CN105056230A - β-拉帕醌的应用及含有β-拉帕醌的复合佐剂和疫苗 - Google Patents

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胡云章
王海漩
胡凝珠
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Abstract

本发明公开一种β-拉帕醌的应用及含有β-拉帕醌的复合佐剂和疫苗，属于免疫学技术领域。β-拉帕醌作为佐剂在疫苗中的应用，且含有β-拉帕醌的复合佐剂由β-拉帕醌和氢氧化铝组成；本发明还提供含有β-拉帕醌复合佐剂的疫苗剂，每单份疫苗剂中含有β-拉帕醌0.5～10μg、以及氢氧化铝0.5mg。本发明首次将β-拉帕醌应用于疫苗佐剂，打破了现有疫苗佐剂种类单一，不能引起机体的特异性细胞免疫反应等问题，该佐剂安全、有效、稳定。本发明提供的复合佐剂毒、副作用小，无累积毒性，在免疫剂量范围内使用是安全的；能够有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，且其所诱导的体液免疫应答效果优于单一的铝佐剂及单一β-拉帕醌佐剂。

Description

β-拉帕醌的应用及含有β-拉帕醌的复合佐剂和疫苗
技术领域
本发明涉及一种β-拉帕醌的应用及含有β-拉帕醌的复合佐剂和疫苗剂，属于免疫学技术领域。
背景技术
近年来，随着新型疫苗领域科学研究的不断深入以及基因工程技术的迅猛发展，DNA疫苗和基因工程表达的蛋白质疫苗等新型疫苗的研究取得了很多成果。这些新型疫苗抗原纯度高、特异性强，但通常存在免疫原性较弱、诱导机体免疫应答不够强的问题，因此需要添加佐剂来增强其免疫原性。
在多年来新型佐剂的研究中，虽已涌现不少新型佐剂，但都处于试验研究阶段。目前在疫苗产业中铝佐剂仍旧是应用最多的疫苗佐剂。
铝佐剂的作用机理主要是在组织中形成抗原贮藏库产生颗粒性抗原，促进抗原递呈给免疫细胞，使抗原滞留，缓慢释放，从而吸引活性淋巴细胞，激活补体系统。其缺点在于不能引起机体的特异性细胞免疫反应。
β-拉帕醌化学名为3,4-二氢-2,2-二甲基-2Ｈ-萘并[1,2-ｂ]-吡喃-5,6-二酮,属于1,2-萘醌类。β-拉帕醌具有广泛的生物活性，包括抗细菌、抗真菌、杀锥虫、抗银屑病、消炎和抗肿瘤等。对其抗肿瘤活性的研究结果表明，它对多种肿瘤细胞均显示出很好的抑制活，而且在低剂量时可以作为肿瘤细胞的放射增敏剂使用。β-拉帕醌也是一种选择性的DNA拓扑异构酶I抑制剂，可以抑制DNAtopoisomeraseI诱导的DNA松弛。同时β-拉帕醌也是一种IDO（IDO；indoleamine2,3-diox-ygenase；吲哚胺2,3-双加氧酶）抑制剂，而IDO在抑制T细胞免疫和抗肿瘤免疫、诱导母胎免疫耐受和移植物免疫耐受中均发挥重要的代谢性免疫调节作用。由此推测β-拉帕醌具有免疫增强的佐剂效应，经研究证实，β-拉帕醌确实具有增强抗原特异性体液免疫应答的作用，同时发现β-拉帕醌与铝佐剂组成复合佐剂其免疫增强效果显著高于单纯铝佐剂和单纯β-拉帕醌佐剂。
通过以上推断，β-拉帕醌具有免疫增强作用，有必要研发β-拉帕醌在疫苗中的应用。
发明内容
为改进现有疫苗佐剂种类单一，且存在缺陷等问题，本发明提供β-拉帕醌在疫苗中的应用，以及提供一种安全、有效、稳定的含有β-拉帕醌的复合佐剂和疫苗剂。
本发明通过下列技术方案实现：β-拉帕醌在制备疫苗佐剂中的应用。
进一步的，β-拉帕醌在制备甲肝病毒灭活疫苗佐剂中的应用。
所述β-拉帕醌作为佐剂在疫苗中的用量为：每单份疫苗液中含有0.5～10μg的β-拉帕醌。
所述β-拉帕醌作为佐剂在甲肝病毒灭活疫苗中的用量为：每单份甲肝病毒灭活疫苗液中含有0.5～10μg的β-拉帕醌。
一种含有β-拉帕醌佐剂的疫苗，其特征在于：每单份疫苗剂中含有β-拉帕醌0.5～10μg。
一种含有β-拉帕醌佐剂的甲肝病毒灭活疫苗，其特征在于：每单份甲肝病毒灭活疫苗剂中含有β-拉帕醌0.5～10μg，且含有甲肝病毒灭活抗原18EU。
一种含有β-拉帕醌的复合佐剂，由下列质量比的β-拉帕醌和氢氧化铝组成：β-拉帕醌:氢氧化铝=1:1000～1:50。
一种含有β-拉帕醌的复合佐剂在制备疫苗剂中的应用。
进一步的，含有β-拉帕醌的复合佐剂在制备甲肝病毒灭活疫苗中的应用。
所述含有β-拉帕醌的复合佐剂在疫苗中的用量为：每单份疫苗液中含有0.5005mg～0.5100mg的复合佐剂。
所述含有β-拉帕醌的复合佐剂在甲肝病毒灭活疫苗中的用量为：每单份甲肝病毒灭活疫苗液中含有0.5005mg～0.5100mg的复合佐剂。
一种含有β-拉帕醌复合佐剂的疫苗，其特征在于：每单份疫苗剂中含有β-拉帕醌复合佐剂0.5005mg～0.5100mg。
一种含有β-拉帕醌复合佐剂的甲肝病毒灭活疫苗，其特征在于：每单份甲肝病毒灭活疫苗剂中含有β-拉帕醌复合佐剂0.5005mg～0.5100mg，且含有甲肝病毒灭活抗原18EU。
所述每单份疫苗剂为100μL疫苗液。
β-拉帕醌与氢氧化铝的复合佐剂诱导增强的免疫反应为体液免疫反应。
所述β-拉帕醌为市购生物试剂，分子式为C15H14O3，分子量为242.274，结构式如附图1所示。
所述氢氧化铝为常规氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典（三部）》，（国家药典委员会.北京:人民卫生出版社.2005:118-119）。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：（1）本发明首次将β-拉帕醌应用于疫苗佐剂，打破了现有疫苗佐剂种类单一，不能引起机体的特异性细胞免疫反应等问题，该佐剂安全、有效、稳定。（2）本发明提供的复合佐剂毒、副作用小，无累积毒性，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的；（3）本发明提供的复合佐剂能够有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，且其所诱导的体液免疫应答效果优于单一的铝佐剂及单一β-拉帕醌佐剂；（4）本发明提供的复合佐剂的原料较易得，均为市售产品；（5）本发明提供的复合佐剂与疫苗联合应用能有效增强疫苗体液免疫应答，增强效果优于单一的β-拉帕醌佐剂和单一的氢氧化铝佐剂。除甲肝病毒灭活疫苗外，本发明提供的复合佐剂还能应用于其他抗原疫苗。
