CN114344457B - 新型冠状病毒蛋白质抗原纳米疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新型冠状病毒蛋白质抗原纳米疫苗及其制备方法和应用。制备方法包括取香菇多糖、亚硒酸钠和维生素C各溶于高压灭菌水中分别制成香菇多糖储备液、亚硒酸钠储备液和维生素C储备液；将RBD加入所述亚硒酸钠储备液中搅拌，加入香菇多糖储备液继续搅拌，再加入高压灭菌水后搅拌使得聚合物与RBD和亚硒酸钠充分混匀，形成混合溶液；向所述混合溶液中逐滴滴加所述维生素C储备液，滴加完毕后在低温下搅拌，最后将反应完的溶液置于透析袋中，得到新型冠状病毒蛋白质抗原纳米疫苗。本发明利用纳米硒载体优势装载RBD进行有效呈递，提高RBD疫苗的免疫原性，诱导机体产生强效的免疫反应。

Description

新型冠状病毒蛋白质抗原纳米疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米硒疫苗领域，尤其涉及新型冠状病毒蛋白质抗原纳米疫苗，以及用于预防新型冠状病毒疫情。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)已成为人类历史上最严重的传染性疾病之一，它是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的，目前已造成超1.8亿人感染。针对性的研发SARS-CoV-2疫苗是阻断COVID19流行的最有效手段，目前虽然已有包括人腺病毒载体疫苗、灭活疫苗、mRNA疫苗、多肽疫苗被批准使用，但是由于变异毒株的出现造成疫情反复出现，因此开发新型安全有效的疫苗对于遏制疫情具有重要意义。

新冠病毒主要通过棘突蛋白介导了病毒与宿主细胞血管紧张素转换酶2(ACE2)的结合，其中刺突蛋白的受体结合区(RBD)是新冠病毒与受体结合的核心区域，针对RBD的抗体可有效阻断病毒感染，它同时也是重要的疫苗抗原，但是由于RBD分子量较小，免疫原性不高，且含有T细胞的反应表位较少，在一定程度上限制了RBD疫苗的在遏制疫情方面的作用。

硒化合物在防治癌症和抗病毒中所起的重要作用已经被大量的流行病学、临床前和临床干预研究的结果所验证。相比于其他纳米材料载体，纳米硒具有优越的生物安全性和免疫调控功能。如果利用纳米化技术或者纳米载体优势装载RBD进行有效呈递，提高RBD疫苗的免疫原性，诱导机体产生强效的免疫反应，是值得研究的新领域。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的不足，本发明首要的目的在于提供以纳米硒为载体的新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗的制备。

本发明的另一个目的在于提供以纳米硒为载体的新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗。

本发明的另一个目的在于提供新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗用于预防新型冠状病毒疫情。

本发明提供的新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备储备液，取香菇多糖和亚硒酸钠各溶于高压灭菌水中分别制成香菇多糖储备液、亚硒酸钠储备液；

(2)制备混合溶液，将新冠病毒的刺突蛋白的受体结合区(RBD)加入所述亚硒酸钠储备液中搅拌，再加入所述香菇多糖储备液和高压灭菌水后继续搅拌充分混合均匀，形成所述混合溶液；

(3)向所述混合溶液中逐滴加入维生素C溶液，并在低温下搅拌，制成含有RBD@SeNPs 纳米疫苗的溶液，再进行透析过滤处理，得到以纳米硒为载体的新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗。

进一步，步骤(2)包括：将1-1.5mg新冠病毒的刺突蛋白的受体结合区(RBD)加入0.5-4mL所述亚硒酸钠储备液中，容器在冰上搅拌10-60分钟，再加入1-3mL所述香菇多糖储备液，以及高压灭菌水后搅拌混合5-30分钟，形成所述混合溶液。

进一步，所述RBD与亚硒酸钠中所含的硒元素的质量比为1:2-16。

进一步，步骤(1)中所述的制成香菇多糖储备液、亚硒酸钠储备液后均放入冰箱中低温保存备用。

进一步，所述的香菇多糖储备液的浓度为18-22mg/mL，所述的亚硒酸钠储备液和维生素C溶液的浓度均为95-105mM。

进一步，步骤(3)所述透析过程是采用透析袋在10000-20000kDa条件下，在高压灭菌水中透析12-24小时。

本发明还提供新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗，通过上述的制备方法制得，是以纳米硒为载体的新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗。

