KR101321615B1

KR101321615B1 - 엘라스틴 및 콜라겐을 사용한 가교물 및 그 용도

Info

Publication number: KR101321615B1
Application number: KR1020117025189A
Authority: KR
Inventors: 요시타카 마츠모토; 다카토시 요츠야나기; 신이치 스토; 요시후미 야마야; 요스케 호시노; 가즈나리 니시무라; 도모코 고가; 히로유키 에나리
Original assignee: 가부시키가이샤 마루하 니치로 쇼쿠힝; 고쿠리츠다이가쿠호징 히로사키다이가쿠; 훗카이도 코리츠 다이가쿠 호진 삿포르 이카 다이가쿠
Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2013-10-23
Also published as: EP2412795B1; EP2412795A1; JP5060653B2; EP2412795A4; KR20110139300A; JPWO2010110067A1; WO2010110067A1; US20120021063A1; TW201036653A; TWI433694B

Abstract

인공 진피를 포함하는 의료용 재료나 세포 배양의 베이스재 등의 여러 가지 용도에 충분히 대응 가능한 콜라겐/엘라스틴 가교물을 제공하는 것.
어류 유래의 콜라겐과 어류 유래의 엘라스틴을 가교함으로써 인공 진피를 포함하는 의료용 재료나 세포 배양의 베이스재 등의 여러 가지 용도에 충분히 대응 가능한 콜라겐/엘라스틴 가교물을 얻는다.

Description

엘라스틴 및 콜라겐을 사용한 가교물 및 그 용도 {CROSSLINKED MATERIAL COMPRISING ELASTIN AND COLLAGEN, AND USE THEREOF}

본 발명은 어류 유래의 엘라스틴 및 어류 유래의 콜라겐을 사용한 가교물 및 그 용도에 관한 것이다.

콜라겐을 사용한 창상 피복재나 인공 진피는 특허 2997823호 명세서, 특허 3772232호 명세서, 특허 3105308호 명세서 등에 개시되어, 실제로 시판되고 있는 것도 있다. 그러나 이것들에 사용되고 있는 콜라겐은 그 대부분이 소, 돼지 등의 가축의 조직으로부터 채취되고 있는데, 최근, BSE (우해면상뇌증) 문제가 현재화되어, 소가죽을 포함하는 포유 동물 유래의 원료를 사용한 콜라겐 제품에 의해, 인간에 대해 병원체가 감염될 위험성이 염려되고 있다.

이러한 배경 중에서, 생체 친화성이 높고, 세포 침입성이 양호하며, 상처 수축 억제가 일어나지 않고, 진피 유사 조직 형성 후에는 신속하게 생체 분해성을 나타내는, 소나 돼지 등의 포유 동물 유래 이외의 소재를 사용한 인공 진피의 개발이 요구되고 있었다. 어가죽 진피 콜라겐을 함유하는 발포체 시트 및 그 용도가 개시되어 있다 (일본 공개특허공보 2005-95331호).

그런데 콜라겐은 수용액 혹은 현탁액 중에서 열을 가하면 변성되어 젤라틴이 된다. 변성된 콜라겐은 물에 녹기 쉽고, 강도가 약하기 때문에, 생체 내의 단백질 분해 효소에 의해 분해되어, 생체에 흡수되기 쉬워져, 생체 내에서 적당한 안정성이 요구되는 의료용 재료로서는 부적합하다. 또한, 어류 유래의 콜라겐은 포유 동물 유래의 것과 비교하면 변성 온도가 낮고, 겔의 강도가 약하다는 결점이 있었다. 변성을 방지하기 위해 변성 온도 이하에서 반응시켜야 하지만, 저온하에서는 가교제의 종류에 따라서는 반응이 진행되지 않는다는 결점이 있었다.

한편, 엘라스틴은 인대나 피부 등 여러 가지 조직이나 기관에 있어서의 탄성 섬유의 주요 단백질로, 엘라스틴의 손상 조직이나 기관의 재생을 위한 의료용 재료로서의 용도가 검토되고 있다.

일본 특허공보 평6-30616호에는 수용성 엘라스틴과 가용성 콜라겐을 냉시 혼합하여 이루어지는 성형용 조성물이 개시되어 있다. 또, 국제 공개 제2002/96978호 팜플렛 (WO2002/96978) 에는, 엘라스틴을 가교제에 의해 가교시킬 때에 콜라겐 등의 성분을 화학적으로 결합시킨 엘라스틴 가교체, 그리고 그 의료용 기구 및 재생 조직이 개시되어 있다.

일본 특허 2997823호 명세서 일본 특허 3772232호 명세서 일본 특허 3105308호 명세서 일본 공개특허공보 2005-95331호 일본 특허공보 평6-30616호 국제 공개 제2002/96978호 팜플렛

콜라겐 및 엘라스틴은 인공 진피 제조용 재료나 조직 재생을 위한 의료용 재료로서의 용도가 주목받고 있는데, 원재료의 유래, 얻어진 제품의 취급성이나 기계적 강도, 목적으로 하는 용도에 대응한 특성 등의 여러 가지 요건에 있어서 만족시킬 수 있는 것을 발견하지 못한 것이 현상황이다.

예를 들어, 소나 돼지 이외에서 유래하는 것으로서의 어류 유래의 콜라겐 및 어류 유래의 수용성 엘라스틴을 사용한 창상 피복재나 인공 진피를 개시하는 선행 기술 문헌은 현상황에서는 발견되지 않는다. 또 어류 유래의 콜라겐은 포유 동물 유래의 것과 비교하면 변성 온도가 낮고, 겔의 강도가 약하다는 결점이 있었다. 변성을 방지하기 위해 변성 온도 이하에서 반응시켜야 하지만, 저온하에서는 가교제의 종류에 따라서는 반응이 진행되지 않는다는 결점이 있었다.

일본 특허공보 평6-30616호에는 수용성 엘라스틴과 가용성 콜라겐을 냉시 혼합하여 이루어지는 성형용 조성물 및 그것을 사용하여 얻어진 막 형상 구조체가 개시되어 있다. 그러나, 이 성형용 조성물로부터 얻어지는 구조체는 가교 등의 불용화 처리가 되어 있지 않다는 점에서, 장시간 수중에서 형태를 유지할 수 없는 경우가 있다. 또 인공 진피는 다공체이지만, 동공보에 기재되는 성형용 조성물로부터 인공 진피용 다공체를 얻는 것은 용이하지 않다.

국제 공개 제2002/96978호 팜플렛에는, 수용성 엘라스틴을 가교제로 가교할 때에 콜라겐을 화학적으로 결합한 가교체 및 그 의료용 재료로서의 용도가 개시되어 있다. 그러나, 국제 공개 제2002/96978호 팜플렛에 기재되는 가교 방법으로는, 가교제나 가교 조건에 의해 주형에 흘려 넣는 것이 곤란하거나 반응 속도의 제어가 어려워, 목적으로 하는 형상이나 성상의 가교체가 얻어지지 않는다는 것이 기재되어 있다. 또한, 이 가교 방법에 의해 가교체가 얻어진 경우에도, 인공 진피를 포함하는 의료용 재료나 세포 배양의 베이스재 등의 여러 가지 용도에 충분히 대응할 수 없는 경우가 있다.

본 발명의 목적은 인공 진피를 포함하는 의료용 재료나 세포 배양의 베이스재 등의 여러 가지 용도에 충분히 대응 가능한 콜라겐/엘라스틴 가교물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 가교물은 어류 유래의 콜라겐과 어류 유래의 엘라스틴을 가교함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명의 가교물의 제조 방법은 어류 유래의 콜라겐과 어류 유래의 엘라스틴을 그 엘라스틴의 코아세르베이션을 일으키지 않는다는 조건하에서 용해시킨 용액을 조제하는 공정과, 그 엘라스틴의 코아세르베이션을 일으키지 않는다는 조건하에서 그 용액에 가교제를 첨가하여 동결 건조 중에 가교를 형성시켜 가교물을 얻는 공정, 혹은 그 엘라스틴의 코아세르베이션을 일으키지 않는다는 조건하에서 그 용액을 건조시켜 얻어지는 건조물을 가교시키는 공정을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 가교물의 제조 방법은 상기 서술한 미가교의 건조물을 가교하는 방법으로서 가교제를 사용한 가교, 열에 의한 가교, 자외선 혹은 방사선에 의한 가교, 이들을 단독 혹은 조합에 의해, 물에 불용인 가교물을 얻는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 의료용 재료는 상기 가교물을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다. 또, 본 발명의 세포 배양 베이스재는 상기 가교물을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다. 또, 본 발명의 화장품 기재는 상기 가교물을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명에 의하면, 어류 유래의 원료로부터 얻어지고, 인공 진피를 포함하는 의료용 재료나 세포 배양의 베이스재 등의 여러 가지 용도에 충분히 대응 가능한 콜라겐/엘라스틴 가교물 및 그 제조 방법, 그리고 이 콜라겐/엘라스틴 가교물을 이용하여 얻어지는 의료용 재료, 세포 배양 베이스재 및 화장품 기재로서의 용도를 제공할 수 있다.

