CN103736090B - 甲磺酸去铁胺佐剂及含甲磺酸去铁胺佐剂的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种甲磺酸去铁胺佐剂及含有甲磺酸去铁胺佐剂的疫苗。所述含甲磺酸去铁胺佐剂的疫苗是：每单份疫苗剂中含有0.6～8mg的甲磺酸去铁胺佐剂。甲磺酸去铁胺佐剂长期应用于临床治疗，毒副作用小，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的，能够有效诱导抗原特异性的体液免疫应答，且所诱导的体液免疫应答效果优于无佐剂组，甲磺酸去铁胺佐剂原料易得，为市售产品，制备工艺简单，成本低，性能稳定，可添加于多种传统疫苗和基因工程疫苗中作为疫苗佐剂。

Description

甲磺酸去铁胺佐剂及含甲磺酸去铁胺佐剂的疫苗
技术领域
本发明涉及一种甲磺酸去铁胺佐剂及含该佐剂的疫苗，属于免疫学技术领域。
背景技术
近年来，随着疫苗研究的不断深入，特别是分子生物技术的迅速发展，研制出的新型基因工程疫苗纯度高、特异性强，但分子小，免疫原性相对较弱，难以产生有效的免疫应答。因此应用佐剂来增强其免疫原性就显得尤为重要。
目前，已认证应用于人类的佐剂仍寥寥无几，铝盐佐剂就是其中之一。铝盐佐剂在提高抗体水平和安全方面已获得长期的实践证实,但由于其可引起过敏、诱导退行性神经病变等缺点,迫切需要开发新型疫苗佐剂以克服这些缺陷，更好的为人类服务。
甲磺酸去铁胺（Deferoxamine，DFO）是放线菌属毛链霉菌产生的细菌性铁载体，临床上用来治疗铁中毒，通过与三价铁离子形成大分子铁胺复合物,从尿及粪便中排出,防止体内铁超负荷和铁沉着于各器官,进而减少因铁超负荷促进的脂质过氧化反应和自由基的生成,减轻溶血。
研究发现甲磺酸去铁胺在常氧条件下能诱导低氧诱导因子-1（hypoxia-induciblefactor，HIF-1）的表达并促其稳定。低氧诱导因子-1是一种随着细胞内氧浓度变化而调节基因表达的转录激活因子,具有DNA结合活性，低氧时在组织细胞中广泛表达,如肾、肝、肺、脑、心等细胞系,并对低氧诱导基因,如促红细胞生成素(EPO)、糖酵解酶和血管内皮生长因子(VEGF)等的活化起关键作用。
由于人体存在氧浓度梯度，在感染和受损伤的部位氧浓度相当低，因而免疫系统的效应细胞需要在一个比较宽的氧压范围内发挥功能，这就需要通过HIF的活化来调节各类免疫细胞的功能，使得其能够在低氧状态下发挥有效作用。低氧诱导因子-1的作用主要有以下几方面：1，提高免疫细胞的存活力，低氧诱导因子-1通过提高糖酵解酶的表达增强糖酵解反应以提高ATP的供应，同时也促进血管内皮生长因子和促红细胞生成素的表达，促进血管和红细胞新生。2，增强免疫细胞的杀菌能力，吞噬细胞对病原菌的识别、吞噬和消化能力也能够被低氧诱导因子-1所增强。3，对炎症反应的影响，吞噬细胞内低氧诱导因子-1对动物炎症反应的发生是必需的。低氧诱导因子-1在天然免疫反应和适应性免疫反应中都具有重要作用，由此我们可推测HIF-1具有免疫增强作用，因而其在常氧条件下的诱导剂甲磺酸去铁胺可间接发挥免疫增强作用。
发明内容
为解决现有疫苗佐剂存在的毒副作用、价格昂贵等问题，本发明提供一种安全、有效、稳定、经济的甲磺酸去铁胺佐剂。
本发明还提供含有甲磺酸去铁胺佐剂的疫苗。
本发明所述甲磺酸去铁胺在制备疫苗佐剂中的应用。
所述甲磺酸去铁胺为市购医用产品，分子式为C26H52N6O11S，分子量为656.80，结构式如图1所示，在人体中推荐剂量为每200μL疫苗液中的甲磺酸去铁胺用量不超过500mg，优选0.6～8mg。
本发明提供的含有甲磺酸去铁胺佐剂的疫苗，其特征在于每单份疫苗剂中含有0.6～8mg甲磺酸去铁胺。
所述每单份疫苗剂为临床或者动物实验中使用的常规单次注射参考量。
本发明提供的含有甲磺酸去铁胺佐剂的疫苗经过下列方法制备：
按每单份疫苗剂加入0.6～8mg甲磺酸去铁胺的量，在疫苗中加入甲磺酸去铁胺，再加生理盐水至100－200ul，按常规混合，得含有甲磺酸去铁胺佐剂的疫苗。
所述疫苗为常规甲肝抗原、乙肝抗原、狂犬病毒抗原中的一种。
甲磺酸去铁胺佐剂能显著增强抗原特异性的体液免疫反应。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：（1）甲磺酸去铁胺佐剂应用于临床治疗，毒副作用小，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的；（2）甲磺酸去铁胺佐剂能够有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，且其所诱导的体液免疫应答效果优于无佐剂组；（3）甲磺酸去铁胺佐剂原料易得，为市售产品，制备工艺简单，成本低，性能稳定，可添加于多种传统疫苗和基因工程疫苗中作为疫苗佐剂；（4）甲磺酸去铁胺佐剂与疫苗联合应用能有效增强疫苗体液免疫应答，免疫效果优于无佐剂的疫苗。
附图说明