本发明还提供采用上述的制备方法制得新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗，在生物医药领域中的应用，具体是运用了作为药物载体的纳米硒的增效和协同作用，提高RBD疫苗的免疫原性，诱导机体产生强效免疫反应，可预防新型冠状病毒疫情。

本申请上述方案带来如下的有益效果：

(1)本申请新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗的制备方法，是采用RBD@SeNPs结合的现代疫苗技术，利用纳米硒的载体优势装载RBD进行有效呈递，提高了RBD疫苗的免疫原性，进而可以诱导机体产生强效的免疫反应。本申请提供的制备方法简单快速，安全可靠，易于大规模生产，另外本发明方案的纳米硒是一种食品级的物质，安全稳定性好，这让新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗更具有潜在的临床转化应用前景。

(2)相比于其他纳米材料载体，纳米硒具有优越的生物安全性和免疫调控功能。硒主要以含硒氨基酸的形式参入到硒蛋白中发挥作用，现有研究表明，纳米硒相比于其他形态的硒，如亚硒酸钠、硒酸钠、有机硒和硒代蛋氨酸，它能更加高效的转化成含硒氨基酸，从而更加高效的调控硒蛋白表达。所以本申请实施例提供的以纳米硒为载体的新型冠状病毒蛋白质抗原纳米疫苗，对于提高RBD的免疫原性，预防新冠病毒，提高机体免疫活性拮抗新冠病毒感染具有重要意义和应用价值。

(3)目前还没有文献报道纳米硒在疫苗方面的应用，而且据发明人研究发现，以纳米硒为载体负载RBD或者联合RBD用于新冠病毒的预防与治疗的效果要优于单独RBD联合亚硒酸钠、硒酸钠、有机硒和硒代蛋氨酸的预防和治疗效果。同时，本发明人通过实验证明，采用RBD@SeNPs结合的疫苗，一方面RBD蛋白是抗原物质，可以充当疫苗激活机体产生针对RBD的抗体，同时，硒可以维持免疫细胞的氧化还原水平；另一方面硒还能够调控免疫细胞免疫活性，从而诱导机体产生强效，持久的免疫反应。发明人研究发现，RBD@SeNPs 疫苗诱导小鼠体内产生的IgG1和IgG2a的抗体滴度分别与RBD联合亚硒酸钠、RBD联合硒酸钠、RBD联合有机硒和RBD联合硒代蛋氨酸诱导产生IgG1和IgG2a的抗体滴度相比，分别为60-90倍，180-200倍，60-180倍和50-90倍。

附图说明

图1为本申请实施例中单独的纳米硒的水合粒径分布；

图2为本申请实施例中RBD@SeNPs纳米疫苗的纳米粒子的水合粒径分布；

图3为本申请实施例中单独的纳米硒的Zeta电位，以及RBD@SeNPs纳米疫苗的Zeta电位；图中，SeNPs为单独的纳米硒，RBD@SeNPs为RBD@SeNPs纳米疫苗；

图4为本申请实施例中RBD@SeNPs纳米疫苗停止免疫的第7天后小鼠血清中IgG1的抗体滴度；

图5为本申请实施例中RBD@SeNPs纳米疫苗停止免疫的第7天后小鼠血清中IgG2a的抗体滴度；

图6为本申请实施例中RBD@SeNPs纳米疫苗停止免疫的第7天后小鼠血清中IgM的抗体滴度；

图7为本申请实施例中RBD@SeNPs纳米疫苗停止免疫的第21天后小鼠的血清中IgG1 的抗体滴度；

图8为本申请实施例中RBD@SeNPs纳米疫苗停止免疫的第21天后小鼠的血清中IgG2a 的抗体滴度。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1，本发明提供的新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备香菇多糖储备液：称取200mg的香菇多糖溶于10mL的高压灭菌水中，配成浓度为20mg/mL的香菇多糖储备液并放于4℃冰箱保存备用。

(2)制备亚硒酸钠储备液和维生素C储备液：取172.94mg的亚硒酸钠(Na₂SeO₃)和176.13 mg的维生素C(Vc)分别溶于10mL的高压灭菌水中，各配成浓度为100mM的亚硒酸钠储备液和维生素C储备液，并放于4℃冰箱保存备用。

(3)制备混合溶液：取1mgRBD加入0.5mL亚硒酸钠储备液中，容器在冰上搅拌15分钟后加入香菇多糖储备液1mL继续搅拌15分钟，加入高压灭菌水至8mL后，在磁力搅拌器上搅拌 5分钟使得香菇多糖与RBD和亚硒酸钠充分混匀，形成混合溶液。

