CN1241940A - 将物质经粘膜施用于哺乳动物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种将物质经粘膜施用于哺乳动物的新方法,该方法包括将哺乳动物的粘膜表面与组合在生物载体中的物质相接触,该生物载体具有一个核心,该核心包括一天然聚合物,或天然聚合物的衍生物或水解产物,或其混合物。优选的天然聚合物是多糖或寡糖。核心任选地被两亲性化合物如脂类包被。
Description
发明背景
大量的各种目的的药物已被研制用于动物包括人。这些物质包括治疗剂如药物,预防剂如用于疫苗中的抗原及诊断剂如标记的显象剂。这些物质可以各种肠道和非肠道给药方式给与。
最近潜在的已有的大分子如蛋白质及核酸分子药物化合物激增,这些大分子化合物由于其不稳定,难吸收及易代谢而在药物释放方面存在许多困难。
药物的粘膜给药方式重新引起人们的兴趣。粘膜是指机体内腔的上皮组织,如胃肠道、呼吸道,肺及生殖器的上皮组织。在本说明书中粘膜也包括眼的外表面即角膜。
一些常用的粘膜给药方式包括口腔及鼻腔给药。现已知的眼睛给药方法受到影响其疗效的限制,这些问题包括迅速经鼻泪管排出,难以渗入角膜,非分泌粘液的结膜破坏及不希望的全身接触药物。
Almeida等在药物定向杂志3:456-467(1996)中综述了疫苗的粘膜给药,尤其是疫苗的鼻腔给药方式。粘膜免疫性基于在粘膜相关的淋巴组织(MALT)的粘膜中的存在。这些组织包括肠相关淋巴组织(GALT),支气管相关淋巴组织(BALT),及鼻相关淋巴组织(NALT)。粘膜免疫可诱导局部(IgA)及全身(IgG)免疫应答。另外,存在一共用的粘膜免疫系统,其中抗原在一局部位点进入MALT,并经局部淋巴管转移至其它粘膜表面,在那里也诱导应答。
药物的施用可以在有载体也可以在没有载体情况下进行。经载体可以达到各种目的,如生物活性分子的受控释放,及生物活性分子定位到特异组织。
Illum等研究了三种作为潜在的用于鼻的药物释放系统的微球体。该微球体是白蛋白,淀粉及DEAE-Sephadex。尽管这些微球体有一定应用前景,但还需克服一些困难。
例如,Illum等报导了微球体的大小必须超过10μm。但如此大的颗粒存在一些不利因素。如其不能经超滤灭菌,需要其它如使用防腐剂等方法灭菌。
另外,Illum等报导了从带正电荷的微球体中释放药物的困难,带正电荷的微球体比较有优势,由Illum报导的问题必须解决。
脂质体通常被用作物质的载体,其呈现作为受控释放药物的释放系统及作为免疫佐剂的潜力。使用脂质体作为疫苗的载体见前面提及的Almeida等的文章。更具体地,使用脂质体作为流感疫苗的载体见于El Guink等,疫苗7,147-151(1989),及Burroughs WellcomeCompany的美国专利4,196,191和Wellcome Foundation的PCT国际申请WO 92/03162所述。
但使用脂质体作为活性化合物的载体也有一些问题,如通常只有少量的一种化合物可被混入脂质体中,且活性化合物与类脂的比率较低。此外活性化合物经常释放得太早。
脂质体也存在一些生产上的问题,如在生产过程的一个阶段,要使用去污剂及溶剂以提高溶解性。这些去污剂及溶剂在后期必须从药物中去除。
使用脂质体作为药物释放系统的其它问题已由Meisner在药物颗粒载体一治疗学应用(A,Roland编辑,Marcel Dekker,1993)第3章第31页中报导。因而需要一种更灵活的物质载体。
其它的物质载体已由麻省理工学院的美国专利4,921,757及4,900,556;Genzyme Corporation的美国专利5,354,853;AccessPharmaceuticlas,Inc的欧洲专利352 295阐述。例如Access专利描述了一种具有多价结合制剂如肝素的药物及诊断剂的载体。该多价结合制剂特异于内皮表面决定簇,并可以三微米大。
但Access专利所述的载体仍存在一些不利因素。首先Access载体与内皮细胞特异性结合。Access专利仅描述了在施用前预加载药物或诊断剂的载体。如此方法可导致不稳定性,因此在Access专利第19页的实施例X和XII中要在一段时间内测稳定性。另外Access专利所述载体通常太大以至于不能进行微量过滤。
除以上所述,还已知许多其它微球体及纳球体,其包括聚丙烯酸酯,胶乳及聚交酯聚合物。Bjork及Edman在国际药物杂志47,233(1988)中报导了淀粉,纤维素及葡聚糖如果达到一定标准,即其必须是吸水的,不溶于水的及可以粉末形式施用于鼻内,则可以作为吸收促进剂。
生物载体治疗学股份有限公司的PCT国际申请94/20078阐述了一种改良的新型载体。这些称作超分子生物载体(SupramolecularBiovectors,SMBV)的载体在水中呈溶剂化悬浮液,但仍保持其包裹物质的颗粒的完整性。这些SMBV包括一非液体亲水核心如交联的多糖或交联的寡糖及任选的含有两亲性化合物如磷脂的外层。生物载体(Biovector)还任选地具有接枝到多糖或寡糖核心的阳离子或阴离子配体。生物载体也任选地具有一层经共价键接枝到核心上的脂质化合物。(见PCT国际申请WO94/23701)。这些生物载体已有描述可用于疫苗中,如用于CMV疫苗中。(见PCT国际申请WO96/06638)。
由此需要一种能高效地释放某些物质给动物(包括人)的载体,并且克服现有技术载体的一些缺点。本发明的一个目的是提供一种以克服上述缺点的方式将生物活性分子及其它物质施用于哺乳动物的方法。更特别地,本发明的目的是提供一种通过载体将某些物质施用于哺乳动物的方法,所述载体以一种非特异方式将物质导向粘膜,能在即将给药前加载所述物质,其规格适于微量过滤且在12个月甚至一年或多年仍可保持稳定。
发明简述
本发明的这些目的及本领域技术人员能理解的其它目的通过提供一种将物质经粘膜施用于哺乳动物的新方法而实现。此方法包括将哺乳动物的粘膜表面与和生物载体组合的物质接触。该生物载体具有一包括天然聚合物或天然聚合物的衍生物或水解产物或其混合物的核心。
本发明还涉及与一种或多种生物活性化合物结合的生物载体在制备经粘膜施用于哺乳动物的用于治疗或预防的组合物,尤其是抗感染制剂中的应用。
附图简述
图1示出给大鼠施用14C-放射标记的生物载体之后从鼻粘膜清除14C-放射标记的生物载体的速率。残留在鼻腔的14C放射标记的百分率对给药后小时数绘图。这一方案见实施例II所述。方形代表阳离子生物载体,菱形代表阴离子生物载体,三角形代表游离14C(对照)。
图2示出根据实施例II所述方案,将14C放射标记的生物载体施用于鼠之后3,6及12小时在血浆中所发现的标记物浓度(ng/ml)。实心三角形代表SMBV-P1,实心圆形代表SMBV-P2,实心方形代表SMBV-P3,空心三角形代表SMBV-Q1,空心圆形代表SMBV-Q2,空心方形代表SMBV-Q3。
图3示出以在志愿者鼻腔内给药剂量的百分率表示的放射性平均浓度。
图4示出以相对于时间给药剂量的百分率表示的在胃及肠腔内放射性平均浓度。
图5示出所收集的SMBV/HA制剂组分或仅含HA的组分的蔗糖梯度分析(0~20%),其中蛋白质用在280nm的内在蛋白荧光或用蛋白质分析(微BSA技术)测定。
图6示出对鼻腔施用111In-DPTA+SMBV及111In-DPTA,相对于时间的每分钟标准计数/毫升(cpm/ml)。
图7示出对阴道施用111In-DPTA+SMBV及111In-DPTA,相对于时间的每分钟标准计数/毫升(cpm/ml)。
图8示出对舌下施用111In-DPTA+SMBV及111In-DPTA,相对于时间的每分钟标准计数/毫升(cpm/ml)。
图9是比较下列施用途径的血浆AUC(曲线下面积)的条线图,所述途径为静脉、鼻、阴道及舌下。
图10示出经在280nm的蛋白内在荧光及微BSA技术分析的所收集的SMBV/流感抗原配制品、多糖核心(PSC)及脂质膜的组分的蔗糖梯度分析(0~20%)。
图11示出在280nm的蛋白内在荧光及微BSA技术分析的所收集的具有四种不同外层成分(DPPC,DPPC/胆固醇,egg-PC/胆固醇及egg-PC)的SMBV-Q2及单独HA的组分的蔗糖梯度分析(0~20%)。
发明详述
在以下发明阐述中将应用以下解释。用于阐述发明实施方案后跟发明要素的术语“包括”意指该实施方案含有但非必须限于该要素。实施方案可包含相同要素的其它成员或其它要素。单数形式表示的要素即“物质”不排除超过一种要素,即“物质(复数)”。所有数字都是近似的,除非说明书文字或上下文表明不是这样。