도 1 은 실시예 1 에 있어서의 어류 유래 아테로 콜라겐의 세포 독성 시험의 결과를 나타내는 그래프이다 (마이토마이신 C (세포 독성 물질, 판매 : 쿄와 발효 기린 주식회사)).
도 2 는 실시예 1 에 있어서의 어류 유래 수용성 엘라스틴의 세포 독성 시험의 결과를 나타내는 그래프이다 (마이토마이신 C (세포 독성 물질, 판매 : 쿄와 발효 기린 주식회사)).
도 3 은 실시예 2 에 있어서의 가교제를 사용한 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체의 주사형 전자 현미경 화상 (SEM 화상 : 200 배) 이다.
도 4 는 실시예 3 에 있어서의 열 가교를 사용한 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체의 주사형 전자 현미경 화상 (SEM 화상 : 200 배) 이다.
도 5 는 실시예 4 에 있어서의 콜라겐에 엘라스틴을 첨가하는 것에 의한 다공체의 파단 강도를 나타내는 그래프이다.
도 6 은 실시예 4 에 있어서의 콜라겐에 엘라스틴을 첨가하는 것에 의한 다공체의 파단 거리를 나타내는 그래프이다.
도 7 은 실시예 6 에 있어서의 콜라겐/엘라스틴 다공체의 래트 피하에 대한 매립 56 일째의 조직 이미지 (매크로 이미지) 이다.
도 8 은 실시예 7 에 있어서의 상처의 면적의 추이 (수술 후의 상처의 면적을 100 ％ 로 하였다) 를 나타내는 그래프이다.
도 9 는 실시예 7 에 있어서의 샘플군 (수술 후 14 일째) 의 상처 상태를 나타내는 도면이다.
도 10 은 실시예 8 에 있어서의 가교제를 사용한 DNA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체의 주사형 전자 현미경 화상 (SEM 화상 : 100 배) 이다.
도 11 은 실시예 9 에 있어서의 가교제를 사용한 프로타민 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체의 주사형 전자 현미경 화상 (SEM 화상 : 100 배) 이다.
도 12 는 실시예 10 에 있어서의 가교제를 사용한 하이드록시 어퍼타이트 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체의 주사형 전자 현미경 화상 (SEM 화상 : 100 배) 이다.
도 13 은 실시예 11 에 있어서의 콜라겐/엘라스틴 다공체를 세포 배양 베이스재로서 사용하여 배양한 조직을 알시안 블루 염색한 결과의 도면이다.
도 14 는 실시예 11 에 있어서의 콜라겐/엘라스틴 다공체를 세포 배양 베이스재로서 사용하여 배양한 조직을 톨루이딘 블루 염색한 결과의 도면이다.
도 15 는 실시예 11 에 있어서의 콜라겐/엘라스틴 다공체를 세포 배양 베이스재로서 사용하여 배양한 조직을 Ⅱ 형 콜라겐 항체에 의한 면역 염색한 결과의 도면이다.
도 16 은 실시예 12 에 있어서의 필름 형상의 콜라겐/엘라스틴 복합체 (함수 상태) 의 사진 화상이다.
도 17 은 실시예 13 에 있어서의 피부 점탄성의 측정 결과의 그래프이다. (n = 4, CES + 화장수 도포부와의 비교, t 검정, **p < 0.01, *p < 0.05)
도 18 은 실시예 14 에 있어서의 필름 형상의 콜라겐/엘라스틴 복합체 (함수 상태) 의 사진 화상이다.

본 발명에 있어서는, 엘라스틴으로서 어류 유래의 것을 사용한다. 엘라스틴 조제용 어류로서 연어, 송어 등의 연어목 연어과, 참치, 가다랭이 등의 농어목 고등어과, 방어 등의 농어목 전갱이과, Ling Cod 등의 쏨뱅이목 쥐노래미과 등을 들 수 있다. 엘라스틴으로는, 콜라겐과의 가교물의 형성에 있어서, 균질한 가교물을 얻는 데에 있어서는, 수용성 엘라스틴이 바람직하다. 수용성 엘라스틴으로는 엘라스틴의 생합성 전구체인 트로포 엘라스틴, 엘라스틴을 산 및 알칼리 처리함으로써 얻어지는 α-엘라스틴, κ-엘라스틴, 및 효소 처리하여 얻어지는 엘라스틴의 가수 분해물이 있다. 본 발명에서 사용하는 엘라스틴으로는, 가교물을 조제했을 때에 기계적 강도가 쉽게 얻어지는 분자량이 갖추어진 고분자인 α-엘라스틴이 바람직하다.

또 본 발명에서 사용하는 엘라스틴의 분자량으로는 특별히 한정되지 않는데, 중량 평균 분자량 1 만 ∼ 10 만 정도가 바람직하다.

엘라스틴은 콜라겐과 비교하면 생체 내에서의 분해는 느리지만, 콜라겐과 마찬가지로 생체 친화성이 높아, 첨가함으로써 기계적 강도나 유연성이 부가되는 것이 기대된다. 또 α-엘라스틴은 매크로 파지 유주 활성, 세포 접착, 혈소판 응집 저해 등의 생물학적 기능을 갖는다고 되어 있고, α-엘라스틴을 가교물의 소재로서 사용한 경우, 이들의 생물학적 기능이 부가되는 것도 기대된다.

어류로부터의 엘라스틴의 조제는 통상적인 방법에 의해 실시할 수 있다.

어류 유래의 엘라스틴은, 소나 돼지로부터의 엘라스틴에 비해, 엘라스틴 분자 내의 가교 구조에 관여하는 아미노산의 일종인 데스모신, 이소데스모신이 적을 뿐만 아니라, 아미노산 조성도 소나 돼지 등의 포유 동물 유래와는 상이한 특징을 갖는다.

본 발명에 있어서 이용할 수 있는 어류 유래 엘라스틴의 동물 유래의 엘라스틴에 대해 상이한 함유량의 아미노산에 대한 조성의 일례로서, 이하의 조성 (mol％) 을 들 수 있다.

·글리신 : 35 ∼ 45 ％

·알라닌 : 10 ∼ 20 ％

·발린 : 3 ∼ 8 ％

·이소데스모신 : 0.1 ∼ 1.0 ％

·데스모신이 0.1 ∼ 1.0 ％

·비극성 아미노산의 합계가 67 ∼ 77 ％

또한, 상기 아미노산 조성에 있어서 분석 대상인 아미노산은 글리신 (Gly), 알라닌 (Ala), 발린 (Val), 류신 (Leu), 이소류신 (Ileu), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 아스파르트산 (Asp), 글루탐산 (Glu), 리신 (Lys), 아르기닌 (Arg), 히스티딘 (His), 하이드록시리신 (Hylys), 시스테인 (Cys), 메티오닌 (Met), 티로신 (Tyr), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 하이드록시프롤린 (Hypro), 이소데스모신 (Iso-Des) 및 데스모신 (Des) 이다. 상기 글리신, 알라닌, 발린, 이소데스모신, 데스모신 이외의 아미노산의 함유율 (mol％) 의 일례를 이하에 든다.

·류신 : 3.4 ∼ 4.5

·이소류신 : 0.9 ∼ 1.9

·세린 : 3.1 ∼ 3.4

·트레오닌 : 3.1 ∼ 6.5

·아스파르트산 : 1.6 ∼ 2.9

·글루탐산 : 3.2 ∼ 4.3

·리신 : 0.7 ∼ 1.5

·아르기닌 : 1.6 ∼ 2.6

·히스티딘 : 0.2 ∼ 0.8

·하이드록시리신 : 0

·시스테인 : 0 ∼ 0.2

·메티오닌 : 0.4 ∼ 0.7

·티로신 : 3.4 ∼ 4.4

·페닐알라닌 : 1.1 ∼ 3.1

·프롤린 : 8.6 ∼ 10.1

·하이드록시프롤린 : 0.5 ∼ 0.9

한편, 콜라겐으로도 어류 유래의 것을 사용한다. 콜라겐 조제용 어류로서 연어, 송어 등의 연어목 연어과, 참치, 가다랭이 등의 농어목·고등어과, 방어 등의 농어목·전갱이과, 대구, 명태 등의 대구목 대구과 등을 들 수 있다. 콜라겐으로는, 엘라스틴과의 가교물의 형성에 있어서, 균질한 가교물을 얻는 데에 있어서는, 가용성 (수용성) 콜라겐이 바람직하다. 어류로부터의 콜라겐의 조제는 통상적인 방법에 의해 실시할 수 있다. 그런데 콜라겐의 양단에는, 콜라겐의 주된 항원 부위인 테로펩티드가 존재한다. 이 부분을 효소 처리에 의해 떼어내면, 콜라겐의 항원성이 극단적으로 낮아진다. 이와 같은 콜라겐을 아테로 콜라겐이라고 부르고, 의료용 임플란트 재료나 조직 공학용 베이스 재료에 응용되고 있다. 본 발명에 사용하는 가용성 콜라겐으로는, 어류 유래의 아테로 콜라겐이 보다 바람직하다.