附图说明
图1为β-拉帕醌的分子结构式。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。文中所述的较佳条件实施方法仅作示范之用。
实施例1
本例提供的复合佐剂由下列组分组成：β-拉帕醌0.5μg、氢氧化铝0.5mg（即含有β-拉帕醌复合佐剂0.5005mg）。
本例提供的含有β-拉帕醌复合佐剂的疫苗是：将β-拉帕醌0.5μg、氢氧化铝0.5mg、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液。该抗原为常规甲肝病毒灭活抗原，购自中国医学科学院医学生物学研究所，β-拉帕醌购自上海源叶生物科技有限公司，氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典（三部）》，（国家药典委员会.北京:人民卫生出版社.2005:118-119）。
本例所得甲肝病毒灭活抗原疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将ICR小鼠分为复合佐剂组、氢氧化铝单一佐剂组、β-拉帕醌单一佐剂组、无佐剂组和空白组，共五组，每组6只。
复合佐剂组是将实施例1所得含有复合佐剂以及甲肝病毒灭活抗原的疫苗液100μL经腹部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝单一佐剂组是将氢氧化铝1mg、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液，经腹部皮下注射到小鼠体内。
β-拉帕醌单一佐剂组是将β-拉帕醌0.5μg、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液，经腹部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水均匀混合制备成总体积为100μL的疫苗液，再经腹部皮下注射到小鼠体内。
空白组是对每只小鼠注射100μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经腹部皮下注射免疫小鼠，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HAVIgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HAVIgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgGELISA试剂盒方法进行检测。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以P﹤0.05为差异的统计学意义。
表1为使用实施例1提供的复合佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平。
表1
时间（周） 4 8 12 16
复合佐剂组 1：538 1：3948 1：1660 1：226
β-拉帕醌单一佐剂组 1：147 1：1974 1：987 1：104
氢氧化铝单一佐剂组 1：226 1：2153 1：1076 1：147
无佐剂组 1：44 1：1280 1：453 1：44
空白组 0 0 0 0
通过数据分析可以看出，从第4周开始，各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中复合佐剂组所取得的免疫效果最佳，12周之内抗体都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够在检测期间维持较高的水平。所有添加佐剂的实验组产生抗体水平均显著高于无佐剂疫苗组，其中复合佐剂组抗体水平显著高于β-拉帕醌单一佐剂组及氢氧化铝佐剂组，P＜0.05，提示β-拉帕醌与氢氧化铝复合佐剂能够增强甲肝病毒灭活抗原的体液免疫效果，其体液免疫增强效果高于单一铝佐剂和β-拉帕醌单一佐剂。
实施例2
本例提供的复合佐剂由下列组分组成：β-拉帕醌5μg、氢氧化铝0.5mg（即含有β-拉帕醌复合佐剂0.5050mg）。
本例提供的含有复合佐剂的疫苗是：将β-拉帕醌5μg、氢氧化铝0.5mg、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液。该抗原为常规甲肝病毒灭活抗原，购自中国医学科学院医学生物学研究所，β-拉帕醌购自上海源叶生物科技有限公司，氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典（三部）》，（国家药典委员会.北京:人民卫生出版社.2005:118-119）。
本例所得甲肝病毒灭活抗原疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将ICR小鼠分为复合佐剂组、氢氧化铝单一佐剂组、β-拉帕醌单一佐剂组、无佐剂组和空白组，共五组，每组6只。
复合佐剂组是将实施例2所得含有复合佐剂以及甲肝病毒灭活抗原的疫苗液100μL经腹部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝单一佐剂组是将氢氧化铝1mg和甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液，经腹部皮下注射到小鼠体内。
β-拉帕醌单一佐剂组是将β-拉帕醌5μg和甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液，经腹部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水均匀混合制备成总体积为100μL的疫苗液，再经腹部皮下注射到小鼠体内。