图1为甲磺酸去铁胺分子结构式。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。文中所述的较佳条件实施方法仅作示范之用。
实施例1
本实施例提供的甲磺酸去铁胺佐剂用量为1mg。
本实施例提供的含有甲磺酸去铁胺佐剂的甲肝疫苗是：在每单份HAV抗原（即动物实验小鼠使用的单次注射剂量）中，加入1mg的甲磺酸去铁胺佐剂，再加生理盐水至200ul，按常规混合，得含有甲磺酸去铁胺佐剂的甲肝疫苗，其中，甲磺酸去铁胺为市购产品，购自瑞士诺华制药有限公司，HAV抗原为市购的抗原滴度为512EU/ml的18EUHAV抗原液，购自中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所。
本实施例1所得含有甲磺酸去铁胺佐剂的甲肝疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将6～8周龄、18～22g的清洁级ICR小鼠随机分为甲磺酸去铁胺佐剂组、氢氧化铝佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组8只；所用氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典（三部）》，（国家药典委员会.北京:人民卫生出版社.2005:118-119），在人体中的剂量为1.8～2.7mg。
对甲磺酸去铁胺佐剂组：实施例1的含有甲磺酸去铁胺佐剂的甲肝疫苗至小鼠体内，注射剂量为每只小鼠200μL，其中疫苗中含有甲磺酸去铁胺　1mg，甲肝抗原18EU；
对氢氧化铝佐剂组：将氢氧化铝300ug与甲肝抗原18EU混合后加生理盐水至200ul，经腹腔皮下多点注射到小鼠体内，注射剂量为每只小鼠200μL；
对无佐剂组：将甲肝抗原18EU与生理盐水混合至200ul，再经腹腔皮下多点注射到小鼠体内，注射剂量为每只小鼠200μL；
对空白组仅注射生理盐水，注射剂量为每只小鼠200ul；
免疫方案：在第0周经腹腔皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次；
B、ELISA检测血清抗－HAVIgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HAVIgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgGELISA试剂盒方法进行检测。
C、数据分析
对所获得的实验数据以SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析，以P﹤0.05为差异的统计学意义，结果见表1。
表1为使用实施例1提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG水平（抗体效价值）。
表1
通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周之内抗体都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。甲磺酸去铁胺1mg佐剂组产生抗体水平均显著高于无佐剂疫苗组，但低于铝佐剂组，说明甲磺酸去铁胺1mg剂量具有体液免疫增强作用，但效果没有铝佐剂组好。
实施例2
本实施例提供的甲磺酸去铁胺佐剂用量为4mg。
在每单份HAV抗原（即动物实验小鼠使用的单次注射剂量）中，加入4mg的甲磺酸去铁胺佐剂，再加生理盐水至200ul，按常规混合，得含有甲磺酸去铁胺佐剂的甲肝疫苗，其中，甲磺酸去铁胺、HAV抗原同实施例1；
本实施例2所得含有甲磺酸去铁胺佐剂的甲肝疫苗的免疫试验同实施例1，结果见表2。
表2为使用实施例2提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平。
表2
通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周之内抗体水平都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。甲磺酸去铁胺佐剂组的抗体水平也显著高于无佐剂组。但从表2中也可以看出，在16周时，甲磺酸去铁胺4mg佐剂组的抗体水平与同期的铝佐剂组抗体水平接近，但两者间的差异不具有统计学意义（P<0.05），表明4mg甲磺酸去铁胺佐剂组能有效增强体液免疫反应并且这种效应可持续较长时间。
实施例3
本实施例提供的甲磺酸去铁胺佐剂用量为8mg。
在每单份HAV抗原（即动物实验小鼠使用的单次注射剂量）中，加入8mg的甲磺酸去铁胺佐剂，再加生理盐水至200ul，按常规混合，得含有甲磺酸去铁胺佐剂的甲肝疫苗，其中，甲磺酸去铁胺、HAV抗原同实施例1；
本实施例3所得含有甲磺酸去铁胺佐剂的甲肝疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表3。