또 본 발명에서 사용하는 콜라겐의 분자량으로는 특별히 한정되지 않지만, 중량 평균 분자량 1 만 ∼ 30 만 정도가 바람직하다.

어류 유래의 콜라겐은 소나 돼지로부터의 콜라겐에 비해, 프롤린이나 하이드록시프롤린이 낮은 등, 아미노산 조성이 상이하다. 또 콜라겐은 어느 온도 이상이 되면 변성되어 젤라틴화되는 성질이 있는데, 어류 유래의 콜라겐의 변성 온도는 소나 돼지 유래의 콜라겐과 비교하면 일반적으로 낮다.

본 발명에 있어서 이용할 수 있는 어류 유래 콜라겐의 아미노산 조성의 동물 유래의 콜라겐에 대해 상이한 함유량의 아미노산에 대한 조성의 일례로서 이하의 조성 (mol％) 을 들 수 있다.

·글리신 : 34 ∼ 40 ％

·프롤린 : 5.0 ∼ 11.0 ％

·하이드록시프롤린 : 4.0 ∼ 8.0 ％

·히스티딘 : 0.8 ∼ 2.0 ％

또한, 상기 아미노산 조성에 있어서 분석 대상인 아미노산은 글리신 (Gly), 알라닌 (Ala), 발린 (Val), 류신 (Leu), 이소류신 (Ileu), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 아스파르트산 (Asp), 글루탐산 (Glu), 리신 (Lys), 아르기닌 (Arg), 히스티딘 (His), 하이드록시리신 (Hylys), 시스테인 (Cys), 메티오닌 (Met), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro) 및 하이드록시프롤린 (Hypro) 이다.

상기 글리신, 프롤린, 하이드록시프롤린, 히스티딘 이외의 아미노산의 함유율 (mol％) 의 일례를 이하에 든다.

·알라닌 : 10.5 ∼ 15.0

·발린 : 1.1 ∼ 2.2

·류신 : 1.5 ∼ 2.3

·이소류신 : 0.5 ∼ 1.1

·세린 : 3.5 ∼ 6.3

·트레오닌 : 2.1 ∼ 3.6

·아스파르트산 : 4.3 ∼ 5.3

·글루탐산 : 7.4 ∼ 9.5

·리신 : 2.4 ∼ 2.9

·아르기닌 : 4.9 ∼ 5.5

·하이드록시리신 : 0.5 ∼ 0.8

·시스테인 : 0 ∼ 0.2

·메티오닌 : 0.3 ∼ 1.7

·트립토판 : 0

·티로신 : 0.2 ∼ 0.3

·페닐알라닌 : 1.1 ∼ 1.4

엘라스틴과 콜라겐의 가교물의 형성에는, 가교제를 사용해도 된다. 특히, 가교물에 강도 안정성이 요구되는 경우에는, 가교제를 사용하여 두는 것이 바람직하다. 가교제로는, 이것들을 가교할 수 있는 것이면 된다. 예를 들어, 카르보디이미드계, 아지드계, 플루오로포스페이트계, 트리아진계, 에폭시계의 가교제 (축합제) 등을 들 수 있다. 또 축합 보조제를 사용해도 되고, N-하이드록시 다가 카르복실산이미드류, N-하이드록시트리아졸류, 트리아진류, 및 2-하이드록시이미노-2-시아노아세트산에틸에스테르 등을 들 수 있다. 이들의 축합제 및 축합 보조제로는, 의료용 재료로서 사용하는 경우에는 잔류성이나 독성이 낮은 것을 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 가교물은 어류 유래의 엘라스틴과 어류 유래의 콜라겐을, 가교제를 사용한 가교법, 열에 의한 가교법, 자외선 혹은 방사선에 의한 가교법에 의해 제조할 수 있다. 인공 진피 등의 의료용 재료, 세포 배양용 베이스재 및 화장품 기재로서의 특성을 얻는 데에 있어서는, 이하의 공정을 갖는 제조 방법에 의해 가교물을 제조하는 것이 바람직하다.

(A) 어류 유래의 콜라겐과 어류 유래의 엘라스틴을 엘라스틴의 코아세르베이션을 일으키지 않는다는 조건하에서 용해시킨 용액을 조제하는 공정.

(B) 공정 (A) 에서 얻어진 용액으로부터 엘라스틴의 코아세르베이션을 일으키지 않는다는 조건하에서 가교물을 얻는 공정.

공정 (B) 로는, 이하의 공정 (B-1) 또는 (B-2) 를 사용할 수 있다.

(B-1) 엘라스틴의 코아세르베이션을 일으키지 않는다는 조건하에서, 공정 (A) 에서 얻어진 용액에 가교제를 첨가하여 동결 건조 중에 가교를 형성시켜 가교물을 얻는 공정.

(B-2) 공정 (A) 에서 얻어진 용액을 엘라스틴의 코아세르베이션을 일으키지 않는다는 조건하에서 건조시켜 얻은 건조물을 가교시키는 공정.

공정 (B-2) 에 있어서의 건조 방법으로는, 동결 건조, 진공 건조, 송풍 건조, 탈수 용제에 의한 건조, 자연 건조 등을 이용할 수 있다. 또 공정 (B) 후에, 추가로 가교제에 의한 가교, 열에 의한 가교, 자외선 혹은 방사선에 의한 가교 등, 이들을 단독 혹은 조합한 가교 처리를 가해도 된다.

따라서 이 제조 방법은, 엘라스틴의 코아세르베이션을 일으키지 않는다는 조건하에서, 엘라스틴을 용해시켜, 그 상태에서 엘라스틴 및 콜라겐이 용해된 용액에 가교제를 첨가하여 동결 건조 중에 가교를 형성시켜 가교물을 얻는 공정, 혹은 이 용액을 엘라스틴의 코아세르베이션을 일으키지 않는다는 조건하에서 건조시켜 얻어지는 건조물을 가교시키는 공정에 특징을 갖는다. 수용성 엘라스틴에는 수용액 중에서 코아세르베이션이라고 하는 현상을 일으키는 온도나 pH 의 조건이 존재한다. 코아세르베이션이 발생하면, 액 바닥에 물엿 형상으로 응집되어, 다른 혼합물과는 균일하게 가교하지 않을 뿐만 아니라, 가교제의 종류나 가교 조건에 따라서는, 수용성 엘라스틴은 전혀 가교되지 않고, 다른 혼합물과 분리된다. 따라서, 가교용 용액 중에 있어서 엘라스틴의 코아세르베이션이 일어나지 않도록 해 두는 것이 바람직하다. 엘라스틴의 코아세르베이션을 일으키지 않는다는 조건하에서 콜라겐 및 가교제와 반응시킴으로써, 엘라스틴과 콜라겐 및 가교제의 균일한 반응이 진행되어, 균질한 가교물을 얻을 수 있다. 가교물을 다공체로서 얻는 경우에 있어서도, 보다 균질한 공공 분포를 갖는 다공체가 형성 가능해진다. 엘라스틴의 코아세르베이션이 일어난 상태에서 가교를 실시하면, 가교물 중에 엘라스틴이 편재된 부분이 생기고, 또한 가교 구조가 가교물 전체에 충분히 형성될 수 없는 경우가 생긴다.

코아세르베이션이 일어나지 않는 조건은 사용하는 수용성 엘라스틴의 종류에 따라 설정 가능하다. 통상적으로 0 ∼ 40 ℃ 범위의 온도, 및 1 ∼ 12 의 범위의 pH 에서 선택한 온도 및 pH 조건이 채용 가능하다.