空白组是对每只小鼠注射100μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经腹部皮下注射免疫小鼠，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HAVIgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HAVIgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgGELISA试剂盒方法进行检测。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以P﹤0.05为差异的统计学意义。
表2为使用实施例2提供的复合佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平。
表2
时间（周） 4 8 12 16
复合佐剂组 1：698 1：4695 1：2153 1：293
β-拉帕醌单一佐剂组 1：207 1：1974 1：987 1：135
氢氧化铝单一佐剂组 1：226 1：2153 1：1076 1：147
无佐剂组 1：44 1：1280 1：453 1：44
空白组 0 0 0 0
通过数据分析可以看出，从第4周开始，各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中复合佐剂组所取得的免疫效果最佳，12周之内抗体都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够在检测期间维持较高的水平。所有添加佐剂的实验组产生抗体水平均显著高于无佐剂疫苗组，其中复合佐剂组抗体水平显著高于β-拉帕醌单一佐剂组及氢氧化铝佐剂组，P＜0.05，提示β-拉帕醌与氢氧化铝复合佐剂能够增强甲肝病毒灭活抗原的体液免疫效果，其体液免疫增强效果高于单一铝佐剂和β-拉帕醌单一佐剂。
实施例3
本例提供的复合佐剂由下列组分组成：β-拉帕醌10μg、氢氧化铝0.5mg（即含有β-拉帕醌复合佐剂0.5100mg）。
本例提供的含有复合佐剂的疫苗是：将β-拉帕醌10μg、氢氧化铝0.5mg和甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液。该抗原为常规甲肝病毒灭活抗原，购自中国医学科学院医学生物学研究所，β-拉帕醌购自上海源叶生物科技有限公司，氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典（三部）》，（国家药典委员会.北京:人民卫生出版社.2005:118-119）。
本实施例3所得甲肝病毒灭活抗原疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将ICR小鼠分为复合佐剂组、氢氧化铝单一佐剂组、β-拉帕醌单一佐剂组、无佐剂组和空白组，共五组，每组6只。
复合佐剂组是将实施例3所述的含有复合佐剂以及甲肝病毒灭活抗原的疫苗液100μL经腹部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝单一佐剂组是将氢氧化铝1mg和甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液，经腹部皮下注射到小鼠体内。
β-拉帕醌单一佐剂组是将β-拉帕醌10μg和甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液，经腹部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水均匀混合制备成总体积为100μL的疫苗液，再经腹部皮下注射到小鼠体内。
空白组是对每只小鼠注射100μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经腹部皮下注射免疫小鼠，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HAVIgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HAVIgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgGELISA试剂盒方法进行检测。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以P﹤0.05为差异的统计学意义。
表3为使用实施例3提供的复合佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平。
表3
时间（周） 4 8 12 16
复合佐剂组 1：761 1：5120 1：1974 1：269
β-拉帕醌单一佐剂组 1：226 1：2153 1：1280 1：160
氢氧化铝单一佐剂组 1：226 1：2153 1：1076 1：147
无佐剂组 1：44 1：1280 1：453 1：44
空白组 0 0 0 0
通过数据分析可以看出，从第4周开始，各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中复合佐剂组所取得的免疫效果最佳，12周之内抗体都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够在检测期间维持较高的水平。所有添加佐剂的实验组产生抗体水平均显著高于无佐剂疫苗组，其中复合佐剂组抗体水平显著高于β-拉帕醌单一佐剂组及氢氧化铝佐剂组，P＜0.05，提示β-拉帕醌与氢氧化铝复合佐剂能够增强甲肝病毒灭活抗原的体液免疫效果，其体液免疫增强效果高于单一铝佐剂和β-拉帕醌单一佐剂。
实施例4
本例提供的β-拉帕醌单一佐剂组由下列组分组成：β-拉帕醌0.5μg。
