が、DNA及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項8乃至12のいずれか1項に記載の多孔体架橋物の製造方法。
- リン酸カルシウムを更に含む請求項8乃至13のいずれか1項に記載の多孔体架橋物の製造方法。
- 請求項1乃至7のいずれか1項に記載の多孔体架橋物を含むことを特徴とする医療用材料。
- 人工真皮である請求項15に記載の医療用材料。
- 軟骨再生基材である請求項15に記載の医療用材料。
- 骨再生基材である請求項15に記載の医療用材料。
- 骨形成因子または骨成長因子を担持させた請求項18に記載の医療用材料。
- 請求項1乃至7のいずれか1項に記載の多孔体架橋物を含むことを特徴とする細胞培養足場材。
- 軟骨細胞の培養に適した請求項20に記載の細胞培養足場材。
- 骨細胞の培養に適した請求項20に記載の細胞培養足場材。
- 請求項1乃至7のいずれか1項に記載の多孔体架橋物を含むことを特徴とする化粧品基材。
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KR102114300B1 (ko) * | 2018-04-16 | 2020-05-22 | 전남대학교 산학협력단 | 최소 침습 골연골 재생용 자기 구동 마이크로지지체 |
CN114146232B (zh) * | 2022-02-10 | 2022-04-19 | 天新福(北京)医疗器材股份有限公司 | 一种抗菌异构多孔膜及其制备方法 |
CN115747197B (zh) * | 2023-01-06 | 2023-04-21 | 中国肉类食品综合研究中心 | 可食用3d打印生物墨水及制备方法和在培育肉中的应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02167211A (ja) * | 1988-12-20 | 1990-06-27 | Sansho Seiyaku Co Ltd | 安定なエラスチン加水分解物水溶液 |
WO2002096978A1 (fr) * | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Keiichi Miyamoto | Elastine reticulee et son procede de production |
WO2006046626A1 (ja) * | 2004-10-29 | 2006-05-04 | Kyushu Institute Of Technology | 水溶性エラスチンとその製造方法及びそれを含む食品と医薬 |
JP2009502364A (ja) * | 2005-07-28 | 2009-01-29 | カーネギー メロン ユニバーシティ | 生体適合性ポリマーおよび使用方法 |
Family Cites Families (11)
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---|---|---|---|---|
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US20030039695A1 (en) * | 2001-08-10 | 2003-02-27 | Ed. Geistlich Soehne Ag Fuer Chemische Industrie | Collagen carrier of therapeutic genetic material, and method |
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FR2801313A1 (fr) * | 1999-05-19 | 2001-05-25 | Coletica | Produit collagenique contenant du collagene d'origine marine a faible odeur et de preference a proprietes mecaniques ameliorees, ainsi que son utilisation sous forme de compositions ou de produits cosmetiques ou pharmaceutiques |
DE10157182A1 (de) * | 2001-11-22 | 2003-06-05 | Matricel Gmbh | Verfahren zur Behandlung von Materialien biologischen Ursprungs und Elastin-Produkt |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02167211A (ja) * | 1988-12-20 | 1990-06-27 | Sansho Seiyaku Co Ltd | 安定なエラスチン加水分解物水溶液 |
WO2002096978A1 (fr) * | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Keiichi Miyamoto | Elastine reticulee et son procede de production |
WO2006046626A1 (ja) * | 2004-10-29 | 2006-05-04 | Kyushu Institute Of Technology | 水溶性エラスチンとその製造方法及びそれを含む食品と医薬 |
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Title |
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JPN6011042166; 本村亜矢子, et al.: 'サケ由来コラーゲンペプチドとエラスチンペプチドのヒト皮膚正常繊維芽細胞(SF-TY)におけるヒアルロ' 日本水産学会誌 Vol.75, No.1, 20090115, p.86-88 * |
JPN6011042167; 多田元比古, et al.: 'サケ由来エラスチン・コラーゲンペプチドの皮膚に対する効果' 日本農芸化学会2008年度(平成20年度)大会講演要旨集 , 2008, p.281 * |
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