한편, 콜라겐은 어느 온도 이상이 되면 변성되어 젤라틴이 된다. 변성된 콜라겐은 물에 녹기 쉽고, 강도가 약하기 때문에, 생체 내의 단백질 분해 효소에 의해 분해 흡수되기 쉬워져, 생체 내에서 적당한 안정성이 요구되는 의료용 재료로서는 부적합하다. 상기 이유로부터 변성 온도 이하에서 용액의 조제 및 가교 반응을 실시할 필요가 있다. 일반적으로 어류 유래의 콜라겐의 변성 온도는 20 ℃ 전후라고 말해지고 있고, 이것보다 낮은 온도대에서 용액의 조제 및 가교 반응을 실시하는 것이 바람직하다. 또 콜라겐은 산성보다 중성영역에서는 가용화되어 있지만, 알칼리성에서는 불용화되는 성질을 갖는다. 이것으로부터 콜라겐을 함유하는 조성물을 균일한 조건에서 가교시키기 위해서는, 콜라겐이 용해되어 있는 용액의 pH 는 1 ∼ 7, 더욱 바람직하게는 3 ∼ 6 이 바람직하다.

따라서 엘라스틴과 콜라겐의 균질한 용액을 얻기 위해서는, 양자가 용해되어 있는 상태인 것이 필요하다. 즉, 온도는 엘라스틴이 코아세르베이션을 일으키지 않고, 또한 콜라겐이 변성되지 않는 10 도 이하, 더욱 바람직하게는 0 ∼ 5 ℃, pH 는 엘라스틴이 코아세르베이션을 일으키지 않고, 또한 콜라겐이 용해되어 있는 3 ∼ 6, 더욱 바람직하게는 선택한 가교제가 반응하기 쉬운 pH 가 바람직하다.

엘라스틴과 콜라겐을 용해시키는 경우의 용매로는, 물 혹은 산, 알칼리, 계면활성제를 함유하는 물, 저농도의 수용성 유기 용매를 함유하는 물 등을 사용할 수 있다.

엘라스틴과 콜라겐의 혼합 비율 (중량％) 로는, 가교물 중량에 대해 엘라스틴이 0.5 ％ ∼ 99.5 ％ 의 범위인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 1 ∼ 50 ％ 이고, 이 범위이면 양호한 다공질인 성형체를 얻을 수 있고, 인공 진피를 포함하는 의료용 기구, 세포 배양 베이스제 및 화장품 기재로서 양호한 성형물을 얻을 수 있다.

엘라스틴 및 콜라겐을 함유하는 건조물을 가교하는 경우의 가교 방법으로는, 가교제를 사용한 화학 가교, 열에 의한 가교, 자외선 혹은 방사선에 의한 가교 등을 사용할 수 있다. 즉, 엘라스틴 및 콜라겐을 함유하는 건조물은 가교제를 첨가하지 않는 경우에 있어서도, 열, 자외선 및 방사선 중 적어도 1 개에 의해 가교 시킬 수 있다.

또, 건조물의 가교는 필요에 따라 용매 중에서 실시할 수 있다. 예를 들어, 건조물이 용매 중에 용해되지 않도록, 고농도의 염류 수용액 중, 혹은 알코올류, DMSO, DMF, 디옥산 등등의 유기 용매 중, 및 이들의 혼합 용매 중에서, 필요에 따라 가교제의 존재하에서 가교를 실시할 수 있다.

가교제의 배합 비율 (중량％) 로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 가교시키는 조성물 중량에 대해 1 ∼ 50 ％ 가 바람직하다. 인공 진피를 포함하는 의료용 기구, 세포 배양 베이스제 및 화장품 기재로서 양호한 성형물을 얻기 위해서는 1 ∼ 30 ％ 의 배합 비율이 특히 바람직하다.

용액 중에서 엘라스틴과 콜라겐을 가교시키는 경우의 이들 농도 (중량％) 로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 콜라겐 및 엘라스틴의 용해성, 혼합액의 점성에 의한 성형성을 고려하면 0.5 ∼ 50 ％ 농도가 바람직하다. 인공 진피를 포함하는 의료용 기구, 세포 배양 베이스제 및 화장품 기재로서 양호한 성형물을 얻기 위해서는 1 ∼ 10 ％ 의 농도 범위가 특히 바람직하다.

본 발명의 콜라겐/엘라스틴 가교체의 성형 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적인 합성 수지의 성형에 사용되는 성형용의 형 (型) 을 사용할 수 있다. 예를 들어, 엘라스틴 및 콜라겐을 함유하는 용액에 가교제를 첨가하여 형에 흘려 넣고, 이것을 동결 건조시킴으로써 가교시거나, 혹은 엘라스틴 및 콜라겐을 함유하는 용액을 형에 흘려 넣고, 이것을 건조시켜 성형된 건조물을 얻어, 그 건조물을 가교함으로써 성형물을 얻는다. 이와 같은 방법으로, 사용한 주형을 반영한 스펀지 형상, 실 형상, 막 형상, 막대 형상, 펠릿 형상, 튜브 형상 등의 콜라겐/엘라스틴 가교체를 성형할 수 있다. 또, 용액 캐스트법에 의해 막 형상으로 성형할 수 있다. 예를 들어, 엘라스틴 및 콜라겐을 함유하는 용액에 가교제를 첨가한 것을 수지나 금속 등의 기판 상에 얇게 펼친 후, 용매를 제거 건조시킴으로써 가교체를 얻거나, 혹은 엘라스틴 및 콜라겐을 함유하는 용액을 수지 등의 기판 상에 얇게 펼친 후, 용매를 제거 건조시킨 것을 가교함으로써 필름 형상의 콜라겐/엘라스틴 가교체를 얻을 수 있다.

본 발명의 가교물에는, 엘라스틴 및 콜라겐 이외에, 어류 유래의 DNA 나 프로타민을 첨가할 수 있다.

DNA 에는 인간 피부 정상 선유 아세포에 대한 히알루론산 산생 촉진 효과를 갖고, 또 이들의 분해물인 데옥시리보뉴클레오티드류는 인간 피부 정상 선유 아세포의 증식 활성이나 콜라겐 산생 촉진 효과를 갖는다. 어류 유래의 DNA 로는, 연어과 유래의 DNA 등을 사용할 수 있다. 또 본 발명에서 사용하는 DNA 의 분자량으로는 특별히 한정되지 않지만, 중량 평균 분자량 1 만 ∼ 1000 만 정도가 바람직하다.

프로타민은 척추 동물의 정자핵에 특이적으로 존재하는 단백질에서 항균 효과를 갖는다는 점에서, 창상의 감염 예방 작용이 기대된다. 프로타민으로는, 연어과 유래의 살민, 니신과 유래의 크루페인 등을 사용할 수 있다.

프로타민을 구성하는 아미노산에는 아르기닌이 많이 함유되어 있고, 연어과 유래의 프로타민인 살민에서는 대체로 70 ％ 는 아르기닌이지만, 콜라겐/엘라스틴 다공체에 프로타민을 함유시켰을 경우, 이들의 생체 내에서의 분해 과정에서 아르기닌이 발생한다. 아르기닌은 조직의 염증 반응에 수반되어 방출되는 과잉의 사이토카인 (자극을 주는 생리 활성 물질) 의 발현을 억제한다. 또, 아르기닌은 대표적인 NO (일산화질소) 를 산생하는 성분으로, NO 는 종양 세포나 감염을 수반한 세포에 공격을 가하는 기능을 갖고 있다. 또한, 아르기닌은 T-임파구의 성숙에 있어서도 중요한 역할을 한다. 이와 같이, 아르기닌은 면역 반응의 활성화, 세포 증식 촉진 효과, 콜라겐 생성 촉진 효과 등을 갖고, 창상이나 욕창의 치유를 촉진하는 중요한 아미노산이다.

따라서 이들 어류 유래의 DNA 나 프로타민을 콜라겐/엘라스틴 가교물에 첨가함으로써 상기 서술한 바와 같은 효과를 기대할 수 있다. 이들 성분의 배합량은 목적으로 하는 물성이나, 특성 혹은 기능성을 가교물에 부여할 수 있도록 배합한다. 배합량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 콜라겐과 엘라스틴의 합계 중량에 대해 0.5 ％ ∼ 50 ％, 바람직하게는 1 ∼ 20 ％ 의 DNA 및/또는 프로타민을 첨가한다.

또한, 본 발명의 가교물에는, 어류 유래의 엘라스틴 및 콜라겐 이외에, 분말상 또는 과립상의 인산칼슘을 첨가할 수 있다. 이 가교물은 뼈 재생 유도제 혹은 재생 촉진제, 혹은 뼈 결손부에 있어서의 뼈 형성의 유도 혹은 촉진을 목적으로 한 뼈 보충재로서의 응용이 가능한데, 이들 용도로 한정되는 것은 아니다.

