CN104056266B - 新喋呤佐剂及含新喋呤佐剂的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新喋呤佐剂及含新喋呤佐剂的疫苗，属于免疫学技术领域。所述含新喋呤佐剂的疫苗是每单份疫苗剂中含有0.5～1μg的新喋呤佐剂。新喋呤佐剂属于人体的内源性物质，毒副作用小，在免疫剂量范围内使用,安全可靠，能够有效诱导抗原特异性的体液免疫应答，且所诱导的体液免疫应答效果优于无佐剂组，近于铝佐剂组，新喋呤佐剂原料易得，为市售产品，成本较低，可添加于多种传统疫苗和基因工程疫苗中作为疫苗佐剂使用。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种新喋呤佐剂及含该佐剂的疫苗。
背景技术
随着分子生物学理论和技术领域的飞速发展，基因工程疫苗研究也随之快速发展，新型基因工程疫苗层出不穷，此类疫苗具有纯度高、特异性强等特点，但由于分子较小，免疫原性较天然抗原相对较弱，难以产生高效的免疫应答。因此研究开发新型的佐剂来增强新型疫苗的免疫原性是一个重要的课题。
铝盐佐剂是应用于人用疫苗历史最久的佐剂。实践证明铝盐佐剂安全有效，但由于其可引起过敏、诱导退行性神经病变等缺点，迫切需要开发新型疫苗佐剂以适应疫苗产业的发展。
新喋呤(neopterin)是人体体液中最重要的一种喋啶类物质，化学名为2-胺基-4-羟基-6-(D-赤藓糖基1,2,3,-三羟基丙基)喋呤，它是三磷酸鸟苷(GTP)代谢、四氢生物喋呤生物合成过程中的一种中间代谢产物。新喋呤可作为多种递质酶(如苯丙氨酸酶、酪氨酸酶、色氨酸酶)羟化过程中的辅助因子，主要由单核巨噬细胞在被活化的T淋巴细胞所产生的C-干扰素(C-IFN)刺激下分泌产生的，是C-IFN诱导单核巨噬细胞活性增强的一个特异性标志物，是细胞介导免疫激活的象征，其生物稳定性好，可于体液中检测到。
发明内容
为解决现有疫苗佐剂种类少，毒副作用等问题，本发明提供一种安全、有效、稳定、经济的新喋呤佐剂，并且还提供含有新喋呤佐剂的疫苗。
本发明采用的技术方案如下：
本发明所述新喋呤作为制备疫苗佐剂的应用。
所述新喋呤为化合物neopterin，别名名称D-erythro-Neopterin，所述新喋呤为市购生物产品，分子式为C9H11N5O4，分子量为253.20，结构式如图1所示。
在人体中推荐剂量为每200μL疫苗液中的新喋呤用量不超过1μg，优选0.5μg。
本发明提供的含有新喋呤佐剂的疫苗，所述的每单份疫苗剂中含有0.5～1μg新喋呤，所述的每单份疫苗剂为临床使用的常规单次注射参考量。
本发明提供的含有新喋呤佐剂的疫苗制备方法如下：
按每单份疫苗剂加入0.5～1μg新喋呤的量，在疫苗剂中加入新喋呤，再加生理盐水至100～200μL，按常规混合均匀，即得含有新喋呤佐剂的疫苗。
所述疫苗为常规甲肝抗原、乙肝抗原和狂犬病毒抗原中的一种。
新喋呤佐剂能显著增强抗原特异性的体液免疫反应。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：（1）新喋呤佐剂是人体的内源性物质，毒副作用小，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的；（2）新喋呤佐剂能够有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，且其所诱导的体液免疫应答效果优于无佐剂组；（3）新喋呤佐剂原料易得，为市售产品，成本较低，可添加于多种传统疫苗和基因工程疫苗中作为疫苗佐剂；（4）新喋呤佐剂与疫苗联合应用能有效增强疫苗体液免疫应答，免疫效果优于无佐剂的疫苗。
附图说明
图1为本发明中新喋呤的分子结构式。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。文中所述的较佳条件实施方法仅作示范之用。
实施例1
本实施例提供的新喋呤佐剂用量为0.5μg。
本实施例提供的含有新喋呤佐剂的甲肝疫苗是：在每单份HAV抗原（即临床使用的单次注射剂量）中，加入0.5μg的新喋呤佐剂，再加生理盐水至200μL，按常规混合均匀，得含有新喋呤佐剂的甲肝疫苗，其中，新喋呤为市购产品，购自SIGMA公司，HAV抗原为市购的抗原滴度为512EU/ml的18EUHAV抗原液，购自中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所。
本实施例1所得含有新喋呤佐剂的甲肝疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将6～8周龄、18～22g的清洁级ICR小鼠随机分为新喋呤佐剂组、氢氧化铝佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组8只；所用氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，其制法参照《中国药典（三部）》，（国家药典委员会.北京:人民卫生出版社.2005:118-119），在人体中的剂量为1.8～2.7mg。
对新喋呤佐剂组：实施例1的含有新喋呤佐剂的甲肝疫苗至小鼠体内，注射剂量为每只小鼠200μL，其中疫苗中含有新喋呤0.5μg，甲肝抗原18EU；
对氢氧化铝佐剂组：将氢氧化铝300ug与甲肝抗原18EU混合后加生理盐水至200ul，经腹腔皮下多点注射到小鼠体内，注射剂量为每只小鼠200μL；
对无佐剂组：将甲肝抗原18EU与生理盐水混合至200ul，再经腹腔皮下多点注射到小鼠体内，注射剂量为每只小鼠200μL；
对空白组仅注射生理盐水，注射剂量为每只小鼠200ul；
免疫方案：在第0周经腹腔皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次；
B、ELISA检测血清抗－HAVIgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HAVIgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgGELISA试剂盒方法进行检测。
C、数据分析
对所获得的实验数据以SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析，以P﹤0.05为差异的统计学意义，结果见表1。
表1为使用实施例1提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG水平（抗体效价值）。
表1