如PCT国际申请WO94/23701,WO94/20078及WO96/06638中所述,令人意想不到地发现生物载体特别适于将物质经粘膜施用于哺乳动物,包括饲养动物、玩赏动物、实验动物及人。粘膜指的是位于机体内腔的上皮组织。例如粘膜包括消化道(口腔、食管、胃肠及肛门)、呼吸道(鼻道、气管、支气管及肺)及生殖器。本说明书中,粘膜还包括眼的外表面即角膜。
与生物载体组合的物质可以加至任何粘膜表面。一些特别合适的粘膜表面包括如鼻、口腔、阴道、眼睛、耳道、肺通道、尿道、消化道或直肠表面。
交联的多糖或寡糖优选与粘膜表面非特异性结合。本申请人意想不到地发现根据本发明非特异结合多糖及寡糖产生将物质施用于粘膜表面的优异载体。这一发现是令人惊奇的,因为如上所述AccessPharmacerticals的欧洲专利352 295报导在用于药物及诊断剂的载体中需要特异于内皮表面决定蔟的多价结合剂。
生物载体的性质
生物载体包括一天然亲水聚合物核心,如交联的多糖或交联的寡糖,或交联多糖或交联寡糖的衍生物或水解产物,或其混合物。该多糖或寡糖可以是天然交联的或是用已知方法化学交联的。一些合适的化学交联法包括例如将多糖或寡糖与多官能团试剂如表氯醇或氧氯化磷相接触。交联剂与葡萄糖残基的最小摩尔比在氧氯化磷情况下可以是如1∶15,1∶12或1∶10;在表氯醇情况下可以是1∶50,1∶40或1∶30。交联剂与葡萄糖残基的最大摩尔比在氧氯化磷情况下可以是1∶0.5,1∶0.7或1∶1,在表氯醇情况下可以是1∶2,1∶3或1∶5。在表氯醇情况下,交联剂与葡萄糖残基比率优选在1∶15~1∶7之间。在氧氯化磷情况下,交联剂与葡萄糖残基比率优选在1∶7~1∶2之间。当氧氯化磷用作多官能团试剂时,交联产物优选包括大约0.1~3.0mmole磷酸酯/g终产物,更优选0.4~1.0mmole磷酸酯/g终产物。
一些合适的天然交联多糖的例子包括例如纤维素及其衍生物。一些合适的化学交联多糖包括例如表氯醇交联的淀粉,即可降解淀粉微球体(DSM),及表氯醇交联的葡聚糖即Sephadex。
用于本发明的多糖或寡糖可以衍生自任何糖单体。葡萄糖是优选的单糖。聚合物或寡聚物可以α或β取向由单体形成,或者可以在每个糖单位的1-4或1-6位连接。多糖或寡糖优选分子量在1,000~2,000,000道尔顿,更优选在2,000~100,000道尔顿,最优选在3,000~10,000道尔顿之间。
优选的多糖是淀粉(葡萄糖α1~4聚合物)及葡聚糖(衍生自细菌的葡萄糖α1-6聚合物)。尤其优选淀粉。来自任何已知淀粉原料的淀粉都合适。一些合适淀粉原料包括如马铃薯、小麦、玉米等。其它合适多糖包括如果胶、等链淀粉、脱乙酰壳多糖及糖胺聚糖。
交联的多糖或寡糖也可以是上述交联多糖或寡糖衍生物或水解产物。一些优选的淀粉水解产物包括例如酸水解的淀粉如糊精,或酶解的淀粉如麦芽糖糊精。多糖或寡糖的水解度通过水解产物的还原力来检测,通常以葡萄糖当量值(DE)表达。DE范围优选在2~20,更优选在2~12范围之内。
将一离子基团(0~3毫当量,优选0~2毫当量离子电荷/g)任选地接枝至交联的多糖或寡糖。此离子基团可以是阴离子基团或阳离子基团。生物载体优选每克多糖核心具有最少0.2,0.4,0.6或0.8毫当量离子电荷,及最大1.2,1.4,1.6或1.8毫当量离子电荷。现有技术已知将离子基团接枝到多糖和寡糖的方法。
交联的多糖或寡糖经接枝负电荷或酸性基团而成为阴离子性的。一些合适的接枝至多糖或寡糖的阴离子基团包括如磷酸根,硫酸根或羧酸根。阴离子基团可经用多羟基酸,如磷酸、硫酸、琥珀酸或柠檬酸的活化衍生物处理多糖或寡糖而接枝。多羟基酸的活化衍生物包括如酰卤,酸酐及活化酯。优选的阴离子基团是经用氧氯化磷处理而接枝的磷酸根。接枝磷酸根基团的生物载体被称作SMBV-P。
多糖或寡糖可以经接枝一包括阳性电荷或碱性基团的配体而成为阳离子性的。一些合适的接枝至多糖或寡糖的阳离子基团包括如季铵离子及伯胺、仲胺或叔胺。一些合适的可被接枝至多糖或寡糖的配体包括如胆碱,2-羟丙基三甲基铵,2-二甲氨基乙醇,2-二乙氨基乙醇,2-二甲基氨基乙胺及2-二乙氨基乙胺。这些配体可以通过本领域已知方法如将多糖或寡糖与合适的相应烷基的衍生物如氯化物、溴化物,碘化物或环氧化物接触,而方便地接枝至多糖或寡糖。
其它将阳离子基团接枝至多糖或寡糖的方法包括接枝如上所述的多羟基酸,然后用一游离酸基团如游离羧酸基团经例如酰胺键或酯键接枝碱性配体。氨基酸可以这种方式方便地接枝。一些合适的氨基酸例子包括如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。
优选的阳离子基团是季铵。接枝季铵基团的生物载体被称作SMBV-Q。
需指出的是Illum等,在国际药物杂志39,189-199(1987)已报导:未发现可检出量的释放自阳离子葡聚糖微球体DEAE-Sephadex的模型药物。Illum等认为此不释放现象与模型药物与微球体基质内阳离子结合位点的结合有关。但本申请人意想不到地发现物质从接枝阳离子基团的多糖中有效释放。
任选地,生物载体的多糖或寡糖核心与脂质化合物层共价结合。该脂质化合物层可部分或完全地包被多糖或寡糖核心。该脂质层优选包括天然脂肪酸,如PCT国际申请WO 94/23701所述。
带有或不带有脂质层的交联的多糖或寡糖也可任选地部分或完全被一种或多种两亲性化合物外层所包被。这种生物载体被称作L-SMBV。只由交联多糖或寡糖核心组成的生物载体被称作核心生物载体。
两亲性包被层优选通过非共价键如离子键或氢键附着在交联多糖或寡糖上或附着在任选的脂质层上。选择适于包被层的两亲性化合物以产生适于所述物质、粘膜给药模型、及所需效果的物理-化学环境。
两亲性包被层可以包括任何可在生物载体核心表面上吸附的两亲性化合物。优选地两亲性包被层主要包括天然或合成的磷脂或神经酰胺,或其混合物。
磷脂的磷酸基团任选地被接枝至离子基团或中性基团。一些合适的磷脂包括如磷脂酰胆碱,磷脂酰羟胆碱,磷脂酰乙醇胺,磷脂酰丝氨酸及磷脂酰甘油。优选的磷脂是二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。
两亲性包被层也可包括磷脂或神经酰胺的衍生物。一些合适的磷脂衍生物包括PEG-磷脂及接枝至其它分子或聚合物的磷脂。
两亲性包被层也可包括其它两亲性化合物,其可以是两亲性化合物自身或与上述磷脂,神经酰胺或其衍生物结合。一些合适的其它两亲性化合物包括poloxamers、改良的聚氧化乙烯及其它去污剂及表面活性化合物。
附加的化合物及其混合物可以加入两亲包被层的磷脂或神经酰胺中,附加的化合物包括脂肪酸、类固醇(如胆固醇)、甘油三酯、脂蛋白、糖脂、维生素、去污剂及表面活性剂。
生物载体的制备通常可方便地以一步法(在核心生物载体情况下)或二步法进行。二步法首先制备核心,然后用两亲性化合物包被以产生轻生物载体。
生物载体的大小是本发明的一个重要因素。如Illum等已强调粒径超过10μm的微球体对鼻腔释放的重要性。见Illum等,国际药物杂志39,189-199(1987)。
但申请人意想不到地发现小于10μm的生物载体是将物质施用于鼻粘膜及其它粘膜的高效载体。本发明的生物载体最小直径优选约为20nm,更优选约30nm,最优选约40nm。最大直径优选约为200nm,更优选大约150nm,最优选大约100nm。生物载体的优化粒径在60-90nm之间,最优化大约80nm。
生物载体的相对较小粒径体现各种优点,使生物载体更适于施用于粘膜。如生物载体具有比较大的纳球体及微球体更大的相对比表面和体积。另外,小粒径的生物载体便于经微量过滤而灭菌,从而不需加防腐剂。
生物载体可以各种方式施用。例如可以分散形式如悬浮液或凝胶施用。生物载体也可用本领域已知方式制成干燥形式,并以适当的计量剂量装置施用。
例如分散的生物载体的悬浮液或凝胶可冻干或喷雾干燥。所有的轻生物载体,如阴离子或阳离子轻生物载体以及核心生物载体如阴离子和阳离子核心生物载体可被干燥。生物载体可以干燥形式施用或在合适介质中重悬浮(即再水合)后再施用,介质优选为药物可接受水性液体或凝胶。本发明中,重悬浮的生物载体是指已经干燥的并在合适介质中重悬浮的生物载体。
粘膜施用的物质