인산칼슘의 배합량은 목적으로 하는 물성이나, 특성 혹은 기능성을 가교물에 부여할 수 있도록 배합한다. 배합량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 콜라겐과 엘라스틴의 합계 중량에 대해 0.5 ％ ∼ 50 ％, 바람직하게는 1 ∼ 20 ％ 의 인산칼슘을 첨가한다.

인산칼슘으로는, 하이드록시어퍼타이트 (HA), 인산3칼슘 (α―TCP, β―TCP), 인산수소칼슘2수화물 (DCPD), 인산8칼슘 (OCP), 인산4칼슘 (TeCP), 탄산어퍼타이트 (CAP) 등을 들 수 있고, 이들 중 적어도 1 종을 사용할 수 있다.

본 발명에 의하면, 수불용성인 균질한 복합체로 이루어지는 가교물을 얻을 수 있고, 다공체로 했을 경우에도, 인공 진피나 세포 배양용 베이스재로서 바람직한 다공질 구조를 가교물로 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 관련된 가교물의 제조에 사용하는 엘라스틴 및 콜라겐은, BSE (우해면상뇌증) 등의 감염증이 염려되는 종래의 포유 동물 유래의 소재가 아니고, 어류 유래의 천연 소재이기 때문에, 보다 안전성이 높은 가교물을 제공할 수 있다.

본 발명에 관련된 가교물은 엘라스틴을 첨가한 것으로, 콜라겐 단체보다 생체 내에서의 안정성과 기계 강도가 향상되고, 또한 생체 내에서의 분해성도 갖고 있어, 의료용 재료로서 바람직한 물성을 갖고 있었다.

본 발명에 관련된 가교물로 이루어지는 다공체는 균질하고, 또한 인공 진피나 세포 배양용 베이스재로서 바람직한 다공질 구조를 갖고 있다. 따라서, 인공 진피로서 사용한 경우에, 피부 선유 아세포의 침입성이 우수하고, 육아 형성이 양호하며, 상처 수축을 억제하여, 창상 치유 후에는 신속하게 생체에 흡수된다는 점에서, 창상, 열창, 욕창 등에 의해 피부가 손상을 받았을 때에, 손상면에 적용되어 진피 성분의 결손 부위에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면, 효과적으로 창상 치유를 촉진시키는 인공 진피를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 관련된 가교물로 이루어지는 다공체는, 내부에 균일한 세공이 존재하고, 생체 적합성 및 생체 내에서 서서히 분해되는 성질을 갖는다는 점에서, 성장 인자 (b-FGF, BMP 등) 나 항생 물질 등의 약물을 유지하고, 환부 등 필요한 지점에 송달하여, 공급할 수 있는 송달 시스템 (DDS) 용 소재로서도 이용할 수 있다. 또, 인공 진피에 머무르지 않고, 재생 의료용 베이스재 (스캐폴드재) 로서 이식 재료 등의 의료용 재료로서 다방면에서 이용할 수도 있다.

본 발명에 관련된 가교물은 뼈 재생 기재로서의 이용이 가능한데, 뼈 형성 인자 및 성장 인자를 포함시킬 수도 있다. 예를 들어, 뼈 형성 인자로는 뼈 형성 단백질 (BMP), 재조합 인간 뼈 형성 단백질 (rhBMP) 을, 성장 인자로는 선유 아세포 증식 인자 (FGF), 형질 전환 증식 인자 베타 (TGF―β), 상피 증식 인자 (EGF), 인슐린 유사 증식 인자 (IGF), 혈소판 유래 증식 인자 (PDGF), 혈관 내피 세포 증식 인자 (VEGF), 신경 영양 인자 (NGF) 등을 들 수 있고, 이들 중 적어도 1 종을 사용할 수 있다.

본 발명에 관련된 가교물은 의료용 및 세포 배양 베이스제용 연골 재생 기재로서의 이용이 가능하다. 예를 들어, 콜라겐/엘라스틴 다공체는 균질하고, 또한 세포의 침입성이 우수한 바람직한 다공질 구조를 갖고 있다는 점에서 연골 유사 조직을 유지할 수 있다. 연골 재생 후에는 신속하게 생체에 흡수된다는 점에서, 연골의 손상면에 적용되어, 효과적으로 연골 유사 조직을 재생할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면, 효과적으로 연골 재생을 촉진시키는 연골 재생 기재를 제공할 수 있다.

본 발명에 관련된 가교물은 의료용 및 세포 배양 베이스제용 연골 재생 기재로서의 이용이 가능한 연골 분화 유도 인자 및 성장 인자를 포함시킬 수도 있다. 예를 들어, 연골 분화 유도 인자로는, 형질 전환 증식 인자 베타 (TGF―β), 뼈 형성 단백질 (BMP), 재조합 인간 뼈 형성 단백질 (rhBMP), Sox 유전자군 (Sox9, Sox5 혹은 Sox6) 등을 들 수 있고, 이들 중 적어도 1 종을 사용할 수 있다.

본 발명의 콜라겐/엘라스틴 가교체는 화장품 기재로서 사용할 수 있다. 화장품 기재로는, 화장용 페이스 마스크나 웨트 시트 등에 사용할 수 있다. 특히 다공체로 한 경우에는, 많은 화장수나 미용액을 함침시킬 수 있어, 콜라겐, 엘라스틴의 기능성도 기대할 수 있다. 화장용 페이스 마스크로서 사용하는 경우, 두께 1 ∼ 5 ㎜ 정도의 시트 형상 다공체로, 얼굴의 형상에 맞춘 것이나 일부를 덮는 형상인 것을 이용할 수 있다.

실시예

다음으로 실시예를 나타내어 본 발명을 실시하기 위한 최선의 형태에 대해, 상세하게 기재하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이하의 실시예에 있어서 특별한 규정이 없는 한 「％」는 중량 기준이다.

〔실시예 1〕

(어류 유래의 아테로 콜라겐 및 수용성 엘라스틴의 세포 독성 시험)

시료로서 연어 가죽 유래의 아테로 콜라겐, 연어 심장 유래의 수용성 엘라스틴을 사용하였다. 평가 세포는 피부 매트릭스 내의 주체를 이루는 인간 피부 정상 선유 아세포를 사용하였다. 세포 독성 시험은 WST-1 어세이에 의해 실시하였다. WST-1 어세이는 세포 내의 미토콘드리아의 기능에 의해 WST-1 이 분해되어 생성하는 포르마잔 (Formazan) 을 비색 정량 (측정 파장 450 ㎚) 하여, 그 흡광도가 생 세포수와 상관하는 것을 이용하여 생 세포수를 측정하는 당업자에 있어서 주지된 방법이다. 얻어진 결과를 도 1 및 도 2 에 나타낸다. 어느 샘플도 0.1 ∼ 10 ㎍/㎖ 의 농도에 있어서 세포 생존율이 높고, 세포 독성을 나타내지 않는 것이 확인되었다.

〔실시예 2〕

(가교제를 사용한 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체의 조제예)

실시예 1 에서 사용한 것과 동일하게, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴을 사용하여 다공체를 조제하였다. 즉, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴의 배합비 (중량비) 가 콜라겐/엘라스틴 = 8 : 2 가 되도록 시험관에 칭량하였다. 그 혼합 콜라겐/엘라스틴 분말에 탈이온수를 첨가하고, 냉장하 (3 ℃) 에서 교반하여 농도 5 ％ 의 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액을 얻었다. 조제한 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액에 냉장하 (3 ℃) 에서 EDC (가교제 : 1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, 토쿄 화성 (주)) 수용액을 첨가하여 혼합하였다 (콜라겐과 엘라스틴의 총 중량에 대해 EDC 가 20 ％ (w/w) 가 되도록 첨가하였다). EDC 를 첨가한 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액을 목적으로 하는 형상의 형에 흘려 넣고, 동결 건조시켜, 콜라겐/엘라스틴 다공체를 얻었다. 얻어진 콜라겐/엘라스틴 다공체를 이온 교환수로 세정하였다. 세정 후, 함수 상태의 콜라겐/엘라스틴 다공체를 동결 건조시켜, 콜라겐/엘라스틴 다공체를 얻었다.

얻어진 콜라겐/엘라스틴 다공체의 구조를 주사형 전자 현미경 (JEOL 제조, JSM-6380LV, 이하 SEM) 에 의해 관찰한 결과, 구멍의 크기는 50 ∼ 100 ㎛ 이고, 구멍 직경은 균일하였다 (도 3 참조).