通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周之内抗体都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。新喋呤0.5μg佐剂组产生抗体水平均显著高于无佐剂疫苗组，但低于铝佐剂组，说明新喋呤0.5μg剂量具有体液免疫增强作用，但效果没有铝佐剂组好。
实施例2
本实施例提供的新喋呤佐剂用量为0.8μg。
在每单份HAV抗原（即临床使用的单次注射剂量）中，加入0.8μg的新喋呤佐剂，再加生理盐水至200μL，按常规混合至混合均匀，得含有新喋呤佐剂的甲肝疫苗，其中，新喋呤、HAV抗原同实施例1；
其他组的配制与实施例1相同。
本实施例2所得含有新喋呤佐剂的甲肝疫苗的免疫试验同实施例1，结果见表2。
表2为使用实施例2提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平。
表2
通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周之内抗体水平都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。新喋呤佐剂组的抗体水平也显著高于无佐剂组。但从表2中也可以看出，在16周时，新喋呤0.8μg佐剂组的抗体水平与同期的铝佐剂组抗体水平接近，但两者间的差异不具有统计学意义（P<0.05），表明0.8μg新喋呤佐剂组能有效增强体液免疫反应并且这种效应可持续较长时间。
实施例3
本实施例提供的新喋呤佐剂用量为1μg。
在每单份HAV抗原（即临床使用的单次注射剂量）中，加入1μg的新喋呤佐剂，再加生理盐水至200μL，按常规混合至混合均匀，得含有新喋呤佐剂的甲肝疫苗，其中，新喋呤、HAV抗原同实施例1；
其他组的配制与实施例1相同。
本实施例3所得含有新喋呤佐剂的甲肝疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表3。
表3为使用实施例3提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平。
表3
通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-HAVIgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周内抗体水平都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。但从表中也可以看出，新喋呤1μg佐剂组抗体水平在8周时接近铝佐剂组，在16周时略高于铝佐组，但均不具有统计学意义（P>0.05），表明新喋呤1μg佐剂组增强体液免疫反应效果可达到铝佐剂组水平，并且这种增强作用能持续较长时间。
实施例4
本实施例提供的新喋呤佐剂用量为0.5μg。
在每单份乙肝表面抗原（即临床使用的单次注射剂量）中，加入0.5μg的新喋呤佐剂，再加生理盐水至100μL，按常规混合至混合均匀，得含有新喋呤佐剂的乙肝疫苗，其中，新喋呤同实施例1，乙肝表面抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg的市购产品，购自中国医学科学院医学生物学研究所。
其他组的配制与实施例1相同。
本实施例4所得含有新喋呤佐剂的乙肝疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表4。
表4为使用实施例4提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-乙肝表面抗原IgG抗体水平。
表4
通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-乙肝表面抗原IgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周内抗体水平都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。但从表中也可以看出，新喋呤0.5μg佐剂组抗体水平在8周时接近铝佐剂组，在16周时略高于铝佐组，但均不具有统计学意义（P>0.05），表明新喋呤0.5μg佐剂组增强体液免疫反应效果可达到铝佐剂组水平，并且这种增强作用能持续较长时间。
实施例5
本实施例提供的新喋呤佐剂用量为0.5μg。
在每单份狂犬病毒抗原（即临床使用的单次注射剂量）中，加入0.5μg的新喋呤佐剂，再加生理盐水至200μL，按常规混合至混合均匀，得含有新喋呤佐剂的狂犬疫苗，其中，新喋呤同实施例1；狂犬病毒抗原为常规的含狂犬病毒抗原0.125IU的市购产品，购自大连汉信生物制药有限公司。
其他组的配制与实施例1相同。
本实施例5所得含有新喋呤佐剂的狂犬疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表5。
表5为使用实施例5提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-狂犬病毒IgG抗体水平。
表5
通过数据分析可以看出，从免疫后第4周开始，除空白组外各实验组都能产生抗-狂犬病毒IgG抗体，并普遍于第八周达到峰值，其中铝佐剂组所取得的免疫效果最佳，16周内抗体水平都显著高于无佐剂疫苗组，P＜0.05，且能够维持较高的水平。但从表中也可以看出，新喋呤0.5μg佐剂组抗体水平在8周时接近铝佐剂组，在16周时略高于铝佐组，但均不具有统计学意义（P>0.05），表明新喋呤0.5μg佐剂组增强体液免疫反应效果可达到铝佐剂组水平，并且这种增强作用能持续较长时间。
Claims (3)
1.一种含有新喋呤佐剂的疫苗，其特征在于每单份疫苗剂中含有0.5～1μg新喋呤，所述的每单份疫苗剂为临床使用的常规单次注射参考量；并经过下列方法制备：按每单份疫苗剂加入0.5～1μg新喋呤的量，在疫苗中加入新喋呤，再加生理盐水至100～200μL，按常规混合均匀，即得含有新喋呤佐剂的疫苗；
所述的疫苗为常规甲肝抗原、乙肝抗原和狂犬病毒抗原中的一种。
2.根据权利要求1所述的含有新喋呤佐剂的疫苗，其特征在于所述新喋呤为化合物neopterin，分子式为C9H11N5O4，分子量为253.20。
3.根据权利要求1所述的含有新喋呤佐剂的疫苗，其特征在于每200μL疫苗液中的新喋呤用量为0.5μg。
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