与根据本发明的生物载体组合施用于哺乳动物的物质可以是任何被用于哺乳动物的物质。一些合适的物质包括如治疗剂,预防剂及诊断剂。一种物质可为多种效用而导入,如治疗剂与预防剂,预防剂与诊断剂及治疗剂与诊断剂组合应用。
治疗剂可以是任何用于治疗哺乳动物疾病及状态的物质的组合物。一些合适的治疗剂例子包括放射性药物,止痛药、麻醉剂,肛直肠(anorcetic)剂,抗贫血剂,抗哮喘剂、抗糖尿病剂、抗组胺剂,抗炎药物、抗生素、抗毒蝇碱药、抗肿瘤药、抗病毒药,心血管药,中枢神经系统兴奋剂,中枢神经系统抑制剂,抗抑制剂、抗癫痫剂、anxyolitic剂、催眠剂、镇静剂,抗精神病药,β阻滞剂,止血剂,激素、血管扩张剂,血管收缩剂,维生素等。
与本发明的生物载体一起施用于哺乳动物的预防剂可以是任何用于以任何机制预防或降低任何哺乳动物疾病或影响机体健康的状态的预防剂。例如预防剂可以是一种用于抗病原体疫苗内的抗原。病原体可以是病毒或微生物如细菌、酵母或真菌。病毒可以是流感病毒如嗜血性流感病毒;巨细胞病毒;HIV;乳头瘤病毒;呼吸合胞体病毒;脊髓灰质炎病毒;痘病毒如鸡痘病毒(即水痘-带状疱疹病毒);麻疹病毒;虫媒病毒;柯萨奇病毒;疱疹病毒如单纯疱疹病毒;汉坦病毒属;肝炎病毒如甲、乙、丙、丁或戊型肝炎病毒;Lyme病病毒如Borrelia burgdorferi;腮腺炎病毒如副粘病毒;或轮状病毒如A,B或C型轮状病毒。使用抗流感病毒及HIV的疫苗已获得尤其满意的结果。
本发明的疫苗有效拮抗的细菌可以是在哺乳动物体内可引起疾病的任何细菌。例如细菌可以是奈瑟氏球菌属如淋病奈瑟氏球菌及脑膜炎奈瑟氏球菌;气杆菌;假单胞杆菌属;Prophyromonas如P.gingivalis;沙门氏菌属;大肠杆菌如E.coli;巴氏菌属;志贺氏菌属;螺旋菌如幽门螺旋菌;棒状杆菌如白喉棒状杆菌;梭状芽胞杆菌属如破伤风梭状芽胞杆菌;分枝杆菌属如结核分枝杆菌及麻风分枝杆菌;耶尔森氏菌属如鼠疫耶尔森氏菌;葡萄球菌属;博德特氏杆菌属如百日咳博德特氏杆菌;布鲁氏菌属如流产布鲁氏菌;弧菌属如霍乱弧菌;及链球菌属如突变链球菌。
本发明的疫苗有效拮抗的其它病原体包括如疟原虫属成员如引起疟疾的物种;血吸虫属如引起血吸虫病或裂体吸虫病的物种,及念珠菌属成员如白色念珠菌。
可与生物载体组合的物质可以是诊断剂。诊断剂可以是为检测疾病或状态,或为检测加入体内的不同物质如药物或疫苗的浓度而导入哺乳动物体内的物质的组合物。例如诊断剂可以是对比剂或显象剂,包廓能检测哺乳动物机体的器官或其它内在部分的磁性显象剂。或者诊断剂可以检测哺乳动物体内的病变,如角膜、呼吸道、消化道、耳道、尿道、直肠或哺乳动物的含有粘膜的其它部分的病变。
为上述目的,诊断剂最好用可检测基团标记。可检测基团可以是如放射性基团;荧光基团如荧光素;可见基团如标记染料;或磁性基团,优选用于磁共振显象的磁性基团。
与生物载体组合输送的物质可以是如一种小化学分子或一种生物分子。小化学分子通常是在其被施用的哺乳动物内可以或不可以天然产生的非聚合分子。小化学分子可以是例如有机分子,无机分子或有机金属分子。小化学分子的例子包括类固醇、卟啉、核苷酸、核苷等,及其混合物和衍生物。
生物载体对将生物分子输送到粘膜尤其有效。本说明书中,生物分子是一种天然产生的聚合物或其单体或组成部分。这种聚合物典型地包括单体如氨基酸、核苷、核苷酸、糖类及其混合物。生物分子的一些结构类别包括如氨基酸、肽、蛋白质、糖蛋白及脂蛋白;粘蛋白,单糖,寡糖、多糖及脂多糖;脂肪酸包括二十烷酸;脂质包括甘油三酯、磷脂及糖脂。
其它通过生物载体输送到粘膜的生物分子包括核苷酸、核苷及核酸分子,包括DNA和RNA聚合体及寡聚体。核酸可以是如核酶及反义寡核苷酸。核酸可以根据其自身诊断或治疗潜力或其与基因治疗相关联的表达能力而被施用。
生物分子的一些功能类别包括如细胞因子,生长因子、酶、抗原(包括抗原的表位及半抗原)、抗体、激素(包括天然及合成激素及其衍生物)、辅因子、受体、脑啡肽、内啡肽、神经递质及营养成分。生物分子的一些特例包括如胰岛素、干扰素如α-,β-,γ-干扰素;白细胞介素如IL-1至IL-15;白细胞介素受体如IL-1受体;降钙素;生长因子如促红细胞生长素;血小板生成素,表皮生长因子、及胰岛素样生长因子-1。
根据本发明的物质的施用可伴有一种或多种补加化合物以加强其活性,特性或可标记性。例如增加粘膜的吸收效力的佐剂已为本领域所熟知。一些如此的粘膜吸收增强剂的例子包括胆盐如甘氨胆酸钠、表面活性剂如聚氧化乙烯-9-十二烷基乙醚。增强抗原免疫原性的佐剂也已知。免疫原性增强剂包括如MPL,Quil A,QS21,LPS,内毒素,CTB及BCG。另外一些补加化合物包括如消毒剂、防腐剂、表面活性剂、稳定剂,螯合剂及着色剂。
本发明的另一重要特征是将物质施用于粘膜的灵活性。例如与大多数其它药物载体不同,本发明提供的每个被输送至粘膜表面的生物载体可输送一种以上的物质。
还有一种灵活性是一种或一种以上物质位于生物载体内。例如一种或一种以上的物质可以位于交联的多糖或寡糖的内核心。或者,一种或一种以上物质可以位于交联的多糖或寡糖的外表面。
如果交联的多糖或寡糖被两亲性层包被,一种或一种以上物质可位于两亲性化合物层的内核心。或者一种或一种以上物质可以位于两亲性化合物层的外表面。
如果每个生物载体将一种以上物质施用于哺乳动物,该物质部分或全部位于生物载体的相同部分。或者该物质部分或全部位于生物载体的不同部分。
已知将物质直接导向生物载体不同部分的方法,见PCT国际申请WO94/20078。
对于其它载体,可将物质先加载在生物载体中,且将加载的生物载体贮存直至施用于哺乳动物。但优选地将物质在即将包装前在空生物载体上后加载,或在不稳定物质情况下生物载体可以用作稀释介质以在即将施用于哺乳动物之前捕获物质。预加载及后加载生物载体的方法是已知的,例如见生物载体治疗学股份有限公司的PCT国际申请WO94/20078,WO94/23701,及WO96/06638。
用生物载体经粘膜施用的优势
用生物载体将物质经粘膜施用于哺乳动物的一些优势可参见以下实施例。这些优势只作为例证之因而阐述。但本发明不受这些实例的限制。
例如见实施例II所述试验,离子基团使生物载体施用方式根据特定情况的需求而变化。该方案详见于实施例II所述。概括地,三种阳离子型配制的及三种阴离子型配制的14C-标记的生物载体经鼻内途径施用于大鼠。在不同时间,大鼠被杀死并检测残留在鼻腔及血浆中的标记百分数。
此实验的结果示于图1,表明在施用5分钟后腔残留大约30%的经鼻内施用于大鼠的三种阳离子型生物载体剂量,且在12小时后仍存在。
阳离子型生物载体的良好粘膜粘附性提高了生物载体在靶粘膜内的存留时间。延长的存留时间是非常重要的,其中所施用物质提高的生物利用性或局部效应是所需的。所施用物质的局部效应在各种情况下均是所需的。
例如,当施用抗生素或抗病毒药物以治疗局部细菌或病毒感染时需要局部效应。或者当施用疫苗以保护哺乳动物抗由微生物或病毒所致粘膜感染时需要局部效应。再一需要局部效应的情况是施用诊断剂以显象含粘膜的器官。
相比之下,显示出相当的起始粘膜粘附作用(5分钟)的阴离子生物载体(SMBV-P1,SMBV-P2和SMBV-P3)比阳离子生物载体具有更快的从鼻粘膜清除速率。阴离子生物载体在施用3小时后,发现在鼻腔中少于10%的生物载体剂量在施用后保持5分钟。测试的三种阴离子配制品没有明显变化。
但在经鼻分别施用SMBV-P1,SMBV-P2及SMBV-P3之后3小时甚至接近6小时后,在血浆中发现大量标记的阴离子生物载体。见实施例II及图2。从而阴离子生物载体特别有用于当全身应答是所需时。
通常使用正电荷生物载体以施用生物载体具有可延长粘膜停留时间的优势。使用负电荷生物载体具有经过粘膜进入血管的能力增强之优势。这两种电荷类型的生物载体的优势可经施用正电荷和负电荷生物载体的混合物而结合起来。
实施例III的结果证实阴离子生物载体(SMBV-P1,SMBV-P2,SMBV-P3)的体内性能与阳离子生物载体(SMBV-Q1,SMBV-Q2,SMBV-Q3)不同。在此试验中,用实施例II方案处理的大鼠在12小时后杀死,并测定在不同器官14C的残留。
如所预期的,在鼻腔、鼻腔冲洗液及支气管中发现大量的来自阳离子生物载体的14C,这表明阳离子生物载体在所施用的粘膜内或在其施用附近的粘膜内的残留时间延长。对于阴离子生物载体,在肝和肾中明显量的14C表明,生物载体穿过粘膜流入血液中的量增加。
在小肠和大肠中发现大量的来自阳离子和阴离子生物载体的14C表明,在鼻腔施用后,生物载体的清除经过消化道发生。生物载体在消化道停留时间的延长在口服与生物载体相结合的抗原进行口服接种情况下尤其明显。