〔실시예 3〕

(열 가교를 사용한 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체의 조제예)

실시예 1 에서 사용한 것과 동일하게, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴을 사용하여 다공체를 조제하였다. 즉, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴의 배합비 (중량비) 가 콜라겐/엘라스틴 = 7 : 3 이 되도록 시험관에 칭량하였다. 그 혼합 콜라겐/엘라스틴 분말에 탈이온수를 첨가하고, 냉장하 (3 ℃) 에서 교반하여 농도 10 ％ 의 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액을 얻었다. 그 혼합 용액을 목적으로 하는 형상의 형에 흘려 넣고, 동결 건조시켜, 동결 건조물을 얻었다. 그 동결 건조물을 감압하에서 150 도, 24 시간 열 가교를 실시하여, 콜라겐/엘라스틴 다공체를 얻었다. 얻어진 다공체를 수중에 넣은 결과 1 주간 이상 형상을 유지하고 있었다. 얻어진 콜라겐/엘라스틴 다공체의 구조를 주사형 전자 현미경 (JEOL 제조, JSM-6380LV, 이하 SEM) 에 의해 관찰한 결과, 구멍의 크기는 50 ∼ 100 ㎛ 이고, 구멍 직경은 균일하였다 (도 4 참조).

〔실시예 4〕

콜라겐에 엘라스틴을 첨가하는 것에 의한 다공체의 물성 변화

연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴을 사용하여, 실시예 2 와 동일한 가교 방법으로, 콜라겐 100 ％ 의 다공체, 콜라겐에 대해 20 ％ (w/w) 의 엘라스틴을 첨가한 다공체, 콜라겐에 대해 40 ％ (w/w) 의 엘라스틴을 첨가한 다공체를 각각 동일한 크기 및 형상 (직경 12 ㎜ 두께 6 ㎜ 의 원주 형상) 이 되도록 조제하였다 (콜라겐과 엘라스틴의 합계 농도는 5 ％ 로 하였다).이들의 다공체를 수중에 24 시간 방치하여, 팽윤 상태의 겔로 하였다. 이 겔의 기계적 강도를 REOMETER (제조 판매 : (주) 산 과학) 로 측정하였다. 그 결과, 엘라스틴을 첨가함으로써 콜라겐 단체 (엘라스틴 함유율 0 ％) 의 경우보다, 겔의 파단 강도, 및 겔의 유연성을 나타내는 값인 파단 거리가 길어졌다 (도 5, 도 6 참조). 또 비교 대조로서 포유 동물 유래의 콜라겐을 사용한 시판되고 있는 인공 진피를 상기와 동일한 분석 조건으로 측정한 결과, 강도가 약해 파단 거리는 측정할 수 없었다.

〔실시예 5〕

(어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체의 스캐폴드 (세포 배양 베이스재) 로서의 평가)

실시예 2 와 동일한 방법으로 조제한 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체 (직경 11 ㎜ × 두께 3 ㎜) 를 사용하였다. 평가용 세포로서 WFB (WKA 래트의 선유 아세포 불사화주), 인간 피부 정상 선유 아세포를 사용하였다. 콜라겐/엘라스틴 다공체를 에틸렌옥사이드 가스 멸균하여, 탈기 처치한 다공체를 12 구멍 배양 플레이트에 두었다. 다음으로 세포함 배양액 (세포 농도 5 × 10⁵ 개/㎖) 을 1 ㎖ 씩 각 스펀지에 스며들게 한 후, 1 ㎖ 의 배양액을 붓고, 이것을 3, 4 일마다 배양액을 교환하여 배양하였다. 세포의 생존 확인과 조직학적 평가를 배양 후 14, 28 일째에 실시하였다. 세포의 생존 확인은 WST-1 어세이의 변법을 사용하였다. 즉, 배양 플레이트에 접착된 세포를 제거하고, 다공체에 생착한 세포만을 측정하기 위해, 다공체를 새로운 배양 플레이트로 옮겼다. 2 ∼ 3 ㎖ 의 WST-1 액-배양액 (1 : 10) 을 새로운 배양 플레이트에 붓고, 그대로 4 시간 반응시켜, 흡광도를 플레이트 리더로 측정하였다. 조직학적 평가는 콜라겐/엘라스틴 다공체를 포르말린 고정시키고, 이것을 파라핀 블록에 포매하여, 박절 후에 헤마톡실린-에오진 염색하여 실시하였다.

WST-1 어세이 변법에 의한 결과를 표 1 에 나타낸다.

표 1 에 나타내는 바와 같이, 양 세포 모두 블랭크 (무세포) 와 비교했을 경우, 흡광도가 분명하게 존재하고, 또한 14 일째와 비교하여 28 일째에서는 흡광도가 증대되어 있다는 점에서, 다공체 내에서 생존하고, 또한 증식하고 있다는 것이 시사되었다. 배양 조직을 염색하여 현미경하에 관찰한 결과, 인간 피부 정상 선유 아세포, WFB 어느 세포도 세포끼리가 접착하여, 다공체에 부착되어 있는 것이 확인되었다. 이것으로부터 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체는 세포 배양 베이스재로서 사용할 수 있다는 것이 분명해졌다.

〔실시예 6〕

(어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체의 생체 내 (래트 피하) 에 대한 매립 시험)

실시예 2 와 동일한 방법으로 조제한 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체 (직경 11 ㎜ × 두께 5 ㎜) 를 사용하였다. Wister 계 래트 (4 주령, 200 g 전후, 암컷) 를 에테르로 마취시키고, 등부의 털을 바리캉으로 깎았다. 가위로 등부 피부를 약 1 ㎝ 절개하여, 피하 (육양막하) 에 직경 약 1 ㎝ 의 포켓을 제조한 후, 에틸렌옥사이드 가스 멸균한 다공체를 매입하고, 나일론실로 봉합 폐창하였다. 수술일부터 3, 7, 14, 21, 28, 56 일째에 래트를 계획 도살하여, 다공체를 매입한 부분을 생검하였다. 조직을 포르말린 고정시킨 후, 파라핀 표본으로 하였다. 이것을 헤마톡실린-에오진 염색하여, 생체 적합성을 평가하였다.

다공체 매립 후의 조직을 관찰한 결과, 이식 조기에는 다공체 주위에 염증 세포 침윤, 모세혈관, 선유 아세포·내피 세포의 이른바 육아 조직이 산견되고, 그 후 점차 육아 조직이 증생되며, 새로운 교원 섬유 (콜라겐 등) 가 산생되어, 56 일째에는 거의 완전하게 반흔화되었다. 한편, 다공체는 주위로부터 파괴·흡수되어 56 일째에는 완전하게 흡수되었다 (도 7 참조). 이것은, 이전에 보고되고 있는 콜라겐 사용 인공 진피인 페르낙 (판매원 ; 죤슨 & 죤슨, 제조원 ; 군제) 의 동물 실험의 결과와 거의 동등하였다.

〔실시예 7〕

(래트 피부 결손 상처에 대한 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체의 이식 시험)

실시예 2 와 동일한 방법으로 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체 (직경 20 ㎜ × 두께 5 ㎜) 를 조제하고, 샘플군은 이것을 이식 재료로 하였다. 컨트롤군에는 시판되고 있는 콜라겐 사용 인공 진피인 테르다미스 (콜라겐 단층 타입, 데루모 제조) 를 이식 재료로서 사용하였다. Wister 계 래트를 에테르로 마취시키고, 등부에 직경 15 ㎜ 정도의 피부 결손 상처를 제조하여, 결손 상처에 이식 재료를 두고, 드레싱 보호재로 결손 상처와 이식 재료를 완전하게 덮어, 드레싱 보호재와 피부절단단을 나일론실로 봉합하였다. 이식 재료와 하상 (下床) 을 밀착시키기 위해 가제로 가볍게 압박하고, 추가로 신축성 밴드로 압박 고정시켰다. 이식 재료가 없는 OPEN WOUND 군, 이식 재료로서 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체를 사용한 샘플군, 이식 재료로서 테르다미스를 사용한 컨트롤군의 3 군을 제조하여, 동일한 처치를 각 군 5 마리 실시하였다.

