JP5839814B2 - Ｄａｎｃｅタンパク質含有徐放基材及び該徐放基材の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材及び該徐放基材の製造方法に関する。

ヒトの生体組織の中でも肺や血管、皮膚等の組織は、弾性、伸縮性に富んだ組織であるが、加齢とともに血管が硬くなる、あるいは皮膚がたるむといった生体組織の弾性が失われていく加齢現象が生じる。これは、生体組織に存在する弾性線維という、ゴムのような柔軟性と弾力を有する線維組織が劣化してしまうためであると考えられている。この弾性線維は、劣化・分解しても再生されることはないとされており、このような弾性線維の再生についての研究が数多くなされている。

近年、弾性線維の形成能を有する細胞の無血清培養において、ＤＡＮＣＥ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｒｔｅｒｉｅｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）−ｌｉｋｅ；ｆｉｂｕｌｉｎ−５ともいう）という分泌蛋白質（以下、ＤＡＮＣＥタンパク質という）を加えることにより効率よく弾性線維を再生できることが見出された（例えば、特許文献１参照）。

しかしながら、このＤＡＮＣＥタンパク質を保持できる形態については十分に研究がなされておらず、その取り扱い性が非常に困難であった。

国際公開第２００６／０８２７６３パンフレット

本発明は、ＤＡＮＣＥタンパク質を保持できかつ徐放できる形態である、ＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材を提供することを目的とする。また、ＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＤＡＮＣＥタンパク質を保持し、かつ徐放することができる新たな形態を見出した。かかる知見に基づき、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は下記のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材及びＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材の製造方法を提供する。
項１．基材及びＤＡＮＣＥタンパク質を含む、ＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材。
項２．基材が、コラーゲンを含む基材である、項１に記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材。
項３．基材が、コラーゲンからなる基材、又はコラーゲンとコラーゲン以外の材料とを含む基材である、項１又は２に記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材。
項４．コラーゲン以外の材料が生体吸収性材料である、項３に記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材。
項５．コラーゲン以外の材料が乳酸−カプロラクトン共重合体である、項２〜４のいずれかに記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材。
項６．基材が、コラーゲンスポンジ、コラーゲン粒子、又はコラーゲンフィルムである、項１〜３のいずれかに記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材。
項７．コラーゲンとＤＡＮＣＥタンパク質溶液を含む溶液を凍結乾燥して得られる、項１、２、３又は６に記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材。
項８．コラーゲン以外の材料に、コラーゲン溶液にＤＡＮＣＥタンパク質溶液を添加した組成物を含浸させ凍結乾燥して得られる、項２〜５のいずれかに記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材。
項９．さらにムコ多糖類を含む項１〜８のいずれかに記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材。
項１０．ムコ多糖類が、コンドロイチン硫酸又はヘパリンである項９に記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材。
項１１．コラーゲン溶液にＤＡＮＣＥタンパク質溶液を添加した溶液を凍結乾燥する工程を含む、ＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材の製造方法。
項１２．コラーゲン溶液に、さらにムコ多糖類を添加する項１１に記載の製造方法。
項１３．項１〜１０のいずれかに記載のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材によって表面がコーティングされた医療用材料。
項１４．ステント又は人工血管である項１３に記載の医療用材料。

本発明のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材は、ＤＡＮＣＥタンパク質を保持することができ、さらに添加剤により、ＤＡＮＣＥタンパク質の徐放性スピードのコントロールに優れるものである。

本発明のＤＡＮＣＥタンパク質含有基材は、基材及びＤＡＮＣＥタンパク質を含むものである。

基材としては、ＤＡＮＣＥタンパク質の保持性及び徐放性に優れることから、コラーゲンを含む基材が好ましく、コラーゲンからなる基材、又はコラーゲンとコラーゲン以外の材料とを含む基材であることがより好ましい。

コラーゲンからなる基材としては、スポンジ（コラーゲンスポンジ）、粒子（コラーゲン粒子）、フィルム（コラーゲンフィルム）、糸（コラーゲン糸）等が挙げられる。

コラーゲン以外の材料としては、生体吸収性材料が挙げられ、具体的には、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、グリコール酸−カプロラクトン共重合体、ポリジオキサノン、ポリグリコール酸等が挙げられる。これらの中で、乳酸−カプロラクトン共重合体、ポリグリコール酸、グリコール酸−カプロラクトン共重合体が、コラーゲンとの複合化が容易であり、ＤＡＮＣＥタンパク質の保持性及び徐放性に優れる点、加工性に優れる点等から好ましい。