本例提供的含有β-拉帕醌单一佐剂组的疫苗是：将β-拉帕醌0.5μg甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液。该抗原为常规甲肝病毒灭活抗原，购自中国医学科学院医学生物学研究所，β-拉帕醌购自上海源叶生物科技有限公司，氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典（三部）》，（国家药典委员会.北京:人民卫生出版社.2005:118-119）。
本例所得甲肝病毒灭活抗原疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将ICR小鼠分为氢氧化铝单一佐剂组、β-拉帕醌单一佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组6只。
β-拉帕醌单一佐剂组是将实施例4所得含有β-拉帕醌单一佐剂以及甲肝病毒灭活抗原的疫苗液100μL经腹部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝单一佐剂组是将氢氧化铝1mg、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液，经腹部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水均匀混合制备成总体积为100μL的疫苗液，再经腹部皮下注射到小鼠体内。
空白组是对每只小鼠注射100μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经腹部皮下注射免疫小鼠，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HAVIgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HAVIgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgGELISA试剂盒方法进行检测。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以P﹤0.05为差异的统计学意义。
表4为使用实施例4提供的复合佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平。
表4
时间（周） 4 8 12 16
β-拉帕醌单一佐剂组 1：147 1：1974 1：987 1：104
氢氧化铝单一佐剂组 1：226 1：2153 1：1076 1：147
无佐剂组 1：44 1：1280 1：453 1：44
空白组 0 0 0 0
通过数据分析可以看出，从第4周开始，各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中β-拉帕醌单一佐剂组与铝佐剂组抗体水平相当，12周之内抗体都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够在检测期间维持较高的水平。所有添加佐剂的实验组产生抗体水平均显著高于无佐剂疫苗组，β-拉帕醌单一佐剂组与氢氧化铝佐剂组抗体水平相当，两组间无统计学差异，，提示β-拉帕醌单一佐剂组能够增强甲肝病毒灭活抗原的体液免疫效果，其体液免疫增强效果与单一铝佐剂相当。
实施例5
本例提供的β-拉帕醌单一佐剂组由下列组分组成：β-拉帕醌5μg。
本例提供的含有β-拉帕醌单一佐剂组的疫苗是：将β-拉帕醌5μg甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液。该抗原为常规甲肝病毒灭活抗原，购自中国医学科学院医学生物学研究所，β-拉帕醌购自上海源叶生物科技有限公司，氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典（三部）》，（国家药典委员会.北京:人民卫生出版社.2005:118-119）。
本例所得甲肝病毒灭活抗原疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将ICR小鼠分为氢氧化铝单一佐剂组、β-拉帕醌单一佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组6只。
β-拉帕醌单一佐剂组是将实施例4所得含有β-拉帕醌单一佐剂以及甲肝病毒灭活抗原的疫苗液100μL经腹部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝单一佐剂组是将氢氧化铝1mg、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液，经腹部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水均匀混合制备成总体积为100μL的疫苗液，再经腹部皮下注射到小鼠体内。
空白组是对每只小鼠注射100μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经腹部皮下注射免疫小鼠，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HAVIgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HAVIgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgGELISA试剂盒方法进行检测。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以P﹤0.05为差异的统计学意义。
表5为使用实施例5提供的复合佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平。
表5
时间（周） 4 8 12 16
β-拉帕醌单一佐剂组 1：207 1：1974 1：987 1：135
氢氧化铝单一佐剂组 1：226 1：2153 1：1076 1：147
无佐剂组 1：44 1：1280 1：453 1：44
空白组 0 0 0 0
通过数据分析可以看出，从第4周开始，各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中β-拉帕醌单一佐剂组与铝佐剂组抗体水平相当，12周之内抗体都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够在检测期间维持较高的水平。所有添加佐剂的实验组产生抗体水平均显著高于无佐剂疫苗组，β-拉帕醌单一佐剂组与氢氧化铝佐剂组抗体水平相当，两组间无统计学差异，，提示β-拉帕醌单一佐剂组能够增强甲肝病毒灭活抗原的体液免疫效果，其体液免疫增强效果与单一铝佐剂相当。
实施例6
本例提供的β-拉帕醌单一佐剂组由下列组分组成：β-拉帕醌10μg。
本例提供的含有β-拉帕醌单一佐剂组的疫苗是：将β-拉帕醌10μg甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液。该抗原为常规甲肝病毒灭活抗原，购自中国医学科学院医学生物学研究所，β-拉帕醌购自上海源叶生物科技有限公司，氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典（三部）》，（国家药典委员会.北京:人民卫生出版社.2005:118-119）。
本例所得甲肝病毒灭活抗原疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将ICR小鼠分为氢氧化铝单一佐剂组、β-拉帕醌单一佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组6只。
β-拉帕醌单一佐剂组是将实施例4所得含有β-拉帕醌单一佐剂以及甲肝病毒灭活抗原的疫苗液100μL经腹部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝单一佐剂组是将氢氧化铝1mg、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为100μL的疫苗液，经腹部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水均匀混合制备成总体积为100μL的疫苗液，再经腹部皮下注射到小鼠体内。
空白组是对每只小鼠注射100μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经腹部皮下注射免疫小鼠，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HAVIgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HAVIgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgGELISA试剂盒方法进行检测。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以P﹤0.05为差异的统计学意义。
表6为使用实施例6提供的复合佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平。
表6
时间（周） 4 8 12 16
β-拉帕醌单一佐剂组 1：226 1：2153 1：1280 1：160
氢氧化铝单一佐剂组 1：226 1：2153 1：1076 1：147
无佐剂组 1：44 1：1280 1：453 1：44
空白组 0 0 0 0
通过数据分析可以看出，从第4周开始，各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中β-拉帕醌单一佐剂组与铝佐剂组抗体水平相当，12周之内抗体都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够在检测期间维持较高的水平。所有添加佐剂的实验组产生抗体水平均显著高于无佐剂疫苗组，β-拉帕醌单一佐剂组与氢氧化铝佐剂组抗体水平相当，两组间无统计学差异，，提示β-拉帕醌单一佐剂组能够增强甲肝病毒灭活抗原的体液免疫效果，其体液免疫增强效果与单一铝佐剂相当。

Claims (10)

1.β-拉帕醌在制备疫苗佐剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述β-拉帕醌在制备甲肝病毒灭活疫苗佐剂中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述β-拉帕醌作为佐剂在疫苗中的用量为：每单份疫苗液中含有0.5～10μg的β-拉帕醌。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述β-拉帕醌作为佐剂在甲肝病毒灭活疫苗中的用量为：每单份甲肝病毒灭活疫苗液中含有0.5～10μg的β-拉帕醌。
5.一种含有β-拉帕醌佐剂的疫苗，其特征在于：每单份疫苗剂中含有β-拉帕醌0.5～10μg。
6.一种含有β-拉帕醌佐剂的甲肝病毒灭活疫苗，其特征在于：每单份甲肝病毒灭活疫苗剂中含有β-拉帕醌0.5～10μg，且含有甲肝病毒灭活抗原18EU。
7.一种含有β-拉帕醌的复合佐剂，由下列质量比的β-拉帕醌和氢氧化铝组成：β-拉帕醌:氢氧化铝=1:1000～1:50。
8.一种含有β-拉帕醌复合佐剂的疫苗，其特征在于：每单份疫苗剂中含有β-拉帕醌复合佐剂0.5005mg～0.5100mg。
9.一种含有β-拉帕醌复合佐剂的甲肝病毒灭活疫苗，其特征在于：每单份甲肝病毒灭活疫苗剂中含有β-拉帕醌复合佐剂0.5005mg～0.5100mg，且含有甲肝病毒灭活抗原18EU。
10.根据权利要求3、4、5、6、8、9任一中所述的疫苗，其特征在于：所述每单份疫苗剂为100μL疫苗液。
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