시험 결과의 시료 매입에 수반하는 사망 및 감염 등의 소견은 각 군 모두 확인되지 않았다. 상처면의 육안적 소견으로는, 샘플군은 수술 후로부터 상처면이 급속히 수축되지 않고, 7 일째에서는 대부분은 육아화한 OPEN WOUND 군의 상처면은 수술 후로부터 급속히 수축하기 시작하여 14 일째에는 거의 치유되었다. 시간 경과적인 상처면의 크기의 비교 검토의 결과, OPEN WOUND 군의 상처면은 수술 후의 조기부터 급속히 수축하기 시작하는 데에 반해, 샘플군 및 컨트롤군에서는 상처 수축은 비교적 느리게 발생되는 것이 확인되었다 (도 8, 9 참조). 상처면 (치유면) 의 조직학적 검토의 결과, 수술 후 7 일째의 샘플군에서는, 주위 조직보다 염증 세포 침윤, 선유 아세포 및 혈관 내 가죽 세포 등이 관찰되었다. 수술 후 14 일째에서는 하상 조직은 육아·반흔 조직이고, 그 상부의 피부절단단으로부터 재생 표피가 신장되어 있었다. 궤양 저부는 세포 성분·모세 혈관이 풍부하고, 심층 부위는 세포 성분이 감소하여 반흔이 계속 성숙하고 있었다. 본 결과는 시판되는 인공 진피인 테르다미스와 동일한 결과였다.

〔실시예 8〕

(가교제를 사용한 DNA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체의 조제예)

실시예 1 에서 사용한 것과 동일하게, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴을 사용하여 다공체를 조제하였다. 즉, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴의 배합비 (중량비) 가 콜라겐/엘라스틴 = 8 : 2 가 되도록 시험관에 칭량하였다. 그 혼합 콜라겐/엘라스틴 분말에 탈이온수를 첨가하고, 냉장하 (3 ℃) 에서 교반하여 농도 5 ％ 의 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액을 얻었다. 연어 백자 유래 DNA 에 탈이온수를 첨가하고, 냉장하 (3 ℃) 에서 교반하여 농도 5 ％ 의 DNA 용액을 얻었다.

먼저 조제한 농도 5 ％ 의 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액에 대해, 농도 5 ％ 의 DNA 용액을 중량비가 8 : 2 가 되도록 첨가하고, 냉장하 (3 ℃) 에서 교반하여 DNA 첨가 콜라겐/엘라스틴 혼합액을 얻었다. 이 DNA 첨가 콜라겐/엘라스틴 혼합액에 대해, EDC (가교제 : 1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, 토쿄 화성 (주)) 수용액을 첨가하여 혼합하였다 (콜라겐, 엘라스틴 및 DNA 의 총 중량에 대해 EDC 가 20 ％ (w/w) 가 되도록 첨가하였다). EDC 를 첨가한 DNA 첨가 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액을 목적으로 하는 형상의 형에 흘려 넣고, 동결 건조시켜, DNA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 얻었다. 얻어진 DNA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 이온 교환수로 세정하였다. 세정 후, 함수 상태의 DNA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 동결 건조시켜, DNA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 얻었다.

얻어진 DNA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체의 구조를 주사형 전자 현미경 (JEOL 제조, JSM-6380LV, 이하 SEM) 에 의해 관찰한 결과, 구멍의 크기는 100 ㎛ 전후이며, 구멍 직경은 균일하였다 (도 10 참조).

〔실시예 9〕

(가교제를 사용한 프로타민 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체의 조제예)

실시예 1 에서 사용한 것과 동일하게, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴을 사용하여 다공체를 조제하였다. 즉, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴의 배합비 (중량비) 가 콜라겐/엘라스틴 = 8 : 2 가 되도록 시험관에 칭량하였다. 그 혼합 콜라겐/엘라스틴 분말에 탈이온수를 첨가하고, 냉장하 (3 ℃) 에서 교반하여 농도 5 ％ 의 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액을 얻었다. 연어 백자 유래 프로타민에 탈이온수를 첨가하고, 냉장하 (3 ℃) 에서 교반하여 농도 5 ％ 의 프로타민 용액을 얻었다. 먼저 조제한 농도 5 ％ 의 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액에 대해, 농도 5 ％ 의 프로타민 용액을 중량비가 8 : 2 가 되도록 첨가하고, 냉장하 (3 ℃) 에서 교반하여 프로타민 첨가 콜라겐/엘라스틴 혼합액을 얻었다. 이 프로타민 첨가 콜라겐/엘라스틴 혼합액에 대해, EDC (가교제 : 1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, 토쿄 화성 (주)) 수용액을 첨가하여 혼합하였다 (콜라겐, 엘라스틴 및 프로타민의 총 중량에 대해 EDC 가 20 ％ (w/w) 가 되도록 첨가하였다). EDC 를 첨가한 프로타민 첨가 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액을 목적으로 하는 형상의 형에 흘려 넣고, 동결 건조시켜, 프로타민 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 얻었다. 얻어진 프로타민 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 이온 교환수로 세정하였다. 세정 후, 함수 상태의 프로타민 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 동결 건조시켜, 프로타민 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 얻었다.

얻어진 프로타민 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체의 구조를 주사형 전자 현미경 (JEOL 제조, JSM-6380LV, 이하 SEM) 에 의해 관찰한 결과, 구멍의 크기는 100 ㎛ 전후이며, 구멍 직경은 균일하였다 (도 11 참조).

〔실시예 10〕

(가교제를 사용한 하이드록시 어퍼타이트 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체의 조제예)

실시예 1 에서 사용한 것과 동일하게, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴을 사용하여 다공체를 조제하였다. 즉, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴의 배합비 (중량비) 가 콜라겐/엘라스틴 = 8 : 2 가 되도록 시험관에 칭량하였다. 그 혼합 콜라겐/엘라스틴 분말에 탈이온수를 첨가하고, 냉장하 (3 ℃) 에서 교반하여 농도 5 ％ 의 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액을 얻었다. 조제한 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액에 대해, 콜라겐과 엘라스틴의 합계 중량과 하이드록시 어퍼타이트 (이하, HA) 의 중량비가 8 : 2 가 되도록 HA 를 첨가하고, 냉장하 (3 ℃) 에서 연화하였다. 이 HA 첨가 콜라겐/엘라스틴 혼합액에 대해, EDC (가교제 : 1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, 토쿄 화성 (주)) 수용액을 첨가하여 혼합하였다 (콜라겐과 엘라스틴의 총 중량에 대해 EDC 가 20 ％ (w/w) 가 되도록 첨가하였다). EDC 를 첨가한 HA 첨가 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액을 목적으로 하는 형상의 형에 흘려 넣고, 동결 건조시켜, HA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 얻었다. 얻어진 HA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 이온 교환수로 세정하였다. 세정 후, 함수 상태의 HA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 동결 건조시켜, HA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체를 얻었다.

얻어진 HA 첨가 콜라겐/엘라스틴 다공체의 구조를 주사형 전자 현미경 (JEOL 제조, JSM-6380LV, 이하 SEM) 에 의해 관찰한 결과, 구멍의 크기는 100 ㎛ 전후였다 (도 12 참조).

〔실시예 11〕

(콜라겐/엘라스틴 다공체의 연골 재생 분야에서의 이용)

실시예 2 와 동일한 방법으로 조제한 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 다공체 (직경 11 ㎜ × 두께 5 ㎜) 를 사용하였다. 배양액 중에서 탈기 처치한 콜라겐/엘라스틴 다공체를 10 ㎝ 배양 접시에 설치하였다. 다음으로 배양한 연골 세포를 배양 플라스크로부터 회수하여 세포수를 세고, 5 × 10⁶ 개를 500 ㎕ 의 배양액 중에 재현탁하여, 세포 배양액으로 하였다. 이 세포 배양액을 콜라겐/엘라스틴 다공체에 스며들게 하여 인큐베이터 내에서 배양을 개시하였다. 또한, 12 시간 후에 배양액 10 ㎖ 를 배양 접시에 부었다. 3 일 또는 4 일에 한 번 배양액을 교환하였다. 배양 후 18 일째에 조직을 회수하고, 이것을 포르말린 고정시킨 후, 파라핀 블록에 포매·박절하여, 조직 절편을 제조하였다. 조직 절편을 헤마톡실린·에오진 염색, 알시안 블루 염색, 톨루이딘 블루 염색, Ⅱ 형 콜라겐 항체에 의한 면역 염색을 실시하였다.

알시안 블루 염색 (도 13) 과 톨루이딘 블루 염색 (도 14) 에 의해 세포 주위의 기질이 농염된 것으로부터, 콘드로이틴 황산이나 히알루론산 등의 산성 무코 다당류가 많이 포함되는 연골 기질이라고 생각되었다. 또 톨루이딘 블루 염색에서는, 연골 세포에 특징적인 메타크로마지가 관찰되었다. 또한, 연골 기질에 특징적으로 포함되는 Ⅱ 형 콜라겐을 염색하는 Ⅱ 형 콜라겐 항체에 의한 면역 염색으로도 농염되어 있고, 세포 주변에 연골 기질이 산생되어 있는 것이 확인되었다 (도 15). 이상의 결과로부터, 콜라겐/엘라스틴 다공체는 연골 세포 배양 기재 (Scaffold) 나 연골 재생 기재가 되는 것이 시사되었다.