コラーゲンスポンジの製造方法としては、コラーゲンとＤＡＮＣＥタンパク質を含む溶液を凍結乾燥して得ることが好ましく、例えば、コラーゲン溶液とＤＡＮＣＥタンパク質溶液を混合した組成物を凍結乾燥して得ることが好ましい。また、コラーゲン粒子の製造方法としては、例えば、前記のコラーゲンスポンジの製造方法によって得られたコラーゲンスポンジを粉砕して得ることができる。さらに、コラーゲンとコラーゲン以外の材料とを含む基材の製造方法としては、コラーゲン以外の材料によって基材を形成させ、その基材に、コラーゲンとＤＡＮＣＥタンパク質を含む組成物を含浸させ凍結乾燥することによって得ることが好ましい。

基材の形状としては、特に限定されるものではなく、用いられる用途によって適宜設定されるものであるが、例えば、スポンジ状、チューブ状、シート状、粒状、モノフィラメント、糸状、編物、不織布、織物、マルチフィラメント、ステント形状等が挙げられる。

以下に、本発明のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材及びＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材の製造方法について詳細に説明する。

１．コラーゲン溶液
コラーゲンとしては特に限定はなく、牛、豚等の皮膚や腱等に由来するものを用いることができる。抗原性を排除してより安全性を高める観点から、コラーゲンをプロテアーゼやペプシン等の酵素で処理して、テロペプチドをできる限り除去したアテロコラーゲンが好ましい。アテロコラーゲンには、Ｉ〜ＩＶ型があるが、適宜選択することができる。

コラーゲン溶液の溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等を挙げることができる。

コラーゲン溶液の濃度としては、０．１〜１重量％程度であることが好ましく、０．１〜０．５重量％程度であることがより好ましい。コラーゲン溶液の濃度が前記範囲にあることで、均一なコラーゲン溶液を作製できるため好ましい。

２．ＤＡＮＣＥタンパク質溶液
「ＤＡＮＣＥタンパク質」とは、ｆｉｂｕｌｉｎ−５とも呼ばれる分泌蛋白質であり、弾性線維を構成する分子であることが知られている。

本発明で用いるＤＡＮＣＥタンパク質は、ヒト由来のヒトＤＡＮＣＥタンパク質、又は、そのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）を含む。

ＤＡＮＣＥタンパク質のオルソログは特に限定されず、例えば任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来するものであり得る。哺乳動物としては、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス等が挙げられる。

ＤＡＮＣＥタンパク質については、例えば、国際公開第２００６／０８２７６３パンフレット等に記載されている。

本発明で用いるＤＡＮＣＥタンパク質溶液のＤＡＮＣＥタンパク質濃度は、特に限定されるものではなく、所望の濃度にすることができるが、例えば、１〜１０,０００ｎｇ／ｍＬ程度であることが好ましく、１０〜８，０００ｎｇ／ｍＬ程度であることがより好ましい。ＤＡＮＣＥタンパク質濃度が前記範囲内にあることで、希釈しすぎることによって生じるＤＡＮＣＥタンパク質の変性や、活性再現性の低下を防ぐことができるため好ましい。

ＤＡＮＣＥタンパク質溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、水（蒸留水）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｃａｒｍｏｄｙ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等を挙げることができる。これらの中でも、不純物が混入していない点から水（蒸留水）が好ましい。

本発明で用いられるＤＡＮＣＥタンパク質溶液には、ＤＡＮＣＥタンパク質の活性を維持するために、さらに、ゼラチンを含んでいてもよい。

ゼラチンは、酸性、塩基性両アミノ酸を含む両性電解質であり、等電点４〜６程度のアルカリ処理ゼラチンであることが、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定性の点から好ましい。より好ましいゼラチンの等電点は、５〜６程度である。

このようなアルカリ処理ゼラチンとしては、市販のものを好適に用いることができ、例えば、ゼラチン粉末（♯２５０、新田ゼラチン（株）製、等電点：５）、ニワトリゼラチン（ニッポンハム（株）製）等を挙げることができる。

３．ＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材の製造方法
本発明のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材は、コラーゲンとＤＡＮＣＥタンパク質を含む溶液を凍結乾燥することにより得ることができる。具体的には、前述のコラーゲン溶液にＤＡＮＣＥタンパク質溶液を添加した組成物を凍結乾燥することにより得ることができる。

ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の添加量は、コラーゲン溶液全体量に対して、０．１〜５重量％程度であることが好ましく、０．１〜１重量％程度であることがより好ましい。ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の添加量が前記範囲内であることにより、コラーゲンが保持できるＤＡＮＣＥタンパク質の量と、徐放されるＤＡＮＣＥタンパク質の量とが好適に釣り合うため好ましい。

また、本発明においては、コラーゲン溶液にムコ多糖類を添加することが好ましい。ムコ多糖類をコラーゲン溶液に添加して凍結乾燥を行うことで、架橋コラーゲンスポンジを得ることができる。

ムコ多糖類をコラーゲン溶液に添加した場合、ＤＡＮＣＥタンパク質の徐放速度を制御することができる。これは、ムコ多糖類は親水基を有するため、該ムコ多糖類の添加量により基材の親水基の量をコントロールすることで含水率を制御できるためと考えられている。

また、コラーゲンスポンジを作製する際には、通常、熱処理による架橋が行われるが、本発明において熱架橋を行うとスポンジ中のＤＡＮＣＥタンパク質が失活してしまうため、熱架橋処理を行うことは望ましくない。

ムコ多糖類としては、例えば、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸等を挙げることができる。これらの中でも、コラーゲンとの溶解性、安価に入手できる点から、コンドロイチン硫酸、ヘパリンが好ましい。

ムコ多糖類の添加方法としては、特に限定されるものではなく、コラーゲン溶液に直接添加することも可能であるが、取扱性の点から、ムコ多糖類を溶媒に溶解した溶液にして、コラーゲン溶液に添加することが好ましい。

ムコ多糖類溶液の濃度としては、０．１〜５重量％程度であることが好ましく、０．１〜１重量％程度であることがより好ましい。ムコ多糖類溶液の濃度が前記範囲にあることで、ムコ多糖類溶液の作製が容易にでき、コラーゲン溶液への溶解性も容易にできるため好ましい。

ムコ多糖類溶液の溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等を挙げることができる。

ムコ多糖類溶液の添加量としては、コラーゲン溶液全体量に対して、１〜５０重量％程度であることが好ましく、１〜３０重量％程度であることがより好ましい。ムコ多糖類溶液の添加量が前記範囲内であることにより、架橋によるスポンジが持つ特有の柔軟性の損失もなく、コラーゲン溶液との溶解性も良いために好ましい。

このようにして調整されたコラーゲン溶液、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液及び任意で添加されるムコ多糖類を含む組成物を適当な型枠の中に流延し、−１３５〜−４０℃程度で３０分〜２時間程度凍結後、凍結乾燥することによりＤＡＮＣＥタンパク質含有基材を得る。

得られたＤＡＮＣＥタンパク質含有基材中におけるＤＡＮＣＥタンパク質の含有量は、通常０．００１〜１重量％程度、好ましくは０．０１〜０．８重量％程度である。

本発明のＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材は、ＤＡＮＣＥタンパク質を保持できる全く新しい形態であり、該基材は、ＤＡＮＣＥタンパク質を徐放することができる。そのため、組織又は器官の再生の足場となるような再生医療用基材、動脈の再生等に用いられる血管再生用基材、陥没やたるみがみられる皮膚の再生用の基材等の用途に用いられる。より具体的には、美容整形用のコラーゲンインプラント、瘢痕治療、人工皮膚、皮膚キット、血管再生基材等の用途に好適に用いられる。

さらに、該基材によって、例えば、ステント、人工血管、人工気管、人工弁等の医療用材料の表面にコーティングさせて用いることも可能である。

以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

製造例１（ＤＡＮＣＥ水溶液の調整方法）
凍結乾燥されたＤＡＮＣＥタンパク質（ヒト由来）の粉末４μｇを蒸留水で溶解し、１０μｇ／ｍＬのＤＡＮＣＥタンパク質の水溶液Ａを作製した。

実施例１
コラーゲン（新田ゼラチン（株）製、製品名Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩ−Ｐ）を原料とし、０．３重量％、ｐＨ３のコラーゲン水溶液を調整した。

このコラーゲン水溶液１０ｍＬに、ＤＡＮＣＥタンパク質水溶液Ａ １００μＬを添加した溶液を、凍結乾燥用テフロン(登録商標)シャーレに流し込み、該テフロン(登録商標)シャーレを−１３５℃で凍結し、真空減圧下（０．１ＭＰａ）、−４０℃〜４０℃で１４時間凍結乾燥して、厚さ１ｍｍのＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲンスポンジを得た。

実施例２
ヘパリン（和光純薬工業（株）製）を原料とし、０．３重量％のヘパリン水溶液を調整した。

実施例１で調整したコラーゲン水溶液９ｍＬに、ＤＡＮＣＥタンパク質水溶液Ａ １００μＬを添加し、さらに、ヘパリン水溶液１ｍＬを添加した組成物を用いた以外は、実施例１と同様にして、厚さ１ｍｍのＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲンスポンジを得た。

実施例３
コンドロイチン硫酸（和光純薬工業（株）製）を原料とし、０．３重量％のコンドロイチン硫酸水溶液を調整した。

実施例１で調整したコラーゲン水溶液９ｍＬに、ＤＡＮＣＥタンパク質水溶液Ａ １００μＬを添加し、さらに、コンドロイチン溶液１ｍＬを添加した組成物を用いた以外は、実施例１と同様にして、厚さ１ｍｍのＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲンスポンジを得た。

比較例１
実施例１で得られたスポンジを、真空下１１０℃で２４時間加熱処理することにより熱架橋を行った。

比較例２
ゼラチン粉末（新田ゼラチン（株）製、製品名 ＃250）を蒸留水に溶解し、０．３重量％、ゼラチン水溶液を調整した。このゼラチン水溶液１０ｍＬに、ＤＡＮＣＥタンパク質水溶液Ａ １００μＬを添加した溶液を、凍結乾燥用テフロン(登録商標)シャーレに流し込み、該テフロン(登録商標)シャーレを−１３５℃で凍結し、真空減圧下（０．１ＭＰａ）、−４０℃〜４０℃で１４時間凍結乾燥して、厚さ１ｍｍのＤＡＮＣＥタンパク質含有ゼラチンスポンジを得た。
（試験）
実施例１〜３及び比較例１、２で得られた基材を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＬに浸漬し、３７℃で保管した。浸漬後１時間、１日、３日、７日、１４日、２１日、２８日に、ＰＢＳ中に放出されたＤＡＮＣＥタンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。抗体は、マウス抗ＤＡＮＣＥタンパク質ＩｇＧを用いた。測定キット（製造元：エヌビィ健康研究所）を用い、実施例１〜３、比較例１〜２のＤＡＮＣＥ溶液のＤＡＮＣＥ濃度を測定した。その結果を下記表１に示す。

実施例１〜３から明らかなように、これら３種の基材は、ＤＡＮＣＥタンパク質の徐放性に優れ、ムコ多糖溶液を添加した実施例２、３では、添加しなかった場合（実施例１）よりも早くＤＡＮＣＥタンパク質が放出された。これは、ムコ多糖が親水基を有することにより、スポンジ基材の含水率が高くなったためと考えられる。

また、熱架橋を行った比較例１では、ＤＡＮＣＥタンパク質が測定されなかった。これは、熱架橋により、ＤＡＮＣＥタンパク質が失活したためと考えられる。

ゼラチンを用いた比較例２では、浸漬後１日以内にほとんどのＤＡＮＣＥタンパク質が溶出してしまい、徐放することができなかった。これは、ゼラチンスポンジが直ちに溶解してしまったためであると考えられる。

コラーゲン溶液とＤＡＮＣＥタンパク質を混合した水溶液を凍結乾燥することによって、ＤＡＮＣＥタンパク質を徐放することが可能な基材を作製することが可能になった。

実施例４
乳酸とカプロラクトン共重合体からなる人工血管基材を直径９ｍｍに打ち抜き、０．３％コラーゲン溶液１ｍｌ（ｐＨ３)にＤＡＮＣＥ溶液１００μｌ（１００μｇ／ｍｌ）を添加した溶液を５００μｌ滴下し、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥を行い、人工血管基材にＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放剤を一体化させた。

その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＬに浸漬し、３７℃で保管した。浸漬後１時間、１日、３日、７日に、ＰＢＳ中に放出されたＤＡＮＣＥタンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。抗体は、マウス抗ＤＡＮＣＥタンパク質ＩｇＧを用いた。測定キット（製造元：エヌビィ健康研究所）を用い、ＤＡＮＣＥ溶液のＤＡＮＣＥ濃度を測定した。測定結果を表２に示す。

実施例５
コラーゲン（新田ゼラチン（株）製、製品名Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩ−Ｐ）を原料とし、０．３重量％、ｐＨ３のコラーゲン水溶液を調整した。

このコラーゲン水溶液１０ｍＬに、ＤＡＮＣＥタンパク質水溶液Ａ １００μＬを添加した溶液を、凍結乾燥用テフロン（登録商標）シャーレに流し込み、該テフロン（登録商標）シャーレを−１３５℃で凍結し、真空減圧下（０．１ＭＰａ）、−４０℃〜４０℃で１４時間凍結乾燥して、厚さ１ｍｍのＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲンスポンジを得た。

このスポンジを凍結させ、小型粉砕機を用いて粉砕し、ＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲン粒子を得た。

その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＬに浸漬し、３７℃で保管した。浸漬後１時間、１日、３日、７日に、ＰＢＳ中に放出されたＤＡＮＣＥタンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。抗体は、マウス抗ＤＡＮＣＥタンパク質ＩｇＧを用いた。測定キット（製造元：エヌビィ健康研究所）を用い、ＤＡＮＣＥ溶液のＤＡＮＣＥ濃度を測定した。測定結果を表２に示す。

実施例６
乳酸とカプロラクトン共重合体からなる縫合糸（直径０．５ｍｍ）を編み、内径５ｍｍの吸収性のステントを作製した。

厚さ０．５ｍｍのポリグリコール酸不織布を作製し、コラーゲン水溶液１０ｍＬに、ＤＡＮＣＥタンパク質水溶液Ａ １００μＬを添加した溶液を、ガラス板にキャストし、一定の厚さになるように広げ、その上に上記で作製した不織布を置き、一晩風乾させ、ＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲンと不織布が一体化したものを作製した。

吸収性ステントの内周とほぼ同じ大きさにカットしたポリグリコール酸不織布をステント内部に入れ、ぴったりくっつくように円筒状とし、周りからジオキサンを塗布し、風乾させた。その結果、吸収性ステントとポリグリコール酸不織布とＤＡＮＣＥタンパク質含有コラーゲンフィルムが一体となったステントが得られた。

Claims (10)

1. 基材及びＤＡＮＣＥタンパク質を含む、ＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材の製造方法であって、基材が、コラーゲン、及びムコ多糖類を含む基材であり、
   ムコ多糖類を含むコラーゲンとＤＡＮＣＥタンパク質溶液を含む溶液を凍結乾燥する工程を含む、ＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材の製造方法。
2. 基材が、コラーゲンからなる基材、又はコラーゲンとコラーゲン以外の材料とを含む基材である、請求項１に記載の製造方法。
3. コラーゲン以外の材料が生体吸収性材料である、請求項２に記載の製造方法。
4. コラーゲン以外の材料が乳酸−カプロラクトン共重合体である、請求項２又は３に記載の製造方法。
5. 基材が、コラーゲンスポンジ、コラーゲン粒子、又はコラーゲンフィルムである、請求項１又は２に記載の製造方法。
6. コラーゲン以外の材料に、ムコ多糖類を含むコラーゲン溶液にＤＡＮＣＥタンパク質溶液を添加した組成物を含浸させ凍結乾燥して得られる、請求項２〜４のいずれかに記載の製造方法。
7. ムコ多糖類が、コンドロイチン硫酸又はヘパリンである請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
8. コラーゲン溶液にＤＡＮＣＥタンパク質溶液を添加した溶液を凍結乾燥する工程を含む、ＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材の製造方法であって、
   コラーゲン溶液に、さらにムコ多糖類を添加する製造方法。
9. 請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法で得られるＤＡＮＣＥタンパク質含有徐放基材によって表面をコーティングする工程を含む医療用材料の製造方法。
10. ステント又は人工血管である請求項９に記載の医療用材料の製造方法。