阳离子生物载体的良好粘膜粘附作用的进一步证据见实施例IV结果所示。在该试验中,荧光标记的阳离子轻生物载体以分散的或重悬浮的形式被鼻内施用于大鼠。大约20%的重悬浮的生物载体在施用后粘附于粘膜,并以同样量保持至少12小时。分散的生物载体在3小时后除以低水平粘附之外,不能粘附于鼻粘膜。在施用5分钟后在鼻腔冲洗液中仍可发现所施用的荧光生物载体的1/3仍留在悬浮液中,但在6小时后则未发现。
实施例V提供了在经粘膜施用疫苗中生物载体优越性的重要证据。在此实验中对比了在阳离子轻生物载体中的制备自病毒膜的血凝素(HA)及神经氨酸酶的单价疫苗抗原的鼻内(i.n.)施用与单独抗原的鼻内及皮下施用。该实验表明以鼻内施用的在生物载体中的抗原能引起较高的粘膜及血清应答。
这样,当抗原在生物载体中以鼻内方式施用时与抗原单独皮下施用相比,总IgG,特异性IgG和血凝抑制因子在相同数量级。但抗原/生物载体配制品引起循环及分泌性IgA的产生,而皮下或鼻内施用单独抗原则不能。
另外,当抗原在生物载体中以鼻内方式施用时,鼻腔冲洗液中特异性IgG与总IgG的比率比皮下单独施用抗原时的该比率高出2倍。这一高比率表明免疫应答有望更特异及更保护。尽管不希望受理论限制,本申请人认为膜抗原如那些用于此实验的抗原经生物载体的外层呈递,产生一有利于将抗原呈递给免疫系统的脂质环境。
实施例VI所述实验对比了HIV的gp160蛋白的不同配制品对兔粘膜免疫应答的效力。该蛋白经两种正电荷的轻生物载体配制品,一种分散型配制品和一种重悬浮型配制品施用。作为对照,将该蛋白与潜在粘膜佐剂霍乱毒素B亚基(CTB)组合施用。在这三种情况下,以30天间隔进行一系列免疫接种。前二次免疫经阴道,后二次免疫经口服,最后一次免疫经肌肉进行。
结果示出在第二次阴道施用后第10天(D40),生物载体与CTB在阴道及唾液中引起特异性IgA分泌的效力相同。当与抗原和CTB组合配制品或分散的SMBV相比时,重悬浮的SMBV诱导使IgA提高50%。
需指出的是抗原的阴道施用引起特异性IgA在唾液及阴道中分泌。这样以阴道水平进入MALT(粘膜相关的淋巴样组织)的抗原引起IgA在该部位的分泌。另外生物载体配制品能通过进入所谓的“共有粘膜免疫系统”在唾液中刺激健全的IgA应答。
实施例VII所述的实验比较了在对照配制品中流感血凝素对小鼠的鼻内免疫与四种不同轻生物载体配制品对小鼠的鼻内免疫,这四种配制品是:分散的及正电荷的、分散的及负电荷的、重悬浮及正电荷的,重悬浮及负电荷的。在28天后测定预加载及后加载的每种生物载体配制品对相关血清IgG滴定度的作用。另外对比了将预加载的生物载体施用于清醒的动物所得相关滴定度及将预加载的生物载体施用于麻醉的动物所得相关滴定度。
正如所预期的,不具有任何载体或佐剂的对照亚单位抗原当鼻内施用于清醒的或麻醉的小鼠时,免疫原性不高。在SMBV亚组中,正电荷的分散的生物载体的滴定度比仅用抗原或其它生物载体配制品的滴定度明显增加(超过一个数量级)。预加载及后加载的生物载体均具有通常可比的效果。生物载体的此通用性尤其令人感兴趣,其可以使活性物质与生物载体在施用时混合,或将活性物质在其使用前与生物载体结合。
令人惊奇地,麻醉动物未显示抗体滴定度明显增高,提示抗原在下呼吸道或肺内的沉积(如果有)的生物效应很小。
实施例1 生物载体的制备
在下面实施例中,标记的生物载体在磷脂化过程前标记。当用一种(或一种以上)生物活性化合物加载时,要在产生空生物载体之后进行。
I(a)阴离子核心生物载体(SMBV-P1)的制备
将500g麦芽糖糊精(Glucidex,Roquette,Lestrem,France)与2升脱矿质水一起倾注于10升反应器(TRIMIX)中。在4℃溶解后,将500ml 10M氢氧化钠机械搅拌加入。当溶液的温度稳定在4℃时,在受控流动条件下加入1700ml 10M NaOH和283.3ml POCL3。在20小时阶段期间机械搅拌下发生交联反应。在20小时阶段末,将反应混合物再搅拌15分钟。加入体积为5升的脱矿质水,并用冰醋酸将pH中和调节至7.0。在高压下研磨所得水凝胶。在此步骤末,颗粒的平均直径大约为60nm。进一步纯化程序如下:①在0.45μm微量过滤以清除较大颗粒,②以恒体积渗滤以清除较小分子(盐、多糖片段等)。然后浓缩阴离子多糖核心(PSC),加入无菌烧瓶中在-20℃贮存。
I(b)分散的阴离子轻生物载体(SMPV-P2)的制备
如实施例I(a)所述制备阴离子核心生物载体,并当需要时用所述方法标记。在玻璃烧瓶中以1mg/ml的浓度将解冻的核心用渗透水稀释(如250mg PSC/250ml水)。将此分散体搅拌5~10分钟,并在高压均质机(RANNIE实验室)中在400bars均质3分钟。在恒温浴器中在80℃保温此悬浮液。将粉末形式的外膜脂质(如DPPC,DPPC/胆固醇等)以与PSC为0.3∶1(w/w)的比率加入(如75mg脂质/250ng PSC)。将脂质混合并用2.5ml 95%(v/v)乙醇溶解。将均质机经封闭水循环保温在60℃。将脂质的乙醇溶液在80℃注入PSC悬浮液中,然后在60℃以450bars均质25分钟。在此步骤末,将制备物置入玻璃容器内并在减压下将游离乙醇从轻生物载体制备物中清除。将所得阴离子轻生物载体过滤(0.2μm)并贮存。
I(c)重悬浮的阴离子轻生物载体(SMBV-P3)的制备
将阴离子核心及轻生物载体以1.2mg/ml浓度悬浮在水中,然后以1ml剂量分布于特殊标记的冷冻瓶中以冻干。将冷冻瓶置于冻干器上(Dura dry,FT Systems),在-30℃冷冻,并分步冻干,在开始干燥期间,首先-10℃,然后0℃,最后10℃,在随后步骤30℃。通常在24小时内可干燥。将每个冷冻瓶中的冻干的生物载体在200μl PBS中再水合。
I(d)阳离子核心生物载体(SMBV-Q1)的制备
将500mg麦芽糖糊精(Glucidex,Roquette,Lestrem,France)用0.880升水在20℃在温度调节反应器中搅拌溶解。加入7g NaBH4并混合1小时。加入220ml 10M NaOH,随后加入30.25ml表氯醇(Fulka)。反应12小时后导入382.3g缩水甘油基三甲基氯化铵(Fulka),并将此混合物搅拌10小时。将所得凝胶用8升脱矿质水稀释,并用冰醋酸中和将pH调节为7.0。在高压下研磨所得水凝胶。所用压力为400bars。在此步骤末,颗粒的平均直径大约为60nm。进一步纯化程序如下:①在0.45μm微量过滤以清除较大颗粒,②以恒体积渗滤以清除较小分子(盐,多糖片段)。然后浓缩阳离子PSC,在无菌烧瓶中制成样本并在-20℃贮存。
I(e)分散的阳离子轻生物载体(SMBV-Q2)的制备
如实施例I(d)所述制备阳离子核心生物载体并在需要时如上所述加以标记。在玻璃烧瓶中以1mg/ml浓度将解冻的核心用渗透水稀释(如250mg PSC/250ml水)。将此分散体搅拌5~10分钟,并在400bars下均质(RANNIE Lab)3分钟。在恒温浴器中在80℃保温此悬浮液。将粉末形式的外膜脂质(如DPPC,DPPC/胆固醇等)以与PSC为0.3∶1(w/w)的比率加入(如75mg脂质:250mg PSC)。将脂质混合并用2.5ml 95%(v/v)乙醇溶解。将均质机经封闭水循环保温在60℃。将脂质的乙醇溶液在80℃注入PSC悬浮液中,然后在60℃以450bars均质25分钟。在此步骤末,将制备物置入玻璃容器内,并在减压下将游离乙醇从轻生物载体制备物中清除。将阳离子轻生物载体过滤(0.2μm)并贮存。
I(f)重悬浮的阳离子轻生物载体(SMBV-Q3)的制备
将阳离子核心及轻生物载体以1.2mg/ml浓度悬浮在水中,然后以1ml剂量分布于特殊标记的冷冻瓶中以冻干。将冷冻瓶置于冻干器上(Duradry,FT System),在-30℃冷冻,并分步冻干,在开始干燥期间,首先-10℃,然后0℃,最后10℃,且在随后步骤以30℃干燥。通常在24小时内可干燥。将每个冷冻瓶中的生物载体在200μl PBS中再水合。
I(g)用14C氰尿酰氯标记生物载体
利用氰尿酰氯与多糖的游离羟基反应的能力用放射性14C三嗪标记多糖核心。该反应在如上所述制备的多糖核心上进行。下面的方案适用于任何多糖核心(阴离子或阳离子)。