〔실시예 12〕

(필름 형상의 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 복합체의 조제)

실시예 1 에서 사용한 것과 동일하게, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴을 사용하여 막을 조제하였다. 즉, 아테로 콜라겐과 수용성 엘라스틴의 배합비 (중량비) 가 콜라겐/엘라스틴 = 8 : 2 가 되도록 시험관에 칭량하였다. 그 혼합 콜라겐/엘라스틴 분말에 탈이온수를 첨가하고, 농도 20 ％ 의 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액을 얻었다. 조제한 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액에 EDC (가교제 : 1Ethyl3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, 토쿄 화성 (주)) 수용액을 첨가하여 혼합하였다 (콜라겐과 엘라스틴의 총 중량에 대해 EDC 가 0.5 ％ (w/w) 가 되도록 첨가하였다). EDC 를 첨가한 이 혼합 용액을 폴리프로필렌제의 시트 상에 도포하고, 이것을 건조제가 들어간 데시케이터 내에 가만히 정지시켜, 건조·고화시켰다 (이상의 조작을 5 ℃ 이하에서 실시하였다). 건조·고화 후, 필름 형상의 콜라겐/엘라스틴 복합체를 감압하에서, 180 ℃ 에서 1 시간 가열 처리를 실시하였다.

얻어진 필름 형상의 콜라겐/엘라스틴 복합체를 물에 침지시킨 결과, 일주일 이상 형상을 유지하고 있었다 (도 16).

〔실시예 13〕

(콜라겐/엘라스틴 복합체의 화장품 기재로서 이용)

피험자 (20 대 ∼ 30 대의 남성 4 명) 의 왼쪽 앞팔을 비누로 잘 세정하고, 수세한 후 손을 닦아 말렸다. 세정 30 분 후, 왼쪽 앞팔 내측 3 지점에 측정기의 프로브가 닿는 장소에 표시를 하였다. 표시한 부위의 점탄성을 피부 점탄성 측정 장치 큐트미터 MPA580 (Courage + Khazaka 사, 측정 모드 1) 으로 측정하였다 (도포 전 : 0 시). 0 시 측정 후, 각 피험자의 3 지점 표시 중, 1 지점에 시판 화장수를 충분히 스며들게 한 시트 형상의 콜라겐/엘라스틴 다공체를 붙여 15 분간 방치하였다. 또한 시트 형상의 콜라겐/엘라스틴 다공체는 실시예 2 와 동일하게 조제하였다. 15 분 후, 화장수를 함유시킨 콜라겐/엘라스틴 다공체 (CES + 화장수 도포로 약기) 를 벗김과 동시에, 표시한 다른 1 지점에 화장수를 도포하였다. 동일하게 하여 전체 4 명의 피험자에 대해, 도포하지 않은 부, 화장수 도포부, CES + 화장수 도포부를 제조하였다. 도포 2 시간 후, 표시한 부위의 피부 점탄성을 상기 서술한 바와 동일하게 측정하였다.

각 부의 도포 전후의 피부 점탄성값 (R 7 값) 의 차를 비교한 결과, CES + 화장수 도포부에서는, 도포하지 않은 부와 비교하여 유의하게 피부 점탄성이 상승하였다 (도 17). 또 CES + 화장수 도포부의 육안적 소견으로는 이상은 확인되지 않았다. 이상과 같이 콜라겐/엘라스틴 다공체는 화장품의 효과를 높였다는 점에서, 화장품 기재로서 사용 가능하였다.

〔실시예 14〕

(필름 형상의 어류 유래 콜라겐/엘라스틴 복합체의 조제 (2))

실시예 1 에서 사용한 것과 동일하게, 연어 가죽 유래 아테로 콜라겐과 연어 심장 유래 수용성 엘라스틴을 사용하여 막을 조제하였다. 즉, 아테로 콜라겐과 수용성 엘라스틴의 배합비 (중량비) 가 콜라겐/엘라스틴 = 8 : 2 가 되도록 시험관에 칭량하였다. 그 혼합 콜라겐/엘라스틴 분말에 탈이온수를 첨가하고, 농도 20 ％ 의 콜라겐/엘라스틴 혼합 용액으로 하였다. 이 혼합 용액을 폴리프로필렌제의 시트 상에 도포하고, 이것을 건조제가 들어간 데시케이터 내에 가만히 정지시켜, 건조시켰다 (이상의 조작을 5 ℃ 이하에서 실시하였다). 건조·고화 후, 필름 형상의 콜라겐/엘라스틴 복합체를 감압하에서, 180 ℃ 에서 1 시간, 가열 처리를 실시하여, 필름 형상의 콜라겐/엘라스틴의 가교물을 조제하였다.

얻어진 필름 형상의 콜라겐/엘라스틴 복합체를 물에 침지시킨 결과, 수중에서 1 주간 이상 형상을 유지하고 있었다 (도 18).

Claims

어류 유래의 콜라겐과 중량 평균 분자량이 1 만 ~ 10 만인 어류 유래의 엘라스틴을 0 ~ 10 ℃ 에서 용해시킨 용액을 조제하는 공정과,
5 ℃ 이하의 온도에 있어서 그 용액으로부터 건조물을 얻는 공정과,
그 건조물을 가교하여 가교물을 형성하는 공정을 갖는 제조 방볍에 의해 얻어지고,
또한, 어류 유래의 콜라겐과 어류 유래의 엘라스틴의 혼합 비율이 8 : 2 ~ 5 : 5 인 것을 특징으로 하는 다공체 가교물.
제 1 항에 있어서,
상기 건조물이 동결 건조에 의해 얻어지는 다공체 가교물.
삭제
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 용액이 DNA 및 프로타민 중 적어도 일방을 추가로 함유하는 다공체 가교물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
인산칼슘을 추가로 함유하는 다공체 가교물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 가교물이 구멍 직경이 50 ~ 100 ㎛ 인 다공체로서 얻어지는 다공체 가교물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 가교물이 필름 또는 막으로서 얻어지는 다공체 가교물.
어류 유래의 콜라겐과 중량 평균 분자량이 1 만 ~ 10 만인 어류 유래의 엘라스틴을 0 ~ 10 ℃ 에서 용해시킨 용액을 조제하는 공정과,
5 ℃ 이하의 온도에 있어서 그 용액으로부터 건조물을 얻는 공정과,
그 건조물을 가교하여 다공체 가교물을 형성하는 공정을 갖고,
어류 유래의 콜라겐과 어류 유래의 엘라스틴의 혼합 비율이 8 : 2 ~ 5 : 5 인 것을 특징으로 하는 다공체 가교물의 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 건조물이 동결 건조에 의해 얻어지는 다공체 가교물의 제조 방법.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
상기 가교물이 구멍 직경이 50 ~ 100 ㎛ 인 다공체로서 얻어지는 다공체 가교물의 제조 방법.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
상기 가교물이 필름 또는 막으로서 얻어지는 다공체 가교물의 제조 방법.
삭제
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
상기 용액이 DNA 및 프로타민 중 적어도 일방을 추가로 함유하는 다공체 가교물의 제조 방법.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
인산칼슘을 추가로 함유하는 다공체 가교물의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 의료용 재료.
제 15 항에 있어서,
인공 진피인 의료용 재료.
제 15 항에 있어서,
연골 재생 기재인 의료용 재료.
제 15 항에 있어서,
뼈 재생 기재인 의료용 재료.
제 18 항에 있어서,
뼈 형성 인자 또는 뼈 성장 인자를 담지시킨 의료용 재료.
제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 베이스재.
제 20 항에 있어서,
연골 세포의 배양에 적절한 세포 배양 베이스재.
제 20 항에 있어서,
뼈 세포의 배양에 적절한 세포 배양 베이스재.
제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장품 기재(Cosmetic base material).
제 4 항에 있어서,
인산칼슘을 추가로 함유하는 다공체 가교물.
제 4 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 의료용 재료.
제 5 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 의료용 재료.
제 6 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 의료용 재료.
제 7 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 의료용 재료.
제 4 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 베이스재.
제 5 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 베이스재.
제 6 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 베이스재.
제 7 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 베이스재.
제 4 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장품 기재(Cosmetic base material).
제 5 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장품 기재(Cosmetic base material).
제 6 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장품 기재(Cosmetic base material).
제 7 항에 기재된 다공체 가교물을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장품 기재(Cosmetic base material).