(4)制备RBD@SeNPs纳米疫苗：随后将2mL维生素C储备液逐滴滴加入混合溶液中，至维生素C储备液滴加完毕后，4℃下搅拌8小时，制得含有RBD@SeNPs纳米疫苗的溶液。

(5)透析：将反应完的溶液置于20000kDa的透析袋中，透析12h，用于除去未反应完的香菇多糖、亚硒酸钠和维生素C。

(6)保存：最后收集RBD@SeNPs纳米疫苗于离心管中并放于4℃保存。

(7)检测：按照国家标准方法(GB5009.93-2017)对RBD@SeNPs纳米疫苗进行消化后通过原子荧光光谱仪测定硒含量，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物，P0010S)测定RBD含量。

(8)实验比较效果

(i)实验动物分组

将BALB/C小鼠(40只，雌性)分生理盐高压灭菌水组、RBD抗原免疫组、纳米硒组、RBD@SeNPs纳米疫苗免疫组、铝佐剂(铝佐剂+RBD)组共5组，每组8只。

(ii)药物分散方式

药物用高压灭菌水分散；通过皮下注射法，给予每只小鼠25微升的药物。

(iii)实验内容

每只小鼠按RBD为20微克/只，纳米硒为40微克/只的量进行给药。每两周一次的给药频率，共给药3次。第三针疫苗注射完后第7和第21天，通过眼球取血的方式收集血液。血液在室温静置1.5小时后在3000转/分钟的转速和4℃下离心10分钟。将血清转移至另一EP管中，并将收集的血清放-80℃冰箱保存。

将RBD按5微克/毫升，100微升/孔的量铺于96孔板中，4℃过夜。次日取出96孔板，弃上清，拍干后用PBST(含0.5％吐温20的PBS)洗涤板，5分钟/次，洗涤3次后加入5％牛血清白蛋白(溶解于磷酸盐缓冲液中)，100微升/孔。将板置于37℃培养箱中，封闭2小时。2小时后取出板，并用PBST(含0.5％吐温20的PBS)洗涤板，5分钟/次，洗涤3次后，加入不同梯度稀释的血清(1：400开始，依次梯度稀释到1:1638400倍)100微升/孔。将板置于37℃培养箱中，孵育2小时。2小时后取出板，并用PBST(含0.5％吐温20的PBS)洗涤板，5分钟/次，洗涤4 次后，用酶稀释液将酶标二抗以1:10000倍稀释，之后每孔加入100μL，用不干胶封盖酶联板，置于37℃培养箱中温育30分钟。弃去二抗，用洗涤液(PBST)洗板5次，每次20-30秒，拍干。之后每孔加入TMB显色液100μL，轻轻震荡后，37℃条件下避光显色10-15min，之后每孔加入50μL终止液，用酶标仪于450nm处检测(630nm为参考波长)，OD值小于0.12的视为阴性。

(iv)实验结果

结果如图1-3所示，单独的纳米硒水合粒径大小为72.25纳米，Zeta电位为-22.5mV,在RBD 加入后，众体系纳米粒子的水合粒径大小为293.8纳米，Zeta电位为0.057mV，这些结果表明 RBD与纳米硒发生相互作用，纳米硒负载了RBD，本发明方案成功制备了以纳米硒为载体的新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗。

为了进一步验证该RBD@SeNPs纳米疫苗的活性，我们通过皮内注射方式对小鼠进行干预。如图4-6所示，我们发现RBD@SeNPs纳米疫苗(即以纳米硒为载体的新型冠状病毒蛋白质抗原纳米疫苗)免疫后的小鼠血清中的IgG1抗体滴度比单独RBD免疫组高60倍，比铝佐剂组提高了16倍，血清中的IgG2a和IgM的含量也与IgG1的抗体滴度趋势一致。

此外，如图7-8所示，在停止疫苗免疫的21天，RBD@SeNPs纳米疫苗诱导的抗体可在较长时间内维持较高滴度。

这些结果表明纳米硒作为纳米载体的引入能够显著增强RBD的免疫原性提高机体的免疫响应。

实施例2，本发明提供的新冠病毒蛋白质抗原纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备香菇多糖储备液：称取215mg的香菇多糖溶于11mL的高压灭菌水中，配成浓度为19.55mg/mL的香菇多糖储备液并放于4℃冰箱保存备用。