表3为使用实施例3提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平。
表3
通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周内抗体水平都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。但从表中也可以看出，去铁胺8mg佐剂组抗体水平在8周时接近铝佐剂组，在16周时略高于铝佐组，但均不具有统计学意义（P>0.05），表明甲磺酸去铁胺8mg佐剂组增强体液免疫反应效果可达到铝佐剂组水平，并且这种增强作用能持续较长时间。
实施例4
本实施例提供的甲磺酸去铁胺佐剂用量为8mg。
在每单份乙肝表面抗原（即动物实验小鼠使用的单次注射剂量）中，加入8mg的甲磺酸去铁胺佐剂，再加生理盐水至200ul，按常规混合，得含有甲磺酸去铁胺佐剂的乙肝疫苗，其中，甲磺酸去铁胺同实施例1，乙肝表面抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg的市购产品，购自中国医学科学院医学生物学研究所。
本实施例4所得含有甲磺酸去铁胺佐剂的乙肝疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表4。
表4为使用实施例4提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-乙肝表面抗原IgG抗体水平。
表4
通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-乙肝表面抗原IgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周内抗体水平都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。但从表中也可以看出，甲磺酸去铁胺8mg佐剂组抗体水平在8周时接近铝佐剂组，在16周时略高于铝佐组，但均不具有统计学意义（P>0.05），表明去铁胺0.8mg佐剂组增强体液免疫反应效果可达到铝佐剂组水平，并且这种增强作用能持续较长时间。
实施例5
本实施例提供的甲磺酸去铁胺佐剂用量为0.6mg。
在每单份狂犬病毒抗原（即动物实验小鼠使用的单次注射剂量）中，加入0.6mg的甲磺酸去铁胺佐剂，再加生理盐水至200ul，按常规混合，得含有甲磺酸去铁胺佐剂的狂犬疫苗，其中，甲磺酸去铁胺同实施例1；狂犬病毒抗原为常规的含狂犬病毒抗原0.125IU的市购产品，购自大连汉信生物制药有限公司。
本实施例5所得含有甲磺酸去铁胺佐剂的狂犬疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表5。
表5为使用实施例5提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-狂犬病毒IgG抗体水平。
表5
通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-狂犬病毒IgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周内抗体水平都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。但从表中也可以看出，去铁胺8mg佐剂组抗体水平在8周时接近铝佐剂组，在16周时略高于铝佐组，但均不具有统计学意义（P>0.05），表明甲磺酸去铁胺0.6mg佐剂组增强体液免疫反应效果可达到铝佐剂组水平，并且这种增强作用能持续较长时间。

Claims (3)

1.一种含有甲磺酸去铁胺佐剂的甲肝疫苗，其特征在于每单份甲肝疫苗剂中含有0.6～8mg甲磺酸去铁胺佐剂；并经过下列方法制备：按每单份甲肝疫苗剂加入0.6～8mg甲磺酸去铁胺的量，在甲肝疫苗中加入甲磺酸去铁胺后，再加生理盐水至100－200ul，按常规混合，得含有甲磺酸去铁胺佐剂的甲肝疫苗。
2.一种含有甲磺酸去铁胺佐剂的乙肝疫苗，其特征在于每单份乙肝疫苗剂中含有0.6～8mg甲磺酸去铁胺佐剂；并经过下列方法制备：按每单份乙肝疫苗剂加入0.6～8mg甲磺酸去铁胺的量，在乙肝疫苗中加入甲磺酸去铁胺后，再加生理盐水至100－200ul，按常规混合，得含有甲磺酸去铁胺佐剂的乙肝疫苗。
3.一种含有甲磺酸去铁胺佐剂的狂犬疫苗，其特征在于每单份狂犬疫苗剂中含有0.6～8mg甲磺酸去铁胺佐剂；并经过下列方法制备：按每单份狂犬疫苗剂加入0.6～8mg甲磺酸去铁胺佐剂的量，在狂犬疫苗中加入甲磺酸去铁胺佐剂后，再加生理盐水至100－200ul，按常规混合，得含有甲磺酸去铁胺佐剂的狂犬疫苗。
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