从Dupont NEN Product(Boston,MA)商业合成获得47mCl/mmol14C氰尿酰氯。在使用前将氰尿酰氯以100g/l悬浮在纯乙腈中。将多糖核心以40g/l悬浮在水中,并用碳酸钠将pH调节为10。将悬浮液加温并保持在50℃,加入所需量的氰尿酰氯(通常在1~5%(w/w)多糖核心)。并用pH计监测pH值。经加入少量固体碳酸钠使pH值在反应期间保持恒定,且反应进行5小时。一旦反应完成,将标记的多糖核心悬浮液置入装备10kd膜(Amicon,France)的超滤搅拌器中,并将该溶液经1mM pH7.4磷酸盐缓冲液渗滤,直至在滤液中未发现有放射性。然后将所得标记的多糖核心悬浮液经0.2μm滤器过滤灭菌,并贮存在无菌容器中。用Beckman Beta-Counter(Germany)检测放射性含量并以μCi/每克多酶核心表示。所得标记的多糖核心可用作如上所述制备标记的生物载体。
I(h)用二氯三嗪荧光素标记生物载体
利用二氯三嗪组分与多糖游离羟基反应的能力用二氯三嗪荧光素标记多糖核心。该反应在如上所述制备的多糖核心上进行。此方案适用于任何多糖核心(阴离子或阳离子)。二氯三嗪荧光素得自Sigma Chemicals(St.Louis,USA)。在使用前将二氯三嗪荧光素以100g/l悬浮在纯二甲基甲酰胺中。将多糖核心以50g/l悬浮在缓冲溶液(150mM NaCl和140mM碳酸氢钠)中,并不用NaOH将PH调节为10。加入所需量的二氯三嗪荧光素(通常为1-50%(w/w)多糖核心),并在室温下轻搅拌反应5小时。一旦反应完成,将标记的多糖核心悬浮液置入装备30kd膜(Amicon,France)的超滤搅拌器中,并经水渗滤该溶液直至滤液中未发现放射性。然后将所得标记的多糖核心悬浮液经0.2μm滤器过滤灭菌,并在灭菌容器中保存。用Perkin Elmer Luminescence Spectrophoto meter LS50 B检测荧光含量。所得多糖分子在标记后就通常用于如上所述制备SMBV悬浮液。
I(i)SMBV-Q2的111In配制品的制备
将111InCl3(Cisbio)溶液(370MBq/ml)与InCl3(Fluka)溶液(InCl315mM,柠檬酸钠2mM,pH6.0)混合,将该溶液加到SMBV-Q2悬液中。最终的悬液具有下列特征:SMBV-Q2 15mg/ml,InCl3 0.3mM,柠檬酸钠1mM,pH6.0。
在柠檬酸缓冲液(1mM,pH6.0)中稀释1/10后用γ计数器测游离铟的浓度,并经Mcrocon 100kd(Amicon)超滤。将所得悬浮液经过滤(0.2μm)灭菌,并保持在4℃直至施用前。为将悬浮液施用于受试者,将120μl悬浮液导入单喷雾器(Piffer,UK)中,从而使以100μl/射施用。
下表I-1示出利用制备的一批原料进行人类药物动力学研究的结果。在这些条件下,由InCl3标记的SMBV用缔合速率87.5±9.8%精确定量。进一步地发现放射性剂量(0.39±0.03MBq/剂)与人鼻内施用SMBV后进行的闪烁照相极匹配。表I-1:用于人类药物动力学研究中的用111In标记的SMBV-Q2制剂的性质
平均值 | SD | |
PSC(mg/ml) | 12.7 | 1.7 |
DPPC(mg/ml) | 2.3 | 0.2 |
胆固醇(mg/ml) | 0.67 | 0.06 |
放射活性(Mbq/剂量) | 0.39 | 0.03 |
I(j)分散的轻生物载体的大规模制备
对实施例I(b)和I(e)所述程序进行修改以能大规模生产。将高压均质步骤的持续时间根据所制备的轻生物载体的体积及浓度加以变化。第二步高压均质可以省略,并替代为将轻生物载体在80℃经搅拌保温。乙醇的清除可经水渗滤而非减压来完成。
实施例II 14C-标记的生物载体对大鼠鼻粘膜的粘附
将每只大约重200g的雄性Sprague Dawley大鼠根据所施用的标记的生物载体类型分成6组。这6种所用生物载体见下表II-1所示:表II-1:用于鼻内药物动力学和生物分布研究中的生物载体的性质
PSC载荷是指每克多糖核心阴离子的毫当量ND指未测定
样品 | SMBV-P1 | SMBV-P2 | SMBV-P3 | SMBV-Q1 | SMBV-Q2 | SMBV-Q3 |
类型 | 核心 | 轻 | 轻 | 核心 | 轻 | 轻 |
实施例 | I(a) | I(b) | I(c) | I(d) | I(e) | I(f) |
电荷类型 | 阴离子 | 阴离子 | 阴离子 | 阳离子 | 阳离子 | 阳离子 |
PSC载荷 | 1.79mEq/g | 1.79mEq/g | 1.79mEq/g | 1.85mEq/g | 1.85mEq/g | 1.85mEq/g |
PSC平均直径 | 55nm | 55nm | ND | 68nm | 68nm | ND |
状态 | 分散的 | 分散的 | 重悬的 | 分散的 | 分散的 | 重悬的 |
SMBV-P1和SMBV-Q1组的每只大鼠未麻醉经鼻内施用了100μg在50μl悬浮液中的经14C标记的生物载体配制品(每鼻孔25μl)。
SMBV-P2,SMBV-P3,SMBV-Q2及SMBV-Q3组的每只大鼠经鼻内未麻醉施用了150μg在50μl悬浮液中的经14C标记的生物载体配制品的(每鼻孔25μl)。
上述剂量代表大约每千克大鼠使用200μl生物载体悬浮液。悬浮液的这一体积相当于每千克大鼠大约400μg多糖及约200μg脂质。
在0.083小时(5分钟),3小时,6小时,12小时及24小时,将每组的3只大鼠杀死。分离两侧鼻腔,打开鼻道并且用5ml生理盐水冲洗;取血并离心。测定鼻腔冲洗液、鼻腔及血浆中14C残留量。结果示于图A和B。
实施例III鼻施用14C标记的生物载体后的生物分布
如实施例II所述处理每只重约200g的雄性Sprague Dawley大鼠。鼻内施用后12小时,将每组的3只大鼠杀死。并测定残留在肝、脾、肾、支气管、肺、食管、胃、小肠、大肠、骨骼肌、上颌骨下淋巴结、脑和鼻甲中的14C残量。
下表III-1示出鼻内施用如表II-1所述生物载体配制品12小时后生物分布:
表III-1:鼻腔给予不同的生物载体制剂后12小时生物分布
所用生物载体的描述见表II-1Blq=低于定量水平
器官 | SMBV-P1 | SMBV-P2 | SMBV-P3 | SMBV-Q1 | SMBV-Q2 | SMBV-Q3 |
支气管 | blq | blq | blq | 1.05±1.81 | blq | 1.34±1.53 |
肺 | blq | blq | blq | blq | blq | 0.15±0.11 |
食管 | 0.05±0.04 | blq | blq | blq | blq | blq |
胃 | 0.23±0.08 | 0.44±0.48 | 0.38±0.41 | 0.55±0.18 | 1.56±0.98 | 3.20±4.60 |
S-L肠 | 46.9±8.1 | 48.6±16.7 | 43.0±19.5 | 42.0±8.7 | 52.3±21.5 | 33.4±16.1 |
脾 | blq | blq | blq | blq | blq | blq |
肝 | 0.72±0.49 | 0.46±0.03 | 0.33±0.06 | blq | blq | blq |
肾 | 0.31±0.16 | 0.34±0.14 | 0.23±0.02 | 0.04±0.01 | 0.04±0.01 | blq |
脑 | blq | blq | blq | blq | blq | blq |
肌肉 | blq | blq | blq | blq | blq | blq |
淋巴结 | blq | blq | blq | blq | blq | blq |
血浆 | blq | blq | blq | blq | blq | blq |
鼻甲 | 0.54±0.64 | 0.68±0.90 | 0.51±0.54 | 11.4±7.0 | 8.7±8.8 | 8.6±7.4 |
洗涤液 | 0.007±0.002 | 0.008±0.003 | 0.008±0.002 | 0.64±1.03 | 0.25±0.20 | 0.26±0.38 |
实施例IV荧光生物载体对大鼠鼻粘膜的粘附