(2)制备亚硒酸钠储备液和维生素C储备液：取181mg的亚硒酸钠(Na₂SeO₃)和187mg的维生素C(Vc)分别溶于11mL的高压灭菌水中，各配成浓度为95.11mM的亚硒酸钠储备液和浓度为96.59mM的维生素C储备液，放于4℃冰箱保存备用。

(3)制备混合溶液：取1.1mgRBD加入0.9mL亚硒酸钠储备液中，冰上搅拌16分钟后，加入香菇多糖储备液1mL继续搅拌16分钟，加入高压灭菌水至9mL后，在磁力搅拌器上搅拌5min 使得香菇多糖与RBD和亚硒酸钠混匀，形成混合溶液。

(4)制备RBD@SeNPs纳米疫苗：随后将2.5mL维生素C储备液逐滴滴加入混合溶液中，至维生素C储备液滴加完毕后，4℃下搅拌9小时，制得含有RBD@SeNPs纳米疫苗的溶液。

(5)透析：将反应完的溶液置于10000kDa的透析袋中，透析24h，用于除去未反应完的香菇多糖、亚硒酸钠和维生素C。

(6)保存：最后收取的RBD@SeNPs纳米疫苗于离心管中并放于4℃保存。

(7)实验

实验方法与实验内容同实施例1。

单独的纳米硒水合粒径大小为72.56纳米，Zeta电位为-22.3mV,在RBD加入后，众体系纳米粒子的水合粒径大小为294.1纳米，Zeta电位为0.058mV。

RBD@SeNPs纳米疫苗免疫后的小鼠血清中的IgG1抗体滴度比单独RBD免疫组高60倍，比铝佐剂组提高了16倍，血清中的IgG2a和IgM的含量也与IgG1的抗体滴度趋势一致。在停止疫苗免疫的21天，RBD@SeNPs纳米疫苗诱导的抗体可在较长时间内维持较高滴度。

实施例3，将亚硒酸钠，硒酸钠，硒代蛋氨酸和有机硒分别按RBD和硒的质量比为1:2-1:16 的比例进行物理混合制备疫苗。动物免疫方法和相关指标检测方法和实施例1相同。

实验结果发现，RBD@SeNPs结合的疫苗诱导小鼠体内产生的IgG1和IgG2a的抗体滴度与RBD联合亚硒酸钠、RBD联合硒酸钠、RBD联合有机硒和RBD联合硒代蛋氨酸诱导产生IgG1和IgG2a抗体滴度相比，分别为60-90倍，90-180倍，180-200倍和50-90倍。

通过上述实验证明，采用RBD@SeNPs结合的疫苗发挥了作为药物载体的纳米硒的增效和协同作用，提高RBD疫苗的免疫原性，诱导机体产生强效的免疫反应。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.新型冠状病毒蛋白质抗原纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备储备液，取香菇多糖和亚硒酸钠分别溶于高压灭菌水中，分别制成香菇多糖储备液、亚硒酸钠储备液；

(2)制备混合溶液，将新型冠状病毒SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合区RBD加入所述亚硒酸钠储备液中搅拌，再加入所述香菇多糖储备液和高压灭菌水后继续搅拌充分混合均匀，形成所述混合溶液；

(3)向所述混合溶液中逐滴加入维生素C溶液，并在低温下搅拌，制成含有RBD@SeNPs纳米疫苗的溶液，再进行透析过滤处理，得到以纳米硒为载体的新型冠状病毒蛋白质抗原纳米疫苗。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)包括：将1-1.5mg新型冠状病毒的刺突蛋白的受体结合区RBD加入0.5-4mL所述亚硒酸钠储备液中，容器在冰上搅拌10-60分钟，再加入1-3mL所述香菇多糖储备液，以及高压灭菌水后搅拌混合5-30分钟，形成所述混合溶液。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述RBD与亚硒酸钠中所含的硒元素的质量比为1:2-16。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的制成香菇多糖储备液、亚硒酸钠储备液后均放入冰箱中低温保存备用。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述的香菇多糖储备液的浓度为18-22mg/mL，所述的亚硒酸钠储备液和维生素C溶液的浓度均为95-105mM。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(3)所述透析过程是采用透析袋在10000-20000kDa条件下，在高压灭菌水中透析12-24小时。

7.新型冠状病毒蛋白质抗原纳米疫苗，其特征在于，通过权利要求1-6任一项所述的制备方法制得，是以纳米硒为载体的新型冠状病毒蛋白质抗原纳米疫苗。