BR0109740B1

BR0109740B1 - MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE IgG A PARTIR DE PLASMA PARA APLICAÇÕES MÉDICAS

Info

Publication number: BR0109740B1
Application number: BRPI0109740-7A
Authority: BR
Inventors: Inger Andersson; Lars-Olof Lindquist
Original assignee: Ge Healthcare Bio Sciences Ab
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2001-03-29
Publication date: 2015-01-06
Also published as: EP1268551A2; AU2001273907B2; DE60102144D1; DE60102144T2; BR0109740A; IL151667A0; EP1268551B1; WO2001072844A2; US20030143222A1; TR200400701T4; AU7390701A; PT1268551E; CN1419566A; WO2001072844A3; RU2002124857A; SE0001128D0; CA2402784A1; ATE260297T1; US6835379B2; JP2003530326A

Description

“MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE IgG A PARTIR DE PLASMA PARA APLICAÇÕES MÉDICAS” Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um método de produção de IgG para aplicações médicas. O método da invenção provê um produto IgG tendo atividade anticomplementar (ACA) baixa.

Fundamentos da Invenção IgG preparado a partir de plasma humano é largamente usado no tratamento de agamaglobulinemia, púrpura trombocitopênica idiopática e na profilaxia de certas doenças. Preparações de IgG são administradas intramuscularmente bem como intravenosamente.

No campo da técnica, é bem conhecido que preparações de IgG isolado possuem atividades anticomplementares (ACA) marcantes. Foi verificado que os componentes responsáveis por estas atividades são agregados de IgG que se formam espontaneamente ou em resultado do procedimento de isolamento. Estes agregados anticomplementares se mostraram danosos em várias aplicações clínicas dos produtos de IgG. Por exemplo, administração intravenosa de preparações de IgG pode causar reações colaterais adversas, incluindo choque anafilático. Várias soluções foram propostas para superar o problema com ACA em preparações de IgG. Por exemplo, em US 3 966 906, é descrito um método para tratamento de uma fração bruta de gama globulina de soro, com pepsina, para desagregar IgG e reduzir atividade anticomplementar. No entanto, o efeito terapêutico proporcionado por tal preparação é inaceitavelmente pequeno, já que ela é rapidamente excretada. Outra desvantagem com imunoglobulinas tratadas com pepsina é que sua capacidade de ligação com Fc é mais baixa do que para imunoglobulinas nativas.

Foram feitas tentativas para estabilizar preparações de IgG tratadas com pepsina, como por polietileno glicol (PEG), ver por exemplo WO 86/06993.

Para resolver o problema da alta atividade ACA, foi proposto modificar quimicamente as preparações de IgG. Por exemplo, na US 3 902 262, uma porção das ligações dissulfeto da molécula de IgG é reduzida a grupos SH, realizando-se, então, a alquilação dos grupos SH.

Por razões óbvias, seria desejável ter um produto IgG livre de modificação enzimática ou outra modificação química de modo a mantê-lo tão próximo quanto possível do nativo. Um método que preenche estes critérios foi descrito em "An improved chromatographic method for production of IgG from human plasma" por I. Andersson, L-0 Lindquist, J Berglõf, apresentado no "XXIII Congress of the ISBT", Amsterdã, Holanda, Julho 2-8, 1994. No entanto, este procedimento também apresenta níveis de ACA insatisfatoriamente altos e não atendem os requisitos do FDA e EU para fármacos intravenosos. Métodos conhecidos para a manufatura de composições de IgG compreendem tipicamente várias etapas selecionadas entre : a) tamponamento do plasma, por exemplo, submetendo-o a uma cromatografia de filtração em gel apropriada ou por diafiltração. b) remoção de euglobulinas, por exemplo, por precipitação; c) remoção da fração de albumina (albumina), por exemplo por ligação da albumina ou similar a um trocador aniônico e coleta da fração não ligada; d) purificação, após remoção de euglobulinas e albumina, da fração de IgG obtida na etapa (c) em um trocador aniônico e coleta da fração não ligada; e) purificação da fração de plasma obtida na etapa (d) em um trocador catiônico e coleta da fração ligada (adsorção e liberação de IgG) f) concentração da fração de plasma enriquecida com IgG obtida na etapa (e) (IgG liberado do trocador catiônico), preferivelmente por ultrafíltração; g) inativação de vírus por adição de produtos químicos de inativação de vírus, preferivelmente uma solução solvente/detergente (S/D), a uma fração de plasma enriquecida com IgG, por exemplo a fração obtida na etapa (f); h) remoção dos produtos químicos antivírus adicionados na etapa (g), preferivelmente por adsorção de IgG em um trocador catiônico e liberação e coleta da fração ligada. i) concentração da fração ligada coletada na etapa (h), por exemplo, por ultrafíltração; j) formulação da fração concentrada na etapa (i) k) filtração estéril da IgG formulada obtida na etapa (k). Sumário da Invenção A presente invenção provê uma solução para produção de produtos de IgG tendo AC A reduzida, por modificação de métodos já conhecidos.