对3组麻醉的雄性Wistar大鼠(每组12只大鼠)在鼻孔内单滴给予50μl的PBS/甘油悬浮液(对照组),0.93mg/ml荧光素标记的阳离子轻生物载体(实施例I(h))悬浮在PBS/甘油中的悬浮液(分散的L-SMBV);或0.93mg/ml的冻干的阳离子荧光素标记的轻生物载体重悬浮于PBS/甘油中的悬浮液(重悬的L-SMBV)。分散的SMBV直径大约80nm,多糖核心用季铵离子接枝。
在初始,5分钟,3小时,6小时及12小时杀死每组两只大鼠。测定两组鼻腔洗液(用NaCl冲洗3次)及鼻粘膜(刮下)内荧光。结果示于下表IV-1及IV-2。表IV-1:鼻腔洗液中的荧光百分数
表IV-2:鼻腔中的荧光百分数
鼻腔洗液 | 5分钟 | 3小时 | 6小时 | 12小时 |
分散的SMBV-Q | 28% | 3% | 0% | 0% |
重悬的SMBV-Q | 30% | 1% | 0% | 0% |
鼻粘膜 | 5分钟 | 3小时 | 6小时 | 12小时 |
分散的SMBV-Q | 40% | 4% | 3% | 0% |
重悬的SMBV-Q | 21% | 20% | 20% | 20% |
平行进行的组织学研究示出观测到的荧光是非颗粒状的,且通常可见在细胞的顶极。
实施例V单价疫苗流感病毒抗原在生物载体中经鼻内施用与HA单独鼻内及皮下施用的对比
用于研究的抗原是可商购的制备自病毒膜的单价疫苗的血凝素(HA)及神经氨酸酶(N)。将5μg抗原施用于三组中的每组6只BALB/C小鼠中进行研究。二组只用抗原,一组鼻内施用,另一组皮下施用。第三组给予在如实施例I(e)制备的具有两亲性层(DPPC/胆固醇的比例为70∶30)的分散的正电荷的生物载体(SMBV-Q)中的抗原。在0天和21天经皮下注射或鼻内施用。在第35天经ELISA及抗Nib 16抑制性血凝试验分析抗体应答。结果示于下表V-1。表V-1:对鼻内施用的抗原的应答
流感疫苗的施用方式 | 血清中的总ELISA应答 | 鼻咽洗涤液中的ELISA应答 | |||
IgG | IHA | IgA | 特异的IgG | 特异的IgA | |
皮下 | 350000 | 320 | 0 | 64 | 0 |
鼻内 | 2000 | 0 | 0 | 0 | 1.5 |
以分散的SMBV-Q鼻内施用 | 145000 | 240 | 581 | 48 | 128 |
实施例VI:使用生物载体的HIV gp160的施用途径对比
以一个月间隔在兔体内进行抗HIV gp160蛋白的连续免疫接种:两次阴道施用,两次口服及一次肌内注射。四只雌兔接受5次剂量为10μg的HIVgp160,其配制为:
(a)一种含有霍乱毒素B亚基(CTB),及是潜在粘膜佐剂的霍乱弧菌外毒素的溶液。
(b)一种正电荷的分散的轻生物载体(分散的SMBV-Q2)溶液。此溶液每100μg/ml gp160含有1.95mg/ml生物载体(1.5mg/ml多糖核心及0.45mg/ml脂质(如DPPC/胆固醇)。
(c)一种冻干的正电荷的重悬浮于PBS中的轻生物载体的溶液(重悬浮的轻生物载体即重悬浮SMBV-Q3)。该溶液每100mg/mlgp160含有1.95mg/ml生物载体(1.5mg/ml多糖核心及0.45mg/ml脂质如DPPC/胆固醇)。
如下进行免疫接种:在0天(D0)及30天(D30)阴道施用,在D60及D90口服;在D120肌内注射。
在每次免疫之后10天(D40,D70,D100,D130),经ELISA测定阴道粘膜及唾液中特异性IgA。结果示于下表。表VI-1:经生物载体输送的HIV gp160的阴道施用
表VI-2:经生物载体输送的HIV gp160的口服施用
在D40时阴道中的IgA | 在D40时唾液中的IgA | |
gp160-CTB | 0.41 | 0.42 |
gp160-分散的SMBV-Q | 0.42 | 0.42 |
gp160-重悬的SMBV-Q | 0.65 | 0.60 |
唾液中的IgA | 阴道中的IgA | ||
D70 | D100 | D100 | |
gp160-CTB | 0.42 | 0.38 | 0.28 |
gp160-分散的SMBV-Q | 0.47 | 0.35 | 0.29 |
表VI-2示出在最后一次阴道施用之后,口服仍可保持粘膜免疫性在相同水平。
另外,生物载体与CTB一样在保持特异性IgA经阴道及唾液分泌上一样有效。表VI-3:经生物载体输送的HIV gp160的肌肉内施用
D130 | 唾液中的IgA | 阴道中的IgA |
gp160-CTB | 0.16 | 0.08 |
gp160-分散的SMBV-Q | 0.05 | 0.16 |
表VI-3示出在第130天(D130),粘膜免疫反应未持续。肌内注射不能再促进免疫反应。
因而生物载体当用于在粘膜水平释放抗原时显示可诱导粘膜免疫。其是尤其适于粘膜施用的活性化合物载体。
实施例VII:由生物载体经鼻内输送的流感血凝素
将4只雌性小鼠分别在D0及D14用5μg血凝素(HA)加至20μl或50μl PBS溶液或悬浮液中单独或配成生物载体配制品于鼻内施用加以免疫和加强免疫。一组动物轻度乙醚麻醉(*),而其它组是清醒的。在清醒动物的外鼻上施用20μl以限制抗原在上呼吸道。将50μl直接用于麻醉动物的鼻内使至少部分抗原除沉积在鼻腔上还沉积在下呼吸道及肺。
使用四种不同的生物载体:正电荷(SMBV-Q)及负电荷(SMBV-P)的轻生物载体,其为重悬浮(res)或分散的(disp)。
将流感病毒亚单位抗原预加载于生物载体(HA于SMBV中),或简单后加载(HA+SMBV),即在其施用于动物前直接混合。单用抗原作为对照。用于本研究的物质的特性等价于为人接种之目的。
在第28天(D28)杀死小鼠。从门静脉中取血清样本并经ELISA测抗原特异性抗体。结果示于表VII-1
表VII-1:对鼻内施用在生物载体中的HA的应答。数值是血清IgG滴定度(几何均数),其为样品稀释度的倒数,相应于在492nm超过背景0.2以上的吸光度。
未麻醉动物 | 麻醉动物 | ||||
HA的施用 | HA | HA在SMBV中 | HA+SMBV | HA | HA在SMBV中 |
单独 | 100 | 200 | |||
disp SMBV-P | 200 | 200 | 60 | ||
res SMBV-P | 400 | 30 | 30 | ||
res SMBV-Q | 10 | 20 | 30 | ||
disp SMBV-Q | 2000 | 2000 | 4000 |
实施例VIII:人体生物载体TM(BiovectorTM)在人鼻内的施用
VIII(a)生物载体TM在人鼻腔中存留时间
10名禁食的健康非吸烟男性,年龄在18~35岁之间,在每侧鼻孔中施用1.5mg111I-放射标记的SMBV-Q2配制品(100μl/鼻孔)。此剂量等同于60kg体重约0.05mg/kg。此研究是非随机的三向交叉研究。
在鼻内施用之后,用γ-相机收集闪烁照相影像以确定经鼻粘膜施用的放射性的保留。收集一系列连续的侧头影像。在鼻腔内的放射性浓度示出在所研究期间内稳定衰减。当与现有技术相比时,在12及24小时仍分别检出20%及7%的剂量,其表明溶液停留时间延长。物质从两区室模型鼻腔的半清除期大约为2小时。这些结果示于图3,证实生物载体TM将物质在鼻腔延迟释放的潜在能力。
VIII(b)在111铟放射标记的生物载体TM施用于人体之后的生物学分布
将放射标记的生物载体TM配制品施用于自愿者鼻内后,除在鼻区检测γ计数外(如上所述),也在其它感兴趣部位测定计数(如肺、胃、小肠/结肠),其以所测计数最大值的百分率表达。这使观测到的放射性在机体的移动得以定量。也要检测24小时收集的总尿、便样本中的放射性。
经鼻腔清除的鼻用药量通常被吞咽,随后经胃肠道排泄。此鼻给药量的清除由在早期胃内检出一定量的放射性,及在晚期小肠/结肠内检出这一事实而支持。存留在小肠/结肠的放射性量与排泄至粪便中放射性量之间可产生一良好反相关。在所测试的感兴趣部位未检出可与其它所识别的组织或器官相关的明显放射性。在尿中检出微量放射性表明只有少量药剂被全身性地吸收。相反在许多志愿者中,在施用(24小时后在小肠/结肠可检出大量放射性平均初始剂量的1/3),这表明该物质已经被排泄。这些结果示于图4。这样,上述结果证实SMBV-Q2配制品是粘膜粘附的,并具有明显潜在的诊断意义,如胃肠道(GI)显像。
实施例IX:纯化的血凝素(HA)/生物载体配制品的鼻内施用评价
