JP6177335B2 - 骨形成用の医療用または歯科用材料 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡ/プロタミン複合体にエラスチン酵素分解物（分子量３５０〜３６００ Ｄａ）を含有させることで得られる、従来の骨形成材料よりも骨形成速度と加工性に優れた新規の骨形成用の医療用または歯科用材料に関する。

歯槽膿漏（歯周病）や骨粗鬆症は加齢とともに増えるが、それらの原因で顎骨（歯槽骨）が減少すると歯の喪失、義歯の不適合がおこり、疾病が進行するとインプラント処置ができなくなる。そこで、顎骨を回復させる手術が行われている。最も効果的な方法は自家骨を骨欠損部位に移植する方法であるが、骨採取時の侵襲は高齢者や有病者にとって大きなリスクである。その代替物としてハイドロキシアパタイトのような人工骨もあるが、無機材料共通の問題点があり、賦形性に難点がある。現在、多くの人工骨は顆粒状で提供されているが、骨欠損形態が完全な凹でなければ流出する危険性が高くなる。特に抵抗力の劣っている高齢者や有病者にとっては、流動性の高い人工骨が血液や外力により流出してしまうことは、治癒過程に重大な影響を与える危険がある。そこで、発明者らは加工性に優れて流動し難く、それでいてシリンジからの直接注入が可能で自由な形状に容易に成型できる骨修復材であるＤＮＡ／プロタミン複合体を開発した（特許文献１）。

魚類の精巣（白子）から得られる塩基性タンパク質であるプロタミンは、ジンジバリス菌が産生するプロテアーゼであるアルジンジパインの阻害活性を示すことが報告されている（非特許文献１参照）。さらに、プロタミン又はその誘導体と、トラネキサム酸及び／又はイプシロンアミノカプロン酸とを含有させることで、歯周病原菌による歯周炎症を効果的に抑制できることが開示されている（特許文献２参照）。これらプロタミンは一般に食品保存料として用いられており、安全性が高いことから従来の殺菌剤、抗生剤に代わる薬剤として有望である。さらに、プロタミンは齲触原因菌であるストレプトコッカス ミュータンスに対する生育抑制効果（特許文献３参照）や、口腔内細菌の付着抑制効果（特許文献４参照）を示すことが開示されている。

本発明者らはプロタミンの加水分解物が口腔カンジダ症を引き起こすカンジダ属などの真菌に対して抗真菌活性を示すことを見出した（特許文献５参照）。さらに、本発明者らはプロタミンがポルフィロモナス ジンジバリスやプレボテラ インターメディアなどの歯周病菌に対しても抗菌活性を示すことも見出した（特許文献１参照）。

プロタミンはポリカチオンの一種であるため、アニオン性高分子と静電的に結合を生じ、水に不溶性の複合体を形成することが知られている。

プロタミンと同じく魚類の精巣から得られるＤＮＡは、ＤＮＡ分子内にアニオン性の結合要素となるリン酸基を多数有しており、カチオン性物質に対して静電的な親和性を示すため、これらカチオン性物質と静電的な反応物を形成させることが可能である。本来、ＤＮＡ分子は賦形性に乏しく、水溶性であるために生体内での代謝拡散速度の調整に難点があったが、ＤＮＡ分子とカチオン性人工脂質を静電的に結合させることで、水不溶性、自己支持性の透明フィルムが調製可能であることが開示されている（特許文献６参照）。

また、ＤＮＡと脂質との複合体からなるフィルムが知られている。このＤＮＡ／脂質複合体フィルムは、生体高分子であるＤＮＡ分子が規則正しい二重螺旋構造を保持しており、二重螺旋構造のＤＮＡ塩基の隙間に種々の低分子化合物をインターカレートさせることや、ＤＮＡの持つ２つの溝（主溝、副溝）に同様の低分子化合物をグルーブバインディングさせることが可能である。このＤＮＡ／脂質複合体フィルムに薬効成分をインターカレート及び／又はグルーブバインディングさせることによる医療用材料の製造方法が発明されている（特許文献７参照）。

本発明者らは、既に医療用及び／又は歯科用材料として利用されているキトサンがカチオン性物質であることに着目し、ＤＮＡ分子とキトサンの複合体がＤＮＡ特有の二重螺旋構造を保持し、且つ水に不溶性で、生体親和性、抗菌性、及び良好な賦形性を有することを発明した（特許文献８参照）。また、ＤＮＡ／キトサン複合体をリン酸緩衝液中に懸濁することで、容易に糸状、ボール状、ディスク状に成型する方法（特許文献９参照）、加熱下で加圧成型することによるフィルムの製造方法（特許文献１０参照）を発明した。これらのＤＮＡ／キトサン複合体とその成型物は、優れた生体適合性と生体安定性を有するため医療用及び／又は歯科用材料として有望であった。

一方、生体の靭帯、血管、心臓、皮膚等の弾性組織に存在するエラスチンは、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ‐β１：ＴＧＦ‐β１）を活性化し、骨形成反応を誘導するという先行文献がある（非特許文献２、非特許文献３参照）。これら先行文献で使用されているエラスチン・プロダクツ・カンパニー社（米）のエラスチンは２種類あり、一つは分子量６６００〜４７０００ Ｄａの天然から抽出されたα‐エラスチンであり、もう一つは分子量１０００〜２５０００ Ｄａの酸および／またはアルカリ処理により分解されたエラスチンペプチドである。エラスチン・プロダクツ・カンパニー社のα‐エラスチンは、ウシの首靭帯を高温のシュウ酸で溶解し、精製、脱塩した後に、コアセルベーション法によりβ‐エラスチンを分離、除去することで得られる。一方の酸／アルカリ処理エラスチンは、ウシの首靭帯を熱水で洗浄して可溶性の夾雑タンパク質を除去した後、アルカリ溶液中で煮沸し、不溶性画分を加水分解および精製することで得られる。これらのエラスチンはいずれも水溶性エラスチンである。

しかしながら、これらエラスチンはｉｎ ｖｉｔｒｏの検討で骨形成誘導効果が認められているものの、臨床応用するためには加工性を有するか他材料に含有させる必要があり、仮に従来の生体材料に染み込ませて含有させたとしても、生体内で極めて短期間で溶解・流出してしまうことが予想されるため、十分な骨形成能力を発揮するとは考えられていなかった。また、架橋剤などを用いてエラスチンを架橋させ、賦形性を持たせることは可能だが、架橋剤自体が生体内で異物反応あるいは毒性反応の原因となることが懸念されるため、架橋剤などの薬剤の使用は骨形成材料においては極力使用しないことが望ましい。

特許第４８０１１９３号 特開２００７−１６９２０１号公報 特開平１１−２２８５２６号公報 特開２００１−８９４３６号公報 特開第４５２０４７７号 特開平８−２３９３９８号公報 特開２００１−３２７５９１号公報 特許第４６７４２８８号 特許第４３５４４４５号 特許第４７１８４１６号

Ｋｏｔａｎｉ Ｍ、他５名「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔａｍｉｎｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ａｄｈｅｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｉｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ．」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９９年、第６７巻、第９号、ｐ．４９１７−４９２０ Ａｇｎｅｔａ Ｓｉｍｉｏｎｅｓｃｕ、他３名「Ｅｌａｓｔｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ＴＧＦ−β１ ｉｎｄｕｃｅ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、２００５年、第３３４巻、 ｐ．５２４−５３２ Ａｇｎｅｔａ Ｓｉｍｉｏｎｅｓｃｕ、他３名「Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ｅｌａｓｔｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β１」Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００７年、第１７１巻、第１号、ｐ．１１6−１２３

前述の通り、現在で利用されている人工骨には流動性などの面で課題があり、高齢者や有病者に対して効果的で汎用性のある骨修復材は存在しないのが現状である。また、特許文献８のＤＮＡ／キトサン複合体、特許文献９のＤＮＡ／キトサン複合体成型物、特許文献１０のＤＮＡ／キトサン複合体フィルムは、生体内で急性炎症反応を呈することと、キトサンが生体内で分解されにくいために、より生体親和性が高く、生分解性の良い材料が望ましかった。さらに、特許文献１のＤＮＡ／プロタミン複合体は、生体内での炎症反応が極めて軽微であり、優れた生体親和性を有する上に、所望の形状に容易に成型できる賦形性を有するために、流動性の問題点が解決されていたが、効率的な骨修復を達成するためには、骨形成速度がより高く、短期間で骨修復がなされることが望ましかった。さらに、非特許文献２、非特許文献３のエラスチンはｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で骨形成誘導効果が認められていたものの、臨床応用する上では生体内で形状を維持することができない問題があり、仮に架橋剤で成型したとしても架橋剤の残留による生体への悪影響が懸念されるため、エラスチンは骨形成材料として利用できる素材ではなかった。

本発明は上述した従来技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、架橋剤などの薬剤を用いずに安全性の高い素材のみで構成され、副作用の心配が無く、水に不溶で、良好な賦形性を有していて所望の形状に容易に成型可能であり、且つ迅速な骨修復を達成する優れた骨形成速度を有した骨形成材料を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、天然由来のエラスチンの骨形成能を高めるべく、プロテアーゼ処理により分子量を３５０〜３６００Ｄａの範囲に調整したエラスチン酵素分解物の骨形成能が特に高いことを見出し、さらにＤＮＡ／プロタミン複合体と当該エラスチン酵素分解物を組み合わせることにより、流動性の問題を解決するだけでなく、骨形成速度が飛躍的に向上することを見出した。

本発明にかかる骨形成用の医療用または歯科用材料は、
（１）ＤＮＡ、
（２）プロタミン、プロタミンの誘導体及びプロタミンの加水分解物のうち少なくとも１種類、及び
（３）エラスチン酵素分解物
を含む複合体を、骨形成用の有効成分とし、
前記エラスチン酵素分解物の分子量が３５０〜３６００Ｄａの範囲にある
ことを特徴とする骨形成用の医療用または歯科用材料である。

本発明によれば、ＤＮＡ／プロタミン複合体と、骨形成能を高めるべく加水分解処理したエラスチン酵素分解物を組み合わせることで、加工性に優れて臨床応用に適した骨修復剤を提供するだけでなく、骨形成速度が飛躍的に向上した従来にはない骨修復材を提供することができる。