Assim, em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um método para produção de IgG de plasma para aplicações médicas, compreendendo pelo menos : (i') remoção de albumina resultando em uma fração de IgG, (ii') purificação de IgG de uma fração de IgG derivada daquela obtida na etapa (Γ), por adsorção de IgG em um trocador de cátions e coleta da fração de IgG adsorvida, e (iii') inativação de vírus em uma fração de IgG derivada daquela coletada na etapa (ii'). O método é caracterizado por (I) concentração da fração de IgG obtida na etapa (i*), (II) ajuste de pH a 4 ± 0,1 da fração de IgG liberada do trocador de cátions na etapa (ii'), preferivelmente mantendo o pH abaixo de 6,0 durante as etapas restantes do método; e (III) realização da inativação de vírus (etapa iii'), pelo uso de produtos químicos de inativação, preferivelmente uma solução solvente/detergente (S/D), em uma temperatura de 30°C ± 2°C por pelo menos 4 horas.

Ajuste de pH em cerca de 4 em (II) permite que a inativação de vírus seja realizada em cerca de 30°C. No método anterior correspondente, no qual o pH era de 5,5, o nível de atividade proteolítica a 30°C era inaceitável.

Uma variante preferida do método de acordo com a invenção compreende as etapas (a) - (k) acima, na qual a etapa de remoção de albumina (c) corresponde a (i'), a etapa de troca catiônica (e) corresponde a (ii'), e a inativação de vírus (g) corresponde a (iii').

As etapas de purificação e/ou remoção acima são, preferivelmente executadas por cromatografia. Meios de separação apropriados usados nestas etapas são hidrofílicos no sentido de que eles são capazes de expor superfícies portando grupos hidrofílicos, como hidróxi, amido, etc., à amostra líquida contendo IgG. Meios de separação apropriados podem ser encontrados entre aqueles que são baseados em polímeros sintéticos e/ou biopolímeros (por exemplo, polissacarídeos), portando grupos hidrofílicos, como referido acima. Dependendo de onde no método devem ser aplicados estes meios, eles podem não conter carga, ou ser positivamente carregados (por exemplo, grupos amônio) e/ou negativamente carregados (por exemplo grupos carbóxi e grupos ácido sulfônico). Os seguintes meios cromatográficos são preferidos: etapa a) : Sephadex G25; etapa c): DEAE Sepharose FF; etapa d): Q Sepharose FF; etapa e): CM Sepharose FF; etapa h) : CM Sepharose FF;

Sephadex e Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suécia) são baseados em dextrano e agarose reticulados, respectivamente. DEAE significa que a matriz base (dextrano reticulado) é substituída com grupos dietilaminoetila. Analogamente, Q representa grupos amônio quaternários, e CM representa grupos carbóxi metílicos. A concentração de acordo com (I) é, preferivelmente, realizada imediatamente após a remoção de albumina (por exemplo, após a etapa c definida acima) por ultrafiltração, a um volume igual ou menor que o do plasma de partida.

Para poder usar um tampão de acetato na etapa de remoção de produtos de inativação de vírus (exemplo h), a força iônica é ajustada a cerca de 1,40 mS antes dessa etapa.

Em um modo de realização preferido, o método compreende, também, na etapa (i) o abaixamento da força iônica para 0,5 mS ±0,1, preferivelmente por diafiltração contra água destilada.

Descrição detalhada da invenção A invenção será descrita, abaixo, com maiores detalhes, associada com o desenhos anexo, Fig. 1, que, esquematicamente, apresenta um modo de realização preferido do método de acordo com a invenção, em que as características específicas do método definidas nas reivindicações estão em negrito.

Material de partida Podem ser usados como material de partida tanto plasma recuperado quanto plasma fresco congelado e plasma da fonte.

As seguintes subclasses de plasma podem ser identificadas e usadas como material de partida. 1. Plasma criossobrenadante que tenha passado por uma etapa cromatográfica para adsorção de fatores dependentes de vitamina K (FIX, protrombina, FVII, FX). 2. Plasma criossobrenadante do qual não tenha sido removido complexo de protrombina. 3. Plasma que tenha passado por um meio de filtração com gel, preferivelmente tendo limites de exclusão na mesma faixa de Sepharose 4FF (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suécia) para remoção de FVIII e que tenha passado por uma etapa cromatográfica para adsorção de fatores dependentes de vitamina K (FIX, protrombina, FVII, FX). 4. Plasma que tenha passado por um meio de filtração com gel para remoção de FVIII e do qual não tenha sido removido o complexo de protrombina. O meio de filtração com gel tem preferivelmente limites de exclusão na mesma faixa de Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech AB) Além disso, o material de partida deve também ser isento de ATUI e/ou fibrinogênio São descritos abaixo dois Exemplos não limitativos de métodos de acordo com a invenção para purificar IgG. Os métodos são realizados em temperatura ambiente se não houver outra indicação.

Atividade anticomplementar (ACA) refere-se a medições do produto final, de acordo com Eur. Pharmacopoeia Monograph (1997) página 963 (2.6.17) e não deve ser maior que lCH50/mg de imunoglobulina.

Exemplo 1 625 1 de plasma descongelado são submetidos a troca de tamponamento com NaAc 0,005 M, pH 7 em uma coluna de diâmetro Di = 800 mm e altura de leito de H = 600 mm, recheada com Sephadex G-25 C. A vazão é maior que 100 cm/h, preferivelmente 300 cm/h correspondente a uma vazão de 1500 1/h. O plasma eluído é coletado em um tanque e ácido acético 1M é adicionado durante a agitação até que tenha sido atingido um pH 5,2. O plasma é deixado em repouso, sem agitação, por 4 a 12 horas em uma temperatura de 4 a 10°C. Após o repouso, a euglobulina formada precipitada é removida por centrifugação. O plasma é ajustado com NaAc 1M, pH 5,2 até uma força iônica de I = 1,4 mS (Faixa I = 1,30 - 1,50). O pH deve ficar entre 5,15 - 5,25. O plasma é aplicado em 6 ciclos, 25 - 30 g de albumina por litro de gel, em uma coluna de Di = 1000 mm e H = 150 mm, recheada com DEAE Sepharose FF e equilibrada com NaAc 0,020 M, pH 5,2. A vazão linear é maior do que 60 cm/h, preferivelmente 120 cm/h, correspondente a uma vazão de 942 1/h. No tampão de equilíbrio, a IgG passará pela coluna enquanto a albumina é adsorvida. Após 3 ciclos, a coluna é lavada com 1,7 Vc (Vc = volume do leito) de NaAc 0,15 M, pH 4,0 + NaCl 0,5 M, 0,5 Vc de NaOH 0,5 M e 1,7 Vc de NaAc 0,15 M pH 4,0. A fração de IgG de cerca de 2350 1 é concentrada por ultrafiltração até um volume final menor ou igual a 625 1, preferivelmente 400 - 500 1. O procedimento deve ser iniciado o mais tardar, quando a fração total é coletada da coluna de DEAE Sepharose. A solução de IgG é ajustada a um pH de 6,5 (6,45 - 6,55) com NaOH 1M e a força iônica é ajustada a 1,40 mS (1,30 - 1,50 mS) por adição de água WFI (WFI = água para injeção). A solução de IgG é aplicada em 6 ciclos em uma coluna de Di = 1000 mm e H = 150 mm, recheada com Q Sepharose FF e equilibrada com NaAc 0,020 M, pH 6,5. A vazão linear é maior do que 30 cm/h, preferivelmente 100 cm/h, correspondente a uma vazão de 785 1/h. Após 3 ciclos, a coluna é lavada com 0,5 Vc de NaOH 0,5 M e 1,7 Vc de NaAc 0,15 M pH 4,0. A fração de saída contendo IgG é diretamente adsorvida na próxima coluna de Di = 800 mm e H = 80 mm e recheada com CM Sepharose FF. Quando a fração de IgG de todos os 6 ciclos foi bombeada através coluna, esta é lavada com 10 Vc de tampão de Glicina 0,01 M, pH 7,0. A IgG é, então eluída com 7 Vc de Glicina 0,1 M + NaCl 0,15 M pH 9,0. Ο ρΗ da solução é ajustado a 4,0 ± 0,1 com HAc (ácido acético) 1 M, e esta é concentrada por ultrafiltração a cerca de 5 % IgG.

Produtos químicos de inativação de vírus, Triton X-100 e TNBP, são adicionados à solução de IgG durante a agitação. Esta mistura é transferida para o tanque de incubação para tratamento térmico a 30°C ± 2°C por 4 a 16 horas. A força iônica da solução é ajustada a 1,40 mS por diluição com WFI e esta é aplicada em 1 ciclo a outra coluna de Di = 800 mm e H = 80 mm, recheada com CM Sepharose FF e equilibrada com tampão de NaAc 0,020 M pH 4,0. A vazão linear é maior do que 40 cm/h, preferivelmente 80 cm/h, correspondente a uma vazão de 400 1/h. Após aplicação, a coluna é lavada com 10 Vc de tampão de Glicina 0,01 M, pH 7,0, para remover os produtos químicos de inativação. A IgG é eluída com 7 Vc de glicina 0,1 M + NaCl 0,15 M pH 9,0, na mesma vazão e ajustada a pH 4,0 com HC1 1M. A solução é, então concentrada por ultrafiltração para 5 % a 7 % IgG e a força iônica é ajustada por diafiltração para 0,5 mS ± 0,2 mS. Finalmente a solução é ajustada a 5,0 %. A solução é formulada com a seguinte composição : - Sacarose lg/g IgG - IgG 5 % - pH 4,0 - força iônica 0,5 mS ± 0,2 mS.

Após filtração estéril, enchimento e colocação de tampa, a solução está pronta para distribuição ou estocagem. ACA para diferentes bateladas medida como definido acima foi de 0,5 - 0,7 CH50/mg de imunoglobulina.

Exemplo 2 625 1 de plasma descongelado são submetidos a troca de tamponamento com NaAc 0,005 M, pH 7 em uma coluna de diâmetro Di = 800 mm e altura de leito de H = 600 mm, recheada com Sephadex G-25 C. A vazão é maior que 100 cm/h, preferivelmente 300 cm/h correspondente a uma vazão de 15001/h. O plasma eluído é coletado em um tanque e ácido acético 1M é adicionado durante a agitação até que tenha sido atingido um pH 5,2. O plasma é deixado em repouso, sem agitação, por 4 a 12 horas em uma temperatura de 4 a 10°C. Após o repouso, a euglobulina formada precipitada é removida por centrifugação. O plasma é ajustado com NaAc 1M, pH 5,2 até uma força iônica de I = 1,4 mS (Faixa I = 1,30 - 1,50). O pH deve ficar entre 5,15 - 5,25. O plasma é aplicado em 6 ciclos, 25 - 30 g de albumina por litro de gel, em uma coluna de Di = 1000 mm e H = 150 mm, recheada com DEAE Sepharose FF e equilibrada com NaAc 0,020 M, pH 5,2. A vazão linear é maior do que 60 cm/h, preferivelmente 120 cm/h, correspondente a uma vazão de 942 1/h. No tampão de equilíbrio, a IgG passará pela coluna enquanto a albumina é adsorvida. Após 3 ciclos, a coluna é lavada com 1,7 Vc (Vc = volume do leito) de NaAc 0,15 M, pH 4,0 + NaCl 0,5 M, 0,5 Vc de NaOH 0,5 M e 1,7 Vc de NaAc 0,15 M pH 4,0. A fração de IgG de cerca de 2350 1 é concentrada por ultrafiltração até um volume final menor ou igual a 625 1, preferivelmente 400 - 500 1. O procedimento deve ser iniciado o mais tardar, quando a fração total é coletada da coluna de DEAE Sepharose. A solução de IgG é ajustada a um pH de 6,5 (6,45 - 6,55) com NaOH 1M e a força iônica é ajustada a 1,40 mS (1,30 - 1,50 mS) por adição de água WFI (WFI = água para injeção). A solução de IgG é aplicada em 4 ciclos em uma coluna de Di = 1000 mm e H = 150 mm, recheada com um leito misto de DEAE Sepharose FF e Arginina Sepharose FF em uma proporção de 60 % / 40 %, e equilibrada com NaAc 0,020 M, pH 6,5. A vazão linear é maior do que 30 cm/h, preferivelmente 100 cm/h, correspondente a uma vazão de 785 1/h. Após 2 ciclos, a coluna é lavada com 0,5 Vc de NaOH 0,5 M e 1,7 Vc de NaAc 0,15 M pH 4,0. A fração de saída contendo IgG é diretamente adsorvida na próxima coluna de Di = 800 mm e H = 80 mm e recheada com CM Sepharose FF. Quando a fração de IgG de todos os 6 ciclos foi bombeada através coluna, esta é lavada com 10 Vc de tampão de Glicina 0,01 M, pH 7,0. A IgG é, então eluída com 7 Vc de Glicina 0,1 M + NaCl 0,15 M pH 9,0. O pH da solução é ajustado a 4,0 ±0,1 com HAc (ácido acético) 1 M, e esta é concentrada por ultrafiltração a cerca de 5 % IgG.

Produtos químicos de inativação de vírus, Triton X-100 e TNBP, são adicionados à solução de IgG durante a agitação. Esta mistura é transferida para o tanque de incubação para tratamento térmico a 30°C ± 2°C por 4 a 16 horas. A força iônica da solução é ajustada a 1,40 mS por diluição com WFI e esta é aplicada em 1 ciclo a outra coluna de Di = 800 mm e H = 80 mm, recheada com CM Sepharose FF e equilibrada com tampão de NaAc 0,020 M, pH 4,0. A vazão linear é maior do que 40 cm/h, preferivelmente 80 cm/h, correspondente a uma vazão de 400 1/h. Após aplicação, a coluna é lavada com 10 Vc de tampão de Glicina 0,01 M, pH 7,0, para remover os produtos químicos de inativação. A IgG é eluída com 7 Vc de glicina 0,1 M + NaCl 0,15 M pH 9,0, na mesma vazão e ajustada a pH 4,0 com HC1 1M. A solução é, então concentrada por ultrafiltração para 5 % a 7 % IgG e a força iônica é ajustada por diafiltração para 0,5 mS ± 0,2 mS. Finalmente a solução é ajustada a 5,0 %. A solução é formulada como no Exemplo 1. Após filtração estéril, enchimento e colocação de tampa, a solução está pronta para distribuição ou estocagem. ACA para diferentes bateladas medida como definido acima foi de 0,5 - 0,7 CH50/mg de imunoglobulina.

Claims

1. Método para produção de IgG a partir de plasma para aplicações médicas, compreendendo pelo menos as etapas de: (Γ) remoção de albumina resultando em uma fração de IgG, (ii') purificação de IgG de uma fração de IgG que é derivada da fração de IgG obtida na etapa (Γ), por adsorção de IgG em um trocador catiônico e coleta da fração de IgG adsorvida, e (iii') inativação de vírus em uma fração de IgG derivada da fração de IgG coletada na etapa (ii'), caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (I) concentração da fração de IgG obtida na etapa (i*) a um volume menor ou igual ao volume do plasma de partida, (II) ajuste de pH a 4 ± 0,1 na fração de IgG liberada do trocador de cátions na etapa (ii'), e preferivelmente mantendo o pH abaixo de 6,0 durante as etapas restantes do método; e (III) realização da inativação de vírus (etapa iii'), pelo uso de uma solução solvente/detergente (S/D) em uma temperatura de 30°C ± 2°C por pelo menos 4 horas.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as etapas: (a) tamponamento do plasma fresco; b) remoção de euglobulinas; c) remoção de albumina, seguida por (I) de acordo com a reivindicação 1; d) purificação da fração de plasma obtida após remoção de euglobulinas e albumina em um trocador aniônico e coleta da fração de plasma não ligada (fração IgG); e) purificação da fração de IgG obtida na etapa (d) em um trocador catiônico e coleta da fração de IgG de plasma ligada, incluindo ajuste de pH como definido em (II) de acordo com a reivindicação 1; f) concentração da fração de IgG de plasma coletada na etapa (e); g) inativação de vírus como definida em (III) de acordo com a reivindicação 1 na fração de IgG de plasma coletada na etapa (f); h) remoção dos produtos químicos de inativação de vírus adicionados na etapa (g), por adsorção de IgG em um trocador catiônico e liberação e coleta da fração de IgG de plasma ligada. i) concentração da fração de IgG de plasma coletada na etapa (h); j) formulação da fração de IgG de plasma concentrada na etapa (i) k) filtração estéril da fração de IgG de plasma formulada obtida na etapa (j).

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 2, caracterizado pelo fato que a concentração é realizada por ultrafiltração até atingir menos que o volume do plasma de partida.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2- 3, caracterizado pelo fato de compreender um ajuste de força iônica a 1,40 mS antes da etapa h).

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-4 caracterizado pelo fato que é utilizado um tampão acetato na etapa h).

6. Método de acordo com uma ou mais das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de compreender também, abaixamento após a etapa (ΙΙΓ), preferivelmente na etapa (i) de acordo com a reivindicação 2, da força iônica para 0,5 mS ±0,1.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato que o abaixamento da força iônica é por diafiltração contra água destilada.