流感蛋白溶液基于片段流感疫苗,其是不同流感蛋白的混合物:血凝素(HA),神经氨酸酶(NA)及其它病毒蛋白如基质蛋白,核蛋白及三种聚合酶。血凝素被认为是该疫苗的主要抗原。为表征HA与SMBV结合的特性,我们分析了纯化的HA与SMBV的结合。纯化的HA得自流感病毒(B/Harbin毒株),使用Wiley等,Ann.Res.Biochem.56:365-394(1987)所述经典菠萝蛋白酶方法。
IX(a):HA与SMBV结合的研究
在蔗糖梯度(0~20%)上分离配制品后分析HA与SMBV结合的产率。蔗糖梯度用于将游离HA从与SMBV结合的HA中分离出。游离HA被分离至该梯度的最后组分。另外由于HA与SMBV配制在一起,蛋白质密度的变化可由于其与SMBV的结合而观测到。观测到HA与SMBV几乎定量结合。用微BCA技术或在280nm照射后抗原的内在荧光分析抗原蛋白质含量(使用这两种技术未发现有何不同)。该实验结果示于图5。
IX(b):小鼠对鼻内施用在生物载体TM中的HA的应答
将4只雌性小鼠分别在D0及D14用5μg血凝素(HA)加至20μl或50μl PBS溶液或悬浮液中单独或配成生物载体配制品于鼻内施用加以免疫和加强免疫。对于5μg的HA,HA/脂质比率为1/10,导入SMBV量大约为220μg。一组动物轻度乙醚麻醉。在清醒动物的外鼻上施用20μl以限制抗原在上呼吸道。将50μl直接用于麻醉动物的鼻孔内使至少部分抗原沉积在下呼吸道及肺。
使用四种不同的生物载体:正电荷(SMBV-Q2,Q3)及负电荷(SMBV-P2,P3)的轻生物载体,其为重悬浮(res)或分散的(disp)。将HA预加载于生物载体(HA于SMBV中),或简单后加载(HA+SMBV),即在其施用于动物前直接混合。单用抗原作为对照。在第28天(D28)杀死小鼠。取血清样本并经ELISA测抗原特异性抗体。结果示于表IX-1。
表IX-1:对鼻内施用在生物载体中的HA的应答。数值是血清IgG滴定度(几何均数),其为样品稀释度的倒数,相应于在492nm背景为0.2的吸光度。
未麻醉动物 | 麻醉动物 | ||||
HA的施用 | HA | HA于SMBV中 | HA+SMBV | HA | HA于SMBV中 |
单用抗原 | 100 | 200 | |||
disp SMBV-P2 | 200 | 200 | 60 | ||
res SMBV-P3 | 400 | 30 | 30 | ||
res SMBV-Q3 | 10 | 20 | 30 | ||
disp SMBV-Q2 | 2000 | 2000 | 4000 |
实施例X:二乙烯三胺戊乙酸(DTPA)的鼻、阴道及舌下施用
DTPA用作诊断工具,使化合物如铟及钆可以施用。DTPA是亲水的并被认为是胞外水分的高效标记物,能迅速从血浆中清除(H.JWeinmem,RC et al.,Characterictic of Gd-DTPA-a potential NMRConstrast agent,A.J.R.142:619(1984);Brash R.C.et al.,Constrastenhanced HMR imaging,Animal study using gadolinium DTPA complex,A.J.R.142:625(1984);Doucet et.al.,in enhanced magnetie resonanceimaging,P87-92.Editor val M.Runge and C.V.Mosby,Companyedition(St Louis,Missouri)(1989))。
用111In-DTPA加载阳离子SMBV。为此将一体积的DTPA(Fluka)溶液(12mM水溶液)用一体积的111InCl3(10mCi/ml Cisbio)标记。将一体积的如实施例I(e)制备的电荷密度为2mEq/g的以20mg/ml在水中的阳离子SMBV(SMBV-Q2)与一体积的111In-DTPA溶液(6mM)混合。以同样程序但不加阳离子SMBV制备一对照制备物。
将两种制备物以三种不同粘膜途径:鼻、阴道或舌下施用于雌鼠。在施用后D+2分钟,D+5分钟,D+15分钟,D+30分钟,D+1小时,及D+4小时(D为0时间),从每只动物取少量血并用γ计数器测放射性。
另外进行两组对照实验。第一组对照是将制备物经静脉施用。在此情况下,将111In-DTPA-SMBV-Q2用柠檬酸盐NaCl缓冲液(柠檬酸钠1mM,NaCl 150mM)稀释以补偿制备物的低渗性,并因柠檬酸缓冲液能抑制多羧基化合物如DTPA与阳离子SMBV间分子相互作用。第二组对照是将用柠檬酸盐缓冲液(1mM,PH6)稀释的制备物鼻内施用。
在粘膜施用111In-DTPA-SMBV之后所得结果示于图6、7、8。这些比较药物动力学研究示出:鼻腔及阴道途径施用可以与其111In-DTPA吸收动力学相比。与阳离子SMBV结合的111In-DTPA经鼻内或阴道内施用可迅速吸收,半吸收期分别为7min及27min。吸收的高速率由达到最高血浆浓度所需时间(Tmax)反映。经鼻途径Tmax为30分钟,经阴道Tmax为60分钟。在鼻内及阴道施用111In-DTPA之后,111In-DTPA的半清除期分别为2.0小时及2.3小时(由静脉施用111In-DTPA-SMBV半清除期为13分钟),此值也可与经鼻施用于人后阳离子SMBV的半衰期相对照(2.3小时,见实施例VIII)。
尽管111In-DTPA-SMBV舌下施用结果似乎较低,但经此施用途径也可得到明显的111In-DTPA吸附。另外当111In-DTPA-SMBV在柠檬酸盐缓冲液中经鼻内施用时不吸附。此结果表明111In-DTPA与阳离子间的结合是得到111In-DTPA粘膜吸附所必需的。
与静脉施用相对照,所有粘膜途径均促进血浆AUC(曲线下面积)提高,其是111In-DTPA在血浆中存留时间的代表(见图9)。事实上鼻内或阴道施用比静脉施用改善300%,而舌下施用改善150%。
实施例XI:鼻内施用在生物载体中的流感病毒抗原单价疫苗与鼻内及舌下施用没有生物载体的流感病毒抗原的比较
XI(a):抗原与SMBV结合的研究
流感疫苗制备自不同流感蛋白的混合物:血凝素(HA),神经氨酸酶(HA)及其它病毒蛋白如基质蛋白、核蛋白及三种聚合酶。血凝素被认为是该疫苗的主要抗原。使用如实施例IX所述相同技术分析总疫苗蛋白与SMBV的结合。
为确定SMBV的超分子结构(脂质与多糖核心结合)是否保持不变,将SMBV的不同部分标记。SMBV-Q2的内部(PSC)用共价结合的荧光素标记,而膜用二苯基己三烯(DPH)标记。使用蛋白质分析(微BCA技术)或在280nm荧光分析测定在蔗糖梯度(0%~20%)上的总蛋白。收集组分的分析示于图10。
从图10可观测到抗原在与SMBV-Q2(PSC+脂质)相同组分中发现,其中大多数HA与SMBV结合。另外SMBV的超分子结构(PSC+脂质的结合)当与配制品中抗原结合时保持不变。
为尽可能优化疫苗流感蛋白与SMBV-Q2的结合,将外层不同组分进行研究,(即DPPC,DPPC/胆固醇,egg-PC及egg-PC/胆固醇),对照物是只有内PSC核心(SMBV-Q1)和只有外层组分(即脂质体的膜),其中外层组分和PSC都未用荧光标记以避免任何干扰。结果示于图11,定量分析列于表XI-1。
表XI-1:疫苗流感抗原与纳颗粒结合率的分析。SMBV(PSC+脂质)或SMBV的组分:PSC或脂质(脂质体)
纳颗粒的类型 | 结合率(%) |
脂质体: | |
-EggPC | Nd |
-EggPC/胆固醇(70/30,w/w) | Nd |
-DPPC | 35 |
-DPPC/胆固醇(70/30,w/w) | 11 |
多糖核心(PSC)(SMBV-Q1) | 37 |
SMBV(SMBV-Q2) | |
-PSC/蛋PC | 36 |
-PSC/蛋PC/胆固醇 | 37 |
-PSC/DPPC | 52 |
-PSC/DPPC/胆固醇 | 90 |
如表XI-1所列,流感抗原与脂质体及与SMBV-Q1多糖核心(PSC)的结合在11~37%之间。但抗原与SMBV-Q2(PSC/脂质混合物)的结合明显较高,依膜组成而定为52%~90%。这一结果可通过SMBV超分子结构双重性质而解释。在此结构中抗原与外层结合,且由阳离子多糖核心稳定。最佳外层组合为DPPC/胆固醇。
XI(b):小鼠对鼻内施用在生物载体中的流感病毒抗原及鼻内及舌下单施用抗原的应答