本発明に係る複合体の中で、ＤＮＡ／プロタミン複合体は、生体親和性及び生体内での安定性に優れ、さらに所望の形状に容易に成型可能な賦形性を有しているため、歯周組織再生誘導（ＧＴＲ）膜として、骨再生誘導（ＧＢＲ）法として、抗菌性義歯塗布剤として、その他口腔内用抗菌剤、止血剤、各種衛生用品などとしての利用が可能である。さらには、ＤＮＡが低分子化合物をインターカレーションあるいはグルーブバインディングすることができるため、成長因子（ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰなど）を担持させることで骨形成速度をさらに高めた骨形成材料を提供することができる。さらには、抗生物質などの薬物を担持させることで、患部など必要な箇所に送達し、供給することのできる送達システム（ＤＤＳ）用のメンブレン、フィルム、ラインニング材、又はコーティング材として利用することができる。また、歯科用材料にとどまらず、再生医療用の足場材（スキャフォールド材）として、創傷被覆材料として、感染防止膜として、癒着防止膜として、移植材料としてなど、医療用材料として多岐に利用することも可能である。

また、本発明を臨床応用することにより、歯周病患者や高齢者の転倒骨折、事故などによる複雑骨折した患者に対し、従来の骨形成材料よりも骨形成速度と加工性に優れ、手術時の取り扱いが簡便な骨形成材料を提供することが可能である。本技術は最先端の骨再生医療技術の発展に貢献するだけでなく、骨折による運動機能の低下からの回復を支援し、国民の健康寿命の延伸にも貢献することが期待される。

図１は水溶性エラスチンをゲル濾過クロマトグラフィーで分析したときのクロマトグラムである。 図２はエラスチン酵素分解物をゲル濾過クロマトグラフィーで分析したときのクロマトグラムである。 図３（ａ）は、骨欠損部に何も埋入せずに縫合したとき、図３（ｂ）はＤＮＡ／プロタミン複合体を単独で埋入したときのＤＮＡ／プロタミン複合体埋入部のμＣＴ画像（埋入１〜３ヶ月後）の状態をそれぞれ示す。 図４（ａ）は、水不溶性エラスチンを２０％（ｗ／ｗ）添加したとき、図４（ｂ）は水不溶性エラスチンを５０％（ｗ／ｗ）添加したときのＤＮＡ／プロタミン複合体埋入部のμＣＴ画像（埋入１〜３ヶ月後）の状態をそれぞれ示す。 図５（ａ）は水溶性エラスチンを２０％（ｗ／ｗ）添加したとき、図５（ｂ）は水溶性エラスチンを５０％（ｗ／ｗ）添加したＤＮＡ／プロタミン複合体埋入部のμＣＴ画像（埋入１〜３ヶ月後）の状態をそれぞれ示している。 図６（ａ）はエラスチン酵素分解物を２０％（ｗ／ｗ）添加したとき、図６（ｂ）はエラスチン酵素分解物を５０％（ｗ／ｗ）添加したときの添加したＤＮＡ／プロタミン複合体埋入部のμＣＴ画像（埋入１〜３ヶ月後）の状態をそれぞれ示している。

次に、本発明について詳細に説明する。

ＤＮＡは、天然由来ＤＮＡ及び合成ＤＮＡを利用することができる。天然由来ＤＮＡとしては、細菌ウイルスのλファージＤＮＡ、大腸菌染色体ＤＮＡ、仔牛胸腺ＤＮＡ、サケ、ニシン、マスなど魚類精子ＤＮＡを挙げることができる。また、合成ＤＮＡは、ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＧ）、ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＡ−ｄＴ）、ポリ（ｄＧ−ｄＣ）などを用いて合成装置によって合成可能な、塩基配列の異なる種々の合成ＤＮＡ；ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｕ）、ポリ（Ａ−Ｔ）、ポリ（Ｇ−Ｕ）などを用いて合成装置により合成可能な、塩基配列の異なる種々の合成ＲＮＡ；ポリ（ｄＧ）、ポリ（Ｕ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（ｄＣ）ポリ（ｄＡ−ｄＴ）、ポリ（Ａ−Ｔ）などのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを用いて合成装置によって合成可能な、相補的塩基対を有するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを挙げることができる。これらのＤＮＡは必要に応じて単独であるいはこれらの２種以上を組み合わせて使用することができる。

ＤＮＡの分子量は特に制限されず、ある程度の二重螺旋構造を保持していれば良い。ＤＮＡの分子量としては、１０ｂｐ〜３０，０００ｂｐのＤＮＡを用いることができるが、分子量が大きすぎると水溶液の調製が困難となり、逆に分子量が小さすぎると複合体の回収率が低くなるため、好ましくは３００ｂｐ〜７，０００ｂｐに分子量分布の中心を持つＤＮＡを用いることが望ましい。

このようなＤＮＡは、二重らせんを形成している四種類の塩基［シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ)］に種々の基（例えばリン酸含有基を末端に有する基）などが結合した構造を有しており、このＤＮＡ全体としては、例えば上記の末端に結合したリン酸基などに起因してアニオン性を示す。

このようなＤＮＡ自体は、二重らせん構造を有する紐状物であり、また、このＤＮＡは水に溶解することから、このＤＮＡ自体に成形性はない。ＤＮＡがアニオン性を有していることを利用して、アニオン性のＤＮＡと、カチオン性のプロタミンとを静電的に反応させることでＤＮＡ／プロタミン複合体を得ることができる。このようにして複合体となることで、ＤＮＡは実質的に水に溶解しなくなる。また、有機溶剤に対する溶解性も低くなる。
プロタミンは、サケ、ニシン、マス等魚類の精子核中にＤＮＡと結合したヌクレオプロタミンとして存在する強塩基性蛋白質であり、原料の違いによって、例えばサルミン（サケ）、クルペイン（ニシン）等と称され、それぞれ若干構造も異なるが、何れのプロタミンも使用可能である。

プロタミン誘導体は、プロタミンと無機酸、もしくは有機酸との塩や無機塩基、若しくは有機塩基との塩を指す。酸や塩基としては、塩の用途に応じて選択できるが、食品、化粧品、医薬品などへの用途を考慮すると、以下に挙げる薬学的に許容される塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、更にはシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、またはフマル酸等のジカルボン酸との塩、更に、酢酸、プロピオン酸、または酪酸等のモノカルボン酸との塩等を挙げる事ができる。又、本発明で得られるペプチド化合物の塩の形成に適した無機塩基は、例えば、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩等である。有機塩基との塩としては、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンの様なモノ−、ジ−及びトリ−アルキルアミン塩、モノ−、ジ−及びトリ−ヒドロキシアルキルアミン塩、グアニジン塩、Ｎ−メチルグルコサミン塩等を挙げる事ができる。これらのプロタミン誘導体は必要に応じて単独であるいはこれらの２種以上を組み合わせて使用することができる。

プロタミンの加水分解物は、プロタミンを酸、アルカリ、蛋白質分解酵素、又はそれらの組合せにより加水分解したものであるが、蛋白質分解酵素を用いて加水分解することが望ましい。加水分解の方法は、より詳細には次の通りである。プロタミンに脱イオン水等の加水分解処理用の溶媒を加え、水酸化ナトリウム又は塩酸を加えてｐＨを酵素の至適ｐＨに調整する。酵素の至適温度に加温した後、酵素を添加して、攪拌しながら酵素反応を行う。反応終了後、反応液を８０〜１００℃に加温して５〜６０分間加熱失活させｐＨを中性域となるように調整後、反応液を凍結乾燥し、プロタミン分解物を得ることができる。これらのプロタミン分解物は必要に応じて単独であるいはこれらの２種以上を組み合わせて使用することができる。

上述の方法により調製したプロタミン分解物は、プロタミンを完全に分解したものは抗菌性を殆ど示さないため、分子量が５００〜４，０００Ｄａの範囲に分布するように部分分解することが望ましい。

プロタミンの加水分解に用いることのできる蛋白質分解酵素としては、例えばバシラス属（例えばバシラス サチリス、バシラス サーモプロテオティカス、バシラス リシェニフォルミスなど）の産生する酵素、アスペルギルス属（例えばアスペルギルス オリーゼ、アスペルギルス ニガー、アルペルギルス メレンスなど）の産生する酵素、リゾパス属（例えばリゾパス ニベウス、リゾパス デレマーなど）の産生する酵素、ペプシン、パンクレアチン、パパイン等が挙げられる。これらの酵素は単独、又は２種以上を組み合わせても良い。また、蛋白質分解酵素は、蛋白質の内部配列を特異的に認識して切断するエンドペプチダーゼと、末端から１〜２アミノ酸残基ずつ切断するエキソペプチダーゼに分類される。従って、必要に応じて、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの組合せにより、様々なペプチド鎖を生成させることが可能である。酵素により加水分解する場合には、基質に対して、酵素０．００１〜１０％を添加し、溶液を使用される酵素の至適ｐＨとして加水分解する。

本発明のプロタミン、プロタミン誘導体、プロタミン分解物は、バシラス属やストレプトコッカス属、乳酸菌などのグラム陽性細菌、カンジダ属などの真菌、ポルフィロモナス属やプレボテラ属などの歯周病菌に対する抗菌活性を有している。

ＤＮＡとプロタミンとの複合体は、ＤＮＡと、プロタミン、プロタミン誘導体及びプロタミン加水分解物の少なくとも１種を、水性媒体中で反応させることにより調製することができる。例えば、ＤＮＡの水溶液を、攪拌しているプロタミン水溶液に添加して混合することによりこれらを反応させることができる。

ＤＮＡと、プロタミン、プロタミン誘導体及びプロタミン加水分解物の少なくとも１種の配合比は、この複合体の用途に応じて選択することができる。例えば、１／９から９／１、好ましくは１／１から１／１．５（重量比）の範囲から選択することができる。

ＤＮＡと、プロタミン、プロタミン誘導体及びプロタミン加水分解物の少なくとも１種を水性媒体中で反応させることにより複合体の沈殿を生じる。この沈殿を水あるいは各種の緩衝液で洗浄し、必要に応じて、更に水洗し、余分な水分を遠心分離などで除去してから、乾燥することで複合体の乾燥物を得ることができる。乾燥は、常温乾燥法、加熱乾燥法、凍結乾燥法、減圧乾燥法など目的に応じた乾燥方法を適宜選択して行うことができる。

沈殿の洗浄用の緩衝液としては、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、バルビツール酸緩衝液、フタル酸緩衝液、カコジル酸緩衝液、炭酸緩衝液、Ｂｉｓ−トリス緩衝液、Ｂｉｓ−トリスープロパン緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、コラミンクロリド緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＨＥＰＰＳ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、グリシンアミド緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液などの中から選択することができる。緩衝液の濃度やｐＨも目的とするＤＮＡ／プロタミン複合体の性状や物性が得られるように自由に選択することができる。

次に、本発明で用いるエラスチンとしては、魚類由来、ウシ由来、ブタ由来のエラスチンを用いることができる。エラスチン調製用の魚類としては、サケ、マス等のサケ目サケ科、マグロ、カツオ等のスズキ目サバ科、ブリ等のスズキ目アジ科、Ｌｉｎｇ Ｃｏｄ等のカサゴ目アイナメ科などを挙げることができる。

エラスチンをＤＮＡ／プロタミン複合体に含有させて優れた骨形成能を発揮させるためには、水不溶性エラスチンの酵素分解物が用いられる。この水不溶性エラスチンとしては、魚類、ウシあるいはブタの心臓動脈球を原料とし、動脈球を０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム水溶液中で、１０〜６０℃で２時間〜４８時間撹拌して夾雑タンパク質を溶解し、水洗あるいは塩酸で中和することで得られるが、アルカリ濃度が高すぎるとエラスチンが溶解してしまう可能性があるため、好ましくは０．０４〜０．０６％の水酸化ナトリウム水溶液で、３０〜４５℃、１２〜１８時間撹拌することが望ましい。また、可溶性の夾雑物質を溶解、除去するために、中和後に７０℃以上で５分間以上加熱することが望ましい。本発明で用いる酵素分解用の水溶性エラスチンの分子量範囲は、９１００〜９７５００Ｄａ程度である。酵素分解に用いる酵素の種類としては、中性あるいはアルカリ性で作用するプロテアーゼならば用いることができるが、バシラス属由来のプロテアーゼが適しており、好ましくはバシラス属由来のプロテアーゼを２種類以上組み合わせて使用することで効率的に酵素分解物を得ることができる。具体的には、アルカラーゼ２．４Ｌ ＦＧ（ノボザイム）とプロテックス６Ｌ（ジェネンコア協和）の組み合わせが挙げられる。酵素反応の条件としては、ｐＨ６〜１２、温度は４０〜７０℃、時間は３０分間〜２４時間で反応させ、酵素濃度は基質乾燥重量に対して０．１〜２．０％の範囲で添加する。好ましくは、ｐＨ６〜９、６０℃、２〜６時間酵素反応を行うことで効率的に酵素分解物を得ることができる。エラスチンの酵素分解物の分子量としては、分子量が３５０〜３６００Ｄａの範囲内に分布しているものが好ましく、少なくとも３５０〜９９０Ｄａの範囲にあるものを含むことが好ましい。

ＤＮＡ／プロタミン複合体に対するエラスチン酵素分解物の配合割合は、目的とする骨形成能が得られるように設定できる。例えば、ＤＮＡ／プロタミン複合体に対するエラスチン酵素分解物の配合割合としては、１〜７５％（ｗ／ｗ）の範囲、好ましくは２０〜５０％（ｗ／ｗ）の範囲、より好ましくは５０％から選択できる。すなわち、ＤＮＡ／プロタミン複合体（固形分）１００重量部に対して、エラスチン酵素分解物を１〜７５重量部、好ましくは２０〜５０重量部、より好ましくは５０重量部を配合することができる。

ＤＮＡとプロタミンの複合体乾燥物に適量の水を加えて乳鉢で錬和することにより、その錬和する時間に応じてペースト状、ゲル状、さらに粘着性を示す糊状などの容易に成型可能な状態とすることができるため、そこにエラスチン酵素分解物を加えながら練り込むことによって、ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体を得ることが出来る。このＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体では、ＤＮＡと、プロタミン、プロタミンの誘導体及びプロタミンの加水分解物のうち少なくとも１種と、が結合することによって複合体マトリクスが形成され、この複合体マトリクス中にエラスチン酵素分解物が取り込まれて保持された構造を有する。エラスチン酵素分解物は、複合体マトリクス中に取り込まれることによって、治療部位への設置時においてＤＮＡ／プロタミン複合体から離脱することなく安定的に保持され、治療部位においてＤＮＡ／プロタミン複合体の骨形成能を更に向上させる効果を発揮する。

上述したＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体の練り込み物は、高粘性や弾力性（フレキシビリティー）を有しているために、治療部位に適用する際に、紐状、帯状、山状などの所望の形状に容易に成形でき、かつその形状が拡散せずに、少なくとも治療部位への適用時に安定維持可能である賦形性を有する。

さらに、これら複合体のペースト状物を、シリンジを用いてリン酸緩衝液中に押し出すことにより、紐状の成型物が得られる。また、目的に応じたモールドに充填することによって、容易に棒状、あるいは球状、ディスク状などの各種の形状の成型物を得ることができる。

これら複合体のフィルム状成型物は、この複合体の乾燥粉末、あるいはペースト状、棒状、球状、ディスク状成型物を、加熱成型機を用いて加圧することにより得ることができる。さらには、上記ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体成型物を、乳鉢で薄く延ばしてやることによっても、容易に透明のフィルムを成型することができる。

上記の加熱成型機を用いたフィルムの作成時の温度は、フィルム成形用材料に応じて種々設定可能であるが、好ましくは室温（例えば、１５℃〜２５℃）〜１２０℃の範囲から選択するができる。また、フィルム成形時のプレス圧は、２〜２０ＭＰａの範囲から選択することができる。加圧時間は、所望の物性のフィルムが得られる程度でよく、上記の温度およびプレス圧であれば、例えば１〜１０分間でフィルム化を完了することができる。好ましくは、５〜１０分間プレスすることにより、丈夫で破れにくいフィルムを作製可能である。フィルムの厚さは、プレス時の温度、圧、加圧時間により調節することが可能であり、本方法によれば、１〜１００μｍ程度の膜厚の透明な複合体フィルムを得ることもできる。

本発明にかかる骨形成材料は、喪失された歯周組織の再生を図る組織再生誘導（ＧＴＲ）法において、ＧＴＲ膜として利用することができる。中でも、ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体を含む歯科用材料は、生体親和性（適合性）に優れ、ＧＴＲ膜の構成成分として特に好ましい。ＧＴＲ膜は、欠損部位において先行増殖をする上皮組織から遮蔽して、歯槽骨、歯根膜、セメント質などの再生を図るための環境形成材料である。このメンブレンは、一定期間、生体中に留置されるので、生体親和性の高い素材で形成されていることが好ましく、さらには歯周病菌などに対する抗菌性を有していることがさらに好ましい。こうしたメンブレンとしては、コラーゲンあるいはポリ乳酸を基材とした吸収性のメンブレンとフッ素樹脂を使用した非吸収性メンブレンが使用されている。本発明にかかるＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体のフィルム状、あるいはゲル状、糊状賦形物から成るＧＴＲ膜は、生体親和性が高く、従来のメンブレンよりも長期間にわたって安定に使用することができる。また、本発明の歯科用の材料を用いて製造されたＧＴＲメンブレンを使用すれば、再生期間を従来の吸収性メンブレンを用いた場合よりも長く設定することができる。

ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体では、ＤＮＡの有するアニオン性基であるリン酸基の一部と、プロタミンの有するカチオン性基とが静電的に結合して所望の賦形性を発現させているが、ＤＮＡ分子中にはプロタミンに結合していない多数のリン酸基が残存している。このＤＮＡ中のリン酸基を活用して、骨形成因子または成長因子と静電的に結合させて、これらサイトカインや抗生物質などのキャリアーとして使用することもできる。また、ＤＮＡの二重螺旋構造によるインターカレーションやグルーブバインディングを利用して、薬剤のキャリアーとすることもできる。

骨形成因子及び成長因子としては、ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体に担持可能であれば特に制限なく利用できる。例えば、骨形成因子としては骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、組換えヒト骨形成タンパク質（ｒｈＢＭＰ）を、成長因子としては線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ―β）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経栄養因子（ＮＧＦ）などを挙げることができ、これらの少なくとも１種を用いることができる。

また、ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体を、粉末状または顆粒状のリン酸カルシウムと、練り込みなどの方法により混合することにより、賦形性を有する混和物を得ることができる。この混和物の形成においては、必要に応じて適量の水分またはリン酸緩衝液を追加して賦形性のあるペースト状とすることができる。この混和物の形成によってリン酸カルシウムの顆粒や粉末に賦形性を持たせることが出来る。即ち、ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体とリン酸カルシウム顆粒また粉末の練和物は、モールドに充填することで自由な形に成形可能で、またシリンジに充填して押し出すことで、複雑な形状の骨欠損部にも充填することが可能である。また、ペースト状の混和物を所望の形状とした後に乾燥処理をして、混和物の所望の形状を固定することもできる。この混和物は、歯周組織再生療法における歯周組織（具体的には歯槽骨、歯根膜、セメント質）の再生誘導剤もしくは再生促進剤、あるいは骨欠損部における骨形成の誘導もしくは促進を目的とした骨補填材としての応用が可能であるが、これらの用途に限定されるものではない。

リン酸カルシウムとしては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（α―ＴＣＰ，β―ＴＣＰ）、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、リン酸四カルシウム（ＴｅＣＰ）、炭酸アパタイト（ＣＡＰ）などを挙げることができ、これらの少なくとも１種を用いることができる。

また、ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体は、上記の歯科用材料としてだけではなく、フィルム、ライニング材、コーティング材に形成し、これを再生医療用の足場材（スキャフォールド材）、創傷被覆材料、あるいは感染防止膜や癒着防止膜として用いることにより、移植した際の生体親和性を向上させたり、あるいは生体の異物に対する生体反応を抑制するようにしたことを特徴とする医療用材料としての利用も可能である。

次に実施例を示して本発明を実施するための最良の形態について、詳細に記載するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕
（ＤＮＡ／プロタミン複合体の作製）
シロサケの白子由来のプロタミン硫酸塩（プロザーブ；(株)マルハニチロ食品製）の５７％（ｗ／ｖ）水溶液と、同じくシロサケの白子由来のＤＮＡ（分子量分布の中心が３００ｂｐ、(株)マルハニチロ食品製）の０．５％（ｗ／ｖ）水溶液を用いた。それぞれプロタミン硫酸塩とＤＮＡの重量が１：１となるように、プロタミン硫酸塩水溶液０．８７５ｇを１００ｍＬの滅菌蒸留水で希釈し、ＤＮＡ溶液１００ｍＬと混合して１時間攪拌した。遠心分離により沈殿物を回収した後、水洗して再度遠心分離して得られた沈殿物をＤＮＡ／プロタミン複合体（未乾燥品）として回収した。このＤＮＡ／プロタミン複合体（未乾燥品）を更に凍結乾燥し、ＤＮＡ／プロタミン複合体０．６１ｇを得た。尚、ＤＮＡ／プロタミン複合体の回収率は、重量％で６１％（ｗ／ｗ）であった。
（エラスチンの作製）
サケ心臓をプロテアーゼアマノＰ６（天野エンザイム）で処理し、サケ心臓から動脈球の部分のみを残留物として回収する。回収した動脈球を４０℃の０．０６％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液で一晩処理して、塩酸で中和し、湯浴で８０℃達温後１５分間加熱し、動脈球の夾雑タンパク質などをさらに溶解、除去して、水不溶性エラスチンを得た。水不溶性エラスチンにシュウ酸あるいは酢酸を加えて、フィルター濾過して固形分を除去し、限外濾過膜処理（５０００Ｄａ）により酸を除去した後、凍結乾燥して水溶性エラスチンを得た。一方、水不溶性エラスチンにアルカラーゼ２．４Ｌ ＦＧ（ノボザイム）を加えて4時間処理した後、プロテックス６Ｌ（ジェネンコア協和）を加えて４時間処理し、加熱失活後に活性炭を加えてフィルター濾過し、凍結乾燥してエラスチン酵素分解物を得た。ゲル濾過クロマトグラフィーで分析したところ、水溶性エラスチンの分子量は９１００〜９７５００Ｄａ、エラスチン酵素分解物の分子量は３５０〜３６００Ｄａであった。尚、水不溶性エラスチンは不溶性のため分子量分布は測定していない。ＧＰＣのクロマトグラムを図１〜図２に示す。尚、ＧＰＣの分析条件としては、カラムはＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷｘｌ、溶媒としては０．１％トリフルオロ酢酸含有４５％アセトニトリル、スタンダードとしてはグルタチオン（３０７Ｄａ）、ブラジキニン（１０６０Ｄａ）、α‐メラノサイト刺激ホルモン（１６６５Ｄａ）、酸化インスリンＢ鎖（３４９６Ｄａ）、アプロチニン（６５１２Ｄａ）、シトクロームＣ（１２４００Ｄａ）カルボニックアンヒドラーゼ（２９０００Ｄａ）、アルブミン（６６０００Ｄａ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５００００Ｄａ）を用いた。
（ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体の作製）
ＤＮＡ／プロタミン複合体の粉末に適量の脱イオン水を加え、メノウ乳鉢上で練和してＤＮＡ／プロタミン複合体ペーストを作製した。このペーストにエラスチン酵素分解物および水溶性エラスチン、水不溶性エラスチンを２０％（ｗ／ｗ）と５０％（ｗ／ｗ）になるように、メノウ乳鉢上で練和しながら少量ずつ加え、ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体ペーストを作製した。

〔実施例２〕
（ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体の骨形成能の確認）
（ａ）試料
実施例１で得られた各ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体ペーストを内径８ｍｍ、厚さ１．５ｍｍのシリコンモールドに填塞し、ＤＮＡ／プロタミン／エラスチン複合体ディスクを作製した。１０週齢のＳＰラット（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ ｒａｔ、オス）の頭蓋骨部位に、トレフィンバーで直径５ｍｍの欠損を作製し、ディスク状複合体を埋入した。埋入後、骨膜および上皮の縫合を行った。
（ｂ）新生骨形成能評価：
埋入１ヶ月、２ヶ月及び３ヶ月目に同一個体を用いて、Ｘ線ＣＴ装置（ＳｃａｎＸｍａｔｅ‐ＲＢ０９０ＳＳ１５０、コムスキャンテクノ社製）を用いて頭骸骨欠損部の断層画像を撮影し、骨形成過程の進行の有無を確認し、骨形成量を比較検討した。また、対象群として、ブランク及び３００ｂｐＤＮＡ／プロタミン複合体単独群も同様に評価を行った。また、３ヶ月後に埋入試料を周囲組織から摘出し、通法にて固定、脱灰、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色した組織の観察を行った。
（ｃ）結果と考察
得られた結果を図３〜図６に示す。図３（ａ）は、骨欠損部に何も埋入せずに縫合したとき、図３（ｂ）はＤＮＡ／プロタミン複合体を単独で埋入したときのＤＮＡ／プロタミン複合体埋入部のμＣＴ画像（埋入１〜３ヶ月後）の状態をそれぞれ示している。図４（ａ）は、水不溶性エラスチンを２０％（ｗ／ｗ）添加したとき、図４（ｂ）は水不溶性エラスチンを５０％（ｗ／ｗ）添加したときのＤＮＡ／プロタミン複合体埋入部のμＣＴ画像（埋入１〜３ヶ月後）の状態をそれぞれ示している。図５（ａ）は水溶性エラスチンを２０％（ｗ／ｗ）添加したとき、図５（ｂ）は水溶性エラスチンを５０％（ｗ／ｗ）添加したＤＮＡ／プロタミン複合体埋入部のμＣＴ画像（埋入１〜３ヶ月後）の状態をそれぞれ示している。図６（ａ）はエラスチン酵素分解物を２０％（ｗ／ｗ）添加したとき、図６（ｂ）エラスチン酵素分解物を５０％（ｗ／ｗ）添加したときの添加したＤＮＡ／プロタミン複合体埋入部のμＣＴ画像（埋入１〜３ヶ月後）の状態をそれぞれ示している。各図において、（ａ−１）及び（ｂ−１）は埋入１月後の状態を、（ａ−２）及び（ｂ−２）は埋入２月後の状態を、（ａ−３）及び（ｂ−３）は埋入３月後の状態を、それぞれ示している。

以上の結果から、埋入後、ブランク群では、ほとんど骨形成は見られなかったが、ＤＮＡ／プロタミン複合体単独群では３ヶ月後に新生骨形成が確認された。ＤＮＡ／プロタミン複合体に水不溶性のエラスチンを２０％（ｗ／ｗ）および５０％（ｗ／ｗ）、水溶性エラスチンを２０％（ｗ／ｗ）および５０％（ｗ／ｗ）添加した群では、３ヶ月後でも新生骨形成は殆ど確認されなかった。一方、ＤＮＡ／プロタミン複合体にエラスチン酵素分解物を２０％（ｗ／ｗ）および５０％（ｗ／ｗ）添加した群では、埋入１ヶ月後より新生骨形成が確認でき、新生骨形成量は経時的に増加した。埋入３ヶ月後にはＤＮＡ／プロタミン複合体を単独で埋入した群よりも明らかに新生骨形成量が多く、ＤＮＡ／プロタミン複合体にエラスチン酵素分解物を添加したことによる骨形成速度の大幅な亢進が確認された。また、５０％（ｗ／ｗ）エラスチン酵素分解物化合物含有試料が２０％（ｗ／ｗ）のものより骨形成性が優れていた。
〔比較例１〕
当該発明におけるエラスチン酵素分解物と、エラスチン・プロダクツ・カンパニー社のα‐エラスチンおよびエラスチンの酸および／またはアルカリ処理分解物の分子量分布をゲル濾過クロマトグラフィーで分析した結果を表１に示す。当該発明のエラスチン分解物は比較例よりも分子量が小さいことが確認され、当該発明の酵素分解により得られた分子量３５０〜９９０Ｄａの低分子画分に強い骨形成促進を示す活性関与成分が含まれること、あるいは当該発明の酵素分解物に含まれない分子量３６００Ｄａ以上の高分子画分が骨形成を阻害している可能性が示唆された。

〔比較例２〕
当該発明におけるエラスチン酵素分解物と、エラスチン・プロダクツ・カンパニー社のα‐エラスチンおよびエラスチンの酸および／またはアルカリ処理分解物の骨芽細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ評価系における骨形成関連遺伝子の発現量の違いを調べた。９週齢の雄性ラットの口蓋歯肉を採取し、ｏｕｔ ｇｒｏｗｔｈ法により細胞の継代、単離、回収を行い、当該発明のエラスチン酵素分解物、および比較例のエラスチンを１μＬ／ｍＬの濃度で培養液に添加し、４８時間培養後にＲＮＡを抽出し、線維芽細胞から骨芽細胞様細胞への形質転換遺伝子であるマトリックス・メタロプロテナーゼ‐２（ＭＭＰ‐２）の発現量をＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを用いて測定した。培養液のみで培養した細胞をコントロールとし、コントロールのＭＭＰ‐２発現量を１としたときの相対発現量の結果を表２に示す。当該発明のエラスチン分解酵素は、ＭＭＰ‐２の遺伝子発現量を５．７倍に高めることが確認され、比較例のエラスチンには遺伝子発現量の変化は確認されなかった。従って、当該発明のエラスチン分解物は特異的に骨形成関連遺伝子の発現量を高めることが示された。

Claims (5)

1. 骨形成用の医療用または歯科用材料であって、
   （１）ＤＮＡ、
   （２）プロタミン、プロタミンの誘導体及びプロタミンの加水分解物のうち少なくとも１種類、及び
   （３）エラスチン酵素分解物
   を含む複合体を、骨形成用の有効成分とし、
   前記エラスチン酵素分解物の分子量が３５０〜３６００Ｄａの範囲にある
   ことを特徴とする骨形成用の医療用または歯科用材料。
2. 更なる薬効成分を、インターカレート及び／又はグルーブバインディングにより取り込んだ請求項１に記載の医療用または歯科用材料。
3. 骨形成因子または成長因子を担持させた請求項１または２に記載の医療用または歯科用材料。
4. リン酸カルシウムを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の医療用または歯科用材料。
5. 前記複合体が骨欠損部または歯槽骨欠損部への充填を可能とする賦形性を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の医療用または歯科用材料。
   

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