进行一项研究以确定流感抗原与生物载体组合(Flu/BV)经鼻腔施用及游离流感抗原(Flu/Ag)的舌下施用的免疫生物等价剂量。将由Flu/BV鼻内施用所诱导的抗原应答与由Flu/Ag舌下施用所诱导的抗原应答相比较。
鼻用配制品由流感蛋白溶液、疫苗流感病毒(毒株A/SingaporeHIB16 NINI菌株)与阳离子SMBV悬浮液混合而成。评价用不同的Flu/BV配制品接种的小鼠,该Flu/BV配制品由与SMBV-Q2结合的疫苗流感病毒抗原(Flu/Ag)组成。
将15只BALB/cJ/Rj雌鼠(10周龄)分成三组(5只/组)并施用游离Flu/Ag(对照组)或Flu/BV。动物为未麻醉的。剂量方案列于表XI-2。
表XI-2:疫苗流感病毒配制品的免疫应答评价研究
抗原配制品 | 施用途径 | 体积(μg/次) | 脂质量(μg/次) | HA量(μg/次) | |
初始 | 持续 | ||||
游离Flu/Ag | 舌下 | 舌下 | 100 | / | 5 |
游离Flu/Ag | 鼻内 | 鼻内 | 25 | 50 | 5 |
Flu/BV | 鼻内 | 鼻内 | 25 | 50 | 5 |
小鼠在D0初次免疫并在D21加强免疫,在D35分析免疫应答。取血清样本分析抗体滴定度及血凝素抑制分析(IHA)实验。经用500μl PBS冲洗鼻腔可得鼻腔分泌物,检测鼻IgG和SigA滴定度水平,分析结果列于表XI-3:
表XI-3鼻施用Flu/BV配制品与鼻内或舌下施用游离Flu/Ag免疫学对比。将小鼠在D0初次免疫并在D21加强免疫,并在D35分析免疫应答,每组HA剂量为5μg
抗原配制品 | 施用 | 血清应答 | 鼻应答 | |||
总IgG | IHA | 总sIgA | 特异性IgG | 特异性sIgA | ||
游离Flu/Ag | s.c./s.c. | 350,000 | 320 | 0 | 64 | 0 |
游离Flu/Ag | i.n./i.n. | 2,000 | 0 | 0 | 0 | 1.5 |
Flu/BV | i.n./i.n. | 145,000 | 240 | 581 | 48 | 128 |
舌下施用游离Flu/Ag诱导强的血清IgG应答并与HA高滴定度相关。当与舌下施用对照时,鼻内施用游离抗原不能引起任何特异血清应答,相反鼻用Flu/BV配制品引起一与舌下施用游离抗原相似的强血清应答。另外鼻施用Flu/BV配制品在鼻洗液中引发特异性sIgA。相反鼻内或舌下施用游离Flu/Ag都不能引起任何粘膜应答。
从上述结果可见,与阳离子SMBV结合的鼻内流感抗原(Flu/BV配制品)能诱导与舌下施用游离Flu/Ag等价的IgG及IHA滴定度。另外只有Flu/BV配制品的鼻内施用可诱导血清中IgG高滴定度及重要的鼻sIgA抗体应答。
Claims (46)
1.一种将物质经粘膜施用于哺乳动物的方法,包括将哺乳动物的粘膜表面与组合在生物载体中的物质相接触,该生物载体包括一天然聚合物,或天然聚合物的衍生物或水解产物,或其混合物。
2.权利要求1的方法,其中天然聚合物是交联的多糖或交联的寡糖,或者交联的多糖或交联的寡糖的衍生物或水解产物,或其混合物。
3.权利要求1的方法,其中交联的多糖或交联的寡糖选自淀粉,葡聚糖,糊精及麦芽糖糊精。
4.权利要求2的方法,其中将0~2毫当量/g离子电荷接枝到交联的多糖或交联的寡糖上。
5.权利要求4的方法,其中离子电荷是正电荷。
6.权利要求5的方法,其中正电荷是由于存在阳离子或碱性基团而导致的,所述基团选自季铵基团、伯胺、仲胺或叔胺。
7.权利要求5的方法,其中正电荷是由于季铵基团的存在而导致的。
8.权利要求5的方法,其中正电荷是由于存在选自胆碱、2-羟丙基三甲铵、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙胺和2-二乙氨基乙胺的配体或氨基酸而导致的。
9.权利要求4的方法,其中离子电荷是负电荷。
10.权利要求9的方法,其中负电荷是由于存在或选自磷酸基团,硫酸基团或羧酸基团的阴离子或酸性基团而导致的。
11.权利要求9的方法,其中负电荷是由于磷酸基团的存在而导致的。
12.权利要求1的方法,其中交联的多糖或交联的寡糖由两亲性化合物层部分或完全包被。
13.权利要求12的方法,其中两亲性化合物是磷脂或神经酰胺。
14.权利要求13的方法,其中磷脂是磷脂酰胆碱、磷脂酰羟胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸及磷脂酰甘油。
15.权利要求1的方法,其中生物载体直径为20~200nm。
16.权利要求1的方法,其中生物载体直径为20~100nm。
17.权利要求1的方法,其中交联的多糖或交联的寡糖与粘膜表面非特异性结合。
18.权利要求1的方法,其中生物载体是分散的。
19.权利要求1的方法,其中生物载体是干燥的。
20.权利要求19的方法,其中干燥的生物载体是重悬浮的。
21.权利要求1的方法,其中的物质是治疗剂、预防剂或诊断剂。
22.权利要求21的方法,其中治疗剂是放射性药物、止痛药、麻醉药、肛直肠剂,抗贫血药、抗哮喘药、抗糖尿病剂、抗组织胺、抗炎药、抗生素、抗毒蝇碱药、抗肿瘤药、抗病毒药,心血管药,中枢神经系统兴奋剂,中枢神经系统抑制剂,抗抑制剂、抗癫痫剂、anxyolitic剂、催眠剂、镇静剂,抗精神病药,β阻滞剂,止血剂,激素、血管扩张剂,血管收缩剂或维生素。
23.权利要求21的方法,其中预防剂是抗病原体的疫苗。
24.权利要求23的方法,其中病原体是病毒、细菌、酵母或真菌。
25.权利要求24的方法,其中病毒是流感病毒、巨细胞病毒、HIV、乳头瘤病毒、呼吸合胞体病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、麻疹病毒、虫媒病毒、柯萨奇病毒、疱疹病毒、汉坦病毒、肝炎病毒、lyme病病毒、腮腺炎病毒或轮状病毒。
26.权利要求25的方法,其中病毒是流感病毒。
27.权利要求25的方法,其中病毒是HIV。
28.权利要求24的方法,其中的细菌是奈瑟氏球菌、气杆菌,气杆菌,假单胞菌,Porphyromonas,沙门氏菌,埃希氏杆菌,巴斯德氏菌,志贺氏菌,芽孢杆菌,螺旋杆菌,棒杆菌,梭状芽孢杆菌,分枝杆菌,耶尔森氏菌,葡萄球菌,伯德特氏菌,布鲁氏菌,弧菌或链球菌。
29.权利要求24的方法,其中病原体是疟原虫,血吸虫或念珠菌属的一个成员。
30.权利要求21的方法,其中诊断剂是一对比剂或显像剂。
31.权利要求21的方法,其中诊断剂能检测角膜病变。
32.权利要求21的方法,其中诊断剂用可检测基团标记。
33.权利要求32的方法,其中可检测基团是放射性基团,磁性基团或荧光基团。
34.权利要求1的方法,其中物质是小化学分子。
35.权利要求34的方法,其中小化学分子是有机分子,无机分子或有机金属分子。
36.权利要求1的方法,其中物质是生物分子。
37.权利要求36的方法,其中生物分子是氨基酸、寡肽、肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、粘蛋白、单糖、寡糖、多糖、脂多糖、脂肪酸、二十烷酸、脂质、甘油三酯、磷脂、糖脂、核苷酸、核苷、核酸、DNA分子、RNA分子、单糖、寡糖或多糖。
38.权利要求1的方法,其中一种以上的物质与生物载体组合施用。
39.权利要求2的方法,其中物质位于交联的多糖或交联的寡糖的内核心。
40.权利要求2的方法,其中物质位于交联的多糖或交联的寡糖的外表面。
41.权利要求12的方法,其中物质位于两亲性化合物层的内核心。
42.权利要求12的方法,其中物质位于两亲性化合物层的外表面。
43.权利要求1的方法,其中物质在施用于哺乳动物之前加入到生物载体中。
44.权利要求1的方法,其中物质与生物载体在施用于哺乳动物时混合在一起。
45.权利要求1的方法,其中粘膜表面是鼻、口腔、阴道、眼、耳、肺、尿道、消化道或直肠表面。
46.权利要求45的方法,其中粘膜表面是鼻、阴道或眼的表面。
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Legal Events
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---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |